Los contaminantes emergentes en los sistemas de...

Los contaminantes emergentes en los sistemas

de saneamiento y sus efectos ambientales

Damià Barceló, M. José Lopez de Alda, Mira Petrovic, Silvia Lacorte, Benjamí Piña, M.D. HernandoDepartment de Quimica Ambiental, IIQAB-CSIC, Barcelona

Antoni GinebredaAgencia Catalana de l’Agua

Resumen

§ Contaminantes emergentes§ Clases y compuestos§ Disruptores endocrinos (EDCs)

§ AnálisisIntegración de análisis químicos y biológicos (RYA)§ Ensayo con cepas de levaduras recombinantes§ Inducción de la síntesis de vitelogenina en peces

§ Aplicación del método§ Integración del análisis químico de EDCs y de la actividad estrogénica medida

por RYA en la cuenca del Llobregat§ Integración del análisis químico de EDCs y de la inducción de la síntesis de

vitelogenina en carpas en los ríos Cardener and Anoia

§ Conclusiones

Def.: contaminantes previamente desconocidos o no reconocidos como tales cuya presencia en el medio ambiente no es necesariamente nueva pero si la

preocupación por las posibles consecuencias de la misma

Nuevos y más sensibles métodos de análisis químicos y biológicos

Línea prioritaria de investigación (OMS, EPA, UE)

Nuevos Contaminantes Orgánicos (Emergentes)

...........No regulados...........

Poco o no investigadosEscasez/ausencia de datos ambientales

Falta de métodos analíticos

Elevada producción y consumo → continua introducción en el medio ambiente: no necesitan ser persistentes para ocasionar efectos negativos.

Contaminantes orgánicos emergentes

< Retardantes de llama (difenil éteres polibromados)< Detergentes de tipo alquilfenol etoxilado y derivados

Parafinas cloradas< Ftalatos

< Compuestos organoestánnicosSubproductos de desinfección del agua potable

< Productos de transformación de pesticidas

Metil tert-butil éter y otros aditivos de la gasolinaSurfactantes perfluorados (PFOA, PFOS)

< FármacosProductos para el cuidado y la higiene personalToxinas de algas

< Bisfenol A. . . .

*Susan D. Richardson (2004) Anal. Chem. 76, 3337-3364.

< Disruptores endocrinos

2455/2001/EC

Ya legisladosDatos nuevos

No legisladosDatos insuficientes

Compuestos disruptores endocrinos (EDCs)

§ Los EDCs son compuestos sintéticos o productos naturales que interfieren en el sistema endocrino(hormonal)

§ El Sistema Endocrino produce hormonas que guíanel desarrollo, crecimiento, reproducción, y comportamiento de humanos y animales

• Malformaciones en recién nacidos• Problemas en los testículos• Esperma anormal y pobre• Funcionamiento tiroideo anormal• Posible cáncer de testículos• Cáncer de próstata• Otros efectos

Efectos sospechosos en humanos:

• Disminución de la fertilidad y el crecimiento

• Alteraciones sexuales• Problemas en las cáscaras de los

huevos• Funcionamiento tiroideo anormal

Mucha documentación de efectos en organismos del medio natural:

Surfactantes de tipo alquilfenol etoxilados

Alquilfenoletoxilados(APEOs)

- Detergentes en formulaciones industriales (textil, curtidos, papeleras)- Coadyuvantes de pesticidas- Ingredientes de pinturas- Agentes humectantes

Efectos Efectos estrogénicosestrogénicos:1-20 µg/L (NP and NP1EO)

Niveles en Niveles en - aguas: ng-µg-mg/L- sedimentos: µg/Kg- lodos: mg/Kg- biota: ug/Kg

OOH

Rn

n=1-20

Alquilfenoles(APs)

APEOs de cadena corta

Alquilfenoxicarboxilados

(APECs)

OH

R

OOH

R

n

n=1-2

nOCH2COOHO

R

Productos de degradación Productos de degradación aeróbica y anaeróbica aeróbica y anaeróbica

Directiva 2455/2001Directiva 2455/2001Nonilfenoles; 4-p-NonifenolOctilfenoles, p-t-Octilfenol

Análisis:Análisis: GC-MS-MS (deriv.), LC-MS-MS

Petrovic M y col. (2003) Environ. Sci. Technol. 37, 4442-4448

Heberer T (2002) Toxicol. Lett. 131, 5-17.

Analgésicos/antiinflamatorios: paracetamol, ác. acetilsalicílico, ibuprofeno, diclofenac

Antibióticos:- Macrólidos: claritromicina, dehydroeritromicina, roxitromicina, lincomicina

- Sulfamidas: sulfametoxazol, sulfadimetoxina, sulfametacina, sulfatiazol

- Fluoroquinolonas: ciprofloxacina, norfloxacina, enrofloxacina

- Tetraciclinas: clortetraciclina, oxitetraciclina, tetraciclina

... cloranfenicol, tilosin, trimetoprimAntiepilépticos: carbamazepina, primidona

β-Bloqueantes: metoprolol, propanolol, bisoprolol, betaxolol, nadolol, sotalol

Reguladores de lípidos: ácido clofíbrico, bezafibrato, gemfibrozil, ác. fenofíbrico

Medios de contraste en rayos-X: diatrizoato, iohexol, iopamidol, iopromide, iomeprol

Citostáticos (quimioterapia): ifosfamida, ciclofosfamida

Anticonceptivos orales: etinilestradiol, mestranolEsteroides: coprostanol, estradiol, progesterona, testosterona.Broncodilatadores, tranquilizantes, antihistamínicos, barbitúricos, antidiabéticos...

Fármacos en el medio ambiente acuático

NIVELES: ng-µg/L; µg-g/Kg

Análisis:LC-UV-FLLC-MS → LC-MS-MSGC-MS → GC-MS-MS

1Heberer T (2002) Toxicol. Lett. 131, 5-17.2 Thiele-Bruhn S (2003) J. Plant Nutr. Soil Sci. 166, 145-167.3 http://www.epa.gov/OGWDW/ccl/cclfs.html

Fármacosmás problemáticos/menos estudiados1

Anticonceptivos orales:N Efectos estrogénicos a ∼ 1ng/LsMedio marino, sedimentos y fangos

Antibióticos2:N Resistencia bacteriana- 2/3 en medicina humana: posición 3.- 1/3 en medicina veterinaria: 70%

Medios de contraste en rayos-X:N PersistenciaPoca eliminación en STPAguas subterráneassMetabolitos

Citostáticos:N Prop. CarcinogénicasPoca eliminación en STPsniveles, destino, y riesgos

U.S. EPA Contaminants Canditate List (CCL)3

Diclofenac (antirreumático) Carbamazepine (antiepiléptico)Chloramphenicol (antibiótico)

.

Procedimiento integrado de análisis químicos y ensayos biológicos

Extracción de componentes activos

Co

rrel

ació

n y

cuan

tifi

cac

ión

de

fact

ore

sca

usa

tivo

s

Environmental samples

Estrogenicity screeningRecombinant yeast assay (RYA)

Actividad positiva

HPLC fractionation


SPE -C18 (aqueous samples)PLE (solid samples)

Extractos

Environmental samplesMuestras ambientales


Medida de la estrogenicidad (vitelogenina)Ensayo levaduras recombinantes (RYA)

Fraccionamiento HPLC


Fracciones activas

SPE -C18 (aqueous samples)PLE (solid samples)

SPE-C18 (muestras acuosas)PLE (muestras sólidas)

Identificación de comp. desconocidos por LC-MS-MS

Análisis de compuestos diana

por LC-MS

Medida de la estrogenicidad (vitelogenina)Ensayo levaduras recombinantes (RYA)

Muestras agua

Filtración

SPE (ASPEC)LiChrolut RP-18

SPE (PROSPEKT)PLRP-s

Off-line On-line (steroids)

N2 evaporación

LC-MS/(MS)

Chemical analysis

Ultrasonic extractionExtracción con fluídos presurizados

Muestras sólidas(sedimentos/lodos)

Rotary evaporationRotavapor

LyophilizationLiofilización

N2N2 evaporación

LC DAD MSLC-MS/(MS)

Purificación (clean-up)

SPESep-Pak C18 Plus (esteroides)LiChrolut RP18 (alquilfenoles)

Análisis químico – compuestos diana

1. Detergentes no iónicos, nonilfenol etoxilado (NPEO), y octilfenoletoxilado (OPEO) y sus productos de degradación nonilfenol (NP), octilfenol (OP), y derivados carboxilados (NPEC y OPEC), respectivamente.

2. Bisfenol A (BPA)

3. Ftalatos (DMP- dimetil ftalato; DEP – dietil ftalato, DBP - dibutil ftalato, BBP - butil bencil ftalato, DEHP-di(2-etil-hexil) ftalato)

4. Hormonas sexuales esteroidales naturales y compuestos sintéticos relacionados (E1-Estrona; E2- β-estradiol , E3-Estriol, EE- etinilestradiol, DES-Dietilestilbestrol, PRO-Progesterona, NOR-Noretindrona, LEV-levonorgestrel)

5. Benzotiazoles (HOBT. 2-hidroxibenzotiazol)

Ensayo con cepas de levaduras recombinantes(Recombinant Yeast Assay, RYA)

§ Basado en una cepa de levadura que expresa el receptor humano de estrógenos (hER) y un gen de ensayo (ß-galactosidasa) cuya expresión depende de la activación del receptor del hER.

§ La actividad β-galactosidasa se mide fácilmente con substratos cromogénicos o fluorogénicos y depende de la presencia de ligandos del hER, por lo que puede ser tomada como indicadora de actividad estrogénica.

§ Todo el ensayo puede ser llevado a cabo en placas de ensayo de 96 pocillos

Concentration efectiva media (EC50) y factor de estrogenicidadrelativa obtenida para diferentes compuestos por RYA

Vitelogenina en plasma: Western blot

Extracción de sangre: 2 ml jeringa heparinizada + Aprotinina

Obtención plasma: Centrifugaciónn 1,000 g x5’

SDS-PAGE análisis: PAb anti-conejo (Biosense, Norway)

Cyprinus carpio

Integración de análisis químicos de EDCs y ensayos con cepas de levaduras recombinates para la determinación de actividad estrogénica

Análisis de EDCs en la cuenca del río LlobregatAnálisis de fármacos en la cuenca del río Llobregat

Integración de análisis químicos de EDCs e inducción de la síntesis de vitelogenina en carpas

Análisis de EDCs en estaciones de depuración de aguas residuales (EDAR) catalanas y en los ríos receptores de los efluentes (aguas y sedimentos fluviales).

APLICACIONES

Area de estudio: Cataluña

Mapa con los puntos de muestreo en la cuenca del Llobregat.

Números 1 al 10 indican los puntos de muestreo de aguas.Letras A a la D corresponden a la localización de las EDAR.

Zonas en gris indican la localización de las poblaciones próximas a las EDAR: A-Manresa; B-Terrassa , C-Igualada; D-Martorell.

Puntos Río OP NP BPA NPEO1 NPEO2 DEP DEHP DBPAguas superficiales

1 Llobregat < 0.09 0.22 0.09 < 0.22 < 0.06 1.45 < 0.20 0.62 Llobregat < 0.09 < 0.15 0.09 < 0.22 0.61 1.5 < 0.20 0.343 Cardener < 0.09 0.39 < 0.09 3.22 2.53 6.85 < 0.20 0.34 Llobregat < 0.09 0.26 < 0.09 1.19 1.2 0.54 < 0.20 0.47

5a Llobregat 0.09 0.5 0.27 < 0.22 0.39 1.26 0.82 15b Llobregat < 0.09 0.45 < 0.09 < 0.22 < 0.06 2.05 3.09 1.3

6 Anoia < 0.09 1.23 < 0.09 < 0.22 < 0.06 0.85 0.65 < 0.197 Anoia < 0.09 0.53 0.12 < 0.22 1.27 0.58 0.45 < 0.198 Llobregat 0.26 2.57 0.11 3.54 1.17 0.46 0.31 < 0.199 Rª de Rubí 21.9 37.3 0.85 6.87 3.17 0.4 0.77 < 0.19

10 Llobregat 2.57 13.9 2.97 < 0.22 < 0.06 0.22 < 0.20 < 0.19

Aguas resid. EDAREDAR A Inf Manresa 0.17 17.1 0.94 19.3 5.56 1.62 3.17 0.07EDAR A Efl Manresa < 0.09 2.99 0.34 9.53 8.97 0.93 1.34 < 0.19EDAR B Inf Terrasa 0.08 29.8 < 0.09 < 0.22 < 0.06 12.97 0.26 0.83EDAR B Efl Terrasa < 0.09 0.8 < 0.09 10.6 9.69 10.21 0.23 < 0.19EDAR C Inf Igualada 0.24 44.8 6.98 2.37 5.61 3.19 0.82 8.86EDAR C Efl Igualada < 0.09 1.24 < 0.09 < 0.22 < 0.06 2.25 1.12 < 0.19EDAR D Inf Martorell 0.18 11.9 < 0.09 3.8 0.82 1.06 1.9 0.35EDAR D Efl Martorell 0.09 0.89 < 0.09 < 0.22 3.87 0.56 0.33 < 0.19

LOD (µg L-1) 0.09 0.15 0.09 0.22 0.06 0.2 0.2 0.19

Concentraciones en µg/L de diferentes EDCs analizados por LC-MS

Cálculo de equivalentes de estradiol a partir de losresultados RYA.

Los círculos negros, losblancos, y los triángulosrepresentan los valoresrelativos de ß-galactosidasa, obtenidos a diferentesfactores de dilución, en el agua residual de entrada de la EDAR de Manresa, en el agua de salida, y en un puntode muestreo próximo a ésta(el 3), respectivamente.

Las funciones sigmoidales se calcularon mediante métodosde regresión no-lineal. Las líneas gruesas continua y discontinua corresponden a las aguas de entrada y de salida de la EDAR de Manresa, y la línea finadiscontinua a la muestra de agua en el punto 3.

Valores totales de estrogenicidad en equivalentes de estradiol para muestras de aguas residuales (izquierda) y de aguas de río (derecha).

Correlación entre los valores totales de estrogenicidad(en eq. E2) obtenidos por RYA (eje X) y los estimados a

partir de la composición química de las muestras (eje Y).


Análisis de EDCs en la cuenca del río LlobregatAnálisis de fármacos en la cuenca del río Llobregat



APLICACIONES


Detección de fármacos

ACIDO CLOFIBRICO

ACIDO ACETILSALICILICO

DICLOFENAC

N

0 25 km

Manresa

Barcelona

Igualada

Cardona

Martorell

Llobregat river

Llobregat river

Cardener river

Anoia river

Abrera

Sant Joan Despí

(1)

Mediterranean Sea

(2)

RIO LLOBREGAT

(3)

(4)

EDAR ABRERA

050

100150 ng/L

EDAR RUBI

0

50

1001200 ng/L

RIO ANOIA

050

100150

ng/L

050

100150

ng/L


Detección de fármacos

ACIDO CLOFIBRICO

ACIDO ACETILSALICILICO

DICLOFENAC

N

0 25 km

Manresa

Barcelona

Igualada

Cardona

Martorell

Llobregat river

Llobregat river

Cardener river

Anoia river

Abrera

Sant Joan Despí

(1)

Mediterranean Sea

(2)

RIO LLOBREGAT

(3)

(4)

EDAR ABRERA

050

100150 ng/L

EDAR ABRERA

050

100150 ng/L

EDAR RUBI

0

50

1001200 ng/L

EDAR RUBI

0

50

1001200 ng/L

RIO ANOIA

050

100150

ng/L

050

100150

ng/L

050

100150

ng/L

---Aigua tractada ETAP SJD ---Llobregat captació ETAP SJD---Aigua tractada ETAP Abrera

501071200Edar Rubí-14-Llobregat després Anoia-35-Llobregat abans Anoia---Anoia final

31.540-EDAR Abrera-24.5-MPATSA---Distribució zona Ter

Ac.acetilsalic ílico

Ac.clofíbricoDiclofenacMuestras

Fármacos


Concentraciones en ng/L de fármacos

à Octubre 2003

----Aigua tractada ETAP SJD

---17.46Captació ETAP SJD, 28-04-04, 17:00

----Abocament ETAP (SJD), 28-04-04, 15:15

--14.4030.50Llobregat després Anoia, 28-04-04, 14:30

----ETAP Abrera (aigua tractada), 28-04-04, 12:40

--13453.70EDAR Martorell, 28-04-04, 12:00

--31127.20Anoia final, 28-04-04, 11:30

--11.827.42Llobregat abans Anoia, 28-04-04, 11:00

--240.68134.30EDAR de Abrera, 28-04-04, 10:30

----MPATSA, 28-04-04, 10:00

----ETAP Cardedeu aigua tractada

---Muestras

AtenololÁcido clofíbrico

DiclofenacIbuprofen


Concentraciones en ng/L de fármacos

à Abril 2004

Area de estudio: Cataluña – Ensayo RYA

MUESTRAS pH ACIDO

0

5

10

AIGUA TR

ACTADA ET

AP ABRER

A 3

EDAR SO

RTIDA ABRER

A 3

DISTRIBUC. Z

ONA 3

MAPTSA

3

LLOBREG

AT ABANS A

NOIA 3

ANOIA FI

NAL 3

EDAR RUBI 2

AIGUA TRACTA

DA ETAP S

JA 3

LLOBREG

AT DES

PRES

2 BLANC

BLANC OH-

BLANC H+

UN

IDA

DE

S 1:30

1:90

1:270

1:500

Fig. Gráfico de unidades ß- galactosidasa de las muestras extra ídas a pH ácido.

Area de estudio: Cataluña – Ensayo RYA

CONTROL POSITIVO

0

500

1000

1500

0 0 0 0

GENIST

EINA 228

ENTE

ROLACTO

NA

UN

IDA

DE

S

1:30

1:90

1:270

1:500

Fig. Gráfico de unidades ß- galactosidasa de control positivo (Genisteína 1.9 mM) y negativos (0). Véase la diferencia de escala con respecto a la anterior figura.


Análisis de EDCs en la cuenca del río LlobregatAnálisis de EDCs en la cuenca del río Llobregat



APLICACIONES

Mar Mediterráneo

Río Anoia

Río Cardener

Río Llobregat

A1

A2 A3

C1 C2

C3

Barcelona

EDAR1EDAR2

EDAR3

EDAR4

0 30 60 km

lN

Spain

A1-A3, C1-C3Agua

SedimentoPez (Cyprinus carpio)

sangre, hígado, bilis, tejido(130 machos adultos, 116 hembras de carpas)


Río Anoia

Río Llobregat

A1A2 A3 Barcelona

EDAR1EDAR2

EDAR3NPEONP1ECNP

0

10

20

30

40

50

I III V VII

µg/L

AGUA

0

200

400

600

800

µg/kg

SEDIMENTo AGUA

SEDIMENT

0

200

400

600

800

µg/kg

SEDIMENTO

0

1020

30

40

50

I III V VII

µg/L

Variación temporal de las concentraciones de compuestos

nonilfenólicos en aguas y sedimentos del río Anoia

800

0

10

20

30

40

50

I III V VII

µg/L

0

200

400

600

µg/kg

AGUA

SEDIMENTO

NPEONP1ECNP

Río Cardener

Río Llobregat

C1

C2 C3

Barcelona

STP

µ

400SEDIMENTO

0

100

200

300

g/kg

0

2

4

6

8

10

I III V VII

µg/L

AGUA

0

2

4

6

8

10

I III V VII

µg/L

AGUA

0

100

200

300

400

µg/kg

SEDIMENTO

02468

10

I III V VII

µg/L

AGUA

0

100

200

300

400

µg/kg

SEDIMENTO

Variación temporal de las concentraciones de compuestos

nonilfenólicos en aguas y sedimentos del río Cardener

0

5

10

15

20

25

A1 A2 A3 A1 A2 A3 A1 A2 A3 A1 A2 A3

ng/L

E3 E2EE E1DES NORLEV PRO

Enero 2000 Marzo 2000 Mayo 2000 Julio 20000

1

2

3

4

ng/g

E3 E2EE E1DES NORLEV PRO22.8

Variación temporal de las concentraciones de esteroides en aguas y

sedimentos del río Anoia

0

5

10

15

20

25

30

C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3

ng/L

E3 E2EE E1DES NORLEV PRO

71.1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

ng/g

E3 E2EE E1DES NORLEV PRO11.8

Enero 2000 Marzo 2000 Mayo 2000 Julio 2000

Variación temporal de las concentraciones de esteroides en aguas y

sedimentos del río Cardener

Niveles de vitelogenina, en µg/mL de plasma, en carpas macho (Cyprinus carpio) del río Anoia

Anoia

(4)

(7:3)

(6)(4)

(9) (6) (3)

(6)

x100

* **

(10:4)

(4) (5)

(6)

0

40

80

120

VTG

(g/

ml p

lasm

a)

Enero Marzo Mayo Julio

A1A2A3

Control

Correlación entre la concentración de VTG en plasma y la concentración de NP en agua de río

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 20 40 60 80

µg VTG/mL plasma

µg NP/L

R = 0.82

Cromatograma obtenido en el análisis off-line de etinil estradiol porLC-NI-ESI-MS-MS (295>145) en un sedimento tomado en una

zona en donde se observó una alta incidencia de peces intersex y de niveles de vitelogenina.

21 22 23 24 25 26

6500

7000

7500

8000

8500

9000

9500 Etinil estradiol

Tiempo (min)

Abu

ndan

cia 22.8 ng/g sedimento A2

MRM

Anoia

(4)

(7:3)

(6)(4)

(9) (6) (3)

(6)

x100

* **

(10:4)

(4) (5)

(6)

0

40

80

120V

TG (

g/m

l pla

sma)

January March May July

A1A2A3

ControlVTG-Anoia

(4)

(7:3)

(6)(4)

(9) (6) (3)

(6)

x100

* **

(10:4)

(4) (5)

(6)

0

40

80

120V

TG (

µg/m

l pla

sma)

Enero Marzo Mayo Julio

A1A2A3

Control

Conclusiones/propuestas para la mejora de la calidad del agua en Cataluña

- Mejor depuración de las aguas residuales urbanas- Incremento significativo del tratamiento terciario en la depuración de

aguas residuales urbanas- Reutilización creciente de aguas depuradas- Tratamiento separado, y diferenciado desde el origen, de las aguas

de procedencia industrial- Máxima reutilización del agua industrial mediante circuitos cerrados y

autodepurados- Implementar la calidad integral de las aguas promoviendo programas

de vigilancia ambiental para los contaminantes emergentes de forma que se garantice la conservación del medio acuático natural, la gestión integral de los recursos hídricos, la eficacia en el uso del agua y la reutilización de la misma.

Projecto de la UE P-THREE (EVK1-CT-2002-00116)(Removal of Persistent Polar Pollutants ThroughImproved Treatment of Wastewter Effluents)

Ministerio de Ciencia y Tecnología (PPQ2002-10945-E)

AgradecimientosAgradecimientos

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