Laboratorio de Bioquímica Reporte de la Práctica #1 PROPIEDADES QUIMICAS E IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS 2° semestre Q.F.B 

PROPIEDADES QUIMICAS E IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS 

OBJETIVO 

El propósito de esta práctica es identificar algunos aminoácidos que presentan grupos característicos en las cadenas laterales utilizando ensayos cualitativos y específicos para cada función , así como la explicación de los fundamentos de las reacciones que se van a efectuar. 

INTRODUCCIÓN 

El carácter único de cada a aminoácido se debe a la estructura del grupo R. En los poli péptidos los grupos R de los aminoácidos a menudo se denominan cadenas laterales y pueden variar desde un átomo de hidrógeno, hasta estructuras complejas como el grupo guanidina. 

Los aminoácidos se pueden clasificar según diversos criterios. Con fines analíticos, y limitándonos a los grupos representativos que se tratan en esta práctica, distinguiremos: 

Aminoácidos con un anillo fenólico: Fenilalanina y tirosina. Aminoácido que contienen azufre:Cistina, Cisteína, Metionina. Aminoácido con un grupo guanidínico: Arginina, creatina Aminoácidos derivados del indol: Triptófano. Debe verificarse la identificación haciendo uso de la cromatografía de aminoácidos es la ninhidrina, que da color con todos los aminoácidos y el color sirve de indicador sobre el aminoácido presente (así la prolina e hidroxiprolina dan color amarillo, la asparagina da color café y los demás dan tonos azul – violeta). 

La reacción de Ehrlich, que se efectúa también en esta práctica, es positiva para la histidina y tirosina, aminoácido que no pertenecen a un mismo grupo químico. 

FUNDAMENTO TEÓRICO 

Los aminoácidos tienen un papel primordial en la formación de los seres vivos, puesto que constituyen los bloques fundamentales con que se forman las proteínas. Entre las principales reacciones de identificación de los aminoácidos se encuentran las siguientes: 

Reacción con la ninhidrina 

El grupo alfa-amino de los aminoácidos forma complejos coloreados con la ninhidrina: violeta azuloso en la mayoría de los aminoácidos cuyo grupo amino es primario, amarillo para la prolina e hidroxiprolina y café para la asparagina que tiene un grupo amido en la cadena lateral. Esta reacción también identifica los grupos alfa-amino libres presentes en péptidos y proteínas. 

Reacción de Millón 

El anillo fenólico tiene un comportamiento característico frente a las sales de Mercurio a pH ácido, formando complejos color rojo ladrillo con el anillo fenólico de la tirosina y las proteínas que la contienen. 

Reacción Xantoprotéica 

Los anillos aromáticos presentes en algunos aminoácidos reaccionan con ácido nítrico concentrado formando nitroderivados de color amarillo o anaranjado por lo cual esta reacción permite reconocer la presencia de Tirosina, Fenilalanina y Triptófano. 

Reacción de Sakaguchi 

El grupo guanidinio presente en la cadena lateral de la Arginina reacciona con soluciones de alfanaftol en presencia de Bromo en medio alcalino formando complejos coloreados rosados o rojos. 

Reacción de Ehrlich 

La presencia de anillos aromáticos fenólicos o nitrogenados en la cadena lateral de los aminoácidos se puede identificar mediante la reacción con ácido sulfanílico y nitrito de Sodio por formación de sales de Diazonio fuertemente coloreadas permitiendo así detectar la presencia de Tirosina e Histidina libres o formando péptidos y proteínas. 

Reacción de Hopkins Cole 

El anillo indólico presente en la cadena lateral de los alfa-aminoácidos libres o haciendo parte de péptidos y proteínas se puede reconocer mediante reacción con el ácido glioxílico a pH ácido, puesto que forma complejos de coloración violeta o amarillo violeta, permitiendo así identificar al triptófano. 

Reacción de Sullivan o de aminoácidos Azufrados 

Los Aminoácidos azufrados como Metionina, Cisteina y Cistina se reconocen por la formación de precipitados de Sulfuro de Plomo de color gris oscuro o negro que se forman 

cuando reacciona con acetato de Plomo en medio alcalino. 

MATERIALES Y REACTIVOS 

Las soluciones están propuestas para cada grupo de trabajo en el laboratorio, por ejemplo 10 ml de ninhidrina para un grupo, si el curso es de 4 grupos se requieren máximo 40 ml de ninhidrina. 

Materiales 40 Tubos de ensayo de 5ml Pipeta automatica de 1000 microlitros Pipeta automatica de 200 microlitros Puntillas azules Puntillas amarillas 2 Pipetas graduadas de 1 ml. 2 Pipetas graduadas de 2 ml. 2 Pipetas graduadas de 5 ml. 2 Vasos de precipitados de 250 ml. 1 Vasos de precipitados de 600 ml. 1 Embudo de filtración 1 Erlenmeyer de 125 ml. 1 Gradilla para tubo de ensayo 1 Pinza metálica para tubo de ensayo Mechero Bunsen Placa refractaria 

REACTIVOS 

Reactivos por cada grupo de trabajo: 10 ml de Ácido sulfúrico concentrado 12 ml de Ácido nítrico concentrado 10 ml de Ácido acético concentrado 

Se requiere la preparación de los siguientes reactivos: 10 ml de Reactivo de ninhidrina: disolver 100 mg. de ninhidrina en 10 ml. de etanol a 95% y completar a 100 ml con agua destilada 

10 ml de Reactivo de Millon: .disolver 1 g de mercurio en 1 ml. De ácido nítrico concentrado, calentar suavemente, dejar enfriar y completar a 60 ml con agua 

5 ml de Reactivo de Sakaguchi: cuidadosamente disolver 2 g. De bromo en 100 ml. De NaOH al 5% (realizarlo en campana de extracción de gases muy toxico) 

10 ml de Reactivo de Hopkins cole: ácido acético impurificado con trazas de ácido 

glioxílico 

Soluciones 30 ml de Hidróxido de sodio 40%. 20 ml de Hidróxido de sodio 10 %. 10 ml de Hidróxido de amonio 10% 20 ml de Ácido clorhídrico 2%. 20 ml de Acetato de plomo 10%. 20 ml de Sulfato de cobre 0.5%. 10 ml de Nitrito de sodio 0.5% (fresco). 10 ml de Ácido sulfanílico 0.5% en HCl. 50 ml de Alfa-naftol 0.15%. 15 ml de Soluciones al 0.1% en agua acidulada (Agua acidulada con 1,5 mL de HNO3 concentrado ultra puro por cada litro de agua ultra pura) de los siguientes aminoácidos Cisteína ó metionina. Glutamina ó asparragina. Lisina ú ornitina. Tirosina. Fenil-alanina. Prolina. Arginina. Histidina. Triptófano. Alanina. 

Albúmina de huevo: separar la clara de un huevo y diluir en relación 1: 10 con agua destilada (al momento de la práctica) 

Harina de trigo: dispersar 10 g. de harina de trigo en 100 ml. de agua caliente y filtrar a través de gasa doble (al momento de la practica) 

No olvide pedir al profesor la muestra problema que va a analizar 

Para prevenir la contaminación de los reactivos: las soluciones que no estén en frasco gotero deben tener una pipeta exclusiva y el equipo encargado de preparar los reactivos debe estar pendiente, que las pipetas no sean intercambiadas durante al práctica 

CUESTIONARIO 

1. Escriba la reacción completa que se realiza entre un alfa-aminoácido y la ninhidrina. La reacción ocurre en dos pasos. Durante la primera reacción, se consumen dos equivalentes de Ninhidrina por cada aminoácido. En el primer paso de la reacción el aminoácido se oxida, descarboxilándose y liberando amoniaco, mientras que uno de los equivalentes de Ninhidrina se reduce a Hidrindantina En el segundo paso la Hidrindantina formada y otro equivalente de Ninhidrina, reaccionan con el amoniaco, todos los aminoacidos forman un complejo de color púrpura (Púrpura de Ruhemann), excepto la Prolina que produce un compuesto color amarillo. 

2. Consulte la reacción mediante la cual se puede preparar ácido glioxilico (reactivo de Hopkins-Cole) a partir de ácido oxálico. Es una solución del aldehído( HOOC- HC=O)del ácido oxálico(HOOC-COOH )que queda estabilizado después de la oxidación del magnesio, en medio ácido, por ejemplo ácido acético(CH3COOH). Sirve para identificar el Triptófano y las proteinas que lo contienen. Resulta que da positivo cuando se forma en el tubo de ensayo un anillo rojo -violeta( color del alfa-iminoglioaxil-beta-indolpropíonico ). 

REACCIONES INVOLUCRADAS: 

Mg + 2CH3COOH --> Mg(CH3COO)2 + 2H(+) + 2e(-): Semireacción de Oxidación del Mg. HOOC-COOH + 2H(+) + 2e(-) --> HOOC- HC=O + H2O Semireacción de Reducción del ác. oxálico ----------------------------------------… Mg + HOOC-COOH + 2CH3COOH ----> Mg(CH3COO)2 + HOOC- HC=O + H2O 

PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE HOPKINS COLE : 

Colocar 10 gr de magnesio en polvo en un matraz erlenmeyer de 1 lt, agregue unos 200ml de agua destilada , 10ml de ácido acético glacial y agitar a manera de remolino. Tenga a la mano,preparada una solución fría de ácido oxálico 45 g en 400 ml de agua y poco a poco agitando y enfriando externamente el erlenmeyer con el magnesio y ácido acético, dentro de un recipiente mayor con agua, agregar la solución del ácido oxálico, sobre el magnesio. 

3. Escriba las fórmulas de los aminoácidos identificados en su problema.

4. Como se realiza la reacción de Sullivan para identificación de la Cys. 

5. Escriba las estructuras de los aminoácidos que analizó en cada prueba e identifique el grupo que estaba reaccionando o el responsable de la coloración positiva del ensayo. 

OBSERVACIONES Durante la Practica #1 notamos que 2 de las pruebas de identificación de aminoácidos no podrían llevarse acabo por falta de reactivos las cuales fueron la reacción de SAKAGUCHI y la de HOPKINS COLE. 

Reacción de Ninhidrina. Se colocaron solo 4 de los 5 tubos de los cuales fueron Alanina, albumina de huevo, proteína de trigo, y el blanco a cada uno se les agrego un mililitro de Ninhidrina y se llevo a calentar al retirarlos vimos un cambio de coloración en el tubo de la albumina de huevo el cual cambio a color azul-violeta que nos indica que es un aminoácido alfa. 

Reacción de Millón 

En la prueba de Millón se rotularon solo 5 tubos los cuales fueron fenilalanina , la tirosina, albumina de hueva, proteína de trigo y el blanco. En esta observamos que el cambio de coloración después de colocar 1ml. De reactivo de millón y de haber calentado los tubos en la tirosina que tomo un color entre rojiso-rosado lo cual nos indica y presencia del mercurio en la tirosina. 

Reacción Xantoprotéico. 

Fue igual que en el ensayo de millón solo que en esta ocasión agregamos 2ml. De acido nítrico concentrado y se calentaron hasta ver cambio de coloración y a amarillo que indica la presencia de aminoácidos de la seria de aromáticos, en este caso la tirosina fue muy particular ya que solo tomaba color amarillo al momento de colocar el Hidróxido de Sodio al 40% para después regresar a la normalidad después la albumina de huevo demostró contener aminoácidos del tipo aromático y la proteína de trigo mostro el cambio naranja hasta el final. 

Reacción de Ehlrich Rotulamos 4 de los 5 tubos de ensaye: blanco, triptófano, albumina de huevo, harina de trigo. Le agregamos a cada uno 1ml, de 1 mL de ácido sulfanilico 0.5% y 1 ml, después lo dejamos reposar por 15 minutos, y al final le agregamos 1ml,de la solución que le correspondía en cada tubo de ensaye. Mezclamos y a cada tubo le agregamos 0.5 ml. de NH4OH 10%. Observamos que casi todas presentaron un color amarillo, y anaranjado. 

Reacción de Sullivan o de aminoácidos Azufrados 

En cuatro tubos de ensaye: agua destilada, proteína de trigo, albumina de huevo y cisteína, agregamos 2ml, de cada solución correspondiente. Después agregamos 2 mL. de NaOH 10% y 0.5 mL. de acetato de Plomo al 10%. Lo calentamos por 5 minutos en baño maria, y observamos que la albumina presento un color poco gris y esto nos indica que presenta aminoácidos de azufrato . 

Conclusiones 

En la prueba#1 la Albumina del Huevo resulto contener aminoácidos del tipo alfa. En la prueba#2 la Tirosina mostro contener mercurio. En la prueba#3 La proteína de trigo mostro que contenía aminoácidos del tipo aromático y comprobado mientras la tirosina y la albumina de huego solo llegaron a tener coloración amarilla al final. 

BIBLIOGRAFÍA BOHINSKI. 1991 Bioquímica. 5ed., Pearson. México. Conn, Stumpf.- 1976 Fundamentos de Bioquímica Ed. Interamericana pag. 60-62 Fesenden and fesenden. 2002. Química orgánica. Interamericana. México 

Mathews Van Holde. 2004 Bioquímica. 3 Ed Pearson. España Strayes, L. Bioquímica, Ed. Interamerican