LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

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Instrumentación y principios básicos

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LABORATORIODE MICROBIOLOGÍA

Instrumentación y principios básicos

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La Habana, 2004

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Datos CIP-Editorial Ciencias Médicas

González Alfaro JoséLaboratorio de Microbiología: Instrumentacióny principios básicos/ José González Alfaro, BorisGonzález González, Rosa T. Barrial González.La Habana: Editorial Ciencias Médicas; 2004

256p. Fig.

Incluye índice general. Está dividida en 19 capítulos.Listado de referencias al final de la obra.ISBN 959-212-131-11. MICROBIOLOGÍA 2. PERSONAL DE LABORATORIO3. TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS. LIBRO DE TEXTOI. González González Boris II. Barrial González Rosa T.

QW23

Diseño: Ac. Luciano O. Sánchez NúñezEmplane: Maria Pacheco Gola

© José González Alfaro, Boris González González y Rosa T. Barrial González, 2004© Sobre la presente edición Editorial Ciencias Médicas, 2004

Editorial Ciencias MédicasCentro Nacional de Información de Ciencias MédicasCalle I No. 202, esquina Línea, Vedado,Ciudad de La Habana, 10400, CubaCorreo electrónico: ecimed@infomed.sld.cuTeléfonos: 55 3375, 832 5338

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"Vivid en la serena paz de los laboratoriosy preguntaos cada día:

-¿Qué puedo hacer para mejorar la calidaddel servicio que presto?

-¿Cómo puedo ayudar a mi país?-¿Cómo puedo servir a la humanidad?

Luis Pasteur

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AUTORES

José González AlfaroTécnico de Microbiología Especializado en Docencia, Profesor Facultad Tec-nológica Dr. Salvador Allende

Boris González GonzálezLic. En Microbiología Hospital Salvador Allende, Profesor Facultad Tecnológi-ca Dr. Salvador Allende

Rosa T. Barrial GonzálezMcS en Microbiología Hospital Salvador Allende, Profesora Facultad Tecnoló-gica Dr. Salvador Allende

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ÍNDICE

EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA / 17INTRODUCCIÒN / 17LABORATORIO CLÍNICO / 17LABORATORIO DE MEDICINA TRANSFUSIONAL / 17LABORATORIO DE RAYOS X / 17LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA. GENERALIDADES / 18ACTIVIDADES FUNDAMENTALES / 18RECURSOS HUMANOS / 18ESTRUCTURA ADMINISTRATIVA / 18IMPORTANCIA DEL TRABAJO DE LOS PROFESIONALES Y TÉCNICOS DEMICROBIOLOGIA / 19ESTRATEGIA ORGANIZATIVA DE TRABAJO / 19DISPOSICIÓN DE LOS MATERIALES DE TRABAJO / 20CERTEZA DE LOS MEDIOS REACTIVOS O MEDIOS A EMPLEAR / 20ORDENAMIENTO DE LAS MUESTRAS / 20PLANIFICACIÓN DEL TRABAJO A REALIZAR. / 20CONCENTRACIÓN EN EL TRABAJO / 21CUESTIONARIO / 21BIOSEGURIDAD / 22INTRODUCCIÒN / 22RIESGOS FÍSICOS / 22RIESGOS QUÍMICOS / 22RIESGOS BIOLÓGICOS / 22BIOSEGURIDAD. CONCEPTO / 22DAÑO INDIVIDUAL Y COMUNITARIO. / 23PRINCIPALES CAUSAS / 23NIVELES DE RIESGO BIOLOGICO / 23PRINCIPIOS BÁSICOS / 24PARA LA CORRECTA REALIZACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE LABORATORIO / 24EMPLEO SISTEMÁTICO DE EQUIPOS Y MEDIOS DE SEGURIDAD / 25EL DISEÑO ADECUADO DE LOS LABORATORIOS / 26MEDIDAS DE PREVENCIÓN / 33PRECAUCIONES A TENER EN CUENTA PARA LA / 33DESINFECCIÓN DE JERINGUILLAS Y AGUJAS REUSABLES, ANTES DE SU ESTERI-LIZACIÓN / 33INDICACIONES EN CASOS DE ACCIDENTE / 34LAVADO DE MANOS / 35TIPOS DE LAVADO DE MANOS / 36LAVADO SOCIAL DE LAS MANOS / 36

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LAVADO HIGIÉNICO O MÉDICO DE LAS MANOS / 36LAVADO QUIRÚRGICO DE LAS MANOS / 37MANEJO DE DESHECHOS PELIGROSOS / 38CUESTIONARIO / 38ETICA MEDICA / 40INTRODUCCION / 40LA MORAL / 40ETICA / 41TEORÍA DE LA MORAL / 41ÉTICA NORMATIVA / 41ÉTICA MÉDICA / 41EN RELACIÓN CON EL PACIENTE Y SUS FAMILIARES / 42EN RELACIÓN CON EL RESTO DE LOS TRABAJADORES DE LA SALUD / 44EN LAS RELACIONES ENTRE EL DOCENTE Y LOS EDUCANDOS / 44COMO PARTE DE LA SOCIEDAD / 44LAS COMISIONES DE ÉTICA MÉDICA / 45CUESTIONARIO / 45EL AGUA / 46INTRODUCCIÓN / 46IMPORTANCIA / 46CALIDAD DEL AGUA / 46PURIFICACIÓN DEL AGUA / 47DESTILACIÓN / 47DESIONIZACIÓN / 48PH DEL AGUA DESTILADA / 48CONDUCTIVIDAD DEL AGUA / 48CUESTIONARIO / 49CRISTALERÍA DE LABORATORIO / 50INTRODUCCIÓN / 50COMPONENTES DEL VIDRIO / 50SUSTITUTOS MODERNOS DEL VIDRIO / 50CLASIFICACION / 51CARACTERIZACIÓN DE LOS DIFERENTES TIPOS / 52DE CRISTALERÍA / 52CRISTALERÍA GENERAL DE TRABAJO / 52CRISTALERÍA DE MEDICIÓN / 59MATERIALES DE PORCELANA / 63LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN / 64PREPARACIÓN PREVIA DE LA CRISTALERÍA / 65PARA SU ESTERILIZACIÓN / 65CUESTIONARIO / 67ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN / 68INTRODUCCIÓN / 68TÉRMINOS EMPLEADOS RELACIONADOS CON LA ESTERILIZACIÓN Y LA DES-INFECCIÓN / 68

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ESTERILIZACIÓN / 68EL CALOR / 69PROTOTIPO STANDARD DEL AUTOCLAVE / 70MANIPULACIÓN DEL AUTOCLAVE / 71CALOR HÚMEDO A 1000 C / 72CALOR HÚMEDO A MENOS DE 1000C / 74CALOR SECO / 74USO DEL HORNO / 75INCINERACIÓN / 76MECHEROS / 76LAS RADIACIONES / 79RADIACIONES IONIZANTES / 79RADIACIONES NO IONIZANTES / 80FILTRACIÓN / 81CARACTERÍSTICAS DE LOS FILTROS / 81PREPARACIÓN DE LOS FILTROS / 81DESINFECCIÓN / 83SELECCIÓN DE LOS DESINFECTANTES / 84CUESTIONARIO / 85EQUIPOS CALORIFICOS / 87INTRODUCCION / 87INCUBADORA / 87REQUERIMIENTO DE TEMPERATURAS / 87CLASIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS DE ACUERDO CON SUS NECESI-DADES DE OXÍGENO / 88INCUBACIÓN DE BACTERIA ANAEROBIAS / 90INCUBADORA PARA ANAEROBIOS / 92BAÑO DE AGUA CALIENTE. (BAÑO DE MARÍA) / 92CUESTIONARIO / 94MICROSCOPIO / 95INTRODUCCIÓN / 95MICROSCOPIO. CONCEPTO / 96DIFERENTES TIPOS / 96MICROSCOPIO ÓPTICO / 96CLASIFICACIÓN / 97SISTEMA MECÁNICO / 98PRINCIPIOS BÁSICOS / 109INDICACIONES PARA EL MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO / 111OTRAS VARIANTES DEL MICROSCOPIO ÓPTICO / 112MICROSCOPIO ESTEREOSCÓPICO / 117CUIDADO, LIMPIEZA Y MANTENIMIENTO DEL MICROSCOPIO / 119MICROSCOPIO ELECTRÓNICO / 121ESTRUCTURA DEL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO / 121

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FUNCIONAMIENTO / 123

CUESTIONARIO / 124INSTRUMENTOS MECÁNICOS / 126INTRODUCCIÓN / 126PIPETAS MECÁNICAS / 126PIPETA TIPO MARBURG / 127EQUIPOS ELECTROMECÁNICOS / 131LAS CENTRÍFUGAS / 131PRINCIPIO TÉCNICO / 133BALANCE DE LOS TUBOS / 133FUNCIONAMIENTO / 134EL ROTOR / 135DISEÑO DEL EQUIPO / 135FUNCIONAMIENTO / 136EL AGITADOR / 136DISEÑO DEL EQUIPO / 137FUNCIONAMIENTO / 137POTENCIOMETROS / 138ESTRUCTURA / 138ELECTRODOS / 139TIPOS DE ELECTRODOS / 139PRINCIPIO FUNCIONAL / 139MEDICIÓN DEL PH / 140PROCEDIMIENTO PARA EL MANEJO DEL POTENCIÓMETRO / 140CUESTIONARIO / 141BALANZAS / 143INTRODUCCIÓN / 143PRINCIPIO / 143DIFERENTES TIPOS DE BALANZAS / 143BALANZAS GRANATARIAS / 144FUNCIONAMIENTO / 145PROCEDIMIENTOS PARA EFECTUAR LA PESADA / 145CAJA DE PESAS / 146PRECAUCIONES / 147BALANXA DE UN SOLO PLATILLO (TIPO OHAUS) / 147BALANZA DE PRECISION O ANALÍTICA / 147BALANZA DE PRECISIÓN MECÁNICA / 148PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR LA PESADA / 150PRECAUCIONES / 151BALANZA DE PRECISIÓN ELÉCTRICA / 151FUNCIONAMIENTO / 153PESADA / 154DETERMINACIÓN DEL PESO / 155BALANZA ANALITICA DIGITAL / 156CUESTIONARIO / 156

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INSTRUMENTOS DE MEDICIÓN / 158

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NO VOLUMÉTRICOS / 158INTRODUCCIÓN / 158INSTRUMENTOS. DIFERENTES TIPOS / 158RELOJES / 158TERMÓMETROS / 159DENSÍMETROS / 160CUESTIONARIO / 161ACCCESORIOS, INSTRUMENTAL QUIRÚRGICO Y MATERIALES DE CURACIO-NES / 162INTRODUCCION / 162ACCESORIOS / 162GRADILLAS / 162CESTOS / 163SOPORTE UNIVERSAL / 163PINZAS DE SUJECCIÓN / 164TRÍPODE / 164MALLA DE AMIANTO / 165INSTRUMENTAL QUIRÚRGICO / 165MATERIALES DE CURACIONES / 166CUESTIONARIO / 167TOMA DE MUESTRAS / 168INTRODUCCIÓN / 168MUESTRA. CONCEPTO / 168MUESTRA REPRESENTATIVA / 168MÉTODOS DE CONSERVACIÓN / 169CALIDAD DE LA MUESTRA / 170INSTRUCCIONES AL PACIENTE / 172DIFERENTES TIPOS DE MUESTRAS / 172EXUDADOS / 172LÍQUIDOS ORGÁNICOS / 179SANGRE / 181LINFA / 182EXCRECIONES / 183FANERAS / 185PRODUCTOS PATOLÓGICOS / 185CUESTIONARIO / 186PREPRACIÓN DE MUESTRAS EN LÁMINAS PARA EXÁMENES MICROSCÓPI-COS / 187INTRODUCCIÓN / 187DIFERENTES MÉTODOS / 187PREPARACIÓN DE MUESTRAS EN LÁMINAS PARA EXAMEN MICROSCÓPICOEN FRESCO / 187MÉTODO DE LA GOTA COLGANTE / 188PREPARACIÓN EN LÁMINAS DE MUESTRAS COLOREADAS / 189

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CUESTIONARIO / 191COLORANTES Y COLORACIONES / 192INTRODUCCIÓN / 192CONCEPTO / 192FUENTES DE OBTENCIÓN DE LOS COLORANTES / 192COLORANTES NATURALES / 192COLORANTES SINTÉTICOS / 193CLASIFICACIÓN / 193AFINIDADES TINTORIALES / 194TOXICIDAD DE LOS COLORANTES. VENTAJAS Y DESVENTAJAS / 194METODOS DE COLORACIÓN / 195COLORACIÓN DE GRAM / 195COLORACIÓN DE "ZIEHL NEELSEN / 199CCOLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN (MODIFICADA PARA MYCROBACTERIUMLEPRAE) / 202COLORACIÓN FRAGELAR DE LEIFSON (MODICFICACIÓN DE CLARK) / 203COLORACIÓN DE CÁPSULAS / 204COLORACIÓN DE ESPORAS / 205CUESTIONARIO / 206MEDIOS DE CULTIVO / 208INTRODUCCIÓN / 208OBJETIVOS DE LA NUTRICION MICROBIANA / 208CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO / 208CONSISTENCIA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO / 212COMPUESTOS NUTRITIVOS BASICOS / 213ELABORACION DE MEDIOS DE CULTIVO / 217DISTRIBUCIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO / 220CONSERVACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO COMERCIALES / 222CONSERVACIÓN DE MEDIOS ELABORADOS / 222COMPROBACIÓN DE LA ESTERILIDAD DE LOS MEDIOS ELABORADOS / 223CUESTIONARIO / 223SIEMBRA E INCUBACIÓN / 225INTRODUCCIÓN / 225INSTRUMENTOS DE SIEMBRA / 225DIFERENTES TIPOS / 226MÉTODOS DE SIEMBRA / 227INCUBACIÓN / 232MANIFESTACIONES DEL CRECIMIENTO BACTERIANO / 233EN LOS MEDIOS DE CULTIVO / 233CULTIVO PURO / 233CULTIVO MIXTO / 233RESIEMBRA / 233CUESTIONARIO / 234PRODUCTOS QUÍMICOS Y BIOLÓGICOS PARA EL DIAGNÓSTICO / 235INTRODUCCIÓN / 235

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HIDRATOS DE CARBONO / 235INDICADORES / 236SANGRE Y HEMODERIVADOS / 237COLORANTES / 237PRODUCTOS QUÍMICOS / 238AMINOÁCIDOS / 238ANTIBIÓTICOS / 238SUEROS / 240ANTÍGENOS / 240LÁTEX / 241CUESTIONARIO / 241GARANTÍA DE LA CALIDAD / 243INTRODUCCIÓN / 243OBJETIVOS / 243DIFERENTES TIPOS DE CONTROL / 244PRUEBAS ESTADÍSTICAS / 245PRINCIPALES FUENTES DE ERRORES / 245MANUAL DE NORMAS Y PROCEDIMIENTOS / 246REGULACIONES DEL CONTROL DE CALIDAD / 247EN BACTERIOLOGIA / 247CONTROL DE EQUIPOS E INSTRUMENTOS / 247CONTROL DE MEDIOS DE CULTIVO / 248CONTROL DE COLORANTES Y REACTIVOS / 248CONTROL DE DISCOS PARA ANTIBIOGRAMA / 249CONTROL DE ANTÍGENOS Y ANTISUEROS / 249CONSERVACIÓN DE CEPAS PARA EL CONTROL BIOLÓGICO / 249DEL LABORATORIO DE REFERENCIA AL LABORATORIO QUE SERÁ EVALUADO / 251DEL LABORATORIO DE LA UNIDAD AL LABORATORIO DE REFERENCIA / 251CUESTIONARIO / 253REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS / 254

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PREFACIO

Como parte de la política del estado cubano de universalizar la enseñan-za, los cursos de técnicos medios de la salud que durante casi 4 décadasse impartieron, en más de 20 especialidades, en los institutos politécnicos,creados al efecto en todo el país, fueron diseñados como carreras univer-sitarias, a partir del curso 2003-2004, mediante un nuevo modelo peda-gógico que comprende dos niveles de formación intermedia: técnico básicoy técnico medio, culminando la formación universitaria como licenciadoen tecnología de la salud en diferentes perfiles.

Los planes de estudio se han sustentado en la modalidad de estudio-trabajo,lo que permite a los estudiantes desarrollar progresivamente las habilidadesen los propios escenarios donde se encuentran los diferentes servicios desalud, bajo la asesoría de profesionales y técnicos de experiencia, con lo quese pretende que adquieran la capacitación adecuada para brindar un servi-cio de excelencia a nuestra población, así como desempeñarse con eficacia ycompetitividad en cualquier otro país donde se requiera su colaboración.

Como apoyo al diseño curricular del perfil de microbiología, hemos edita-do este libro de texto para que sea utilizado como bibliografía básica en elestudio de la asignatura Fundamentos y Principios Básicos del Laborato-rio de Microbiología.

Cada tema ha sido abordado con una proyección tecnológica, atendiendoa los contenidos del programa y el perfil de salida de los egresados, paralo cual se tuvo en cuenta precisar la particularidad utilitaria de cadaequipo, instrumento, accesorios y otros materiales de trabajo, así como,todo lo concerniente a su descripción estructural estándar y sus varian-tes, la función de cada una de las partes y su interacción con el resto delsistema, el principio de su funcionamiento y el algoritmo de trabajo, ade-más de todo lo concerniente a su cuidado y conservación.

En los capítulos correspondientes a los procederes de laboratorio, cadaaspecto ha sido explicado pormenorizadamente, de manera que, siguien-do al pie de la letra las instrucciones que se proporcionan, los estudiantespueden realizar sin contratiempos los procederes en cuestión.

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Al finalizar cada tema se ha incluido un cuestionario de preguntas, con elobjetivo de que sea utilizado como guía de estudio individual o colectivo.Esperamos que este texto te sea de utilidad en el proceso de aprendizaje,no solo para alcanzar buenos resultados docentes, sino más bien, comouna herramienta que te proporciona una capacitación perdurable, sobreel que se sustente tu desempeño profesional, que es, en definitiva, el obje-tivo esencial de tu formación.

Los autores

CAPITULO 1

EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

INTRODUCCIÒN

Los laboratorios son edificados especialmente diseñados, para la realiza-ción de experimentos, investigaciones científicas o el análisis de diferentes mues-tras, así como, para la producción de medicamentos, reactivos o la obtención deproductos biológicos.

Como parte del Sistema Nacional de Salud, en Cuba, existen diferentestipos de laboratorios, por ejemplo:

Laboratorio Clínico

La actividad básica que se realiza en este tipo de laboratorio es la de recibirlas ordenes de análisis del médico de asistencia, tomar y recibir muestras bioló-gicas, tales como: sangre, líquido cefalorraquídeo, jugo gástrico, orina, etc, a lascuales se les realizan análisis bioquímicos, hematológicos, serològicos, etc. Paradeterminar sus alteraciones en relación con sus valores de referencia. Realizaanálisis de urgencia e informa los resultados.

Laboratorio de Medicina Transfusional

El laboratorio de Medicina Trasnfusional, recibe indicaciones y solicitudesmédicas, toma y recibe muestras biológicas, realiza sangrías a donantes, análisisinmunohematológicos y serológicos e informa los resultados. Transfunde san-gre total o sus derivados. Y obtiene y procesa componentes de la sangre parauso terapéutico o de investigaciones. Cumple indicaciones de urgencia e infor-ma los resultados.

Laboratorio de Rayos X

El Laboratorio de Rayos X, recibe indicaciones médicas, administra con-traste a los pacientes, para las investigaciones que así lo requiera, realiza exá-menes radiológicos convencionales o mediante la utilización de técnicas modernas

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de imagenología, para detectar alteraciones anatomofibiológicas en partes blan-das u óseas del organismo asi como la presencia de cuerpos extraños. Cumpleindicaciones de urgencia e informa los resultados.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA. GENERALIDADES

Actividades fundamentales

El laboratorio de microbiología clínica, recibe indicaciones médicas, toma yrecibe muestras biológicas a las que realiza investigaciones microbiológicasmediante exámenes microscópicos directos y por cultivos, con el objetivo deidentificar a los agentes causales de las infecciones estudiadas, precisar sucuantía en los casos que así se requiera o demostrar la presencia de anticuerposevocadores de la presencia del agente etiológico en cuestión.

El servicio de microbiología, proporciona al medico de asistencia, informa-ción precisa relacionada con la sensibilidad o resistencia del agente infeccioso alos diferentes antibióticos, con lo cual aporta un dato de inestimable valor para laindicación del tratamiento

También brinda apoyo especializado al Comité de Prevención y Control delas Infecciones Nosocomiales (infecciones intra hospitalarias) originadas en elhospital u otro establecimiento de atención de salud.

Recursos humanos

El personal de los laboratorios de microbiología clínica, esta compuesto porprofesionales universitarios; médicos especialistas de 1er o 2do. grado(microbiólogos), Ms.C. o Licenciados en microbiología, así como bioquímicos,biólogos y otros tecnólogos, ademas de técnicos medios, especializados o no,personal de oficina y auxiliares generales entrenados.

Estructura administrativa

Todos los laboratorios están gerenciados por un jefe de servicio, cargo queocupa generalmente un médico especialista o en su defecto otro profesional.

Las diferentes secciones están dirigidas a su vez por diferentes profesionales.En la mayoría de los laboratorios, un técnico medio experimentado, se des-

empeña como jefe técnico, asumiendo determinadas funciones delegadas por eljefe de servicio.

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IMPORTANCIA DEL TRABAJODE LOS PROFESIONALES Y TÉCNICOSDE MICROBIOLOGIA

Dado el incremento actual de las enfermedades emergentes y reemergentes,así como el desarrollo cada vez más creciente de cepas resistentes a losantibióticos de uso tradicional, el trabajo de los profesionales y técnicos de mi-crobiología, adquiere cada día mayor protagonismo, al proporcionar datos exac-tos acerca de la identidad de los microorganismos en estudio, diagnósticadospor procedimientos habituales o de diagnósticos rápidos, así como mediantetécnicas serodiagnósticas de alta sensibilidad y por aportar el patrón de suscep-tibilidad a los antibióticos de los microorganismos en cuestión, todo lo cual am-plia la capacidad del diagnóstico médico a magnitudes que están fuera del alcancede los métodos clínicos, posibilitando la indicación de un tratamiento mas eficaz.

El perfeccionamiento del trabajo microbiológico se proyecta en dos direc-ciones:

1. La prestación de este servicio a toda la población del país, a nivel de laatención primaria, en policlínicos, así como en unidades hospitalarias o cen-tros especializados, ya que ha sido y es política de la Revolución que losservicios médicos sean accesibles a todos los ciudadanos. Para ellos, casitodos los hospitales y policlínicos cuentan con servicios de microbiología y enla actualidad se esta concretando un proyecto de estaciones microbiológicasdestinadas fundamentalmente al diagnostico mediante exámenes directores,en las investigaciones donde resulte factible, así como la toma y preservaciónde muestras en medios de transporte para su envió a los laboratorios dereferencia.

2. Mejorar la calidad del servicio, mediante el acceso a las tecnologías másmodernas, el perfeccionamiento en la formación de los profesionales del sec-tor y la superación científico-técnica de los graduados a través de diplomadosy cursos de post-grado, maestrías y doctorado.

ESTRATEGIA ORGANIZATIVA DE TRABAJO

Para lograr una buena eficacia en la realización de los procederes de labo-ratorio, resulta indispensable sistematizar una estrategia de trabajo, que permitaasegurar la calidad de los resultados, incrementar la productividad de las deter-

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minaciones y al mismo tiempo que proporcione una adecuada protección contraposibles accidentes.

Para el logro de estos propósitos el laboratorista debe cumplir con las si-guientes indicaciones:

Disposición de los materiales de trabajo

Seleccione todos los utensilios (escrupulosamente limpios o estériles) quese requieran para el trabajo a realizar (gradillas, tubos, pipetas, etc) y ubíquelosordenadamente sobre la mesa de trabajo, de manera que queden al alcance dela mano. En este sentido es importante tener la certeza de que no falte ningúnmaterial que implique tener que interrumpir el procedimiento para su localiza-ción, ya que además de ocasionar una pérdida de tiempo innecesaria, la discon-tinuidad de la marcha analítica, puede en algunos casos, introducir causas deerrores, por alteración del tiempo establecido en algún paso de la técnica y enconsecuencia afectarse los resultados.

Certeza de los medios reactivos o medios a emplear

a) Al seleccionar los reactivos, lea cuidadosamente la etiqueta del frasco paraevitar errores, cerciórese del nombre del reactivo, su concentración y que lafecha de vencimiento no haya caducado.

b) Verifique mediante un examen visual que no se encuentran alterados (preci-pitados, turbios, etc).

c) Cerciórese de que se le haya hecho control de calidad.d) Colóquelos en la mesa de trabajo en el orden en que serán utilizados.e) Al destaparlos coloque cada tapa delante del frasco correspondiente para

evitar errores al taparlo que impliquen su contaminación.

Ordenamiento de las muestras

Coloque las muestras en la mesa de trabajo por orden numérico de izquier-da a derecha.

Planificación del trabajo a realizar.

Siempre que resulte pertinente conviene planificar el trabajo a realizar en ellaboratorio, para aprovechar al máximo el tiempo disponible. Por ejemplo, si se

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van a preparar exámenes microscópicos directos de heces fecales, para la bús-queda de protozoos, por los métodos eocina y lugol, es conveniente hacer lasdos preparaciones por separados en una misma lamina portaobjetos, lo quefacilita la operatoria microscópica sin pérdida de tiempo al no tener que inter-cambiar láminas.

Concentración en el trabajo

Durante todo el tiempo que dure la ejecución del procedimiento, concentresu atención en cada paso de la técnica, evite interrupciones innecesarias y abs-téngase de mantener conversaciones ajenas a lo que esta haciendo. Trabajecon meticulosidad y esmero y aplique las medidas de asepsia cuando la determi-nación así lo requiera.

CUESTIONARIO

1. Especifique El concepto que Ud. tenga de lo que es un laboratorio.2. Nombre diferentes laboratorios que pertenezcan al Sistema Nacional de Sa-

lud.3. Refiérase a las actividades fundamentales que se realizan en un laboratorio

de microbiología clínica.4. Indique las diferentes categorías ocupacionales del personal que labora en un

laboratorio de microbiología.5. Explique la estructura administrativa de los laboratorios.6. ¿En que radica la importancia del trabajo de los profesionales y técnicos de

microbiología?7. Explique cada uno de los indicadores establecidos para la estrategia

organizativa del puesto de trabajo.

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CAPÍTULO 2

BIOSEGURIDAD

INTRODUCCIÒN

Los profesionales y técnicos de la salud que laboran en unidades hospitala-rias, policlínicos, etc o en centros de investigaciones biomédicas, están expues-tos, por la naturaleza de su trabajo, a diversos riesgos profesionales, que puedenclasificarse según su origen en:

Riesgos físicos

Ocasionados regularmente por, traumas, exposiciones al calor, la electrici-dad, las radiaciones, etc.

Riesgos químicos

Originados por el manejo con sustancia inflamables, corrosivas, tóxicas,cancerigenas, etc.

Riesgos biológicos

Debido a la manipulación frecuente de pacientes infectados, el manejo deproductos sépticos y el nivel de contaminación ambiental predominante en elámbito hospitalario, especialmente en los laboratorios donde se realizan exáme-nes de sangre, líquidos corporales, excreciones y productos patológicos.

BIOSEGURIDAD. CONCEPTO

Es la disciplina que se ocupa de la prevención y control del riesgo biológicoal que están expuestas, directa o indirectamente las personas, los animales y lasplantas como consecuencias de accidentes o negligencias, en los laboratoriosde microbiología, clínicos, etc. Así como en la industria biotecnológica y el tra-bajo con organismo transgénicos.

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DAÑO INDIVIDUAL Y COMUNITARIO.PRINCIPALES CAUSAS

Los accidentes imprevistos y el deficiente desempeño del personalocupacionalmente expuesto, son las principales causas del daño individual quebajo determinadas circunstancia, puede extenderse al entorno hospitalario o a lacomunidad, ocasionando diversos grados de afectaciones médicas, veterinariaso fitosanitarias con el consiguiente perjuicio económico o ecológico.

NIVELES DE RIESGO BIOLOGICO

Cuadro 1: Diferentes niveles de riesgo biológico.

Los niveles de riesgo para un laboratorio básico, son los de tipo I y II.

R I E S G O CARACTERIZACIÒN DE LOS AGENTES PATÓGENOS INVOLUCRADOS

INDIVIDUAL COMUNITARIO

I ESCASO ESCASO TIENEN POCAS PROBABILIDADES DEPROVOCAR ENFERMEDADES EN LOSSERES HUMANOS Y EN LOS ANIMALES

PUEDEN PROVOCAR ENFERMEDADESEN LOS SERES HUMANOS Y EN LOSANIMALES.

II MODERADO LIMITADO TIENEN POCAS PROBABILIDADES DEENTRAÑAR RIESGOS GRAVES PARA ELPERSONAL DEL LABORATORIO,LA COMUNIDAD, LOS ANIMALESY EL MEDIO AMBIENTE.SU EXPOSICIÓN EN EL LABORATORIOPUEDEN PROVOCAR INFECCIONES GRAVES.

III ELEVADO ESCASO PUEDEN PROVOCAR ENFERMEDADESGRAVES EN SERES HUMANOS.GENERALMENTE LA INFECCIÓN NO SEPROPAGA DE UN INDIVIDUO A OTRO.

IV ELEVADO ELEVADO PUEDEN PROVOCAR ENFERMEDADESGRAVES EN SERES HUMANOS Y EN LOSANIMALES.PUEDEN PROPAGARSE FÁCILMENTE DEUN INDIVIDUO A OTRO, DIRECTA OINDIRECTAMENTE.

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PRINCIPIOS BÁSICOS

Los principios básicos, regidos por las normas de bioseguridad para la pre-vención y control del riesgo biológico son los siguientes:

1. La correcta realización de las técnicas de laboratorio.2. El empleo sistemático de los equipos y medios de seguridad.3. El diseño adecuado de los laboratorios.

Para dar cumplimiento a estos principios se establece en el reglamentoun código practico, con las indicaciones y regulaciones a cumplimentar porel personal de laboratorio, que serán expuestas resumidamente a continua-ción.

Para la correcta realización de las técnicas de laboratorio

a) Regulaciones básicas.- Aplicar rigurosamente las medidas de asepsia y antisepsia en todas las

ocasiones en que la acción a realizar así lo requiera.- Los instrumentos de siembra de platino o nicròn, se deben esterilizar a la

llama del mechero, antes y después de su uso. A los efectos de evitarsalpicaduras del material residual empleado, el instrumento debeintroducirse gradualmente en la llama del mechero hasta ponerse al rojovivo.

- Los frotis coloreados, así como los portaobjetos, cubreobjetos y pipetasutilizadas se depositaran en recipientes apropiados que contengan solu-ción desinfectante.

- Los procederes técnicos han de realizarse de manera que se evite en loposible la formación de aerosoles siendo las causas mas frecuentes lassiguientes.

. Flameos de instrumentos de siembra contaminadas con productosbiológicos infecciosos.

. Pipeteo energético.

. Retirar la aguja de las jeringuillas que contengan material contami-nado.

. Apertura de cultivos liofilizados en ámpulas.

. Abrir la tapa de la centrífuga antes de que esta se detenga o deinmediato, cuando se ha centrifugado muestras biológicas o materialcontaminado.

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. La caída brusca de las placas o tubos de cultivos, aún cuando nollegaran a romperse.

Los tubos de ensayo que contengan cultivos, deben mantenerse siempreen posición vertical en una gradilla. Nunca dejarlos en posición horizontal, yaque el agua de condensación puede arrastrar los gérmenes del cultivo, hume-decer los tapones de algodón y contaminar la mesa de trabajo.

Los cultivos en placas deben mantenerse con la tapa hacia abajo en elinterior de la incubadora o sobre la mesa de trabajo.

b) Higiene del laboratorio y el personal.- Mantener el laboratorio escrupulosamente limpio, retirando del mismo

material que no tenga relación con el trabajo.- Las superficies de las mesetas se descontaminaran al menos una vez al

día y en caso de derramamiento de sustancia potencialmente peligrosasde inmediato.

- Velar por el cumplimiento del programa de lucha contra insectos y roedores.- En las zonas de trabajo del laboratorio, no comer, beber, fumar, guardar

alimentos ni aplicar cosméticos, realizando estas actividades solamenteen las áreas autorizadas.

- No humedecer las etiquetas de los frascos con la lengua.- Lavarse las manos después de haber manipulado pacientes, material con-

taminado, o animales y al retirarse del laboratorio (ver mas adelante,procedimiento para el lavado de manos).

Empleo sistemático de equipos y medios de seguridad

- Utilizar bata sanitaria u otras prendas apropiadas cuando la envergaduradel trabajo así lo requiera, como: batones, botas, nasobucos, etc.

- Emplear guantes quirúrgicos en todo trabajo que entrañe contacto consangre, material infecciosos o animales infectados. Los guantes se de-ben retirar asépticamente y ser esterilizados en autoclave.

- Utilizar pipetas mecánicas para manipular líquidos infecciosos. Nuncapipetear con la boca esos productos peligrosos.

- Siempre que sea necesario, proteger los ojos y la cara de salpicaduras eimpactos mediante gafas de seguridad, viseras, pantalla facial u otrosdispositivos de protección.

- Cuando la naturaleza del trabajo a realizar así lo requiera, recurrir alempleo de campanas químicas, gabinetes, o cabinas de seguridad.

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- Utilizar incineradas de asas microbiológicas.

El diseño adecuado de los laboratorios

Debido a los diversos riesgos implícitos en las investigaciones microbiológicas,la construcción o adaptación de un laboratorio de microbiología clínica, requiere decondiciones especiales que propicien el establecimiento de una organización de tra-bajo, que permita al personal del laboratorio, el cumplimiento estricto de las normasde asepsia y antisepsia establecidas para la manipulación de los pacientes, el manejoy control de los microorganismos presentes en las diferentes muestras y cultivosdurante el proceso de la investigación, así como, el de los gérmenes ambientales ocontaminantes que por diversas vías pueden tener acceso a las áreas de trabajo.

Dentro de los requerimientos esenciales del diseño constructivo se encuen-tran los siguientes.

1. Como medida de seguridad, la construcción de un laboratorio de microbiolo-gía se hará en un área separada de locales destinados a otros fines.

2. Las paredes, en especial la parte inferior, el piso y el techo, deben ser lisos,sin grietas o ralladuras donde se pueda acumular la suciedad y el polvo quedificulten su limpieza y desinfección.

3. Casi todas las salas o cubículos del laboratorio dispondrán de mesetas,generalmente empotradas en las paredes o instaladas en el centro del local.Las mesetas deben ser construidas con acero inoxidable u otro material simi-

Fig. 1 : Equipos y medios de seguridad: a) Incinerador de asas, b) Guantes de polietileno,Lentes de seguridad, d) Nasobuco.

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lar que propicie un terminado de su superficie liso y sin poros y que sea al mismotiempo muy resistente a la acción de los ácidos, álcalis y sustancias corrosivas, demanera que puedan ser desinfectadas o esterilizadas por métodos físicos o quími-cos sin que se deterioren. La superficie de estas mesetas no deben reflejar exce-sivamente la luz para que no interfiera la lectura de algunos exámenes ni afectecon el tiempo la vista del laboratorista.Las que sean destinadas para trabajar senta-do, tendrán una altura de 75 a 80 cm de altura por 60 cm de ancho, no debiendoexistir ninguna construcción debajo que dificulte la colocación de las piernas y solode ser necesario podrá disponer de una gaveta. Las destinadas para trabajar depie tendrán una altura de 85 a 90 cm de alto y el mismo ancho que la anterior.Estas mesetas generalmente están provistas de gavetas y estantes con anaque-les, destinados a la colocación de la cristalería, los frascos con reactivos coloran-tes, medios de cultivos, así como otros materiales e instrumentos.

4. Las ventanas deben estar situadas a unos 30 cm, mínimo, por encima de laaltura de las mesetas para evitar la exposición directa del aire y el polvoprocedente del exterior.

5. El laboratorio dispondrá de instalaciones de : agua, electricidad, aire y gas. Elgrado de iluminación y ventilación se debe adecuar a las normas establecidaspara locales cerrados o abiertos, atendiendo a la cantidad de personas pre-vistas, que estarán presentes en un turno de trabajo.

Caracteres estructurales

La estructura de un laboratorio de microbiología, dependerá esencialmentede la disponibilidad de espacio. En aquellos laboratorios que cuenten con sufi-

Fig. 2 : Disposición de las mesetas en el laboratorio.

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cientes salas y cubículos, las actividades suelen ser compartimentadas en lassiguientes áreas o secciones de trabajo:

- Sala de recepción y archivo.- Cubículo para las tomas de muestras.- Sala principal de trabajo.- Cuarto de siembra.- Cubículo para la preparación de medios de cultivo, reactivos y colorantes.- Cubículo para la esterilización y preparación de materiales.

La sala de recepción y archivo, debe estar a la entrada de la edificación yel resto de las secciones de trabajo, se ubicará estratégicamente en el interiordel laboratorio, de menor a mayor nivel de contaminación. (áreas bio limpias obio sucias) con esta estrategia, los pacientes, familiares y visitantes no tendránacceso a las áreas de riesgo, siendo limitado para el resto del personal dellaboratorio y otros visitantes, no relacionados con la actividad que se realiza enesas secciones de trabajo, todo lo cual está encaminado a reducir la probabili-dad de posibles propagaciones de agentes patógenos por todo el laboratorio y lacomunidad.

Sala de recepción y archivo

En esta sección, un personal de oficina entrenado, recepciona las órdenesde análisis entregadas por los propios pacientes o enviadas desde las salas de launidad hospitalaria, en caso de pacientes encamados, o procedentes de otrasunidades de salud vinculadas al centro, donde se procederá a asentar en el librode registro de entrada, el numero, que consecutivamente le corresponde a esasolicitud, la fecha de registro, los datos del paciente (nombre y dos apellidos ynúmero de historia clínica), la procedencia (consulta externa, sala donde seencuentra hospitalizado o unidad de salud que hace la solicitud), y el tipo deinvestigación que se indica.

Fig. 3 : Libro de registro.

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En un pequeño cuadrante que se encuentra impreso en el ángulo superiorderecho de la orden de análisis se notara el número asignado en el registro deentrada.

Cuando la orden se entrega conjuntamente con la muestra (orina, heces,esputo, etc) en los frascos se anota con lápiz cristalográfico, el mismo númerode registro. Como medida de seguridad, los frascos que contienen muestras nodeben estar en contacto con las órdenes de análisis, dada la posibilidad de quese haya producido algún derramamiento durante su recolección en cuyo caso, lamanipulación ulterior de las ordenes pueden propiciar una vía de contagio.

Si se tratara de un tipo de muestra que deba ser tomada en el laboratorio(exudados, lesiones infecciosas en la piel, etc) después de registrada, la orden leserá devuelta al paciente, quien la entregara al técnico que le vaya a tomar lamuestra.

Concluida la investigación, los resultados serán debidamente informados enla orden de análisis, por el técnico que realizó el examen, quien la firmará yanotara la fecha de realización, debiendo reintegrarla a la sección de recepcióny archivo, donde se anotará los datos en el libro de registro de resultados, lo quepermitirá en caso de extravío de la orden, emitir un duplicado. Las ordenes conlos resultados serán enviadas al Dpto. de archivo de la unidad hospitalaria paraque sean archivados en las historias clínicas o en el laboratorio cuando debanser recogidas por los interesados.

Si el examen no se puede realizar y se solicite su repetición, en la orden deanálisis se especificaran las causas (muestras escasa, muestra contaminadas,suero hemolizado, etc).

Además de estos datos primarios que se registran diariamente, la sección dearchivo tiene la función de procesar un resumen bioestadístico mensual con los resul-

Fig. 4 : Orden de análisis.

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tados de cada tipo de investigación y adicionalmente llevar un control estadísticoestablecido por los programas de enfermedades de transmisión sexual y tuberculosis.

Cubículos para las tomas de muestras

En este local, el laboratorista dispondrá de los recursos necesarios (guan-tes, hisopos estériles, instrumentos de siembra, mechero, etc, etc) para la tomade las diferentes muestras (exudado faringeo, óptico, conjuntival, etc) debiendocontar con la privacidad requerida y las condiciones necesarias, para la toma delexudado vaginal, uretral, etc tales como parabanes, camillas ginecológicas, etc).

Sala principal de trabajo

Esta sala puede contar de uno o varios cubículos, constituyendo cada uno deellos, una sección de trabajo independiente, en la que se realizan determinadas in-vestigaciones, por ejemplo: Urocultivo, coprocultivo, misceláneas, tuberculosis,parasitología, serología, etc. En algunas unidades, particularmente, centros munici-pales o provinciales, pueden existir otras secciones especializadas para la investiga-ción de lepra, leptospirosis, etc. Cada sección contará con los recursos necesariospara la realización de esas investigaciones especificas, tales como: preparación ycultivo de las muestras, tinciones, observaciones microscópicas, pruebas de iden-tificación, etc. Estas secciones de trabajo deben estar climatizadas.

Cuarto de siembra

Generalmente los laboratorios pequeños que disponen de una sala principalen un único local tienen anexado un pequeño cubículo que es donde radica elcuarto de siembra. Este cuarto esta provisto de mesetas y de todos los materialese instrumentos para la realización de siembras, resiembras y de aquellas activida-des que requieran de una estricta asepsia, así como de una lámpara de luz ultravioletapara la esterilización del medio ambiente, o la superficie del inmueble y el mobilia-rio. Al igual que la sala principal de trabajo, debe estar climatizado.

Cubículo para la preparación de medios de cultivos, reactivos y colo-rantes

Este local estará equipado con balanzas, baño de María, potenciómetro,refrigerador, etc., así como de la cristalería y otros accesorios para estos fines.

En sus estantes y anaqueles se almacenará el stok de productos químicos,medios de cultivos y otros reactivos y colorantes, debiendo contar con una colec-ción de cepas microbianas certificadas para la realización del control de calidad.

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Cubículo para la esterilización y preparación de materiales

Este local se destina para la realización de diversas actividades, entre lasque se encuentran las siguientes.

. Limpieza y desinfección de la cristalería y otros materiales, incluyendosu secado.

. Empaquetamiento y preparación de la cristalería y otros materiales parasu esterilización.

. Esterilización.

. Destilación de agua.

Limpieza y desinfección de la cristalería y otros materiales, incluyendosu secado

En este local se instala una meseta con tres fregaderos colindantes; en elprimero se friega la cristalería con detergentes especiales y agua abundanteempleando hisopo de tamaño apropiado. En el segundo de enjuaga, con aguacruda y en el tercero con agua destilada. Las pilas de estos fregaderos debenestar lo suficientemente altas como para permitir el enjuague de las pipetas enposición vertical.

En un área de este local se situara un recipiente grande con solución desin-fectante o sulfocromica con el objetivo de sumergir la cristalería que asi lorequiera.

Empaquetamiento y preparación de la cristalería y otros materiales parasu esterilización

La cristalería de trabajo y otros materiales que vayan a ser sometidos a unproceso de esterilización, en horno o autoclave, deben ser previamente taponados

Fig. 5 : Hisopo para la limpieza de la cristalería.

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con algodón y/o empaquetados con papel de estraza, para evitar su posteriorcontaminación una vez estériles, por las manipulaciones ulteriores y losmicroorganismos presentes en el medio ambiente.

Esterilización

El local debe estar dividido en dos áreas; una para esterilizar el materiallimpio y la otra para esterilizar el material sucio. Como se comprenderá serequieren de dos autoclaves.

El área para el tratamiento del material limpio contará al menos con unhorno que además de ser utilizado para la esterilización se puede emplear parael secado.

Destilación de agua

Generalmente, los laboratorios que disponen de destiladores metálicos, losinstalan en este lugar (Área limpia) procediendo a la destilación y recoleccióndel agua destilada en botellones con tapón de goma.

El flujo de trabajo en esta sección es el siguiente: entrada del material sucio,esterilización, fregado, preparación y esterilización del material limpio.

Fig. 6 : Destilador metálico de agua.

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MEDIDAS DE PREVENCIÓN

1. El personal del laboratorio recibirá, a través de su director una minuciosainformación acerca de:

a) Las medidas de seguridad establecidas.b) La existencia y localización de un manual de seguridad y de operaciones

en el que se identifiquen los riesgos actuales y potenciales y se indiquenlos procedimientos para su reducción.

c) Los riesgos mas probables que pueden ocurrir debido al tipo de investi-gaciones que se realizan en ese laboratorio.

2. A todos los miembros del personal del laboratorio y demás personas expues-tas se les tomara muestras de sangre periódicamente y con el suero se reali-zaran determinaciones que servirán de referencia en función de los agentesinfecciosos manipulados.

3. Durante el horario de trabajo las puertas del laboratorio permanecerán cerra-das y solo tendrán acceso el personal del laboratorio y las personas autoriza-das que hayan sido debidamente informadas sobre los posibles riegos y satis-fagan cualquier requisito que se exija para tener acceso, como por ejemplo lainmunización actualizada. No se permitirá la presencia de niños en las zonasde trabajo del laboratorio.

4. No se permitirá tampoco la entrada en el laboratorio de animales que notengan relación con el trabajo que se esté realizando.

PRECAUCIONES A TENER EN CUENTA PARA LADESINFECCIÓN DE JERINGUILLAS Y AGUJAS REUSABLES,ANTES DE SU ESTERILIZACIÓN

1. La manipulación se hará siempre con guantes quirúrgicos estériles observan-do un cuidado extremo para evitar pinchazos o cortaduras.

2. Dejar las agujas colocadas en la jeringuillas.3. Sumergir la jeringuilla con la aguja ensamblada, en posición horizontal, en el

interior de una bandeja que contenga solución desinfectante y exponerla a suacción por un espacio de tiempo no menor de 20 minutos.

4. Descargar la solución desinfectante contenida en la jeringuilla a través de laaguja.

5. Enjuagar la jeringuilla y la aguja con agua (llenar y vaciar). Observar que noqueden restos de sangre ni manchas.

6. Examinar la aguja y la jeringuilla cerciorándose de que el ajuste de la boquillade la aguja a la jeringuilla es adecuado y que las marcas volumétricas semantienen legibles.

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7. Secar y proceder a empaquetar las agujas y las jeringuillas por separado condoble envoltura para su esterilización en autoclave.

INDICACIONES EN CASOS DE ACCIDENTE

En caso de derrame de muestras biológicas o material contaminado

a) Colocarse guantes quirúrgicos.b) Cubrir la sustancia derramada con material absorbente (algodón, papel de

filtro, etc).c) Aplicar solución desinfectante de hipoclorito de calcio o sodio al 1% alrede-

dor del derrame y sobre el material absorbente esperar de 10 a 20 minutos.d) Remover el material absorbente y colocarlo en un contenedor destinado para

materiales contaminados.e) Limpiar nuevamente el área contaminada con el desinfectante y posterior-

mente con detergente y agua abundante.

Fig. 7 : Desinfección de muestras biológicas o material infeccioso derramado accidental-mente: a)Cubrir el área con un material adsorbente, b)Aplicar solución desinfectante,c)Remover el material infeccioso, d)Aplicación nuevamente de desinfectante, e) y f)Limpieza con agua y detergente.

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En caso de lesiones o contacto no protegido con material contami-nado o muestras biológicas

a) Lavar de inmediato la lesión con agua y jabón.b) Estimular el sangramiento, para arrastrar mecánicamente a los agentes in-

fecciosos.c) Aplicar una solución desinfectante débil de hipoclorito de sodio o calcio. Cu-

rar y cubrir la lesión.d) Para continuar el trabajo colóquese un débil o guante.e) En caso de salpicaduras de sangre en los ojos o la boca, debe irrigarse de

inmediato con cantidades de agua abundantes o solución salina fisiológica.f) Los derrames accidentales, punturas, lesiones o exposiciones con muestras o

material contaminado, deben ser comunicados lo antes posible al jefe del labo-ratorio, quien registrará el hecho en el libro de control que existe al efecto.

g) El jefe de Dpto. verificara la procedencia de la muestra y si comprueba queel instrumental estaba contaminado con sangre o liquido corporal de un en-fermo o portador de VIH, lo notificara al Dpto. de Epidemiología y orientaráal trabajador que reporte cualquier síntoma febril agudo, sobre todo si esacompañado de rash, diarreas o adenopatías que ocurra dentro de las 12semanas con posterioridad a la exposición. El personal accidentado debe serpuesto en observación epidemiológica que incluya pruebas para detectaranticuerpos contra el VIH que serán realizadas 6 semanas después de laexposición. Si la prueba es negativa, se repite a los 3 meses y con esa perio-dicidad durante un año. Si al cabo de ese tiempo continua negativa se da, elalta epidemiológica.

LAVADO DE MANOS

Objetivo: Eliminar la micro biota transitoria y disminuir la residente o normalde las manos y los antebrazos.

Justificación: La medida básica mas importante, relacionada con la higienepersonal lo constituye sin lugar a dudas el lavado de manos. La manipulación delos pacientes o materiales, trae como consecuencia la contaminación de lasmanos y las muñecas pudiendo extenderse a los antebrazos, por lo que de nodebe aplicarse con sistematisidad estas medidas higiénicas al personal de lasalud puede propagar la infección de un paciente a otro y contribuir de estamanera al incremento de las infecciones nosocomiales.

En el lavado de manos intervienen elementos mecánicos y químicos. Elagua arrastra mecánicamente una parte de los microorganismo presentes en las

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manos, mientras que el jabón emulsiona las materias extrañas y reduce la ten-sión superficial de los gérmenes presentes lo que facilita su lisis, conjuntamentecon la eliminación de los ácidos grasos y la suciedad.

TIpos de lavado de manos

. Lavado social.

. Lavado higiénico.

. Lavado quirúrgico.

Lavado social de las manos

Concepto: Es la limpieza mecánica de las manos con agua y jabón conven-cional, que elimina todo tipo de suciedad visible.

Empleo: Siempre que se perciban las manos sucias, al realizar actividadesfisiológicas, personales o sociales que lo requiera y antes y después del contactocon pacientes en procederes no invasivos y sin riesgo.

Procedimiento

1. Retire las prendas de las manos y las muñecas.2. Abra la llave del agua y tome el jabón. Remoje las manos hasta las muñecas

y haga una abundante espuma.3. Con la punta de los dedos, enjuague el jabón y colóquelos en la jabonera.4. Cierre la llave con una de las manos y enjabónelas.5. Frote rigurosamente las manos con movimiento rotativo y haga que la espu-

ma se extienda hasta las muñecas.6. Abra la llave hasta que salga un chorro abundante de agua y enjuague las

manos y manténgalas en un plano horizontal.7. Junte las manos en forma de recipiente, llénelas de agua y enjuague la llave.8. Cierre la llave y séquese las manos con servilletas, papel o paño para cada

una, sin frotárselas.

Lavado higiénico o médico de las manos

Concepto: Es la limpieza mecánica de las manos con agua y jabón conven-cional, las que se frotan de forma enérgica se enjuagan abundantemente duran-te un minuto y después del secado se aplica solución antiséptica..

Empleo: Se utiliza ante las maniobras semicriticas, con el objetivo dearrastrar suciedades, evitar infecciones cruzadas y proteger al personal desalud.

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Procedimiento

1. Realice el lavado social de las manos hasta el paso en que se enjuaga la llavecon las manos juntas en forma de recipiente.

2. Moje las manos y antebrazos (5 cm por encima de las muñecas) enjabónelascon jabón convencional o bacteriostático y haga una abundante espuma.

3. Frote las manos de la siguiente forma:a) Palma con palma.b) Palma derecha sobre dorso de la mano izquierda o viceversa.c) Palma con palma intercalando los dedos.d) Dorso de los dedos flexionados para cada mano.e) Pulgar derecho con la mano izquierda y viceversa.f) Frotación de las yemas de los dedos sobre las palmas.g) Frote en forma circular la superficie de los antebrazos 5 cm por encima

de las muñecas.h) Realice un enjuague abundante y deje que el agua corra hacia los codos.i) Seque las manos y antebrazos con paños, servilletas o papel estéril (uno

para cada mano) apriete suavemente la piel sin restregar, comience porlas manos y finalice en los codos nunca regrese a las manos.

j) Aplicar solución antiséptica y déjela actuar sobre las manos por un tiem-po no menor de 2 minutos antes de la maniobra semicritica.

Lavado quirúrgico de las manos

Concepto: Es la limpieza mecánica de las manos con agua, jabón y cepillo,con utilización de solución antiséptica después del secado.

Empleo: Antes de cualquier maniobra critica.

Procedimiento

1. Realice el lavado social de las manos hasta enjuagar la llave con las manosjuntas.

2. Moje las manos y antebrazos hasta 2 pulgadas arriba del codo, enjabóneloscon jabón convencional en forma circular y haga una abundante espuma.

3. Frote las manos igual que para lavado higiénico incluyendo los antebrazos.4. Tomar un cepillo estéril para cada mano, aplíquele jabón y cepille bien las

uñas, lechos ungueales y la yema de los dedos.5. Enjuague bien sin dejar ningún residuo de jabón, mantenga las manos siempre

levantadas para que el agua corra hacia los codos.

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MANEJO DE DESHECHOS PELIGROSOS

Se debe establecer un sistema de identificación y separación de los mate-riales contaminados (y de sus recipientes).

a) Deshechos no contaminados que pueden eliminarse con la basura.b) Objetos aguzados y cortantes (agujas, jeringuillas, etc).c) Material contaminado para tratamiento en autoclave y reutilización.d) Material contaminado para su eliminación.

Objetos aguzados y cortantes: Las agujas hipodérmicas deben ser coloca-das en recipientes con paredes que no puedan traspasarse fácilmente. Cuandoestos estén llenos se colocaran dentro de otros recipientes para desechos con-taminados y se incineran, incluso cuando las normas de laboratorio consistan enesterilizarlos primero en autoclave.

Material contaminado para tratamiento en autoclave y reutilización: Estematerial se coloca en recipientes impermeables poco profundos que contengauna cantidad desinfectante suficiente para cubrir el contenido y se llevan alautoclave. No se efectúa ninguna acción previa; cualquier limpieza o repara-ción que se considere se hará después de esterilizados.

Material contaminado para eliminación: Todos los cultivos y materiales con-taminados suelen esterilizarse en autoclave, previamente introducidos en reci-pientes impermiables,antes de proceder a su eliminación. Después del tratamientoen autoclave puede colocarse el material en recipientes apropiados para el trans-porte al incinerador o a otro lugar de evacuación.

Lo mejor es poner los deshechos en un saco plástico que se introduce enuna caja de cartón, con lo que se puede incinerar el contenido y el continente.Si se utiliza recipientes especiales concebidos para el transporte, habrá quelimpiarlos y desinfectarlos después de descargar transporte, habrá que lim-piarlos y desinfectarlos después de descargar el contenido y antes de devol-verlos al laboratorio. Estos recipientes deben ser impermeables y estar provistosde tapa herméticas.

CUESTIONARIO

1. Nombre los diferentes tipos de riesgo a los que están expuestos los pro-fesionales y técnicos de microbiología en el ejercicio de su trabajo.

2. Enuncie el concepto de Bioseguridad.

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3. ¿Cuáles son las principales causas del daño individual?4. Especifique que elemento biológico resultan vulnerables de ser afectados

en la comunidad por negligencias o accidentes en un laboratorio que tra-baja con agentes biológicos peligrosos.

5. Caracterice los diferentes niveles de riesgo, en cuanto a la afectaciónindividual y comunitaria.

6. Mencione los principios básicos establecidos para la prevención y controldel riesgo biológico.

7. Refiérase a las medidas establecida para evitar la formación de aerosoles.8. Mencione las prohibiciones establecidas en el código practico o regla-

mento de estricto cumplimiento para el personal que labora en el labora-torio, que están encaminadas a evitar la ocurrencia de contagio infeccio-sos.

9. Describa como debe ser el diseño constructivo de un laboratorio de mi-crobiología.

10. ¿Qué instalaciones debe tener el laboratorio para su buen funcionamiento?11. Nombre las diferentes salas o cubículos con que se estructura un laboratorio

de microbiología.12. Especifique las característica constructivas que debe tener cada una de las

salas o cubículo, y su equipamiento.13. Indique cuales don las actividades que se realizan en cada sala o cubículo

del laboratorio.14. Precise las medidas de prevención que debe conocer el personal que labora

en los laboratorios.15. ¿Qué indicaciones se establecen en caso de accidente?.16. ¿Cuáles son las indicaciones a seguir en el caso de que se produzcan derra-

mes de muestras biológicas o material contaminado?17. Describa pormenorizadamente las normas establecidas para efectuar las

diferentes técnicas de lavado de manos.18. ¿Cómo se clasifican los objetos peligrosos antes de ser deshechos?19. Explique como usted procede con cada tipo de material u objeto contamina-

do, teniendo en cuenta su reutilización o eliminación.

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CAPITULO 3

ETICA MEDICA

INTRODUCCION

La sociedad está formada pro un conjunto de seres humanos que convivendentro un mismo ámbito cultural, relacionándose de un modo u otro, para obte-ner los medios de subsistencia necesarios (alimentos, vestidos, vivienda, instru-mentos de producción, etc.).

En todo sistema social impera un modo de producción que determina labase económica de esa sociedad, cuya estructura responde a los intereses de laclase dominante, mediante el establecimiento de relaciones de producción basa-da en la propiedad sobre los medios de producción que va a delimitar el grado deaccesibilidad a los bienes materiales y culturales de cada clase y/o capa socialexistente, lo que dependerá del lugar que ocupen en la escala social y el carác-ter privado o social de las fuerzas productivas.

Como una necesidad de las sociedades divididas en clases, surge el Estado;una organización política de la clase dominante que tiene como finalidad mante-ner el orden establecido y aplastar la resistencia de las clases antagónicas, paralo cual crea organizaciones represivas o políticas e instituciones productivas yde servicio que responden a sus intereses económicos o tienen el encargo deinfluir ideológicamente con iguales propósitos sobre la conciencia común (esta-do de opinión, juicios, criterios etc.) de la población, mediante la inculcación deideas, concepciones políticas, jurídicas, morales, estéticas,, religiosas, filosófi-cas, que en su conjunto forman la conciencia social.

A diferencia de las relaciones de producción que se forman independiente-mente de la voluntad del hombre, las concepciones ideológicas pasan primeropor la conciencia, antes de constituirse en patrones del comportamiento.

LA MORAL

La moral puede definirse, como el conjunto de convicciones, fundadas odogmáticas, que cada individuo incorpora a su escala de valores, debido a in-fluencias socioculturales y que se expresa mediante opiniones, representacio-nes, normas y evaluaciones sobre la regulación de la conducta de los individuos,constituyendo obligaciones con respecto a otros individuos, la familia, su clasesocial, la patria y el Estado, evaluando estas relaciones de buenas o malas, dejustas o injustas, de honestas o deshonestas etc. Y fijándolas en su concienciacomo principios o normas morales. La moral está condicionada por la base

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económica el régimen social, pero a la vez como otras formas de la concienciasocial incide y actúa sobre ella.

Al cumplir esta función, la moral no se apoya en leyes formales, sino en lafuerza de la persuasión y el ejemplo, en la autoridad moral de algunas personaso en la opinión publica de determinadas colectividades.

Como quiera que en la sociedad dividida en clases los intereses son contra-dictorios, existen en aquellas morales diferentes.

ETICA

La ética es la ciencia de la moral y de la moralidad.A diferencia de la moral, que surge y se desarrolla como resultado de las

relaciones de producción, estableciéndose como hábito o costumbre en la con-ciencia, la ética investiga científicamente las concepciones morales en su senti-do mas amplio y establece las regulaciones para su aplicación.

Para su estudio la ética se divide en. Teoría de la Moral y Ética Normativa.

Teoría de la moral

Investiga la esencia de la moral, su origen y desarrollo, las leyes a queobedece, sus normas y carácter histórico.

Ética normativa

Investiga el problema del bien y del mal, establece el código moral de laconducta, señala que aspiraciones son dignas, que conducta es buena y cual esel sentido de la vida.

En los últimos tiempos se ha incorporado una nueva modalidad denominadaMetaética, que investiga los enunciados éticos y su relación con la verdad.

ÉTICA MÉDICA

La ética médica es una manifestación de la ética general y se refiereespecíficamente, a los principios y normas que rigen la conducta de los profe-sionales y técnicos de la salud, así como de los trabajadores administrativos y deservicio que laboran en instituciones biomédicas.

Cuando los actos del personal médico o paramédico dan lugar, de manerairreversible, a afectaciones somáticas, psíquicas o morales en el paciente, susfamiliares o a la comunidad, se incurre en violaciones de la BIOETICA, con

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independencia de que la acción se haya producido de manera intencional oinconscientemente.

El comportamiento bioético, está regulado básicamente pro 4 principios: lano maleficencia, la justicia, la beneficencia y la autonomía. En el primero seestablece, no causar daño al paciente de manera intencional, por negligencia uomisión. El principio de beneficencia preconiza que todas las acciones y esfuer-zos deben estar encaminados a beneficiar al enfermo. En cuanto al principio dejusticia, establece la equidad, es decir, todos los pacientes tienen las mismasoportunidades de beneficiarse por igual, de los recursos y atención que presta lainstitución y por último, la autonomía, donde se respeta la decisión del pacientede someterse a acciones médicas o experimentales que puedan afectar su inte-gridad físico, psíquica o moral.

El carácter socialista del Sistema Nacional de salud de nuestro país, consti-tuye la base material sobre la que se sustenta la moral y la ética de los trabaja-dores de la salud, basados en los siguientes principios:

a) La voluntad política del estado cubano de crear una infraestructura queha permitido llevar los servicios médicos a todo el país, aún en las zonasmás apartadas y recónditas.

b) El carácter gratuito de la atención médica, tanto preventiva como curati-va en las instituciones de salud, con independencia del elevado costo quepueda tener para el Estado.

c) La disposición los profesionales y técnicos de la salud de participar enmisiones internacionalistas. Para brindar su colaboración en cualquierlugar del mundo.

Es por ello que en el ejército de nuestra función social debemos observarprincipios éticos - morales de profundo contenido humano, ideológico y patrióti-co, tales como; dedicar todos nuestros esfuerzos y conocimientos científicos ytécnicos al mejoramiento de la salud del hombre; trabajar consecuentemente allídonde la sociedad lo requiera; estar siempre dispuesto a brindar la atenciónnecesaria, con el elevado espíritu internacionalista.

Nuestra conducta en relación con el paciente y sus familiares, con el restode los trabajadores y estudiantes del sector y con la sociedad, debe estar basadaen la estricta observancia de los siguientes principios éticos:

En relación con el paciente y sus familiares

- Dedicar nuestros esfuerzos a la prevención, recuperación, rehabilitación ypromoción de la salud humana.

- Evitar que se produzcan daños a personas sanas o enfermas en los trabajosde investigación que realicemos.

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- Respetar el decoro, el pudor y la dignidad de las personas bajo nuestraatención.

- Propiciar una adecuada relación personal con el paciente que le inspire unbuen estado de ánimo y seguridad.

- Escuchar las preocupaciones y dificultades del paciente y sus familiares,darles la atención requerida y esforzarnos por viabilizar las soluciones posi-bles.

- Utilizar en todo momento de nuestras relaciones con los pacientes y fami-liares, un lenguaje claro, sencillo y comprensible, sin alardes de tecnicismosy erradicando cualquier expresión de mal gusto.

- Conservar el secreto profesional, teniendo en cuenta los intereses del pa-ciente siempre que ello no ocasione un perjuicio social ni ponga en peligrola salud de otras personas.

- No divulgar aspectos de la enfermedad que puedan estar relacionados conla vida intima del paciente o sus familiares.

- Mantener en los casos de enfermedades de curso fatal absoluta o relativareserva sobre el diagnóstico y pronóstico en relación con el paciente.

- Abstenerse de realizar trabajos investigativos con los pacientes sin su con-sentimiento.

- Atender, de forma solícita, a toda persona que recabe nuestros servicios,sin mostrar prisa o indiferencia hacia sus padecimientos, ni hacer comenta-rios indiscretos en su presencia.

- Evitar que lleguen a manos de los pacientes o de sus familiares las historiasclínicas, informes de laboratorio o cualquier otro documento que pueda dar-le indebida o perjudicial información.

- Exigir, de aquellos trabajadores que nos están subordinados, la conductaadecuada ante el paciente y sus familiares y en el mismo sentido actuarsobre aquellos que, aunque no estén subordinados, intervienen de una for-ma u otra en el trato con los pacientes.

- Cuidar de no incurrir en el error técnico que resulta de una equivocación,aunque no exista mala fe, ni elementos de negligencia, despreocupación eignorancia, evitando a toda costa que nuestro trabajo se afecte por elapresuramiento, la superficialidad o la rutina.

- Los errores técnicos deben ser conocidos y analizados críticamente en re-uniones del departamento con la libertad y profundidad necesaria que per-mitan derivar de ellas la experiencia que impidan su repetición.

- Los profesionales y técnicos de la salud deben poseer la honestidad nece-saria para reconocer sus errores y eliminarlos.

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En relación con el resto de los trabajadores de la salud

- Mantener, para con nosotros mismos y con los demás profesionales y técni-cos de la salud, una actitud crítica y autocrítica sobre los asuntos referidos ala relación con los pacientes, cuidar que las opiniones y criterios se basen enel mas profundo análisis científico posible.

- Evitar indiscreciones que menoscaben el prestigio de otros compañeros oinstituciones del sistema de salud.

- Poner en conocimiento de las autoridades correspondientes cualquier viola-ción que nos conste, tanto de estos principios éticos como de los reglamentosestablecidos en las Unidades de Salud Pública.

En las relaciones entre el docente y los educandos

- El docente debe promover en sus alumnos los principios éticos, a través de lapalabra y su ejemplo.

- Propiciará que las relaciones entre el y sus educandos se enmarquen en ladebida autoridad y respeto que se requieren en la actividad docente.

- Prestar especial atención a su superación individual, teórica y práctica, comoaspecto esencial para el cumplimiento de sus responsabilidades docentes.

- Inducir en los alumnos la disposición de recibir entrenamiento especializadoen aquellas disciplinas que lo demanden, a fin de satisfacer las necesidadesde nuestro pueblo y las tareas internacionalistas que se requieran.

Como parte de la sociedad

- Ejercer con altruismo las actividades propias de su esfera de trabajo, subor-dinando el interés personal al social.

- Comportarse en todo momento con sencillez, modestia honestidad y dentrode las reglas de una elevada educación formal y política.

- Estar siempre en disposición de cumplir las obligaciones que le correspondancomo ciudadano, así como aquellas que, por razón del carácter excepcionalde nuestro trabajo, exija el mayor esfuerzo, dedicación y sacrificio.

- Actualizar y perfeccionar los conocimientos de forma continua, para lograr laoptima calidad de los servicios que prestamos a la sociedad.

- Procurar que la información que se ofrezca con propósitos de divulgacióncientífica y educativa sea correcta y adecuada, absteniéndose de emitir con-ceptos u opiniones que pueden alarmar innecesariamente a la ciudadanía.

- Mantener en todo momento un buen porte y aspecto personal, utilizando elvestuario adecuado en las diferentes áreas de trabajo.

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LAS COMISIONES DE ÉTICA MÉDICA

En todas las unidades del Sistema Nacional de Salud se crean las comisio-nes de Etica Medica, que de común acuerdo entre la administración y el sindi-cato, es elegida para un mandato de 2 años quedando integrado por 5 miembros,3 en activo y dos suplentes, que serán seleccionados entre los compañeros demás prestigio laboral científico, moral y político del centro.

Esta comisión es la encargada de conocer toda denuncia o quejas sobreviolaciones de la ética, realizando las investigaciones pertinentes en el plazo de20 días. En el caso de arribar al criterio de que se incurrió en violación de laética, trasladará su criterio a la dirección y al sindicato, los que a partir de esemomento actuarán de acuerdo con la legislación laboral vigente.

CUESTIONARIO

1. En su opinión ¿Qué cosa es la ética?2. ¿Cuáles son los aspectos generales de la ética médica?3. ¿Qué usted entiende por violaciones de la Bioética?4. ¿Cúales son los principios que regulan el comportamiento bioético?5. ¿Cúales son los principios éticos que regulan las relaciones entre el per-

sonal de la Salud con los pacientes y familiares?6. Refiérase a los principios éticos que se ponen de manifiesto en las rela-

ciones con otros trabajadores del sector y con los estudiantes.7. ¿Cómo se materializa el comportamiento ético cuando el profesional o

técnico se siente parte de la sociedad.8. ¿Qué son y cómo se crean las comisiones de ética médica?9. ¿Cuál es la competencia y el desempeño de los integrantes de las comi-

siones de ética médica en los centros de Salud?

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CAPÍTULO 4

EL AGUA

INTRODUCCIÓN

El agua es un líquido transparente, incoloro, inodoro e insípido. Se congela a00c, pasando al estado sólido y hierve a 1000c, pasando al estado de vapor deagua.

Químicamente está compuesta por 2 átomos de hidrógeno unidos a un áto-mo de oxígeno, formando la molécula una configuración especial no lineal, sinoangular, por lo que se clasifica el enlace como polar, lo cual propicia que sobreel átomo de oxígeno exista una cierta densidad de cargas negativas y sobre elhidrógeno una densidad de cargas positivas, lo que determina sus propiedadesdisolventes.

IMPORTANCIA

El agua es indispensable para la vida, por constituir el elemento esencial detodos los tejidos y líquidos orgánicos, siendo considerada como el solvente uni-versal para la disolución de una gran cantidad de solutos y otros compuestos enestado líquido. En el laboratorio, el agua es el reactivo más empleado, desempe-ñando un protagonismo esencial en las reacciones químicas, debido a que alionizarse se une a muchos óxidos, formando ácidos y bases con otros compues-tos para formar hidratos.

CALIDAD DEL AGUA

El agua tal y como se encuentra en la naturaleza no es pura. Durante lasprecipitaciones, el agua de lluvia se une a diversos elementos gaseosos presen-tes en el aire, como el nitrógeno, dióxido de carbono, helio, metano, etc. Al caerse disemina o se filtra en el suelo, contaminándose con los diversos compuestosorgánicos e inorgánicos que estén presentes. Posteriormente en los afluentes,ríos, represas o acueductos donde va a parar, continua el proceso de contamina-ción, que variará, dependiendo de los compuestos presentes en cada lugar, loque unido al tratamiento con cloro a que es sometida en los acueductos para supotabilización, hacen que en conjunto pierda su pureza, pasando a ser un líquidoque contiene múltiples sustancias en disolución.

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PURIFICACIÓN DEL AGUA

Para las determinaciones de laboratorio, resulta indispensable que el aguasea lo más pura posible, ya que de lo contrario algunos componentes, provoca-rían efectos indeseables distorsionando la fiabilidad de los resultados. Por ejem-plo: el cloro libre, posee un gran poder de oxidación por lo que puede alterar lacomposición química de uno o varios compuestos del sustrato empleado. Por suparte el fluor y el cobre inactivan a las enzimas, mientras que las sales demercurio las activan. Para lograr la purificación del agua se emplean dos méto-dos: la destilación y la desionización.

DESTILACIÓN

La destilación consiste, en someter al agua a temperatura de ebullición en elinterior de un destilador metálico o de vidrio, diseñado para que los vapores quese desprendan en este proceso, pasen por un sistema de enfriamiento que loscondensan, haciendo que pasen nuevamente al estado líquido con una mejorcalidad, ya que los contaminantes al no tener la capacidad de evaporarse, que-dan retenidos en el destilador.

Fig. 8 : Destilador de vidrio.

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El agua destilada, obtenida por el procedimiento explicado no es totalmentepura, ya que el vapor de agua que se forma puede arrastrar mecánicamentepartículas de agua que no estén en estado de vapor. No obstante, el agua destiladapuede emplearse en el trabajo diario sin que introduzca errores apreciables.

Si se quiere, para algunas determinaciones, una mayor calidad de pureza, elagua destilada, debe ser sometida nuevamente al proceso de destilación con loque se obtiene el agua bidestilada. Si se sometiera a una tercera esterilizaciónobtendríamos el agua tridestilada.

DESIONIZACIÓN

La desionización consiste en hacer pasar el agua corriente por una columnade resinas, las cuales captan los aniones y cationes que la contaminan, con locual adquiere un buen estado de pureza, incluso, mejor que la del agua bidestilada,aunque tiene la desventaja, que como el proceso no lleva implícito su esteriliza-ción, debe ser renovada diariamente.

Para el trabajo del laboratorio de microbiología, el procedimiento común-mente empleado es la destilación.

PH DEL AGUA DESTILADA

El ph del agua destilada oscila entre 4 a 5, debido a la presencia de dióxidode carbono atmosférico disuelto. Si se desea neutralizar ese pH ácido para queno interfiera en algunos procederes, como por ejemplo en la preparación demedios de cultivo, que requieren generalmente, un pH neutro o ligeramentealcalino, el agua destilada debe ser sometida a un proceso de descarboxilación,lo cual se realiza de la siguiente manera:

1. Se vierte el agua en un erlenmeyer y se somete a temperatura de ebulli-ción por espacio de 3 a 5 minutos.

2. Antes de apagar la fuente de calor, tapar el erlenmeyer con un tapónperforado de caucho, provisto de un tubo trampa con perlas de hidróxidode sodio.

3. Después que el agua se ha enfriado, se verterá en recipientes apropiados,donde se conservará hasta su empleo.

CONDUCTIVIDAD DEL AGUA

Mediante la conductividad eléctrica se puede determinar el grado de purezadel agua, como se ilustra en la siguiente tabla:

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Cuadro 2 : Grado de pureza de los distintos tipos de agua en correspon-dencia con su conductividad.

TIPO DE AGUA CONDUCTIVIDAD ( ohms -1 cm -1 )

Corriente 300

Destilada 5

Bidestilada 1

Desionizada 0,2

CUESTIONARIO

1. ¿Cuál Es la importancia del agua para los laboratorios?2. ¿Cómo es la calidad del agua, tal como se encuentra en la naturaleza?3. ¿Explique por qué causa el agua empleada en el laboratorio debe ser lo más

pura posible?4. ¿Cómo se denomina el método más empleado en los laboratorios para

purificar el agua?5. ¿En que consiste la destilación?6. ¿Cuál es la diferencia entre el agua destilada y la bidestilada?7. ¿Por qué se hace necesario bidestilar o tridestilar el agua?8. Explique el proceso de desionización del agua.9. ¿Cuál es la ventaja y la desventaja de la desionización sobre la esteriliza-

ción del agua?10. ¿Cuál es el pH del agua destilada?11. ¿Mediante que procedimiento se puede determinar el grado de pureza del

agua?

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CAPÍTULO 5

CRISTALERÍA DE LABORATORIO

INTRODUCCIÓN

Se denomina cristalería de laboratorio, al conjunto de objetos utilizados en larealización de diferentes procedimientos técnicos, que independientemente desu forma y tamaño están constituidos solamente por vidrio.

COMPONENTES DEL VIDRIO

El vidrio se fabrica mediante la fusión de arena sílice con sales de sosa opotasa a una temperatura de 1, 0000c. El producto fundido, en ese estado líqui-do, se vierte en diversos moldes de acuerdo a los objetos que se requieranproducir, debido a la propiedad de no cristalizarse cuando se enfría. Quedandocomo un cuerpo sólido, generalmente transparente. De esta manera se obtieneel cristal empleado para cubrir puertas o ventanas, así como para la fabricaciónde vasos, copas y otros objetos.

Como se sabe, este tipo de cristal es muy vulnerable a los impactos mecá-nicos, exposiciones a elevadas temperaturas,. Etc., lo que no resulta apropiadopara la fabricación de la cristalería de laboratorio la cual requiere del empleo deotros componentes como el borosilicato de sodio y el aluminio, cuya aleación leconfiere una alta resistencia mecánica, térmica y química. La cristalería fabri-cada con estos componentes, se identifica por estar rotulada con el nombre de"Pyrex" (Pairex).

SUSTITUTOS MODERNOS DEL VIDRIO

En la actualidad, los diversos objetos de vidrio que integran la cristalería delaboratorio, también se fabrican de material plástico, especialmente con teflón(tetrafluoruroetileno) un polímero de bajo costo, caracterizado por su dureza, loque le confiere una alta resistencia contra impactos, además tiene la propiedadde permanecer inerte durante las reacciones químicas, lo que lo valida como unsustituto eficaz del vidrio, con la ventaja de que dado su bajo costo, algunosobjetos, como por ejemplo: las jeringuillas utilizadas, pueden ser desechadas singrandes afectaciones económicas para la institución.

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CLASIFICACION

La cristalería de laboratorio de clasifica de la siguiente manera:

Cuadro 3: Clasificación de la cristalería de laboratorio.

CLASIFICACION SUB-CLASIFI CARACTERIZACIÓN DIFERENTES TIPOS CACIÓN - Alta resistencia química Todos los frascos o reciopientes DE ALMACE destinados a contener o almace- NAJE - Cierre hermético. nar, productos químicos - Fotorresistencia (materias primas) o soluciones G y reactivos elaborados E ________________________________________________________ N - Utilización para la Frascos erlenmeyer E realización de diver- Frascos Kitasatos R sos procedimientos Frascos para reactivos A técnicos. Frascos de fondo plano L DE - La mayoría se fabri- Frascos goteros TRABAJO can de diferentes Vaso de Koplin

tamaños y capaci- Tubos de ensayo dades. Vidrio reloj Placas de Petry Embudos Condensadores Láminas de portaobjetos Láminas cubre objetos Láminas excavadas

TC (Para contener) - No revelan magni- Pipetas de : Shali, tudes volumétricas. Thoma o Westergreen

DE (No utilizadas en el laboratorio de microbiología) MEDICION _______________________________________________________

VOLUMETRICA TD (Para dis- - Expresan magnitu- Pipeta tribuir) des volumétricas. Probetas

- Pueden tener o no Beaker (Vaso de precipitado) rotulada una escala Matraces de graduación Copa cónica

- Se fabrican de dife- Buretas rentes tamaños. Jeringuillas

- Están calibradas para trabajar a 200c.

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CARACTERIZACIÓN DE LOS DIFERENTES TIPOSDE CRISTALERÍA

CRISTALERÍA GENERAL DE TRABAJO

Erlenmeyer

Los erlenmeyer son recipientes de forma cónica y fondo plano, que secaracteriza por tener un diámetro 3 ó 5 veces mayor en su porción inferior conrespecto a su porción superior.

Si lo colocamos sobre la mesa de trabajo y lo observamos de arriba haciaabajo podemos percatarnos que en el extremo superior presenta una aberturacircular con rebordes, que corresponde a la boca, seguida de una porción cilín-drica de algunos cm a manera de cuello. Al concluir este espacio se va ensan-chando progresivamente de forma oblicua adquiriendo la forma cónica que locaracteriza.

Aunque los erlenmeyer pueden emplearse para la preparación de diferen-tes reactivos, esta cristalería está diseñada específicamente para la preparaciónde compuestos que requieran ser sometidos a la acción del calor, como porejemplo, la preparación de medios de cultivo, debido a que su forma cónica,hace que los vapores se condensen en el cuello, lo que propicia que no afectesignificativamente el volumen de la preparación.

Los erlenmeyer se fabrican de diferentes tamaños. Los más empleadosen el laboratorio de microbiología son los de: 100, 250, 300,500 y 1 000 ml.Los de menor o mayor volumen de capacidad se utilizan con menor fre-cuencia.

Fig.. 9 : Erelenmeyer

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Kitasatos

Los frascos de Kitasatos, son similares a los erlenmeyer con la diferenciade que en el cuello tiene insertado un pequeño tubo corto en dirección horizon-tal abierto en su porción distal siendo las paredes de vidrio más gruesas, parasoportar las diferencias de presiones externas e internas provocadas por lastécnicas de filtración al vacío para los que básicamente son empleados. Al igualque los erlenmeyer se fabrican de diferentes tamaños.

Frascos para reactivos

Los frascos para reactivos son de diferentes tipos y pueden contener deacuerdo a su tamaño entre 25 ml y 1 litro. La tapa del frasco puede ser de cristalesmerilado o plástica si el cierre es de rosca, lo que dependerá del tipo dereactivo que contenga. Con ambas variantes se consigue el cierre hermético delfrasco. Esta cristalería puede ser incolora o ámbar para la protección de reactivosfotosensibles.

Fig.10 : Frasco de kitasato

Fig.11 : Frasco para reactivos.

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Frascos de fondo plano

Se utilizan para la preparación de determinadas disoluciones, fabricándosede diferentes tamaños, debiendo ser termorresistentes por si se requiere some-terlos a la acción del calor. En el trabajo microbiológico se utilizan regularmentepara la preparación del antígeno de cardiolipina, utilizado en las pruebasserológicas VDRL.

Frascos goteros

Existen en el mercado diferentes modelos. Los de vidrio, tradicionalmenteempleado son incoloros o ámbar. De acuerdo con su capacidad, pueden conte-ner entre 25 y 100 ml. Estos frascos poseen una tapa de vidrio esmeriladoprovista de una ranura perpendicular, que cuando se rota la tapa y se hacecoincidir con la ranura en el cuello del frasco, el contenido goteará si se inclinael frasco adecuadamente.

Otros modelos consisten en frascos provistos de un gotero con tapón decaucho, similar a los empleados en los frascos de medicamentos, en tanto queotro están diseñados para que comiencen a gotear si el frasco es invertido.

Fig.12 : Frasco de fondo plano

Fig.13 : Frascos goteros

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Vaso de Koplin

Estos vasos se caracterizan por ser cuadrados con paredes rectangula-res. Algunos están diseñados para ser utilizados en posición vertical y otros deforma horizontal, pero todos tienen, en dos de sus paredes inferiores que quedanfrente a frente, 4 ó más salientes de vidrio de 1mm de grosor alineados a todo lolargo con una separación de 2 mm entre sí, lo que posibilita la insertación devarias láminas portaobjetos, de manera que quedan separados.

Estos vasos están provistos de tapas de vidrio y se utilizan para fijar prepa-raciones sobre láminas portaobjetos y/o colorearlas.

Tubos de ensayo

Son pequeños recipientes de vidrio o plástico, fabricados de diferentes ta-maños, con capacidad variable. Todos son cilíndricos, aunque la forma de susextremos varía en función de su empleo. Los utilizados comúnmente en análisiscualitativos y cuantitativos tiene el fondo ligeramente cóncavos, en tanto que lostubos para cultivo son similares, pero se diferencian en que están provistos ensu extremo superior de aristas helicoidales por donde se enrosca una tapa debaquelita, resina sintética obtenida por polimerización del fenol y el formaldehído,

Fig.14: Vaso de Koplin

Fig.15: Tubos de ensayo

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generalmente con estrías longitudinales para facilitar su sujeción cuando se vana desenroscar, mientras que los tubos de centrífuga se caracterizan por tener elfondo cónico, para acoplarse a los portatubos de la centrífuga, pudiendo tenerimpresa una escala de graduación en ml.

Los tubos ordinarios y los empleados para cultivo, mayormente utilizados enlos laboratorios de microbiología, son los de 12 x 75, 13 x 100, 15 x 125 y16 x 150 mm, correspondiendo el primer valor al diámetro y el segundo a lalongitud.

Se utiliza esencialmente para contener, conservar y procesar muestras bio-lógicas, cultivar microorganismos y realizar pruebas de identificación para eldiagnóstico de laboratorio, de las especies investigadas.

Vidrio reloj

Es un tipo de cristalería circular y cóncava de aspecto transparentes, simi-lar a las utilizadas para cubrir las esferas de algunos relojes despertadores.

Se utilizan regularmente para efectuar pesadas de productos sólidos conexcepción de aquellos que sean higroscópicos que absorben la humedad del aireo volátiles.

Placas de "Petry"

Fig.16: Vidrio reloj

Fig.17: Placas de "Petry"

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Están constituidas por una caja circular de vidrio de 11 ó más cm de diáme-tro con el fondo plano pudiendo o no estar tabicado con un borde de 1 cm dealtura en todo su perímetro. La placa se completa con una tapa igualmente devidrio con un diseño similar al de la caja, pero, ligeramente superior en diámetro.Cuando las dos partes se ensamblan, la superficie interior de la tapa quedadescansando sobre el borde de la caja.

En el trabajo microbiológico se utiliza comúnmente para contener algúnmedio de cultivo sólido.

Embudos

Los embudos presentan la porción superior cónica y la posterior en formade un tubo cilíndrico y delgado cortado oblicuamente en su extremo terminal,pudiendo tener una longitud, menor , igual o mayor que la porción cónica, cuyacapacidad oscila entre 30 ml y 5 litros, teniendo las paredes internas, según elmodelo, estriadas o lisas. Se emplean para traspasar líquidos.

Láminas portaobjetos

Fig.19 : Lámina potaobjetos

Fig.18 : Embudos

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Las láminas portaobjetos son planas, delgadas y lisas, de aspecto transpa-rente y forma rectangular. Miden 7,5 cm de largo por 2,5 cm de ancho.

Se utilizan esencialmente para colocar sobre su superficie pequeñas frac-ciones o volúmenes de muestras, que serán sometidas o no a un proceso decoloración, con la finalidad de ser observadas a través del microscopio. Estetipo de lámina se emplea igualmente como soporte para realización de pruebasserológicas de aglutinación.

Láminas excavadas

Son similares a las láminas portaobjetos ordinarias, con la diferencia de quepresentan una excavación cóncava de algo más de 1 cm de diámetro en centrode la lámina en forma de pozuelo.

Se utilizan para la preparación de la "gota colgante", una técnica mediantela cual se determina microscópicamente si la bacteria en estudio es o nomóvil.

Láminas cubre objetos

Fig.20 : Lámina portaobjetos excavada

Fig. 21: Láminas cubreobjetos

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Son laminillas muy delgadas, transparentes e incoloras. La forma varía decuadradas a rectangular; cuando son cuadradas miden 22 x 22 mm y cuandoson rectangulares 22 x 50 mm.

Son empleadas para cubrir las muestras o preparaciones que han sido coloca-das previamente sobre las láminas portaobjetos para ser observadas al microscopio.

Cristalería de medición

Pipetas

Son tubos de vidrio rectos, de longitud y grosor variable que se caracterizanpor tener el extremo inferior ligeramente cónico.

Se fabrican diferentes tipos, que han sido diseñados para diversos procede-res de laboratorio, siendo utilizada básicamente para medir y/o transferir volú-menes exactos de líquidos.

Las más utilizadas en los laboratorios de microbiología, son las pipetas gra-duadas, principalmente las de 1, 2, 5, y 10 ml. Este tipo de pipeta tiene impresoen la parte superior un número que equivale a su capacidad volumétrica y a todolo largo una escala graduada en ml, que indica numéricamente los espacios enque se divide el volumen total. Cada espacio a su vez se divide en 10 líneasequidistantes que corresponden a las subdivisiones volumétricas. Por ejemplo:En una pipeta de 5 ml de capacidad, la escala queda dividida en 5 espaciosiguales, cada uno de los cuales equivale a 1 ml. Cada especio a su vez sesubdivide en 10 líneas, equivalente cada una de ellas a 0,1 ml.

Las pipetas serológicas, son similares a las graduadas, pero su capacidad esde 1 ml o menos, estando dividida en 0,1 y/o 0,01 ml.

En el trabajo microbiológico se utiliza en ocasiones un tipo de pipeta nograduada, denominada pipeta de Pasteur, que puede ser fabricada en el propio

Fig. 22: Pipetas

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laboratorio con tubos de cristal fusible mediante su exposición a la llama delmechero de gas.

Este tipo de pipeta suele emplearse cuando no se requiere precisar conexactitud el volumen a pipetear.

Procedimientos para el manejo de las pipetas graduadas:

1. Sostenga la pipeta por su parte superior mediante los dedos pulgar ymedio.

2. Haga penetrar la pipeta en el líquido que va a ser aspirado.3. Introduzca el otro extremo en la boca y aspire suavemente, observando

simultáneamente la escala graduada, hasta que la columna de líquido so-brepase ligeramente la marca deseada.

4. Retire la pipeta de la boca y de inmediato tape el orificio con la yema dedoíndice, ejerciendo la presión suficiente para evitar que el líquido descien-da por gravedad.

5. Manteniendo la presión del dedo índice, proceda a retirar el exceso delíquido de la parte exterior de la pipeta, con un paño, gasa o servilletalimpia.

6. Introduzca la pipeta en el frasco o tubo donde se extrajo el líquido y hagaque la punta contacte con la pared interna. Estando la pipeta en posiciónperpendicular ir aflojando la presión del dedo índice para propiciar que lacolumna de líquido descienda del por gravedad, hasta observar que la

Fig. 23 : Forma correcta de sostener la pipeta.

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curvatura en la superficie del líquido (menisco) contacte justamente so-bre la línea correspondiente que marca el volumen deseado. En ese mo-mento exacto, proceda nuevamente a ejercer presión con el dedo índicepara evitar que el líquido continúe descendiendo. Al realizar la lecturavolumétrica, evitar incurrir en el error de paralaje, ocasionado por noestar el ojo del observador en el mismo plano horizontal con respecto almenisco, que ocasionaría errores en la lectura.

7. Introduzca la punta de la pipeta en el frasco o tubo receptor, apoyando lapunta, en la parte superior de la pared interna y nunca sobre el fondo,pues al retirar la pipeta parte del líquido trasegado quedarán adherido alexterior de la pipeta, siendo arrastrado al retirarla, afectando la exactituddel volumen pipeteado.

8. Proceda a aflojar la presión del dedo para distribuir el volumen deseado encada tubo.

9. Al vaciarse el contenido de la pipeta, en el extremo de la punta quedará unpequeño volumen residual. Si la pipeta utilizada, tiene una banda esmeriladao coloreada en el extremo superior proceda a soplar para que salga ycompletar el volumen previsto. Si la pipeta carece de franja esmerilada ocoloreada no se debe soplar ya que están diseñadas para desestimar eseresiduo sin que se afecte el volumen deseado. En el caso de las pipetasserológicas, se soplarán las que estén marcadas en la parte superior conla letra "D" (to de livery) no debiendo soplarse las marcadas con la letra"C" (to contain).

Fig. 24: Ubicación correcta del ojo para efectuar la lectura del menisco

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Probetas

Las probetas son recipientes cilíndricos y alargados de vidrio, de diámetro ytamaño variable, en correspondencia con su capacidad volumétrica. Las más utili-zadas en el trabajo microbiológico están comprendidas en el rango de 50 a 1,000 ml.

Están provistas de una base de fondo plano que posibilita que puedan ser colo-cadas en posición vertical sobre una superficie nivelada. En el borde del orificio, quese haya en la parte superior, presentan un pico, , similar al de las cafeteras, parafacilitar verter el líquido que contiene sin que se produzcan derramamientos. Algu-nas probetas están provistas de tapa de vidrio esmerilado o plástica.

La mayoría tienen rotulado en la parte superior un número que indica sucapacidad volumétrica, la marca de 200C, que es la temperatura de trabajo deeste tipo de cristalería, y al igual que las pipetas, una escala graduada a todo lolargo que divide y subdivide el volumen total.

Se utilizan específicamente para medir volúmenes.

Beaker (Vasos de precipitados)

Los Beaker son recipientes transparentes e incoloros que presentan unaforma cilíndrica teniendo una longitud de casi el doble de su diámetro. Al igual

Fig. 25 : Probetas

Fig. 26 : Beaker

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que las pipetas tienen un pico en el borde la boca que propicia que se puedaverter el líquido que contiene sin que se produzca derramamiento. Al igual queotras cristalerías de medición, tienen rotulado, el número que indica su capaci-dad volumétrica, la temperatura de trabajo (200C) pudiendo tener o no unaescala graduada en ml, al igual que las probetas y las pipetas.

Matraces

Las matraces son frascos de vidrio incoloros y transparentes que tienen unaporción superior en forma de un fino tubo cilíndrico y alargado, la inferior piriformecon el fondo plano, lo que permite colocarlos en posición vertical. Algunos estánprovistos de tapa de vidrio esmerilado. Al igual que otros tipos de cristalería demedición, tienen grabado el número que indica su capacidad volumétrica, la tem-peratura de trabajo (200C) y una línea alrededor del cuello que indica la marca deaforo. Se emplean para preparar disoluciones donde se requiere exactitud.

Materiales de porcelana

Además de los materiales de vidrio o de teflón, en los laboratorios se utilizanotros, fabricados de porcelana, siendo los más empleados las cápsulas y losmorteros.

Cápsulas

Fig. 27 : Matraces

Fig. 28 : Cápsula de porcelana

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Son pozuelos de borde esférico, fondo redondeado y tamaño variable, ca-racterizándose generalmente por ser de color blanco y tener las paredes delga-das lisas y muy pulidas, con un doblez en forma de labio por un punto de suborde para facilitar verter su contenido, sin que se produzca derramamiento.

Uso: Se utilizan regularmente como recipientes de disoluciones que van aser sometidas a una medición de pH o para colocar medios de cultivo que sepretenden pesar.

Morteros

Los morteros son recipientes de porcelana, aunque también se fabrican devidrio. A diferencia de las cápsulas, generalmente, son de mayor tamaño y estánprovistos de paredes más gruesas, pudiendo tener el fondo plano o redondeado.Al igual que las cápsulas presentan un doblez en forma de labio en el borde paraverter su contenido.

El mortero se complementa con una pieza cilíndrica adicional, del mismomaterial, con el extremo inferior redondeado, denominado mazo,. Similar a unpequeño bate de pelota.

Uso: Para triturar compuestos sólidos con ayuda del mazo.

LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN

La cristalería que vaya a ser utilizada en las investigaciones microbiológicasde laboratorio, debe ser sometida previamente a un proceso de limpieza y des-infección antes de esterilizarla.

Si la cristalería es nueva: Debe pasarse previamente por agua caliente paraeliminar la presencia de vestigios fábriles. Después se sumerge en una solución deácido clorhídrico al 1%, dejando actuar el desinfectante por un espacio de tiempo nomenor de 4 horas. Posteriormente se lava con detergente, se enjuaga con aguacorriente y finalmente con agua destilada. Después de escurrida se deja secar alaire o si se desea secado con mayor rapidez se puede introducir en una incubadora.

Fig. 29 : Mortero

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Cuando la cristalería haya sido utilizada: Si mantiene material infeccioso,por haber estado en contacto directo con microorganismos o contiene cultivo deésta, debe ser sometida previamente a un proceso de esterilización en autoclave a1210C, durante 30 minutos, para evitar que el técnico o la persona encargada de lalimpieza de la cristalería se contamine con microorganismos patógenos. Despuésde la esterilización, la cristalería se enjuaga para eliminar los restos groseros delmaterial que contenía y se sumerge durante 10 ó 15 minutos en mezcla sulfocrómica,o más tiempo si la mezcla ya ha sido utilizada y mermada su efectividad. Lacristalería así tratada, se friega con detergente, se enjuaga con agua corriente yfinalmente con agua destilada, procediendo a su secado en la forma explicada.

Desinfectantes más empleados (ver Capítulo 6)

PREPARACIÓN PREVIA DE LA CRISTALERÍAPARA SU ESTERILIZACIÓN

Objetivo: Evitar que se vuelvan a contaminar con posterioridad a su este-rilización y mantenerlas en esas condiciones hasta su utilización.

Procedimiento: Después de desinfectadas, fregadas y secas:

Tubos de ensayos: Se taponean con algodón y se envuelven con papel deestraza en grupos de 5 a 10 tubos.

Placas de Petry: Después de ensambladas (tapa y caja) podrán ser coloca-das dentro de un cilíndrico de metal inoxidable con tapa, fabricado específicamentepara ese uso, o en su defecto, las placas serán empaquetadas con papel deestraza, individualmente, en parejas o en grupos de no más de 5 placas.

Fig. 30 : Taponeamiento de tubos con asa y algodón

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Las pipetas: Se taponean de tal manera que no dificulte la succión, pero almismo tiempo impida el paso hacia la boca del material que esté pipeteando.Posteriormente se enrollan en una franja de papel de estraza.

Los erlenmeyer, probetas y otras cristalerías similares: Se taponean conalgodón y se retapan con papel de estraza, el cual se ata fuertemente con unlazo al cuello o porción anterior de la cristalería.

Fig. 31 : Placas de Petry: a)Empaquetadas con papel de estraza, b)Cilíndro de metalinoxidable para colocar las placas

Fig. 32 : Pipetas: a)Taponeamiento con algodón, b)Empaquetamiento con papel deestraza

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El resto de los materiales se empaquetan igualmente e incluso, algunos,como las jeringuillas con doble envoltura.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué Ud. entiende por cristalería de laboratorio?2. Explique cómo se fabrica el vidrio.3. Nombre los componentes del vidrio "Pyrex".4. ¿Qué es el teflón y para qué se utiliza?5. ¿Cómo se clasifica la cristalería general?6. ¿Cuáles son las características de la cristalería de almacenaje?7. Nombre los diferentes tipos de cristalería de medición volumétrica?8. ¿Cuáles son las características de la cristalería de medición volumétrica?9. Mencione las cristalerías de medición volumétricas.

10. ¿ Cuáles son las diferencias entre en erlenmeyer y un frasco de kitasato?11. ¿ Cómo es una bureta?12. ¿Cómo funcionan los frascos goteros con tapa esmerilada?13. Describa el vaso de Koplin.14. Describa las características de los tubos de ensayo.15. ¿Cómo son las placas de "Petry"?16. ¿Cuánto miden las láminas portaobjetos y las cubreobjetos?17. Explique en orden cronológico los pasos que deben efectuarse durante la

realización del pipeteo.18. Explique las diferentes causas de error en que puede incurrirse durante el

pipeteo.19. ¿Para qué se utilizan regularmente los vasos de precipitado o Beaker?20. ¿Qué otros recipientes además de los de vidrios se fabrican de porcelana?21. Precise semejanzas y diferencias entre una cápsula y un mortero.22. Explique cuáles son los procederes establecidos para la limpieza y desinfec-

ción de la cristalería.23. Describa cómo Ud. prepara la cristalería para que se mantenga estéril des-

pués de la esterilización.

Fig. 33 : Erelenmeyer: a)Taponeamiento con gasa y algodón

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CAPITULO 6

ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN

INTRODUCCIÓN

La esterilización y desinfección son los métodos esenciales empleados enlos laboratorios de microbiología, para destruir, inhibir o separar a losmicroorganismos presentes en los diferentes objetos, compuestos orgánicos,medio ambiente, etc., donde se requiere su eliminación.

La mayoría de los métodos y agentes empleados, ocasionan específicamentela desnaturalización de las proteínas celulares. Destruyen las diversas estructu-ras o inhiben su funcionamiento, lo cual a mediano plazo resulta letal para elmicroorganismo.

Términos empleados relacionados con la esterilización y la desinfección

Sepsis: infección pútrida (putrefacto, corrompido, etc.)Séptico: que produce la sepsis.Asepsia: método encaminado a prevenir la infección mediante la destruc-

ción o evitación de los agentes infectivos. Específicamente mediante el empleode métodos físicos.

Antisepsia: conjunto de procedimientos prácticos destinados a destruir oalejar los gérmenes patógenos, en especial por medio de agentes químicos.

Aséptico: libre de toda materia séptica o infecciosa.Bactericida: agentes destructor de bacterias.Bacteriostático: agente que inhibe las funciones de las bacterias.

ESTERILIZACIÓN

Concepto: Esterilización significa: destrucción o eliminación de todas lasformas de vida, no limitándose exclusivamente a la estructura vegetativa, sinoincluyendo además a sus esporas.

Diferentes agentes empleados en la esterilización: Para la esterilización seemplean diferentes agentes físicos y químicos, los agentes físicos más utilizadosson: el calor, las radiaciones y la filtración. En relación con los agentes quími-

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cos, solamente algunos, como por ejemplo. El formaldehído y el óxido de etilenoejercen un efecto letal sobre las esporas.

El calor

El calor resulta un método muy eficaz para lograr una adecuada esteriliza-ción, siempre y cuando el objeto o producto no sea termolabil, y se cumpla conlos parámetros de eficacio, como son: la aplicación del nivel de temperaturarequerido y el tiempo de exposición al calor, en dependencia de la magnitud delmaterial a esterilizar. El calor se utiliza de tres maneras diferentes: calor húme-do, calor seco y la incineración.

Calor húmedo

El calor húmedo es la variante más empleada. Debido a que las bacteriasresultan más vulnerables en la medida en que estén más húmedas. Bajo estascondiciones, el calor generado provoca la desnaturalización y coagulación delas proteínas, de manera similar que cuando se cocina un huevo duro, en conse-cuencia los puentes de hidrógeno de la membrana citoplasmática, son destrui-dos, inactivando su función osmótica, lo que trae como resultado la emigraciónincontrolada de los constituyentes intracelulares, como aminoácidos, potasio,etc. que ocasionan la muerte del microorganismo.

El calor húmedo se emplea en los laboratorios de tres maneras diferentes.Calor húmedo a presión, calor húmedo a 1000 C.

Calor húmedo a presión

El calor húmedo a presión se obtiene mediante el empleo del autoclave, unequipo metálico provisto de un cierre hermético, diseñado para resistir la pre-sión generada por la acumulación de vapor de agua, con lo cual la temperaturaaumenta, alcanzando valores de 121 C requeridos para la eliminación de lasesporas para lograr una adecuada esterilización.

En el mercado se comercializan diferentes modelos de autoclave: vertica-les, horizontales, de doble cámara, etc., pero todos tienen en común una estruc-tura similar.

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Prototipo standard del autoclave

Cámara

La cámara del autoclave consiste en un cuerpo cilíndrico de aproximada-mente un metro de largo x 50 a 60 cm de diámetro, siendo el lugar destinadopara la colocación de los objetos y materiales que sé desean esterilizar.

Algunos modelos disponen de una segunda cámara denominada externa,que debido a su mayor diámetro rodea a la cámara interna en toda su longitud,quedando las paredes de ambas separadas entre sí por varios cm. En esteespacio se acumula el vapor de agua procedente de la caldera que posterior-mente pasa a la cámara interna.

Puerta

La puerta está articulada con bisagras en la parte anterior del equipo, aunos pocos cm de la cámara interna estando provista de un número variable demetálicas en posición radial que al ser cerrada mediante el de una manivela

Fig. 34: Autoclave. Vista frontal y lateral: 1.Llave que comunica la cámara externa con lainterna; 2.Lave de escape de vapor; 3.Manómetro que indica la presión de la cámaraexterna; 4.Manómetro que indica la presión de la cámara interna; 5.Válvula termostá-tica; 6.Válvula de seguridad; 7. Respiradero; 8.Puerta de seguridad; 9.Cierre herméti-co de la puerta; 10.Cámara externa; 11.Cámara interna; 12.Termómetro; 13 y l4.Tanquede agua; 15.Quemador de gas; 16.Escape de agua de condensación; 17.Llave depaso para suministrar agua al tanque; 18.Llave de paso para sacar el agua del tanque;19.Llave de paso de gas; 20.Entrada de aire; 21. Llave que controla el nivel del agua.

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ubicada centralmente, penetran en un reborde periférico situado en la partefrontal del autoclave propiciando un cierre hermético.

Válvulas

Los autoclaves poseen dos válvulas, una para extraer el aire que quedó enel interior del equipo al cerrarse y la otra para propulsar la salida del vaporcuando la presión sobrepasa los límites admisibles. Esta última se denomina"válvula de seguridad".Caldera

Según el modelo de que se trate, la caldera puede estar ubicada junto oseparada de la cámara. En su interior se deposita el agua (destilada) hastaalcanzar el nivel adecuado.

Fuente de calor

La fuente de calor empleada para calentar el agua contenida en la calderay se produzca vapor de agua, puede ser eléctrica o de gas.

Instrumentos de medición

Estos equipos disponen de un termómetro y un manómetro que permiten irmonitoreando la temperatura y la presión existente en el interior del autoclave,durante su funcionamiento.

Uso del autoclave

El autoclave se utiliza regularmente para la esterilización de ropas, mediosde cultivo, material quirúrgico, etc.

Manipulación del autoclave

a) Revise el nivel del agua de la caldera y en caso de ser insuficiente, proceda aechar la cantidad requerida.

b) Revise la válvula de seguridad, y límpiela si estuviera sucia u obstruida.c) Introduzca en la cámara los objetos y materiales que se van a esterilizar y

cierre herméticamente la puerta.d) Proceda a abrir la válvula de salida del aire.e) Encienda la fuente de calor.

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f) Manténgase atento a la válvula de salida de aire. Cuando el vapor salgamediante un chorro continúo y sin intermitencia, cierre la válvula, pues seráindicativo de que el aire acumulado dentro del autoclave ha salido y que todoel espacio de la cámara está ocupado exclusivamente por el vapor de agua.

g) Espere a que el termómetro marque 1210 C y el manómetro 15 lb/pgda3 depresión, para comenzar a contar el tiempo de esterilización, que generalmen-te es de 15 a 20 minutos, aunque puede extenderse a 30 minutos si el objetoo producto a esterilizar es demasiado grande, si se diera el caso, de que latemperatura no se corresponde con la presión, es indicativo de que no sesacó todo el aire de la cámara, recomendándose en ese caso aumentar unpoco la presión para que el equipo alcance la temperatura requerida.

h) Transcurrido el tiempo de esterilización, desconecte la fuente de calor (haymodelos donde la fuente se apaga automáticamente) y espere hasta que elmanómetro marque "O". No trate de reducir la presión abriendo la válvula deseguridad o la de salida de aire, ya que esta acción puede provocar que losmedios de cultivo que aún tengan más de 100 C al serle retirada abruptamentela presión, asciendan, expulsen los tapones de algodón y se derramen dentrodel equipo.

i) Cuando el termómetro y el manómetro marquen "O" proceda a abrir la válvu-la de salida de aire y espere a que salga el vapor residual. A continuación,abra la puerta el autoclave con sumo cuidado, ya que los restos de vapor quequeden aún dentro de la cámara, al salir por la puerta, pueden ocasionarquemaduras al manipulador.

Calor húmedo a 1000 C

El calor húmedo a 1000 C. se obtiene de dos maneras diferentes:

1. Por ebullición: El líquido en cuestión es sometido a la acción del calor hastaalcanzar temperaturas de 100 C, siempre que la acción calórica se prolonguepor 5 a 10 minutos, mediante este método se logra la destrucción de todas lasformas vegetativas y de algunas esporas. Otras esporas resisten la tempera-tura de ebullición por más de una hora, por lo que no puede garantizarse unaesterilización eficaz con este método.

2. Vapor fluente: El vapor fluente se utiliza para la esterilización de compuestosy medios de cultivo elaborados con determinados azúcares, gelatina, urea,etc. Que se deterioran a temperaturas superiores a 1000C, no debiendo por lotanto ser esterilizados en auto clave. El principio de este método consiste ensometer el compuesto o medio de cultivo a esterilizar a una corriente devapor a 1000C para lo cual se emplea el esterilizador de Arnold, que consisteen un equipo similar al autoclave, con la diferencia de que no es hermético, ya

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que el vapor producido por el calentamiento del agua, va saliendo por uncondensador que lo traslada en forma de agua, nuevamente a la caldera. Alno acumularse el vapor, no aumenta la presión y por consiguiente la tempera-tura se mantiene en 1000C. La exposición al vapor fluente del material aesterilizar será de 20 a 30 minutos.

Como ya se explicó en acápite de ebullición, la temperatura de 1000C resultainsuficiente para la destrucción de algunas esporas, por lo que se requiereaplicar la esterilización fraccionada, conocida como "tyndalización", que con-siste en exponer el material a esterilizar al vapor fluente durante tres díasconsecutivos por espacio de 30 minutos, para que las esporas que resistieronla primera exposición germinen en células vegetativas muy vulnerables a latemperatura de 1000C. De quedar alguna espora germinará y la célulavegetativa será destruida en la 3era. Exposición.El autoclave puede sustituir al equipo de Arnold, siempre que se deje la válvu-la abierta para que el vapor no se acumule, con lo cual la temperatura semantiene estable a 1000C.

Fig. 35: Esterilizador de Arnold: 1.Resistencia eléctrica; 2.Soporte; 3.Tapa; 4.Termóme-tro; 5.Tuberia de escape de vapor; 6.Recuperador; 7.Agua destilada.

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Calor húmedo a menos de 1000C

La aplicación del calor húmedo a menos de 1000 C, es un método conocidocon el nombre de pasteurización, ideado en el siglo XIX por Luis Pasteur, queestá basado en el efecto de la temperatura sobre los microorganismos y susenzimas. Consiste básicamente en calentar el producto de 62 a 650 C durante30 minutos o a 710 C durante 15 segundos, seguido de un enfriamiento inmedia-to. Con este método se eliminan los patógenos que con alguna regularidad pue-dan estar presentes en productos como la leche y bebidas alcohólicas, etc. Sinque pierdan su sabor natural, debido a las bajas temperaturas empleadas y elcorto tiempo de exposición.

Calor seco

El calor seco, es utilizado con regularidad en los laboratorios de microbiolo-gía, con el objetivo de determinados objetos y materiales. Su acción provoca ladesnaturalización y coagulación de las proteínas, así como la oxidación de cier-tos componentes de la célula microbiana.

El calor seco se obtiene por medio del horno, un mueble metálico de formarectangular o cuadrada, 40 % de aproximadamente 80 cm cúbicos, aunque secomercializan otros de menor o superior tamaño. En su parte inferior o base,está situada la fuente de calor; una resistencia eléctrica que ocupa todo el áreadel fondo del horno, la cual queda cubierta por una tapa metálica perforada, porcuyos orificios pasa el calor, que se disemina por todo el interior del horno, pormedio de un ventilador ubicado en una de las paredes laterales. A diferentesniveles de altura están situadas las parrilladas en posición horizontal, dondeserán colocados los materiales a esterilizar.

Fig. 36: Horno: 1.Termómetro; 2.Salida de aire; 3.Tapa; 4.Botón del termostato; 5.Ventila-dor; 6. Bombillo; 7.Fuente de calor; 8.Puerta.

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En la parte superior externa se encuentra un orificio ocupado por un regu-lador, encargado de expulsar el exceso de aire del interior del horno. En la parteanterior, debajo o al lado de la puerta presentan un panel donde se encuentra elinterruptor, el botón para regular el termostato, el termómetro y un bombillopiloto. Casi todos los hornos tienen dos puertas; una interna de vidrio que sehalla dentro de un marco metálico y otra externa metálica forrada de amianto,con la cual se cierra firmemente el equipo.

Uso del horno

El horno se utiliza para esterilizar cristalería de laboratorio, objetos de metal,aceites, grasas sólidas o productos en polvo, que debido al bajo porciento deagua que contienen no son penetrados suficientemente por la humedad genera-da por el vapor de agua de los autoclaves.

Manipulación del horno

1. Coloque en las parrillas los materiales a esterilizar, debidamente preparadoscuidando de que queden separados entre sí y de las paredes del horno, quepor ser metálicas adquieren un mayor grado de temperatura y pueden que-mar el material comburente empleado, y para que el aire caliente circulante,tenga acceso por igual en toda la superficie del material a esterilizar.

2. Cierre firmemente la puerta.3. Encienda la fuente de calor (automáticamente el ventilador comenzará a

funcionar y el bombillo piloto se encenderá)4. Gire el botón del termostato hasta que indique la temperatura deseada y

espere a que el termómetro registre de 160 ó 180 C (en ese momento seapagará automáticamente el bombillo piloto).

5. Comience a contar el tiempo de esterilización, que en este equipo debe ser de90 minutos a 2 horas.

6. Transcurrido el tiempo de esterilización, apague la fuente de calor, accionandoel interruptor y espere hasta que el horno se enfríe para extraer el material.

La esterilización en horno requiere de una temperatura superior a la utilizadacon el autoclave, así como un tiempo de exposición más extenso, ya que el calorseco no se distribuye uniformemente por todo el equipo como lo hace el vapor deagua, garantizando de esta manera que en el área del horno donde se alcancemenos temperatura, exista la suficiente para que el material quede estéril.

Advertencia

Cuando el horno haya alcanzado una elevada temperatura no debe abrirsepara introducir o sacar algún material, ya que los paños, algodón etc. Empleados

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pueden inflamarse por la penetración abrupta de oxigeno y ocasionar quemadu-ras al manipulador.

Incineración

La incineración se logra, exponiendo directamente a la acción de la llama, alos microorganismos contenidos en las muestras y otros materiales contamina-dos que se determine carbonizar, para este propósito se utilizan el incinerador yel mechero.

El incinerador se emplea básicamente, para llevar al estado de cenizasmateriales contaminados, que por su peligrosidad deben ser destruidos total-mente, en tanto que los mecheros son utilizados como fuente de calor paradiversos propósitos y comúnmente en el trabajo diario para esterilizar, mediantela incineración, a los instrumentos de siembra.

Mecheros

Los mecheros son instrumentos de laboratorio diseñados para obtener unallama calorífica a partir de la combustión del alcohol o del gas. Los mecheros dealcohol, consisten, en un pequeño recipiente de vidrio de forma redondeada, conel fondo plano, estando provisto por su parte superior de un pequeño salientecilíndrico por donde se enrosca un pequeño tubo metálico de unos pocos mm dediámetro a través del cual se inserta una mecha cuyo extremo posterior quedaen contacto con el alcohol contenido en el recipiente. Una pequeña capuchacilíndrica de metal con el extremo superior redondeado, se utiliza para tapar elmechero y que no se evapore el alcohol.

Fig. 37 : Mechero de alcohol: 1.Tapa; 2.Alcohol.

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Mecheros de gas

Son los mas empleados. Existen diferentes modelos, pero todos estánestructurados básicamente por tres partes separables: La base, el tubo quema-dor y el regulador de aire.

1. La base: Es una pieza metálica de forma circular y fondo plano, lo que permi-te mantener el tubo quemador en posición vertical. Tiene un diámetro de 4 a6 cm y presenta en la parte superior un pequeño tubito en posición horizontalde unos 6 mm de diámetro denominado tobera, donde se inserta ajustada-mente, con una presilla de seguridad, una fina manguera que se inserta por suotro extremo a una llave de gas.

2. Tubo quemador: El tubo quemador puede tener un diámetro variable, en de-pendencia del modelo de que se trate. El mechero de "Bunsen" convencional,tiene aproximadamente 6 ó 7 mm de diámetro x 6 ó 7 cm de largo, en tantoque el mechero de "Fisher" es mucho más grueso con una longitud tambiénmayor y está provisto en su extremo superior de un quemador que propiciauna llama grande e intensa. En ambos tipos de mecheros, muy próximo alextremo donde se enrosca a la base, el tubo presenta un orificio de un diáme-tro similar al del collarín que regula la entrada de aire.

3. Regulador de aire: El regulador de aire está compuesto por un collarínmetálico de forma anular, semejante a una alianza, que se insertacalibradamente en el extremo inferior el tubo quemador, quedando en con-tacto con la base. Está provisto de un orificio circular de un diámetro simi-lar al del tubo quemador.

Fig. 38 : Mechero de gas

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Manipulación del mechero

1. Revise que las diferentes partes del mechero, estén debidamente acopladasy ajustadas.

2. Abra ligeramente la llave de gas. Cuando esta operación se realiza, el gasque atraviesa la manguera y la tobera se dirige al centro de la base, dondehay un dispositivo provisto de un fino orificio, calibrado a décimas de mm queregula el paso del gas hacia el tubo quemador.

3. Aproxima la llama de un fósforo o de una fosforera al orificio del tubo que-mador por donde sale el gas para encender el mechero.

4. Regule la salida del gas en dependencia de la intensidad de la llama.5. Ajuste la entrada de aire hasta obtener la llama deseada, para lo cual se

hará girar al collarín hasta hacer coincidir su orificio con el del tubo quema-dor. Al realizar esta operación, en mayor o en menor grado se producirá laentrada de aire en el tubo quemador lo que propiciará la mezcla gas - aire(combustible y comburente). En la medida en que se enriquezca el gas conel aire. Así será la llama. Una mezcla rica en aire produce una llamaazulosa, no luminosa y de gran poder calorífico. Si empobrecemos la llamacerrando la entrada de aire, obtendremos una llama de color amarillo -rojizo, luminosa y poco calorífica.

Fig. 39: a) Mechero de Bunsen; b) Mechero de Fisher

Fig. 40: Diferentes zonas de la llama del mechero

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Uso del mechero

El mechero tiene una función utilitaria muy diversa: se emplea a diario paraesterilizar los instrumentos de siembra de nicrón o platino, mediante su exposicióndirecta a la llama, que los calentarán al rojo vivo en pocos segundos. Para flamearla boca de los tubos de ensayo y otras cristalerías estériles. Por su parte externacon el objetivo de eliminar los microorganismos contaminantes, como paso previoa la realización de siembras, resiembras, distribución de medios de cultivo enplacas y otros procederes. El mechero también es utilizado para fijar frotis enláminas portaobjetos y calentar medios de cultivo durante su preparación.

Advertencia

- El empleo del mechero entraña un peligro potencial de quemaduras en la piel oen la ropa, por lo que se debe tener sumo cuidado con su manejo. Se recomien-da retirar de su alrededor, durante su uso, papeles (utilizados para la esteriliza-ción de la cristalería) así como, líquidos inflamables (alcoholes para coloraciones)y otros materiales similares. Por las mismas razones debe mantenerse el pelorecogido y concentrarse totalmente en la actividad que se esté realizando.

- Los instrumentos de siembra (asas o agujas de platino o nicrón) que contenganrestos de muestra o de cultivos, deben ser introducidos gradualmente en lallama del mechero de la siguiente manera: de inicio se expondrá el extremo delinstrumento a la zona azul de la llama y tan pronto se ponga al rojo, se introducegradualmente el resto del alambre hasta que también se ponga al rojo vivo. Laintroducción total del instrumento en la llama tiende a aumentar la intensidad dela formación de aerosoles, potencialmente peligrosos para el manipulador. Loidóneo cuando se trabaja con muestras o cultivos, es disponer de un recipientecon arena humedecida en fenol, para introducir previamente el asa, con losrestos de inoculo, antes de flamearla a la llama del mechero.

LAS RADIACIONES

Las radiaciones empleadas en microbiología como método de esterilizaciónson esencialmente de dos tipos:

- Radiaciones ionizantes.- Radiaciones no ionizantes.

Radiaciones ionizantes

Deben su acción a la capacidad de producir partículas que al interaccionarseceden la energía suficiente para producir ionización; fenómeno mediante el cual,

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una molécula, átomo o ion estrictamente neutro, se ven privados de uno o maselectrones mediante la acción de un campo eléctrico.

Los rayos gamma, rayos x y rayos catódicos, ejercen una acción letal sobrelas diversas estructuras, el ADN y las proteínas celulares, no solo por sus pro-piedades ionizantes, sino además, por su elevada capacidad de penetración.

Aplicación: Se utilizan regularmente para la esterilización de inyectables,equipos médicos, catéteres, jeringuillas plásticas y alimentos.

Advertencia: La exposición a las radiaciones ionizantes son nocivas paralas células del cuerpo humano, por lo que si su empleo es reiterado deben em-plearse las medidas de protección radiológicas establecidas.

Radiaciones no ionizantes

A diferencia de las radiaciones ionizantes, las no ionizantes tienen pocacapacidad de penetración. Su efecto esterilizante depende de que la energíapropagada, procedente de sus radiaciones electromagnéticas (luminosas) seanabsorbidas por la célula microbiana, oxidando las proteínas y los ácidos nucleicos,para dar lugar a la inactivación de las enzimas, mutación genética o muerte.

Las radiaciones no ionizantes más empleadas en los laboratorios de micro-biología y en determinadas áreas del ámbito hospitalario, son las producidas porlámparas de luz ultravioleta cuyo expectro está comprendido en rango de longi-tud de onda de 2600 a 2700 .

Aplicación: El poco poder de penetración de estos rayos lo hacen inefectivospara esterilizar compuestos o medios de cultivo, además de que son agentescatalizadores de la oxidación de las grasas, lo que acarrearía numerosos trastor-nos, sin embargo su aplicación resulta efectiva para la esterilización del ambien-te de quirófanos, cuartos de siembra, etc. Así como para las paredes, piso ytecho del inmueble o la parte externa del mobiliario, siempre y cuando se cum-pla la indicación referida al tiempo de exposición y se tenga en cuenta la distan-cia entre la ubicación de la lámpara y el objeto o espacio a esterilizar.

Las radiaciones de luz ultravioleta además de ser germicidas, son muy efec-tivas contra las esporas.

En el trabajo diario la lámpara se debe encender 2 ó 3 horas antes decomenzar a trabajar en el local.

Advertencias

- No se debe entrar ni permanecer en ningún local que tenga encendida lalámpara de luz ultravioleta, pues ocasiona daños en la vista e incluso puedenproducir quemaduras cuando la exposición es prolongada, por lo que el inte-rruptor debe estar ubicado fuera del local.

- Debe chequearse periódicamente la lámpara para determinar su estado deagotamiento, que en caso de ser significativo reduciría su capacidad germicida.

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FILTRACIÓN

La filtración es un método mediante el cual, se hace pasar un líquido conta-minado a través de un filtro, con el propósito de que los microorganismos quecontiene sean retenidos y el líquido filtrado quede estéril.

La eficacia de este método depende del tipo de filtro empleado, ya quealgunos de los tradicionalmente utilizados no pueden retener el paso de los virus,por lo que de hecho, no es una verdadera esterilización, aunque en la práctica,retienen a la mayoría de los microorganismos.

Características de los filtros

Los filtros se fabrican con diversos materiales: amianto, vidrio poroso oporcelana, los cuales tienen en común ser muy compactos, y provistos deporosidades microscópicas de un diámetro menor que la talla promedio de losmicroorganismos, algunos como los de amianto se comercializan en forma dediscos de algunos cm de diámetro por varios mm de grosor.

En la actualidad se están empleando discos de membrana de celulosa parafiltros, tipo millipore, que se fabrican con diámetros tan pequeños que imposibi-litan el paso de los virus, así como filtros HEPA que se utilizan para retener laspartículas presentes en el aire durante la aplicación del flujo laminar.

Empleo: La filtración se utiliza para esterilizar compuestos termolábiles como:el plasma, medios azucarados, urea, vitaminas, etc., para los que no debe em-plearse el calor como método de esterilización por ser termolábiles.

Preparación de los filtros

Fig. 41: Filtros: a) Filtro Seitz; b) Bujia de Charberland.

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Cuando se emplean filtros en forma de disco, el procedimiento para sumontaje consiste, en colocarlo en posición horizontal en el interior de un soportemetálico de forma cilindra, de unos 6 cm de diámetro aproximadamente 12 cmde largo, denominado filtro "Seitz" que presenta en la parte superior una tapa derosca metálica y en la inferior un tubo recto, fino y delgado que se encuentrainsertado en el centro de la base presentando una escotadura oblicua en su extre-mo distal que le proporciona una terminación puntiforme que se utiliza para inser-tarlo en el orificio de caucho que se encuentra tapando a un frasco de kitasato. Elfiltro y el frasco de kitasato, una vez ensamblados se empaquetan con papel deestraza y son esterilizados en autoclave a 1210C durante 20 minutos. No se debeesterilizar en horno, ya que el calor seco puede dañar el tapón de caucho.

Preparación previa

Cuando vaya a ser utilizado, se le retira la envoltura de papel y se inserta elextremo de una manguera al tubo del frasco de kitasato y el otro extremo seacopla a una de vacío.

Procedimiento

1. Destapar el filtro "Seitz" y verter en su interior el líquido que se desea esteri-lizar, procediendo a taparlo con la tapa de rosca.

2. Conectar la bomba de vacío: La comprensión centrífuga axial (de su eje)transformará la energía cinética en energía de presión, originando una pre-

Fig. 42 : Filtro Seitz ensamblado en el kitasato

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sión negativa en el interior del frasco de kitasato al serle extraído todo el aireacumulado, lo que provocará la succión del líquido, el cual pasará a través delfiltro, quedando retenidos los microorganismos en su superficie acumulándo-se estéril en el kitasato.

Advertencia: Los discos de amianto se utilizan una sola vez, pero los devidrio poroso o porcelana se pueden limpiar con facilidad, lo que permite sureutilización.

DESINFECCIÓN

La desinfección es un método utilizado en los laboratorios de microbiologíapara provocar la muerte de los microorganismos. Mediante el empleo de pro-ductos químicos denominados desinfectantes, que determinadas concentracio-nes pueden ser letales, debido a los efectos tóxicos que producen sobre lasestructuras y los procesos metabólicos de la célula microbiana, la efectividad delos desinfectantes depende de su accesibilidad sobre el objeto o material a des-

Fig. 43: Proceso de filtración: a) Ensamblar el kitasato a la bomba de vacio; b) Verter ellíquido a filtrar; c) Cerrar el filtro; d) Accionar la bomba de vacio para que se produzcala succión y el líquido pase estéril al kitasato

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infectar y que las condiciones ambientales sean favorables para la desinfecciónasí como que la exposición se prolongue durante el tiempo predeterminado.

Los desinfectantes actúan sobre la estructura vegetativa de los microor-ganismos de diferentes maneras. Desnaturalizando las proteínas, provocandola ruptura de la membrana citoplasmática o la pared celular, removiendo losgrupos sulfhídricos libres, interfiriendo las reacciones enzimáticas o afectandoel funcionamiento de ADN, pero solo algunos son capaces de destruir las esporas.

La mayoría de los desinfectantes son muy nocivos para los tejidos, estandorestringido su empleo para la desinfección de objetos, materia orgánica o am-bientes, debiendo manipularse con sumo cuidado ya que el contacto accidentalcon algunos de ellos, puede ocasionar lesiones tisulares o dermatitis y su aspira-ción, intoxicación respiratorias o toxemias.

Algunos desinfectantes como por ejemplo, el alcohol y otros compuestosquímicos, pueden ser empleados como productos tópicos, gargarismos o colirios,siempre y cuando cumplan con el principio de toxicidad - selectiva, determinadoporque siga siendo tóxico para los microorganismos pero que al mismo tiempo,sean relativamente inocuos para las células del paciente.

Selección de los desinfectantes

El hecho de que todos los desinfectantes tengan la capacidad de matar a losmicroorganismos, no significa que pueda emplearse cualquiera sin una previaselección. Lo primero que hay que hacerse, es la caracterización del objeto,material o ambiente que se desea desinfectar, lo segundo, seleccionar el desin-fectante que resulte mas eficaz para ese objetivo, teniendo en cuenta su poca osuficiente capacidad de penetración en el tratamiento de las sustancias orgáni-cas y tercero, cerciorarse de que su empleo no produzca deterioro del objeto adesinfectar.

Los desinfectantes mas empleados en las instituciones de salud, son lossiguientes:

- Fenol del 2 al 5 %- Alcohol etílico de 70-90 %- Alcohol isopropílico del 40-80 %- Formaldehído al 4 %- Gluraldehido al 2 %- Peróxido de hidrógeno al 6 %- Sales de iones pesados (mercurio, cobre, zinc, etc.)- Detergentes catiónicos (compuesto de amonio o cloruro de benzalconio)- Bicloruro mercúrico al 1: 1000- Otros...

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La aplicación de estos productos químicos se realiza de manera diferente,de acuerdo con lo que se quiera desinfectar:1. Desinfección por sumersión.: Consiste en sumergir los objetos en un reci-

piente apropiado hasta cubrirlos con la solución desinfectante.2. Desinfección por aplicación directa: Aplicar con ayuda de un algodón, gasa o

paño, el desinfectante a la superficie del objeto de que se trate: mesa, puestode trabajo y en menor grado las paredes y el suelo.

3. Desinfección por gasificación: Algunos desinfectantes como el formaldehído,se pueden emplear en su estado gaseoso, para la desinfección de ambientesespeciales, ropas, mobiliarios y otros artículos.

Advertencia: Debido a que muchos desinfectantes tienen poca actividadsobre las sustancias orgánicas, resulta pertinente que sean removidos previa-mente del el objeto que se vaya a desinfectar con agua y detergente.

Las sustancias antisépticas más utilizadas en el laboratorio para uso exter-no son las siguientes:

- Alcohol etílico de 70-90 %- Alcohol isopropílico al 70 %- Formoaldehído al 1 %- Hexoclorofeno al 2 %- Yodopuvidona al 4 %- Hipoclorítico de sodio o calcio al 1 %.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es la esterilización?2. ¿Cuáles son los diferentes efectos que se producen sobre los

microorganismos sometidos a procesos de esterilización?3. Mencione los agentes físicos empleados en la esterilización.4. Cuáles son las diferentes formas en que se emplea el calor como agente

esterilizante?5. ¿Cuál es el agente esterilizante que se pone de manifiesto en el calor

húmedo a presión?6. ¿Cómo se denomina el equipo empleado en los laboratorios para producir

calor húmedo a presión?7. Durante la esterilización en autoclave ¿cómo Ud. determina la tempera-

tura y la presión del equipo?

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8. ¿Por qué causa el agua empleada para la esterilización en autoclave debeser destilada?

9. Explique paso a paso el funcionamiento del autoclave10. ¿Cuáles son las precauciones a tener en cuenta al concluir la esterilización

en autoclave.11. ¿Cómo se denomina el equipo a utilizar en la esterilización con calor seco?12. ¿Por qué la temperatura del horno y el tiempo de esterilización deben ser

mayores que cuando se emplea el autoclave?13. ¿Cuál es la fuente de calor del horno?14. Explique paso a paso el funcionamiento del horno.15. Mencione las diferentes partes del mechero de gas.16. ¿Cuál es la diferencia entre el mechero de "Bunsen" y el de "Fisher?"17. ¿Cómo Ud. regula la entrada de aire al mechero?18. Para qué se utiliza regularmente el mechero de gas.19. ¿Cómo se denomina la lámpara utilizada en los laboratorios para esterilizar?20. ¿De qué depende el efecto esterilizante de las radiaciones no ionizantes?21. ¿En qué lugares se aplica la esterilización con luz ultravioleta.22. ¿Qué cuidados debe tenerse en cuenta con el empleo de la luz ultravioleta?23. ¿Que tipo de materiales se deben esterilizar con filtros?24. Explique cómo usted realiza una esterilización con filtro25. ¿Cuál es la diferencia entre esterilización y la desinfección?26. ¿Cuáles son los efectos nocivos que provocan los desinfectantes sobre los

microorganismos?27. Mencione los diferentes métodos de desinfección.28. Nombre los desinfectantes empleados con mayor frecuencia y sus respec-

tivas concentraciones.

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CAPÍTULO 7

EQUIPOS CALORIFICOS

INTRODUCCION

Son equipos diseñados para producir y distribuir calor. Las autoclaves, hor-nos y otros instrumentos similares, empleados en la esterilización mediante elcalor, se incluyen dentro de este concepto, pero en este capítulo nos referiremosespecíficamente a otros equipos que también producen y distribuyen calor, peroque son empleados para otros menesteres. Entre los mas utilizados en el labora-torio de microbiología se encuentran:

1. La incubadora o estufa2. El baño de María.

INCUBADORA

El diseño industrial de las incubadoras es similar al del horno, en lo referentea su forma, estructura y tamaño. Se trata de un mueble rectangular o cuadrado deunos 80 cm3 , provisto de múltiples paneles, calentadores y doble puerta, la internade cristal y la externa metálica, con excepción de algunos modelos ya en desusoconstruidos de madera. Al igual que el horno, el lado o debajo de la puerta externa,dispone de un panel donde se encuentra el interruptor, el botón para regular latemperatura, el cuál está rodeado de una escala metrada y un bombillo piloto queindica mediante su apagado o encendido de forma automática, el funcionamientodel termostato. En su interior, la incubadora está provista de un número variablede parrillas metálicas intercambiables, donde se colocan los materiales a incubar.

La diferencia sustancial con respecto al horno radica en que el nivel máxi-mo de temperatura no excede de los 60 a 700 C, siendo ajustada generalmentepara que produzca de 35 a 370 C, lo cuál puede comprobarse mediante la obser-vación de un termómetro acoplado al equipo con una escala de 0 -700 C.

Requerimiento de temperaturas

Cada especie de microorganismo se desarrolla óptimamente en un rango,temperatura específica (termofília). Sobre la base de esos requerimientos seclasifican de las siguientes maneras:

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Cuadro 4: Clasificación de los microorganismos de acuerdo a sutermofilia.

CLASIFICACIÓN RANGO DE TEMPERATURA ÓPTIMOPARA EL CRECIMIENTO

PSICRÓFILOS DE 15 A 20 CMESOFILOS DE 30 A 37 CTERMOFILOS DE 50 A 60 C

La mayoría de los microorganismos patógenos al hombre, así como otrosque forman parte de la microbiota residente o transitoria, son mesófilos, por loque logran establecerse sin grandes dificultades en diferentes áreas anatómicasdel organismo, debido entre otros factores, a que la temperatura corporal resul-ta compatible con su temperatura optima de desarrollo.

Cada uno de estos grupos se subdivide a su vez en obligados y facultativos.Los primeros requieren obligatoriamente, disponer de la temperatura que seespecifica en cada clasificación, mientras que los facultativos son capaces dedesarrollarse, aunque menos óptimamente, por debajo o por encima de ese rango.

Además de una temperatura óptima que favorezca el aceleramiento de sucrecimiento, la incubación debe proporcionar además, condiciones adecuadasde aereación, acorde a las necesidades de oxígeno de cada microorganismo. Enese sentido se clasifican en: aerobios, microaerofílicos, anaerobios y facultativos.

Cuadro 5: Clasificación de los microorganismos de acuerdo a sus nece-sidades de oxígeno.

CLASIFICACIÓN AEREACCIÓN

Aerobios estrictos Requieren oxígeno a una tensión similar a la del aire ordinario.Microaerofílicos Requieren de una tensión de oxígeno inferior a la del aire.Anaerobios Requieren de un ambiente privado totalmente de oxígeno.Facultativo Pueden adaptarse a vivir en presencia o ausencia de oxígeno.

Clasificación de los microorganismos de acuerdo con sus necesidadesde oxígeno

De ahí, que deban emplearse diferentes métodos de incubación que propi-cien las necesidades específicas del microorganismo en estudio.

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Incubación de bacterias aerobias estrictas: Las bacterias aerobias es-trictas no requieren que la incubadora tenga ninguna adaptación especial, yaque ellas utilizan el oxígeno presente en el aire ordinario que se encuentra en elinterior del equipo.

Incubación de bacterias microaerofílicas: Como estas bacterias requie-ren de una baja tensión de oxígeno para poderse desarrollar, aunque puedenemplearse procedimientos físicos oxirreductores para este propósito, el métodomás empleado para propiciar esas condiciones, consiste en sembrar las mues-tras en medios de cultivo que contengan Fe2Co4, metabisulfíto de sodio o piruvatode sodio, que proporcionan a los microorganismos microaerofílicos una mayortolerancia al oxígeno.

Incubación de bacterias que requieren de CO2 : Todos los microorganismosrequieren carbono en forma de CO2 y la mayoría utilizan el que está presente en elaire, pero aquellas especies que necesitan este elemento en mayor proporción, sele debe suministrar durante la incubación, para lo cual existen diversos todos:

a) Método de la vela: Es muy sencillo de realizar. Consiste en colocar en elinterior de un frasco de cristal de tamaño apropiado y provisto de tapa derosca, las placas o tubos sembrados, conjuntamente con los cultivos se intro-duce un pedacito pequeño de algodón humedecido en agua, para que man-tenga la humedad necesaria y una vela, la cual se encenderá procediendo deinmediato a cerrar el frasco. La llama utilizará como comburente parte deloxigeno que quedó encerrado dentro del frasco. Cuando este proceso hayaconcluido la llama se apagará y en el interior del frasco producto de la combus-tión quedará una atmósfera con un 10 % de CO2. Seguidamente el frasco conlos cultivos será colocado en el interior de una incubadora ordinaria.

Fig. 44: Método de la vela

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b)Incubadora de CO2: Son incubadoras especiales, diseñadas para extraer un% de 02 deseado e intercambiarlo por un gas sustituto (CO2).

Incubación de bacteria anaerobias

La incubación de bacterias anaerobias se puede efectuar por diferentesmétodos:

a)Siembra en medios oxirreductores.b)Empleo de la jarra de "Brewer".c) Incubadora para anaerobios.

Siembra en medios de cultivo oxirreductores

En medio de cultivo líquido: El medio empleado contiene un compuestooxireductor; tioglicolato sódico que consume él oxigeno, estableciendo condicio-nes anaerobias. Después de realizada la incubación se efectuará en la mismaincubadora que se emplea para los cultivos aerobios.

En medio de cultivo sólido: Un medio de cultivo especial, agar anaerobioal glicolato u otro similar se vierte sobre la caja de una placa de "Petry" corrien-te y después de solidificado se le coloca encima una tapa especial de vidriodenominada cubierta de "Brewer", la cual está diseñada para quedar apoyadasobre los bordes de la caja interior y sobre el perímetro externo del medio decultivo de manera que en el área central del cultivo queda encerrado un espaciode aire.

Realizada la siembra, se cubre con la apa de "Brewer". El tioglicolato con-sume el oxigeno en el pequeño espacio de aire, estableciendo condicionesanaerobias, procediéndose a su incubación en una incubadora común para cul-tivos aerobios.

Fig. 45 : Placa de Brewer

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Empleo de la jarra de "Brewer": Es un recipiente cilíndrico, provisto deuna tapa que propicia un cierre hermético mediante un tornillo ubicado en suporción central. La jarra tiene un diámetro y altura que permite colocar en suinterior (una encima de la otra), unas 10 placas con cultivo. La tapa tiene insta-lada un elemento de calefacción rodeado de un catalizador platinado.

Fig. 46: Jarra de Brewer

Funcionamiento

Después de introducidas las muestras de cultivos, se produce a colocar latapa, de manera que no quede herméticamente cerrada, para lo cual se enros-cará el tornillo lo cual evitará que se produzca una explosión cuando se le sumi-nistre hidrógeno.

La tapa dispone de dos válvulas. En una de ellas se instala una mangueraconectada a una bomba de vacío para extraer el aire acumulado en el interior dela jarra. Por la otra válvula se le suministra el hidrógeno para reemplazar el aire.Cuando la capacidad de la jara es completada con este gas, se aprieta el tornillopara hermetizarla. La primera dosis de hidrógeno se debe botar para que salgael aire de la manguera. El poco oxigeno que puede quedar aún en el interior dela jarra es eliminado por el catalizador platinado que al activarse hace que secombine con el hidrógeno para formar agua o agua y dióxido de carbono, esta-bleciendo finalmente condiciones anaerobias. En estas condiciones la jarra escolocada en el interior de la incubadora para que le proporcione a los cultivos elcalor necesario, no debiendo abrirse antes de las 48 horas.

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En la actualidad se comercializan diversos productos oxirreductores que seintroducen en la jarra con los cultivos y suplen la función de esta, es decir, sinser necesario hacer vacío para extraer el aire ni inyectar hidrógeno.Incubadora para anaerobios

Se trata de un moderno equipo, con similar capacidad que las incubadoraspara cultivos aerobios que funciona bajo el mismo principio que la jarra de Brewer,con la ventaja que nos permite disponer de mas espacio y estudiar una mayorcantidad de cultivos.

Baño de agua caliente. (Baño de María)

El baño de agua caliente, comúnmente conocido como "baño de Maria" esutilizado en diversos procederes de laboratorio. Mediante este método se pue-den alcanzar valores por encima de la temperatura ambiente hasta un máximode 1000 C con o sin regulación termostática.

Baño de agua caliente sin regulación termostática

Cuando se recurra a esta variante se debe emplear un recipiente metálicoo de vidrio de fondo plano, dentro del cual se verterá agua destilada hastaalcanzar el nivel necesario, de manera, que el material a examinar depositadodentro de un tubo de ensayo, quede por debajo del nivel del agua. Conjunta-mente con la muestra será introducido en el baño un termómetro de mercuriocolocado previamente dentro de un tubo de ensayo, debiendo quedar a lamisma altura que la muestra. En estas condiciones, el recipiente se colocasobre una fuente de calor, que puede ser de gas o eléctrica. Cuando se utilizael mechero de gas debe situarse sobre el trípode una malla de amianto, paraque el calor se distribuya lo mas uniformemente posible por todo el fondo delrecipiente, debiendo bajarse la llama o incluso apagarla cuando el termómetromarque dos o tres grados por debajo de la temperatura deseada, volviendo aencenderla cuando la columna de mercurio comience a descender mante-niendo este control, durante todo el tiempo que dure la exposición de la mues-tra al calor.

Cuando se emplean hornillas eléctricas, faltando 2 ó 30 C, el recipientepuede ser separado de esa fuente de calor, ya que aún después de apagada,mantiene por algunos momentos la intensidad calorífica.

Como se puede apreciar el empleo de este procedimiento es engorroso porlo laborioso que resulta y la imposibilidad de mantener estable el nivel de tempe-ratura de la muestra. En la práctica el baño de agua sin regulación termostáticase emplea casi exclusivamente cuando se requiere temperatura de ebullición.

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Baño de agua con regulación termostática

Se trata de un equipo diseñado con material inoxidable que tiene la forma de uncajón rectangular. De acuerdo al modelo su tamaño será variable, pero con la capa-cidad suficiente, como para permitir la colocación en su interior de varias gradillas.

Funcionamiento

En el interior del equipo se vierte agua destilada hasta alcanzar el nivelpertinente. A continuación se introducen las gradillas con los tubos que contie-nen las muestras, las cuales deben quedar por debajo del nivel del agua.

Estos equipos siempre son eléctricos. Después de accionar el interruptor segira el botón hasta que indique la temperatura deseada y se hace girar igual-mente el botón del "Timer" para indicar el tiempo requerido de exposición alcalor.

El calor es suministrado por una resistencia eléctrica, ubicada generalmen-te en la base del equipo, la cual es regulada por un termostato que mantieneautomáticamente el grado de temperatura al nivel deseado. Algunos modelosestán provistos de un aditamento similar a un pequeño ventilador, ubicado gene-ralmente en el extremo posterior, sumergido en el agua. Al ser encendido elequipo, las aspas comienzan a girar agitando constantemente el agua, lo quepropicia que la temperatura se mantenga homogénea.

Algunos modelos cuentan con un termómetro de mercurio acoplado, que varegistrando la temperatura del agua. En su efecto se debe introducir un termó-metro dentro de un tubo de ensayo, y colocarlo en la gradilla debiendo quedar elvástago al mismo nivel que las muestras.

Importante

El agua a emplear para el baño de agua caliente, debe ser siempre destila-da, ya que las sales que el agua cruda al evaporarse tiende a formar capassobre las paredes internas y el fondo del depósito pueden deteriorar al equipo.

Fig. 47 : Baño de agua

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Uso

El baño de agua caliente, tiene diversos usos. En el laboratorio de microbio-logía se emplea frecuentemente para inactivar el complemento de sueros quevan a ser sometidos a procedimientos serológicos.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuales son las diferencias y semejanzas entre el horno y la incubadora?2. Describa el diseño o modelo de una incubadora.3. ¿Para que se utiliza la incubadora?4. ¿Cómo se clasifican los microorganismos de acuerdo al rango de tempe-

ratura óptima para su desarrollo?5. ¿Por qué causa los microorganismos mesófilos son los que con mayor

frecuencia infectan al hombre?6. ¿Cómo se clasifican los microorganismos de acuerdo a sus necesidades

de oxigeno?7. ¿Cómo Ud. puede proporcionar una atmósfera microaereofílica?8. ¿Cómo Ud. puede proporcionar un 10 % de CO2 a las bacterias que así

lo requieran?9. Describe el método de la vela.

10. Mencione los diferentes métodos de incubación anaeróbica.11. ¿Para que se utiliza la jarra de "Brewer?"12. Explique cómo es el funcionamiento de una jarra de "Brewer"13. ¿Cuántos tipos de baño de agua Ud. conoce?14. ¿Cuál es la fuente de calor de los baños de agua con regulación termos- tática?15. ¿Por qué causa se debe emplear agua destilada en los baños de agua?16. ¿Cuál es la función de las aspas que poseen algunos baños de agua?17. ¿Cómo se regula la temperatura del baño de agua?

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CAPITULO 8

MICROSCOPIO

INTRODUCCIÓN

La tierra se formó hace miles de millones de años y desde sus albores sedesarrollaron los primeros microorganismos a partir de las estructuras pre-bio-lógicas existentes, originadas por la interacción de los compuestos orgánicos,que al evolucionar dieron lugar a la biogénesis de las bacterias primitivas, co-rrespondiendo por lo tanto a los microorganismos haber sido los primeros seresvivos del planeta. Con el decursar del tiempo, algunos fueron afectados por laacción de diversos agentes mutagénicos que alteraron su expresión fenotipal,transformándose en otros tipos de microorganismos más evolucionados, como:protozoarios, hongos y algas, diseminándose gradualmente en el aire, los suelosy las aguas, hasta poblar todo el globo terráqueo, de ahí que los microorganismospatógenos, hayan sido durante siglos y sean en la actualidad, los agentes infec-ciosos causales de la morbi-mortalidad en plantas y animales, afectando igual-mente a la especie humana desde el surgimiento del hombre primitivo hastanuestros días.

A pesar de que los microorganismos ya existían antes que el hombre y dehaber sido durante milenios los causantes de diversas enfermedades infeccio-sas, grandes epidemias y de pandemias que diezmaron poblaciones enteras, losconocimientos que el hombre tuvo durante siglos, acerca de las causas queoriginaban las enfermedades infecciosas eran meramente especulativos y porconsiguiente carentes de rigor científico, debido esencialmente al tamaño mi-croscópico de los diversos gérmenes que imposibilita su observación a simplevista y no disponerse en esas épocas de instrumentos técnicos como el micros-copio que dieron esa posibilidad, lo que impidió a los hombres de ciencia ver susrespectivas morfología y estructuras, estudiar su comportamiento y asociarlosdespués como los agentes causales de los procesos morbosos y/o letales.

El invento del microscopio fue el punto de partida, que dio lugar el surgi-miento de la microbiología como ciencia, estando su desarrollo ulterior influido,en gran medida, por el perfeccionamiento de las técnicas microscópicas.

El microscopio compuesto fue diseñado y construido por el inglés RobertHooke, en el año1665, basándose en el principio funcional del telescopio astro-nómico, inventado a principios de ese siglo por el físico-matemático, italiano,Galileo Galilei.

El microscopio de Hooke, consistió en un tubo cilíndrico de unos 15 cm delongitud, al que insertó en cada extremo, una lente de aumento. El tubo a su vez

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fue acoplado a un soporte previsto de platina para colocar las preparaciones aobservar. Este instrumento se complementaba con una fuente de luz accesoria.Como se puede apreciar la estructura básica del microscopio diseñado porHooke, no difiere esencialmente de la de los microscopios luminosos que seutilizan en la actualidad.

A pesar de que los lentes empleados por Hooke, podían proporcionar unaampliación suficiente, solo logró observar, algunos insectos de ínfimos tamaños,así como diversos tejidos vegetales y hongos microscópicos y algas, que comose sabe, constituyen los microorganismos de mayor talla, no logrando observara otros más pequeños como protozoarios y bacterias.

Probablemente sus limitadas observaciones se debieron a imprecisionestécnicas, relacionadas con el grosor de las preparaciones o el empleo deficientede iluminación.

En 1668, Antón Van Leeuwenhouek, un comerciante holandés, fabricantede gafas, tomando como referencia el invento de Hooke, fabricó un microsco-pio al cual dotó de poderosos lentes de aumentos y empleando técnicas másefectivas, logró observar todo lo visto por Hooke, así como bacterias yprotozoarios, en muestras examinadas de: sangre, pus, semen, heces, etc., de-nominando a estos microorganismos en su conjunto como "animálculos".

MICROSCOPIO. CONCEPTO

La palabra microscopio, proviene del prefijo micro que significa pequeño ydel sufijo skope, que quiere decir, examinar o ver.

Los microscopios son instrumentos ópticos o electrónicos con un elevadopoder resolutivo, que posibilita la observación de los microorganismos, células yotras estructuras microscópicas, al proporcionar una imagen aumentada virtual-mente del tamaño real a total magnitud que posibilitan su observación a travésde su empleo.

DIFERENTES TIPOS

Se fabrican dos tipos de microscopios: el óptico y el electrónico. De cadatipo se comercializan diferentes modelos y aditamentos especiales para propor-cionar determinados efectos, aunque todos tienen respectivamente el mismoprincipio.

Microscopio óptico

Concepto: Son instrumentos de laboratorio, diseñados básicamente con unasola lente o mediante un sistema de lentes de aumentos, que son ubicados

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alineadamente en el eje óptico del microscopio para que proporcionen una ima-gen virtual ampliada de los objetos microscópicos examinados, lo que hace po-sible su observación, siempre que se utilice una adecuada iluminación.

Clasificación

Los microscopios ópticos se clasifican en: simples y compuestos.

Microscopios simples

Están formados por una sola lente convergente, que proporciona una ima-gen virtual, no invertida, varias veces mayor que el tamaño real del objeto ob-servado. Debido a su limitada capacidad de ampliación, no se puede observarcon ellos objetos microscópicos, quedando restringido su empleo para el exa-men de diversas estructuras u organismos microscópicos muy pequeños, cuyosdetalles escapan a la agudeza visual del ojo humano, como por ejemplo: coloniasmuy pequeñas, desarrolladas en los cultivos, vermes de poca longitud, como elNecator americanus o el Enterovirus vermicularis, etc.

Entre los dispositivos utilizados se encuentran las lupas empleadas en lasprácticas de disección.

Para su manejo, se debe colocar la lente de manera que su cara plana omenos curva, quede hacia el objeto a examinar y observando por la cara opues-ta, aproximar el instrumento gradualmente, hasta una distancia focal menor quela empleada si se fuera a observar directamente.

Microscopio compuesto

A diferencia de los microscopios simples, los compuestos funcionan me-diante la combinación de varias lentes, que conjuntamente con una fuente deiluminación, forman parte de un sistema óptico, que tiene como soporte a un

Fig. 48 : Lupa

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sistema mecánico, provisto de diversas piezas y aditamentos que deben sermanipulados para lograr y mantener el enfoque de la preparación, recorrerla yobservar la cantidad de campos microscópicos que sean pertinentes.

Sistema mecánico

El sistema mecánico consta de las siguientes partes:

1. Base o pie.2. Brazo.3. Tubo óptico.4. Revolver portaobjetivos.5. Platina6. Tornillos.

Base o pie

Es la parte del microscopio que queda en contacto con la superficie de lamesa de trabajo. Su fondo plano y acentuado peso le proporcionan estabilidad almicroscopio y constituyen a aminorar los efectos de las vibraciones que causandistorsiones durante la observación. La base es el sostén donde se asientantodas las restantes partes del microscopio. Algunos modelos están provistos deuna charnela (pasador) que permite la inclinación hacia el observador de laparte superior del microscopio.

Brazo

Es una columna sólida y rectangular que se haya articulada por su extremoinferior a la base. En su trayectoria hacia la parte superior, algunos modelos

Fig. 49 : Microscopio óptico compuesto

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forman una curvatura, mientras que en otros su trayectoria es recta hasta másallá de la mitad de su longitud en que se dobla en dirección frontal, formandouna inclinación oblicua o un ángulo recto de 900.

En su parte superior, el brazo está articulado al tubo óptico o al cuerpobinocular, mientras que la porción media de su cara frontal sirve de asiento alextremo posterior de la platina.

Tubo óptico

En los microscopios monoculares, consiste en un tubo cilíndrico de 2,3 cmde diámetro, con una longitud de varios cm que varía según el modelo, encon-trándose rodeado por un tubo de mayor diámetro, denunciado fusil que articulaa la parte superior del brazo. El orificio superior se emplea para insertar la lenteocular, mientras que en el inferior se encuentra acoplado al revolver portaobjetivos.

En los microscopios binoculares, el extremo superior del tubo óptico notermina recto, sino que forma un cuerpo binocular, que consiste en una cajuelarectangular ubicada en posición horizontal que puede estar ligeramente inclina-da hacia el observador. En la superficie frontal presenta 2 tubos cortos de2,3 cm de diámetro donde se insertan los dos lentes oculares. En algunos mode-los, uno de los tubos, al menos, es giratorio al ser accionado se desplaza haciaarriba o hacia abajo, lo cual permite sincronizar la distancia de ambos lentes alas diferencias de potencialidad de cada ojo. Este cuerpo binocular, tiene ubica-do en el punto de contacto con el tubo óptico un prisma o espejo que refracta laimagen por igual hacia ambas lentes, disponiendo además, por la misma caradonde se hayan los tubos para insertar los lentes oculares, un mecanismo dedesplazamiento, consistente en dos tapas de corredera, que se accionan lateral-mente para ampliar o reducir la distancia entre ambos lentes, hasta hacerloscoincidir con la de los ojos del, observador, lo cual se logra cuando éste deje dever dos campos microscópicos separados o superpuestos y vea uno solo.

Revolver portaobjetivos

El revolver portaobjetivos es un disco plástico o metálico de unos 7 cm dediámetro que se encuentra atornillado por su eje a una pieza que rodea al tuboóptico denominado fusil, estando provisto de una tapa metálica giratoria de su-perficie cónica, provista de 3 ó 4 orificios de 2 cm de diámetro con rosca inter-na, ubicados equitativamente alrededor de su entorno a menos de un cm de suborde. En cada uno de estos orificios se enroscará un lente objetivo, cuya se-cuencia aproximada será de menor o mayor potencia de aumentos.

Cuando se requiera un mayor o menor aumento se hará girar, manualmenteel revolver hacia la derecha o hacia la izquierda hasta ubicar el lente deseado

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sobre el orificio de la platina, quedando la parte posterior del lente frente al tuboocular. El disco fijo tiene en su extremo frontal una pequeña hendidura y el girato-rio presenta un pequeño saliente frente al orificio donde se enrosca cada lenteobjetivo. Al rotar el disco y ubicar el lente deseado sobre el orificio de la platina,coincide con que el saliente se introduce en la hendidura produciendo un ligerosonido audible al acoplarse que indica que la lente está ubicada correctamente.

La platina

La platina es una doble plataforma metálica de color negro o gris de aspec-to mate. Generalmente es de forma cuadrada y mide unos 15 cm2 de superficiex 1 a 2 cm de grosor, pudiendo en algunos modelos ser circular. Presenta en suporción central un orificio circular de unos 5 cm de diámetro, por donde pasa laluz procedente de la fuente de iluminación. En algunos modelos el orificio esovoide.

La platina está provista de pinzas, que se utilizan para sujetar las láminasportaobjetos que contiene la preparación a observar. Estas pinzas, en algunosmodelos son fijas, mientras que en otros, se encuentran articuladas a un sistemade rodamiento formado por dos cremalleras y dos tornillos, engranados respec-tivamente a cada una de ellas. Mediante movimientos de rotación que se impri-men a uno de los tornillos se propicia el desplazamiento de la pinza hacia uno uotro lateral y con el accionar del otro se desplaza la plataforma superior de laplatina hacia delante o hacia atrás.

Fig. 50 : Revólver portaobjetivos

Fig. 5l: Diferentes formas de platinas y pinzas

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La mayoría de los microscopios que se emplean en la actualidad, tienengrabada sobre el borde frontal de la platina una escala graduada de 0 a 80 mm,junto con un nonio, y en el borde lateral derecho otra con el rango de 80 a 110mm provista igualmente de un nonio. Estas escalas permiten al microscopistaubicar la posición de un campo microscópico que desea posteriormente volver aver, para lo cual anotará las coordenadas que le proporcionan ambas escalas, loque facilitará la localización del campo con rapidez sin tener que rastrear toda lapreparación.

Tornillos

Además de los tornillos de la platina, los microscopios están provistos deotros 3 tornillos; el macrométrico, el micrométrico y el del elevador del conden-sador.

Es la parte superior del brazo, algunos microscopios presentan dos orificios,uno debajo del otro, que lo atraviesan de lado a lado. En el que está ubicado enla parte superior se inserta el tornillo macrométrico (uno por cada lado) y en elorificio inferior, de similar manera el tornillo micrométrico.

Estructuralmente ambos tornillos son iguales, con la única diferencia de queel tornillo micrométrico es más pequeño.

Cuando los tornillos son introducidos en sus orificios respectivos solo que-dan externamente sus cabezas, las cuales son de forma circular con un tamañode varios cm de diámetro por 1 ó más de ancho, con el borde estriadotransversalmente para facilitar el agarre manual al imprimirle movimientos derotación. El vástago helicoidal de cada tornillo que penetra en el orificio terminaen un pequeño piñón (rueda dentada) que se engrana a la cremallera del tuboóptico, lo que propicia al accionar el tornillo, transformar el movimiento rotatoriodel piñón en movimiento rectilíneo del tubo óptico en dirección ascendente odescendente para hallar la distancia focal.

El piñón del tornillo macrométrico tiene separado los dientes a la mismadistancia que los de la cremallera, lo que propicia imprimirle movimientos rápi-dos de desplazamiento al tubo óptico con lo que se consigue con prontitud elenfoque grosero de la preparación.

En cambio el piñón del tornillo micrométrico tiene los dientes más unidos, loque no le permite engranarse directamente a la cremallera, sino a través de unpiñón similar al del tornillo macrométrico que tiene acoplado un uno de suslaterales a otro más pequeño con los dientes a igual distancia que los del tornillomicrométrico. Esta diferencia mecánica propicia un desplazamiento muy lentodel tubo óptico, con el que se logra la nitidez del enfoque.

En otros modelos de microscopios el tubo óptico es fijo y la distancia focalse consigue, mediante el desplazamiento ascendente o descendente de la platina,

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por un mecanismo similar, mediante los tornillos macrométricos y micrométricos,mientras que en otros, ambos tornillos están acoplados, quedando el micrométricoinsertado en el centro del macrométrico.

El funcionamiento para subir o bajar el condensador tiene el mismo meca-nismo que el empleado para los tornillos macrométricos. Este tornillo quedamuy próximo al condensador y se acciona en uno u otro sentido según sean losrequerimientos de iluminación de acuerdo al tipo de microscopía que se vaya arealizar.

Sistema óptico. Diferentes partes

El sistema óptico está formado por las diferentes partes provistas de lentesy de las que intervienen en la iluminación, siendo las siguientes:

_ Lentes oculares_ Lentes objetivos_ Condensador_ Diafragma_ Espejo_ Fuente de luz_ Filtros

Los lentes

Los lentes empleados en la fabricación de los microscopios son discos puli-dos y transparentes, siendo al menos, una de sus dos superficies, convexa.Miden desde unos pocos mm hasta varios cm y tienen la propiedad de propor-cionar una imagen del objeto observado aumentada de tamaño.

Lentes oculares

Fig. 52: Lentes oculares

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Antiguamente los lentes oculares disponían de una sola lente, pero desdehace años se viene utilizando un sistema de 2 lentes colocados en el interior deun pequeño tubito cilíndrico de 2,2 cm de diámetro x 3 ó más cm de largo, que lesirven de soporte, quedando separados entre sí, por un diafragma anular enforma de arandela, que se haya insertado en la porción media del tubo. La lenteubicada en el extremo superior mide 1,7 cm de diámetro, es plano-convexa,teniendo el lado plano dirigido hacia el interior del tubo. La segunda lente esbiconvexa, mide 2,1 cm de diámetro y está ubicada en el extremo posterior deltubito, el cual dispone de una tapa de rosca de color negro provista de un criteriocentral de 1,9 cm, que al ser enroscada suavemente la lente inmovilizándola,pudiendo ser observada a través del orificio. En algunos modelos esta lente seencuentra empotrada en la misma tapa.

La tapa tiene grabado en su superficie un número seguido de una "x", queindica su poder de ampliación. Por ejemplo: 10x, lo que significa que esa lenteaumenta virtualmente el tamaño real del objeto observado en una imagen 10veces mayor.

Los lentes oculares que se utilizan con mayor frecuencia, son los que pro-porcionan los siguientes aumentos: 6x, 8x, 10x, 12,5x y 15x. Este pequeño tubo,portador de las lentes, está calibrado para que pueda ser insertado en el interiordel tubo óptico, quedando retenido en su descenso por el borde de la tapa quetiene un mayor diámetro.

Los microscopios monoculares están diseñados para trabajar con un sololente ocular y los binoculares con dos.

La función de los lentes oculares es la de ampliar virtualmente, la imagenformada ampliada por el lente objetivo y corregir las aberraciones cromáticas yde esferidad debidas a la curvatura de la lente, mediante la combinación devarias lentes con distintos radios de curvatura o suprimiendo por medio deldiafragma anular los rayos que atraviesan la porción periférica de la lente.

Lentes objetivos

Los lentes objetivos constituyen la parte más importante del sistema ópticodel microscopio, ya que mediante su poder de resolución es posible observarseparados dos objetos microscópicos muy próximos entre sí.

Al igual que los lentes oculares, los lentes objetivos, están formados por unsistema de varias lentes, colcadas en el interior de un pequeño tubito cilíndrico,que a diferencia del que porta las lentes oculares... está formado por tres piezasdesarmables; la primera es un fino tubito que contiene las lentes, provisto derosca en su extremo posterior, mientras que el extremo frontal o inferior, apocos mm de su terminación se va estrechando cónicamente, para finalmenteterminar plano, como si se hubiera cortado la punta del cono, quedando la aber-

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tura del tubo con un diámetro reducido de 1 a 5 mm, por donde se puede obser-var la cara plana de la lente plano convexa que está en contacto con el pequeñoorificio. Esto se debe a que las lentes oculares deben ser pequeñas, ya que entremenor sea su diámetro, mayor será su capacidad de ampliación. La segunda, esla base, una especie de unión universal, de 2,2 cm de diámetro x 2 ó 3 mm degrosor, estriada transversalmente como algunas monedas, teniendo por amboslados un saliente anular adjunto de menor diámetro de 2 ó 3 mm de longitud, loscuales están diseñados con rosca externa y uno solo de ellos, además, con roscainterna, por donde se enrosca el tubito portador de las lentes. La tercera pieza,es una cánula cilíndrica que se ensambla a la base por la rosca externa delmismo saliente donde se enroscó el tubito portador de las lentes por su roscainterna. Al quedar ensamblado el lente objetivo, la cánula rodeará a todo eltubito menos por extremo cónico. En estas condiciones el lente objetivo podráser colocado en uno de los orificios del revolver portaobjetivos, mediante larosca que se encuentra en el lado opuesto.

Diferentes tipos de lentes objetivos

Existen dos tipos de lentes objetivos; los secos y los de inmersión.

Los objetivos secos alcanzan la distancia focal a varios cm por encima de lapreparación, quedando un espacio de aire entre la lámina cubreobjetos y lalente. Este tipo de objetivo se fabrica, con diferentes potencias de aumento. Elde menor aumento (5x ó 6x) es el más corto de todos y se caracteriza porproporcionar la observación de un área extensa de la preparación, por lo que sele conoce también como lente explorador. Debido a su baja potencia de amplia-ción no es posible observar con este lente a las bacterias, protozoarios y otromicroorganismos de dimensiones microscópicas muy pequeñas. Los lentes ob-jetivos de 10x ó 20x, son más largos, proporcionan un aumento mayor que elexplorador, aunque todavía insuficiente para observar con nitidez microorganismos

Fig. 53 : Lentes objetivos: a) Objetivos secos; b) Objetivo de imersión

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muy pequeños como las bacterias, aunque pueden ser factibles a microscopistascon experiencia para identificar huevos de helmintos y otros elementos de inte-rés de tamaño similar. Este lente se le conoce también como seco débil. El máslargo de los tres es el de 40x ó 45x, que abarca un área más reducida de lapreparación, pero proporciona un aumento lo suficientemente amplio, como parapermitir la observación detallada de algunos microorganismos como protozoariosy hongos, así como: huevos y larvas de helmintos, células, artefactos y otroselementos de interés de tamaño similar, resultando aún insuficiente para laobservación pormenorizada de bacterias, particularmente de las cocáceas porsu íntimo tamaño. Este lente se conoce también como seco fuerte.

Lente de inmersión se diferencia de los secos, no solo por ser más largo,sino además, por tener, generalmente, una franja de color negro a su alrededory grabadas en su cánula la sigla HI(Homg Inmersión) u OI(Oil Inmersión), asícomo su potencia de aumento (90x a 100x) que depende enteramente del gradode ampliación que proporcione la lente frontal, ya que las demás ubicadas den-tro del tubito son de corrección.

En el orificio anterior del tubito, se haya la lente frontal, mide escasamente1 mm de diámetro, de ahí, que para poder captar los rayos luminosos proceden-tes del condensador, que han atravesado la preparación, que tenga que estarsituado a 1 ó 1,5 mm de la misma. Como el espacio de la distancia focal es tanreducido se corre el riesgo de incurrir en la impericia de presionar la prepara-ción con el lente, provocando no solo la ruptura de la lámina, sino además pu-diendo ocasionar daños, en ocasiones irreparables a la propia lente. Para evitarestos accidentes, generalmente, el tubito portador de las lentes se diseña deforma retráctil, está estructurado por dos tubitos de diámetro ligeramente dife-rentes, lo que propicia que el ponga las lentes pueda introducirse calibradamentedentro del otro, disponiendo además de un pequeño resorte que mantiene fija alas dos partes, pero posibilitando que cuando la parte inferior que contiene lalente frontal sea presionada sobre la lámina, se introduzca unos mm dentro de laexterno, volviendo a su posición normal cuando cesa la presión, como si fueraun pistón. Los rayos de luz al pasar de un medio a otro con diferente índice derefracción tiende a desviarse por reflexión. Cuando se emplean objetivos deinmersión, a pesar de que la distancia que separa a la lente de la preparaciónsea escasamente de 1 mm, este fenómeno ocurre. Para evitarlo, se debe colo-car sobre la preparación una gota de un líquido cuyo índice de refracción seamás elevado que el del aire y muy próximo al vidrio de la lente, que es de 1.52,en el que quede inmersa la lente. El líquido empleado tradicionalmente ha sido elaceite de cedro, cuyo índice de refracción es de 1.52. Al cubrirse el espacio deaire por el aceite los rayos de luz que han atravesado la preparación asciendeperpendicularmente hacia la lente sin refractarse significativamente, lo que sí,ocurre, cuando se utilizan lentes objetivos secos.

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El aceite de cedro tiene el inconveniente de oxidarse con el aire, adquirien-do una consistencia muy viscosa, que con el tiempo afecta la calidad de la lente,aunque se limpien adecuadamente después de su uso, por lo que, en la actuali-dad se emplean otros aceites para microscopios más estables, con las mismasventajas, pero dañando menos las lentes.

La función de los lentes objetivos es formar la imagen del objeto observadoy ampliarla virtualmente de acuerdo a su potencial de aumento.

Aumento total que proporciona el microscopio: Para conocer el número dediámetro en que se amplia virtualmente el objeto observado, se procede a mul-tiplicar el valor de ampliación que está grabado en el lente objetivo, por el valorde ampliación del lente ocular. Ejemplo: si la ampliación del lente objetivo fuerade 20x y el del ocular 10x, entonces, 20.10=200. Por lo tanto el aumento totalsería de 200x.

Condensador

El condensador de campo claro o brillante, está compuesto por 2 lentesconvergentes de desigual, tamaño, ubicadas en el interior de un dispositivo cilín-drico de 3 cm de diámetro, que tiene la parte superior ligeramente cónica, con elextremo de su vértice cortado, donde se encuentra un orificio de menos de 1 cmde diámetro, ocupado por la cara plana de la lente más pequeña que es plano-convexa. La segunda lente es biconvexa, siendo de mayor tamaño, encontrán-dose ubicada por su lado menos curvo a corta distancia de la lente más pequeña.

El condensador se introduce de abajo hacia arriba, dentro de un dispositivoanular, que se haya justamente debajo del orificio de la platina, siendo inmovili-zado mediante un fino tornillo, quedando ambas lentes en posición perpendicular

Fig. 54: Condensador luminoso

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con respecto al lente objetivo. Este dispositivo a su vez, está articulado a unapieza angular que lo fija a la parte inferior del brazo, muy próximo a la base,estando provisto de un tornillo engranado a una cremallera, que se utiliza comoelevador del condensador al propiciar con su accionar su desplazamiento verti-cal ascendente o descendente, según sea necesaria una mayor o menor intensi-dad de luz.

La función del condensador es hacer los rayos luminosos procedentes di-rectamente de la lámpara e indirectamente por reflexión del espejo, se refracten(desvíen) al atravesar las lentes convergentes, formando un cono de luz, encuyo vértice se intensifica un foco luminoso, por la convergencia de los rayos deluz que al atravesar todo el sistema, salen paralelos al eje principal incidiendosobre el objeto a observar, para después atravesarlo y seguir su trayectoriaperpendicularmente, sino divergen, hacia la lente frontal del objetivo.

Su colocación, muy próxima a la cara posterior del portaobjetos reduce ladivergencia de los rayos de luz, con lo que se logra una mayor iluminación queresulta imprescindible cuando se hacen observaciones a grandes aumentos.

Diafragma de Iris

Es un accesorio del condensador, consistente en un fino disco metálico,diseñado con múltiples laminillas planas superpuestas consecutivamente queadoptan el aspecto de un abanico plegable, encontrándose acoplado en el extre-mo del orificio posterior del condensador, debajo de la lente biconvexa, cubrien-do todo ese diámetro.

El condensador presenta, muy próximo a su base, una ranura que los bor-dea horizontalmente, de cuyo interior sale una pequeña palanquita plana, quepuede ser desplazada hacia delante o hacia atrás de la ranura. Cuando el movi-miento se produce hacia delante, las laminillas del diafragma se despliegan ha-cia el entorno del cilindro, lo que da lugar, al recogerse, a la formación de unorificio de diámetro variable en el centro del diafragma. Si la palanquita fuerahacia atrás, sucedería todo lo contrario, ya que las laminillas se desplazarían

Fig. 55: Diafragma: a) Diafragma iris; b) Diafragma anular.

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hacia el centro, cerrándose, para reducir progresivamente el diámetro delorificio.

El diafragma se utiliza para regular la cantidad de rayos luminosos quedeben pasar al interior del condensador. Cuando pretendemos realizar unamicroscopía donde el exceso de iluminación, lejos de beneficiar, afectan la cali-dad de la observación se cierra total o parcialmente el diafragma y cuandonecesitamos más intensidad de luz se va abriendo hasta obtener la requerida.

Espejo

El espejo de los microscopios es circular, mide unos 5 cm de diámetro yconsta de dos espejos adosados por su reverso, uno de los cuales tiene la super-ficie plana y el otro cóncava. La primera se utiliza cuando la fuente de luz esnatural y la segunda cuando se emplea iluminación artificial. Ambos espejos seencuentran montados conjuntamente dentro de un fino aro metálico de unos 5mm de ancho que les sirven de marco, teniendo por cada lateral de su líneaecuatorial, un fino orificio de 1 mm de diámetro por donde se articula a dospequeños salientes puntiformes que se hayan en cada extremo de una planchuelacurva acoplada por su centro a un pequeño vástago cilíndrico, dándole un as-pecto de horquetilla. El extremo posterior del vástago se introduce en un orificiopresente en el extremo inferior del brazo donde se fija. De esta manera elespejo puede ser movido por rotación, mediante las articulaciones laterales,para seleccionar la cara a emplear o conjuntamente, mediante la rotación delvástago, para hallar el ángulo adecuado que propicie la reflexión del espectroluminoso procedente de la lámpara hacia el condensador.

Lámpara

Las lámparas utilizadas, como parte del módulo del microscopio óptico, de-ben proporcionar para la microscopía ordinaria, una luz monocromática de cortalongitud de onda. En los microscopios modernos, la lámpara está acoplada en labase aunque todavía se utilizan modelos, donde se encuentra separada. En am-bos casos la lámpara forma parte de un soporte diseñado para proyectar me-

Fig. 56 : Espejo

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diante un reteden sus emanaciones como un cono de luz, de manera similar acomo lo hace una linterna. La mayoría de dichos soportes se fabrican con diver-sos aditamentos para optimizar el empleo de la iluminación, tales como: portafiltros,diafragma y reóstato, este último para regular la intensidad de la luz.

Cuando la lámpara está separada del microscopio, debe proyectarse el hazde luz de manera que incida directamente sobre el espejo, para que los rayossean dirigidos por reflexión hacia el condensador.

Filtros

Son dispositivos de vidrio, que se caracterizan por ser transparentes, esféri-cos y planos, miden de 2 a 3 cm de diámetro y tienen un determinado color. Sufunción es la de absorber las longitudes de ondas de determinados colores paraproporcionar una luz que mejore la observación microscópica.

Principios básicos

Los principios básicos en que se sustenta el empleo utilitario de los micros-copios son esencialmente de:

_ Su poder de resolución._ La capacidad de formar imágenes.

Fig. 57 : Lámpara

Fig. 58 : Filtros

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Poder de resolución

El poder de resolución es equivalente a la potencia de observación, lo cualestá delimitado por la menor distancia entre dos puntos muy próximos entre sí,en que es posible observarlos separadamente. Si la distancia se acortara y elpoder de resolución del observador ya hubiera llegado a su límite , no podrádistinguir la separación entre ambos puntos y para su percepción estarán uni-dos. Por ejemplo, el ojo humano no puede distinguir la separación de dos puntosque estén a menos de 0,2 mm de distancia, por lo tanto su poder de resolución esde 0,2 mm, por lo que cualquier objeto con un tamaño inferior a esa medida leresultará imperceptible.

Como el microscopio está estructurado con lentes que amplían virtual-mente la imagen del objeto real, su poder de resolución será mayor, en depen-dencia del aumento, pudiendo alcanzar hasta 0,2 (micrómetros) estandolimitada su potencia a esa magnitud, las limita cuando el tamaño de la longitudde onda de la luz.

Formación de imágenes

En dependencia del grosor y la densidad óptica que tenga cada parte delobjeto a observar, los rayos de luz que lo atraviesan sufren un retraso propor-ciona en su trayectoria con respecto a los que siguieron directamente hacia ellente objetivo. Al reunirse en la lente todos los rayos, el brillo ocasionado porlos que no tuvieron interferencia, las sombras producidas por la densidadóptica de cada parte del objeto y la oscuridad proporcionada por su grosor,darán lugar a una diversidad de tonos y matices con los que se produce laformación de imagen.

Percepción de la imagen

Los rayos del haz de luz empleados en la microscopía, no ascienden per-pendicularmente a través del sistema óptico, ya que al atravesar en su trayec-toria, las diferentes lentes y la preparación , así como los espacios de aire,que tienen diferentes densidades ópticas se refractan (desvían) en cada oca-sión, dispersando o concentrándose, entrecruzándose entre sí, lo que da lugara que la imagen del objeto llegue a la retina del ojo con una ubicación inverti-da, observándose los elementos que están a la izquierda de la preparación, ala derecha del campo microscópico y los que están arriba se observan debajoo viceversa.

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Indicaciones para el manejo del microscopio óptico

El requisito primordial para efectuar una adecuada microscopía es, el dedisponer de condiciones mínimas de confort para su realización. Cuando éstasno existen o son deficitaria la tendencia es el apresuramiento, con lo que afectala calidad de los resultados . en este sentido la superficie de la mesa o mesetadonde esté colocado el microscopio debe ser lisa y sólida, preferentemente decolor negro y aspecto mate para que no se refleje la luz. La silla o banquetautilizada por el microscopista debe tener un altura adecuada en relación con lamesa, que resulte cómoda para la manipulación y observación a través del mi-croscopio, debiendo tener respaldar.

Pasos a seguir

1. Cerciorarse de que el aumento del lente ocular es el pertinente para eltipo de microscopía que va a realizar.

2. Rote el revolver portaobjetivos y coloque sobre el hueco de la platina ellente objetivo de menor aumento.

3. Accione el tornillo del elevador y suba el condensador.4. Mueva la palanquita y abra el diafragma.5.- Si requiere utilizar el espejo, seleccionar la cara plana o cóncava, según

sea el tipo de iluminación a emplear (natural o artificial).6. Si el microscopio fuera monocular, mirando por la lente ocular, proceda a

mover convencionalmente el espejo de manera que los rayos de luz proceden-tes de la fuente de iluminación se reflejen y los desvíen hacia el condensador, locual se podrá constatar cuando el campo microscópico se observe completa-mente iluminado. Si el microscopio carece de espejo por disponer de una lám-para acoplada en su base, Bastará con encenderla. Si fuera un microscopiobinocular, previamente, mueva lateralmente los lentes hasta Hacerlos coincidircon la distancia intrapupilar, que logrará con exactitud cuando vea un solocampo, procediendo a manipular el espejo en la forma explicada.

Fig. 59 : Percepción de la imagen microscópica

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7. Coloque la lámina portaobjetos con la preparación sobre la platina y fíjelacon las pinzas.

8. Con ayuda de los tornillos de desplazamientos laterales o frontales mue-va la preparación hasta situarla debajo del lente objetivo.

9. Ladeando la cabeza, para observar directamente la operación, aproxi-me, con ayuda del tornillo macrométrico el lente objetivo seco, hastaque quede a 4 ó 5 mm de la preparación. Si fuera a utilizar el lente deinmersión, coloque previamente sobre la preparación una gota de aceitede cedro y al aproximar la lente haga que ésta contacte con la gota deaceite, quedando aproximadamente a 1mm de la lámina.

10. Mirando por el lente ocular, proceda a separar lentamente el lente objetivode la preparación con ayuda del tornillo macrométrico hasta que logreavizorar la imagen microscópica. Seguidamente gire el tornillo micrométricohasta que el enfoque sea nítido.

11. Si el enfoque se realizó con objetivo seco de poco aumento y se requiereun objetivo de más aumento, rote el revolver portaobjetivos y sitúe sobrela preparación el lente requerido. Si el microscopio está debidamenteajustado, al cambiar el lente objetivo debe quedar enfocado el mismocampo pero con menos radio de observación.

12. Ajuste la altura del condensador y la abertura del diafragma a las necesi-dades de iluminación de la microscopía que vaya a efectuar.

13. Para recorrer la preparación y observar los campos necesarios, accionecon su mano derecha los tornillos de la platina y desplace la lámina endiferentes direcciones, y con su mano izquierda accione el tornillomicrométrico para ir corrigiendo el enfoque cuando la lámina esté enmovimiento.

Nota. Si está utilizando un microscopio monocular, alterne los ojos durante la observa-ción y mantenga el que no esté utilizando abierto. Si la microscopía a realizar requierede filtro, utilice el correcto.

Otras variantes del microscopio óptico

El microscopio óptico de campo brillante es el que se utiliza corrientementeen el trabajo cotidiano del laboratorio, pero no siempre resulta eficaz para larealización de determinados exámenes, requiriéndose otras variantes microscó-picas con las que se pueda obtener los resultados requeridos. Entre las másempleadas en el laboratorio de microbiología se encuentran las siguientes:

_ Microscopía de campo oscuro.

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_ Microscopía de contraste de fase._ Microscopía de fluorescencia.

En la actualidad las empresas dedicadas a la fabricación de microscopios,comercializan modelos multipropósitos, diseñados de tal manera que puedan serintercambiables; tubos ópticos, condensadores, etc.

Microscopía de campo oscuro

Para la realización de este tipo de microscopía se procede a retirar delmicroscopio óptico, el condensador de "Abbe", colocando en su lugar uno decampo oscuro.

Este tipo de condensador está provisto de un aditamento circular opaco, demenor diámetro que el orificio posterior que se encuentra ubicado debajo de lalente, teniendo la función de impedir el paso del haz de luz hacia el área centraldel condensador posibilitando solamente la entrada de los rayos periféricos, losque al refractarse en su interior, atraviesan la lámina portaobjetos en formaoblicua como un cono hueco de luz con su vértice hacia abajo. Cualquier objetocolocado en la trayectoria de los rayos luminosos será atravesado por éstos oiluminados indirectamente. Como el rayo de luz no penetra en el tubo óptico, noilumina por lo tanto los ojos del observador, que vera como resultado un campomicroscópico de color negro (campo oscuro). Los rayos que atraviesan laspartículas que se hayan en la preparación, o las iluminan indirectamente, creanun efecto que proporcionan la observación de las partículas con un aspectobrillante sobre fondo oscuro, de similar manera, que cuando se observan lasestrella en la noche.

Fig. 60 : Condensador de campo oscuro

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La microscopía de campo oscuro se utiliza para la observación demicroorganismos y otros elementos de interés que no resultan factibles de sercoloreados. Al no sufrir efectos tóxicos de las sustancias colorantes se mantie-nen viables, lo que permite estudiar su motilidad.

Microscopía de contraste de fase

Las diferentes partes de las células, no cambian significativamente la am-plitud de los rayos de luz que las atraviesan, pero al tener diferencias en ladensidad de sus respectivas estructuras, obviamente, sí cambiandiferenciadamente la fase (dirección) de la onda luminosa. Como el ojo no essensible a los cambios de fase por ser muy imperceptibles, la microscopía ordi-naria no posibilita que se pueden detectar las diferencias. El método de contras-te de fase proporciona que se pongan en evidencia cambios de fase mediante suamplitud lo que hace posible distinguir por contraste las estructuras celularesentre sí y diferenciar a estas de su entorno. Para la realización de la microscopíade contraste de fase se requiere acoplar dos aditamentos al microscopio ordina-rio: un diafragma anular y una placa de cambio de fase.

Diafragma anular: Es un disco opaco, de unos 2 cm, que presenta en sudiámetro medio un aro transparente. Este disco se acopla en la parte inferior delcondensador, de manera que al haz de luz que lo atraviesa pasa al condensadorcomo un aro hueco de luz.

Placa de cambio de fase: Es una placa transparente de forma circular, quetiene en su diámetro medio un aro de vidrio óptico. Esta placa se sitúa debajo dellente ocular.

Funcionamiento: Debido a la forma anular del diafragma, la luz pasa alcondensador en forma de aro. Al atravesar el objeto, prosigue su trayectoria porel tubo óptico hacia el lente ocular, mientras que los rayos no pasan alrededordel objeto se dispensan. Al proseguir su trayectoria estos rayos atraviesan el aro

Fig. 6l: Aditamentos para la microscopía de contraste de fase: a) Diafragma anular;b)Placa de cambio de fases

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de vidrio óptico de la placa de cambio de fase. Como resultado los rayos que serefractan para luego pasar por el anillo óptico de la placa de cambio de fase,sufren un notable retraso en su velocidad de traslación con respecto a los rayosque transitaron normalmente después de atravesar el objeto, lo que ocasiona unacentuado contraste de brillo y oscuridad que propicia distinguir por contrastelos componentes de la estructura celular.

Empleo: Cuando no existen marcadas diferencias en la densidad óptica delas diversas estructuras celulares o el índice de refracción entre las células y loslíquidos circundantes no están suficientemente contrastados en cuanto a brillo,sombra u oscuridad, que posibilitan su observación con una microscopía ordinaria.

La placa de contraste de fase amplía significativamente las diferencias en-tre las ondas luminosas refractadas y las que no lo están, haciendo factible larealización de exámenes directos en fresco, sin la aplicación de colorantes, paraobservar microorganismos presentes en líquidos igualmente transparentes.

Microscopía de fluorescencia

El principio de este método, difiere del de otras formas de microscopíaóptica, en que no utiliza directamente la luz incidente, sino que emplea fuentesindirectas de energía luminosa, obtenida mediante la aplicación de ciertos com-puestos denominados fluocromos, que tienen la propiedad de absorber la luz

Fig. 62: Trayectoria del haz de luz en la microscopía de contraste de fase

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ultravioleta de onda corta y emitirla posteriormente, durante algún tiempo, enforma de luz fluorescente (fosforescente) a mayor longitud de onda. Entre losfluocromos más empelados se encuentra la auramina y la naranja acridina quese utilizan para la tinción directa de microorganismos y otros como el isotiocinatode fluoresceína que pueden ser conjugados a anticuerpos y se emplean entécnicas de inmunofluorescencia indirecta (IFA).

La estructura del microscopio de fluorescencia es similar a la del microsco-pio óptico común, diferenciándose en que dispone de los siguientes aditamentos:

1. Fuente de luz: Consiste en una lámpara de mercurio o xenón de alta presiónque produce con firmeza y fuerza sostenida ondas luminosas en el espectroultravioleta.

2. Filtro primario: Este filtro se sitúa entre la fuente de luz y el condensador y suselección debe estar en correspondencia con el fluorocromo empleado yaque tiene la función de eliminar las longitudes de ondas de la luz, que nosirvan para exitarlo.

3. Condensador de campo oscuro: Para concentrar la luz ultravioleta sobre lamuestra y lograr un mayor grado de Fluorescencia, dando como resultadoque la imagen del objeto enfocado se vea, a través del lente ocular, fluores-cente sobre fondo negro.

4. Filtro de barrera: Está situado en el interior del tubo óptico, teniendo la fun-ción de absorber la longitud de onda de la luz ultravioleta, sin interferir elpaso de la luz emitida por el objeto, con un cambio de longitud de onda,después de haber interactuado con la luz ultravioleta de onda corta. Me-diante este filtro se protege la vista del observador de los efectos de la expo-sición a las Radiaciones ultravioleta.

Funcionamiento

- En el caso en que se utilice luz refleja, el espejo debe estar debidamentealineado con el eje del microscopio, para que no haya pérdida de energíaluminosa.

- La luz ultravioleta, procedente de la lámpara, después de atravesar elfiltro primario seleccionado, penetra en el condensador de campo oscuroy al salir se refleja oblicuamente sobre el objeto teñido o conjugado confluocromo el cual absorbe las radiaciones y posteriormente se propagaen una longitud de onda más larga que es visible (fluorescencia).

- Tanto, los rayos incidentes de luz ultravioleta como la fluorescencia ge-nerada por los fluocromos, atraviesan la lente frontal del objetivo en eltubo ocular, donde los rayos ultravioletas son absorbidos por el filtro debarreras, mientras que la luz fluorescente lo atraviesa y la imagen virtual

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del objetivo es observado a través de la lente ocular con un aspecto fluo-rescente.

Precauciones

- Se pueden emplear lentes oculares y objetivos de uso común, siempreque se tenga la certeza de que no estén fabricados con materialfluorescentes, que alterarían los resultados.

- Para las observaciones con objetivos de inmersión se debe utilizar unaceite especial, ya que el aceite de cedro es fluorescente.

Empleo

Este tipo de microscopio posibilita examinar, microorganismos difíciles de colo-rear, como las espiroquetas y otros agentes microbianos como: Chlamydiatrachomatis, Cryptosporidium sp, Giardia lamblia y otros, así como para la de-tección rápida de antígenos virales.

Observaciones

Mediante este tipo de microscopía se pone de manifiesto, diferencias decoloraciones de diversos tejidos, sin ningún tratamiento con fluorocromo, porser los mismos fluorescentes.

MICROSCOPIO ESTEREOSCÓPICO

El microscopio estereoscópico difiere del microscopio óptico convencional,no solo en su diseño, sino además, en el principio de su poder de aumento y enla finalidad de su empleo.

Diseño

Durante muchos años se ha venido utilizando, un prototipo de microscopioestereoscópico consistente en el ensamblaje de dos tubos ópticos independien-tes, diseñados para que cada ojo del microscopista observe la imagen ampliadapor un lente objetivo común, desde posiciones diferentes, lo que propicia unavisión estereoscópica o tridimensional del objeto. En la actualidad se fabricanmodelos más modernos, provistos de un prisma que refleja la imagen, desdeángulos diferentes hacia ambas lentes.

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Los lentes objetivos, generalmente dos, se encuentran montados en el inte-rior de un revolver tubular y se caracteriza por tener un bajo poder de aumento(2x o 4x), mientras que el de los lentes oculares oscila de 5x a 10x, lo queproporciona un aumento potencial total, entre 10x y 40x.

Estos microscopios no poseen condensador ni diafragma, estando estructu-rado por una base de 4 ó 5 cm de altura que le sirve al mismo tiempo de platina,en cuya porción central se encuentra un orificio de unos 7 cm de diámetrocubierto por un cristal nevado.

El sistema de iluminación consiste en dos lámparas, una que se haya en labase del microscopio, cuyos rayos atraviesan el cristal nevado de la platina,proporcionando una iluminación tenue y otra instalada en la articulación quesostiene al sistema de los lentes, que proyecta la luz en dirección oblicua sobreel objeto dando la posibilidad de observar cuerpos opacos.

Este microscopio está provisto de un tornillo único, articulado a una crema-llera, que se utiliza para aproximar o alejar al lente objetivo del objeto a exami-nar.

Principio

El principal funcionamiento del microscopio estereoscópico no está basadocomo en el microscopio óptico en el poder de resolución, sino en su capacidaddirecta de aumento, por lo que la imagen ampliada se observará en el campomicroscópico en el mismo plano que el objeto real, no invirtiendo su posicióncomo sucede con el microscopio de uso común.

Fig. 63 : Microscopio estereoscópico

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CUIDADO, LIMPIEZA Y MANTENIMIENTODEL MICROSCOPIO

Los microscopios son equipos que requieren de un cuidado esmerado parasu buen funcionamiento y prolongación de su vida útil, no solo por su elevadocosto, sino porque resultan imprescindibles en el laboratorio para el examen dediferentes muestras, que no puede ser resuelto por ningún otro procedimientoque no sea la microscopía.

Las causas que afectan con mayor frecuencia su óptimo estado de funcio-namiento y por consiguiente su eficacia son: el polvo, la suciedad, los fuertesimpactos, la humedad y los inadecuados métodos de limpieza.

Cuidado

1. Durante su empleo- Ubique el microscopio sobre una mesa o meseta sólida de superficie

nivelada, separándolo ligeramente de la orilla para evitar que accidental-mente pueda caer al piso y dañarse.

- Antes de instalarlo a la red eléctrica, cerciórese de que el voltaje de latoma, se corresponda con el requerido para ese microscopio, ya que unerror en este sentido ocasionaría la ruptura de la lámpara y en el mejor delos casos se produce una disminución de la intensidad lumínica con laconsiguiente pérdida de nitidez de la imagen.

- Si accidentalmente se produce derramamiento de agua, reactivos u otroscompuestos orgánicos sobre la platina, no permita que se sequen porevaporación ya que pueden formarse costras o sufrir efectos oxidantesque deterioran su construcción y en consecuencia su funcionamiento.Cuando suceda, seque de inmediato la platina con material absorbente yseguidamente límpiela con un paño de lino fino o gamuza.

2. Al concluir su utilización.- Apague la lámpara. Si se trata de un modelo con regulador de intensidad,

reduzca la luz antes de apagarla. Con esta acción se protege al filamentoque puede quebrarse por cambios bruscos de la temperatura si no setoma esa medida.

- Antes de retirar la lámina, separe el lente objetivo de la preparación conel tornillo macrométrico, para evitar roces con la lente frontal que puedendañarla. Se utilizó lente de inmersión, remueva el aceite empleado conpapel para lentes o un paño de tela fina que no ocasione ralladuras. Noutilice el alcohol para estos menesteres, pues pueden desprender la lentedel cemento que la fija al dispositivo tubular inutilizable. En caso de em-

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plear xilol, por estar muy impregnado el aceite, humedezca ligeramente elpaño, no lo empape, para evitar que se produzca el mismo efecto que conel empleo del alcohol.

- Coloque la tapa a cada lente ocular para evitar que se afecte por el polvo,y cubra el microscopio con un tapacete de nylon con el mismo propósito.

- Si tuviera que trasladar el microscopio para otro sitio, cerciórese de queel tornillo del cuerpo binocular lo mantiene fijo. Sujete el microscopio conuna mano por la base y con la otra agarre firmemente el brazo, realizandoel traslado todo el tiempo con el equipo en posición vertical, para evitarque se salgan los lentes oculares y puedan dañarse.

Limpieza

1. Del sistema óptico.- El vidrio con que se fabrican las lentes es blando, de ahí, que sean muy

susceptibles a la erosión. Cuando se requiera su limpieza se debe em-plear, para remover el polvo, un pincel fino y plano, de ser posible de pelode camello, que se utilice exclusivamente para eso o un paño de lino finoo gamuza para la suciedad, que de manera frecuente está ocasionadapor la grasa de la pestañas y los cosméticos. La remoción del aceite deinmersión ya fue tratada en el acápite de cuidado.

- Para detectar la presencia de polvo o suciedad en las lentes oculares,basta con observar a través de ellas el campo microscópico; si se detec-tan manchas, haga rotar el lente sin sacarlo del tubo ocular, las manchasrotan con la lente, es que está sucia. Después de realizada la limpieza dela manera explicada colóquela nuevamente en el tubo ocular y comprue-be que las manchas han desaparecido, si persisten, puede deberse a unainsuficiente limpieza o que el polvo ha penetrado el interior del lente, enese caso, desenrosque el tubito portador de las lentes y proceda cuidado-samente a su limpieza, volviendo a colocar las lentes en la misma posi-ción en que estaban, absteniéndose de contactar con el diafragma anularque se haya en su interior. Si después de realizada esta operación la sucie-dad persiste, limpia la lente frontal del lente objetivo, cuyo soporte no debeabrirse nunca, correspondiendo, solo a un personal especializado, pues delo contrario se corre el riesgo de que sufran un daño irreparable.

- La limpieza de las lentes del condensador se hará, con igual cuidadoexternamente, sin desarmar el dispositivo.

- El espejo se limpiará con un paño fino, no requiriendo cuidados espe-ciales.

2. Del sistema mecánico.

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- La base, brazo, platina, etc. Se limpiarán con un paño, con el que seremoverá el polvo y la suciedad de sus superficies.

- No debe utilizarse alcohol para limpiar el microscopio pues tiende a dete-riorar la pintura.

3. Mantenimiento.- Los lentes que no estén en uso, deben ser colocados en dispositivos con

tapa de rosca para preservarlos del polvo.- Si desea guardar los microscopios en sus cajas, cerciorarse de que éstas

no tenga humedad que creará un ambiente muy propicio para que laslentes se contaminen con hongos que resultan muy difíciles de remover.

- La grasa vieja que se ha solidificado o adherido, removerla con xilol ogasolina.

- Lubricar periódicamente las cremalleras con grasa de buena calidad librede ácidos.

- Para pulir las partes metálicas lustrosas, utilizar un paño fino impregnadoligeramente con aceite de máquina exentos de ácidos.

- El equipo debe recibir asistencia técnica especializada cada 6 meses.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

Como ya se explicó en la parte inicial de este capítulo, la ampliación delobjeto real, se logra con el microscopio óptico, a través de una imagen virtual,proporcionada mediante una combinación de lentes y luz visible con un alcancemáximo de 2000x. ¿A qué se debe esta limitación?. Aunque se emplearan lentesde vidrio, cuya combinación, pudiera proporcionar más de 2000x, la longitud deonda de la luz visible que es de 400 a 700 m/µ , limita esa posibilidad, ya quepartículas separadas por menos de 200 m/µ escapan a su poder de resolución. Sinembargo los electrones de alta energía tienen una longitud de onda muchísimomás corta que no exceden 0,5 m/µ lo cual le proporciona un poder de resoluciónque permite la observación de partículas por menos de una millonésima de mm.

El principio del microscopio óptico y el electrónico es el mismo; proporcio-nar una imagen ampliada del objeto real para hacer posible su observación através del ojo humano, pero se diferencian en que el microscopio electrónico enlugar de luz incidente o reflejada utiliza electrones y en el de lentes de vidriocampos magnéticos.

Estructura del microscopio electrónico

En la actualidad se fabrican diferentes modelos de microscopios electróni-cos, pero todos están constituidos básicamente por tres partes:

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1. Un tubo de rayos catódicos.2. Un panel de mandos.3. Una bomba de vacío.

Tubos de rayos catódicos

Consiste en un tubo cilíndrico de más de 1 metro de largo por aproximada-mente 50 cm de diámetro, que se haya colocado en posición vertical. En suinterior se encuentran instalados, de arriba hacia abajo, los siguientes compo-nentes que constituyen su sistema funcional:

- Filamento de tungsteno.- Condensador magnético circular.- Porta muestra.- Objetivo magnético circular.- Proyector de imagen intermedia.- Pantalla fluorescente.

Por la parte externa, el tubo presenta en el tercio superior un soporte de atrilpara la colocación de la preparación y en dirección descendente, diversas pa-

Fig. 64: Microscopio electrónico: a) Filamento de tungsteno; b) Condensador magnéti-co circular; c) Bomba de vacio; d) Portamuestras; e) Muestra; f) Proyector de imagenintermedia; g) Tubo óptico con lente ocular; h) Pantalla fluorescente; i) Panel demandos.

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lancas y manivelas que se emplean para corregir el enfoque, el ajuste de loscampos magnéticos y el funcionamiento de la bomba de vacío.

En la parte inferior del tubo, muy próximo a la base, se encuentra acopladoun anteojos binocular centelleante, para observar la pantalla fluorescente.

Papel de mandos

Está ubicado sobre la mesa de trabajo, muy próximo a la base del tubo derayos catódicos, donde ambas partes se encuentran instaladas. En la paredfrontal presenta una pizarra con diversas escalas metradas que permitenmonitorear y ajustar el funcionamiento del equipo.

Bomba de vacío

Está instalada en el tercio superior del tubo.

Funcionamiento

1. Se coloca la preparación sobre el porta muestras, la cual debe ser extre-madamente fina (menos de 0,1 mm), de lo contrario resultaría opaca alos electrones no pudiendo ser atravesadas por éstos.

2. Se extrae el aire que se encuentra en el tubo, mediante la bomba devacío, para hacer factible la movilización de los electrones, los cuales seencuentran impedido de desplazarse en su presencia.

3. Encender el equipo, sometiendo el filamento de tungsteno a una potenciade 30 a 150 kv, con lo que se propicia que los electrones generados porel calentamiento del filamento se propaguen, penetrando en el condensa-dor magnético, para seguidamente concentrarse sobre el objeto y atra-vesarlo, ampliando su imagen hasta 2000x en forma análoga a como lohace el lente objetivo del microscopio óptico.

4. El proyector de imagen intermedia, con un funcionamiento similar al dellente ocular del microscopio óptico, amplia la imagen unas 250,000 ve-ces o más.

5. La imagen puede finalmente observarse directamente sobre la pantallafluorescente o proyectarse sobre una placa fotográfica si se desea elregistro permanente de la imagen.

6. La imagen formada por la pantalla fluorescente es ampliada de 4 a 6veces por el anteojos binocular, con lo que se obtiene un aumento totalde 1.000,000x o más, sin pérdida excesiva de detalles.

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Empleo

1. Para la observación de partículas víricas.2.Para la observación de estructuras bacterianas y de otros microorganismos.

Desventajas

En contraposición a su elevado poder de resolución, la microscopía electró-nica tiene la ventaja de que la acción de los electrones resulta letal para losmicroorganismos por lo que no es posible observarlos en estado viable.

CUESTIONARIO

1. Nombre las diferentes partes del sistema mecánico del microscopio óptico.2. Relacione en el mismo orden en que se encuentran, las diferentes partes

del sistema óptico.3. ¿Cuál es la función del revolver?4. Precise cuál es la diferencia funcional entre el tornillo macrométrico y el

tornillo micrométrico.5. Describa la forma de los lentes que se encuentran en el interior del conden-

sador de campo brillante.6. ¿Cuál es la función del diafragma?7. Clasifique los diferentes tipos de lentes objetivos.8. ¿Cuál es la función del aceite de inmersión?9. Describa la forma que tienen las dos caras del espejo y especifique cuando

se utiliza cada uno de ellas.10. ¿Con qué objetivo se utilizan los filtros?11. ¿Qué Ud. Entiende por poder de resolución?12. ¿Cuál es el poder de resolución del microscopio óptico?13. Describa como se forma la imagen del objeto observado con el microscopio

óptico.14. Describa la trayectoria que específicamente va siguiendo el haz de luz al

atravesar el condensador, el objeto a observar y los lentes objetivo y ocular.15. Describa paso a paso, como Ud. monta una preparación en láminas en el

microscopio óptico y la enfoca.16. Sí Ud. emplea primero un lente objetivo de 20x y posteriormente un lente

objetivo de 40x ¿Cuál de los dos le proporcionará un campo microscópicomás amplio? Fundamente su respuesta.

124

17. ¿Describa las características estructurales y funcionales del condensadorde campo oscuro?

18. ¿Cuáles son las funciones que respectivamente tienen el diafragmaanular y la placa de cambio de fase en la microscopía de contraste defase?

19. Explique las funciones del filtro primario y el filtro de barrera que se utilizaen la microscopía de fluorescencia.

20. Describa la estructura del microscopio estereoscópico.21. ¿Con qué particularidad se observa la imagen del objeto a través del mi-

croscopio estereoscópico? 22. ¿Con qué finalidad se realiza la observación a través del microscopio

estereoscópico?23. ¿Cuál es la diferencia estructural entre un microscopio óptico y microsco-

pio electrónico?24. ¿Cuál es la ventaja y la desventaja más significativa del empleo de la

microscopía electrónica?

125

CAPÍTULO 9

INSTRUMENTOS MECÁNICOS

INTRODUCCIÓN

La cantidad y variedad de investigaciones que se realizan diariamente enlos laboratorios de microbiología clínica , han tenido una marcada tendencia aincrementarse progresivamente en los últimos años, en la misma medida en queestos servicios se han ido extendiendo a todas las unidades del sistema Nacio-nal de Salud.

La introducción de instrumentos mecanizados y automatizados para la rea-lización de los diferentes procederes han venido a suplir en alguna medida losmétodos tradicionales, con lo cual se ha logrado no sólo una mayor productivi-dad, precisión y ahorro de recursos materiales y humanos, sino que su aplica-ción, interpone una barrera de bioseguridad que reduce significativamente losriesgos potenciales a los que se ven expuestos los manipuladores.

La mecanización sustituye la labor del hombre, mediante el empleo de ins-trumentos técnicos, regulados por éste, mientras que la automatización com-prende además un control intrínseco del instrumento mecanizado que ha sidodiseñado para que se autorregule.

En los laboratorios de microbiología se utilizan diversos instrumentos deeste tipo, pero sin lugar a dudas uno de los empleados con mayor frecuencia esla pipeta mecánica.

PIPETAS MECÁNICAS

En la actualidad se comercializan varios tipos y modelos de pipetas mecáni-cas. Entre las más empleadas en los laboratorios de microbiología se encuen-tran: la pipeta de pistón clásica del tipo "Marbung", la del tipo "Jena" y la"Multicanal", que forman parte del sistema micro analítico Eppendorf. En estostipos de pipetas el líquido se carga y descarga, mediante el accionar manual dela pipeta a una boquilla finamente cónica y puntiaguda de material plástico, quese inserta en el extremo inferior de la pipeta, de manera que el líquido aspiradopasa a la boquilla, pero no entra en ningún momento en la pipeta lo que permitesu empleo reiterado, mediante el intercambio en cada ocasión de la boquillaplástica deshechable.

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El índice de error, dado por los fabricantes, para este tipo de pipeta es desólo un 1%.

Estas pipetas se emplean para medir volúmenes de líquidos en el rango demicrolitros. Un microlito es equivalente a la millonésima parte de un litro o lacentésima parte de 1 mL.

PIpeta tipo Marburg

Este tipo de pipeta es de pistón fijo, estando diseñada para cargar o descar-gar solamente, un volumen determinado en microlitros, el cual está indicadomediante un número impreso en la parte superior de la pipeta.

Como cada pipeta de este tipo, está limitada para aspirar o dispersar exclu-sivamente, un volumen fijo para el que ha sido diseñada, los fabricantes la co-mercializan en serie de: 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,120, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 750, 800, 900 y 1000 mL.

Estructura externa

Está estructurada con una cánula cilíndrica de material plástico de unos 2 cmde diámetro, estriada transversalmente para facilitar la sujeción manual.

La parte superior de la cánula tiene insertada una anilla plástica previstalateralmente de un pequeño saliente plano en posición horizontal, que sirve detope al dedo índice, una vez que la pipeta esté empuñada. Por encima de laanilla, la pipeta se estrecha ligeramente en forma de un cono cortado por suvértice, en cuya pared se encuentra impreso un número que indica el volumenfijo que carga esa pipeta y sobre el número una franja que circula su diámetro,de color amarillo o azul, de varios mm de ancho. La franja de color amarillodistingue a las pipetas diseñadas para cargar 100 microlitros o menos y las de

Fig. 65 : Pipeta mecánica tipo Marburg

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color azul a las que se cargan más de 100 y hasta 1000 microlitros, teniendo estaúltima mayor diámetro.

En el extremo superior de la pipeta se encuentra un botón cilíndrico inserta-do calibradamente en el orificio que se haya en la parte más estrecha del extre-mo distal cónico.

Por debajo de la cánula se encuentra insertado un fino vástago cilíndrico,ligeramente cónico de material plástico, de unos 5 mm de diámetro, por cuyoextremo se inserta la boquilla plástica deshechable, cuyo color será igual al de lafranja que circula la parte superior de la pipeta.

Estructura interna

En el interior de la pipeta se encuentra el sistema mecánico que haceposible, al ser accionado, su funcionamiento, interaccionando las diferentespiezas que lo conforman, de la siguiente manera: el botón que se encuentraexternamente en la parte superior de la pipeta, contacta internamente con laparte superior de un pistón cilíndrico que se encuentra rodeado por un mue-lle flexible, cuyo extremo inferior contacta con el cerrador circular, unaespecie de zapatilla circular, que por su lado opuesto queda junto a una piezacilíndrica que en las pipetas de menor calibre tiene insertado centralmenteun mandril (aguja), para finalmente terminar en una pieza tubular que com-pleta el sistema.

Principio de su funcionamiento

1. Se procede a insertar ajustadamente una boquilla plástica deshechable en elextremo del vástago que sea del mismo color (amarillo o azul) que el quetiene la franja que circula el extremo superior de la pipeta.

Fig. 66: Estructura interna de la pipeta mecánica tipo Marburg: a) Botón; b) Pistóncilíndrico; c) Muelle; d) Cerrador circular; e) Cilíndro; f)Pieza que cierra hermética-mente la pipeta

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2. Se empuña la cánula, de manera que el borde del dedo índice quede en contactocon el saliente de la anilla que se haya sobre la cánula y la yema del dedo pulgarsobre el botón que se encuentra en el extremo superior de la pipeta.

3. Al presionar con el dedo pulgar el botón hacia abajo, hace que se comprima elmuelle, lo que provoca, que el pistón y el resto del sistema mecánico desciendan.

4. Sin dejar de presionar el botón, se introduce la punta de boquilla deshechable,varios mm en el interior del líquido que se desea extraer y se procede aaflojar suavemente la presión del dedo. Esta acción hace que todo el sistemaasciende hasta ocupar su ubicación normal, provocando la succión que haceque pase al interior de la boquilla, un volumen exacto de líquido, que seráespecífico para cada pipeta de pistón fijo.

Fig. 67: Ajuste de la boquilla plástica deshechable a la piapeta

Fig. 68: Manera de empuñar la pipeta

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5. A continuación se introduce la punta de la boquilla en el tubo de ensayo demanera que quede sobre la pared interna del tubo, procediendo a presionar elbotón para verter el volumen fijo de líquido.

6. Si se desea tomar una muestra diferente, basta con intercambiar la boquilladeshechable y repetir la operación.

Nota: El intercambio de boquilla debe realizarse con la mano enguantada, depositando lautilizada en un vaso de precipitado con solución desinfectante.

Pipeta del tipo Jena

Fig.. 69: Procedimiento para verter el líquido en el tubo receptor

Fig. 70: Pipeta tipo Jena: a) Botón giratorio; b) Ventanilla con escala en microlitros

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El principio funcional es similar al de la pipeta del tipo Marburg, aunquedifieren en el diseño, comercializándose distintos modelos. La particularidadestructural que tiene este tipo de pipeta es que está provista de un botón girato-rio en su parte superior, mediante el cual se hace descender o ascender alsistema mecánico, con lo que consigue variar su nivel de ubicación, lo que pro-picia que se pueda ajustar el grado de succión de la pipeta dentro de un determi-nado rango, para que aspire o disperse un volumen deseado.

Esta pipeta dispone además en su parte superior, muy próximo al botóngiratorio, de una ventanilla rectangular provista en su interior de una escalanumérica que va aumentando o disminuyendo el valor de los dígitos en la medi-da en que el botón sea girado hacia delante o hacia atrás. De esta manera seajusta previamente la pipeta para que trabaje a un volumen deseado en númerosexternos y décimas de microlitros.

Pipeta del tipo multicanal

Este tipo de pipeta se sustenta en el mismo principio funcional, pero difierenen que, en lugar de una sola boquilla deshechable, están diseñadas para que sele puedan insertar 8 o más boquillas, ubicadas unas al lado de las otras, lo que leda un aspecto de rastrillo. Cuando se acciona la pipeta, cada una de las boquillassucciona o dispersa el mismo volumen de líquido de manera simultánea.

EQUIPOS ELECTROMECÁNICOS

Los equipos electromecánicos son utilizados en el laboratorio para la prepa-ración de diferentes muestras o como parte de la realización de diversos proce-deres, teniendo en común, que son accionados mediante energía eléctrica. Entrelos más empleados se encuentran los siguientes:

- Las centrífugas.- El rotor.- El agitador.

Las centrífugas

La centrifugación es un procedimiento mecánico mediante el cual se pue-den separar de un líquido, partículas sólidas, células, microorganismos, etc. quese encuentre en suspensión, compactándolos, mediante una sedimentación for-zada en el fondo de un tubo de ensayo. También puede servir para separarlíquidos miscibles mezclados entre sí, con pesos específicos diferentes, como

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las emulsiones, donde los compuestos que lo forman, no pueden ser separadosmediante la gravedad (sedimentación) o la filtración.

Diseño industrial de las centrífugas

En la actualidad se fabrican diversos modelos de centrífugas, pero todastienen el mismo principio funcional. La mayoría de las centrífugas son eléctricasy solo algunos modelos ya en desuso se accionan manualmente.

Partes de la centrífuga

1.Cabeza: Es una pieza metálica, en forma de barra más o menos plana, que seinserta mediante un orificio central al eje del motor, formando una crucetacuando se trata de centrífugas de dos tubos. Como la centrífuga puede estardiseñada para 4, 6, 8 ó más tubos (siempre en número par) el cabezal adop-tará la forma que tienen los rayos de una carreta con tantas barras fijas enposición horizontal, como tubos pueda centrifugar. En el extremo de cada

Fig. 71: Esquema de las centrífugas

Fig. 72: a) Cabezal; b) Portatubos.

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barrera se inserta un porta tubo el cual puede ser de angulación o de suspen-sión. Los porta tubos de angulación son fijos, quedando en posición oblicuarespecto al eje, en tanto que los segundos, quedan articulados al cabezal, ensuspensión, lo que le permite adoptar una posición horizontal cuando la cen-trífuga alcanza altas velocidades.

2. Porta tubos: Son tubos metálicos, que se utilizan para introducir los tubos devidrio que contienen el material que va a ser centrifugado. Estos porta tubostienen colocado en el fondo, por su parte interna, un taco de goma que sirvede amortiguador a los tubos de vidrio durante la centrifugación.

3. Motor eléctrico: Tiene la función de imprimir movimientos de rotación alcabezal mediante velocidades controladas por medio de un reóstato que varíala intensidad del flujo eléctrico.

4. Tacómetro o velocímetro: Se utiliza para ir registrando la velocidad de rota-ción del cabezal en revoluciones por minutos (r.p.m).

5. Reloj de intervalo: Se utiliza para regular el tiempo de cada centrifugación.6. Bombillo piloto: Es un pequeño bombillo, generalmente de color rojo, que

indica cuándo el equipo está encendido.

Principio técnico

Está determinado por la fuerza centrífuga, que se sustenta que en todo elcuerpo que se mueve en torno a un punto central, se desarrolla una fuerza quetiende a separarlo de dicho centro, la cual será directamente proporcional a sumasa.

Balance de los tubos

Para el buen funcionamiento de la centrífuga es indispensable que los tubosqueden colocados en una posición diametralmente opuesta, tengan el mismopeso, ya que de lo contrario, la fuerza centrífuga sería desigual, lo que ocasiona-ría un desbalance que provocaría vibraciones y sacudidas de la centrífuga conla consiguiente ruptura de los tubos y el desajuste del equipo.

Para lograr un buen balance de los tubos se puede utilizar un nivelador detubos; que es una especie de balance, diseñada para colocar dos tubos, uno acada lado, determinándose la igualdad en peso mediante la sincronización de suequilibrio. Cuando no se disponga de este instrumento, deberá emplearse elmismo tipo de tubo y asegurarse de que el volumen de líquido en ambos seasimilar. Si se va a centrifugar una sola muestra, se deberá llenar en segundotubo con agua, con similares requisitos y ser colocado en el punta tubo que seencuentra en el lado opuesto que fuerza el que purza la muestra.

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Funcionamiento

1. Abrir la tapa de la centrífuga.2. Introducir los tubos con las muestras en el interior de los porta tubos,

teniendo especial cuidado de que quedan diametralmente apuestos (unofrente al otro) están debidamente balanceados en peso.

3. Cerrar la tapa de la centrífuga.4. Conectar el equipo a la red eléctrica5. Cerciorarse de que el botón que regula la velocidad del tacómetro o velo-

címetro este en "0".6. Accionar el interruptor para encender el equipo.7. Girar el botón del reloj de intervalo, hasta que indique el tiempo de

centrifugación deseado.8. Girar el botón del velocímetro lentamente, de manera que vaya marcan-

do gradualmente la velocidad (r.p.m.) en el tacómetro hasta alcanzar ladeseada.

9. Si la centrífuga no tuviera reloj de intervalo, proceda a apagarlas tanpronto concluya el tiempo previsto de centrifugación.

10. Espere a que la centrífuga se detenga, lo cual se puede determinar obser-vando el velocímetro. Si se hubiera centrifugado material contaminado,espere 2 ò 3 minutos antes de abrir la tapa, para evitar la exposición a losaerosoles.

11. Extraiga los tubos, apague la centrífuga, desconéctela de la red eléctricay ciérrela.

Medidas de cuidados y conservación

1. Llenar los tubos hasta 1 cm por debajo del borde superior.2. Los tubos colocados en lados apuestos, deben tener el mismo tamaño y

peso.

Fig. 73 : Nivelador de tubos

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3. Cualquier material que se derrame sobre la centrífuga debe ser eliminan-do de inmediato.

4. Cuando se produzcan rupturas de tubos, los porta tubos serán extraídos,procediendo a la eliminación de los restos de vidrio y limpiándolos escru-pulosamente.

5. Periódicamente debe limpiarse el interior de la centrífuga con un pañohúmedo para eliminar el polvo y la suciedad.

EL ROTOR

El rotor se utiliza para mezclar mecánicamente las muestras con los reactivos,lográndose una mejor homogenización, que la que se puede conseguir por pro-cedimientos manuales. En el laboratorio de microbiología se utiliza regularmen-te para mezclar el suero con la emulación de antìgeno para las pruebas serologícasde V.D.R.L.

Diseño del equipo

El rotor es un pequeño equipo eléctrico que tiene la forma de un cajón.Mide aproximadamente 30 cm2 x 15 cm de altura, estando provisto de una

superficie plana de unos 35 cm2, sobre la cual se encuentra una plataformagiratoria de unos 30 cm2.

Fig. 74: El rotor: a) Superficie plana giratoria; b) Botón del "timer"; c) Botón del velocí-metro

135

En la pared frontal del equipo, se encuentran insertados dos botones, rodea-dos en todo su perímetro por una escala numérica; el primero corresponde al"timer" o reloj de intervalos y el segundo al velocímetro.

Muy próximo a estos botones se encuentra un pequeño bombillo, gene-ralmente de color rojo, que indica cuando el equipo está encendido.

Funcionamiento

1. Conecte el equipo a la red eléctrica.2. Coloque la cristalería con la muestra sobre la superficie de la plataforma

giratoria.3. Accione el botón del "timer", hasta hacerlo coincidir en la escala numéri-

ca con el tiempo deseado de rotación.4. Accione gradualmente el botón del velocímetro hasta hacerlo coincidir

en la escala con la velocidad de rotación por minutos (r.p.m.).5. Concluido el tiempo, el equipo se apagara automáticamente, procediendo

a retirar las muestras, llevar el botón del velocímetro a "0" y desconectarel equipo de la red eléctrica.

Cuidado y conservación

1. Cualquier material que se derrame sobre la superficie de la plataformagiratoria o el equipo, debe limpiarse de inmediato.

2. Como la plataforma giratoria no queda fija, para evitar su desplazamientopor colisiones accidentales, algunos modelos disponen por uno de suslaterales de una presilla, que al ser colocada adecuadamente, impide queesa situación ocurra.

3. Se debe verificar sistemáticamente que las rotaciones de la plataformagiratoria se correspondan con la indicada en el velocímetro. Cuando sedetecte alguna diferencia se debe engrasar el equipo y si eso no resuelveel problema solicitar el servicio de un especialista.

EL AGITADOR

El agitador se utiliza para mezclar muestras muy difíciles de homogenizarpor procedimientos manuales debido a su densidad o mucosidad. En el laborato-rio de microbiología tiene diversas aplicaciones, entre las empleadas se encuen-tra la homogenización de esputos.

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Diseño del equipo

Este equipo se fabrica de diferentes tamaños. La mayoría de los modelostienen forma rectangular, con capacidad suficiente para que puedan ser coloca-dos en su superficie varias gradillas.

Al igual que el rotor, presenta en su superficie una plataforma, que en lugarde rotar , se desplaza con movimientos cortos, frontales y de retroceso en formacontinua a velocidad regulable, propiciando mediante las sacudidas que ocasio-na, la mezcla u homogenización de las muestras.

Posee igualmente un "timer", un velocímetro para determinar el desplaza-miento por minuto y un bombillo piloto.

Funcionamiento

1. Conecte el equipo a la red eléctrica.2. Coloque las gradillas con las muestras sobre la plataforma oscilatoria y

fíjelas con los dispositivos que dispone el equipo para que las gradillas nose vayan a caer cuando se le aplique el movimiento propio del equipo.

3. Gire el botón del "taimer" hasta hacerlo coincidir con la escala que indi-que el tiempo de agitación deseado.

4. Gire, lentamente, el botón del velocímetro hasta hacerlo coincidir con lavelocidad deseada.

5. Concluido el tiempo de agitación, retirar las gradillas de la plataforma,haga un girar en retroceso el botón del velocímetro hasta ubicarlo en "0"y desconecte el equipo de la red eléctrica.

Cuidado y conservación

Similar a las que se aplican al rotor.

Fig. 75: El agitador: a) Plataforma oscilante; b) Botón del "timer'; c) Botón del velocímetro

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POTENCIOMETROS

Los potenciómetros o pHmetros, son instrumentos eléctricos que se utilizanpara medir el pH de una disolución, por estar diseñados para determinar lasconcentraciones de iones hidronios que posea, lo que permite conocer con pre-cisión su grado de acidez o basicidad.

En el trabajo microbiológico, la determinación del pH de una disolución,resulta primordial en diversos procederes, como por ejemplo: en la elaboraciónde medios de cultivo, donde el pH debe ser ajustado de acuerdo a los requeri-mientos de los diferentes grupos y géneros bacterianos que pretendamos culti-var, puesto que el grado de tolerancia a la acidez o a la basicidad resulta diferentepara cada uno de ellos, para lograr su desarrollo óptimo.

Estructura

Los potenciómetros tienen la forma de una caja rectangular, midiendo unos30 cm2 x 8 cm de ancho, aunque el tamaño varia de acuerdo al modo comercia-lizado por los diferentes fabricantes.

En la pared frontal o sobre la superficie se haya un galvanómetro provistode una escala impresa del 0 al 14 que se complementa con una aguja insertadapor su parte posterior a un pequeño eje situado en su centro y borde inferior.

Debajo del galvanómetro se encuentran articulados al menos tres botonesgiratorios:

1. Botón para mover la aguja e indicar en la escala el pH de la solución buffer.2. Botón indicador de la temperatura del potenciómetro.3. Botón de lectura. Este botón se hace girar según se requiera hacia la posición

STD.BY (En espera) o hacia la posición indicada con la palabra READ(Lectura)

Fig. 76 : Potenciómetro: a) Eléctrodos; b) Galvanómetro

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Por el lateral derecho, el pHmetro tiene articulado en posición vertical unsoporte universal metálico, provisto de una presilla habilitada para la colocacióny sujeción de dos electrodos.

Electrodos

Concepto: Los electrodos no son mas que el polo (Positivo: Ánodo-Negati-vo: cátodo) de una pila eléctrica.

Estructura de los electrodos del potenciómetro o pHmetro: Consisten bási-camente en un tubo de vidrio de unos 10 ò 12cm de largo x 1 o 1,5cm dediámetro, cuya porción terminal inferior puede ser redondeada, mas afinada oen forma de un pequeño bulbo redondeado similar a un densímetro.

El tubo es atravesado longitudinalmente por un alambre de platino, cuyoextremo terminal queda en contacto con el material sensible o indiferente a loscambios de pH. El otro extremo del alambre queda empalmado a un cableeléctrico que se conecta en el fondo del equipo.

Tipos de electrodos

1. Electrodo indicador: En su extremo distal, en contacto con el alambre seencuentra el material sensible a los cambios de pH, como por ejemplo:hidrógeno, quinhidrona. Etc.

2. Electrodo de referencia: Generalmente presenta un mayor diámetro y sefabrica con calomel (Hg2 Cl + K Cl) un material estable, permaneciendoinalterado independientemente de la concentración de iones hidrontes ohidroxilos que contengan la disolución.

Ambos electrodos se unen mediante puentes salinos (K CL o NH4 NO3)cuando se acciona el equipo

Principio funcional

Se basa en la medición de las fuerzas electromagnéticas (f.e.m.() de lasdisoluciones a investigar, mediante el empleo de las pilas voltais preparadas conlos electrodos que marcan la diferencia de potenciales entre ambos.

El electrodo transforma la energía química en energía eléctrica, en conse-cuencia la fuerza electromotriz por la celda electroquímica es comparada con ladel potenciómetro y la diferencia es medida en voltios, para ser convertida ypresentada por el galvanómetro con un valor de pH.

En los pHmetros modernos, el galvanómetro ha sido sustituido por una es-cala digitalizada.

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Medición del pH

La medida del pH es una forma convencional de indicar la concentraciónde iones hidrionios o de iones hidroxilo en una escala del 0 al 14.

Cuadro 6: Gráfico de logaritmo inverso de iones hidrógeno.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

10-14 _________________________10-9________________________10-0 Ácido Alcalino

Por lo tanto, el pH no es otra cosa que el logaritmo inverso de la concentra-ción de iones hidrógenos en una disolución.

Una disolución es ácida cuando la cantidad de iones hidrionios (H30+) esmayor que la de iones hidroxilo (0H-) y viceversa, ya que las sustancias ácidasceden electrones y por consiguiente retienen hidrógeno en tanto que las básicasson capaces de aceptar protones.

Solución Buffer: Las soluciones buffer o amortiguadores o tampón comotambién se les conocen están compuestas por dos o más sustancias que evitanla producción de cambios significativos en la concentraciones de iones hidrionios,aun cuando a dicha solución se le agregue un ácido o una base fuerte.

Procedimiento para el manejo del potenciómetro

Estandarice el aparato

1. Conecte el equipo a la red eléctrica y asegúrese de que el botón se encuentreen la posición STD.BY.

2. Sumerja los electrodos en una solución buffer de pH conocido. (por ejemplo:pH 7). Accione el botón y haga coincidir la aguja en el número 7 de la escala depH.

3. Extraiga los electrodos de la solución buffer y proceda a enjuagarlos en unrecipiente que contenga agua destilada.

140

4. Tome la temperatura de la solución donde se medirá el pH y accione el botónindicador de temperatura del potenciómetro. También, si lo prefiere utilicecomo referencia la temperatura ambiente, en lugar de tomar la de la solución.

Lectura

1. Proceda a sumergir los electrodos en la solución cuyo pH se desea deter-minar.

2. Accione el botón cambiándolo de la posición STD.BY a READ. La agujaoscilará, hacia la izquierda o la derecha indicando en la escala, el pH.

Si se requiere realizar una nueva lectura lave los electrodos previamentecon agua destilada.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las ventajas de la mecanización y la automatización sobrelos métodos tradicionales de laboratorio?.

2. Nombre los diferentes tipos de pipetas mecánicas que usted conozca.3. Describa la estructura de la pipeta mecánica tipo Marburg.4. ¿Qué relación existe entre la banda coloreada de la parte superior de la

pipeta Marburg y el de la boquilla desehechable?5. Describa como se activa el sistema mecánico de la pipeta cuando se

ejerce presión sobre el botón que se haya en la parte superior de la pipeta.6. Describa como opera la pipeta Marburg cuando se retira la presión del

dedo sobre el botón que se haya en la parte superior de la pipeta.7. ¿Cuál es la diferencia funcional entre la pipeta tipo Marburg y la pipeta

tipo Jena?8. ¿Qué característica particular presenta la pipeta multicanal?9. Fundamente porque causa el empleo de las pipetas mecánicas, resulta

favorable para la bioseguridad del laboratorio.10. ¿Con qué objetivo se utilizan las centrífugas en el laboratorio?11. ¿En qué radica la fuerza centrífuga?12. Describa la estructura del cabezal de las centrífugas.13. ¿Cuál es la función de tacómetro?14. ¿Qué requisitos deben tenerse en cuenta al colocar los tubos en la centrí-

fuga?15. Explique en orden cronológico, los pasos que usted debe dar para realizar

una centrifugación.

141

16. Haga referencia a los cuidados que debemos observar para el buen fun-cionamiento y cuidado de la centrífuga.

17. ¿Para que se utiliza el rotor en el laboratorio?18. ¿Cómo es el movimiento de la plataforma del rotor?19. ¿Qué mide el velocímetro del rotor?20. ¿Para qué se utiliza el agitador en el laboratorio?21. ¿Cómo es el movimiento de la plataforma del agitador?22. ¿Para qué se utiliza el potenciómetro en el laboratorio?23. ¿Cuál es la diferencia funcional entre los diferentes tipos de electrodos

del pHmetro?24. ¿Qué es lo que marca el galvanómetro del pHmetro?25. Explique como usted estandariza el potenciómetro26. Describa los pasos que debe efectuar para determinar el pH de una diso-

lución con el empleo del pHmetro.

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CAPÍTULO 10

BALANZAS

INTRODUCCIÓN

Las balanzas son instrumentos que se utilizan para medir el peso relativo delos cuerpos, mediante la comparación, con piezas de peso certificado denomi-nadas pesas.

Existen en el mercado múltiple tipos y modelos de balanzas, los cuales estándiseñados para diversas aplicaciones, que van desde las que se utilizan paramedir el peso en tonelada hasta las que se emplean para medir con precisiónfracciones de Mg.

Unidades de medición micrometricas. Unidad básica (Gramo)

Unidad micro Equivalente Ejemplométrica a la Milésima para pesar

parte de un ... la masa de ...

Miligramo Gramo Tabletas de medicamentos.Microgramo Miligramo Grano de polvo o gota de un liquido.Nanogramo Microgramo Estructura bacterianasPicogramo Nanogramo Un virusFentogramo Picogramo Una moléculaAtogramo Fentogramo Un átomo

PRINCIPIO

El funcionamiento de las balanzas se sustentan en el principio físico de laspalanca de primer grado, en las que el punto de apoyo se encuentra exactamen-te entre el punto de potencia y el punto de resistencia. Ejemplo:el cachumbambé.

DIFERENTES TIPOS DE BALANZAS

Las balanzas que se utilizan corrientemente en los laboratorios de microbio-logía clínica son las granatarias y las analíticas digitales, ya que las de precisióno analíticas de tipo mecánico o eléctrica se emplean solo ocasionalmente.

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Balanzas granatarias

Se denomina así, al tipo de balanza, con la que se puede determinar mecá-nicamente, el peso de un cuerpo que se encuentra entre 0,1 a 500g o más.Cualquier objeto que se pretenda pesar con este tipo de balanza, de menos pesoque el señalado, los resultados que se obtengan serán dudosos, ya que por serdemasiado ínfimo, determinados factores como: las corrientes de aire, las vibra-ciones o el polvo circulante puede influir en la determinación del peso real, lasbalanzas granatarias son empleadas cuando no se requiere conocer con preci-sión el peso del objeto, como por ejemplo: para determinar el gramaje de unmedio de cultivo deshidratado en polvo.

Se fabrica dos variantes de balanzas granatarias; las de dos platillos y las deun platillo.

Balanza de dos platillo (Balanzas de Roberval)

Esta estructurada por dos planchuelas paralelas de acero, en posición hori-zontal, de unos 30 cm de largo, articuladas por sus respectivos extremos a unabarra metálica, plana o cilíndrica, en posición vertical, formando un paralelogramorectángular.

Las barras horizontales quedan articuladas exactamente por su posiciónmedia, mediante un pasador al extremo superior de una columna sólida, ubicadaen el centro de la balanza, que le sirve de punto de apoyo.

Sobre el extremo superior de las barras verticales se encuentran atornilla-das dos planchuelas metálicas de unos 2 cm de ancho, formando una cruz conlos extremos ligeramente curvados hacia arriba, que sirven de soporte para lacolocación de los platillos, mientras que su extremo inferior, queda introducidoen un orificio existente en ambos extremos de la base, que al no estar topadosen su interior posibilitan que la barra vertical penetre aun mas, si el peso delobjeto es superior al de las pesas que se hayan en el otro platillo.

Fig. 77: Balanza granataria de dos platillos(Balanza de Roberval)

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La barra o planchuela que queda frente al manipulador esta grabada conuna escala metrada en gramos, provista de una pesa deslizante para ser movidahacia la izquierda o hacia la derecha hasta hacerla coincidir en la escala con elpeso que se desea medir.

El fiel en forma de aguja esta articulado por su extremo inferior a las barrashorizontales, quedando en posición vertical, perpendicularmente a la columnade la balanza. La parte superior de la aguja queda junto a una escala grabada encuyo centro esta el "0" y hacia ambos lados, presenta de 5 a 10 líneas verticalesequidistantes, que permiten determinar las oscilaciones de la aguja hacia la de-recha o la izquierda de la escala.

Algunos modelos de este tipo de balanza, en lugar de dos barras horizonta-les tienen una sola carente de grabación en g, siendo el resto de la estructurasimilar.

Funcionamiento

Antes de efectuar la pesada:

1. Cerciórese de que los platillos estén limpios, vacíos y colocados correcta-mente sobre las crucetas.

2. Mueva la pesa deslizante de la barra graduada hacia la extrema izquier-da, hasta que marque "0" g.

3. Ajuste el fiel de la balanza a "0", para lo cual debe observar como la agujaoscila libremente sobre la escala a ambos lados del "0". Desestime las2 o 3 primeras oscilaciones y posteriormente compare las que se produ-cen hacia la izquierda del "0". Si las oscilaciones son coincidentes, porejemplo 5-5 ò 4-4, la aguja del fiel al detener su movimiento lo hará justa-mente en el "0".Si las oscilaciones fueran desiguales, proceda a accionar las tuercas delos tornillos de ajuste que se hayan a ambos extremos de la balanza, hastaconseguir que las oscilaciones sean parejas.

Procedimientos para efectuar la pesada

Una vez que el fiel de la balanza se haya ajustado a "0" proceda de lasiguiente manera:

1. Si va a pesar algún material en polvo o líquidos, utilice un recipiente ade-cuado (Papel, cápsula de porcelana, vidrio reloj, vaso de precipitado, etc)pesándolo previamente, para tener en cuenta ese dato al determinar elpeso del material (tara). Nunca coloque los materiales directamente so-

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bre el platillo, a menos de que se trate de sólidos limpios, como por ejem-plo, una barra metálica, una sortija, etc.

2. Para efectuar la pesada, mueva hacia la derecha de la barra grabada lapesa deslizante, hasta que indique el peso adecuado. Si fuera insuficiente,extraiga de la caja de pesas las necesarias y colóquelas sobre el platillode la derecha. A continuación coloque el recipiente seleccionado sobre elplatillo del lado izquierdo y vierta poco a poco en su interior el materialque desea pesar, hasta que la aguja del fiel marque "0".

Caja de pesas

Consiste en un pequeño cofre cuadrangular provisto de una tapa articuladacon bisagras en su parte superior. Internamente se encuentra tapizado de ter-ciopelo, presentando linealmente unos 20 orificios de diferentes diámetros don-de se introducen las pesas.

En los orificios que están situados de la mitad hacia atrás del estuche secolocan las de mayor peso. Estas pesas son cilíndricas, pulidas y brillantes,estando provistas de una pequeña prominencia en su parte superior, por dondese toman con una pinza de disección.

Cada una de estas pesas tiene grabado el peso (1,2,3,4,5,10,20,30,40,50 o100g) las cuales pueden combinarse para obtener cualquier peso en ese rango.

En los orificios de la parte anterior del estuche, se colocan las que tienenmenor peso que las referidas. Este tipo de pesas consiste en una laminilla planade metal con forma cuadrada o rectangular, que presenta uno de los bordesdoblados en un ángulo de 900 por donde se toman con las pinzas. Al igual quelas cilíndricas tienen grabado el peso, que como es obvio sera menor(0,01,0,02,0,03,0,05,0,1,0,2,0,3 y 0,5g). Todas estas pesas se fabrican básica-mente con latón, acero inoxidable o aleaciones no magnéticas.

Conjuntamente con las pesas, dentro del estuche se encuentra una pinzaque es utilizada para extraerlas del estuche, colocarlas sobre el platillo y poste-riormente reintegrarlas, por su orden en la caja.

Fig. 78 : Caja de pesas

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PRECAUCIONES

1. Coloque la balanza sobre una superficie nivelada en un lugar donde no seproduzcan vibraciones y que la temperatura así como la humedad relativasean estables.

2. Mantenga las balanzas escrupulosamente limpias, en especial los platillos.3. Conserve limpias las piezas, las cuales no deben ser colocadas en otro lugar

que no sea los platillos. Cuando se efectúan pesadas de productos en polvo,antes de guardarlas en la caja cepíllelas con un pincel de pelo de camello,parra evitar que el polvo o la su ciedad puedan afectar la fiabilidad del peso.

Balanxa de un solo platillo (tipo Ohaus)

A diferencia de la balanza de dos platillos, esta balanza tiene la columnaque sirve de punto de apoyo, no en el centro, sino en el extremo izquierdo. Lasbarras horizontales son dos o tres, según el modelo, y están grabadas condiferentes escalas en gramos, teniendo cada una de ellas una pesa deslizante.Generalmente estas barras están provistas ,en su parte superior ,de una mues-ca sobre cada numero de la escala para fijar la pesa en el punto exacto. El fielde estas balanzas ,no es en forma de aguja, sino de flecha y la escala seencuentra en el extremo derecho y no arriba con en la de dos platillos.

Los tornillos de ajustes,generalmente, se encuentran debajo de los platillos.El procedimiento para efectuar la pesada es similar, con la diferencia de

que esta balanza no utiliza las piezas certificadas de la caja de pesas.

BALANZA DE PRECISION O ANALÍTICA

Este tipo de balanza se utiliza cuando se requiere determinar con precisiónel peso de pequenas cantidades de materiales u objetos, cuyo peso sea dedécimas o centésimas de gramos o pocos gramos.

Fig. 79 : Balanza granataria de un solo platillo (tipo Ohaus)

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De acuerdo a su diseno se clasifican en: mecánicas, eléctricas y digitales.

Balanza de precisión mecánica

Para evitar inexactitudes durante la pesada, debido a la influencia de lascorrientes de aire, el polvo circulante o la humedad, este tipo de balanza seestructura por el fabricante dentro de una vitrina de cristal , incoloro y transpa-rente, de unos 40cm cúbicos, sobre una base de varios cm de altura,que aligual que los marcos que sirven para fijar las paredes y la parte superior decristal, generalmente es de madera o material plástico.

En la pared anterior que queda frente al manipulador se encuentra incertadala puerta de la vitrina, la cual está provista de un marco independiente, queposee en el centro de su parte inferior un pequeño tirador que se utiliza parasubir o bajar la puerta por un mecanismo de corredera (similar al de una guillo-tina) diseñado para que la puerta se quede fija, sin caerse, en cualquier altura enque sea detenida.

La base está sostenida por un tornillo en cada uno de su ángulos , que sonutilizados para nivelar la balanza, lo cual se comprueba mediante la observaciónde uno de los dos niveles de agua circulares que se encuentran en la superficie

Partes de que consta

l. Columna: La columna sirve de base al punto de apoyo de la balanza. Consisteen un tubo de metal inoxidable de unos 20 cm de largo x l,5cm de diámetro,que se encuentra atornillado por su base en el centro del piso de laurna,quedando debidamente nivelado en posición vertical. El extremo de suparte superior esta estructurado con una planchuela metálica en posiciónhorizontal, en dirección al manipulador. La superficie de la planchuela tiene

Fig. 80: Balanza de precisión mecánica: a) Columna; b) Cruz; c) Fiel; d) Platillos; e) Dispositivos para subir o bajar la cruz; f) Soportaplatillos; g) Chapa; h) Cuchilla

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forma de cajuela en U ,en cuya cavidad se inserta una placa de acero oágata , denominada "chapa", caracterizada por su dureza e inalterabilidad alcontacto con el aire, teniendo su superficie plana y muy pulida.

2. La cruz: Es una barra plana , de unos l6cm de longitud,que adopta una formatriangular con el vértice hacia abajo en cuyo extremo distal presenta uncorte cóncavo. Esta barra se caracteriza por tener varias perforacionessimétricas , suficientes para aligerar su peso sin que por ello pierda rigideza la flexión. A todo lo largo del margen superior tiene grabada una escala enmm, donde se observa el 0 en el centro y numeraciones iguales hacia amboslados. Debajo del semicírculo que forma la concavidad, tiene insertado unprisma de ágata de forma triangular, denominado "cuchilla", cuyo vértice seapoya sobre la chapa de la columna, quedando de esta forma la cruz enequilibrio. La cruz en ambos extremos laterales presenta dos salientes enforma de horquetilla angular denominada estribo ,por donde se cuelgan losplatillos. Los salientes ubicados en la parte inferior tienen insertada respecti-vamente una cuchilla con la arista dispuesta hacia arriba y apoyadas en unapequena placa del mismo material contenidas en los estribos. Las aristas delas tres cuchillas deben estar situadas en el mismo plano, el cvual será hori-zontal cuando el fiel de la balanza esté en 0. En el extremo lateral de cadaestribo, se encuentra articulado un fino tornillo en posición horizontal, cuyastuercas se utilizan cuando se requiere nivelar la balanza.

3. Fiel: Sobre el centro de la concavidad de la cruz se encuentra atornillada unachapilla que sostiene por su extremo posterior a una larga y fina aguja que esel FIEL de la balanza, quedando en posición vertical, perpendicularmente ala columna. El extremo inferior es puntiforme y oscila como un péndulo,juntoa una escala graduada desprovista de números cuyo centro representa al 0.

4. Los platillos: Son dos piezas metálicas planas, de forma circular,semejantes aun plato,provisto de una saliente por cada lateral, por donde se inserta unalambre acerado rígido que describe una parábola algo angosta para factibilizarsu colocación en los estribos de la cruz, que hace que los platillos quedensuspendidos.

5. Dispositivos para subir y fijar la cruz : Es una fina planchuela metálica muyrígida que tiene por la superficie de cada lateral, una pequena pieza cilíndricaproyectada hacia fuera y en cada extremo un gancho semicircular del mis-mo material similar a la forma de las herraduras. Este dispositivo queda ubi-cado por debajo y muy próximo a la cruz, estando unido por su porción mediaa un eje que se encuentra introducido a todo lo largo de la columna, el cual sehaya articulado por su porción posterior a un botón giratorio que se encuentraen la parte externa de la base de la urna en su porción central. Un medio girodel botón hacia la derecha, hace que el eje que atraviesa la columna seeleve,provocando que las piezas cilíndricas de la planchuela metálica

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contacten con la parte inferior de la cruz y la eleve,separando la cuchilla dela chapa para finalmente quedar estática debido a la presión del dispositivo.Resulta indispensable realizar esta acción cuando no se esté realizando lapesada,para evitar que la cuchilla esté innecesariamente en contacto con lachapa, con el objetivo de que no pierda el filo, lo cual afectaría su exactitud.

6. Soportaplatillos :Son dos discos articulados respectivamente a un fleje metá-lico recubierto de fieltro, los cuales quedan ubicados debajo de los platillos,estando separados de estos, aproximadamente por lcm . Del lado izquierdodel botón para fijar la cruz, se encuentra el utilizado para accionar losportaplatillos,con el cual; se consigue que éstos suban y entren en contactocon los platillos, impidiendo que oscilen cuando se le esté añadiendo algúnpeso,propiciando que el filo de la cuchilla no roce innecesariamente con lachapa durante esta acción. Cuando el material a pesar y las pesas esténcolocados sobre los platillos, se bajan los portaplatillos para que oscilen libre-mente y se pueda determinar el peso.

PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR LA PESADA

l. Cerciorese de que la balanza esté nivelada, para lo cual observe la ubicaciónde la burbuja de aire en el nivel; de agua que se encuentra en la superficiede la base de la balanza. Si se encuentra en una posición excéntrica, procedaa girar convenientemente los tornillos donde se apoya la balanza hasta lograrque la burbuja esté en el centro del nivel.

2. Determine el punto "0" de la balanza, para lo cual haga bajar la cruz con losplatillos vacios y observe las oscilaciones del "fiel" junto a la escala gradua-da. Si se percata de que son diferentes hacia uno u otro lado del cero, proce-da a accionar los tornillos de nivelación de los extremos de la cruz, hasta quelas oscilaciones sean iguales.

3. Suba los portaplatillos.4. Deposite el material a pesar en un recipiente apropiado (previamente pesado) y

colóquelo en el centro del platillo de la izquierda,seguidamente tome con la pinzalas pesas y situelas por orden de peso (de mayor a menor) sobre el platillo de laderecha, teniendo la precaución de colocar en el centro la pieza de mayor peso ya su alrededor las de menos peso. Cierre la balanza, baje los portaplatillos yobserve las oscilaciones del fiel, procediendo a quitar o poner las pesas o anadiro quitar producto en dependencia de los objetivos de la pesada.

5. Si se quiere determinar el peso de un objeto que tenga un peso inferior al mg,utilice los hilos de platino, denominados jinetillos , con peso cerificado, quetienen forma de gancho,los cuales se deslizan a lo largo de la regla grabadaque se encuentra en la cruz.

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6. Al concluir la pesada procesa a subir los portaplatillos,retire el material yapesado y con el empleo de la pinza retire las pesas por su orden de menor amayor peso. Suba la cruz,baje los portaplatillos y cierre la balanza.

PRECAUCIONES

- Garantice que la balanza sea ubicada sobre una mesa o meseta nivelada,donde no existan vibraciones, cambios de temperaturas o humedad.

- Limpie el interior de la balanza, en especial los platillos, antes y después de suuso.

- Cerciorase de que las pesas estén limpias y manipúlelas siempre con lapinza, no las toque con los dedos, ya que éstos le comunican humedad ysuciedades que alteran el peso.

- Exclusivamente los sólidos se pueden colocar directamente sobre el platillo.- La lectura de las pesadas deben efectuarse siempre con la puerta cerrada.- En los ángulos de la urna coloque un pequeño recipiente que contenga un

desecador con el objetivo de que absorba la humedad y mantenga secas laatmósfera en el interior de la urna, como por ejemplo: lana de vidrio embebi-da en ácido sulfúrico concentrado o pequeños gránulos de cloruro de calcioanhidro.

BALANZA DE PRECISIÓN ELÉCTRICA

Fig. 8l: Balanza de precisión eléctrica: a) Botón para el ajuste de la compensación detara; b) Botón para el ajuste del punto "0"; c) Platillo; d) Indicador digital; e) Botónpara la graduación de la precisión del indicador digital; f) Botones de ajustes de laspesas de cambio; g) Palanca de retención; h) Orientador de la dosificación.

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Este tipo de balanza se utiliza al igual que la balanza analíticamecánica,cuando se requiere determinar con precisión el peso de un objeto,pero difiere de ésta, tanto en el tamaño como en su diseño, generalmente esmás pequeña aunque al igual que la mecánica, la caja o urna donde se encuen-tra estructurada tiene forma rectángular y se haya en posición vertical sobre subase.

Aproximadamente, la mitad inferior de la pared frontal, sin incluir la base,es de cristal.

Las paredes laterales están provistas, respectivamente, de una ventana decorredera, tambien de cristal, que ocupa la mitad del ancho de la caja. La parteposterior, así como la porción inferior de los laterales y la cubierta superior songeneralmente de material plástico. Un tabique en posición horizontal divide laurna internamente en dos partes; la superior ocupa aproximadamente un terciode todo el espacio y en ella se encuentra instalado parte del sistema eléctrico yotros dispositivos interconectados con el resto del sistema que se encuentra enla parte posterior de la balanza. En la parte inferior (Rodeada por la pared decristal y las ventanas laterales) se encuentra colgado centralmente el únicoplatillo que posee este tipo de balanza.

Principales partes de que consta

1. Indicador de nivel : Consiste en un aditamento circular de no más de 2 cm dediámetro, que generalmente se localiza empotrado centralmente en la super-ficie de la balanza muy próximo al borde anterior, estando cubierto por unatapa de vidrio, provista de un círculo concéntrico de unos 7 mm de diámetro.Al igual que la balanza mecánica, el nivel se regula, haciendo girar convenien-temente en una u otra dirección los tornillos, hasta lograr que la burbuja de airedel agua que contiene quede en el mismo centro del circulo concéntrico.

2. Botón para el ajuste de la compensación óptica de tara : Este botón seencuentra articulado en el ángulo superior derecho de la pared frontal dela balanza. Es de formas circular, teniendo la superficie plana provista deuna letra "T" impresa, muy próximo a su borde y un grosor de menos de 2cm estriado transversalmente, para facilitar su manipulación . En la partesuperior de la periferia donde gira este toirnillo, la pared de la caja tienegrabada una pequeña linea vertical, que sirve para indicar donde ser de-tenido el giro del botón para hacer coincidir la letra "T"con la línea dereferencia.

3. Botón de ajuste del punto cero: Es un botón igualmente igualmente cilíndricode menor tamaño, aunque más grueso, que se caracteriza por tener un diá-metro mayor en su base que en la parte anterior, lo que le da una configura-ción ligeramente cónica . Se encuentra articulado en el centro del botón para

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el ajuste de la compensación óptica de tara, ya explicado, estando provisto deuna tapa, que tiene grabado en su centro un "0"con un (.) en su periferia.

4. Botón para la graduación de la precisión del indicador digital :Tambien deno-minado botón micrométrico. Es un botón grande, ubicado en el lateral dere-cho de la base.

5. Botones de ajuste de las pesas de cambio : Son dos. Se encuentran ubicados enla parte frontal de la base, por su lado izquierdo. El ubicado a la izquierda tienegrabado en su tapa un # l0 y el de la derecha un #1 . Al ser girados hacia laderecha van colocando las pesas o al ser girados hacia la izquierda las levan-tan, lo cual se va registrando en el contador o indicador de pesas de cambiosque se haya en el lado derecho de la base..El botón marcado con el # 10,produce el cambio de pesas de l0 en 10, o sea: 10, 20, 30… etc. Lo que equivalea 10g, 20g, 30g,…etc y el botón marcado con el #1, produce el cambio de pesasde l en l o sea: l, 2, 3,…hasta el 9, lo que equivale al lg, 2g, 3g..etc.

6. Indicador de pesas de cambio :Consiste en una pequeña pantalla que se hayaen la parte frontal de la base, por su lado derecho, donde se van registrandoen una doble escala, el peso originado por el accionar de los botones deajustes de las pesas de cambio. En el centro de las dos escalas se haya unindicador óptico, denominado tambien placa mate,provisto de una escala nu-mérica.

7. Palanca de retención :Es una pieza rígida de forma lanceolada (como la puntade una lanza) que se encuentra articulada por su extremo más grueso, en elcentro de la base. Alrededor de la palanca se encuentran grabado 3 números:

. En la parte superior el "0". En esta posición la balanza se encuentrafrenada y la iluminación apagada,no debiendo poner ni quitar del platilloel objeto a pesar.

. Hacia la derecha se encuentra grabado ½. En esta posición se puede leerel peso aproximado en gramos en la escala proyectada.

. Hacia la izquierda, el # 1. En esta posición se lee el resultado de lapesada.

8. Orientador para la dosificación : Debajo del indicador de las pesas de cambiose haya una pequeña escala graduada, con los números 0,500 y 1000, provis-ta de una línea oscura que indica aproximadamente el peso.

Funcionamiento

Acciones previas

l. Verifique que la balanza este debidamente nivelada, de no ser así, haga giraren uno u otro sentido'los tornillos de la base de la balanza, hasta lograr que la

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burbuja de aire del nivel de agua quede ubicada exactamente en el centro delcírculo concéntrico.

2. Conecte la balanza a la red eléctrica para propiciar su funcionamiento eiluminación, incluyendo el encendido del bombillo piloto.

Ajuste al punto cero

l. Haga girar la palanca de retención hacia el "0".2. Si el indicador de pesas de la izquierda y el contador micrométrico de la

derecha no están marcando respectivamente "00", haga girar los botones deajuste de las pesas de cambio y el botón para la graduación de precisión , encontra de las manecillas del reloj hasta que marquen "00". En este momentola balanza está frenada y la iluminación apagada.

3. Mueva lentamente la palanca de retención hacia el # l. La balanza se iluminaráy proyectará la escala numérica. Haga coincidir la marca índice con la raya"00" proyectada, haciendo girar el botón para la graduación de la precisión.

PESADA

1. Compensación de tara- Haga girar el botón para el ajuste de compensación de tara, en contra de

las manecillas del reloj hasta hacer coincidir la letra "T": con la línea dereferencia, que se encuentra en la parte superior.

- Proceda igualmente con el botón del ajuste a "0".- Gire la palanca de retención en dirección a ½ (semiretención)- Abra la ventana lateral y coloque sobre la superficie del platillo el reci-

piente vacio (tara) donde se va a depositar el material a pesar.- Cierre la ventana de la balanza.- Gire hacia la derecha gradualmente el botón de ajuste de las pesas que se

encuentra del lado izquierdo (marcado con el # 10) y vaya observandosimultáneamente la escala del indicador de la izquierda hasta que aparez-ca un signo menos (-) o se trabe el avance . Detenga la rotación y proce-da a girar el botón una graduación hacia atrás , por ejemplo: si la escalamarcó 50g, retroceda hasta 40g. Repita la operación con el botón de la dere-cha (marcado con el # l). Por ejemplo: si la escala se detiene en 5g, retrocedauna unidad o sea hasta 4g, lo que dará lugar a un peso total de 44g..

- Gire la palanca de retención hacia el # 1 y deje oscilar la escala.- Retrase la escala a "0"haciendo girar el botón de compensación de tara.- Haga girar en contra de las manecillas del reloj, los botones de ajuste de

las pesas hasta situar la escala en "00"(de esta manera queda anulado elpeso del recipiente (tara)

- Girar finalmente la palanca de retención hasta el "0"

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DETERMINACIÓN DEL PESO

- Poner nuevamente todos los elementos de mando en "0"- Cerciorese de que la palanca de retención esté en "0"- Depositar el producto a pesar en el interior del recipiente y cerrar la

ventana.- Girar la palanca de retención hasta ½ (semi retenida) durante la

preselección del peso- Proceda igual que para determinar el peso de la tara, utilizando los

botones de ajuste de las pesas de cambio.- Haga girar la palanca de retención hacia el "0"para retener la balanza y

seguidamente soltar lentamente la retención haciendo girar la palancahacia el # 1

- Haga girar hacia atrás el botón para la graduación de la precisión delindicador digital hasta hacer coincidir la placa mate del indicador ópticocon la raya proyectada. Al mismo tiempo el contador micrométrico regis-trará las dos últimas cifras del resultado de la pesada.

- Haga girar hacia atrás el botón para la graduación de la precisión delindicador digital,hasta que la escala quede inmóvil y el trazo inmediatoinferior se encuentre exactamente en la rendija de la horquillaíndice,accionando el botón para hacerlo coincidir con la raya proyectada.Al mismo tiempo el contador micrométrico registrará las dos últimas ci-fras del resultado de la apesada en la escala de la derecha del indicadorde pesas de cambio.

- Leer el resultado. Por ejemplo, si el indicador de pesas de cambio regis-tra 42g , el indicador digital marca 20 y el contador micrométrico de laderecha marca l4, el peso será el siguiente ; 42.2014 g.

- Colocar la palanca de retención en "0", abrir la ventana y extraer el mate-rial ya pesado.

Fig. 82 : Lectura de una balanza analítica eléctrica

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BALANZA ANALITICA DIGITAL

La balanza analítica digital simplifica todas las operaciones explicadas a loslargo de este capítulo, ya que basta con conectarla a la red eléctrica, colocar elmaterial a pesar sobre un platillo externo, accionar un botón y el peso podráobservarse digitalizado en una pequeña pantalla. La dificultad que presenta, escuando se produce algún desperfecto, lo cual no puede ser resuelto internamen-te por el personal del laboratorio experimentado, requiriendose de un servicioespecializado. Este tipo de balanza tiene un alto grado de precisión.

CUESTIONARIO

1. Explique en que consiste el principio funcional de las balanzas2. ¿ A que denominamos pesas ¿3. ¿Cual es el rango de pesadas de una balanza granataria?4. ¿Cuántos tipos de balanzas granatarias Ud. conoce?5. ¿Qué se entiende por peso de tara?6. ¿A que denominamos fiel de la balanza?7. Describa en orden cronológicos que Ud. debe efectuar para realizar una

pesada en una balanza granataria de un solo platillo?8. ¿En que orden se deben colocar las pesas sobre el platillo?9. Explique por que causa las pesas se deben tomar con una pinza de disec-

ción y no con la mano.10. Argumente por que causa los platillos deben estar limpios?11. ¿Con que objetivo se utilizan las balanzas de precisión?12. ¿Cuál es la función de la cuchilla de la balanza de precisión13. Con que objetiovo se debe subir y fijar la cruz de la balanza?

Fig. 83 : Balanza analítica digital

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14. Explique las causas por lo que las balanzas de precisión deben estar en elinterior de una urna

15. Describa el orden cronológico,como Ud. efectua una pesada con unabalanza de precisión mecánica.

L6. ¿Cómo Ud. regula el nivel de una balanza de porecisión17. Explique como Ud. realiza la depreciación del peso de tara en una balan-

za de precisión elaéctrica.18. ¿Cómo se colocan las pesas en la balanza de precisión eléctrica?19. Explique lo que indican las tres posiciones que tiene la palanca de reten-

ción.20. ¿Cómo Ud. realiza el ajuste al punto cero,con una balanza de precisión

eléctrica?21. Describa paso a paso como usted determina el peo de un objeto en una

balanza de presición elaéctrica22. Diga lo que usted sepa en relación con la balanza analítica digital.

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CAPÍTULO 11

INSTRUMENTOS DE MEDICIÓNNO VOLUMÉTRICOS

INTRODUCCIÓN

Los instrumentos de medición no volumétricos se emplean en las investiga-ciones de laboratorio para medir específicamente magnitudes de tiempo, tem-peratura o densidad.

INSTRUMENTOS. DIFERENTES TIPOS

Relojes

Se emplean dos tipos de relojes: los cronómetros y los de intervalo.

Cronómetros

Son relojes manuales, eléctricos o de cuerda, provistos de uno o dos boto-nes de control que se utilizan para accionarlos o detenerlos.

Empleo: para medir el tiempo en minutos y/o segundos.

Relojes de intervalos

Estructuralmente son similares a un reloj despertador doméstico y al igualque los cronómetros pueden ser accionados por energía eléctrica o cuerda,caracterizándose por hacer sonar una alarma cuando concluye el tiempo previsto.

Fig. 84: Relojes: a) Cronómetros; b) Reloj de intervalo.

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Este tipo de reloj se encuentra tambien articulado en algunos equipos de laboratorio,como por ejemplo. Centrífuga, rotor, etc, haciendo que se detenga automáticamentesu funcionamiento al concluir el período de tiempo en que fue ajustado.

Empleo: para medir el tiempo en horas y minutos.

Termómetros

Los termómetros empleados en el laboratorio consisten en un tubo de vidriode paredes gruesas de longitud y diámetro variable, provisto de una escalaimpresa en grados Celsius (ºC y/o grados Fahrenheit º F). Su extremo anteriorestá sellado como un ámpula, y el posterior, generalmente, más estrecho estáocupado por un bulbo, lleno de un producto químico dilatable por el calor. Estebulbo se continúa con un fino capilar ubicado a todo lo largo del termómetro,paralelamente a la escala, denominado columna indicadora.

Cuando el bulbo es expuesto al calor, el producto químico que contiene sedilata y asciende por el capilar. Al detenerse se confrontará con la escala paradeterminar el grado de calor, ya sea en grados Celsius o Fahrenheit.

Diferentes tipos de termómetros

Se utilizan dos tipos de termómetros: el clínico y el químico.

1.Termómetro clínico: En este tipo de termómetro el reservorio se encuentralleno de mercurio. Debido a que el capilar que forma la columna indicadoraestá unido al reservorio por una especie de sifa en forma de "S" cuando lacolumna de mercurio alcanza el grado máximo, en correspondencia con laexposición al calor a que ha sido sometido. Al disminuir su intensidad semantendrá indicando ese valor, por lo que hay que "sacudirlos" para que seconcentre nuevamente en el reservorio.

Fig. 85: Termómetros.

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2. Termómetro químico: La estructura de este tipo de termómetro es similar ala del termómetro clínico, con la diferencia que generalmente tiene una ma-yor longitud y la escala de temperatura es de un rango mucho mayor. Enlugar de mercurio el reservorio de estos termómetros está lleno de alcohol oxilol teñidos. Otro aspecto que lo distingue del clínico es que al carecer de lasifa, ya explicada, la columna del alcohol o xilol, ascenderá o descenderá, enel capilar en correspondencia con las oscilaciones de temperatura. Este tipode termómetro se encuentra insertado en los equipos termoregulados como:el horno, la incubadora, el autoclave, etc, pudiendo tener una estructura dife-rente a l explicada, pero basada en el mismo principio. Para convertir tempe-raturas de una escala a otra se procede de l siguiente manera:

- De grados Fahrenheit a Celsius (ºF-32). 0,555=ºC- De grados Celsius a Fahrenheit (ºC. 1.8)+32=ºF

Existen otras dos escalas para medir la temperatura, que son: la Kelvin y laRankine. Para convertir grados Celsius en grados Kelvin basta con adicionar laconstante 273 a los grados Celsius obtenidos. Por ejemplo: 3200C+273=3020K

Para convertir grados Fahrenheit a grados Rankine, se procede de igualmanera, pero empleando la constante 460.

Densímetros

Son instrumentos que se emplean para medir la densidad o peso específicode soluciones compuestas por diferentes solutos y solventes.

El peso específico es la relación entre el peso de una sustancia con respec-to al peso de un volumen igual de una sustancia de referencia, que usualmentees el agua.

Como la densidad del agua es de 1,0g/mL a 4ºC, el peso específico de loslíquidos, en g/cm3 o en g/mL es numéricamente igual a sus densidades.

Estructura

Los densímetros son tubos de vidrio que miden de 15 a 20 cm de largo,estando estructurados por tres partes diferentes entre sí. la parte superior consisteen un fino tubo de vidrio, alargado y cilíndrico, encontrándose sellado como unámpula en su extremo distal. Mide aproximadamente algo más de un tercio de lalongitud total del densímetro, teniendo impreso a todo lo largo una escala graduada

Fig. 86: Densímetro.

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en cuya parte superior se puede observar el número 1.000 (que es la densidad delagua). La escala va descendiendo dividida en partes iguales y el valor mayor,variará, en dependencia del tipo de densímetro de que se trate, como por ejemplo:1.060 en los urodensímetros, que se utilizan para medir la densidad de la orina.

La porción media es más gruesa y de mayor longitud, consistiendo básica-mente en un bulbo lleno de aire. En su extremo posterior el bulbo se estrecha ya continuación se dilata, formando un bulbo pequeño y redondeado, lleno debolitas de metal,, semejantes a municiones, que proporcionan peso al densíme-tro, para propiciar que se mantenga en posición vertical cuando sea introducidoen el líquido al que se le va a medir la densidad.

Procedimiento

1. Deposite en una probeta de tamaño apropiado (preferentemente no gradua-da) la solución a la que se le desea medir la densidad y colóquela sobre unasuperficie nivelada.

2. Tome el densímetro específico por la parte superior con los dedos índice ypulgar e introdúzcalo en la solución, colocándolo en el centro del diámetro dela probeta en posición vertical.

3. Haga girar el densímetro, mediante el accionar de los dedos y cerciorarse deque al rotar, no entre en contacto con las paredes de la probeta.

4. Espere a que se detenga el movimiento de rotación y proceda a realizar lalectura, para lo cual debe observar en qué graduación de la escala se encuen-tra el nivel de la solución, cuidando de no incurrir en el error de paralelaje.

CUESTIONARIO

1. ¿Cómo se denominan los dos tipos de relojes empleados para el trabajode laboratorio?

2. ¿Cuál es el principio funcional de cada uno de los relojes?3. Describa la estructura de un termómetro clínico y uno químico.4. ¿Cómo se denomina el producto químico que se utiliza en cada tipo de

termómetro para llenar sus respectivos reservorios?5. Especifique las diferencias funcionales entre el termómetro clínico y el

químico.6. ¿Cómo usted debe proceder para convertir grados centígrados en grados

Fahrenheit y viceversa?7. ¿Para qué se utilizan los densímetros en el laboratorio?8. ¿Qué usted entiende por peso específico?9. ¿Cuál es la densidad del agua?10. Describa la estructura de un densímetro .11. ¿Con qué objetivo el bulbo redondeado que se encuentra en la parte infe-

rior de los densímetros se encuentra lleno de municiones?12. Describa el procedimiento a seguir para determinar la densidad de un

líquido?

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CAPÍTULO 12

ACCCESORIOS, INSTRUMENTAL QUIRÚRGICOY MATERIALES DE CURACIONES

INTRODUCCION

Bajo el término de accesorios, se agrupan diversos objetos, utilizados concarácter auxiliar en el trabajo de laboratorio al igual que algunos instrumentalesquirúrgicos, mientras que determinados materiales de curaciones son emplea-dos para diversos usos.

ACCESORIOS

Entre los accesorios que se utilizan con mayor frecuencia, se encuentranlos siguientes:

Gradillas

Son soportes diseñados para la colocación de tubos de ensayo u otros tiposde cristalería, fábricadas de metal, madera o plástico. Generalmente sonrectángulares y están estructuradas por dos o tres planchas, en posición hori-zontal, separadas entre sí, provistas de perforaciones, por donde se coloca lacristalería en cuestión. Teniendo en cuenta que los tubos de ensayo tienen diá-metros diferentes, los orificios de las gradillas también serán de tamaño varia-ble, lo que permite seleccionar la adecuada para cada tipo de tubo.

Además de facilitar el acceso al tipo de cristalería con que se esté trabajan-do o el ordenamiento secuencial de las muestras, las gradillas factibilizan ade-más el que se puedan escurrir los tubos después de ser fregados, insertándolosen los orificios boca abajo.

Fig. 87: Gradilla

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Cestos

Al igual que las gradillas, los cestos son soportes, no compartimentados, quese utilizan para la colocación de tubos de ensayo y otros tipos de cristalería.Generalmente son cilíndricos o cuadrangulares y están fabricados de alambresentrelazados o chapas de metal inoxidable perforado. Los cestos son utilizadospara depositar la cristalería para su secado o esterilización.

Soporte universal

Está constituido por una base metálica sólida y pesada, lo que le pro-porciona estabilidad, sobre la que se erige una varilla recta de hierro de1,5cm de diámetro, que se utiliza para colocar pinzas de sujección o arosmetálicos.

Fig. 88: Cesto metálico.

Fig. 89: Soporte universal

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Pinzas de sujección

Se fabrican diferentes tipos de pinzas de sujección, algunas de las cuales,diseñadas para fijarlas a la varilla de fierro del soporte universal y otras paraoperarlas manualmente. Entre las más empleadas se encuentran: los modelosde tres dedos, los de bureta, los de vasos de precipitado, así como las pinzaspara tubos de ensayo y la pinza de Mohr, estas dos últimas de utilización ma-nual. En ambos casos, el principio de su funcionamiento es similar al de un palitode tendedera, es decir, cuando se aprietan con ayuda de los dedos índice ypulgar, las respectivas pinzas se abren, y cuando se retira la presión se cierran.La pinza de Mohr se utiliza para obstruir el paso de un líquido que fluya a travésde una manguera de goma flexible de más o menos un cm de diámetro. Otrotipo de pinzas igualmente empleadas para el manejo de objetos pequeños comolas pesas y los diversos especímenes son de acero inoxidable, teniendo la puntacurva o recta.

Trípode

Se trata de un accesorio metálico, formado por tres varillas metálicas deigual longitud, separadas entre sí a una misma distancia y soldadas por su extre-mo superior a un aro también de metal. Cuando el trípode es colocado sobre lamesa de trabajo, podemos percatarnos de que las patas no quedan en posición

Fig. 90: Pinzas de sujeción: a) Pinza de tres dedos; b) Pinza de bureta; c) Pinza de Mohr.

Fig. 91: Trípode.

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vertical, sino ligeramente oblicuas, con los extremos que contactan con la mesamás separados que los que están soldados en el aro.

Malla de amianto

Es una malla plana de alambre entrejido, similar a un colador, de formacuadrangular o circular que mide unos 15cm2 o de diámetro, que posee en sucentro una circunferencia de unos 10 cm de diámetro de amianto fundido en lamalla.

Esta malla se utiliza cuando se va a calentar un líquido contenido en frascosde vidrio, directamente a la llama de mechero, para lo cual se coloca sobre elaro del trípode, y sobre ésta el frasco de cristal, de manera que el recipientequeda aislado de la llama directa y el calor se distribuye uniformemente a travésdel amianto.

Instrumental quirúrgico

Además de los trocars y las agujas hipodérmicas de diferentes calibres enel trabajo de microbiología, ocasionalmente se requiere del empleo de diferentesagujas, bisturí y tijeras de disección, así como de charolas, una especie de ban-deja donde, se realiza la disección de determinados especímenes de experimen-tación.

Fig. 92: Malla de amianto

Fig. 93: Instrumental quirúrgico: a) Bisturí; b) Tijeras; c) Pinzas de disección; d) Agujasde disección

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MATERIALES DE CURACIONES

Entre los materiales de curaciones más empleados en el trabajo microbio-lógico, se encuentran los siguientes:

1. Algodón2. Gasa quirúrgica3. Aplicadores4. Depresores5. Soluciones y tinturas desinfectantes

Algodón

El algodón se utiliza para taponear la boca de los tubos y otras cristaleríasque van a ser sometidas a un proceso de esterilización y conjuntamente con losaplicadores de madera en la confección de hisopos finos y gruesos.

Gasa quirúrgica

Se utiliza para la preparación de torúndas que posteriormente son empa-quetadas en papel de 3 a 5 unidades para ser esterilizadas en autoclave antes desu empleo.

Aplicadores y depresores

Los aplicadores, además de ser utilizados en la confección de hisopos, seemplean también para la toma de algunas muestras, como por ejemplo: hecesfecales, para su preparación en láminas destinadas a la investigaciónparasitológica.

Los depresores, de madera o plástico, se utilizan para deprimir la lengua enla toma de muestras de exudado faríngeo y también, pueden emplearse paraextraer medio de cultivo de sus frascos, para efectuar la pesada o como sustitu-to de los aplicadores en las preparaciones de heces en láminas para examenparasitológico.

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CUESTIONARIO

1. Describa la estructura y el material con que se fabrican las gradillas.2. Especifique los diferentes usos que se les dan a las gradillas en el labo-

ratorio.3. Describa la estructura de los cestos y el material con que se fabrica.4. ¿Para qué se utilizan los cestos?5. ¿Cuál es la finalidad utilitaria del soporte universal?6. Describa los diferentes tipos de pinzas de sujección que usted conozca.7. Describa la estructura de los trípodes.8. ¿Para qué se utiliza la malla de amianto?9. Mencione los instrumentales quirúrgicos que se utilizan en el laboratorio.

10. ¿Para qué se utilizan materiales de curación en el laboratorio?

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CAPÍTULO 13

TOMA DE MUESTRAS

INTRODUCCIÓN

El diagnóstico microbiológico de laboratorio, se sustenta en el estudio de lasmuestras obtenidas del paciente o portador, que propicia la identificación directao indirecta de los agentes casuales de la infección o enfermedad infecciosa y endeterminadas investigaciones información complementaria acerca de la sensi-bilidad o resistencia del microorganismo en cuestión a la acción de los fármacosantimicrobianos, lo cual aporta al médico de asistencia un dato valioso que lepermite indicar un tratamiento antimicrobiano mucho más eficaz.

MUESTRA. CONCEPTO

Se denomina MUESTRA a la porción o volumen de: líquidos corporales,material excrementicio, exudados, etc. que obtenemos del paciente o portador,como por ejemplo: sangre, orina, heces, etc., donde presuntivamente se encuen-tran microorganismos patógenos o los anticuerpos inducidos por sus componen-tes antigénicos.

Además de las fuentes ya referidas se obtienen del paciente muestras delos productos patológicos, como el esputo y el pus, que son producidos poralgunos microorganismos en su interacción con los tejidos.

Muestra representativa

Para que el diagnóstico de laboratorio sea fidedigno, es indispensable entreotros requisitos, que las especies patógenas que se encuentran en los líquidoscorporales, tejidos, etc. del paciente sean las mismas que contiene la muestra ysu cuantía relativamente proporcional.

Visto así, pudiera pensarse que esta paridad, resulta suficiente para consi-derarla como una muestra representativa, sin embargo determinados factores yprocederes como: la demora en realizar la siembra de la muestra, los inadecua-dos métodos de conservación, la insuficiente o excesiva cantidad de muestras autilizar para el cultivo, la mala calidad de su obtención y la no observancia de lasprecauciones de asepsia, pueden en algunos casos afectar la viabilidad del ger-men y en otros su cuantía, además de propiciar contaminaciones que en su con-junto afectan la calidad de los resultados al perder la muestra representativa.

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Demora en realizar la siembra

En principio todas las muestras deben ser sembradas lo antes posible en losmedios de cultivo que favorezcan el desarrollo de las especies patógenas quepresuntivamente contienen procediendo a su inmediata y adecuada incubación.Cuando esto no sea posible, el proceder a seguir dependerá de la muestra deque se trate, por ejemplo: la Neisseria meningitidis (meningococos) que conelevada frecuencia se aísla en la muestra de L.C.R es muy sensible a los cam-bios de temperatura, por lo que el frío y la temperatura ambiente provocan sulisis, ocurriendo similar situación con algunos virus, como los Mixovirus yHirpesvirus, que no sobreviven mas allá de tres horas si la muestra en que seencuentra no es inoculada antes de ese tiempo en los medios apropiados. Encambio , con la muestra de orina (urocultivo) sucede todo lo contrario; los com-ponentes nitrogenados, hidratos de carbono y otros residuos minerales presen-tes en la muestra son utilizados por la mayoría de las especies, que comúnmenteestán presentes en la orina, como nutrientes, que favorecen su desarrollo ymultiplicación. En este caso la pérdida de representatividad sería por exceso yno por defecto como suele suceder en los ejemplos anteriores.

Métodos de conservación

a) Refrigeración a 4 0C (en las parrillas). Fundamento: el frío enlentece elproceso de multiplicación. Ejemplo, para conservar muestras de orinapara el urocultivo.

b) Incubación a 370 C. Fundamento: mantener a los microorganismos enuna temperatura similar a la corporal.

c) Formol al 10 %. Fundamento: mata a los microorganismos sin deteriorarlossignificativamente, lo que permite identificarlos mediante la observaciónde su morfología. Ejemplo: para la conservación de muestras que contie-nen protozoarios, larvas o huevos de helmintos.

d) Medios de transporte. Cuando la muestra no puede ser sembrada deinmediato, por haberse tomado en lugares distantes, se siembran en estetipo de medio y se envían a la mayor brevedad posible, a temperaturaambiente, al laboratorio de referencia. Los medios de transporte se em-plean generalmente, para la siembra de exudados caracterizándose pormantener la viabilidad del microorganismo, pero al mismo tiempo sin fa-vorecer significativamente su desarrollo, debido a que son muy reductores,caracterizándose por inhibir las reacciones enzimáticas autodestructorasy aminorar los efectos de la oxidación.

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Cantidad de muestras a tomar

En algunas determinaciones, como por ejemplo: el hemocultivo, está normadoque la cantidad de sangre total a sembrar sea de un 10 % en relación con elvolumen de medio de cultivo a utilizar. Cantidades menores o mayores sonobjetables, ya que afectan la calidad de los resultados. Si el volumen de sangrefuera menor que el indicado, reducirá proporcionalmente la expresión de creci-miento en los cultivos y si fuera mayor, la cantidad de anticoagulante que seadiciona al medio de cultivo, resultaría insuficiente, lo que traería como conse-cuencia la formación indeseable de coágulos de sangre que interfieren delimitanlas manifestaciones de crecimiento (turbidez).

Otro ejemplo donde la cantidad de muestra a emplear, resulta indispensable,es en la de esputo para investigar B.A.A.R (bacilos ácido alcohol resistentes)requiriéndose no menos de 2ml, ya que por las características mucoides de esteproducto patológico los bacilos se encuentran distribuidos desigualmente en lamuestra.

Calidad de la muestra

Para que la muestra sea de buena calidad, a de tenerse en cuenta en algu-nas ocasiones el momento idóneo y en general delimitar con precisión el áreaanatómica para su obtención.

Momento idóneo

En algunas muestras como el esputo, debe ser recogido por el paciente, enayunas, al levantarse, que es el momento en que mayor cantidad de expectora-ción se encuentra acumulada y en otras muestras, como por ejemplo, la sangrepara hemocultivo o gota gruesa, se recomienda esperar el momento del picofebril, que es cuando se encuentra en sangre la mayor cantidad demicroorganismos.

En otras ocasiones, el momento más adecuado, va a depender del cuadroclínico del paciente y del tiempo de evolución de la enfermedad. Por ejemplo: enla fase inicial de la fiebre tifoidea, el agente causal, la Samonella tiphy seencuentra en la circulación sanguínea por lo que resulta procedente tomar mues-tra de sangre para hemocultivo, pero cuando la enfermedad lleva unas dossemanas de evolución el microorganismo emigra al intestino, por lo que en esemomento lo adecuado es obtener muestras de heces fecales para coprocultivo.La lectospirosis, transcurre por una evolución similar en los primeros 10 días(periodo de leptospiremia) la leptospiras se encuentran en sangre y posterior-mente invaden diferentes vísceras y el sistema renal, (leptospiuria) debiendo

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obtenerse en la primera fase sangre para hemocultivo y en el segundo momen-to orina para urocultivo.

Delimitación del área anatómica

Una vez determinado en que órgano o tejido se va a realizar la toma demuestra, se debe delimitar el área exacta para su obtención por ejemplo: latoma de muestra de lesiones purulentas debe realizarse en la región subyacentey no del pus que se encuentra en el orificio de salida, donde la mayoría de losmicroorganismos están muertos.

Cuando la muestra ha sido recolectada por el paciente, la porción que setomará para el cultivo, será la mas evocadora de contener la mayor cantidadde microorganismos, por ejemplo, en el esputo, se utilizará la parte maspurulenta, no la saliva y en las muestras de heces fecales las porcionesmucosanguinolentas.

Precauciones de asepsia

Son las acciones encaminadas a evitar que la muestra se contamine du-rante su obtención, con especies microbianas ajenas al proceso infeccioso,por ejemplo: para obtener muestras de sangre para hemocultivo, L.C.R, lesio-nes en la piel, etc. Se debe remover previamente los m.o. de la microbiotaresidente, del sitio donde se va a realizar la punción, hisopado o raspado, conalcohol etílico al 70 % con yodo, para evitar que estos contaminen la muestray se desarrollen en el cultivo, creando confusión en el momento de establecerel diagnóstico.

El cumplimiento de estos requisitos, favorece, que el diagnóstico de labora-torio se corresponda con los agentes infecciosos, que tenia el enfermo o porta-dor en el momento en que fue obtenida la muestra.

Las deficiencias en este sentido, traen como consecuencia una serie decontratiempo como son:

1. Molestias innecesarias al paciente que debe someterse nuevamente a laobtención de la muestra.

2. Demora en la información del diagnóstico al médico de asistencia parainiciar o modificar el tratamiento.

3. Afectaciones económicas por gastos de materiales e insumos.4. Y lo que puede ser mas perjudicial, la información de un diagnóstico erró-

neo, con implicaciones para la evolución del paciente y el cuestionamientosobre la calidad del servicio.

171

INSTRUCCIONES AL PACIENTE

El paciente que tiene indicado uno o varios exámenes microbiológicos debeser instruido por su médico de asistencia o por el personal del laboratorio a losefectos de que recojan la muestra con la calidad requerida, o concurran allaboratorio en condiciones favorables para su obtención.

Las instrucciones son de dos tipos: generales y específicas.

Instrucciones generales

1. Suspender cualquier tratamiento con antibióticos 48 horas antes de latoma de la muestra, lo cual favorecerá, que en el momento de su obten-ción, la cantidad de microorganismos sea suficiente para que puedan serobservados en los exámenes microscópicos y aislados en los cultivos.

2. Suspender cualquier tratamiento local con medicamentos antimicrobianos,tales como: productos tópicos (pomadas, lociones etc.), colirios, gotasnasales, óvulos, gargarismos etc. Al menos 12 horas antes de la toma dela muestra.

Instrucciones específicas

Variarán en dependencia del tipo de muestra de que se trate.

DIFERENTES TIPOS DE MUESTRAS

Exudados

Concepto: es la materia mas o menos fluida salida de los vasos pequeños ocapilares por exudación, en los procesos inflamatorios y que se deposita en losintersticios de los tejidos o en la cavidad de una serosa. Se clasifican en:albuminoso, fibroso, hemorrágico y seroso.

Diferentes tipos de exudados

a. Exudado faríngeo: Indicaciones específicas: antes de concurrir al laboratorioel paciente debe realizar el aseo matutino habitual, para reducir la probabili-dad de que la muestra se contamine con la microbiota normal.Procedimiento: estando el paciente sentado, inclínele ligeramente la cabezahacia atrás, solicitándole que abra la boca y emita un ¡ahhh! sostenido. Ob-serve la zona faríngea con ayuda de una lámpara de cuello que proporcione

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una luz intensa, con la finalidad de detectar evidencias patológicas, comopueden ser: mucosas enrojecidas o edematosas, marcada exudación o la pre-sencia de anginas (placas de diferentes formas y tamaño, de color blanco oblanco grisáceo, adheridas a las mucosas) Deprima la lengua con un depre-sor y con la otra mano introduzca el hisopo en la cavidad bucal, cuidando deno tocar los labios, los carrillos o la lengua y frótelo sobre cada regiónamigdalina y la pared posterior de la faringe, en particular en las áreas conevidencias patológicas. Al retirar el hisopo, cuide igualmente de que no entreen contacto con la lengua, labios u otra zona bucal.Si el médico presume que el paciente está infectado con Corynebacteriumdiphteriae (agente causal de la difteria) indicar al laboratorio, mediante unaorden de análisis que se realice la investigación pertinente, en cuyo caso latoma de muestra se hará levantando el borde de la angina y pasando el hisopopor debajo de la misma para contactar con los microorganismos diftéricos,situados en ese lugar, el hisopo podrá estar seco si la siembra se hace deinmediato, en caso contrario deberá humedeserse previamente en soluciónde glicerina, telurito e introducido después de la toma en medio de transportepara su conservación.

b) Exudado nasal: Indicaciones específicas: No instilarse ningún tipo de gotasnasales 12 horas antes de la toma de la muestra.Procedimiento: al igual que para la toma del exudado faríngeo, el pacientedebe estar sentado y con la cabeza ligeramente flexionada hacia atrás. Conel dedo índice presione la base de la nariz, de manera que posibilite la obser-

Fig. 94: Toma de muestra de exudado faríngeo: a) Amígdalas; b) Pared posterior de lafaringe

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vación de los dos orificios, para lo cual se auxiliará de una lámpara. Introduz-ca el hisopo en ambas fosas nasales, imprimiéndole movimientos de rotaciónen ambos sentidos, para facilitar la recogida de la secreción.

c) Exudado nasofaríngeo: Indicaciones específicas: similar a las explicadas paraexudado faríngeo y nasal.Procedimiento: para la toma del exudado nasofaríngeo, se utiliza un hisopoespecial consistente en un alambre de cromo o acero inoxidable curvado ensu extremo terminal.Después de observar la zona faríngea y las fosas nasales con buena ilumina-ción se procede a introducir suavemente el hisopo por una de las fosas nasaleshasta la nasofarínge. Si no fuera posible, introducir el hisopo por la cavidadbucal hasta la nasofarínge, con los mismos cuidados ya explicados en al tomadel exudado faríngeo.

Fig. 95: Toma de muestra de exudado nasal.

Fig. 96: Toma de muestra de exudado nasofaríngeo.

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d) Exudado ótico: Indicaciones específicas: no instilarse gotas óticas de ningúntipo, durante las 24 horas precedentes a la toma de la muestra.Procedimiento. Después de indicar al paciente que se siente, el técnico seubicará por el lateral que corresponda al oído que será objeto de la toma dela muestra, procediendo a ladear ligeramente la cabeza del paciente para ellado opuesto, con una torúnda o algodón estéril humedecido en alcohol etílicoal 70 %, limpiar el pabellón auricular, especialmente la entrada del orificiodel conducto auditivo. Disponiendo de una buena iluminación, sujetará laoreja por la parte superior con ayuda d los dedos índice y pulgar, imprimién-dole un movimiento hacia arriba y hacia atrás, lo cual favorecerá la obser-vación del conducto auditivo externo. Manteniendo la oreja en esa posi-ción, introducir el hisopo suavemente en el conducto, imprimiéndole movi-mientos de rotación con el propósito de recoger la mayor cantidad posiblede secreción (otorrea)

Fig. 97: Toma de muestra de exudado ótico: a) Manipulación del pabellón auricular;b) Introducción del hisopo en el conducto auditivo externo

e) Exudado conjuntival: Indicaciones específicas: durante las 48 horas prece-dentes a la toma de la muestra, no irrigar los ojos con colirios, pomadasoftalmológicas ni anestésicos conjuntivales que tienden a desalojar a losmicroorganismos del saco conjuntival. La noche anterior, el paciente se debelimpiar el ojo afectado con suero fisiológico o agua previamente hervida. Sepuede tapar o no, el ojo en cuestión con un apósito estéril fijado con espara-drapo, ya que se ha demostrado que no influye en los resultados la contami-nación ambiental, la mañana en que concurra al laboratorio para que le seatomada la muestra no debe realizarse nigun lavado facial.Procedimiento: para la toma de muestra del exudado conjuntival, se puedeutilizar un hisopo de algodón fino (estéril) o un asa de platino empleada exclu-sivamente para ese fin, esterilizada en autoclave.

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Indicar al paciente que se siente y retirar el apósito, con ayuda del dedoíndice baje el párpado inferior y proceda de inmediato e introducir con sumocuidado el hisopo o el asa, evitando tocar las pestañas, o el margen de lospárpados, hasta la superficie del ángulo interno (próximo al lagrimal) del "cul-de- sac" fondo del saco inferior deslizando suavemente el instrumento endirección al ángulo externo del ojo.También se pueden tomar muestras de las márgenes parpebrales (membra-nas que tapizan los párpados.En el caso de que el paciente presente furúnculos de las glándulas pilosebáceasanexas a una pestaña (orzuelo) se procederá a obtener un poco de pus, me-diante la punción con una lanceta estéril.

f) Exudado uretral: Indicaciones específicas: El o la paciente deben de abste-nerse de orinar durante las 4 horas que preceden a toma de la muestra, paraevitar que los microorganismos sean arrastrados mecánicamente durante lamicción. Debiendo concurrir al laboratorio sin previo aseo matutino de losgenitales externos.En mujeres: Se le indicará que se desnude de la cintura hacia abajo y seacueste bocarriba en una camilla ginecológica con estribos, adoptando unaposición ginecológica, de manera que los glúteos queden muy próximos alextremo de la camilla, en estas condiciones con la palma de la mano haciaarriba se introduce en la vagina el dedo índice el cual se arquea hacia arribapara comprimir la uretra a través de la sínfisis que le separa de la vaginadesplazar el dedo, hacia atrás, sin dejar de comprimir la sinfigis para inducir lasalida del pus por la uretra. Conjuntamente se introduce el hisopo, 1cm en elinterior de la uretra, haciéndolo girar suavemente para que recoja la mayorcantidad posible del exudado.

Fig. 98: Toma de muestra de exudado conjuntival

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En los hombres: La muestra se tomará permaneciendo el paciente parado.Se le indicará manualmente el prepucio hacia atrás y a continuación hagapresión hacia delante del pene con el objetivo de "ordeñar" la uretra. Segui-damente se le introduce unos mm el asa de platino estéril en la uretra porunos segundos retirándola finalmente.

g. Exudado vaginal. Indicaciones específicas: Suspender cualquier terapéu-tica por vía local 2 o 3 días antes de que le sea tomada la muestra. Debeconcurrir al laboratorio sin previo aso vaginal desde la noche anterior,aunque puede, efectuar lavado matutino de genitales eternos. Se reco-mienda no realizar coito vaginal en ese periodo de tiempo.Procedimiento: Se le indicará a la paciente que se desnude de la cinturahacia abajo y se acueste en posición de cúbito supino (boca arriba) sobreuna camilla con estribos, adoptando una posición ginecológica (las corvassobre los estribos y los glúteos muy próximos al borde de la camilla.Antes de proceder a la toma de la muestra se hará una inspección de laregión vulvar con el objetivo de detectar inflamación o erosión en lasglándulas anexas Skéne o Bartholin, la primera, dos pequeñas glándulassituadas dentro del meato de la uretra femenina, consideradas homologasde las vesículas seminales y la segunda, situadas a ambos laterales del

Fig. 99: Toma de muestra de exudado uretral en mujeres.

Fig. 100: Toma de muestra de exudado uretral en hombres.

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orificio vaginal, cuya secreción tiene la función de lubricar el área parafacilitar la penetración del pene.Con el empleo de una torúnda estéril humedecida en alcohol al 70 %, sujetapor una pinza de disección, desinfectar la región vulvar. Seguidamente seprocederá a insertar un espéculo estéril de tamaño conveniente sin lubricantes,ya que puede ser tóxico para algunos microorganismos.

En los casos de niñas se realiza un exudado vulvar y en pacientes vírge-nes se realiza también un exudado vulvar y si el orificio del himen lopermite se puede emplear un espéculo pequeño.En los casos de pacientes con cistocele (protución de vejiga en la vagina)la incertación del espéculo debe ser realizada por un personal con expe-riencia. A continuación se procede a introducir un hisopo estéril hasta elfondo del saco posterior de la vagina el cual será embebido con el exuda-do. Se recomienda utilizar hisopos con algodón sintético, ya que los áci-dos grasos presentes en algodón vegetal puede resultar tóxico para algu-nos microorganismos. Además del hisopo se puede emplear para obtenerla muestra una pipeta de Pasteur estéril con un dispositivo en su parteposterior como el que tienen los goteros para factibilizar la aspiración delexudado. Al momento de tomar la muestra se realiza la medición del pHal exudado.

h) Exudado endocervical.Indicaciones específicas: Abstenerse de realizarel coito durante las 12 horas precedentes a la toma de la muestra.Procedimiento. Después de colocada la paciente en posición ginecológicae insertado el especulo (sin lubricantes) en forma similar que para exuda-

Fig. 101: Toma de muestra de exudado vaginal. Paciente en posición ginecológica con elespéculo incertado.

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do vaginal, se procederá a retirar el moco cervical del cuello del úterocon ayuda de una torunda estéril, sujeta por una pinza de disección. Se-guidamente se introduce un hisopo estéril, que se hace comprimir suave-mente sobre el cervix, imprimiéndole movimientos de rotación durantevarios segundos para que se embeba en el exudado.

Líquidos orgánicos

Concepto: Los líquidos orgánicos, son fluidos serosos, portadores de com-puestos orgánicos e inorgánicos, así como de células leucocitarias. Son produci-dos por las membranas que recubren los diferentes órganos, por tratarse deespacios anatómicos cerrados, estos líquidos son normalmente estériles, por loque, el aislamiento de microorganismos en cualquiera de ellos es evocador deinfección.

Los líquidos orgánicos que con regularidad se investigan en los laboratoriosde microbiología clínica, son los siguientes.

Cuadro 7: Localización de los líquidos orgánicos

DIFERENTES REGION ANATOMICA DONDE TOMA DE MUESTRALIQUIDOS SE LOCALIZA (por punción)

L.C.R. Canal raquídeo (espacio delimitado Lumbarpor las membranas sub aracnoideaso meníngeas, que recubren la médulaespinal, la región sub - occipital ylos ventrículos cerebrales

PLEURAL Delimitado dentro del espacio que Intercostalsepara las dos membranas pleuralesque recubren el tejido pulmonar

SINOVIAL Se encuentra entre las sinovias Articularo membranas que recubrenlos tendones

ASCITICO Se encuentra entre las membranas Peritonealperitoneales que delimitenal abdomen

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Cuadro 8. Datos para la obtención de las muestras de líquidosorgánicos y características de su aspecto.

LÍQUIDOS CANTIDAD DISTRIBUCCIÓN ASPECTO XXXORGÁNICOS (ml) EN TUBOS NORMAL PATOLÓGICO

ESTERILES

L.C.R 3 a 10 3 Incoloro y TURBIO,transparente hemorrágico o

satocrómico(amarillento)

PLEURAL 2 a 3 Uno con Incoloro y Turbio y heparina transparente purulento

SINOVIAL 2 a 3 Uno sin Amarillo claro, Turbio yheparina transparente purulento

y viscoso

ASCITICO 2 a 3 Uno con Seroso Purulentoheparina

Recolección de la muestras

Serán tomadas por un especialista, previo riguroso lavado de manos y colo-cación asépticas de guantes quirúrgicos estériles.

Procedimiento:

- Desinfectar con tiomersal (timerosal) u otro desinfectante apropiado elárea de la piel, donde se va a efectuar la punción.

- Realizar la punción con trocar o aguja apropiada hasta donde se encuen-tra el líquido en cuestión.

- Retirar el mandril del trocar, lo que propiciará que fluya el líquido a travésde la cánula o si la punción se realiza con aguja, insertar una jeringuilla ysuccionar el líquido.

- Recolectar el líquido en tubos de ensayo, con y sin anticoagulante(heparina) según se trate.

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Sangre

Concepto: La sangre es un líquido rojo que circula por las arterias, venas ycapilares. Estando formada por elementos figurados como los hematies, leuco-cito y plaquetas, así como una parte líquida denominada plasma, que contienediversas sustancias nutritivas e inmunológicas.

Indicaciones específicas

La toma de muestra debe realizarse cuando el paciente presente fiebresuperior a 38 C, solo eventualmente se procede a tomar la muestra, en el mo-mento que presente hipotermia.

Procedimiento

- La sangre se obtendrá por venipunción, mediante jeringuilla de vidrio es-téril y seca (que no esté caliente) a la cual se le acopla una aguja No. 20estéril, pudiendo utilizarse igualmente jeringuillas y agujas estérilesdesechables, después de comprobar el tiempo de caducidad, la jeringuillaacoplada a la aguja se colocan posteriormente en el interior de un tubo deensayo de tamaño apropiado.

- Después de estar la ligadura por encima del codo del paciente, se proce-derá a verificar el pulso, para comprobar que la circulación arterial no hasido interrumpida. Se le pedirá al paciente que abra y cierre la manovarias veces con el objetivo de inducir el aumento de la circulación y lellene las venas, palpe el área y seleccione la vena mas prominente conayuda de la inspección visual. Desinfecte la zona a puncionar, mecánica-mente, primero con agua y jabón y químicamente después con tintura deyodo al 1 % en pacientes (no alérgicos) y posteriormente con alcoholetílico al 70 %. Deje secar el alcohol y efectúe la punción, para ellosolicite al paciente cerrar la mano y extender el brazo, tome la jeringuillade tal manera que el dedo índice quede colocado sobre el cabo de laaguja para guiarla durante su introducción en la vena. Con la mano opuestasujete el antebrazo del paciente, unos 5cm por debajo del sitio quepuncionará y estire la piel hacia abajo con el pulgar con lo cual seinmovilizará la vena. Inserte la aguja en la piel adyacente paralelamentea la vena y hágala penetrar en el lumen, un ligero cese de la resistenciaindicará que la aguja ha penetrado en la vena, la sangre fluirá espontá-neamente dentro de la jeringuilla. En caso de que la presión de la venasea baja, retire el émbolo, para asegurarse de que la aguja se encuentreen el interior de la vena. Extraiga la cantidad de sangre necesaria suelte

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la ligadura y coloque una torunda o un pedazo de algodón seco sobre elsitio de la punción y saque la aguja, pídale al paciente que abra la mano ypresione la torunda o algodón por espacio de 2 a 3 minutos con el brazodoblado.

Para sembrar la sangre, proceda del siguiente modo:

1. Retire el círculo central de la retapa metálica del frasco que contiene elmedio de cultivo, desinfecte con alcohol etílico al 70 % la tapa perforable yflaméela.

2. Cambie la aguja utilizada por otra estéril del mismo calibre.3. Puncione la tapa perforable del frasco y empujando el embolo de la jeringuilla

vierta un 10% de sangre en relación con el volumen del medio de cultivoempleado. Retirando la jeringuilla con la aguja y el volumen de sangre so-brante.

4.Invierta el frasco inoculado, 4 o 5 veces para que el anticoagulante que con-tiene el medio impida que se formen coágulos.

Observaciones: Durante el proceso de toma de muestra, absténgase depalpar la vena seleccionada con los dedos, después de desinfectada la piel.

Linfa

Concepto: La linfa es un líquido claro, y transparente de color ligeramenteamarillento, pH alcalino y salobre, que llena los vasos linfáticos. Está constituidapor agua, albúmina, fibrina y sales.

Indicaciones al paciente: Las generales.Procedimiento: La muestra de linfa se obtiene específicamente de los lóbu-

los de las orejas y de los pliegues de la piel de los codos.

1. Con el empleo de torundas o motas de algodón humedecidas en alcohol al70 %, desinfecte ambos lóbulos y los pliegues de la piel de cada codo.

2. Coloque una pinza en cada uno de los lóbulos, de manera que ejerzan lasuficiente presión para que la sangre contenida en los capilares sea excluida,lo cual se evidenciará por un aclaramiento de la zona (zona de isquémia).

3. Con un bisturí haga una incisión de unos 5mm de largo por 2 mm de anchoy raspe la zona con su superficie, rápidamente, antes que la sangre infiltreel corte, proceda a recoger con el borde del bisturí la linfa que emane,depositándola en la lámina portaobjetos habilitada al efecto. Esta operaciónse debe realizar en ambos lóbulos y en los pliegues cutáneos de los doscodos.

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Excreciones

Concepto: Compuestos excretados por las glándulas (saliva, sudor, lágri-mas) o producidos en el reservorio donde se han acumulado (heces, orina, etc.)

Heces fecales

Concepto: Material que se forma en el intestino básicamentea partir de losresiduos del material ingerido no digerido.

Indicaciones al paciente: las generales.Procedimiento: En el caso de heces destinadas para examen parasitológico.Se indicará al paciente recoger 10 ó 20g de heces sólidas (aproximadamen-

te del tamaño, equivalente a un 1/3 de un tabaco) y sí fueran sólidas unos 30 ml(una onza fluida) en un frasco limpio y seco, sin vestigios de sustancias antisép-ticas, provisto con tapa de rosca, preferentemente incoloro y transparente.

En todos los casos las heces deben ser recién emitidas.Si el examen de una muestra resulta negativo, no correspondiéndose este

resultado con el cuadro clínico, se debe realizar un examen seriado, consisten-te, en el análisis de varias muestras (6 a 8) enviadas al laboratorio en díasalternos, ya que en ocasiones los resultados negativos estando el pacienteparasitado debido a que diversas especies presentan las llamadas fases negati-vas, durante las cuales no aparecen sus elementos de diagnóstico, aunque exis-tan en el tracto digestivo, por lo que el examen de varias muestras en periodosde tiempo diferentes aumentan las probabilidades de localizar e identificar laespecie.

La primera muestra debe recogerse por defecación espontánea y las suce-sivas; algunas mediante la inducción con laxantes y otras, al igual que la primerade forma espontánea, con el empleo del laxante (sulfato de magnesia) se lograevacuaciones de heces líquidas o al menos blandas que permiten detectar con

Fig. 102: Toma de muestra de la linfa auricular: a) Colocación de la pinza en el lóbulo dela oreja; b) Incisión con el bisturí en la zona isquémica.

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mayor frecuencia la presencia de quistes y huevos de helmintos, contrario a loque ocurre con las heces sólidas.

En el caso de heces destinadas para coprocultivo: Indicar al paciente, querecoja la muestra en un frasco, con similares características que el empleadopara el examen parasitológico, pero estéril, el cual debe ser solicitado en ellaboratorio.

Orina (para urocultivo)

Concepto: La orina es un líquido secretado por los riñones, que se caracte-riza por tener un color amarillo, ser ligeramente ácida, tener un olor peculiar yun sabor salino. Está compuesta principalmente por agua en la que se encuen-tran en disolución diversos compuestos, como, urea, glucosa etc. y otros com-ponentes como, ácido urico, ácido hipúrico, etc. Además de células epitelialesleucocitos y eventualmente hematies.

Indicaciones específicas:

1. No orinar después de las doce de la noche.2. Aseo matutino de genitales externos con agua y jabón, y enjuagar con agua

previamente hervida y yodada. Para realizar con efectividad el aseo, los hom-bres se deben retirar bien el prepucio y las mujeres separar los labios.

En todos los casos la muestra debe ser recogida en frascos estériles entre-gados por el laboratorio.

Procedimiento:

1. Comenzar a orinar desechando el primer chorro. Aguantar la micción.2. Destapar el frasco estéril y depositar con cuidado de 10 a 20ml de la porción

media, desechando el resto de la orina.3. Tapar el frasco inmediatamente y enviar la muestra al laboratorio antes que

transcurran dos horas.

Nota:

- Las mujeres deben orinar paradas y recoger la orina "al vuelo", ya que orinar senta-das, como es lo habitual, las probabilidades de contaminación con los gérmenesprocedentes de la microbiota residente o transitoria aumentan.

- En los casos de niños pequeños, se emplean colectores estériles que deben sercambiados si la misción se demora o si se contamina con heces.

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Faneras

Concepto: Término general aplicado a las infecciones persistentes en lasuperficie de la piel, el pelo o las uñas.

Indicaciones específicas: Suspender cualquier tratamiento local, 48 horasantes de la toma de la muestra. La noche anterior a la toma de la muestra, elpaciente debe asearse la zona de la lesión con agua y jabón, enjuagándose consolución salina fisiológica estéril cubriendo la lesión con apósito estéril, el cual leserá retirado en el laboratorio.

Procedimiento:

a) Lesión abierta en piel. Con hisopo estéril, fino, tomar la muestra en elentorno del borde sin tocar la piel.

b) Absceso subcutáneo. En los abscesos calientes, previa desinfección de lapiel, se toma la muestra, puncionando la lesión con una aguja insertada a unajeringuilla. En los accesos fríos se toma igualmente con aguja y jeringuilla,pero específicamente en el punto mas elevado de la colección purulenta.

c) Lesión seca. (escamosa en piel). Previa desinfección de la zona con unatorunda estéril, humedecida en alcohol etílico al 70 %, raspar la lesión conun bisturí, recolectando la descamación en el interior de una placa dePetry estéril.

d) Lesión grasienta o purulenta. Tamponar la lesión con solución salina fi-siológica estéril, para seguidamente tomar la muestra con hisopo.

e) Fístula. Desinfectar previamente el orificio y tomar la muestra con hiso-po fino estéril en profundidad.

f) Uñas. Al igual que para la toma de muestra de la lesión seca en piel, la demuestra de la uña infectada se realiza mediante raspado de la superficiey debajo de la uña con un bisturí, recobrando el material en el interior deuna placa de Petry estéril.

g) Observar la cabellera del paciente bajo la luz de una lámpara de Wood.Con una pinza de disección arrancar varios cabellos que se observenfluorescentes, y colocarlos en el interior de una placa de Petry estéril.

PRODUCTOS PATOLÓGICOS

Concepto: Producto resultante de la actividad de algunos microorganismosal interactuar con los tejidos. Los más comunes son el pus y el esputo:

- Pus (ya explicado en la toma de muestras de piel)- Esputo. Materia densa y viscosa, que es expectorada por las vías respi-

ratorias superiores, mediante el esfuerzo de tos profunda, eliminándosepor la boca o siendo deglutido.

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Indicaciones específicas:

1. Al levantarse en horas de la mañana, retirar las prótesis y realizar aseomatutino bucal, adecuado.

2. Recoger en un frasco estéril con tapa de rosca y color ámbar la primeraexpectoración de la mañana, mediante inspiración, seguida de tos profun-da, tratando de no recoger saliva.

3. Enviar lo antes posible la muestra al laboratorio (separada de la orden deanálisis).

4. Durante la recolección del esputo evitar que se produzca derramamientodel mismo, por la parte externa del frasco.

Para la recepción ver capítulo de Bioseguridad.

CUESTIONARIO

1. En su opinión que es una muestra?2. ¿Que usted entiende por muestras representativas?3. Refiérase a las diferentes causas que pueden afectar la representatividad

de una muestra.4. ¿Que implicaciones puede tener la demora en la realización de la siembra?5. Explique los diferentes métodos empleados para la conservación de las

muestras.6. ¿Que importancia tiene para usted. La cantidad de muestra a tomar?7. ¿En que momento se debe tomar la muestra?8. ¿Porque es importante delimitar el área anatómica de donde se va a

tomar la muestra?9. ¿En que consiste las precauciones de asepsia?10. ¿Que instrucciones generales debemos dar al paciente que tiene indicado

un examen microbiológico?11. ¿Que es un exudado?12. Nombre los diferentes tipos de exudado que podemos tomar del paciente.13. Nombre los diferentes líquidos orgánicos que se obtiene del paciente para

investigaciones microbiológicas.14. Describa el procedimiento a seguir para obtener del paciente una mues-

tra de sangre para hemocultivo.15. ¿Como usted procede para obtener una muestra de linfa para el paciente?16. ¿Cómo se le indica al paciente recoger las muestras de heces fecales

para examen parasitológico?17. ¿ Que instrucciones debe seguir el paciente para recoger muestras de

orina para urocultivo?18. ¿Como usted toma las muestras de las faneras?19. ¿Que indicaciones le daría al paciente para recolectar una muestra de

esputo con calidad?

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CAPÍTULO 14

PREPRACIÓN DE MUESTRAS EN LÁMINASPARA EXÁMENES MICROSCÓPICOS

INTRODUCCIÓN

La microscopía, constituye junto con el cultivo y las pruebas de identifica-ción, los procederes básicos, sobre los cuales se sustenta el diagnóstico micro-biológico de laboratorio.

Para la realización del examen microscópico, las muestras a investigar de-ben ser preparadas previamente sobre láminas portaobjetos escrupulosamentelimpias, sin rayaduras ni manchas.

El procedimiento a emplear para el montaje de las muestras en láminas,variará en dependencia de los objetivos que se pretenden con la microscopía yde la muestra de que se trate.

En los exámenes microscópicos, esencialmente se pretende observar: lamorfología de los microorganismos y/o sus diferentes estructuras, la manera deagruparse y sus afinidades tintoriales, así como, detectar la presencia de célu-las, leucocitos y otros elementos de interés como pueden ser, larvas, huevos dehemintos, etc.

DIFERENTES MÉTODOS

Preparación de muestras en láminas para examen microscópico enfresco

Para la realización de este montaje, la muestra a emplear se utiliza, tal ycomo se obtuvo, sin la adición de ningún reactivo, ni procesamiento previo,aunque en algunas ocasiones resulta pertinente centrifugarla para concentrarlos elementos, que presuntivamente contiene y facilitar su localización durantela realización de la microscopía.

Procedimiento:

1. Empleando un asa de platino previamente flameada, el propio tubo que con-tiene el sedimento o una pipeta estéril, deposite una gota de la muestra en elcentro de la lámina portaobjetos.

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2. Coloque sobre la gota de la muestra o sedimento una lámina cubreobjetos. Siel volumen de la gota fue el adecuado, debe quedar, exactamente debajo detoda el área del cubreobjetos. Si quedara algún espacio sin cubrir se incurriríaen error por defecto, debido a insuficiente cantidad de muestra y si se derra-ma por fuera del cubreobjetos, el error en el montaje sería por exceso. Enambos casos se debe repetir el montaje.Para evitar que queden espacios con burbujas de aire, la colocación delcubreobjetos debe efectuarse suavemente.

Método de la gota colgante

Este método se emplea específicamente para constatar mediante la obser-vación microscópica si el microorganismo en estudio es o no móvil.

Procedimiento:

1. Coloque sobre la mesa de trabajo una lámina portaobjetos excavada y auxiliándosede un aplicador unte petrolado en todo el perímetro de la excavación.

2. Proceda a flamear al rojo un asa de platino y una vez fría, tome una asada delcultivo germinado en medio de cultivo líquido y deposítela en el centro de unalámina cubreobjetos. Si el microorganismo a examinar se hubiera desarrolla-do en un medio sólido se procederá a colocar previamente sobre la láminacubreobjetos una gota de suero fisiológico y posteriormente se tomará conasa de platino estéril y fría, una pequeña porción de la colonia, procediendo aemulsionarla en la gota de suero fisiológico.

3. Coloque la lámina excavada sobre el cubreobjetos, de manera que la prepa-ración quede justamente debajo de la excavación y ambas láminas quedenpegadas por el petrolado.

Fig. l03: Preparación de muestras en láminas para exámenes microscópicos: a) Depositaruna gota de muestra en el centro del portaobjetos; b) Colocación encima de lamuestra de una lámina cubre objetos.

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4. Con un movimiento suave voltee sin temor la preparación, de manera queel cubreobjetos quede encima con la preparación la cual quedará colgan-do. En estas condiciones se coloca en el microscopio para su observa-ción.

Preparación en láminas de muestras coloreadas

Este método se utiliza cuando se requiere teñir a los microorganismos y/osu entorno, para su mejor observación o para determinar sus afinidades tintoriales.Debido al ínfimo tamaño o la composición bioquímica de las diferentes estructu-ras, se requiere en cada caso técnicas de tinción especiales para la coloraciónde cada una de ellas.

La preparación en láminas se efectúa por dos procederes diferentes: laadición del colorante a la muestra o la preparación de frotis.

Adición de colorantes a la muestra

Se procede exactamente igual que para la preparación en fresco con ladiferencia de que la muestra es emulsionada con el colorante en cuestión, antesde ser colocada la lámina cubreobjetos.

Ejemplo: Examen directo de heces fecales, con el empleo del coloranteEosina.

Fig. 104: Esquema de una preparación de gota colgante: a) Portaobjetos con una excava-ción central rodeada de un anillo de petrola to; b) Cubreobjetos con una gota decultivo; c) Ensamblaje de la lámina excavada con el cubreobjetos; d) Viraje de lapreparación.

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Preparación de frotis

El frotis consiste en una extensión de la muestra con hisopo o asa de platinosobre la lámina portaobjetos, de manera que al sacarse quede formando una capa.

Procedimiento:

Si la muestra o el cultivo fueran líquidos, deposite sobre la lámina portaobjetosuna cantidad suficiente, que le permita hacer un frotis grueso con ayuda de unasa de platino estéril. Debe ser grueso, ya que los microorganismos cuando sehayan en un medio líquido tienden a estar muy dispersos, lo cual dificulta sulocalización en el examen microsocópico en la medida en que el frotis sea de-masiado fino.

Si el frotis se fuera hacer empleando una colonia germinada en medio decultivo sólido, se debe echar previamente en el centro de la lámina portaobjetosuna gota de solución salina fisiológica y posteriormente emulsionar la coloniacon un asa de platino estéril con la que se hará la extensión. Debido a que en lascolonias, los microorganismos están muy conglomerados, el frotis debe hacersemuy fino para que se pueda distinguir adecuadamente su agrupación caracterís-tica.

Después de realizado el frotis, déjelo sobre la mesa de trabajo hasta que elagua residual que contiene se evapore y se seque. Si desea acelerar este proce-so puede introducirlo en una incubadora pero nunca, en la llama del mecheropara acelerar el proceso ya que los gérmenes pueden deformarse y generarconfusiones al microscopista.

Una vez seco el frotis, tome la lámina por los bordes con los dedos índicey pulgar, de manera que la extensión quede hacia arriba. Pase la lámina direc-tamente por la llama del mechero dos o tres veces, de manera que la parteposterior de la lámina sea lamida por la llama. La exposición al calor directoprovocará que las estructuras de naturaleza proteíca, se coagulen, lo que pro-vocará que la preparación quede adherida a la lámina y no sea desprendidadespués de la coloración por el agua que se utilice para eliminar el exceso decolorante.

Fig. 105: Preparación de una preparación sobre láminas portaobjetos.

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Fig. 106: Fijación de un frotis a la llama del mechero.

CUESTIONARIO

1. Describa el procedimiento para el montaje de muestras para la observa-ción de examen en fresco ente cubre y portaobjetos.

2. Especifique para qué se realiza el método de la gota colgante.3. ¿En qué consiste un frotis?4. Explique las diferentes maneras de preparar los frotis de acuerdo al tipo

de muestra de que se trate.5. ¿Cómo usted fija los frotis?6. ¿Con qué objetivo se fijan los frotis?

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CAPÍTULO 15

COLORANTES Y COLORACIONES

INTRODUCCIÓN

Las bacterias, levaduras y protozoarios, en su estado natural, carecen decolor, teniendo un aspecto semitransparente, por lo que resulta muy difícil suobservación en las preparaciones acuosas sobre láminas portaobjetos, someti-das a la intensa iluminación que se requiere en los exámenes microscópicos decampo brillante, siendo necesario colorearlas por diferentes métodos de tinciónque factibilicen su observación y distinguir las características morfológicas yestructurales que sirvan de datos para su identificación genérica.

CONCEPTO

Los colorantes son sustancias de origen químico o biológico, generalmentetintes, pigmentos, reactivos u otros compuestos, empleados en la coloración detejidos microorganismos para exámenes microscópicos, debiendo tener al me-nos, un grupo cromóforo que le proporcione la propiedad de teñir.

FUENTES DE OBTENCIÓN DE LOS COLORANTES

Atendiendo a la fuente de obtención, los colorantes se clasifican en natura-les y sintéticos.

Colorantes naturales

Los colorantes naturales son básicamente histológicos, encontrándose en-tre los empleados con mayor frecuencia, los siguientes:

1. Índigo: Se obtiene de diversas especie de plantas del genero indigófera quecontiene indican, el cual se fermenta para producir el colorante.

2. Carmín: Se produce, mediante el tratamiento con alumbre y otras sales metá-licas a hembras del insecto cochinilla "Coccus castis".

3. Orceína y Tornasol: Se obtiene mediante el procesamiento industrial de líque-nes de los géneros: Le canora tinctoria y Rosella tinctoria.

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4. Hematoxilina: Este colorante se extrae con éter de la madera de un árboloriundo de México y de algunos paises suramericanos denominadosHematoxilium campechianum.

Colorantes sintéticos

Se obtiene de la anilina, o es mas exactamente del alquitrán de hulla siendotodos derivados del benceno. Atendiendo a su estructura química se agrupan dela siguiente manera:

Cuadro: 9. Clasificación de los colorantes.

G R U P O S U B - G R U P O C O L O R A N T E

QUINONIMINA TIACINA Azul de metilenoToluidina

ACINAS Rojo neutroSafranina CNigrosina

FENILMETANO DIAMINOTRIFENIL- Verde malaquitaMETANO Verde Brillante

Violeta cristal

XANLEIRO FLUORANA Eosina B e YMercuro Cromo 220Rosa de bengala

SULFONSFTALEINA Azul de bromofenolVerde bromocresolAzul de bromotimolRojo cresolFenolftaleinaRojo fenolAzul timol

ACRIDINA AcriflavinaNaranja de acridina

CLASIFICACIÓN

Los colorantes se clasifican, teniendo en cuenta si la propiedad tintorial seencuentra en el aniòn o el catiòn de su estructura química. Sobre esta base sepueden dividir en tres grupos: básicos, ácidos y neutros.

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Colorantes básicos: La acción colorante está a cargo del catión, mientrasque el anión no tiene esa propiedad, por ejemplo: - cloruro de azul de metileno+.

Colorante ácido: Sucede todo lo contrario, la sustancia colorante esta acargo del anión, mientras que el catión no tiene propiedad, por ejemplo:eosinato- de sodio+

Colorantes neutros: Están formados simultáneamente por soluciones acuo-sas de colorantes ácido y básicos, donde el precipitado resultante, soluble exclu-sivamente en alcohol, constituye el colorante neutro, que tiene la propiedadtintorial de sus componentes ácidos y básicos, por ejemplo: la giemsa.

AFINIDADES TINTORIALES

En el proceso de la coloración, ocurre una combinación de reacciones físi-cas y químicas.

Reacción física

Ocurre un fenómeno de absorción similar al que tiene lugar en las materiasporosas, considerando que el colorante penetra en los intersticios del cuerpocoloreable y se mantiene allí por la cohesión molecular.

Reacción química

Las células microbianas son ricas en ácidos nucleicos que portan cargasnegativas en formas de grupos fósfato combinándose como colorante básicoscargados positivamente. Los colorantes ácidos que tienen la acción coloranteen el anión no tiñen la célula, empleándose como colorante de contraste paracolorear su entrono, como por ejemplo: la tinta china o la eosina que no coloreaal microorganismo, pero si el fondo del campo microscópico.

TOXICIDAD DE LOS COLORANTES. VENTAJASY DESVENTAJAS

Los colorantes son sustancias tóxicas, por lo tanto el proceso de la tincióngeneralmente resulta letal para los microorganismos, provocando su inmo-vilización, lo cual puede significar una ventaja o desventaja para el investi-gador según sean los objetivos con la sustancia colorante. Veamos algunosejemplos:

1. Al ocasionar la muerte de los microorganismos sometidos al proceso de tinciónse reducen las posibilidades de contaminación para el manipulador.

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2. Los colorantes pueden ser tóxicos para el manipulador, algunos incluso han resul-tado cancerigenos por lo que ha habido la necesidad de retirarlos del mercado.

3. Algunos colorantes solo tienen afecto letal para determinadas especies ogéneros bacterianos, siendo utilizados como constituyentes de medios de cul-tivo selectivo para impedir el desarrollo de microorganismos indeseables yfavorecer el desarrollo de las especies que nos interesa estudiar. Por ejem-plo: el verde de malaquita.

4. Otros se emplean como desinfectantes microbianos, mas que para teñir, confines de microscopia, por sus propiedades bacterianas o bacteriostáticas.

5. Algunos tipos de colorantes son empleados no para teñir, sino como indicadoresde pH, formando parte de la composición de los medios de cultivo para indi-car los cambios de basicidad o acidez que se vayan produciendo en el mediocomo consecuencia de su actividad metabólica. Ejemplo: rojo fenol, azul debromotimol, etc.

METODOS DE COLORACIÓN

Atendiendo a los objetivos que se persigan, los métodos de coloración seclasifican en: Tinción simple, tinción compuesta y tinción especial.

Tinción simple

En la tinción simple se utiliza un solo colorante con el que se tiñe rápidamen-te el microorganismo, utilizándose fundamentalmente para observar su morfolo-gía y tamaño. Los colorantes empleados con mayor frecuencia para este tipo detinción son los siguientes: azul de metileno, violeta cristal y fuscina fenicada,entre otros.

Tinción compuesta

En este tipo de tinción, se utiliza más de una sustancia tintórea. Los colo-rantes se aplican, a la preparación, separados o juntos, formando parte de unasolución. En consecuencia se puede determinar algunas características propiasde diversos géneros que permiten diferenciarlo de los demás, por lo que recibentambién el nombre de coloraciones diferenciales. Entre los métodos mas utiliza-dos se encuentran: La coloración de Gram. y la de Ziehl Neelsen.

Coloración de Gram

En 1884, el danés Hans Chistian Gram, ideó un método de coloración, quees en la actualidad, el más empleado en los laboratorios de bacteriología, me-

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diante el cual, la bacteria sometida a esta tinción, en dependencia de la compo-sición químico de la especie, queda teñida de color violeta o de color rojo.

Colorantes y reactivos

1. Solución violeta de genciana al 1%- Violeta de genciana ................................... 1g- Cristales de ácido carbólico....................... 2g- Alcohol absoluto........................................10 mL- Agua destilada .......................................... 100 mL Preparación ( en un mortero):. Diluir los cristales de violeta de genciana en alcohol, con ayuda del brazo

del mortero.. Agregar los cristales de ácido carbólico y mezclar.. Agregar poco a poco las dos terceras partes del agua destilada. Revol-

viendo constantemente.. Echar la mezcla en una probeta graduada de 100 ml de capacidad.. Con el resto del agua, enjuagar el mortero y añadir este residuo con

cuidado en la probeta.. Añadir el resto del agua, hasta enrasar en 100 ml." Dejar la preparación en reposo durante 24 horas y filtrarla con papel de

filtro.. Envasar en frasco ámbar o plástico no transparente con tapa de rosca y

rotular..2. Lugol de Gram.

. Cristales de yodo ......................... 1g

. Yoduro de potasio ....................... 2g

. Agua destilada ............................. 300 ml Preparación (en un mortero):. Mezclar los cristales de yodo con los de yoduro de potasio.. Agregar poco a poco el agua destilada, revolviendo constantemente con

el brazo del mortero.. Envasar en frascos de vidrio de color ámbar con tapa de rosca o prefe-

riblemente con tapa de vidrio esmerilado. Rotular.3. Alcohol etílico 95 % o alcohol acetona al 20 %

. Alcohol etílico 95 % ........................ 80 mL

. Acetona ...................................................... 20 ml Preparación. Después de diluida la acetona en el alcohol, envasar en frascos de vidrio

o plástico con tapa de rosca.

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4. Solución de Safranina al 1 %. Safranina ........................... 1g. Agua destilada .................. 100 ml Preparación ( en un mortero):. Echar la safranina en un mortero y añadirle poco a poco al agua destilada

hasta diluir el colorante.. Dejar en reposo durante 24 horas y filtrar con papel de filtro.. Envasar en frascos de vidrio o plástico. Rotular.

Procedimiento

Después de fijado el frotis a la llama del mechero, colocar la lámina sobre elpuente de coloración.

1. Verter la solución de violeta de genciana, hasta cubrir el frotis, dejandoque el colorante actué por espacio de 30 segundos.

2. Lavar la preparación ligeramente con agua corriente.3. Echar sobre la preparación el lugol de Gram., hasta cubrir el frotis dejan-

do que actué durante 30 segundo.4. Lavar la lámina con agua corriente.5. Echar sobre la preparación el alcohol etílico 95 % o el alcohol acetona al

20 %, hasta que se evidencie que este solvente no extrae mas el coloran-te violeta. Esta operación debe durar aproximadamente de 1 a 2 minutos.

6. Lavar la lámina con agua corriente.7. Echar sobre la preparación la solución de safranina, dejándola actuar por

espacio de 30 segundo.8. Lavar con agua corriente.

Secado de lámina

Al concluir el proceso de coloración, la lámina se debe colocar de cantopara que se escurra. Debe tenerse en cuenta que el agua y en especial, el agua

Fig. 107: Juego de colorantes y reactivos empleados en la coloración de Gram.

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destilada, es un agente decolorante, por lo que si se deja sobre el portaobjetosdespués de teñirlo demasiado tiempo quita parte del colorante. Lo ideal es escu-rrir la lamina poniéndola de canto y seguidamente secarla con papel de filtro.

Principios

A pesar de que esta técnica de coloración se ha venido empleando desdehace mas de un siglo, aún no se ha podido determinar con exactitud la basemolecular de la reacción, existiendo controversias al respecto.

El criterio mas generalizado es que la violeta y el lugol forman un complejoque reacciona con los componentes bioquimicos de la pared celular deshidratada,fijándose en esta. Teniendo en cuenta que la composición química de la pared,no es igual en todos los géneros, la reacción resultante será obviamente diferen-te, lo que da lugar, que mientras algunos géneros retienen firmemente el colo-rante al resultar el complejo impenetrable para el decolorante, en otros génerosla barrera que se produce es más permeable, lo que permite al solvente penetrary extraer el complejo violeta-lugol, dejando a la bacteria nuevamente incolora.

Fundamento técnico

En el primer paso de la coloración, cuando los microorganismos presentesen el frotis son expuestos a la acción colorante de la violeta de genciana, todoslos géneros que se encuentran en el frotis se tiñen de color violeta.

Al adicionar el lugol, no se produce ningún cambio de color, ya que el lugolno es un colorante, sino un mordiente, que se adiciona con el objetivo de formarun complejo violeta-lugol, para fijar el color en la bacteria.

Al adicionar el decolorante (alcohol etilicio o alcohol acetona) algunos gé-neros no son afectados por estos solventes, reteniendo por consiguiente el colorvioleta aplicado inicialmente, en tanto que otros son decolorados quedando labacteria nuevamente incolora.

Al echar finalmente la solución de safranina (que es de color rojo ) lasespecies que no fueron decoloradas, mantienen la coloración violeta ya que lasafrania es un colorante mas débil que la violeta y su adición no influyesignificativamente en cambio de color, en tanto que los géneros que fuerondecolorados por el alcohol, se tiñen con la safrina, adquiriendo un color de rosa-do o rojo.

Diagnóstico microscópico

Las bacterias que se observan de color violeta se clasifican como Grampositivas y las que se observan de color rojo, como Gram negativas.

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Coloración de "Ziehl Neelsen

Algunos géneros microbianos dentro de los que se incluyen lasmicrobacterias, tienen la propiedad de retener el colorante con que han sidoteñidas, aunque sean sometidos a la acción de solventes tan fuertes como losácidos para su decoloración, el primer método de coloración para este tipo demicroorganismo, fue concebido y aplicado por Robert Koch, descubridor delagente causal de la tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis o Bacilo de Koch.Fue modificada y perfeccionada posteriormente por Ziehl y Neelsen. Este mé-todo se utiliza hoy en dia, con alguna que otra modificación en función de lasparticularidades de la especie en estudio.

1. Colorantes y reactivos. Fucsina básica ...................... 1g. Cristales de fenol ................. 5g. Alcohol absoluto .................. 10 ml. Agua destilada ...................... 100 ml Preparación:. Disolver los 5g de fenol en 100 ml de agua destilada. Echar 50 ml de la

solución en una probeta graduada de 100 ml de capacidad.. Moler en un mortero 1g de fucsina y añadir en la probeta que contiene

los 50 mml de la solución del fenol.. Lavar el mortero con la solución de fenol y añadir ese residuo en la

probeta.. Añadir el resto de la solución de fenol hasta enrasar a 100 ml.. Dejar la preparación en reposo por espacio de 24 horas y filtrar con

papel de filtro.. Envasar en frascos de vidrio de color ámbar y rotular.

2. Alcohol clorhidrato al 3 %. Alcohol etílico .................... 97 ml. Ácido clorhídrico concentrado......3 ml

Fig. 108: Juego de colorantes y reactivos empleados en la coloración de Ziehl Neelsen.

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Preparación. Agregar los 3ml del ácido clorhídrico a los 97ml de alcohol etílico.. Envasar en frascos de vidrio con tapa de rosca. Rotular.

3. Solución de ácido sulfúrico al 20 %. Agua destilada ............................ 80 ml.. Ácido sulfúrico............................ 20 ml. Preparación.. Agregar poco a poco, con cuidado, los 20 ml de ácido sulfúrico a los

80 ml de agua destilada. (Nunca a la inversa).. Envasar en frasco de vidrio con tapa de rosca. Rotular.

4. Solución de azul de metileno (Colorante de contraste). Cloruro de azul de metileno ............................ 0,1g. Agua destilada................................................. 100,0 ml El cloruro de azul de metileno es hidrosoluble, por lo que su dilución se

realiza sin ningún tipo de contratiempo Preparación.. Una ves diluido, dejar en reposo por 24 horas y filtrar con papel de filtro.. Envasar en frascos de vidrio o plástico con tapa de rosca. Rotular.

Procedimiento:

Después que el frotis se ha secado colocar la lamina sobre el puente decoloración.

1. Cubrir el frotis con fucsina fenicada y oscilar suavemente la llama delmechero por debajo de la lamina, hasta que el colorante calentado co-mience a emitir vapores. Retirar el mechero y dejar que el coloranteactué sobre el frotis por espacio de 5 minutos. Si en ese tiempo el colo-rante se secara, añadir más, pero sin volver a calentarlo.

200

2. Verter el exceso de colorante de la lámina, ladeando la lámina y lavarlacon agua corriente.

3. Echar sobre frotis la solución de alcohol clorhídrico o en su defecto lasolución acuosa de ácido sulfúrico, dejando actuar el decolorante, hastaque se observe que el solvente no extrae mas colorante de la prepara-ción. Esta operación debe durar aproximadamente unos 2 minutos.

4. Lavar la lámina con agua corriente.5. Añadir la solución acuosa de azul metileno, dejando actuar el colorante

de 30 segundos a un minuto.6. Lavar la lámina con agua corriente.7. Dejar que la lámina se seque al aire sin aplicar papel de filtro para acele-

rar el secado.

Principio:

Las microbacterias, como el Mycobaccterium tuberculosis y otras especiessusceptible de ser coloreadas por esta técnica, se caracterizan por tener unaalta proporción de ácido micolico (lípidos) en su pared celular. La acción delcalor, introducido en este método, hace que la misma se permeabilice y hagaaccesible la penetración de la fucsina, tiñéndose la pared celular. Al normalizar-se la temperatura de la preparación, el compuesto lipidico impermeabiliza lapared a la acción del decolorante ácido, con lo cual el microorganismo se man-tiene teñido. El resto de las especies, así como las células epiteliales y otrosartefactos, que no disponen de ácido micólico en su pared o membrana, sondecolorados, después de teñidos por la fucsina.

Fundamento técnico

Al someter el frotis a la acción de la Fucsina, todos los microorganismos,independientemente de que dispongan o no de ácido micolico en sus respectivasparedes celulares serán coloreados de rojo. Al aplicar el decolorante ácido, lasespecies que posean el ácido micolico en la pared, resisten la acción decolorantey se mantienen teñidas de rojo, en tanto que las demás se quedan incoloras. Alaplicar la coloración de contraste (azul de metileno) las bacterias que retuvieron elcolor proporcionado por la fuscina, no sufren ninguna alteración permaneciendode color rojo, pero las especies que si fueron decoloradas, se tiñen de azul, al igualque las células epiteliales y otros artefactos presentes en la preparación.

Diagnóstico microscópico

Los bacilos que se observan coloreados de rojo están diagnosticados comoB.A.A.R. (Bacilos ácidos alcohol resistentes)

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Ccoloración de Ziehl Neelsen (modificada para Mycrobacteriumleprae)

Justificación: La capacidad de acidorresistencia del M.leprae, es diferentea la del M.tuberculosis. lo que ha dado lugar a una modificación del metodo detinciòn clásico, para hacer mas efectiva su tinciòn.

Procedimiento:

Después que el frotis se ha secado al aire, proceda de la siguiente manera:

1. Pase la lámina 3 veces por la superficie de la llama del mechero.2. Coloque en el fondo de un vaso de koplin, una pequeña mota de algodón

impregnado con 3 gotas de formol al 40 %3. Intriouzca la lamina en el vaso de Koplin y tapelo. Dejar actuar los vapo-

res de formol por espacio de 3 minutos.4. Sacar la lamina del vaso de koplin y pasarla nuevamente 3 veces por la

llama del mechero.5. Repetir el paso 3.6. Coloque la lamina sobre el puente de coloración y cubrala con fuscina

basica. Dejar actuar el colorante por espacio de 20 minutos7. Lavar la lamina con agua cruda.8. Colocar nuevamente la lamina sobre el puente y cubrirla con alco-

hol clorhídrico al 1%. Dejar actuar el decolorante por espacio de 2minutos.

9. Lavar la lamina con agua cruda.10. Colocar la lamina sobre el puente de coloración y cubrirla con azul de

metileno, verde de malaquita o hematoxilina. Dejar actuar el colorante decontraste por espacio de 1 a 2 minutos.

11. Lavar la lamina con agua corriente escurrir y dejar secar al aire.

NOTA: Estos colorantes se comercializan ya elaborados por diferentes empresas.

Tinciones especiales:

Existen decenas de metodos de coloraciones especiales, destinadas a latinciòn de las diferentes estructuras de la celula microbiana, tales como flagelos,capsulas, esporas, granulos, etc, generalmente no susceptible de ser coloreadospor los metodos anteriormente explicados. En este tema haremos referenciasolo a algunos metodos empleados con mayor frecuencia.

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Coloración Fragelar de Leifson (modicficación de Clark)

Los flagelos son estructuras, cuyo diámetro no excede de los 30mm, lo cualesta muy por debajo del poder de rersouciòn del micrososcopico optico. Parahacer visibles a los flagelos se requiere aumentar su grosor, para lo cual seemplea una suspensión de acido tanico que al precipitarse sobre su cubiertaforman una capa que aumenta aparentemente su diámetro. Lo que propicia queal ser posteriormente coloreado, tanto los flagelos como su disposición con res-pecto al bacilo se hagan visibles al microscopista.

Colorantes y reactivosSolución A:- Fuscina basica (certificada para colores flagelos) ...........1,2g- Alcohol etílico 95% ......................................................... 100.0 ml

Mezclar y dejar a temperatura ambienteSolución B- Acido tanico.................................... 1,5g- Cloruro de sodio............................. 0,75g- Agua destilada................................ 100,0 ml

Preparación:1. Mezclar a volumen iguales A y la B. Ajustar el pH con NaOH/1N.2. Envasar en alícuotas de 50 ml. Guardar congelado en refrigeración (Tiempo

de conservación: 1 mes).

Requisitos a tener en cuentaPara que la tinciòn de los flagelos sea efectiva se requiere cumplir con los

siguiente requisitos

1. Los medios de cultivo empleado para el desarrollo de las cepas deben seradecuados.

2. Los cultivos tienen que ser jóvenes.3. Las laminas portaobjetos y cubreobjetos deben estar escrupulosamente

limpias sin el mas minimo vestigio de grasa.4. Las laminas a emplear deben calentarse previamente y enfriarse a la

temperatura corporal, para que los frotis se sequen con rapidez.

Procedimiento

1.Coloque sobre la mesa de trabajo 3 láminas portaobjetos limpias y aca-badas de calentar.

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2.Deposite una gota grande de una suspensaiòn bacteriana joven, proce-dente de un cultivo líquido o del agua de condensación de un cultivo sóli-do, casi al extremo de cada una de las tres láminas e inclínelas suave-mente para que la gota se deslice (no extender con asa).

3.Espere a que las laminas se sequen al aire. 4.Eche sobre cada lámina portaobjetos 1mL del colorante de Leifson y dé-

jelo actuar con un tiempo diferente para cada preparación. Una de lasláminas por espacio de 8 minutos, la segunda por espacio de 10 minutos yla tercera 15 minutos.

5.Lave con agua corriente. 6.Cubra cada frotis con solución de azul de metileno 1:1,000 en solución

acuosa 1:2,000 de borax y deje actuar el colorante por espacio de 10minutos.

7.Lave con agua corriente y espere a que las preparaciones se sequen al aire.

Coloración de cápsulas

La cápsula es una sustancia viscosa producida por algunas especies que lasintetizan a partir de polipéptidos, polímeros de glucosa u otros aminoazucaresque contienen nitrógeno, que después de combinarse con el agua es segregadapor todo el contorno de la pared celular como un moco gelatinoso. Cuando lacápsula ha sido producida puede observarse en los frotis coloreado por el méto-do de Gram como un halo incoloro alrededor de la bacteria. Cuando se requierever la cápsula con más detalle o inducir su producción se recurre a coloracionesespeciales.

Coloración de Hiss

-Colorante capsular de Hiss.Mezclar 5 mL de solución alcohólica satura de violeta de genciana en

95 mL de agua destilada.

Procedimiento.

1. Sobre una lámina portaobjetos mezcle partes iguales del material a teñircon suero específico. Haga un frotis fino y déjelo secar al aire.

2. Fije la preparación a la llama del mechero.3. Cubra el frotis con el colorante de Hiss.4. Proceda a pasar la llama del mechero por debajo de la lámina hasta que

el colorante se caliente y empiece a emitir vapores. Esperar de 5 a 10segundos.

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5. Lavar el colorante con solución acuosa de sulfato de cobre al 20%.6. Dejar que la preparación se seque al aire y examinar al microscopio.

Resultado

Las bacterias, así como otras células y el fondo del campo se tiñen de rojointenso en tanto que las cápsulas se observan incoloras y en ocasiones con unmatiz azul muy tenue.

Coloración de Esporas

Coloración de Dorner.- En un tubo de ensayo haga una suspensión densa del microorganismo en

estudio con 3 o 4 gotas de agua destilada.- Agregar 3 o 4 gotas de fucsina fénica de Ziehl Neelsen.- Hervir de 10 a 15 minutos, en baño de agua de ebullición.

Colorante.Solución de nigrosina de Dorner.

-Nigrosina .................................................................................... 10g-Agua destilada .............................................................................100 ml

Preparación

1. Hervir la solución en erlenmeyer durante 30 minutos.2. Agregar 0,5 mL de formol al 40 % (como preservo)3. Filtrar dos veces con papel de filtro doble.4. Distribuir en tubos de ensayo serológico, unos 5 mL por tubo procediendo

a taponearlos con tapas de corcho, retapándolos finalmente con papel dealuminio.

Procedimiento

- Coloque en el centro de una lámina portaobjetos un asa de la preparacióny mézclela con un asa de nicrosina de Dorner, haciendo un frotis delgado.

- Dejar secar y observar a microscopio a 700x con lente de inmersión.

Resultado

Las esporas se observan de color rojo. Las células vegetativas no se colo-rean y el fondo del campo adquiere un tono gris.

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Coloración de gránulos.

Colorante.Azul de metileno.Preparación.Azul de metileno ........................................................................... 1,5gAlcohol etílico 95 % .................................................................. 100,0 mL

Preparación

Mezclar el azul de metileno en un mortero, añadiendo poco a poco el alco-hol y revolviendo. Dejar en reposo durante 24 horas y filtrar con papel de filtro.

Procedimiento

1. Hacer frotis finos y dejar secar al aire.2. Cubrir con el colorante y dejar actuar durante tres minutos .3. Lavar con agua corriente.4. Dejar secar al aire y observar con lente de inmersión a 700x.

Resultados

Los gránulos se tiñen de azul oscuro y el cuerpo de la bacteria de azul claro.

CUESTIONARIO

1. En su estado natural ¿qué color y aspecto tienen las bacterias?2. ¿Qué usted entiende por colorantes?3. ¿Cuáles son las diferentes fuentes a partir de las cuales se obtienen los

colorantes?4. Mencione tres tipos de colorantes naturales.5. Nombre los colorantes sintéticos de uso frecuente en microbiología.6. Caracterice a los colorantes de acuerdo a su clasificación.7. ¿Cómo tiene lugar la reacción física en el proceso de tinción?8. ¿Cómo tiene lugar las reacciones químicas en el proceso de tinción?9. ¿Cuáles son las ventajas y las desventajas de la toxicidad que ocasionan

los colorantes a los microorganismos?10. ¿En qué consiste el método de coloración simple?11. ¿En qué consiste el método de coloración compuesta?

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12. ¿Cómo se denominan los colorantes empleados en la coloración de Gram?13. ¿Cuál es la función del lugol en la coloración de Gram?14. ¿Cómo reacción las bacterias al ser sometidas a la coloración de Gram

cuando se le adiciona el alcohol?15. De acuerdo al color con que quedan teñidas después de la coloración de

Gram, ¿cómo son clasificadas las bacterias?16. ¿Cómo se denominan los colorantes empleados en la coloración de Ziehl

Neelsen?17. ¿Por qué se debe calentar la fucsina en el proceso de tinción?18. ¿De qué color quedan los B.A.A.R. después de ser sometidas a la colo-

ración de Ziehl Neelsen?19. Describa el procedimiento para la realización de una coloración de Ziehl

Neelsen modificada.20. ¿Con qué objetivo son tratadas con ácido tánico las bacterias, antes de

aplicar una coloración de flagelos?21. ¿Qué requisitos han de tenerse en cuenta para realizar una coloración de

flagelos?22. Describa el procedimiento para la coloración de cápsula.23. ¿Para qué se utiliza la coloración de Dorner?24. ¿Cómo se observan las esporas y las células vegetativas coloreadas con

nigrosina?25. Explique como usted realiza una coloración de gránulos.

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CAPÍTULO 16

MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCIÓN

Los medios de cultivo son compuestos o preparaciones alimenticias elabo-radas en los laboratorios de microbiología con los nutrientes requeridos paracada género en particular, que conjuntamente con las codiciones ambientalesadecuadas propician su desarrollo, constituyendo de hecho el micromundo delos microorganismos en condiciones de laboratorio.

Para que un medio de cultivo resulte eficaz, sus componentes deben res-ponder a las exigencias nutricionales de las especies que se pretenden cultivar.Debido a que existen diferencias en los elementos constitutivos de cada géneroo especie, así como en sus actividades metabólicas y los mecanismos paraobtener los nutrientes, se comprenderá que no haya un medio de cultivo stan-dard que posibilite el desarrollo de todas las especies, existiendo por lo tanto unaamplia variedad.

OBJETIVOS DE LA NUTRICION MICROBIANA

Cuando los microorganismos son colocados en medio de cultivo apropiados,metabolizan los nutrientes para sintetizar macromoléculas que suplan el desgas-te natural de sus estructuras en cuyo proceso se libera energía que es empleadaen el desarrollo de las actividades fisiológicas, tales como respirar, moverse,reproducirse, etc. Así como para controlar el paso de los gradientes químicos através de la actividad osmótica de la membrana celular.

Por lo tanto la nutrición microbiana cumple dos objetivos fundamentales: labiosíntesis para la renovación de los compuestos de su estructura celular y laproducción de energía.

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios e cultivo se clasifican:1. Atendiendo a su composición2. Atendiendo a los objetivos de su empleo.

Atendiendo a su composición, se clasifican a su vez en: simples, sintéticosy vivos.

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Medios simples

En este tipo de medio no es posible conocer la proporción exacta de suscomponentes nutricionales por ser muy variable. Se utilizan en su forma natural,tal y como se encuentran en la naturaleza, siendo prácticamente imposible pre-parar dos lotes idénticos con productos iguales de distinta procedencia. Ejem-plo: la leche, las carnes, la papa, jugos vegetales, etc.

Cuando un medio simple natural sufre algún tipo de modificación, como porejemplo: someter la carne o los vegetales a un proceso de cocción para obtenerun caldo nutritivo, pierde su condición de medio simple natural y se convierte enun medio simple artificial.

Medios sintéticos

A diferencia de los medios simples, los sintéticos están compuestos por unconjunto d nutrientes definidos cuyas proporciones son constantes, lo que per-mite reproducir el mismo medio de cualquier otro lote con exactitud. Se puededecir que son verdaderas fórmulas químicas o recetas de cocina. Cada uno deestos medios responde a las necesidades específicas de grupos microbianosdeterminados.

La literatura informa cada año un número cada vez mayor de medios sinté-ticos recomendados para cultivar todo género de microorganismos, existiendoen la actualidad mas de un centenar de diferentes medios sintéticos, ejemplo:Agar Saboreaud, Agar SS, Kligler, etc. Este tipo de medio se comercializa enforma deshidratada por diferentes empresas cubanas y extranjeras que se dedi-can a la elaboración de medios de cultivo.

Fig. 110: Frasco con medio de cultivo deshidratado.

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Medios vivos

Los medios vivos están constituidos por animales o capas de tejidos que sonutilizados para el cultivo de virus y rickettsias, que no se desarrollan en losmedios simples o sintéticos por requerir de la presencia de células vivas parareproducirse en su interior (parásitos intracelulares obligados). Estos medios notienen utilidad práctica para el cultivo de las bacterias y los hongos. Ejemplos:hámster (curieles jóvenes), ratones blancos lactantes, huevos fértiles de gallinade 7 a 10 días, cultivo de tejidos, etc.

Atendiendo a los objetivos de su empleo

Se clasifican a su vez en: medios de enriquecimiento, medios de aislamien-to, medios selectivos y medios diferenciales.

Medios de enriquecimiento

Son medios generalmente líquidos, que se utilizan con el propósito de favorecerel desarrollo de una especie determinada que por encontrase en pequeñas cantida-des en la muestra, conjuntamente con otras especies que se hayan en mayor pro-porción, se encontrarían en desventaja si la colocamos en un medio de cultivo, dondeambas se puedan desarrollar, ya que las que se encuentran predominando consumi-rían prácticamente casi todos los nutrientes lo que traería como resultado un pobredesarrollo o incluso ningún desarrollo del germen que nos interesa estudiar.

Los medios de enriquecimiento satisfacen los requerimientos nutricionales delgermen objeto de estudio, al mismo tiempo que no favorecen las necesidades esencialesdel resto. Ejemplo: el caldo Selenito utilizado en la investigación del coprocultivo que

Fig. 111: Medios de cultivos vivos: a) Hamster; b) Huevo de gallina con embrión depollo de 7 a 10 dias; c) Cultivo de tejidos

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favorecen el desarrollo de los géneros Salmonella y Shigella, dificultando al mismotiempo el de otras bacterias entéricas predominantes en el bolo fecal.

Medios de aislamiento

Por lo regular resultan específicos para un solo tipo de germen al no poderdesarrollarse en ellos ninguna de las demás especies, por las características delmedio. Ejemplo: el medio "Chapman" denominado también Agar Manitol Sala-do. Este medio se caracteriza porque uno de sus componentes, el CI Na, seencuentra a una elevada concentración, lo que imposibilita el desarrollo de lasespecies bacterianas con excepción de los Estafilococos, que puede desarro-llarse y multiplicarse en este medio salino.

Otro ejemplo lo constituye el medio Agar, verde brillante, que se utiliza parael aislamiento e identificación de la Salmonella sp/ en materiales patológicos. Eneste caso se aprovecha la resistencia de esta especies a ciertos agentes quími-cos, como el colorante verde brillante, que sin embargo, inhibe el crecimiento deotras enterobacterias, especialmente la Escherichia coli, que generalmente seencuentra predominando en las muestras empleadas.

Medios diferenciales

En este tipo de medio de cultivo se pueden desarrollar sin dificultad diferen-tes especies microbianas. Se utiliza para diferenciar la especie desarrollada porlas reacciones bioquímicas que genera su actividad metabólica, lo cual es deter-minado por cambios y reacciones evidentes que de manera específica producecada especie en el medio de cultivo, cuyas diferencias permiten encaminar lainvestigación hacia su identidad. Ejemplo: el medio Kligler, que es utilizado en lainvestigación de las enterobacterias. Después de 14 a 16 horas de incubaciónse puede observar que el medio de cultivo cambia de color, de rojo a amarillo enla parte inferior o en todo el medio, así como la presencia o no de manchas decolor negro o evidencias o no de producción de gas.

Fig. 112: Medio diferencial (Kligler); a) Medio sin sembrar (rojo); b) Cambio de color derojo a amarillo en el fondo del medo; c) Cambio de color de rojo a amarillo en todo elmedio; d) Formación de manchas de color negro desde el medio hacia abajo;e)Manifestación de formación de gas

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CONSISTENCIA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Atendiendo a su consistencia los medios se clasifican en: líquidos semisólidosy sólidos.

La consistencia del medio de cultivo se logra con la adicción a la fórmula,de un compuesto denominado AGAR.

El agar en malayo significa jalea. Es una sustancia mucilaginosa que seobtiene de algas de color purpúreo. Perteneciente al grupo Agarofíto que com-prende los géneros: Gellidium, Pteroclaida, Gracilaria, y Acanthopeltis, que pro-liferan principalmente a lo largo de las costas de Japón, China, Ceilán, Malasiay California meridional.

Las paredes de la planta posee una capa interna, de celulosa y otra máseterna de sustancias pécticas. Para la producción de agar se extraen las capaspécticas ricas en agarosa y agaropectina, para ser procesadas industrialmente,siendo comercializado en forma deshidratada.

Bioquímicamente se trata de un éster sulfúrico de una molécula linealgaláctano que es insoluble en agua fría pero soluble en agua caliente.

Una solución de 1,5 % de agar forma un gel firme entre 32 y 390 C que nose funde por debajo de 850 C.

Como lo atacan muy pocas bacterias se emplea básicamente comosolidificante.

Medios líquidos

Los medios líquidos no contienen agar, siendo trabajados en forma decaldo. Los microorganismos desarrollados en medios líquidos, se mueven conlibertad y su desarrollo provoca la formación de un enturbamiento difuso osedimento visible. Ejemplo: Caldo Selenito, agua, peptonada Alcalina, caldolactosado, etc.

Fig. 113: Diferentes formas de crecimiento en medios de cultivo líquidos.

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Medios semisólidos

Estos medios contienen un % de agar menor que el empleado para losmedios sólidos, lo que facilita una mayor migración de sustancias y la movilidadde los gérmenes. Ejemplo: medio de "Cary - Blair" y agar semisólido paramotilidad.

Medios sólidos

Son medios de cultivo que contienen en su composición alrededor de 1,5 %de agar, cantidad suficiente para la gelificación del medio. La solidez proporcio-nada por el agar impide a los microorganismos su migración en el cultivo por loque se multiplican en un mismo sitio dando lugar a un cúmulo de millones dedescendientes que forman sobre el cultivo estructuras macroscópicas denomi-nadas colonias de diferentes formas, aspectos y tamaños. Cada género y espe-cie producirá un tipo de colonia con caracteres culturales diferentes, quepermitirán al investigador orientarse hacia la identificación ulterior de la espe-cie. Teóricamente cada colonia se genera a partir una o varias bacterias de lamisma especie, aunque ocasionalmente pueden desarrollarse a partir de dosespecies distintas, lo que da lugar a la formación de colonias atípicas. Ejemplo:Agar Saboreaud Dextrosa, Agar Violeta Rojo Bilis, Agar Sangre, etc.

De lo anterior expuesto se deduce que la cantidad de Agar añadida al mediode cultivo será directamente proporcional al grado de solidez que adquiera elmedio.

COMPUESTOS NUTRITIVOS BASICOS

Como fue explicado anteriormente, uno de los objetivos de la nutriciónmicrobiana es la biosíntesis, mediante la cual el microorganismo degrada los

Fig. 114: Medio de cultivo sólido distribuidos en placas de Petra: a) Medio sin sembrar;b)Medio sembrado; c)Después de 24 horas de incubación (presencia de colonias).

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nutrientes presentes en el medio de cultivo y posteriormente lo sintetizan en elinterior de la célula, transformándolos en los diferentes compuestos que confor-man su estructura, por lo tanto los ingredientes con que se elabora un medio decultivo deben responder a las necesidades específicas de la especie que desea-mos que se desarrolle en él. Veamos el siguiente ejemplo, donde se indicanpormenorizadamente los componentes químicos de las diferentes estructurasde la Escherichia coli:

Cuadro 10. Componentes químicos de las diferentes estructuras de laE. coli.

ELEMENTOS % PESO SECO ELEMENTOS % PESO SECO

Carbono 50 Sodio 1Oxigeno 20 Calcio 0,5Nitrógeno 14 Magnesio 0,5Hidrógeno 8 Cloro 0,5Fósforo 3 Hierro 0,2Azufre 1 otros 0,3Potasio 1

Por lo tanto si pretendemos que se desarrolle una Escherichia coli, los com-puestos empleados en la preparación del medio de cultivo deben aportar todos ycada uno de esos elementos.

A continuación haremos referencia a las distintas fuentes a partir de lascuales se pueden elaborar los medios de cultivos, con los componentes queaporten a la nutrición los elementos químicos de referencia:

Fuente de oxigeno e hidrógeno

El solvente de todos los medios de cultivo es el agua, siendo por lo tanto laprincipal fuente de obtención, por parte de la bacteria de oxigeno y nitrógenomediante su ionización y en menor grado a través de la actividad catabólica quedesarrollan sobre los compuestos orgánicos, como las proteínas, los lípidos y loscarbohidratos, que en el proceso de degradación liberan en alguna proporciónestos elementos. Algunas bacterias utilizan el oxígeno y el hidrógeno que for-man parte de la composición de aire.

Fuente de carbono

Las formas aprovechables van desde el CO2 atmosférico altamente oxida-do hasta complejas formas orgánicas.

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Para los microorganismos fotosintéticos y litotróficos, el CO2 es la únicafuente de carbono. Otros microorganismos (heterótrofos) emplean fuentes or-gánicas como las proteínas, carbohidratos y lípidos, así como productos deriva-dos de estos compuestos como aminoácidos, ácido cítrico o glicerina, para obtenerel carbono que los provea de energía.

La mayor proporción del carbono presente en el sustrato orgánico entra enla vía metabólica para producir energía y se excreta como CO2, el cual esempleado para la carboxilación del fosfornolpivurato para formar intermedia-rios biosintéticos como el carbamilfósfato como precursor de arginina, pirimidinasy para la síntesis de anillos purínicos.

Especies del género Pseudomonas, utilizan alrededor de 90 compuestosorgánicos diferentes como fuente de carbono y energía.

Fuente de nitrógeno

Es obtenido por los microorganismos de las proteínas y sus derivados, talescomo: peptonas, urea o compuestos amoniacales así como a partir de fuentesinorgánicas como el nitrato, el cual es utilizado por la mayoría de losmicroorganismos fotosintéticos. Algunos géneros son incapaces de reducir losnitratos, por lo que deben obtener el nitrógeno a partir de las sales de amonioque se adicionan al medio de cultivo.

Hay bacterias que fijan el nitrógeno mediante su reducción preliminar aamoniaco, en tanto que otras, mas exigentes, requieren de la presencia de pro-teínas, tales como: carnes, leche, huevo etc. O en forma de peptonas un produc-to intermedio del metabolismo de las proteínas, transformándolas por hidrólisisen aminoácidos.

Independientemente de, la fuente de obtención para ser asimilados por labacteria, el nitrógeno debe estar en forma de amonio, es decir, si está en formade N2, NO3 o nitrógeno orgánico debe ser transformado extracorporeamenteen amonio para poder ser incorporado a la célula bacteriana.

Fuente de iones inorgánicos

Son obtenidos por los microorganismos de la materia orgánica que se en-cuentra formando parte de la composición del medio de cultivo, ejemplo: elazufre lo obtienen de los grupos, sulfhídricos de las proteínas, específicamentedel aminoácido, cisteína y del fósforo que está presente en los ácidos nucleicosy los nucleóticos. Estos dos elementos y otros como: hierro, magnesio, potasio,cinc y cobalto, son suministrados a los microorganismos, en la composición delmedio de cultivo, en forma de sales minerales, ya sea como cloruros, sulfatos ofosfatos, ejemplo: cloruro de calcio, sulfato de cobre, fosfato de magnesio, etc.

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Cuadro 11: función de los elementos químicos en la nutrición microbiana

FUNCIONES ESPECÍFICAS DE CADA ELEMENTO

ELEMENTOS FUNCION FISIOLOGICA (ACTUA COMO...)

OXIGENO - constituyente del agua celular y de transporte- constituyente de los compuestos celulares orgánicos- Como aceptor de electrones en la respiración aerobia.

HIDROGENO - Constituyentes del agua celular y de transporte, así como de materias orgánicas celulares. Los m.o. fotosintéticos, lo usan como fuente de elec- trones en forma de donadores de hidrógeno.- Como aceptor de hidrógeno en las reacciones REDOX

CARBONO - Constituyentes de materiales celulares orgánicos.- Constituyentes de intermediarios biosintéticos y precursores.

NITROGENO - Constituyentes en la síntesis las proteínas, ácidos nucleicos y co- encimas formadas por la célula bacteriana.

AZUFRE - Constituyentes de algunos aminoácidos, como la metionina, y la cisteína derivados del metabolismo de las proteínas.- Componente de algunas coenzimas como Co A y otros.

FOSFORO - Constituyentes de ácidos nucleicos, coenzimas, fosfolípidos y ATP.- Sustancia tampón para mantener el pH del medio en un rango de 4,5 a 8.

POTASIO - Catión celular, cofactor de algunas enzimas.- Participante en la permeabilidad celular.

MAGNESIO - Catión celular, cofactor inorgánico para reacciones inorgánicas, incluyendo aquellas con ATP.- Participante en la unión enzima - sustrato.- Constituyente de la clorofila.

CALCIO - Catión celular, cofactor de algunas enzimas, Ej. Proteínasas.- Excretor de las enzimas.- Los gramnegativos lo utilizan para la síntesis de la pared celular.- Componente principal de las esporas.

MANGANESO - Cofactor inorgánico de varias enzimas, a veces remplazando el magnesio.HIERRO - Constituyentes de los citocromos (imprescindible en la respiración

celular).- Como parte de las hemoproteinas.- Como cofactor de varias enzimas.

COBALTO - Constituyente de la vitamina B12 y sus coenzimas derivadas.COBRE / ZINC - Constituyentes inorgánicos de determinadas enzimas.MOLIBDENO - Constituyentes inorgánicos de enzimas especiales.

- Útil en la fijación de nitrógeno y en la reducción de nitratos.MAGNESIO - Activador de determinadas enzimas.

- Regulador del grado de asociación de las partículas ribosómicas.SODIO / CLORO - Estabilizador osmótico.

- Participa en la permeabilidad celular.

216

ELABORACION DE MEDIOS DE CULTIVO

Elaborar un medio de cultivo es un procedimiento relativamente fácil, perosu calidad dependerá esencialmente del cumplimiento estricto de los pasos es-tablecidos, atendiendo a las particularidades del medio de cultivo en cuestión.La premura, así como obviar determinados requisitos pre establecidos son cau-sas frecuentes de su mala elaboración, con todos los efectos negativos que esoentraña, no solo desde el punto de vista económico, teniendo en cuenta que lamayoría de los medios son de importación, sino por lo que resulta mas importan-te, los errores en el diagnóstico de laboratorio ocasionado por el empleo demedios deficitarios que menoscaban la fiabilidad de la institución, por ocasionardemoras evitables en el tratamiento del paciente.

Como ya se explicó, existen centenares de medios de cultivo diferentes,cada uno de los cuáles, formado por diversos compuestos en proporciones fijasque constituyen su fórmula particular.

La variabilidad de los medios responde a los requerimientos nutricionales delos distintos grupos microbianos, por lo que la elección de un determinado mediode cultivo estará en correspondencia con el microorganismo que presuntivamenteesperamos que se desarrolle durante la investigación al respecto, que realice-mos en el laboratorio.

Un medio de cultivo, se puede elaborar a partir de los componentes que seindican en la fórmula o empleando medios comerciales deshidratados.

Elaboración a partir de sus componentes

1. Localizar en el formulario existente en el laboratorio, la fórmula del me-dio que se desea preparar (generalmente indicada para un litro).

2. Seleccionar de los estantes cada uno de los componentes del medioserciorandose de que no hayan sobrepasado la fecha de caducidad y quese observen en buen estado sin cambios organolepticos ostensibles como:resequedad, hidratación, precipitación, cambio de color, etc.

3. Con rigurosa precisión, pese por separado cada uno de los productossólidos, a emplear en una balanza adecuada, teniendo especial cuidadoen desestimar el peso de "tara".

4. Mida con precisión cada uno de los productos líquidos a los volúmenesexactos que se indican en la fórmula.

5. Mida en una probeta graduada el agua destilada a emplear, la cual debetener un pH y conductividad adecuada.

6. Vierta en una cristalería (erlenmeyer, matraz, etc.) de tamaño suficiente aproxi-madamente a las ¾ partes del volumen de agua contenido en la probeta. Yproceda a colocarla sobre una fuente de calor con el objetivo de tibiar el agua.

217

7. Retire la cristalería de la fuente de calor una vez que el agua esté tibia ycolóquela sobre la mesa de trabajo

8. Proceda a adicionar en el agua tibia los compuestos pesados y medidospreviamente, en el orden que se establece en la fórmula, dándole en cadaocasión un movimiento de rotación al frasco para que los ingredientes semezclen.

9. Si quedara algún residuo, en la cristalería donde fue pesado (Ej. Cápsulade porcelana, vidrio reloj, etc.) o medido, se enjuagará con parte del volu-men de agua que queda en la probeta, procediendo a continuación a ver-terlo en el resto del medio para que la proporción estipulada en la formulano se altere.

10.Adicionar el agua que pudiera quedar en la probeta para completar elvolumen de medio previsto.

11. Si se observa que los componentes no quedan disueltos, someter el medionuevamente a la acción del calor, por unos minutos imprimiendo intermi-tentemente movimiento de rotación al frasco. Para determinar que elmedio se ha diluido, observe las paredes del recipiente durante su agita-ción, mientras presenta gránulos es evidente que aún no se ha disuelto.

Elaboración a partir de medios comerciales deshidratados

En la actualidad diversas empresas dedicadas a la fabricación de medios decultivo, lo comercializan en forma deshidratada (pulverizados) que contienen latotalidad de los ingredientes, con lo que se evita el tener que pesar o medirpreviamente cada uno de sus componentes.

Estos medios se expenden en frascos de tamaño variable con tapa de roscahermética estando provistos de una etiqueta en la que se encuentran impresoslos siguientes datos:

1. El nombre del medio de cultivo. Ejemplo: "Agar Saboreaud Dextrosa","Kligler", "Mac Conkey" "S.S." etc.

2. La fórmula del medio de cultivo, donde se relaciona cada uno de suscomponentes y las proporciones respectivas.

3. El pH a que debe ajustarse e medio después de hidratado y antes de suesterilización.

4. Las instrucciones para hidratar el medio donde se precisa la cantidad demedios deshidratados que debe pesarse para preparar un litro. En elcaso que no se requiera preparar ese volumen se harán los cálculospertinentes.

5. Coloque sobre el plato de una balanza granataria una cápsula de porce-lana o un vidrio reloj limpio y proceda a determinar su peso (tara)

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6. Sume el peso de la "tara" y el de cantidad de medio de cultivo a pesar ymueva las pesas hasta que indiquen en la barra el peso total.

7. Con el empleo de un depresor o cuchara plástica extraiga del frasco elmedio de cultivo deshidratado y deposítelo en el recipiente que se en-cuentra en el plato de la balanza hasta que la punta de la barra coincidacon el "fiel".

8. Mida en una probeta graduada el volumen de agua destilada a emplear yvierta aproximadamente las ¾ partes d ese volumen en un erlenmayer omatraz de tamaño suficiente.

9. Coloque el recipiente sobre una fuente de calor durante dos o tres minu-tos para que el agua se tibie.

10. Baje el recipiente de la fuente d calor y proceda a verter en su interior,con sumo cuidado, el medio deshidratado ya pesado que se encuentra enla cápsula d porcelana o vidrio reloj, con ayuda de un depresor plástico.

11. Deposite un poco del agua destilada que quedó en la probeta en el interiorde la cápsula de porcelana. Revuelva con el depresor plástico e incorpo-ra este residuo en el erenmeyer que contiene el medio , añadiendo elresto del agua que pudiera quedar en la probeta para completar el volu-men total previsto.

12. Coloque nuevamente el recipiente sobre la fuente de calor, imprimiéndolemovimientos de rotación cada 30 ó 40 segundos hasta observar que enlas paredes de la cristalería no se detecta la presencia de granulacioneslo cual será sugerente de que el medio no se ha diluido adecuadamente.Debe evitarse el recalentamiento excesivo que provocaría lacaramelización de los azúcares y el deterioro de otros compuestos nutri-tivos básicos.

Fig. 115 : Datos que se encuentran en la etiqueta de los frascos de medios de cultivo.

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Determinación del pH del medio

Una vez que el medio ha sido diluido o fundido se extrae con pipeta unaalicuota y se deposita en un tubo de ensayo que será utilizada como muestrarepresentativa de todo el volumen de medio para determinar su pH, para lo cual,se utiliza tiras de papel tornasol o mediante el empleo del pHmetro.

Para determinar el pH con tira de tornasol se cortan 4 ó 5 cm de la cinta dpapel del carrete y se introduce una de las puntas en el medio de cultivo por 4 ó5 segundos. Al extraer la tira se compara el color que ha tomado la puntadespués de contactar el medio con la escala que tiene por sus laterales el carre-te cuyos colores se corresponde con pH diferentes. Si se desea una mayorprecisión se empleará el pH metro (ver capitulo 9).

Ajuste de pH

En el caso de que el pH medido no se corresponda con el indicado en lafórmula del medio de cultivo deberá ser ajustado para lo cual se emplean solu-ciones patrones con diferentes niveles de concentración, las utilizadas para aci-dificar el medio y bajar el pH son generalmente HCL o H2SOA y las utilizadaspara alcalinizar el cultivo y subir el pH son NaOH o KOH. Tanto las solucionesácidas como las alcalinas se emplean a concentraciones 5N, 1N y 0, 1N.

Para ajustar el pH se utiliza la alicuota empleada para medirlo, a la cual sele adiciona cuidadosamente gota a gota, la disolución ácida o alcalina segúncorresponda hasta obtener el pH deseado, conociendo el volumen de la soluciónpatrón empleada para ajustar el pH de la alicuota se procede a hacer los cálcu-los pertinentes para determinar la cantidad requerida para todo el volumen delmedio de cultivo.

Distribución de los medios de cultivo

El medio de cultivo que vaya a ser trabajado en tubos de ensayo se distri-buye en los mismos con pipeta, un volumen determinado, antes de su esteriliza-ción, mientras que el medio que vaya a ser distribuido en placas de "Petry", seesteriliza en un erlenmeyer taponeado con algodón y retapado con una capuchade papel de estraza, siendo distribuido en las placas con posteridad a su esteri-lización, después que la temperatura del medio haya descendido de 50 a 55 C,para evitar que el exceso de calor produzca agua de condensación que se ad-hiera, en el reverso de la placa.

Al depositar el medio en las placas la altura del volumen no debe sobrepa-sar los 3 ó 4 mm. Cuando el medio se haya solidificado, la caja que lo contienese coloca boca abajo sobre el borde de la tapa hasta que se refresque, en que se

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tapa para ser guardado en el refrigerador, sin la presencia en el interior de latapa de agua de condensación.

Si el medio es distribuido en tubos con tapas de rosca, estas deben quedarflojas durante la esterilización, para permitir el flujo de aire, debiendo ser apre-tadas al concluir la esterilización.

Cuando las instrucciones indiquen la adición d un reactivo o compuestoestéril, en el medio después de autoclaveado, se debe realizar esta operacióncon sumo cuidado, observando minuciosamente todas las precauciones de asepsia,por ejemplo en la preparación del medio de cultivo denominado "Agar Sangre",se debe esperar a que la temperatura del medio descienda entre 45 a 50 C, paraadicionar el volumen de sangre lo cual requiere que sea vertida poco a poco,imprimiéndole simultáneamente movimientos de rotación al frasco para asegu-rar una aereación adecuada de la sangre.

Observaciones

1.Algunos medios de cultivos elaborados básicamente con hidratos decarbono, como el "Dulcitol" 10 %, así como otros medios elaborados consueros no deben ser sometidos a la esterilización en autoclave pues sedeterioran, en estos casos se emplea la Tindalización.

2.Evitar refundir los medios de cultivo pues en la medida en que esto ocu-rre, se hacen mas propensos a la precipitación y sufren una disminuciónen su potencial nutricional.

Cuñas de medios agaranizados

Los medios de cultivo agaranizados (que contienen Agar) distribuidos entubos generalmente se utilizan en forma de cuña. Para lograr que estos mediosadopten esa forma deben ser colocados oblicuamente sobre la mesa de trabajoestando aún fundidos para que cuando solidifiquen, al bajar la temperatura,mantengan esa forma, aunque el tubo se coloque en posición vertical.

De acuerdo al medio de que se trate la inclinación será mas o menos acen-tuada en interés de los objetivos que se persiguen con los cultivos que se desa-

Fig. 116: Manera de colocar la placa, una vez que el medio se ha solidificado hasta quese enfríe, para que no se acumule en su reverso agua de condensación.

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rrollen en los mismos. Por ejemplo, en el caso del medio "Kligler" la inclinaciónes menos acentuada para propiciar que el fondo del tubo quede lleno de mediode cultivo a una altura aproximada de 2 cm de altura, quedando en su superficieuna cuña de menos de 2cm. Si se tratara el medio "Citrato de Simmons", lainclinación debe ser mas acentuada, ya que el objetivo del empleo de este medioes que se produzca el desarrollo bacteriano en toda la superficie de la cuña(slam) por lo tanto al no ser de interés que quede un fondo como en el medio"Kligler", prácticamente toda la superficie será de slam.

Conservación de medios de cultivo comerciales

Los frascos con medios de cultivos nuevos, deben ser ordenados en losestantes por lotes y fecha de vencimiento.

Una vez abierto el frasco se debe escribir en la etiqueta, la fecha en queocurrió su apertura para que sea de conocimiento de otros que ese frasco estáen uso.

Deben ser almacenados en lugares frescos y lejos de aparatos térmicos yde ventanas.

Conservación de medios elaborados

Alcanzada la temperatura ambiente después de esterilizados,l os mediosserán conservados de diferentes maneras atendiendo al medio de que se trate.Por ejemplo:

1. Saboreaud, Agar semisólido para motilidad, tioglicolato, etc. Serán coloca-dos en gradillas y mantenidos hasta su empleo a temperatura ambiente.

2.Los medios distribuidos en placas de "Petry" serán colocados en las pa-rrillas del refrigerador boca abajo tan pronto se hayan solificado.

Fig. 117: Cuñas de medios agarinizados en tubos de ensayo: a) Kligler; b) Citrato deSimmons

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3.Los que contienen colorantes o indicadores se deben proteger de la luzdurante su almacenamiento.

4.Los que tienen propiedades REDOX, como por ejemplo "selenito" sedeben conservar en las parrillas del refrigerador.

5.Los medios como el "Lowestein - Jensen, se almacenarán en refrigera-ción para prolongar su tiempo de duración.

Comprobación de la esterilidad de los medios elaborados

De cada medio de cultivo preparado y almacenado se seleccionan dos otres placas o tubos y se colocan en la incubadora durante 24 a 48 horas paracomprobar su esterilidad.

Empleo de los medios

Los medios preparados que han estado conservados en refrigeración, de-ben extraerse varias horas antes e incubarlos durante 30 minutos, antes de suempleo. Cuando se obvia este paso se puede demorar la iniciación del creci-miento al ser colocado el inóculo en una superficie fría.

Observación

El agua de condensación y la opacidad que se produce en algunos mediosconservados en tubos, al sacarlo de su almacén frío y colocarlo a una tempera-tura ambiente, facilita su contaminación.

No se deben preparar medios de cultivo en exceso, ya que si están muchotiempo en almacenamiento se pueden resecar de manera imperceptible y oca-sionar reacciones inexactas y fallas en el crecimiento.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué usted entiende por medio de cultivo?2. Cuales son los objetivos de la nutrición microbiana?3. ¿Cómo se clasifican los medios de cultivo atendiendo a su composición?4. ¿Que es un medio artificial?5. ¿Cómo se denominan los medios de cultivo que están constituidos por

una variedad de ingrediente fijos con gramaje y volumen predetermina-dos?

6. ¿Cómo se clasifican los medios de cultivo atendiendo a los objetivos desu empleo?

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7. ¿Qué información aportan los medios diferenciales?8. ¿Cómo se denomina el producto que se añade a los medios de cultivo

para sodificarlos?9. ¿Cuales son los compuestos nutritivos básicos?10. A partir de que fuentes, las bacterias obtienen el oxigeno y el nitrógeno.11. ¿Que compuestos podemos incorporar al medio de cultivo que le sirva a

la bacteria como fuente de nitrógeno?12. ¿Que compuesto nutritivo aporta el carbono que le sirve a la bacteria

para obtener energía?13. ¿Que aporta a la nutrición bacteriana el magnesio y el calcio.14. Explique como usted realiza la pesada de un medio de cultivo deshidratado.15. Describa como se hidrata el medio de cultivo una vez pesado.16. ¿De cuantas maneras se puede ajustar el pH del medio de cultivo?17. ¿Cómo se distribuye el medio de cultivo antes de su esterilización?18. Explique como se preparan las cuñas en tubo de medios de cultivo sóli-

dos.19. ¿Como se conservan los diferentes medios una vez elaborados?20. ¿Cómo se comprueba la esterilidad de los medios de cultivo recién elabo-

rados?21. ¿Que proceder debe seguirse cuando se va a realizar la siembra en un

medio que está conservado en refrigeración?

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CAPÍTULO 17

SIEMBRA E INCUBACIÓN

INTRODUCCIÓN

La siembra microbiológica es un procedimiento técnico que consiste encolocar una pequeña fracción o volumen de la muestra, sobre o dentro, de unoo varios medios de cultivo que contengan los nutrientes necesarios par las espe-cias que presuntivamente contiene, con la finalidad de que puedan desarrollarseadecuadamente, para factibilizar su estudio y posterior identificación. El núme-ro de células microbianas que se encuentran en el volumen o fracción sembradase denomina inóculo.

Este tipo de siembra, guarda estrecha relación con la siembra agrícola con-vencional, donde la semilla es equivalente a la bacteria y el terreno fértil almedio de cultivo, ; de la misma manera, los aperos de labranza, tales como laguataca, el azadón, etc, son sustituidos por los instrumentos de siembras, talescomo: el asa, la aguja de platino, etc.

Para comprender debidamente esta analogía, analicemos el siguiente ejem-plo: Si sembramos una semilla de naranja en un terreno fértil, al transcurrir unperíodo de tiempo determinado, veremos que emerge de ésta una pequeñapostura, la que posteriormente se desarrollará hasta convertirse en un árbol conlas características de esa especie de naranja el cual fructificará, en decenas ocientos de naranjas, portadoras del mismo tipo de semilla que las generó. Sisustituimos la semilla de naranja, por una especie bacteriana y la sembramos enun medio de cultivo apropiado, podremos observar un proceso similar, aunquemás dinámico, ya que al transcurrir solamente algunas horas, la bacteria co-menzará a multiplicarse, hasta alcanzar una cifra exorbitante de descendientesque puede calcularse por millones. Este agregado de bacterias se denominacolonia, y llega alcanzar tal magnitud que se hace visible microscópicamente alobservador. Todo lo cual será equivalente a la obtención de un árbol frondoso,sin las características físicas de éste, aunque si, colmado de millones de bacte-rias de la misma especie.

INSTRUMENTOS DE SIEMBRA

Los instrumentos de siembra son los objetos empleados para tomar el volu-men o fracción de la muestra y sembrarla en el medio de cultivo.

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Diferentes tipos

1. La aguja.Consiste en un fino alambre recto, de platino o nicrón, que tiene aproximada-mente una longitud de 7cm, el cual se encuentra insertado por uno de susextremos a un cabo metálico, el cual sirve para que el manipulador puedatomar en su mano este instrumento de siembra.Tanto el platino como el nicrón tienen la propiedad de calentarse rápidamentey ponerse a al rojo vivo, cuando son expuestos directamente la llama delmechero y de enfriarse a los pocos segundos, después de haber sido retira-dos de esa fuente de calor. Esta característica se aprovecha en el trabajodiario del laboratorio, para esterilizar en pocos segundos este instrumento encada ocasión en que se requiera su uso.

2. El asa.Es similar en todos los aspectos a la aguja, con la diferencia de que el extre-mo terminal del alambre de platino o nicrón, en lugar de ser recto, forma unpequeño círculo en el extremo con un diámetro de 4 a 5 mm. El método deesterilización es igual al empleado para la aguja.

3. Espátula de Drigalski.La espátula de Drigalski puede ser metálica o de vidrio fusible. Al igual que laaguja y el asa, cuando son metálicas, consisten en un alambre de platino o denicrón, insertado a un cabo metálico, pero con la particularidad de que elextremo terminal tiene la forma de un triángulo. Se esteriliza a la llama delmechero de igual manera que la aguja y el asa.Las de vidrio fusible, consisten en un tubo fino de varios mm de diámetro porunos 12cm de largo, el cual está doblado por uno de sus extremos en forma

Fig. 118: Instrumentos de siembra: a) Asa de platino; b) Aguja de platino; c) Espátula deDrigalski; d) Pipeta; e) Hisopo

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de un triángulo equilátero, que mide unos 2 cm por cada uno de sus lados.Para su esterilización la parte triangular de la espátula se introduce en unrecipiente que contenga alcohol y de inmediato se aproxima a la llama parque se encienda y flamee el triángulo de la espátula. Cuando la llama seapague, se debe esperar unos segundos para que se enfríe y en esas condi-ciones utilizarlas en la realización de la siembra.

4. Pipeta.Las pipetas utilizadas como instrumentos de siembra, deben ser previamenteesterilizadas en autoclave y estar provistas de un bulbo de caucho, por suparte posterior, similar las empleadas en los goteros. Las más utilizadas en eltrabajo ordinario son: las de "Pasteur", que se elaboran con cristal fusiblecareciendo de escala graduada y las de 0,2 mL, graduadas en centésimas ymilésimas de mL.

5. Hisopos.Consiste en un fino aplicador, generalmente de madera, con una pequeñamota de algodón adherida en uno de sus extremos.. los hisopos, una vezconfeccionados, deben ser colocados en el interior de tubos de ensayo detamaño apropiado, taponeados y retapados antes de proceder a su esteriliza-ción en autoclave. Cuando se emplean para tomar las muestras, casi siemprese utilizan a continuación para realizar la siembra en el medio del cultivo.

MÉTODOS DE SIEMBRA

El método de siembra a emplear dependerá de los objetivos que se preten-dan alcanzar con el cultivo, ya que en ocasiones se requiere que el desarrollo delmicroorganismo se produzca de forma masiva, mientras que en otras resultaindispensables que las colonias queden aisladas o que las manifestaciones delmetabolismo tengan lugar con tensiones reducidas o privadas de oxígeno, losmétodos de siembra más empleados son los siguientes:

1. Siembra por estrías.2. Siembra por punción.3. Siembra volumétrica.4. Siembra masiva.

Siempre que se utilicen instrumentos de siembra de platino o nicrón, debenser calentados en la llama del mechero hasta el rojo vivo, antes y después derealizar la siembra, con el objetivo de destruir a los microorganismos contami-nantes de la superficie del instrumento.

Con independencia del tipo de medio y el método de siembra a emplearésta debe realizarse en las proximidades de la llama del mechero y a que el

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calor emanado reduce el número de microorganismos presentes en sus inme-diaciones, lo cual es utilizado como un recurso a favor del proceder aséptico.

Siembra por estrías

Este método de siembra se realiza sobre la superficie de los medios decultivo sólidos distribuidos en placas de "Petry" o en tubos de ensayo solidificadosen forma de cuña.(Slam)

Instrumentos de siembra a emplear.

Para la siembra por estría se utiliza el asa de platino o el hisopo. En algunasocasiones, como explicaremos más adelante, se utilizan ambos instrumentos enla misma siembra.

Procedimientos

Cuando se utilice exclusivamente el asa de platino o nicrón.

1.Coger el asa por el cabo, en forma similar, a cuando tomamos el lápiz paraescribir.

2. Introduzca el asa de alambre de platino o nicrón directamente en la zona decolor azul de la llama del mechero, hasta que se ponga al rojo vivo. Seguida-mente, proceda a introducir lentamente el resto del alambre para lograr elmismo efecto.

3. Retire el instrumento de la llama y espere de 4 a 5 segundos con el objetivo deque el asa se enfríe.

4. Con el asa estéril y fría tome el volumen o fragmento de la muestra que serásembrado y trasládelo de inmediato para el medio del cultivo seleccionado.

5. Si la siembra se fuera a producir en un medio solidificado en forma de cuñaen tubo de ensayo, proceda del siguiente modo:a) Con la mano opuesta a la que sujeta el asa, tome el tubo por l porción

inferior.b) Con el dedo meñique de la mano que sostiene el asa, retire del tubo el

tapón de algodón o la tapa de rosca y reténgala(no colocar el tapón o latapa sobre la mesa de trabajo)

c) Flamee de inmediato la boca del tubo de ensayo, pasándola una o dosveces por la llama del mechero, con el objetivo de eliminar por incinera-ción, los microorganismos contaminantes que se encuentran en esa zona,por la parte externa del tubo. Esta acción calórica, provoca además unaconvección del movimiento del oxígeno presente en el interior del tubohacia afuera, debido a la desigualdad de calor, lo cual favorece que de-crezca el riesgo de contaminación.

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d) Introduzca el asa con el volumen o fracción de la muestra en el tubo, hastael fondo de la cuña. A partir de este momento, la siembra puede realizar-se de diferentes maneras, en dependencia del tipo de microorganismoque pretendemos que se desarrolle en ese medio de cultivo:

- Deslizando el asa, desde el fondo hacia arriba, por toda la superficie de lacuña, trazando una línea longitudinal.

- Deslizando el asa por la superficie de la cuña desde el fondo hacia arriba,imprimiéndole un movimiento de zigzag.

- Motiando toda la superficie de la cuña con hisopo.- Efectuando cualquiera de las tres variantes explicadas pero adicionalmente

roturando el medio con el asa, haciendo un pequeño corte longitudinal.- Al concluir la siembra se flamea la boca y se taponea nuevamente el

tubo procediendo a esterilizar el asa en las llama del mechero.

Fig. 119: Siembra microbiológica en medios de cultivos distribuidos en tubos de ensa-yo: 1) y 2) Retirar el tapón del tubo; 3) Flamear la boca del tubo; 4) Introducir elinstrumento de siembra con la muestra y realizar la siembra; 5) Retirar el instrumentoy flamear nuevamente la boca del tubo; 6) Taponar el tubo.

Fig. 120: Siembra en medios sólidos en cuñas (tubos de ensayo): a) Trazando una líneaperpendicular desde el fondo hacia arriba; b) Deslizando el instrumento con el inóculode abajo hacia arriba en forma de zigzag; c) Roturando el medio

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Si la siembra se fuera a realizar en la superficie de un medio solidificado enplaca de Petry, proceda de la siguiente manera:

a) Con la mano opuesta a la que sujeta el asa de platino, tome la placa dePetry, de manera que la tapa quede hacia arriba. Con ayuda del dedopulgar abra parcialmente la placa.

b) Introduzca el asa con la muestra y proceda a deslizarla suavemente enforma de zigzag, desde la pared, hasta cubrir aproximadamente un terciode toda la superficie.

c) Cierre la placa y gírela varios cm, en contra de las manecillas del reloj,procediendo a abrirla nuevamente por igual procedimiento.

d) Introduzca nuevamente el asa y haga un segmento similar al anterior, demanera que las bacterias sembradas en el primer segmento sean removi-das para el segundo.

e) Repita esta operación una o dos veces más.

Fig. 121: Apertura manual de la placa de Petra con medio de cultivo.

Fig. 122 : Método de siembra por estrias en medios de cultivo sólidos distribuidos Enplacas de Petra

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f) Finalmente cierre la placa y colóquela sobre la mesa de trabajo bocaabajo.

g) Esterilice el asa de platino a la llama del mechero, en la forma explicadaantes de dejarla en el puesto de trabajo.

Cuando la muestra es tomada con hisopo.

1. Si la siembra se va a producir en una cuña de agar, se procede en formasimilar que la siembra con asa en este tipo de medio de cultivo.

2. Si la siembra se fuera a producir en medios sólidos en placas, el primersegmento se hace con el mismo hisopo con que se tomó la muestra y losrestantes se realizan con asa estéril, para lograr una diseminación poragotamiento, que posibilite el desarrollo aislado en los últimos segmentosdel microorganismo en estudio. Otra variante es la diseminación cruza-da, en este caso, en lugar de hacer un primer segmento en zig zig con elhisopo, se procede a trazar en el centro de la plaza una letra "Z" y acontinuación con el asa esteril se procede a deslizarse con un movimien-to ondulatorio sobre la "Z".

Siembra por punción

Como es obvio, el instrumento de siembra a emplear será la aguja deplatino y el medio de cultivo sólido, generalmente, en tubo de ensayo. Lasmanipulaciones y la observancia de las precauciones de asepsia, son simila-res que cuando se utiliza el asa. La particularidad que tiene este método, esque la aguja (con el inoculo) debe atravesar perpendicularmente el medio decultivo.

Fig. 123: Siembra por diseminación cruzada: a) Trazar con el hisopo que contiene elinóculo una "Z"en la superficie del medio; b) Completar la siembra con un asa deplatino estéril, imprimiendo movimientos ondulatorios sobre la "Z"

231

Siembra volumétrica

Este método de siembra consiste en sembrar una muestra liquida cuyo volumenno puede ser predeterminado, en medio de cultivo sólidos o líquidos. Por ejemplo: Enlas muestras de exudado vaginal tomadas con pipetas de Pasteur, no puede determi-narse el volumen, ya que este tipo de pipeta carece de escala de graduación, sinembargo, la orina empleadas en el urocultivo o la sangre para el hemocultivo se puededeterminar con pipeta o jeringuilla respectivamente el volumen que será sembrado.

Siembra masiva

Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar la espátulade Driglaski. En este caso la gota de muestra liquida se esparce con la espátulapor toda la superficie del medio de cultivo sólido imprimiéndo un movimiento enespiral. La siembra masiva también se puede realizar con un hisopo gruesoembebido de un cultivo liquido, procediendo a su deslizamiento sobre toda lasuperficie de una placa de agar.

INCUBACIÓN

Una vez realizada la siembra, atendiendo a los requerimientos de los géne-ros o especies que presuntivamente se encuentran en la muestra, se debe pro-porcionar a los cultivos la temperatura y las condiciones de aereación quefavorezcan su desarrollo, durante un tiempo predeterminado que será variablepara cada grupo de microorganismo..

Fig. 124: Siembra por punción

Fig. 125: Siembra masiva con espátula de Drigalski

232

Algunos tipos de microorganismos (como la mayoría de los hongos) se de-sarrollan sin dificultad a temperatura ambiente y en condiciones de aerobiosis,por lo que basta con dejar los tubos o las placas sembradas sobre la mesa detrabajo para que se desarrollen sin dificultad

Los microorganismos que requieran para su desarrollo una temperaturamás elevadas o más bajas que la ambiental, deben ser colocados en una incuba-dora provista de temperatura regulable o con condiciones especiales como lasincubadoras de CO2 y las anaeróbicas.

(Ver Capitulo 7)

MANIFESTACIONES DEL CRECIMIENTO BACTERIANOEN LOS MEDIOS DE CULTIVO

En medios de cultivo líquidos

En general el crecimiento se manifiesta por turbidez, la cual podrá opacartodo el cultivo o darle un aspecto granuloso o nebuloso.

En medios de cultivos sólidos

Como la bacteria se encuentra impedida de desplazarse por la solidez del me-dio, al multiplicarse en un punto especifico, sus descendiente que alcanzan magnitu-des millonarias en menos de 24 horas, ocasionan agregados bacterianos, que danlugar a estructura visibles de diferente formas, aspecto y colores, denominadoscolonias bacteriana , cuyos caracteres serán típicos para cada genero o especies.

Cultivo puro

El cultivo es puro cuando en el se desarrolla una sola especie.

Cultivo mixto

Cuando dos o más especies se desarrollan simultáneamente en el medio decultivo.

Resiembra

Cuando en el cultivo mixto, nos interesa estudiar un solo tipo de colonia, seprocede a extraer una pequeña porción con un asa de platino estéril procedien-do a sembrarla en un medio de cultivo idóneo, para de esta manera obtener uncultivo puro. Esta acción se denomina resiembra.

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CUESTIONARIO

1. ¿Qué usted entiende por siembra microbiológica?2. ¿Describa los diferentes instrumentos de siembra?3. ¿Describa el método de siembra por estrías?4. ¿Cómo se realiza la siembra por punción?5. ¿Cómo se denomina el método de siembra que se realiza con pipetas?6. ¿Con que objetivo se utiliza la espátula de Dyigalski?7. ¿Describa como se realiza la siembra con asa de platino o hisopo en el

slam de los medios sólidos en tubos.?8. ¿Cómo se realiza la siembra cuando se utiliza el mismo hisopo con que

se toma la muestra?9. ¿Cuales son los aspectos a tener en cuenta para incubar los cultivos.?10. ¿Como se manifiesta el crecimiento bacteriano en los medios líquidos y

sólidos.?11. ¿Cuál es la diferencia entre un cultivo puro y uno mixto?12. ¿Qué usted entiende por resiembra?

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CAPÍTULO 18

PRODUCTOS QUÍMICOS Y BIOLÓGICOSPARA EL DIAGNÓSTICO

INTRODUCCIÓN

Además de los nutrientes básicos y específicos, que le son proporcionadosa las especies de interés, para que puedan desarrollarse plenamente a nivel delaboratorio, en la fórmula de algunos medios de cultivo empleados al efecto, seincluyen determinados compuestos con el objetivo de favorecer su desarrollo endetrimento de otras especies contaminantes o no, o para distinguir y diferenciarlas colonias producidas.

Una vez aisladas, las especies deben ser identificadas, para lo cual se em-plean indistintamente productos químicos, principalmente carbohidratos, paraconocer su capacidad metabólica frente a esos sustratos o se enfrentan a otrostipos de compuestos para determinar su resistencia, así como a diversos pro-ductos biológicos para evidenciar sus reacciones.

HIDRATOS DE CARBONO

Los carbohidratos comúnmente empleados son diversos. Los más utiliza-dos son los monosacáridos como: glucosa, manosa, galactosa y fructuosas, en-tre otros y los disacáridos como: lactosa, sacarosa, maltosa y celobiosa. Tambiénalgunos trisacáridos, entre los que se encuentra la rafinosa y polisacáridos comola celulosa y el almidón.

Uno o varios de estos carbohidratos suelen formar parte, como fuente decarbono, de la composición de diversos medios, para el cultivo primario o lasresiembras, así como, de los medios bioquímicos destinados para el diagnósticode las especies.

El objetivo de su empleo, es determinar, si el microorganismo en estudio,fermenta "in vitro" el carbohidrato con formación de sustancias ácidas, comopor ejemplo: el ácido láctico, lo cual será detectado por la acción del indicadorpresente en el medio de cultivo al variar el pH.

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INDICADORES

Los indicadores son compuestos químicos elaborados con ácidos o ba-ses débiles, que se caracterizan por dar lugar al cambio de color de la diso-lución o sustancia donde se encuentran al variar el pH, debido a su capacidadde ionización mediante la cual, a determinado nivel de la escala de pH,transforman los iónes o moléculas y viceversa. Los indicadores son de doscolores oudiendo ser uno de ellos incoloro. Cuando el indicador está cam-biado de color, la mitad se encuentra en estado iónico y la otra mitad enestado molecular, por lo que el color en esta fase no será definido, sino másbien un color intermedio entre ambos.

Los indicadores que forman parte de la fórmula del medio de cultivo, debenestar en concentraciones muy bajas, para que la determinación del ph se debaexclusivamente a los cambios que tiene lugar en la solución.

Ejemplos de indicadores

Cuadro 12. Colores a los que dan lugar los indicadores en su rango de pH

C O L O RI N D I C A D O R ACIDO BASE RANGO DE ph

ROJO FENOL Amarillo Rojo 6.4 - 8.2

AZUL BROMOTIMOL Amarillo Azul 6.0 - 8.0

ROJO DE METILO Rojo Amarillo 4.0 - 6.0

ROJO NEUTRO Rojo Amarillo 7.0 - 8.0

FENOLFTALEINA Incoloro Rojo 8.0 - 10.0

ROJO CRESOL Amarillo Rojo púrpura 7.2 - 8.3

PÚRPURA DEBROMOCRE. Amarillo Rojo 5.2 - 6.8

Los indicadores presentes en los medios de cultivo, cambian el color delmedio o de las colonias, en correspondencia con las variaciones del pH.

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SANGRE Y HEMODERIVADOS

La sangre se emplea en la elaboración de algunos medios de cultivo, noteniendo como única finalidad proporcionar un nutriente esencial para el desa-rrollo de determinadas especies, sino además, el permitir evidenciar y diferen-ciar la actividad hemolítica de algunas de ellas. Por ejemplo, cuando se desarrollanen el medio "Agar sangre", colonias correspondientes a especies productorasde hemolisinas, éstas actúan sobre la sangre que se encuentra en sus inmedia-ciones, hemolisando a los hematíes total o parcialmente.

Si el tipo de hemolisina, destruye a los eritrocitos, el efecto se evidenciarápor la formación de un halo incoloro alrededor de la colonia. Este tipo de hemólisistotal se clasifica como "betha".

En cambio, si el tipo de hemolisina no destruye a los hematíes, pero actúasobre la hemoglobina que porta, reduciéndola a biliverdina, el efecto se eviden-ciará por la presencia de un halo de color verde alrededor de la colonia. Estetipo de hemólisis se clasifica como "alpha". Tanto los eritrocitos de sangre hu-mana, como los obtenidos de diversas especies de animales, como por ejemplo:carneros, conejos, cabras, etc., son utilizadas en diferentes pruebas dehemaglutinación o para detectar diversas reacciones hemolíticas.

El suero sanguíneo se emplea comúnmente para serodiagnósticos y el plas-ma (sin preservo) es utilizado regularmente para poner en evidencia la capaci-dad enzimática de especies productoras de coagulosa, una enzima que utilizacomo sustrato el plasma sanguíneo, provocando la formación de coágulos.

Colorantes

La edición de determinados colorantes a la fórmula del medio de cultivo,tiene como objetivo, inhibir el desarrollo de las especies más sensibles, queinterfieren el estudio, favoreciendo de esta manera el desarrollo de otras másresistentes de interés en la investigación, como por ejemplo: el "Verde brillante"que forma parte de la composición del medio de cultivo del mismo nombre,utilizado para aislar algunas especies del género Salmonella, al interferir total oparcialmente el desarrollo de otras especies presentes en la muestra. Las colo-nias de Salmonella se observan además en este medio con un color, rosado ocasi blancas, dependiendo de la condiciones de cultivo y el tiempo de incubación.

Otro ejemplo lo constituye la siembra en el medio "Eosina-Azul de MetilenoAgar". Estos colorantes inhiben el desarrollo de los gérmenes gramnegativos yal mismo tiempo permiten diferenciar a las especies de enterobacteriasfermentadoras de lactosa, la sacarosa o ambos azúcares, de los que no lasfermentan. Por ejemplo, las colonias de E. coli, Citrobacter y P. vulgaris, ad-quieren un color azul oscuro, con aspecto metálico (que se evidencia con luz

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indirecta), en tanto que las Salmonellas y las Shigellas se mantienen incoloras oligeramente teñidas, mientras que las del resto de los coliformes se tiñen con untono parduzco.

Productos químicos

Teniendo en cuenta, la información genética de que dispone cada especiebacteriana, que la capacita para actuar metabólicamente sobre determinadossustratos, es parcial o totalmente diferente entre sí, se emplean para su diagnós-tico diversos sustratos, la mayoría de naturaleza química, cuyas reacciones es-pecíficas, nos aportan información acerca de su identidad.

Entre los productos químicos, empleados con mayor frecuencia se encuen-tran los siguientes: Urea, citrato, malonato, nitrato, KCN, así como diversostipos de aminoácidos, entre otros.

El producto químico que se vaya a emplear, formará parte de la fórmula deun medio de cultivo, que contiene además los nutrientes necesarios para eldesarrollo de la especie en estudio. Al actuar la bacteria sobre el productoquímico en cuestión, generalmente lo degradan por acción enzimática a produc-tos más simples, caracterizados por tener un ph diferente al del productoreaccionante, lo cual se pondrá en evidencia por la acción del indicador queforma parte del medio de cultivo, que proporcionará el cambio de color delmedio, haciendo factible la lectura de esa prueba.

Aminoácidos

Los aminoácidos: lisina, ornitina y arginina son utilizados corrientemente enel laboratorio, como parte de las pruebas que se realizan a una cepa en estudio,para determinar la identidad de la especie.

De manera similar a la empleada con los productos químicos para igualpropósito, cada uno de estos aminoácidos es adicionado por separado, en unaproporción del 1 % a un caldo base que contiene los nutrientes necesarios parael desarrollo del germen y un indicador.

El principio de estas pruebas radica en la capacidad de algunosmicroorganismos para decarboxilar uno o varios de estos aminoácidos forman-do una amina con la consiguiente alcalinidad, lo que será puesto de manifiestopor la acción del indicador, al producirse el cambio de ph.

Antibióticos

Para medir la sensibilidad o resistencia de un microorganismo en estu-dio a los antibióticos, se realiza una técnica denominada antibiograma con el

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empleo de discos de papel de filtro estériles de unos 5 ó 6 mm de diámetro,impregnados por separado con una carga en g o unidades de un antibióticodeterminado, equivalente a la concentración sérica media, obtenida en el picode una terapéutica a dosis habituales. Estos discos (desecados) se colocancon todas las precauciones de asepsia sobre la superficie del cultivo, tan pron-to se realiza la siembra, siendo incubada de inmediato. Transcurrida 24 horas,un halo de inhibición alrededor de cada disco, en dependencia del tamaño deldiámetro, será indicativo de la sensibilidad o resistencia del microorganismoen estudio a cada uno de los antibióticos empleados.

Basado en el mismo principio y por un procedimiento similar, se realizanpruebas específicas con el empleo de un solo disco, impregnado en este casocon bacitracina u optoquina.

La bacitracina inhibe el crecimiento de más del 95 % de los Estreptococosdel grupo A, en tanto que la optoquina inhibe el desarrollo del S. pneumoniae(Neumococos), por lo que, la lectura de estas pruebas aportaran un importantedato para sus respectivos diagnósticos.

Otras pruebas de resistencia, se realizan con el empleo de productos quími-cos como: el cianuro de potasio o el desoxicolato de sodio, así como mediante laexposición del microorganismo a sustancias de secreción orgánica como la bilis.La interpretación de los resultados se sustentará en el hecho de que losmicroorganismos sean o no capaces de desarrollarse en presencia de estoscompuestos.

Fig. 126: Discos de papel de filtros para antibiogramas

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Sueros

Los sueros empleados en las técnicas de serodiagnóstico, se obtienen apartir de animales sensibilizados, que han sido expuestos de manera controladaa determinadas sustancias antigénicas con el objetivo de que induzca la forma-ción y el incremento de diferentes tipos de inmunoglobulinas, con las cuales, elsistema inmunológico del animal producirá los anticuerpos específicos, que alinteractuar con el antígeno en cuestión, darán lugar a reacciones de aglutinación,precipitación o de hemólisis, las que serán perceptibles "in vitro" si este suero esconfrontado con un antígeno similar, por procedimientos de laboratorio. Los suerosobtenidos, mediante sangría de animales sensibilizados son procesados industrial-mente, purificados y preservados, siendo envasados en frascos cuentagotas para sucomercialización, debiendo ser almacenados de 2-80c hasta su caducidad.

Antígenos

Los antígenos comerciales empleados para serodiagnóstico, pueden ser ela-borados con cepas certificadas de microorganismos portadores del antígeno deinterés que reaccione específicamente con los anticuerpos inducidos por él, oser preparados artificialmente con diversos compuestos, cuya composición quí-mica sea similar a la de los antígenos de la célula microbiana, teniendo la propie-dad de reaccionar con los anticuerpos presentes en el suero problema de formasimilar que cuando se confrontan con antígenos reales.

Un ejemplo de antígeno elaborado con cepas, lo constituye, el antígenotroponémico empleado para el serodiagnóstico de la sífilis, que se elabora conuna cepa de Treponema pallidum (cepa Nichols) cultivad "in vivo" en testículosde conejo, la cual se liofiliza para su comercialización. Los anticuerpos presen-tes en el suero de un paciente con sífilis al ser confrontados con este antígeno,interactuará con él, evidenciándose por microscopía las reacciones resultantesde aglutinación o inmovilización del Treponema.

Fig. 127: Sueros empleados para serodiagnósticos.

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Un ejemplo de antígeno no treponémico, lo constituye el denominado antígenode cardiolipina para pruebas de VDRL (Venereal Disease Research Laboratory),el cual no está elaborado con cepas de Treponemas, sino por un compuestoformado por: cardiolipina, lecitina y colesterol. Este compuesto tiene una confi-guración química, aunque no igual, a la del antígeno real, que hace que la reagina(anticuerpo) presente en el suero problema interactúe con este "antígeno", dan-do lugar a reacciones de aglutinación "in vitro". Esta prueba es inespecífica, yaque por tratarse de un antígeno artificial, los anticuerpos inducidos por algunosagentes infecciosos, reaccionan con él de forma similar para dar lugar a reac-ciones positivas aparentes.

Este antígeno se expende en ámpulas selladas de 5 mL.

Látex

El látex es una resina de aspecto lechoso, con textura viscosa y elástica,que se extrae mediante incisiones (cortes) de determinados vegetales, entre losque se encuentran diversas especies pertenecientes a la familia Euforbiáceas,oriundas de Brasil (de donde se extrae el caucho) y la Gutapercha, endémica deSumatra, así como del opio, una adormidera verde, natural de Asia, que se utilizaesencialmente como narcótico.

Esta sustancia tratada con sulfuro de carbono, da lugar a la producción deun material muy resistente que se emplea en la fabricación de neumáticos,envoltura de cables, impermeables, etc.

Investigaciones posteriores demostraron que el látex era muy inerte. Estapropiedad unida al ínfimo tamaño de su partícula de 0,81 de diámetro, fueutilizada por los laboratorios biomédicos para recubrir las globulinas específi-cas, con lo cual se favorece la observación de la aglutinación pasiva.

Desde hace varias décadas, diversas empresas farmacéuticas, dedicadas ala fabricación de reactivos comercializan diferentes tipos de látex sensibilizadospara el serodiagnóstico de diferentes tipos de microorganismos.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué datos aportan los carbohidratos utilizados para el diagnóstico delaboratorio?

2. ¿Qué son los indicadores? 3. Nombre los indicadores que Ud. conozca que sean empleados con fre-

cuencia en los laboratorios de microbiología.

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4. ¿Qué información aporta la sangre y el plasma en el diagnóstico de labora-torio?

5. ¿Para qué se utilizan determinados colorantes en la composición de losmedios de cultivo?

6. Nombre los productos químicos que son empleados en la composición demedios de cultivo destinados al diagnóstico microbiológico.

7. ¿Qué le sucede a los cultivos que contienen ciertos aminoácidos como lalisina, ornitina y arginina, cuando son atacados por determinadas espe-cies bacterianas, cuya reacciones aportan información acerca de su iden-tidad.

8. ¿ De qué manera se emplean algunos antibióticos para identificar especiesbacterianas en estudio?

9. ¿Cómo se obtienen los sueros empleados en los sero diagnósticos?10. ¿Cómo son elaborados los diferentes tipos de antígenos utilizados para el

diagnóstico de las diferentes especies.11. ¿Qué es el látex?12. ¿Cuál es la propiedad que tiene el látex que lo hace muy eficaz en las

pruebas microbiológicas?13. ¿Cómo se utiliza el látex?

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CAPÍTULO 19

GARANTÍA DE LA CALIDAD

INTRODUCCIÓN

Con independencia de las buenas condiciones técnicas que tenga un labo-ratorio de microbiología y de la adecuada competencia del personal que en éllaboran, los resultados de las investigaciones realizadas pueden estar permeadasde imprecisiones, debidas generalmente a deficiencias técnicas o erroreshumanos, originados por impericia, negligencia o mal trabajo.

La falta de cuidado, el incumplimiento de las normas técnicas estableci-das, así como la mala calidad de los materiales empleados o el deficientefuncionamiento de los equipos o instrumentos contribuyen entre otras causasafectar la calidad de los resultados.

Debe tenerse presente que cada uno de los pasos o etapas del procesoinvestigativo es susceptible de afectar la calidad del resultado final. Por ejem-plo: la toma de muestras sin la calidad requerida, así como su deficiente con-servación y transporte. El mal montaje de las preparaciones en láminas, elempleo de colorantes vencidos o deteriorados, deficiente microscopía,incubación incorrecta, así como la errónea interpretación de las pruebas, sonalgunos de los factores que inciden en la calidad de los resultados.

A los efectos de evitar o al menos reducir al mínimo estas insuficiencias yasegurar la buena calidad de los diagnósticos de laboratorio , se establecen unconjunto de medidas encaminadas a controlar mediante fiscalizaciones regu-lares todos los factores que inciden en el proceso investigativo, desde la tomade la muestra hasta el informe final, centrando la atención en los ejecutores,en cada etapa del ciclo.

OBJETIVOS

Los objetivos del control para la garantía de la calidad son los siguientes:

1. Mejorar la fiabilidad de los resultados y con ello optimizar el servicio.2. Validar la calidad de las pruebas empleadas sobre la base de su factibilidad,

bajo costo y eficiencia.3. Emplear racionalmente las pruebas de elevado costo.

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DIFERENTES TIPOS DE CONTROL

- Interno (Denominado también control de calidad)- Externo

Control interno

El control interno es planificado, organizado, ejecutado y controlado por ladirección del laboratorio a través de las siguientes actividades:

a) La fiscalización sistemática "in situ".b) La aplicación de controles de precisión.c) El empleo de pruebas estadísticas.

La fiscalización sistemática "in situ"

Consiste en supervisar la labor que realiza el personal de laboratorio encada sección de trabajo con la finalidad de detectar errores groseros que pue-dan incidir en la calidad de los resultados. Esta fiscalización consiste esencial-mente en la revisión de:

1. La limpieza, desinfección y esterilización del material de vidrio.2. El uso de reactivos y medios de cultivo con la calidad requerida.3. La correcta aplicación de los procederes establecidos para la toma de

muestras.4. La habilidad y destreza en la realización de las técnicas de acuerdo con

las normas.

Control de precisión

Se denomina precisión a la propiedad que tiene un determinado método dedar resultados lo más iguales posibles cuando se realizan varias determinacio-nes sobre una misma prueba. Para determinar la precisión se emplean dosvariantes: la reproductibilidad, que es la precisión de muestras idénticas cuandose procesan en días diferentes y la repetibilidad, que es la precisión de muestrasidénticas cuando se procesan en serie en el mismo día.

En el servicio de microbiología, el control mediante la reproductibilidad, puedeverse afectado por la falta de homogenicidad al estar presente en una mismamuestra más de una especie, así como la falta de estabilidad del microorganis-mo presente en la muestra debido la multiplicación o incremento de las muertesal no procesarse oportunamente. Para la realización de las pruebas de

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reproductibilidad o repetibilidad se emplean muestras "a ciegas", cuyas caracte-rísticas son conocidas por el jefe del laboratorio y que el técnico no puedediferenciar del resto de las muestras, procesándola como una muestra más. Elinforme final de ese resultado se compara con los datos conocidos que sirven decontrol y cuando se detectan resultados incorrectos se toman las medidas deadiestramiento necesarias.

Las muestras empleadas para controlar precisión, pueden ser reales o arti-ficiales. Las reales se estudian previamente y se determinan sus característicaspudiendo añadírsele diferentes sustancias o elementos. Por su parte las artifi-ciales son muestras simuladas elaboradas con diferentes solventes, por ejemplo:agua destilada con ácido pícrico para simular una muestra de orina o soluciónsalina fisiológica a la que se le añade una o dos gotas de suero sanguíneo yglucosa, para simular un líquido cefalorraquídeo. Las muestras artificiales másque un elemento de control de la calidad, constituye una forma de controlar laseriedad y responsabilidad del técnico.

Pruebas estadísticas

Existen diversas pruebas estadísticas utilizadas en los estudios de precisióny por lo tanto muy ligadas al control de la calidad. Entre las más usuales seencuentran la prueba estadística "F" y la prueba estadística "T". La aplicaciónde estas pruebas es muy familiar para los estadísticos, pero no para el personaltécnico de microbiología, que debe recurrir a personas experimentadas en elmanejo de estas pruebas cuando resulte necesario.

Prueba Estadística "F"

Esta prueba es utilizada para comparar la precisión de dos métodos, eltrabajo realizado por dos técnicos, etc.

Prueba Estadística "T"

Esta prueba es utilizada para comprobar si los resultados que se obtienencon un método son cuantitativamente superiores o inferiores en relación conotro o si un grupo de datos de una serie es mayor que los de otra.

PRINCIPALES FUENTES DE ERRORES

Como ya se explicó, la génesis de los malos resultados de las investigaciones delaboratorio, tienen sus principales causas en los errores originados por deficienciastécnicas o humanas, debido al mal desempeño del personal de laboratorio.

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1. Errores técnicos

a) Deficientes condiciones constructivas o estructurales del laboratorio.b) Insuficiente disponibilidad de recursos materiales.c) Mal estado de los reactivos, medios de cultivo, colorantes y otros medios

para el diagnóstico.d) Empleo de equipos e instrumentos obsoletos o con funcionamiento defi-

citario.

2. Errores humanos

a) Deficiente capacitación en su formación.b) Poca experiencia técnico-laboral en la sección de trabajo donde se des-

empeña.c) Falta de habilidad para realizar con destreza y precisión los procederes

de laboratorio.d) Violación arbitraria de las normas técnicas.e) Falta de concentración o premuras indebidas durante la realización de:

exámenes microscópicos, la selección de colonias para las resiembras, lalectura de las pruebas diagnósticas, etc.

f) Inadecuada selección de los medios y métodos empleados.g) Informar de manera incorrecta o incompleta los resultados en la orden

de análisis.

MANUAL DE NORMAS Y PROCEDIMIENTOS

Todos los laboratorios de microbiología deben disponer de un manual denormas y procedimientos donde se describan las secuencias y regulacionesestablecidas para la realización de las diferentes investigaciones, tales como: losrequisitos para la recolección y toma de las diferentes muestras, así como suconservación y transporte, la marcha analítica para su procedimiento, donde seespecifica todo lo concerniente al examen microscópico, la selección de losmedios de cultivo, las particularidades para la incubación de los cultivos, asícomo la notificación de los resultados.

El manual establece además, las indicaciones esenciales para el buen fun-cionamiento del laboratorio, relacionadas con:

a) La limpieza y/o desinfección del lugar de trabajo.b) Las normas de higiene personal.c) Las áreas designadas para comer o fumar.d) Las medidas de seguridad para cada sección de trabajo.

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e) La manipulación y eliminación de materiales infecciosos.f) El cumplimiento del esquema de inmunización acorde con la actividad

que se realiza.g) El control y cuidado de los equipos e instrumentos.

REGULACIONES DEL CONTROL DE CALIDADEN BACTERIOLOGIA

Control de equipos e instrumentos

Todos los equipos e instrumentos que sean asignados al laboratorio debenestar registrados en una carpeta de medios básicos, donde se especifique lamarca, modelo, número de serie y la fecha de su adquisición. A cada equipo sele abrirá una tarjeta, donde se refleje los datos ya referidos y las fechas en quese les da mantenimiento, se dictamina su rotura o se repara.

a) Equipos térmicos

A todos los equipos termorregulados, como: incubadoras, baño de María yrefrigeradores se le comprobará su buen funcionamiento diariamente, antes decomenzar su utilización, anotando los resultados en el registro, habilitado al efecto.En el caso del horno, el control se efectuará cada vez que el equipo se vaya autilizar y en cuanto al autoclave, simultáneamente con la temperatura, se com-probará la presión a través de los manómetros y se colocarán junto con elmaterial a esterilizar, cintas indicadoras o bioindicadores que cambian de colorcuando la esterilización no ha resultado óptima.

b) Balanzas analíticas y técnicas.

Las balanzas se deben mantener limpias para que la suciedad no interfieraen la pesada, debiendo comprobar su exactitud con pesas certificadas.

c) Potenciómetros (pHmetros)

Antes de su utilización se debe ajustar con soluciones estándar de pH 4 o 7de acuerdo a la utilización que se les vaya a dar.

Nota: En todos los casos se debe tener en cuenta la condición de apto para el uso de losequipos emitida por metrología.

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Control de medios de cultivo

Tanto los medios deshidratados, como los ingredientes para su preparacióno los medios que se adquieran ya listos para su uso, deben ser almacenados tanpronto se reciban en el laboratorio, para lo cual se anotará en la etiqueta lafecha de recepción, siendo colocados seguidamente en un lugar ventilado yprotegido de la luz solar. Al extraer los frascos que serán utilizados, se tendrá encuenta la fecha de vencimiento y el número de lote para ir utilizando los másviejos. Al realizar la apertura del frasco se anotará la fecha. Durante el tiempoque dure el almacenamiento, los frascos deben ser revisados periódicamente,procediendo a desechar los que se hallan ennegrecidos o hidratados. Cuando elalmacenamiento se prolongue, es recomendable voltear los frascos y colocarloscon la tapa hacia abajo para aminorar los efectos de la hidratación.

Para comprobar su funcionamiento se utilizará un 3 % del total de mediospreparados en los que se sembrarán cepas controles certificadas salvajes,aisladas y debidamente identificadas en el laboratorio. Las cepas empleadas sesuspenden hasta alcanzar una turbidez de 0,5 % de la escala de McFarland y sesiembran pequeños inóculos calibrados en el medio, procediendo a su incubaciónde acuerdo a las cepas empleadas. Las cepas controles regularmente emplea-das son de cocos grampositivos, Enterobacterias, haemophillus, Neisserias,Pseudomonas, Vibrios, Clostridium y Candidas albicans.

Al concluir el período de incubación si se comprueba que el medio prepa-rado permite el desarrollo óptimo de las diferentes cepas controles se conside-rará con buenas condiciones para su empleo.

Control de colorantes y reactivos

Al igual que los medios de cultivo, en la etiqueta de los frascos de coloran-tes y reactivos se anota la fecha en que se reciben en el laboratorio y se utilizanatendiendo al número del lote y la fecha de vencimiento, debiendo almacenarseigualmente en lugares frescos y protegidos de la luz.

Durante su almacenamiento se observan periódicamente y se procede a laeliminación de aquellos que esten precipitados.

El control de los reactivos y los colorantes se debe realizar frecuentementeen dependencia de su estabilidad. Por ejemplo, el peróxido de hidrógeno em-pleado en la prueba de catalada, el plasma congelado para la prueba decoagulasa, el tertrametil-parafenil endiamina al 1%, empleado para la prueba deoxidasa, el reactivo de Kovac empleado en la prueba de indol, etc, se enfrentancon cepas stock de características conocidas, cada día que se vayan a utilizarestas pruebas. Los colorantes de uso frecuente como los empleados para lascoloraciones de Gram y Ziehl Neelsen, se prueban con cepas stock cuando se

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preparan y posteriormente una vez por semana. Los colorantes de uso menosfrecuente como los empleados para la coloración de cápsulas, esporas, etc, seprueban por igual método cada día que vayan a ser utilizados.

Control de discos para antibiograma

Los discos para antibiograma, así como otros discos que se utilizan para larealización de diferentes pruebas diagnósticas como: optoquina, bacitracina,etc,se deben conservar en refrigeración (congelación) en los recipientes de fábricaprovistos de material desecante.

Su eficacia se debe comprobar con cepas controles conocidos con respectoa su sensibilidad o resistencia a los diferentes antibióticos.

El control se realizará cuando se empiece a utilizar un nuevo lote de mediosde cultivo. Con posteridad a estas comprobaciones el control se realizará unavez por semana, conjuntamente con los antibiogramas que se realicen ese día.

Control de antígenos y antisueros

Para su conservación algunos antígenos y antisueros se almacenan en re-frigeración de 2 a 8ºC, mientras que otros requieren congelación. En relacióncon estos últimos se recomienda dividir el suero en alicuotas para evitar repeti-das congelaciones y descongelaciones que pueden afectar el resultado de laspruebas, no debiendo utilizarse después de la fecha de vencimiento.

Para comprobar su efectividad se utilizarán cultivos puros recientementeobtenidos, de reactividad conocida.

En cada prueba que se vaya a realizar se empleará en paralelo un suerotestigo de reactividad conocida. Recomendándose además el empleo de suerosdobles.

Cada lote que vaya a empezar a utilizarse debe comprobarse con suerosnegativos y positivos.

Conservación de cepas para el control biológico

Como se ha explicado, para la comprobación de la eficiencia de los me-dios de cultivo y colorantes, así como para el control del funcionamiento de losantígenos y los antisueros empleados en el laboratorio se requiere del empleode cepas microbianas debidamente identificadas o certificadas que hayan sidoconservadas sin sufrir ningún cambio genético o fisiológico. Para ello, loslaboratorios deben disponer de una colección acorde con las investigacionesque realiza.

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Métodos de conservación de cepas

Cualquier método que se vaya a emplear debe propiciar microbiostasis,mediante la cual el agente microbiano se mantiene vivo sin crecer ni reproducir-se, debido al enlentecimiento de su actividad metabólica.

Los diferentes métodos empleados pueden proporcionar una conservacióna corto o a largo plazo.

Conservación a corto plazo

Este método se sustenta en el empleo de medios de cultivo con bajo poten-cial nutricional y la conservación de los cultivos en refrigeración, con lo cual selogra mantener la cepa durante varios meses.

1. La mayoría de los microorganismos aerobios se pueden conservar encultivos sobre agar inclinado, conservado en refrigeración.

2. Para la conservación de algunos microorganismos anaerobios se empleala siembra por punción con aguja en medio agarinizado, en tubos de ensa-yo, pudiendo añadirse después de la siembra una capa de aceite mineralcon lo cual se excluye al oxígeno al mismo tiempo que evita la desecacióndel medio, debiendo guardarse en refrigeración.

3. Las especies anaerobias extrictas deben ser sembradas en medio detioglicolato en tubos de ensayo o caldo con carne picada, conservándoseigualmente en refrigeración.

Conservación a largo plazo

Para conservar las cepas durante varios años, se emplea la liofilización, queconsiste en un método de deshidratación con vacío a muestras congeladas.

Procedimiento

1. Suspender el cultivo en suero inactivado o leche estéril, distribuyendoalgunas en ámpulas de vidrio, procediendo de inmediato a su congela-ción.

2. Los cultivos congelados en ámpulas son colocados en una liofilizadorapara efectuar su desecación.

3. Concluida la deshidratación, las ámpulas se sellan al vacío con la llamadel mechero que forma parte de este equipo.

4. Etiquetear el ámpula con el nombre de la especie.

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El material queda dentro del ámpula en forma de una tableta pudiendo eneste estado de desecación conservarse durante varios años.

Cuando se requiera utilizar la cepa, se rompe asépticamente el ámpula de-positando la cepa liofilizada en un medio líquido adecuado, procediendo a suincubación de 24 a 48 horas.

Control externo

Estará a cargo de un laboratorio de referencia de nivel municipal, provincialo nacional.

Este control puede producirse en dos direcciones:

Del laboratorio de referencia al laboratorio que será evaluado

Para realizar el control con esta variante, el laboratorio de referencia en-viará muestras cifradas, cuyos resultados no son conocidos por el jefe dellaboratorio que será evaluado, siendo introducidas "a ciegas" en la forma yexplicada, y procesadas como si se trataran de muestras ordinarias. Los resul-tados obtenidos serán informados en encuestas que acompañan a las muestrasque serán remitidas al laboratorio de referencia para su revisión, notificándoseal laboratorio evaluado los resultados.

Además de muestras pueden enviarse cultivos para determinar la sensibili-dad o resistencia de la cepa a los diferentes antibióticos, o sueros para determi-naciones serológicas de diferentes tipos.

Del laboratorio de la unidad al laboratorio de referencia

Se remitirá al laboratorio de referencia un porciento establecido de: frotiscoloreados y muestras, para estudio por examen directo, examen concentrado yserológico, así como de cepas que serán sometidas a estudios de comprobacióndel diagnóstico emitido por la unidad.

Los frotis, muestras y cepas predeterminadas para este control son lossiguientes:

Frotis coloreados

a- Frotis de esputo coloreado por el método de Ziehl Neelsen para investigar lapresencia de BAAR.- Envío en menos de 72 horas de todas las láminas con diagnóstico negati-

vo para evaluación de la extensión y la coloración

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Frotis de exudados uretales y endocervicales para investigar la presenciade diplococos arriñonados (intra y extracelulares)

- Enviar el 100% de los frotis con diagnóstico positivo.- Enviar un 5% de los frotis con diagnóstico negativo.

Muestras

- Heces fecales

Enviar:- El 5 % de las muestras donde se hayan identificado especies de

protozoarios.- El 10 % de las muestras donde he hayan identificado huevos o larvas de

helmintos.- El 25 % de las muestras con diagnóstico negativo.

Suero o L.C.R.

Enviar el 100 % de las muestras reactivas y débil reactiva empleadas parala prueba de VDRL.

Enviar el 2 % de las muestras no reactivas.

Cepas

Envío del 100% de las cepas recuperadas en los casos de SíndromeNeurológico Infeccioso y de Infecciones Diarreicas Agudas.

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CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las principales causas de la falta de calidad en los diagnós-ticos de laboratorio?

2. ¿Cuáles son los objetivos del control para la garantí de la calidad?3. Enumere los indicadores del control interno.4. ¿Cómo se controla la precisión de los resultados?5. ¿Cuáles son las principales fuentes de error?6. ¿Cuáles son los principales aspectos en cada una de las fuentes de erro-

res?7. ¿Qué aspectos se describen en el manual de normas y procedimientos?8. ¿Cómo se controlan los equipos e instrumentos?9. ¿Qué aspectos han de tenerse en cuenta para el control de los medios de

cultivo?10. Explique cómo se controla el estado de los colorantes y los reactivos.11. ¿Cómo se deben conservar los discos impregnados en antibióticos?12. Refiérase a la manera de controlar los antígenos y los antisueros.13. ¿De cuantas maneras diferentes se puede efectuar el control externo?14. ¿Cuáles son las muestras que deben remitirse al laboratorio de referen-

cia para su control y con qué periodicidad?

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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