Laboratorio de Productos Ilegales - Agencia Española de ... · Cromatografía de líquidos de...

Laboratorio de Productos Ilegales

División de Química y Tecnología Farmacéutica de la AEMPS


De nueva creación en 2010

Personal: 3 titulados superiores

3 analistas de laboratorio

Instrumentación:UPLC-Xevo QTOF (proporciona masa exacta)

UPLC-CAD (permite cuantificación con análogos)

Ensayos:Identificación de componentes declarados o nodeclarados en la composición (acreditado segúnnorma 17025 desde julio de 2013)Cuantificación de componentes no declarados


Técnicas analíticas: UPLC-MS (QTOF)UPLC-CAD

UPLC (UHPLC)

Cromatografía de líquidos de ultra alta eficacia que utiliza columnas con tamaño de partícula inferiores a 2 µm, lo que permite:

�Muy buenas separaciones en cortos periodos de tiempo

�Un buen acoplamiento al espectrómetro de masas (MS) y al detector de aerosol cargado CAD utilizando:

� Ionización por vaporización o electro-spray (ESI) que produce los iones que van al MS

�Nebulización y secado que produce las partículas que se cargan en el CAD


UPLC-Xevo QTOF


MS (QTOF)

Espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (TOF)

� Los iones producidos por ESI se aceleran a alta velocidad aplicando un fuerte voltaje y se lanzan a un tubo de vuelo, para ser “contados” en el detector.

�El tiempo que tarda un ión en atravesar el analizador es proporcional a su velocidad, que es inversamente proporcional a su masa (llegan antes los iones más ligeros).

Si además del analizador de tiempo de vuelo, se acopla un cuadrupolo (Q) tenemos un detector QTOF que permite:

�Conocer la masa exacta del ión y su patrón isotópico

� Fragmentar el ión y conocer la masa exacta de los fragmentos


UPLC-CAD


CAD

Las partículas generadas en el nebulizador se cargan positivamente y el detector mide la carga recibida.

La carga es proporcional a la cantidad de analito dando una respuesta que es bastante independiente de la estructura química, pero dependiente de la composición de la fase móvil por lo que requiere la utilización de un gradiente inverso, para mantener la fase móvil constante.

Responde a cualquier analito no volátil o semivolátil, con o sin cromóforos.

Permite estimar concentraciones aunque no se disponga de patrones de las sustancias concretas.


Con la instrumentación adquirida se ha desarrollado un método de SCREENING para identificación y si se requiere cuantificación de componentes

Utiliza un método cromatográfico único que permite la separación de sustancias con actividad farmacológica

Este método cromatográfico se emplea tanto para el detector de masas (QTOF) como para el detector de corona (CAD)

Cuando se utiliza el detector de masas, la posibilidad de combinar la separación cromatográfica de alta eficacia, la obtención de la masa exacta de un compuesto, el patrón isotópico de la misma y su espectro de masas proporciona la confirmación de la identidad y estructura molecular de una sustancia.

La identificación de las sustancias detectadas en las muestras requiere un procesado muy cuidadoso y muchas veces complejo de los resultados obtenidos.

Con el detector de corona se efectúa la estimación de la cantidad de la sustancia identificada previamente en masas.

Laboratorio de Productos IlegalesEste método de SCREENING ha sido desarrollado para efectuar la identificación de:

� Anabolizantes : testosterona, boldenona, estanozolol, mesterolona, drostanolona, metandriol, metandienona, metenolona, nandrolona, oxandrolona, oximetolona, trenbolona, etc y sus respectivos ésteres.

� Sustancias activas inhibidores de la PDE-5 : vardenafilo, tadalafilo y sildenafilo y otros derivados tales como tiosildenafilo, acetildenafilo, desmetiltiosildenafilo, hidroxihomo-tiosildenafilo, 4-propoxi-N-hidroxietil-tiosildenafilo, nitroso-prodenafilo, etc.

� Sustancias utilizadas ilegalmente en productos para adelgazar : bisacodilo, bupropion, diazepam, fenfluramina, fluoxetina, furosemida, orlistat, rimonabant, sibutramina, tiroxina, liotironina, etc

� Otras sustancias con actividad terapéutica relacionadas con la indicación que se deduzca de su nombre o bien de la información de su material de acondicionamiento.

Se mantiene una lista abierta de sustancias identificadas en el laboratorio, la mayoría de ellas con actividad farmacológica

Laboratorio de Productos Ilegales26-Sep-2014

26-Sep-201415:28:29MEZCLA-15 MeOH-Agua 90-10 (1 µg/ml). 11.07.14. VIAL PREP: 18.09.14

Time4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00

%

0

100

ANAB-125 1: TOF MS ES+ TIC

3.65e54.01

329.2593

7.68387.2943

6.60345.24374.36

289.2184

4.21283.2085

6.04331.2296

4.60303.2330

4.91291.2342

6.48149.0224

7.46161.0612

7.75387.2936 8.07

401.3090

9.45443.3564

9.12429.3398

8.78149.0238

10.14457.3689

9.76663.4587

ANABOLIZANTES

Laboratorio de Productos Ilegales22-Jul-2014

22-Jul-201411:21:33M.PATRONES D.E.SILDE, VARDE, TADA, TIO 2 ug/ml.ACN: H20 (50:50) MATRAZ: 23.05.14 VIAL23.05.14

Time2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 2.70 2.80 2.90 3.00 3.10 3.20 3.30 3.40 3.50 3.60 3.70 3.80 3.90 4.00 4.10 4.20 4.30 4.40 4.50 4.60 4.70

%

0

100

Varde-2201 1: TOF MS ES+ TIC

4.18e54.10

491.1842

3.19475.2128

2.76312.1613

2.59701.5010

4.02268.1122

3.90516.1865

INHIBIDORES DE PDE-5: VARDENAFILO 2.76SILDENAFILO 3.19TADALAFILO 4.02TIOSILDENAFILO 4.10


22-Jul-201422-Jul-201411:21:33M.PATRONES D.E.SILDE, VARDE, TADA, TIO 2 ug/ml.ACN: H20 (50:50) MATRAZ: 23.05.14 VIAL23.05.14

Time2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 2.70 2.80 2.90 3.00 3.10 3.20 3.30 3.40 3.50 3.60 3.70 3.80 3.90 4.00 4.10 4.20 4.30 4.40 4.50 4.60 4.70

%

0

100

2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 2.70 2.80 2.90 3.00 3.10 3.20 3.30 3.40 3.50 3.60 3.70 3.80 3.90 4.00 4.10 4.20 4.30 4.40 4.50 4.60 4.70

%

0

100

2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 2.70 2.80 2.90 3.00 3.10 3.20 3.30 3.40 3.50 3.60 3.70 3.80 3.90 4.00 4.10 4.20 4.30 4.40 4.50 4.60 4.70

%

0

100

2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 2.70 2.80 2.90 3.00 3.10 3.20 3.30 3.40 3.50 3.60 3.70 3.80 3.90 4.00 4.10 4.20 4.30 4.40 4.50 4.60 4.70

%

0

100

Varde-2201 1: TOF MS ES+ 491.19 0.1000Da

2.25e54.10

491.1842

Varde-2201 1: TOF MS ES+ 390.145 0.1000Da

1.85e44.02

268.1122

Varde-2201 1: TOF MS ES+ 475.213 0.1000Da

1.48e53.19

475.2128

Varde-2201 1: TOF MS ES+ 489.228 0.1000Da

5.24e42.76

312.1613

FILTRADO POR MASA EXACTA

Laboratorio de Productos IlegalesM.PATRONES D.E.SILDE, VARDE, TADA, TIO 2 ug/ml.ACN: H20 (50:50) MATRAZ: 23.05.14 VIAL23.05.14

m/z50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525

%

0

100

m/z50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525

%

0

100

m/z50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525

%

0

100

m/z50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525

%

0

100

Varde-2201 473 (4.093) Cm (470:476) 2: TOF MS ES+ 1.26e558.0661

125625

299.101897043

99.093747671

85.078314668

271.099618441

228.05025191

101.10723618

202.04722244152.0317

1394

313.118533793

315.104818167

491.19607066407.1319

2955455.0420

1698

513.17714893


42188

115.054211918

99.05391078

84.9620849

168.06947977

204.082712034 262.0890

9238205.0920

6156 274.08983573

428.09482633

314.0538646

412.1260495

348.0599486 474.1003

703

491.1918138


90773

283.123640324

100.101129635

70.06777155

136.05298767

255.11978029

225.08004164

166.1016;1913

475.213410757

284.13088535

377.1310849

414.0555477

497.195510739


117794

110.06101481472.0821

9536

312.162927578152.0936

12511299.1160

10543209.1712

2281

313.16095538 489.2303

5360376.1111

4283435.3385

886

511.21272511

ESPECTROS DE MASAS:

TIOSILDENAFILO

TADALAFILO

SILDENAFILO

VARDENAFILO

Laboratorio de Productos IlegalesENSAYO DE IDENTIFICACION DE COMPONENTES POR UPLC-MS (QTOF)

Condiciones cromatográficas: Condiciones QTOF:Columna: Acquity UPLC BEH

C18 1.7 µm (2.1x100 mm)

Fase móvil: A.- Fórmico 0.1% en agua B.- Fórmico 0.1% en ACN

Gradiente:

Flujo: 0.4 ml/minTª columna: 30ºCTª inyector: 7ºCInyección: 8 µl

5.095.011.0

95.05.010.5

95.05.07.0

5.095.00

%B%At (min)

20-40 VENERGIA DE COLISION600De desolvatación (L/h)20De cono (L/h)

GASES600Desolvatación120Fuente

TEMPERATURAS4.0Cono extracción35 VCono muestra3.0 kVCapilar

FUENTE: ES +MSEMODO


ENSAYO DE IDENTIFICACION DE COMPONENTES POR UPLC-MS (QTOF)

Preparación de las muestras:Extracción y dilución con disolventes orgánicos (metanol o acetonitrilo). Filtrado e inyección en el cromatógrafo.

Procesado de los cromatogramas:Revisión inicial de los picos más importantes

Software Chromalynx que filtra los cromatogramas por masas exactas utilizando listas de sustancias, que se van ampliando día a día :

� Anabolizantes� Inhibidores de PDE-5� Adelgazantes� Plantas, etc

Procedimiento especial para la identificación de nuevas sustancias


IDENTIFICACION DE NUEVAS SUSTANCIAS

� Extracción de los espectro de masas del pico desconocido con y sin energía de colisión.

� Estimación de la fórmula empírica� Búsqueda en bases de datos sustancias con algún tipo de actividad

farmacológica que puedan corresponder a esa fórmula y a su fragmentación.

� Evaluación del patrón de fragmentación obtenido con las fórmulas de los candidatos, para ver si alguno de ellos corresponde.

� Revisión de la bibliografía disponible.

� Adquisición de material de referencia, si está disponible para confirmar inequívocamente la estructura propuesta.

� Si no se encuentra material de referencia se tratará de confirmar la estructura por otras vías (CG/MS, espectros de masas bibliográficos o remitidos por otros laboratorios de la red de OMCL, etc). En este caso se informa como “estructura compatible con”


SUSTANCIAS IDENTIFICADAS EN EL LABORATORIO: 197

TIEMPO DE RETENCIONMASA EXACTAFRAGMENTACION Y PATRON ISOTOPICO

CON PATRÓN DE REFERENCIA: 160

OTRAS SUSTANCIAS INCLUIDAS EN SCREENING: UNAS 2000

LIMITACIONES:

LA SUSTANCIA DEBE IONIZARSEDEBE ELUIR EN EL GRADIENTE UTILIZADO


SUSTANCIAS IDENTIFICADAS EN EL LABORATORIO

0

10

20

30

40

50

60

Serie1 21 15 49 4 24 23 12 30 7 12

AA ADEL ANAB ANES API DE EST VAR VAS VIT


COLABORACION CON LA RED EUROPEA DE OMCL (GEON)

Remisión de informes de complementos alimenticios adulterados. Introducción de los datos en la base de datos KNOWX desde abril de este año)

Participación en las campañas europeas de control de productos sospechosos de contener sustancias no declaradas (European MarketSurveillance of Suspected Illegal Products MSSIP)

Participación en los estudios de suficiencia SUP:

23 (0)EstanozololComprimidos blancos (3)SUP007

19 (1)TiocolchicósidoComprimidos amarillos (4)SUP006

22 (1)A: JWH081B: Butilona

A y B (Polvo blanco)SUP00523 (1)SibutraminaPolvo marrónSUP004

Países participantes

ResultadoMuestrasEstudio


EUROPEAN MARKET SURVEILLANCE OF SUSPECTED ILLEGAL PRODUCTS

� MSSIP001: Complementos alimenticios adelgazantes (informe definitivo Febrero 2014)

� MSSIP002: Complementos alimenticios que se anuncian como potenciadores sexuales (resultados enviados a finales del 2013, a la espera del informe definitivo)

� MSSIP003: Campaña retrospectiva de Anabolizantes (en proceso de enviar los resultados 2012-2014)

173 – 47%37021MSSIP002

245 - 52%47318MSSIP001

MUESTRAS

ADULTERADAS

MUESTRASOMCLs


MUESTRAS ANALIZADAS 2014 (hasta septiembre)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Total 419 61 9 4

Cumplen 267 34 9 4

No cumplen 152 27 0 0

Anabolizantes Disfunción erectil Adelgazantes Varios

56%

64%

36%

44%100% 100%

85% 12% 2% 1%


MUESTRAS ANALIZADAS 2014 (hasta septiembre)

0

100

200

300

400

500

600

Total 446 45 2 493

Cumplen 286 26 2 314

No cumplen 160 19 0 179

Med no autorizados

Comp. Alimen Varios Totales

64%

36%

58% 42%

64%

36%


CO M PLEM ENTO S ALIM ENTICIO S 2014(hasta septiembre)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Tota l 2 38 4

No adulterados 2 19 4

Adulterados 0 19 0

A nabolizantes D isfunción erectil A delgazantes

86%

5%9%


COMPLEMENTOS ALIMENTICIOS 2011 - 09/2014

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Total 15 287 38 340

No adulterados 14 162 29 205

Adulterados 1 125 9 135

Anabolizantes Disfunción erectil Adelgazantes Totales

7%

44%

24%

40%


COMPLEMENTOS ALIMENTICIOS 2014(hasta septiembre)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Total 45 37 24 8

No adulterados 26 20 12 6

Adulterados 19 17 12 2

Total Cadena legal PANGEA VII Cadena ilegal

58%

42% 54% 46%

50% 50%

75%25%


14-Jul-201414-Jul-201418:49:33M.PATRONES D.E.SILDE, VARDE, TADA, TIO 2 ug/ml.ACN: H20 (50:50) MATRAZ: 23.05.14 VIAL23.05.14

Time1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40

%

0

100

1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40

%

0

100


1.56e53.69

269.1061

2.58701.4963

2.44701.4978

2.74475.3204

5.23200.20685.12

437.19644.11

521.14164.29

84.9605

5.96577.1309

6.47149.0252


4.20e54.11

491.1854

3.19475.2136

2.76312.1602

2.59701.4943

4.02268.1124

3.91516.1871 5.23

200.20336.42

149.0274

MUESTRA PROBLEMA

MEZCLA DE PATRONES

VARDENAFILO

SILDENAFILO

TADALAFILO

TIOSILDENAFILO

EJEMPLO PRACTICOMuestra: Goldmax CápsulasProcedencia de las muestras recibidas: Operación PANGEA VII


m/z60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

%

0

100

m/z60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

%

0

100


77771

135.045911217

84.96251494

130.0685715

262.08677316

250.08823105

214.54931050

136.0528958

167.0158474

390.149144812

269.116113353

302.08842186

389.14041829329.2694

530

391.150810281

392.15611710


147762

135.047022144

130.0676178684.9623

1726

262.089414504

250.08805437169.0790

1657

233.08591408197.0753

437

391.142469786

270.111127552

302.09034029

390.1401910329.0747

487

392.147217265

393.15242420

TADALAFILO

MUESTRA PROBLEMA

ESPECTROSDE MASAS

(SIN ENERGIA DE COLISIÓN)


m/z376 378 380 382 384 386 388 390 392 394 396 398 400 402 404 406

%

0

100

m/z376 378 380 382 384 386 388 390 392 394 396 398 400 402 404 406

%

0

100


44812

389.14041829

382.0875101

377.223222

386.870230

391.150810281

392.15611710

402.140778

395.040841

397.230626

404.14336


69786

390.1401910

374.1225600

377.214885 384.0773

38

379.870711 386.8693

38

392.147217265

393.15242420 396.0483

64 402.631841

398.892015 405.3581

17

PERFIL ISOTOPICO DEL PICO MOLECULAR (M+1)

TADALAFILO

MUESTRA PROBLEMA


m/z60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

%

0

100

m/z60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

%

0

100


26189

115.05398584

84.96212030

135.04456716

168.06935606

167.06361902

204.081711428

170.07824175

191.07781956

262.08797626

205.09135610

232.08022995

233.08701977

274.08892645 300.0367

2052314.0521

1271 348.0571896 390.1507

201


44501

115.055012709

84.96191699

168.06879700

135.04497605

204.083516159

170.08295556

191.07842814

262.088810449205.0913

9056

232.08093912

263.09753850

300.04341583

329.06511568

348.05731084 391.1426

585

ESPECTROSDE MASAS(CON ENERGIA DE COLISIÓN)

TADALAFILO

MUESTRA PROBLEMA

Laboratorio de Productos IlegalesFORMULA EMPIRICA


TADALAFILO

C22H19N3O4

M+1: 390.1454

AMINOTADALAFILO

C21H18N4O4

M+1: 391.1406

Laboratorio de Productos IlegalesPRINCIPALES FRAGMENTOS

COMUNES:

C17H12NO2 C15H10N C11H9N2

262.0868 204.0813 169.0766


FRAGMENTOS DIFERENCIADORES

TADALAFILO AMINOTADALAFILO

C15H14N3O2C14H13N4O2

268.1086269.1039

Laboratorio de Productos IlegalesSe adquiere material de referencia:

24-Jul-201424-Jul-201420:10:50AMINOTADALAFILO 238-1. 20ug . 24.07.14

Time2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60

%

0

100

2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60

%

0

100

2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60

%

0

100

DE 17-1 1: TOF MS ES+ TIC

1.04e53.69

269.1068

4.43240.2347 5.20

268.26514.79

230.2475


1.56e53.69

269.1061

2.58701.4963

2.44701.4978

2.74475.3204 5.23

200.20685.12437.19644.11

521.14164.29

84.9605

4.96372.2318


4.20e54.11

491.1854

3.19475.2136

2.76312.1602

2.59701.4943

4.02268.1124

3.91516.1871

5.23200.2033

AMINOTADALAFILO MR

MUESTRA PROBLEMA

MEZCLA PATRONESVARDENAFILO

SILDENAFILO

TADALAFILO

TIOSILDENAFILO

Laboratorio de Productos IlegalesAMINOTADALAFILO 238-1. 20ug . 24.07.14

m/z60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

%

0

100

m/z60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

%

0

100

m/z60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

%

0

100

m/z60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

%

0

100

DE 17-1 426 (3.690) Cm (425:427) 2: TOF MS ES+ 2.58e4169.0798

25766

115.05408650

77.0401502

89.0444158

168.06966537

135.04603805

204.08349795

170.08122752

262.08915764

205.09214603

232.08172234

263.09792074

302.0805425 413.1233

294

329.0693257

391.1440109


44501

115.055012709

84.96191699

168.06879700

204.083516159

170.08295556

262.088810449205.0913

9056232.0809

3912263.0975

3850

300.04341583

329.06511568 413.1246

1138

391.1426585

DE 17-1 427 (3.694) Cm (426:428) 1: TOF MS ES+ 8.88e4269.1064

88816

135.046112481

130.0674;115284.9633

218

262.08748973

169.07971126

212.2045968

391.143236855

270.111215187

302.09052650

390.1378785337.2547

357

392.14709121


147762

135.047022144

130.0676;178684.9623

1726

262.089414504

169.07901657

233.08591408

391.142469786

270.111127552

302.09034029

390.1401910329.0747

487

392.147217265

AMINOTADALAFILO MR

AMINOTADALAFILO MR

MUESTRA PROBLEMA

MUESTRA PROBLEMA

ESPECTROSDE MASAS

(CON ENERGIA DE COLISIÓN)

ESPECTROSDE MASAS

(SIN ENERGIA DE COLISIÓN)


AMINOTADALAFILO

C22H19N3O2

M+1: 390.1454

TADALAFILO

C22H19N3O2

M+1: 390.1454

CUANTIFICACION DE AMINO TADALAFILO

Estimación utilizando tadalafilo (SQR de la Farmacopea Europea) como patrón

ESTUDIOS DE VALIDACION

Linealidad del método

TADALAFILO y = 166,27x + 89,748R2 = 0,9933

0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

0,000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000


Determinación de contenido (6 muestras en condiciones de repetibilidad):

4.6% / 3.7%

17.8 mg/cap

17.2 mg/cap17.6 mg/cap17.3 mg/cap17.3 mg/cap18.2 mg/cap19.3 mg/cap

----- / -----GoldmaxPrecinto nº014434

D 037/14 CAL

RSD / UMediaAminotadalafiloResultados

Lote / Caducidad

ProductoCódigo interno

1.7%96.4%93.5%96.4%

Media 95.4%

----- / -----GoldmaxPrecinto nº 014434

D 037/14 CAL

RSDRecuperación Lote / Caducidad

ProductoCódigo interno

Recuperación (adición de tadalafilo por triplicado):

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