Iniciamiento del proceso (priming) de respuesta de clulas T CD8+ a los antgenos del parsito del estadio heptico de malaria

Aunque que el rol de las clulas T CD8+ de memoria especficas para el parsito de malaria en el control de los estadios extraeritrociticos est bien documentado y generalmente aceptado, el debate an contina en cuanto a la identidad del sitio anatmico especfico donde se da la activacin de clulas T patgeno-especficas vrgenes, adems de la contribucin de diferentes clulas presentadoras de antgenos (APC) en este proceso. Mientras que algunos estudios infieren un rol de APC profesionales presentes en los ndulos linfoides que drenan los sitios donde el mosquito inyect el parasito, otros argumentan a favor del hgado como un rgano primario y a los hepatocitos como estimulador de la respuesta de clulas T patgeno- especficas vrgenes. Esta revisin apunta al anlisis crtico del conocimiento actual y resalta nuevas lneas de investigacin necesarias para entender la induccin del sistema inmune protector en contra del parasito de la malaria. Palabras clave: Plasmodium, malaria, antgenos de estadio heptico, presentacin antignica a clulas T, clulas detrticas y hepticas como APC

Introduccin: Es actualmente aceptado que la iniciacin de la respuesta de linfocitos T CD8+ por clulas presentadoras de antgeno (APCs) se da en los rganos linfoides secundarios, como el bazo y los ndulos linfticos. La microscopa intravital basada en multi-fotones revela que el primer contacto entre clulas T patgeno-especficas vrgenes y APC ocurre en la periferia de los ndulos linfticos drenantes (DLN) poco tiempo despus de la infeccin y sucede principalmente en los senos subcapsulares o en las regiones interfoliculares enriquecidas con antgenos derivados del patgeno. Dependiendo de la naturaleza del patgeno, la rpida relocacin de la clula T virgen a la periferia del ndulo linftico drenante puede ser tanto antgeno especfica, como antgeno independiente, asociado con una disminucin de los niveles locales de quimiosinas y la drstica alteracin de la arquitectura del linfonodo por accin del patgeno. Datos tomados de ratones infectados con el virus de estomatitis vesicular demostraron que, aunque los macrfagos CD169+ residentes del seno subcapsular fueron la mayor poblacin de clulas con antgenos derivados del virus, fueron las clulas dendriticas (DCs) las principales APC que inducen las clulas T CD8+ antgeno-especficas. La habilidad de las clulas dendrticas inmaduras para adquirir antgenos exgenos seguido del procesamiento proteoltico y la presentacin en las molculas MHC de clase 1, comnmente referido como presentacin cruzada, es considerado como el mayor requerimiento para la generacin de respuestas primarias de clulas T CD8+ especficas para patgenos. Antes del encuentro inicial de clulas T vrgenes con las APC, son generadas una progenie heterognea de clulas T CD8+ antgeno-especificas, donde se incluyen las clulas efectoras de vida corta (SLEC) y las clulas efectoras precursoras de memoria (MPEC). Aun no es claro si la diferenciacin en SLEC o MPEC esta reforzada por la segregacin asimtrica de factores de transcripcin y protenas de la maquinaria de degradacin ya desde la primera divisin celular. O si se refleja la exposicin diferencial a seales de inflamacin y seales de ayuda coestimuladoras enviadas desde APC a las clulas T CD8+ antgeno especificas durante la fase de expansin. Mientras que la generacin de respuestas primarias de clulas T CD8+ a antgenos

no inflamatorios requiere de la ayuda de clulas T CD4+, la induccin de respuestas primarias de clulas T CD8+ a Lysteria, LCMV, y virus de la influenza es independiente de clulas T CD4+ y resulta de la activacin directa de APC por el patgeno. Incluso, la ayuda de las clulas T CD4+ puede ser reemplazada por la induccin de CD40 en las DC, lo que inicia la respuesta de clulas T CD8+ antgeno-especificas vrgenes. Por lo tanto, la naturaleza exacta y los requerimientos del las seales de ayuda necesarias para la induccin inicial y subsecuente expansin de las respuestas primarias clulas T CD8+ antgenos especficos varia entre los diferentes patgenos y sitios de infeccin primaria. En este reporte, nuestro objetivo es el de presentar y discutir la data publicada referente la activacin de las clulas T CD8+ en una infeccin de Plasmodium, y sugiere experimentos para entender mejor el proceso de presentacin de antgenos. La infeccin de malaria es iniciada por la mordida del mosquito hembra Anopheles infectado con Plasmodium, que busca sangre para suplir el desarrollo de los huevos. Mientras que el mosquito explora el ambiente debajo de la piel del hospedero en busca de algn vaso sanguneo, inyecta protenas de las glndulas salivales tanto antes como durante su alimentacin con la sangre para inhibir la coagulacin sangunea. Los parsitos depositados en la piel pueden tambin atravesar clulas circundantes e ingresar en la circulacin con subsecuente infeccin de las clulas hepticas. Estudios realizados con parsitos inyectados por va intradrmica o intraveosa muestran que la carga parasitaria en el hgado es similar. Adems, la transferencia de parsitos desde la piel hacia los DLN ocurre. La identificacin del sitio anatmico y el tipo de APC, que orquesta la induccin de respuestas primarias de clulas T CD8+ en contra de un antgeno particular, representa un paso esencial en el diseo de las estrategias de vacunas basadas en clulas T CD8+. Mientras que la investigacin de la fase efectora de la respuesta de clulas T CD8+ contra malaria ha sido bastante extensa, un numero limitado de los estudios ha intentado diseccionar el tema de la etapa especfica del hgado CD8C clulas T cebar el husped

infectado.

Papel De Los rganos Diferentes En Presentacin De Antgenos

En este respecto, el estudio de Chakravarty et al. parece ser uno de los ms comprensivos y sistemticos a la fecha. Los autores concluyeron que los tejidos linfoides extrahepticos, en particular el DLN y el bazo son los sitios ms importantes contribuyendo a la generacin de la piscina efector de clulas T en el hgado. De acuerdo con estos datos, Obeid y sus colegas demostraron que la inmunizacin estrictamente subcutnea con esporozoitos irradiados condujo a la induccin de inmunidad estril contra la malaria pre-eritroctica con la preparacin de clulas T que ocurre en los ganglios linfticos de drenaje de la piel. Se propuso que la preparacin de clulas TCD8+ especficas a parsito depende de la presentacin cruzada de antgenos de malaria. Esto indica que las APC profesionales, en lugar de los hepatocitos infectados, inician la preparacin de clulas T vrgenes CD8+ dirigidas a los antgenos de la etapa heptica. Varias lneas de evidencia experimental fueron presentadas en apoyo de estas conclusiones. Por lo tanto, la produccin de IFN por clulas T transgnicas vrgenes especficas a protena circumsporozoite (CSP) adoptivamente transferida se detect por primera vez en la piel DLN tan temprano como en el da 2 despus de la inmunizacin de ratones por microinyeccin o picaduras de mosquito, mientras no se detect la activacin de clulas T detectable en otros rganos incluyendo el bazo. Por lo tanto, Chakravarty y co-autores sugieren que estas diferencias temporales en el inicio de la activacin de las clulas T-parsito especfico podran reflejar el orden jerrquico de preparacin de clulas T iniciado en el DLN que podra ser seguido por la migracin de clulas TCD8+ en preparacin a otros rganos, incluyendo el bazo y el hgado. Sin embargo, la eliminacin de los ganglios linfticos que drenan el sitio de inyeccin de parsitos antes de la transferencia adoptiva de clulas TCD8+ especficas al parsito, di lugar a una reduccin del 60% de las clulas TCD8+ activadas en el hgado, no afect a las frecuencias de clulas TCD8+ en preparacin en el bazo, donde se documentaron los primeros signos de activacin de clulas T slo 24 h ms tarde que en DLN y al mismo tiempo que el hgado. Esto indican que el uso de las diferencias temporales en el inicio de la activacin de las clulas T como un parmetro para identificacin del sitio de preparacin de clulas T CD8+ debe ser reconsiderada cuidadosamente en futuros estudios y fortalecer an ms la importancia del bazo como un sitio de induccin primaria respuestas de clulas TCD8+ en modelos animales de la infeccin. Lo ltimo concuerda con los datos de Sano et al. demostrando que el bazo de ratones infectados apoyan la preparacin de las clulas vrgenes TCD8+ especficas al parsito despus de la inyeccin intravenosa de esporozoitos. Al mismo tiempo, varias lneas de evidencia presentadas por Chakravarty y sus colegas no apoyan firmemente el papel esencial del bazo en la preparacin de clulas TCD8+ parsito especficas. En primer lugar, las clulas dendrticas aisladas del bazo 60 h despus de la inyeccin de esporozoitos

fueron incapaces de provocar la proliferacin de las clulas T CD8+ especficas al parsito, mientras las DCs aisladas del DLN inducian la proliferacin de clulas T y, presumiblemente, presentan el antgeno. Desde que no se generan datos con DCs residentes del hgado, un papel directo de APCs intrahepticas profesionales en la preparacin de clulas TCD8+ especficas al parsito todava debe ser abordado. Adems, como se detectaron los primeros signos de la activacin de los linfocitos T especficos del parsito en DLN en el da 2 despus de la inmunizacin, no es del todo claro si las DCs de DLN tenan una mayor capacidad para preparar clulas TCD8+ en comparacin con el bazo y de hgado de DCs residente en los puntos de tiempo antes de 60h. En segundo lugar, los animales sometidos a linfadenectoma y la esplenectoma simultnea antes de la transferencia adoptiva de clulas TCD8+ especficas a CSP seguido por la inmunizacin con esporozoitos y la estimulacin subsiguiente con parsitos viables 10 das ms tarde tuvo carga similar de parsitos en el hgado que los ratones no inmunizados, lo que indica que, el DLN o/y el bazo son necesarios para la preparacin de las clulas TCD8+ especficas a CSP. Al mismo tiempo, la esplenectoma por s sola no afect a la inhibicin de desarrollo del parsito en el hgado, lo que llev a los autores a la conclusin, que DLNS son el sitio de preparacin de las respuestas de clulas T CD8+ de proteccin. Curiosamente, como se muestra por Chakravarty y co-autores, la eliminacin de ambos DLNS y el bazo antes de la inmunizacin con esporozoitos, aunque reduce drsticamente la piscina de clulas T activadas en el hgado, no abroga completamente, lo que sugiere que al menos una proporcin de clulas TCD8+ especficas al parsito que se encuentran en el hgado haban sido preparadas fuera de los DLN y el bazo. Estos hallazgos podran reflejar el proceso de activacin de clulas TCD8+ especficas al parsito en el hgado y definirlo como el rgano esencial para el desarrollo del parsito. Por otro lado, los animales tratados con FTY720, un frmaco que inhibe la salida de linfocitos de los ganglios linfticos, tenan sustancialmente menos clulas T CD8+ especficas al parsito productoras de IFN al da 7 despus de la inyeccin con esporozoitos irradiados. Basndose en esta observacin, los autores concluyeron que la distribucin sistmica de las clulas TCD8+, al menos en parte, contribuye a la piscina intraheptica de las clulas TCD8+ especficas al parsito. Todava tiene que ser visto, si el tratamiento con FTY720 inhibe el desarrollo de clulas TCD8+ tempranamente preparadas" especficas al parsito en el hgado y el bazo, sealadas previamente por los autores ya 72h despus de picadura de mosquito. Adicionalmente, el efecto de FTY720 en la proteccin de los animales de la estimulacin subsiguiente con esporozoitos en vivo tiene que ser abordado en este modelo. Digno de mencin, el tiempo de activacin de las clulas T clonales especficas al parasito en los ganglios linfticos, el hgado y otros rganos se retrasa slo ligeramente (por 24h), mientras se sabe que las clulas T activadas salen de los ganglios linfticos 4-5 das despus del encuentro antgeno. Este ltimo sugiere que o bien la activacin de las clulas T

especficas al parsito puede suceder simultneamente en varios rganos, o la salida inusualmente rpida desde el ndulo linftico despus de prepararla es una caracterstica intrnseca de las clulas T en este modelo experimental especfico. Rol de los hepatocitos infectados en la presentacin de antgenos El rol de los hepatocitos infectados en la preparacin directa de clulas T CD8+ vrgenes especficas al parasito es an un tema de controversia. Estudio temprano por Renia et al. demostr que la inyeccin intraesplenica de hepatocitos infectados produjo inmunidad protectora mediada por clulas T contra infecciones por esporozoitos de Plasmodium yoelii y P. berghei. Leiriao et al. demostr que hepatocitos apoptoticos infectados con esporozoitos irradiados son fagocitados por CDs y solo sirven como fuente de antgenos de Plasmodium para el inicio de respuestas inmunes protectoras va preparacin cruzada. En contraste, Renia y colaboradores argumentaron contra los hepatocitos infectados apoptoticos como fuente de antgenos y sugirieron que las clulas dendrticas del hgado podan ser activadas durante el ingreso de antgenos de parsitos directamente desde hepatocitos infectados viables vistos como anteriormente en otros modelos experimentales. Sin embargo, los datos de Chakravarty et al. dieron a entender que, aunque se requiere una preparacin cruzada, esta tiene lugar en las DLNS y no en el hgado. De acuerdo con estos datos, Jung et al. demostraron que en los ratones sometidos a la deplecin de qumica de CD11c+ las DCs fallaron al inducir respuestas de clulas T CD8+ a la infeccin por Plasmodium yoelii. Ninguno de estos estudios consider los hepatocitos como un subconjunto APC capaz de iniciar las respuestas tempranas de clulas T especficos ante parsitos. Un estudio reciente de Balam et al. se centr en dos preguntas: pueden los hepatocitos infectados preparar directamente clulas T vrgenes especficas a parsitos y si la estimulacin de las clulas T CD8+ ya preparadas pueden proteger a los ratones contra la propagacin del parsito? La administracin de las clulas T CD8+ CSP-especficas pero no una clula T clon irrelevante inyectado en ratones receptores no coincidentes de MHC de clase I deficientes de TAP, simultneamente con hepatocitos infectados que llevan haplotipo relevante de MHC para las clulas T especficos al parsito, dieron como resultado 100% de proteccin de los ratones de la estimulacin subsiguiente con esporozoitos vivos. A medida que la proteccin observada no era debida a un efecto espectador o una secrecin de citoquinas continua por las clulas T CD8 + especficos del parsito, estos datos demostraron que los hepatocitos infectados son capaces de presentar el antgeno a las clulas T CD8 +, reactivar las clulas T + CD8 CSP-especficas en reposo e inducir la proteccin. Es importante destacar que ms de 60% de los ratones BALB/c vrgenes inyectados con hepatocitos infectados con esporozoitos irradiados tambin fueron protegidos de la exposicin posterior al parsito vivo, lo que sugiere que los hepatocitos infectados podran contribuir a la preparacin de clulas T vrgenes endgenas. Sin embargo, se

requieren experimentos de reduccin de clulas T para confirmar que la proteccin es mediada por clulas T. Por ltimo, para excluir formalmente la contaminacin con otras APC potencialmente presentes en las preparaciones de hepatocitos capaces de presentar CSP y preparar las clulas T CD8 + vrgenes, el aislamiento de la poblacin de hepatocitos puros desprovista de clulas que portan los marcadores de DCs, macrfagos, y clulas estrelladas debe ser realizado por citometra de flujo utilizando parsitos transgnicos fluorescentes. Por otro lado, con el argumento contra el nico papel de APC profesional en la preparacin de las respuestas inmunes vrgenes contra parsitos de la malaria, los ratones sin DCs mediante el tratamiento con citocromo c todava estaban protegidos de la propagacin de los esporozoitos vivos a pesar de frecuencias significativamente ms bajas de clulas T especficas al parsitos endgenos preparadas por la inmunizacin con esporozoitos irradiados. Estos datos no apoyan plenamente el papel discutido previamente de la funcin de clulas dendrticas en la induccin temprana de respuestas de clulas T de etapa especfica en el hgado contra malaria OTRAS CONSIDERACIONES La calidad de los hepatocitos como APCs capaces de desencadenar respuestas de clulas T han sido diseccionados recientemente por Ma et al. Se ha demostrado que hepatocitos humanos infectados con P. berghei y P. falciparum conservan la expresin inalterada en gran medida de mltiples molculas de la va de MHC de clase I hasta etapas muy tardas del desarrollo del parsito. Por otra parte, las clulas infectadas no mostraron defectos evidentes en la capacidad de regular positivamente la expresin de diferentes componentes moleculares de la maquinaria de MHC de clase I en respuesta a linfocinas proinflamatorias o desencadenar la activacin directa de allo-especfica, as como las clulas TCD8 + especficas de pptido humanas. Al mismo tiempo, se desconoce si las caractersticas tpicas en APCs profesionales que se presume son importantes para el preparamiento de clulas T, por ejemplo, molculas co-estimulantes B7.1 y B7.2 (seal2) as como la produccin de citoquinas esenciales para la supervivencia y mantenimiento de clulas T en preparacin (seal 3) son posedas por los hepatocitos humanos primarios in-vivo y/o son inducidos tras la infeccin. La literatura actual que investiga la habilidad de los hepatocitos para preparar clulas TCD8+ vrgenes es escasa. Bertolino et al. demostraron que hepatocitos murinicos purificados primarios fueron capaces de inducir la activacin y proliferacin de clulas TCD8+ vrgenes especificas a antgeno in vitro, incluso en ausencia de citoquinas aadidas de manera exgena al igual que las molculas co-estimulantes CD80 y CD86. Ms an, la magnitud de la proliferacin de clulas T inducidas por hepatocitos primarios fue comparable a la inducida por CDs. El preparamiento de clulas T vrgenes por hepatocitos no requiri ayuda de clulas TCD4+ e indujo la expresin de marcadores de activacin temprana de clulas T y actividad efectora transitoria de clulas TCD8+ seguida por la muerte celular rpida de las clulas activadas. Por ende, los hepatocitos primarios fueron

capaces de preparar clulas T vrgenes pero fueron incapaces de sostener respuestas productivas especficas a antgeno de clulas T CD8+. De acuerdo a esta data, experimentos in vivo usando expresin endgena de aloantgenos bajo los promotores especficos a hepatocitos demostraron que la activacin primaria de clulas T primarias por hepatocitos como APCs lleva a la apoptosis de la clula T en vez de a la formacin de clulas T de memoria. Tambin fue demostrado que las clulas T activadas por hepatocitos moran por negligencia y falta de IL-2 y poca expresin de genes pro-supervivencia debido a la co-estimulacin insuficiente en la fase de preparamiento. Por ende, tomando en cuenta la inhabilidad de los hepatocitos primarios de proveer co-estimulacin apropiada durante el preparamiento de clulas T junto con el microambiente inmunosupresivo creado por mltiples sublinajes de APCs residentes en el hgado, puede parecer improbable que los hepatocitos infectados con malaria jueguen un rol mayor en la generacin de respuestas efectivas especficas a parasitos de clulas T de memoria CD8+. Sin embargo, esto no descarta la posibilidad de que clulas TCD8+ especficas a antgenos de malaria puedan ser preparados y activados, al menos a corto plazo, por hepatocitos contribuyendo al desarrollo de formas exo-eritrociticas. Ciertamente, con estimulacin adecuada, tales clulas T pueden ser rescatadas hacia competencia inmunolgica completa y supervivencia ms larga. En el caso de malaria, estmulos de activacin adecuados pueden ser inducidos por infeccin de Plasmodium conllevando a la activacin de numerosos genes en los hepatocitos incluyendo aquellos involucrados en la inmunidad innata y la presentacin de antgenos. Dado que no se ha realizado ningn anlisis transcripcional en clulas de Kupffer travesadas por esporozoitos, sera importante entender si es que los macrfagos residentes en el hgado cambian sus propiedades inmunomoduladoras en el sitio de infeccin por malaria. En este punto, una palabra de precaucin debe ser expresada para el hecho de que todos los estudios animales discutidos arriba se basaron en una nica raza de ratones, BALB/c, al igual que una sola epitope de clula TCD8+derivada del CSP. Futuros estudios sobre la induccin primaria de respuestas de clulas T a formas extra eritrociticas de malaria necesitan ser extendidos a otras epitopes protectivas de clulas TCD8+ incluyendo respuestas, que aparecen ms tarde en la etapa heptica usando esporozoitos atenuados por radiacin (RAS) o genticamente (GAS) o combinados con cloroquina quimioprofilaxis (CPS). Estudios de campo No es aun claro hasta que punto los modelos animales que investigan la induccin de respuesta de clulas T primarias a la malaria, asi como los estudios humanos que involucran voluntarios vacunados, reflejan la adquisicin de respuestas naturales de inmunidad celular en reas endmicas de malaria. Una adquisicin de proteccin inmune esteril, seguida de inmunizacin con RAS, GAS o usando rgimen CPS en animales y humanos contrasta

fuertemente con la situacin en el campo, donde, a pesar de la frecuente (hasta 30 por mes en algunas reas) picadura por mosquitos infectados, ninguna proteccin esteril es obtenida usalmente en tanto adultos como nios en respuesta a infeccin natural bajo tratamiento con drogas o tratamiento preventivo intermitente (IPT). Muchas hiptesis pueden ser propuestas para explicar esta discrepancia: (1) La carga de esporozotos (y, como resultado, el suministro de antigenos del parasito) es muy baja en el campo comparada con aquella dada bajo condiciones experimentales ; (2) la regulacin negativa de respuestas de clulas T CD8+ especificas para el parasito a travs del contenido de las glndulas salivarias del mosquito inyectadas junto a los esporozoitos en el sitio de cebado de clulas T; y (3) induccin excesiva y/o precedente de respuestas inmunes a protenas de glndulas salivarias. Con respecto a lo ltimo, dado el hecho de que solo una fraccin (0-25% dependiendo de la estacin y localizacin) de mosquitos esta infectada, un pool de clulas T memoria especificas para antgenos de la glndula salivara del mosquito est probablemente establecida antes de la infeccin parasitaria. Como resultado, respuestas de clulas T secundarias dirigidas a los antgenos del mosquito podran ser preferentemente activadas a expensas de la activacin de clulas T especificas para el parasito, va, por ejemplo, competencia por IL-2, nicho homeosttico, o por secrecin activa de molculas inhibitorias. Si este es el caso, la eficacia de vacunas basadas en esporzotos pre eritrocticos podra resultar baja en reas endmicas debido a la sutil contaminacin con protenas de las glndulas salivarias. Tanto la segunda como la tercera hiptesis pueden explicar la baja frecuencia de clulas T helper especficas del parasito y T CD8 encontrados en humanos de regiones endmicas de malarias, asi como el fracaso general (con excepcin de un solo donante hasta ahora) para obtener clones estables de clulas T humanas especficas para antgenos de malaria en estadio heptico. Observaciones finales En conclusin, la data experimental existente obtenida de modelos animales sugiere que: (1) tanto DCs como hepatocitos pueden cebar clulas T CD8 vrgenes parasito-especficos para malaria, al menos aquello dirigidos a eptopos derivados de CSP y (2) tanto DCs como hepatocitos son suficientes para inducir respuestas protectoras de clulas T CSP-especficas si la carga parasitaria no es excesiva. Identificacin del sitio esencial para el cebado de respuestas de clulas T CD8 dirigidas al estadio heptico de malaria con especificidad amplia antignica, as como imitar las condiciones de la exposicin natural al vector del mosquito no infectado pavimentara el camino para el diseo ptimo de vacunas basadas en clulas T. Esperamos que los acercamientos experimentales sugeridos anteriormente en el contexto de data original revisada resulte en estudios futuros en la induccin y el mantenimiento de respuestas protectoras de clulas T contra etapas exo eritrocticas de infeccin por malaria.