1. INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA … · INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA...

Sección 1: Introducción al laboratorio de bioquímica

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1. INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PARTE I: REPORTE CIENTÍFICO

Objetivos

− Conocer la importancia de realizar un reporte científico. − Conocer las características o partes de un reporte científico: Introducción, hipótesis, objetivo,

métodos, resultados, discusión y conclusiones, y referencias. − Conocer cómo se formulan las hipótesis. − Plantear hipótesis. − Aprender a realizar un reporte científico.

Introducción Tanto en la Universidad como fuera de ella, sin importar el tema, tus ideas o argumentos, si no son expresados de manera clara y fácil de seguir, difícilmente serán tomados en cuenta. Es de gran valor, tanto para empresas como para instituciones educativas y de investigación, contar con personal que pueda expresar claramente sus ideas de manera escrita y oral. En el desarrollo de las ciencias, la comunicación de las observaciones, resultados y propuestas, es fundamental para continuar avanzando en el conocimiento, y el instrumento principal es el reporte científico. En él, no sólo se informa sobre los resultados de una investigación, sino también se recopila una serie de ideas y propuestas, da cuenta de los errores y avances tecnológicos que pueden ayudar a replantear la dirección de una investigación o llevar a la resolución de un problema en particular. Uno de los pasos comunes dentro del llamado método científico es la de dar respuesta a las preguntas surgidas de la observación (Figura 1.1.). Así como en el reporte, en todos los pasos que conforman al método científico debemos esforzarnos en expresar las ideas de manera clara y lógica. Por ejemplo, en el planteamiento de la hipótesis, tenemos que predecir lo que se espera del experimento propuesto, estableciendo en una frase corta las variables que se están manipulando o las mediciones que se harán, siempre en términos mensurables. Adicionalmente, la hipótesis incluye aquella información que previamente obtuvimos o conocemos respecto a la investigación. Para ayudarnos a construir la hipótesis generalmente se utilizan las preposiciones “si” y “entonces”. Examinemos el siguiente ejemplo: Si observamos que la garganta nos duele, nos planteamos:

“Si tengo dolor de garganta entonces podría deberse a que tengo una infección debida a bacterias o virus, o bien porque grité mucho el día anterior”.

Sin embargo, la anterior hipótesis no toma en cuenta lo que tenemos como conocimiento previo. Al replantearla podemos decir:

“Si sé que el resfriado es contagioso y no estuve en contacto con alguien que estuviera contagiado, y además fuí a un juego de fútbol en donde grité mucho, entonces es probable que esto último me causará el dolor de garganta”.

A pesar de que mejoró, la hipótesis no establece como se validará o no la predicción. Se podría plantear otra diciendo:

“Si no tengo fiebre o síntomas de una infección en la garganta, pero sí una inflamación en la garganta, entonces el cultivo de exudado faríngeo y otros estudios clínicos darán negativo para una infección bacteriana o viral, por lo que la inflamación se deberá a un uso excesivo de las cuerdas vocales.

La hipótesis es una parte importante en una investigación y como se mostró, debe ser cuidadosamente planteada ya que considera el problema que se está investigando, el conocimiento


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previo y el diseño del experimento. Adicionalmente, al contrastar la hipótesis con los resultados sé llegan a conclusiones válidas, que permiten replantear las hipótesis y/o reportar lo encontrado.

Figura 1.1. Diagrama que muestra los pasos del método científico. Se observa que las flechas van hacia delante pero también pueden en cualquiera de los puntos regresar. El método científico es un proceso que permite replantearse desde las preguntas hasta la manera en que los datos fueron analizados. Reporte científico Como se comentó con anterioridad, el principal propósito de escribir un reporte científico es el de comunicar la información que ha sido compilada como resultado de la investigación o experimentación y el análisis de los datos. Los reportes cubren una gran variedad de tópicos pero usualmente se enfocan en transmitir la información con un propósito claro y para una audiencia específica. Un buen reporte es un documento que es preciso, objetivo y completo. Debe también estar bien escrito, claramente estructurado y que se exprese de una manera en la que el lector mantenga la atención en él. Generalmente, el valor de una investigación se evalúa a través del reporte, es decir el reporte escrito es el único producto tangible de muchas de horas de trabajo. Debido a que se juzga el trabajo a través de un reporte escrito, éste debe ser de gran calidad.

Frecuentemente, los reportes presentan las siguientes secciones: resumen del contenido, introducción o antecedentes, métodos, resultados, discusión, conclusiones, recomendaciones o perspectivas y referencias. La inclusión de recomendaciones generalmente ocurre en reportes para la


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industria y son determinantes para la toma de decisiones por parte de los directivos. A continuación se da una breve descripción de cada una de las secciones que conforman un reporte científico.

Resumen. Su función es presentar un avance del contenido del reporte de una manera en la que el lector juzgue si debe leer el reporte completo. Se incluyen los antecedentes más relevantes, una frase sobre el objetivo del experimento, una descripción corta del método que se usó, los principales resultados y las conclusiones o implicaciones de los resultados. El resumen normalmente se escribe como un solo párrafo de 100 a 200 palabras. Introducción. Contiene la información necesaria para que el lector conozca por qué es importante el reporte, así como de que trata. La información que se utiliza en la introducción va de lo general a lo específico, esto es, se comienza primero desde un contexto amplio del tema, lo que facilita entender los conceptos y la importancia del tópico de la investigación en un área particular de estudio. Después, se hace un resumen de investigaciones anteriores, propias o de otros investigadores (literatura específica) para ayudar a justificar la presente investigación. La introducción finaliza con un párrafo en el que se plantea la hipótesis. En algunos casos se requiere que la parte final de la introducción contenga los objetivos del estudio.

Métodos. El propósito de está sección es describir precisamente los materiales y métodos usados para realizar el experimento, siempre con suficiente detalle para que alguna otra persona pueda repetir el procedimiento. Algunas veces se tiene que justificar por qué se usó un método en particular. La sección de métodos debe escribirse en pasado, ya que describe lo que se hizo.

Resultados. En esta sección se describe pero no se explican los resultados; sólo presenta los hechos que van a ser analizados posteriormente. Aunque, se puede explicar algún resultado que es particularmente importante, y que ayuda a entender los siguientes resultados. La sección de resultados debe ser clara y precisa y generalmente contiene figuras. El uso de las figuras como diagramas, tablas, gráficas, cuadros o mapas puede ser muy útil para mostrar o enfatizar la información en un reporte. Las figuras deben ser usadas para compilar los datos de una manera ordenada, son una herramienta útil para ayudar a los lectores a entender datos complejos o numerosos. Es esencial que las figuras estén integradas correctamente en el cuerpo del reporte, que sean referidas inmediatamente después de mencionarlas y deben explicarse. Un error común es mencionar la figura, colocarla y sólo decir que los datos se encuentran en la figura, lo correcto es decirle al lector en qué dato debe poner atención en la figura, aquello que es significativo y que podría utilizarse para comparar datos en figuras separadas o bien en ayudarte a explicar el porque del siguiente experimento.

Discusión. La sección de discusión tiene dos principales objetivos, explicar los resultados del estudio y evaluar si lo encontrado en el estudio tiene un significado práctico, biológico, y/o causal. Para ello se necesita: a) interpretar y explicar los resultados; b) evaluar si las preguntas que se plantearon en la hipótesis han sido contestadas; c) mostrar cómo los resultados de la investigación se relacionan con los que han sido reportados anteriormente; d) calificar y evaluar la importancia y significado de los resultados, esto es, si los resultados son estadísticamente significativos, o si existió algún defecto en el diseño o en el procedimiento que pudieron afectar el resultado; e) plantear nuevas preguntas o determinar si se abrieron nuevas áreas de interés.

Conclusiones. Está sección puede ser incluída como parte de la discusión o bien como una sección aparte. Establece de manera clara y concisa cuál es la relevancia del trabajo y sus implicaciones.

Referencias. Es necesario incluir una lista de referencias, las cuales deben estar citadas en el cuerpo del reporte. Las referencias se pueden colocar en una lista por orden alfabético, o numeradas de acuerdo a como fueron apareciendo en el texto. Cada referencia debe contener toda la información


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bibliográfica. Hay varios formatos para referencias que se pueden utilizar, consulta en internet o libros los formatos que se utilizan.

Actividades sugeridas 1. Después de la explicación de lo que es un reporte científico, el profesor proporcionará al

menos un artículo de investigación, para que identifiquen en éste las partes de un reporte. Después cada equipo expondrá sus resultados.

2. Asignar un problema a resolver por equipo, permitir que los estudiantes formulen hipótesis y diseñen un experimento. Se realizarán dos formas de reporte de ésta actividad: La primera será un reporte oral al final de ésta sesión y la segunda un reporte escrito para la siguiente sesión.

Cuestionario

1. ¿Qué implicaciones para la humanidad tendría el no reportar las investigaciones? 2. ¿Qué información debe contener un reporte científico? 3. Investiga como se lleva a cabo el diseño de un experimento e incluye ¿cuáles son las

variables independientes, las dependientes y las control? 4. ¿Qué estructura debe tener una hipótesis? 5. ¿Cuáles son las secciones de un reporte científico? 6. ¿Qué diferencia (s) hay entre la sección de resultados y la discusión? 7. ¿Qué información bibliográfica deben de contener las referencias, si son libros, artículos o

catálogos o páginas de internet? Referencias

• Day, Robert A. How to Write and Publish a Scientific Paper. 4th edition. Phoenix, AZ: Oryx Press, 1994.

• Williams, Joseph M. Style: Ten Lessons in Clarity and Grace. 6th edition. New York: Longman, 2000.

PARTE II: REVISIÓN DE MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS Y ELABORACIÓN DE CURVA ESTÁNDAR DE PROTEÍNA

Objetivos

− − Aplicar un método espectrofotométrico para medir la concentración de una proteína. − Conocer el manejo de micropipetas y espectrofotómetros. − Construir curvas de calibración y comprender su importancia.

Introducción El espectrofotómetro es un instrumento ampliamente utilizado en el análisis cualitativo y cuantitativo de moléculas biológicas. Parte de la identificación de una molécula se determina por el trazado del espectro de absorción (en función de la longitud de onda λ) en la región visible y ultravioleta. Mientras que la cuantificación de la misma se puede realizar de manera directa (si la sustancia absorbe en alguna región del espectro) o indirecta (por modificación del compuesto mediante una reacción química). Leyes que rigen la espectrofotometría Cuando un haz luminoso de intensidad P0 pasa a través de una solución, parte de éste se absorbe, por lo tanto la intensidad de la radiación emergente P es menor al incidente P0. La relación entre ambos se denomina transmitancia, T:


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T= P/P0. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (1) La cantidad de luz absorbida es proporcional al número N de iones o moléculas capaces de absorber energía; por lo tanto, T disminuye a medida que la concentración aumenta. Ley de Lambert y Beer, conocida generalmente como Ley de Beer, considera que al dividirse la disolución en pequeñas secciones, en cada una de ellas se absorberá una pequeña cantidad de radiación ΔP, que es proporcional a ΔN. Tomando en cuenta que N es directamente proporcional a la concentración y si la longitud por la que pasa el haz de luz (longitud de la celda) es constante, podemos llegar a la ecuación general:

-log P/ P0= abc . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (2) donde: c es la concentración b es la longitud de la celda o paso óptico a es la constante de proporcionalidad llamada absortividad La absortividad o coeficiente de extinción es una característica propia de cada especie y depende de la estructura química de ésta. El valor de la absortividad para un compuesto varía con la longitud de onda. Definiendo que la relación -log P / P0 es la absorbancia de la solución, la ecuación final que define a la ley de Beer queda de la siguiente manera:

Aλ= aλbc . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (3) Es importante mencionar que la constante de proporcionalidad a depende de la longitud de onda por ello se le coloca el superíndice λ así como también a la absorbancia A (ec. 3). Si la concentración se expresa en molaridad, entonces se denomina a la constante de proporcionalidad coeficiente de absortividad molar o coeficiente de extinción (ε). Convencionalmente, el paso de la luz es de 1 cm, por lo que entonces las unidades de ε son cm-1mol-1L. Hay que destacar que A es adimensional, ya que por definición es un índice. Una gráfica de absorbancia de una especie en disolución, a una longitud de onda dada, como una función de su concentración molar, se le llama curva de calibración o curva estándar. Es una línea recta y de acuerdo a la ecuación 3 la pendiente es εb. Conociendo ε y la longitud del paso de la luz b, la concentración de la sustancia en cualquier otra muestra puede ser determinada usando la Ley de Beer. La cuantificación de la especie debe realizarse a la longitud de máxima absorción. Determinación de la concentración de proteínas Dos aplicaciones comunes de la determinación de la concentración de proteínas son: 1) para reportar la actividad específica de una enzima y 2) para hacer un cargado homogéneo de proteína en geles de poliacrilamida-SDS. Dado que hay varios métodos para medir proteínas totales, ¿Cómo se escoge entre estos métodos? Generalmente se selecciona de acuerdo a su aplicación. Por ejemplo, para el cálculo de la actividad enzimática, el principal propósito es tener exactitud en los resultados, mientras que para colocar cantidades iguales de proteína en un gel de poliacrilamida-SDS, la precisión es más importante. Cuantificación de proteínas por medición de absorbancia a 280 nm. El uso de la absorbancia en la región ultravioleta para medir la concentración de proteína es posiblemente el método más simple y rápido, aunque puede producir resultados poco exactos. La cuantificación de proteína por la medida de la absorción a 280 nm, depende de la presencia de aminoácidos aromáticos: tirosina (Tyr) y triptófano (Trp). La medida a 260 nm depende de la


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presencia de fenilalanina (Phe) ya que es en esta longitud de onda donde presenta su absorbancia máxima. Un alto orden de estructuración puede modificar la contribución de las Tyr y Trp en la absorbitividad molar del péptido o proteína y en consecuencia la absorbancia es sensible a cambios en el pH y fuerza iónica del medio. Debido a que en extractos celulares hay otros compuestos que también absorben en la proximidad de los 280 nm, Warburg y Christian (1942) desarrollaron un método para corregir la interferencia por los ácidos nucleicos.

concentración de proteína (mg/mL)= A280* F

siendo F un factor de corrección, que para una solución de proteína con 0% de ácidos nucleicos es 1.12; mientras que para una mezcla de proteínas con un 20% de ácidos nucleicos es de 0.28.

Cuantificación de proteínas por un método colorimétrico. El ensayo de determinación de proteínas por el método de Lowry es uno de los más usados en Bioquímica. Cuando a un péptido o proteína en disolución básica se le hace reaccionar con cobre se forma un compuesto colorido por coordinación entre los nitrógenos del péptido con el ión metálico. En el método de Lowry el reactivo de Folin-Ciocalteu (fosfomolibdato.fosfotungstato) se añade para incrementar la cantidad de color desarrollado. El aumento en el color ocurre cuando el complejo de cobre tetradentado transfiere los electrones al complejo fosfomolibdato/ fosfotungstato, reacción que produce una coloración azul que se lee a 750 nm. La reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu ocurre solamente con los residuos de tirosina y triptófano de la proteína. Material y equipo Celdas de plástico y de cuarzo para espectrofotómetro Tubos de vidrio de 13 X 100 mm Tubos de microfuga 1 caja con puntas de 200 µL (amarillas) para micropipeta. 1 caja con puntas de 1000 µL (azules) para micropipeta. 1 Micropipeta 20-200 µL 1 Micropipeta 200-1000 µL Vórtex Espectrofotómetro (por grupo) Reactivos

− Albúmina de suero bovino o BSA. − Disolución de carbonato-tartrato-cobre (CTC). Ver composición en apéndice. − 10% Dodecilsulfato de sodio (SDS) − 0.8 N NaOH − H2O − Reactivo A. Se prepara inmediatamente antes de usarse con partes iguales de CTC, 10%

SDS, 0.8 N NaOH y H2O. − Reactivo B. Dilución del reactivo de Folin Ciocalteu. 1 volumen de Folin + 5 volúmenes de

H2O. Guardar en frasco ámbar. Preparar preferentemente poco antes de usarse

Desarrollo experimental Determinación de proteínas por absorbancia a 280 ηm

1. Rotular los tubos de microfuga 2. Añadir los volúmenes del estándar de BSA que se indican en la tabla y completar con agua. Volúmenes y cantidades del estándar de BSA para determinar proteína, utilizando la absorbancia a 280 nm.


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Tubo H2O BSA (1mg/mL)

A280ηm Proteína (µg)

0 1000 µL 1 990 µL 10 µL 2 980 µL 20 µL 3 970 µL 30 µL 4 960 µL 40 µL 5 950 µL 50 µL 6 940 µL 60 µL 7 930 µL 70 µL

3. Encender el espectrofotómetro por lo menos 15 minutos antes de la determinación y

seleccionar la λ de 280 ηm. 4. Utilizar celda de cuarzo para realizar las mediciones. 5. Ajustar el espectrofotómetro a cero con agua. 6. Realizar las lecturas. 7. Llenar la tabla con los datos de absorbancia. 8. Calcular la concentración de proteína de acuerdo al volumen añadido de la solución estándar.

Determinación de proteínas por Lowry

1. Rotular los tubos de vidrio y adicionar los reactivos en el orden que se indica en la tabla. Importante: mezclar con el vórtex después de añadir cada una de las disoluciones.

2. Encender el espectrofotómetro, seleccionar la λ de 750 nm. 3. Utilizar las celdas de plástico para realizar las mediciones. 4. Ajustar el espectofotómetro con la disolución del primer tubo de la tabla (sin BSA). 5. Realizar las lecturas. 6. Llenar la tabla con los datos de absorbancia. 7. Construir las gráficas de absorbancia vs concentración de proteína (µg).

Reactivos y cantidades a añadir para realizar una curva patrón de BSA, utilizando el método de Lowry para su determinación.

Tubo H2O BSA (1mg/mL)

Reactivo A

Reactivo B

A750ηm Proteína (µg)

1 900 µL 1000 µL 500 µL 2 890 µL 10 µL 1000 µL 500 µL 3 880 µL 20 µL 1000 µL 500 µL 4 870 µL 30 µL 1000 µL 500 µL 5 860 µL 40 µL 1000 µL 500 µL 6 850 µL 50 µL 1000 µL 500 µL 7 840 µL 60 µL 1000 µL 500 µL 8 830 µL 70 µL 1000 µL 500 µL

Incubar a temperatura

ambiente por 30

minutos

Cuestionario

1. Explica qué tipo de factores contribuyen en la desviación de la línea recta al graficar la absorbancia contra concentración (desviaciones a la ley de Beer).


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2. Menciona el fundamento de determinación de proteínas por Lowry y por absorbancia a 280 nm .

3. De acuerdo al fundamento de los dos métodos de cuantificación de proteínas aplicados en está práctica ¿cuáles son las principales diferencias entre ambos métodos?

4. ¿Cuál es más rápido?, ¿Cuál es más fácil de hacer? y ¿Cuál consideras que es más barato? Fundamenta tu respuesta.

5. ¿Qué sustancias pueden interferir con cada una de las determinaciones? 6. Respecto a la sensibilidad de ambos métodos. ¿Cuál es la masa de proteína que se necesita

en la celda para obtener una absorbancia de 0.1?. 7. Compara tus datos con los de tus compañeros y analiza ¿Qué tan reproducibles son los

datos? 8. ¿Se obtiene una línea recta después de graficar absorbancia vs µg proteína? 9. De acuerdo a tus resultados, ¿cuál es el intervalo en el que se podría determinar la

concentración de una proteína en una muestra utilizando la curva estándar de determinación de proteínas por Lowry? Da una explicación.

10. ¿Cuáles son las aplicaciones en general de una curva de calibración o estándar? Referencias

• Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY.

• Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology 182, 50-69. • Peterson GL. 1977. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more

generally applicable. Analytical Biochemistry 83, 346-356.

Sección 2. Estructura y propiedades de proteínas

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2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS.

Purificación de la enzima lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino.

PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR SALADO.

Objetivos

- Conocer las propiedades físicoquímicas de las proteínas: carga, punto isoeléctrico, masa molecular y afinidad.

- Conocer las diferentes estrategias utilizadas para aislar proteínas a partir de diferentes fuentes celulares.

- Relacionar las propiedades fisicoquímicas de las proteínas con el fundamento de las técnicas utilizadas en la purificación de proteínas: Centrifugación diferencial, precipitación por salado, cromatografía en filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad.

- Aplicar las técnicas de centrifugación y precipitación por salado como técnicas iniciales de purificación de una proteína.

Introducción Una condición esencial para el estudio de la estructura y función de una proteína es su purificación, generalmente de un tejido que contiene miles de proteínas que difieren en tamaño, forma y carga. Los aspectos que deben considerarse para establecer un método de purificación de una proteína son: el uso, las características (tamaño, carga, solubilidad, hidrofilicidad y función biológica), la cantidad que se requiere purificar y el costo. Por lo tanto, no hay un procedimiento único para la purificación de proteínas, no obstante, si hay una forma sistemática en la que se puede realizar. Una guía básica para la purificación de una proteína toma en consideración lo siguiente:

A. Definir los objetivos de la purificación. Grado de pureza, cantidad y nivel de actividad requeridos.

B. Seleccionar la muestra biológica de inicio. Dependerá de la localización de la proteína tanto en tejidos como en compartimentos extracelulares o intracelulares.

C. Desarrollar una técnica de análisis. Para la determinación rápida de la pureza, actividad o contenido total de proteína. Un método frecuentemente utilizado para evaluar la pureza es la separación de la proteína mediante electroforesis.

D. Minimizar la manipulación de la muestra. Evitar los procedimientos largos, ya que se corre el riesgo de perder la actividad de la proteína o reducir el rendimiento.

E. Remover al inicio del proceso los posibles contaminantes. Por ejemplo las proteasas. F. Reducir el uso de aditivos. El uso de muchos y diversos aditivos como sales y

amortiguadores en cada paso, puede llevar a la pérdida de la actividad de la enzima y aumentar los costos de la purificación. Seleccionar y usar sólo lo necesario.

G. Usar una técnica diferente en cada paso. Para ello tomar en cuenta las propiedades fisicoquímicas de la proteína como tamaño, carga, hidrofobicidad y especificidad por ligandos.

H. Minimizar el número de pasos. En cada paso se pierde proteína y tiempo, por lo que hay que combinar los pasos de manera lógica.

Un protocolo típico de purificación de una proteína intracelular utiliza varias técnicas, que pueden incluir en la primera fase, la ruptura de las membranas celulares, la centrifugación diferencial o en gradiente de densidad para separar proteínas de las partículas subcelulares o bien de agregados de diferente peso molecular. Una fase posterior incluirá la precipitación selectiva de proteínas por la


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adición de sales o disolventes miscibles en agua. En la tercera fase de la purificación se removerán los contaminantes utilizando la separación basada en la carga, tamaño y afinidad de la proteína. A continuación se describen brevemente las tres fases del proceso y algunas técnicas para purificar una proteína. SELECCIÓN DE LA FUENTE DE LA PROTEÍNA. Varias pueden ser las fuentes de la proteína; microorganismos, tejidos, cultivos celulares, células transformadas, entre otras. La elección de la procedencia de la proteína debe basarse en criterios tales como la facilidad de obtener cantidades suficientes de biomasa de la que se aísla la proteína, la cantidad de la proteína de interés en el tejido o célula, y cualquier propiedad peculiar de la proteína escogida, que ayudará en su estabilización y su aislamiento. En algunos casos, el investigador necesita forzosamente utilizar un tejido en particular, aún cuando la cantidad del tejido y de la proteína es insuficiente. La recomendación para estos casos, es realizar un ensayo piloto con una fuente de proteína distinta a la requerida. PRIMERA FASE. El objetivo inicial es la obtención del homogeneizado o extracto crudo y su clarificación o concentración. La homogeneización es un proceso donde las células y los tejidos son lisados en fragmentos lo suficientemente pequeños para dar lugar a una suspensión uniforme y estable llamada homogeneizado. Los equipos con los que se realiza la homogeneización son diversos y comprenden desde el mortero hasta las ondas ultrasónicas pasando por la licuadora. El método a utilizar para obtener el homogeneizado depende de la dificultad que presente el material biológico para romperse. Igualmente importante al método de homogeneización es la selección de la solución de homogeneización, puesto que será el medio al que estará expuesto la proteína y en el que se pueden adicionar componentes que ajusten el pH de la solución, la fuerza iónica, inhibidores de proteasas o algún estabilizador de la proteína. Posteriormente, para eliminar los contaminantes o clarificar la muestra se puede recurrir al proceso de centrifugación. La centrifugación aprovecha la propiedades de tamaño, forma y densidad de las proteínas para separarlas de otras moléculas que presentan características distintas. Como resultado, el efecto de la gravedad para cada proteína es diferente. En principio, se pueden separar organelos de una solución homogénea de partículas, al exponer a la muestra a diferente fuerza gravitatoria. Después de la centrifugación, algunas de las partículas que normalmente permanecían en solución se sedimentan. La fuerza centrífuga relativa (RCF) se calcula con la siguiente ecuación:

Donde RPM son las revoluciones por minuto de un rotor con una distancia r (expresada en mm). El radio usado es la distancia del centro del eje del rotor a la posición intermedia del tubo. La fuerza centrífuga creada puede ser tan pequeña como 600 Xg (600 veces la gravedad) sedimentando pedazos de tejido, células intactas, núcleos, entre otros. El líquido residual o sobrenadante puede someterse a un paso posterior de centrifugación, en un proceso denominado centrifugación diferencial. Esto es varios pasos secuenciales de centrifugación a diferentes velocidades. Por ejemplo, después de sedimentar lo más pesado, el sobrenadante se puede centrifugar a una velocidad intermedia para sedimentar las membranas celulares o velocidades tan grandes como 300,000 Xg, en donde la mayor parte de las moléculas solubles permanecen en solución y las moléculas ligeras sedimentan. SEGUNDA FASE. El objetivo principal es remover una cantidad importante de contaminantes que pueden ser proteínas, ácidos nucleicos, toxinas y virus. Uno de los métodos más utilizados para eliminar proteínas contaminantes es el de la precipitación. Para que una proteína precipite debemos modificar el ambiente que le rodea, debido a que los grupos cargados en su superficie pueden


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interaccionar tanto con las moléculas de agua como con los iones que se encuentran en solución. Existen varias estrategias para precipitar a las proteínas, cambio de pH, incremento en la temperatura, adición de disolventes, moléculas cargadas, etc. Pero, el método más comúnmente empleado es la precipitación por salado con (NH4)2SO4. Las proteínas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la concentraciones de iones, fenómeno denominado de “salting in”. Pero cuando se eleva en exceso la concentración de iones, la disminuye la solubilidad de las proteínas y precipitan (“salting out”). El mecanismo del salting-out se basa en la exclusión del co-disolvente, en este caso la sal. La mayor parte de las proteínas presentan una capa de agua (capa de solvatación) que se encuentra asociada y cercana a su superficie. Al incrementar la concentración de los iones la capa de solvatación disminuye y permite que los iones interaccionen con los residuos de las proteínas. Las interacciones de tipo hidrofóbico entre los residuos apolares de la proteína y el disolvente, se evitan gracias al plegamiento o bien por la asociación entre proteínas, produciendo su precipitación. Debido al uso extensivo de este método, que además es muy económico, se han diseñado tablas y formulas en las que se pueden determinar las cantidades a añadir de (NH4)2SO4 sólido o en solución, a una mezcla de proteínas para obtener una concentración dada. Después de la precipitación hay que retirar el agente precipitante. Una manera es diluir la solución para reducir la concentración del compuesto, otras formas pueden ser realizar la diálisis, la ultrafiltración o bien el paso por una columna de exclusión molecular. La diálisis suele llevarse a cabo colocando la muestra en un tubo estándar de diálisis, usualmente una membrana semipermeable de celulosa o celofán con un poro determinado. Se sumerge la bolsa de diálisis que tiene la muestra en una solución al menos 30 veces mayor al volumen de la muestra. La difusión de los materiales hacia adentro y fuera de la bolsa de diálisis permitirán reducir la concentración de la sal precipitante, disolver a la proteína, así como cambiar la solución en la que originalmente estaba la proteína. Existen dos desventajas de la diálisis, el costo de la membrana de diálisis y que el proceso puede llevar al menos 12 h. Por su parte, la filtración en gel no tiene el problema del tiempo. Una columna empacada con Sefadex-G25® puede usarse para eliminar moléculas de peso molecular menores a 5000 daltones. La muestra se coloca en la columna, las moléculas de menor tamaño entran por los poros de la matriz, mientras que las grandes se retienen, al adicionar el amortiguador de elución, las proteínas de bajo peso molecular se mueven con rapidez a través de la columna y salen primero, después eluyen las de peso molecular mayor. En un simple paso la muestra se desala, concentra, cambia de amortiguador y pierde las proteínas o moléculas de bajo peso molecular. TERCERA FASE. El objetivo es obtener una proteína pura o con mínimas trazas de contaminantes. Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinación de varios métodos cromatográficos, como la cromatografía de exclusión molecular, intercambio iónico, interacción hidrofóbica y de afinidad. A continuación sólo se describen las dos técnicas que se usarán en el laboratorio. Cromatografía de intercambio iónico. Es una técnica que separa las biomoléculas en base a sus características de carga. Los grupos cargados sobre la superficie de una proteína interaccionan con los grupos con carga opuesta de la fase estacionaria. La carga electrostática de las proteínas depende del pH en el que se encuentren, cuando se iguala el número de cargas positivas a las negativas se dice que se encuentran en su punto isoeléctrico o pI. La carga neta de una proteína es positiva a valores de pH < pI, y se une fuertemente a una resina con cargas negativas o intercambiador aniónico. Mientras que, para que la proteína presente carga negativa la solución debe encontrarse en valores de pH > pI, y es capaz de unirse a intercambiadores de tipo catiónico que contienen grupos cargados positivamente. Para eluir a la proteína de interés se utilizan soluciones que modifican el pH o la concentración de sales en la resina. Debido a que la separación de las


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proteínas de la matriz ocurre en orden de menor a mayor fuerza de unión, es común eluir a las proteínas usando un gradiente de concentración de sales en orden creciente de concentración. Cromatografía de afinidad. Si la proteína a purificar tiene una afinidad específica por un ligando como su cofactor, un anticuerpo o un ión metálico, esa propiedad se puede usar para purificar a la proteína. Por ejemplo, para purificar a una deshidrogenasa es común usar al cofactor de la enzima, el NAD+ o bien a un compuesto que presente alguna similitud a éste (Figura 2.1). Cuando la muestra atraviesa la columna de afinidad, la proteína de interés se unirá al ligando, mientras que el resto sale de la columna. Este tipo de separación, basada en el reconocimiento biológico, es muy específica y elimina a muchos contaminantes.

Figura 2.1. Comparación entre las moléculas de Cibacron blue 3GA y el NAD+. A) Los colorantes de triazina como el Cibacrón blue 3GA son comúnmente acoplados a resinas de agarosa para utilizarse en ensayos de purificación por cromatografía de afinidad. La molécula es estable, fácil de movilizar, barata y varias compañías las tienen disponibles para realizar purificaciones de proteínas que unen nucleótidos de piridina como B) el NAD+. En la práctica se purificará a la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) de músculo de bovino. En la primera parte del protocolo de purificación, se realizará la clarificación de la muestra mediante filtración y centrifugación y posteriormente se llevarán a cabo dos pasos secuenciales de precipitación con (NH4)2SO4. En la siguiente sesión se realizará el desalado de la muestra para al final purificarla mediante una columna de intercambio iónico o de afinidad. Por último, en la parte III del protocolo se evaluará la pureza de la proteína y el rendimiento, al determinar la cantidad total de proteína y su separación y visualización en un gel de poliacrilamida-SDS. Material biológico 60 g de carne de res Materiales y equipo para la extracción de la enzima (por grupo) 1 Tijeras 1 Espátula 1 Recipiente para hielo 1 Par de guantes de látex Colador de aluminio Gasa 2 Vasos de precipitados de 1000 mL 1 Probeta de 50 mL 2 Botellas de centrífuga Licuadora Balanza granataria Balanza de dos platos

Materiales y equipo para la precipitación con sulfato de amonio 2 Tubos para centrífuga con capacidad para 50 mL

A B


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1 Recipiente para hielo 2 Vasos de precipitados de 100 mL 1 Espátula Tubos para microfuga de 1.5 mL 1 Caja con puntas de 200 µL (amarillas) para micropipeta. 1 Caja con puntas de 1000 µL (azules) para micropipeta. 1 Micropipeta 20-200 µL 1 Micropipeta 200-1000 µL 1 Bandeja pequeña 1 Barra magnética 1 Agitador magnético Centrífuga (por grupo) Balanza (por grupo) Caja para almacenar tubos de microfuga en el congelador (por grupo) Reactivos

− 0.03M KOH. − (NH4)2SO4 sólido.

Desarrollo experimental Importante. Todo el procedimiento deberá realizarse en frío (4°C). Mantener las soluciones y suspensión proteíca en baño de hielo. Anotar en su libreta el peso del tejido utilizado, así como el volumen de la solución de homogenización y los volúmenes resultantes después de cada uno de los pasos de purificación (Figura 2.2). Valores necesarios para calcular el rendimiento, contenido de proteína y actividad enzimática. A. Extracción. Esta primera parte la realizará el profesor con ayuda de un par de voluntarios y se distribuirá el homogeneizado a todos los equipos.

1. Cortar en trozos pequeños 60 g de tejido (eliminar el tejido graso que acompaña a la carne) y colocarlos en un vaso de licuadora previamente enfriado (mantener el vaso en el cuarto frío hasta su uso).

2. Agregar 8 volúmenes de 0.03 M KOH por cada g de tejido y licuar brevemente, hacerlo en pulsos de 10 seg para evitar que la licuadora se caliente.

3. Debido a la textura del homogeneizado, se recomienda primero filtrar en una malla gruesa (colador de aluminio) y después filtrar la mezcla sobre cuatro capas de gasa grandes (previamente humedecidas con agua destilada). Exprimir suavemente y colectar el filtrado en un vaso de precipitados de 1L.

4. Distribuir el filtrado en botellas de centrífuga. Centrifugar a 10,000 rpm a 4°C durante 10 minutos. Decantar con cuidado el sobrenadante en un vaso de precipitados de 1L, el botón tiene una consistencia gelatinosa y está muy laxo. Al sobrenadante lo denominamos homogenizado total (Fracción 1).

5. Apartar 1 mL de la fracción 1 en un tubo de microfuga y almacenar a -20ºC para su posterior uso.

Nota: Tirar el contenido de la gasa en el recipiente preparado para su deshecho.

B. Precipitación con sulfato de amonio por equipo. 6. Tomar 30 mL de la fracción 1 y colocarlo en un vaso de precipitados. 7. Agitar el sobrenadante de manera continua en un agitador magnético, mientras se añade

lentamente sulfato de amonio sólido (calcular la cantidad a añadir considerando 0.258 g de (NH4)2SO4 por cada mL del sobrenadante). La agitación debe ser lo suficientemente vigorosa para evitar la formación de cúmulos de sal no disueltos, pero no demasiado fuerte porque se puede producir espuma, en ningún momento utilizar varilla de vidrio o espátula para disolver


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los grumos. Se recomienda colocar una bandeja pequeña con hielo entre el vaso de pp y la parrilla de agitación para evitar que la solución se caliente.

8. Cuando toda la sal se ha disuelto la solución se encuentra a una saturación del 45% con sulfato de amonio.

9. La mezcla que ahora se encuentra turbia se vacía a un tubo de centrífuga de 50 mL y se centrífuga a 10,000 rpm 4°C por 10 minutos.

10. Colectar el sobrenadante (Fracción 2) y medir el volumen. Descartar el botón. Tomar 1 mL de la fracción 2 y almacenarla en un tubo de microfuga a –20°C para su posterior uso.

11. Calcular el peso de (NH4)2SO4 para obtener una solución al 72% de saturación, (considerar 0.19 g de (NH4)2SO4 por cada mL del sobrenadante obtenido). Agitar como se describió anteriormente.

12. Una vez disuelto el (NH4)2SO4, colocar la mezcla turbia en un tubo de centrífuga. Centrifugar a 10,000 rpm a 4ºC por 5 min y descartar el sobrenadante.

13. Resuspender el botón en 1 mL de agua, el volumen final es de aproximadamente 1.8 mL. 14. Distribuir en 3 tubos de microfuga y etiquetar como Fracción 3. Uno de los tubos debe

contener 750 µL, se usará ese volumen en el siguiente protocolo experimental. Almacenar a –20°C.


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_____g Tejido ______mL 0.03 M KOH

Moler Homogeneizado

Filtrar con malla de aluminio Filtrar con gasa Homogeneizado Distribuir en botellas de centrífuga Centrifugar 10,000 rpm, 10 min, 4°C Botón Sobrenadante (SN) __________mL VOLUMEN TOTAL (FRACCIÓN 1; _________mL) A _______mL SN añadir ________g (NH4)2SO4 (45% saturación) Agitar

Distribuir en tubos de centrífuga Centrifugar 10,000 rpm, 10 min, 4°C Botón Sobrenadante

(FRACCIÓN 2;_________mL)

Añadir ________g (NH4)2SO4 (70% saturación) Agitar

Distribuir en tubos de centrífuga

Centrifugar 10,000 rpm, 5 min, 4°C Botón Sobrenadante

(FRACCIÓN 3) Añadir 1 mL de H20; volumen total obtenido______mL

Figura 2.2 Esquema de purificación inicial de la lactato deshidrogenasa mediante precipitaciones sucesivas con sulfato de amonio. Se sugiere llenar los espacios vacíos con las cantidades solicitadas.


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Cuestionario

1. ¿Mencione cuatro usos que se les puede dar a las proteínas purificadas? 2. Dentro de la guía para purificar a una proteína se plantea que es importante establecer cuál va

a ser el uso final de la proteína purificada. Explique por qué. 3. Clasifique los métodos que se seguirán para la purificación de la lactato deshidrogenasa, de

acuerdo a las propiedades de las proteínas como carga, peso y solubilidad. 4. Es posible clasificar a todos los métodos para purificar a una proteína sólo de acuerdo a las

propiedades mencionadas anteriormente. Explica 5. ¿Por qué es importante mantener a la mezcla de proteínas a 4°C? 6. ¿Qué otro método de homogeneización sería recomendable utilizar para obtener las proteínas

del músculo? 7. Investiga cuáles son las propiedades de la lactato deshidrogenasa, como pI, actividad

enzimática, peso molecular, estructura terciaria y/o cuaternaria. 8. Existen varios métodos en la literatura para purificar a la lactato deshidrogenasa, ¿por qué

existe esa variedad si todos purifican a la misma proteína?. 9. ¿Cuáles son las proteínas que se están purificando con un fin de uso farmacéutico o médico?

Referencias • Allen T, Mark W. 2004. Desalting, Concentration, and Buffer Exchange by dialysis and

ultrafiltration. Current protocols in protein science 4.4.1-4.4.15. John Wiley & Sons Inc, New York, USA.

• Castle DJ. 2004. Overview of cell fractionation. Current protocols in protein science 4.1.1-4.1.9. John Wiley & Sons Inc, New York, USA.

• Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edición. 1997. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localización QP514.T4

• Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden. Code number 18-1132-29 Pp 94.

• Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-7. Consultar la página www.els.net

• Sheehan D, O’Sullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la página www.els.net

• Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edición. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 71-104

Sitios recomendados para 1. aprender sobre las características y propiedades de las proteínas http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/index.html página desarrollada por el Dr. Rogelio Rodríguez Sotres. 2. calcular la concentración de sulfato de amonio a añadir a una muestra. http://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm 3. calcular la fuerza centrífuga de un rotor. Convierte rpm a Xg o vicerversa. http://www.gmi-inc.com/archivedpages/Rotor%20RCF%20Calculator.htm


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PARTE II. PURIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Y DE AFINIDAD

Objetivos

- Aplicar la cromatografía en filtración en gel como una de las técnicas para el desalado de extractos proteicos.

- Aplicar los métodos de cromatografía de intercambio iónico y por afinidad para purificar una proteína.

Material biológico

Fracción 3 obtenida en la sección anterior

Material y equipo 1 Columna de cromatografía vacía 1 Columna de cromatografía pre-empacada con Sephadex G-25* 1 Probeta de 50 mL 4 tubos de vidrio de 13X100 mm Tubos para microfuga de 1.5 mL 1 Recipiente para hielo 1 Soporte universal 1 pinzas de tres dedos de sujeción con nuez Micropipeta de 1000 µL Micropipeta de 200 µL 1 caja de puntas de 1000 µL para micropipeta 1 caja de puntas de 200 µL para micropipeta Adaptadores para tubos de 15 mL (por grupo) Centrífuga (por grupo) Balanza (por grupo)

Reactivos Desalado

− 2.5 % Sephadex-G25 (p/V). La columna contiene 1 mL de volumen de cama de Sephadex, preparado según se indica en el Apéndice. Se entrega pre-empacada para su uso inmediato.

− Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol. Contiene 10 mM de Tris/HCl pH 8.8 y 0.5 mM β-Mercaptoetanol. Ver preparación en el apéndice.

− 400 mM PMSF − Amortiguador Tris--β-Mercaptoetanol-PMSF (Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol + 1 mM de

PMSF). Los alumnos la prepararan poco antes de su uso. Tomar un volumen adecuado del amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol y añadir PMSF para una concentración final de 400 mM. Determinar el volumen a preparar por cada equipo ya que no todos los equipos realizarán la cromatografía de afinidad. Ver apéndice.

− Agua destilada estéril para el lavado de las columnas.

Purificación por cromatografía de intercambio iónico − Matriz para intercambio catiónico, Macro-prep High S de BIORAD (se entregará previamente

lavada, ver Apéndice). − Amortiguador de equilibrio. Contiene 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 7.0. − Amortiguador de elusión. Contiene 50 mM de amortiguador de fosfatos pH 7.0 y 1 M de NaCl.

Purificación por cromatografía de afinidad

− DEAE affi-gel blue gel (previamente lavada ver Apéndice).


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− Amortiguador Tris-PMSF (solución que se uso en el desalado). − Amortiguador de NAD+ . Amortiguador Tris-β-Mercaptoetanol adicionado con 5 mM de NAD+ .

Disolver el NAD+ justo antes de usarse, ver apéndice.

Desarrollo experimental.

Desalado mediante cromatografía de exclusión molecular 1. Tomar 750 µL de la fracción 3 y añadirle 750 µL del amortiguador Tris-PMSF (para reducir la

concentración de la sal a la mitad). 2. Sujetar a un soporte universal la columna, como se muestra en la Figura 2.3. 3. Adicionar a la columna de Sefadex poco a poco la mezcla de proteína y amortiguador del punto

1 y esperar a que entre a la columna por gravedad (aproximadamente 10 min). Posteriormente colocar la columna sobre un tubo de vidrio de 13X100 mm y centrifugar a 3,000 rpm 10 min, 4°C. Se desecha la solución que sale de la columna, proteínas o moléculas que no se retuvieron en la columna.

4. Para eluir las proteínas se adicionan 750 µL de amortiguador Tris-PMSF y se centrifuga a 3000 rpm a 4°C durante 5 min. La fracción que sale contiene a la LDH, Fracción 4. Se mide la cantidad de fracción 4 y se guardan 100 µL para llevar a cabo medición de actividad y determinación de proteína. El resto de la muestra se utilizará en el siguiente paso. NOTAS. 1La columna se lava con agua destilada estéril y se mantiene hidratada para reutilizarla, entregar al profesor lavada. 2No es necesario realizar la operación en condiciones de esterilidad, pero el usar agua estéril ayuda a disminuir una posible contaminación de la columna.

Purificación por cromatografía de intercambio iónico o de afinidad. La mitad del grupo realizará la purificación por intercambio iónico de la LDH de la fracción 4 y la otra parte del grupo se enfocará en la purificación de la LDH por columna de afinidad, también a partir de la fracción 4. A. Preparación de la columna para la fase tres de la purificación. Adicionar 2 mL de alguna de las dos matrices que el profesor te proporcionará, para realizar intercambio catiónico o de afinidad. Dejar de drenar o colocar la columna en un tubo de vidrio de 13X100 para centrifugar a 3,000 rpm por 10 min a 4°C. Es importante revisar que no se hayan producido burbujas para que el flujo del líquido sea constante. B. Purificación por cromatografía de intercambio iónico

1. Se utilizará la columna que se preparó en el paso anterior con la matriz de intercambio iónico. 2. Equilibrar la columna adicionando en la parte superior de la columna 1.0 mL de amortiguador

de equilibrio. Es muy IMPORTANTE adicionar el volumen lentamente, de manera que el flujo de salida sea gota a gota. Se puede acelerar el proceso centrifugando a 3000 rpm por 5 minutos a 4°C.

3. Cuando la última gota del amortiguador de equilibrio a salido se adicionan 600 µL de la fracción 4 y se deja que pase el líquido por la columna o se centrífuga como se menciono anteriormente.

4. Para la elución se adicionan 1.0 mL de amortiguador de elución y se recolectan 2 fracciones de 500 µL cada una (Figura 2.3). Las dos fracciones obtenidas las denominamos, Fracción purificada A (FPA) y Fracción purificada B (FPB). Posteriormente, se usaran ambas fracciones. NOTA. Posteriormente se lava la columna con al menos 2 mL de amortiguador de equilibrio y se guarda la columna para ser reutilizada. Entregar al profesor.


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Figura 2.3 Purificación de proteínas por cromatografía líquida. A. Empacado de la columna y B. Colecta de fracciones de proteína después de añadir la solución de elución.

C. Purificación por cromatografía de afinidad.

1. Se utiliza una columna pre-empacada con DEAE Affi-gel Blue. 2. Se equilibra la columna al adicionar 1 mL de amortiguador Tris-PMSF, el volumen que drena

se desecha. Para acelerar el proceso de paso de las soluciones en la columna se puede centrifugar a 3000 rpm por 5 min a 4°C.

3. Enseguida se adicionan 600 µL de la fracción 4. Se centrífuga a a 3000 rpm por 5 min a 4°C o se deja drenar, se desecha el eluído.

4. Añadir 600 µL del amortiguador Tris-PMSF para eliminar a las proteínas que no se han unido a la columna. Centrifugar nuevamente a 3000 rpm por 5 min a 4°C.

5. Para despegar a la LDH de la columna se adicionan 400 µL de buffer de NAD+ y se recolecta el volumen en un tubo de microfuga (Fracción purificada A o FPA).

6. Se repite el paso 5 para recuperar cualquier cantidad de proteína que haya quedado aún unida a la columna (Fracción purificada B o FPA).

NOTA. Finalmente se lava la columna con al menos 2 mL del buffer Tris-β-mercaptoetanol, y entregar la columna al profesor para ser utilizada nuevamente.


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Cuestionario

1. ¿Por qué es necesario llevar a cabo el proceso de desalado de la fracción 3 del protocolo experimental?

2. ¿Cuáles otros usos tiene la cromatografía de exclusión molecular que no sea la de ayudar a desalar una suspensión de proteínas?

3. Investiga cuál de los métodos de cromatografía es más caro, intercambio iónico o de afinidad. 4. De acuerdo a lo anterior menciona que procedimiento es el que elegirías como primera

instancia. 5. ¿Qué propiedad de la proteína se utiliza para purificar a la proteína mediante una columna de

intercambio catiónico? 6. ¿Porqué el eluyente para la cromatografía de intercambio iónico contiene NaCl? 7. ¿Podrías usar otra solución diferente de elución? Si es así menciónala y explica porque. 8. ¿Qué propiedad de la proteína estás utilizando para purificarla por cromatografía de afinidad? 9. ¿Porqué el eluyente para la cromatografía de afinidad es el NAD+?

Referencias

• Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edición. 1997. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localización QP514.T4

• Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden. Catálogo 18-1132-29 Pp 94.

• Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-7. Consultar la página www.els.net

• Sheehan D, O’Sullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la página www.els.net

• Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edición. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 71-104

Sitios recomendados para 1. aprender sobre cromatografía

• http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia.htm 2. realizar una autoevaluación sobre los fundamentos de la cromatografía

• http://www4.ujaen.es/~acarrera/TBQ_HotPot/T3_TBQ_VF/T3_TBQ_VF.htm


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Parte III. Monitoreo del proceso de purificación. Determinación de la concentración de proteínas y separación por

electroforesis en gel de poliacrilamida- SDS

Objetivos − Conocer los métodos que se utilizan para monitorear el proceso de purificación de una

proteína. − Adquirir la habilidad para analizar el progreso de la purificación de una proteína. − Determinar la concentración de una proteína utilizando un método colorimétrico:

Determinación de proteínas por Bradford. − Aplicar la electroforesis como una herramienta para monitorear la pureza de una proteína. − Analizar el progreso de la purificación de una proteína. − Conocer algunos parámetros que se determinan durante la purificación de una proteína:

rendimiento y pureza. − Aplicar el conocimiento adquirido para elaborar esquemas de purificación de proteínas.

Introducción Para evaluar el rendimiento y pureza de una enzima es necesario contar con una técnica para que específicamente detecte o mida la cantidad de la proteína blanco. En casos raros, la proteína blanco es fácil de detectar, porque es colorida (mioglobina) o porque es fluorescente (proteína verde fluorescente). Cuando la proteína es una enzima, como la lactato deshidrogenasa, se puede realizar un ensayo enzimático específico para determinar si estamos llevando a cabo la purificación de manera adecuada (se realizará en la sección 3 del manual). Para las proteínas que no son enzimas, el ensayo se basa en medir la actividad biológica de la proteína. Debido a que el ensayo específico para la proteína no nos da información sobre los otros contaminantes proteicos, es necesario un ensayo adicional que determine la cantidad total de proteína. Otra técnica que es muy usada para el análisis de la pureza de las proteínas es la electroforesis, aunque también se pueden emplear las técnicas de HPLC o Western Blot. A continuación se da una breve explicación del fundamento de la determinación de proteínas por el método de Bradford y de la separación de proteínas por electroforesis. La determinación de proteínas por Bradford es ampliamente usada ya que es simple, rápida, barata y sensible. El método tiene se basa en la unión específica del colorante azul de Coomassie brillante G250 (CBBG) a los residuos de Arg, Trp, Tyr, His y Phe de las proteínas. El CBBG se une a los residuos de las proteínas produciendo una absorbancia máxima a 595 nm, mientras que el colorante libre tiene una absorbancia máxima a 470 nm. A diferencia del Lowry que es muy sensible a la composición de la solución que acompaña a las proteínas, el Bradford sólo es afectado por algunos detergentes. Una de las desventajas del Bradford es que el colorante CBBG se une fuertemente a las cuvetas de cuarzo, es por ello que se recomienda usar vidrio o cuvetas de plástico. Al usar cuvetas de plástico se facilita su limpieza con un poco de alcohol.

Determinación de proteínas Material biológico. Fracción 1 Fracción 2 Fracción 3 Fracción 4 Fracción PA Fracción PB Material y equipo


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1 Recipiente para hielo 1 Vaso de pp de 25 mL Celdas de vidrio para espectrofotómetro Tubos para microfuga de 1.5 mL 1 Vortex Micropipeta de 200-1000 µL Micropipeta de 20-200 µL 1 caja de puntas de 1000 µL para micropipeta 1 caja de puntas de 200 µL para micropipeta 1 piceta con etanol y una con agua bidestilada. 1 gradilla para tubos de microfuga Espectrofotómetro

Reactivos Reactivo de Bradford Solución estándar de albúmina de suero bovino (BSA) 0.1mg/mL. Desarrollo experimental Determinación colorimétrica de proteínas por el método de Bradford. Se utilizará una curva estándar de albúmina de suero bovino (BSA) y las muestras se harán por duplicado, utilizando tubos de microfuga para hacer las mezclas de ensayo. Descongelar las fracciones de proteína recolectadas durante la purificación de la lactato deshidrogenasa. Mantener en una cuba de hielo durante todo el experimento. Realizar las diluciones de las fracciones y NO olvidar volver a congelar las muestras, se utilizarán en los siguientes protocolos.

Numerar los tubos según se indica en la tabla 2.1, después añadir los reactivos en el orden mostrado, agitando después de cada adición. ¡Precaución, maneja con cuidado el reactivo de Bradford, ya que contiene H3PO4!. Registrar la absorbancia a 595 nm. Graficar absorbancia vs cantidad de proteína (µg). Utilizar los parámetros de regresión obtenidos de la curva, para calcular el contenido de proteína de cada una de las muestras de acuerdo a la siguiente fórmula. Llenar la tabla 1 con los resultados obtenidos.

1. Realizar los promedios. 2. Determinar la cantidad de proteína total que se obtuvo, de cada una de las fracciones

de los diferentes pasos de purificación. 3. Determinar el rendimiento proteico en cada paso de purificación.


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Tabla 2.1. Determinación de la concentración de proteína de las fracciones obtenidas durante los diferentes pasos de la purificación de la LDH de músculo esquelético de bovino. F corresponde a Fracción.

Tubo H2O (µL)

BSA (µL)

F1 1:5

(µL)

F2 1:5

(µL)

F3 1:100 (µL)

F4 1:100 (µL)

F5 1:10 (µL)

FPA 1:5

(µL)

FPB 1:5

(µL)

Reactivo de

Bradford (µL)

Absorbancia a 595 ηm

Proteína (µg)

0 800 0 — — — — — — — 200 1 770 30 — — — — — — — 200 2 760 40 — — — — — — — 200 3 740 60 — — — — — — — 200 4 720 80 — — — — — — — 200 5 700 100 — — — — — — — 200 Proteína

(µg/µL)

6 790 — 10 — — — — — — 200 7 780 — 20 — — — — — — 200 8 790 — — 10 — — — — — 200 9 780 — — 20 — — — — — 200

10 790 — — — 10 — — — — 200 11 780 — — — 20 — — — — 200 12 790 — — — — 10 — — — 200 13 780 — — — — 20 — — — 200 14 790 — — — — — 10 — — 200 15 780 — — — — — 20 — — 200 16 790 — — — — — — 10 — 200 17 780 — — — — — — 20 — 200 18 790 — — — — — — — 10 200 19 780 — — — — — — — 20 200


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Separación de las proteínas en gel de poliacrilamida-SDS Introducción La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida es una herramienta analítica indispensable y rutinaria en una laboratorio de Bioquímica. La electroforesis puede usarse para separar y comparar una mezcla compleja de proteínas, evaluar la pureza de una proteína durante el proceso de aislamiento y provee algunos valores aproximados de las características fisicoquímicas de las proteínas como la composición de subunidades, punto isoeléctrico, tamaño y carga. En la electroforesis la migración de las partículas o moléculas cargadas ocurre cuando se establece un campo eléctrico. La velocidad de la migración depende de la fuerza del campo eléctrico aplicado y la carga neta de las moléculas a separar. Si el reservorio de la solución que se encuentra en contacto con la muestra, generalmente llamada amortiguador de corrida, se encuentra en un pH cercano a 9.0, la mayor parte de las proteínas se encontrarán cargadas negativamente, por lo que al aplicar el campo eléctrico migrarán al ánodo. La migración diferencial de las proteínas dependerá no sólo de su tamaño sino también de su carga, pero cuando se trata de un gel en el que se ha incluido un agente desnaturalizante como el dodecil-sulfato de sodio (SDS), se pierde la estructura terciaria y cuaternaria de la proteína y se uniforman las cargas de las proteínas, llevando a que la migración sólo dependa de su peso molecular. Existe una gran variedad en la composición de los geles, que responde a las necesidades de separación de diferentes mezclas de proteínas. En este caso se utilizará a la electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS para evaluar el proceso de purificación de una proteína. El gel de poliacrilamida, se hace a partir de la reacciones entre los radicales libres de los monómeros de la acrilamida. Las cadenas de poliacrilamida se entrecruzan con la N,N’-metilene bisacrilamida para formar una red. El persulfato de amonio inicia la reacción de formación de los radicales libres y la degradación del persulfato de amonio es catalizada por la tetrametilen diamina o TEMED. Las proteínas pequeñas viajan más rápido que las de mayor tamaño, porque el tamaño del poro entorpece el paso de las proteínas de mayor peso molecular. Material biológico. Fracción 1 Fracción 2 Fracción 3 Fracción 4 Fracción PA Fracción PB Material y equipo 2 vasos de precipitados 25 mL 1 Pipeta Pasteur con bulbo Tubos para microfuga de 0.5 mL 1 Recipiente para hielo 1 Micropipeta de 2-10 µL 1 Micropipeta de 20-200 µL 1 caja de puntas de 200 µL para micropipeta 1 Recipiente de plástico para la tinción. 1 Cámara para electroforesis 1 Fuente de poder 1 juego de placas de vidrio 1 Peine 1 juego de separadores Pinzas para sujetar las placas


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Reactivos

− Acrilamida. Mezcla de 30% acrilamida y 0.8% N’N’metilen-bisacrilamida. − 2 M Tris /HCl pH 8.8 − 0.5 M Tris/HCl pH 6.8 − 20% SDS − TEMED − 10% Persulfato de amonio − Agua destilada − Isopropanol o butanol − Mezcla de estándares de peso molecular de proteínas − Amortiguador de muestra * − Amortiguador de corrida * − Solución teñidora * − Solución desteñidora * *La composición de las soluciones se encuentra en el apéndice.

Desarrollo experimental Preparación del gel de poliacrilamida-SDS.

1. Se lavan perfectamente las placas de vidrio. Ensamblar las dos placas de vidrio con los separadores. Hay que asegurarse de que queden bien niveladas y fijas las placas con las pinzas.

2. Se hace una marca a los 2/3 de la capacidad de los vidrios (ver Figura 2.4). 3. Se mezclan los componentes del gel separador que se indican en la Tabla 2.2, añadiendo al

final el persulfato de amonio y el TEMED. Agitar cuidadosamente la solución (USAR GUANTES MIENTRAS SE MANIPULE LA ACRILAMIDA).

Tabla 2.2. Minigel en placa al 12 % de acrilamida con SDS.

Reactivos Gel separador Gel concentrador 30% Acrilamida + 0.8% Bisacrilamida

2 mL 0.66 mL

2 M Tris/HCl pH 8.8 1 mL 0.5 M Tris/HCl pH 6.8 0.6 mL 20% SDS 25 µL 25 µL H2O 1.94 mL 3.67 mL TEMED* 2 µL 2.5 µL 10% Persulfato de amonio* 40 µL 40 µL Volumen total 5 mL 5 mL

*Añadir justo antes de vaciar entre las placas de vidrio.

4. Añadir inmediatamente la mezcla anterior en el espacio entre las dos placas de vidrio. 5. Agregar poco a poco con la ayuda de una pipeta pasteur isopropanol o n-butanol saturado con

agua, con la finalidad de disminuir la tensión superficial y que no se forme un menisco en la parte superior del gel.

6. Se espera a que polimerice la acrilamida, aproximadamente 20 minutos. 7. Decantar el isopropanol o butanol y se hace un lavado con agua bidestilada, se elimina el

exceso de agua con papel absorbente cuidando de no tocar el gel 8. Preparar la mezcla del gel concentrador similar al punto 2. 9. Se añade entre las placas de vidrio e inmediatamente se coloca el peine en la parte superior

para formar los depósitos en los que colocaremos la muestra. 10. Se espera a que se forme este segundo gel, el cual tarda aproximadamente 20 min.


26

11. Remover con cuidado el peine y se fija el gel con las placas de vidrio a la cámara de electroforesis.

12. Añadir el amortiguador de corrida en ambos reservorios.

Figura 2.4. Pasos a seguir para la preparación de un gel de poliacrilamida-SDS.

Preparación de muestras 13. Calcular el volumen necesario para tener los 25 µg de proteína. 14. Descongelar las muestras y colocar el volumen que se calculó en un tubo de microfuga y a

ese volumen añadirle un volumen igual de amortiguador de muestra. Es recomendable también, si los volúmenes resultantes son muy diferentes entre muestra y muestra, que al añadir el volumen de amortiguador de muestra ajustemos todos a un volumen similar total. Cabe señalar que los pozos tienen una capacidad máxima de 30 µL por lo que la mezcla proteína:amortiguador de muestra no debe exceder ese volumen.

15. Realizar también una mezcla de estándares de peso molecular. Usar 7 µL del estándar y mezclar con un volumen adecuado de amortiguador de muestra.

Adición de muestras y corrida 16. Aplicar las muestras en los pozos del gel concentrador en el siguiente orden F1, F2, F3, F4,

FPA, FPB y el estándar (Figura 2.5). 17. Iniciar la electroforesis de 10 a 15 mA hasta que el frente haya entrado en el gel separador.

Después incrementar el amperaje a 25 mA, siempre y cuando no se caliente el gel. 18. Terminar la corrida una vez que el frente haya alcanzado el borde inferior del el o según se

desee.


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19. Enseguida el gel se desprende de las placas y se realiza la tinción depositando el gel en una charola que contenga solución teñidora y colocando la bandeja en agitación constante.

20. Decantar la solución teñidora, lavar el exceso con H2O destilada y añadir la solución desteñidora. Poner a agitar suavemente.

Figura 2.5 Aplicación de las muestras en los carriles de un gel de poliacrilamida-SDS.

21. Tomar una foto al gel teñido. 22. De acuerdo a los resultados señalar el o los pasos de purificación en donde se produjo el

mayor enriquecimiento en la proteína de interés, la lactato deshidrogenasa.

Cuestionario 1. Con la información de los pesos moleculares utilizados en la electroforesis determinar la zona

en la que se espera se encuentre la lactato deshidrogenasa. 2. De acuerdo a la anterior información señale en la foto del gel en donde se localizaría la LDH. 3. En cuál de los pasos se obtuvo una mayor cantidad de LDH. 4. Cuál de los dos métodos de purificación cromatográfica produce una mayor cantidad de LDH,

la cromatografía de afinidad o la de intercambio iónico. 5. Usualmente, en una purificación se utilizan la cromatografía de intercambio iónico y la de

afinidad como pasos secuenciales, una después de otra, pero por costos hemos utilizado sólo una de ellas. Predice con los resultados que obtuvo tú equipo y los otros equipos cuál sería el resultado si primero realizan la cromatografía de intercambio catiónico y luego la de cromatografía de afinidad.

6. Calcula el rendimiento proteico en cada uno de los pasos de la purificación. 7. ¿Qué cantidad de proteína se obtuvo al final? 8. ¿Cuántos contaminantes se tienen en la mezcla de proteínas final? 9. Elabora un esquema de purificación para la proteína malato sintasa, utilizando semillas de

girasol. Recuerda que debes seguir la guía o protocolo de purificación de proteínas.


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Referencias • Bradley JSCO, Markwell J. 2007. Assay for determination of protein concentration. Current

protocols in protein science 3.4.1-3.4.29. • Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edición. 1997. John

Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localización QP514.T4 • Reiner W. 2005. Gel electrophoresis. John Wiley & sons, Ltd. www.els.net • Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edición. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York,

USA. Pp 71-104

Sección 3. Actividad enzimática

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3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

PARTE I: CURVAS TEMPORALES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA LACTATO DESHIDROGENASA DE MÚSCULO ESQUELÉTICO DE BOVINO. Objetivos

- Conocer las características generales de las enzimas como catalizadores biológicos. - Adquirir la habilidad para medir la actividad de una enzima utilizando un método

espectrofotométrico. - - Relacionar los los distintos parámetros asociados a la medicion de la actividad enzimática que

permiten seguir y evaluar la purificación de una enzima (actividad específica, rendimiento y enriquecimiento).

Introducción Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de una reacción y no se consumen o modifican durante ésta. Sin su presencia, muchas de las reacciones bioquímicas celulares no podrían proceder a la velocidad requerida. El incremento en la velocidad de la reacción se encuentra entre 106 a 1012 veces con respecto a la reacción en ausencia del catalizador. Otra propiedad de las enzimas es su alto grado de especificidad; solamente catalizan la reacción en la que participa un sustrato (especificidad absoluta) o un grupo de sustratos con ciertas características químicas y geométricas comunes (especificidad de grupo). La enzima, al ser una proteína, tiene una estructura geométrica característica y la porción de la enzima que específicamente une o reacciona con el sustrato se denomina centro catalítico o sitio activo. Para muchas enzimas sus residuos de aminoácidos son suficientes para efectuar la catálisis, para otras es necesario que exista un cofactor, ya que en ausencia de éste no se cataliza la reacción. El cofactor es un ión metálico como el Fe2+, Zn2+, Mo2+. Para otras reacciones se necesita una coenzima, es decir una molécula orgánica con características no proteicas, que generalmente se sintetiza a partir de vitaminas. La coenzima funciona como un cosustrato cuando se une transitoriamente al sitio activo de la enzima, de tal forma que se libera al medio durante cada ciclo catalítico. Éste es el caso de las deshidrogenasas que trabajan con el NAD+, como la enzima que nos ocupará en ésta sección experimental. Cuando la coenzima se une fuertemente a la enzima, ya sea por medio de enlaces covalentes o interacciones no covalentes, se le da el nombre de grupo prostético. Diseño de un ensayo enzimático Durante el aislamiento y purificación de una enzima, es necesario realizar un ensayo para determinar la cantidad y pureza de la enzima, así como evaluar las características cinéticas de la enzima. Para el diseño de un ensayo enzimático se requiere conocer la reacción que se analiza, es decir: A) cuales son las especies que se requieren (sustrato, la o las coenzimas, el o los cofactores, entre otros); B) la estequiometría completa, y C) los efectos del pH, temperatura y fuerza iónica sobre la actividad de la enzima. Adicionalmente a lo anterior, debe de estar disponible un método para identificar y monitorear cualquier cambio físico, químico o biológico que ocurre durante la conversión del sustrato a producto. Se pueden utilizar distintas técnicas para determinar los cambios en las concentraciones de sustrato o producto como la espectrofotometría, la fluorometría, la titulación ácido-base y el conteo radiactivo. La elección de alguna de ellas depende esencialmente de las características estructurales del sustrato y/o producto, así como de la química de la reacción.


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Si un ensayo enzimático involucra el seguimiento de la concentración del sustrato o producto durante un intervalo de tiempo, el ensayo se denomina cinético. Por otro lado, cuando se realiza la determinación de la concentración del sustrato o producto a un solo tiempo, se denomina ensayo a tiempo fijo. En lo posible se recomienda realizar ensayos temporales de reacción, ya que cualquier desviación de la linealidad puede detectarse inmediatamente. Los cambios en la linealidad de la reacción pueden deberse a una o varias causas, el decremento en la concentración de sustrato, la desnaturalización de la enzima y a la inhibición causada por el producto de la reacción. Pero, hay que aclarar que la velocidad inicial de una reacción ocurre en los primeros minutos de la reacción, una relación lineal que se mantiene cuando el consumo de sustrato no va más allá del 5% de la concentración inicial. Por tanto, cuando se realiza un estudio sobre la actividad enzimática, es fundamental que las velocidades que se obtengan sean las iniciales. Lactato deshidrogenasa de mamífero. El nombre científico de la lactato deshidrogenasa o LDH es L-lactato: NAD+ oxidoreductasa (EC 1.1.1.27). Es una enzima importante en el metabolismo anaerobio de la glucosa para la regeneración del ATP. La actividad de la LDH es alta durante la actividad física intensa, cuando la tensión de oxígeno disminuye y la demanda de ATP es alta. Bajo condiciones aerobias, la enzima cataliza de manera reversible la conversión de lactato a piruvato (Figura 3.1). Pero lo contrario ocurre cuando disminuye el O2 celular o bien el pH es cercano a 7.0, entonces el piruvato es convertido a lactato con la concomitante conversión de NADH a NAD+. La regeneración del NAD+ permite que el flujo de la vía glucolítica continúe. La actividad de la enzima decrece en el sentido de Piruvato →Lactato cuando la demanda de energía cesa o hasta que los niveles de lactato llegan a ser altos e intolerables.

Figura 3.1. Reacción que cataliza la lactato deshidrogenasa. La reducción del piruvato para formar lactato es reversible y dependiente de la presencia de una coenzima. La LDH es un tetrámero de subunidades con un peso molecular de 35 kDa cada una. Hay dos tipos de subunidades, la H que predomina en el corazón y la M que predomina en el músculo y el hígado. Las subunidades se pueden asociar formando 5 tipos de tetrámeros con estequiometrías distintas: H4, H3M1, H2M2, H1M3 y M4. Todos estos tienen actividad de LDH, pero tienen diferentes afinidades por el lactato o el piruvato. Las enzimas que catalizan la misma reacción pero difieren en su estructura son llamadas isoenzimas. En la práctica se determinará la actividad de la LDH de músculo esquelético de bovino, enzima que contiene casi exclusivamente subunidades M, esto es la isoenzima M4. En está parte del protocolo se medirá a diferentes tiempos la reacción en el sentido de Piruvato →Lactato, utilizando como fuente de enzima las fracciones que fueron obtenidas durante el protocolo de purificación de la LDH de la sección II del manual. El ensayo de actividad está basado en la detección del cambio de absorción del NADH y el NAD+. El NADH es una molécula que absorbe a 340 nm, mientras que el NAD+ no. Entonces, la actividad de la enzima en las muestras se detectará como una disminución en la absorbancia a 340 nm, debido a que en la reacción el NADH es convertido a su forma oxidada, el NAD+. Material biológico Fracción 1 Fracción 2


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Fracción 3 Fracción PA Fracción PB Material y equipo Celdas de plástico Tubos de microfuga Parafilm 1 Recipiente para hielo 1 Micropipeta de 200-1000 µL 1 Micropipeta de 20-200 µL 1 Micropipeta de 2-10 µL 1 caja de puntas de 1000 µL para micropipeta 1 caja de puntas de 200 µL para micropipeta 1 Vórtex Espectrofotómetro (por grupo) Reactivos 1 M Amortiguador de fosfatos pH 7.0 10 mM Piruvato de sodio 4 mM NADH. Reactivo que debe de disolverse justo antes de usarlo. Verificar que la absorbancia a 340 nm sea mayor de 1.0, si no es así volver a pesar y medir. Desarrollo experimental. Curvas temporales de actividad de lactato deshidrogenasa. Se sugiere utilizar al menos 4 fracciones distintas que fueron obtenidas durante el proceso de purificación efectuado en la sección anterior. Las mezclas de reacción se realizarán directamente en las celdas de plástico. Se usará agua para ajustar a 0 el espectrofotómetro.

1. Descongelar la proteína y mantenerla a 4°C. Hacer diluciones de las fracciones. Se recomiendan las siguientes: 1:100 para la Fracción 1, 1:300 para las fracciones 2 y 3, 1:10 para las fracciones PA y PB. También hay que mantener en el hielo las diluciones.

2. Se etiquetan 5 celdas. Si el espectrofotómetro que se tiene disponible presenta la capacidad para leer 6 celdas, es posible realizar 5 determinaciones de actividad a la vez (una celda contendría el blanco). Si no se dispone de ése aparato medir la actividad de las muestra una por una.

3. A cada una de las celdas se les añadirán los siguientes componentes: 515 µL 100 mM Amortiguador de fosfatos 29.3 µL 10 mM Piruvato 210.7 µL H2O

4. Adicionar a la celda 50 µL de 4 mM NADH e inmediatamente agregar 10 µL de la muestra de enzima diluida.

5. Se tapa la celda con parafilm y se agita por inversión dos veces y se lee inmediatamente la absorbancia a una longitud de onda de 340 nm. Consideraciones: si la absorbancia inicial es menor de 0.4 es posible que la actividad de la enzima sea muy alta, por lo que se recomienda repetir el ensayo haciendo una dilución mayor de la enzima.

6. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.1). El ensayo de actividad se realizará a temperatura ambiente, por lo que una vez adicionada la enzima hay que mantener la celda dentro del espectrofotómetro.


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Tabla 3.1. Lecturas de absorbancia de las fracciones obtenidas de la purificación de proteínas Tiempo (min) F1

Dilución F2

Dilución F3

Dilución FPA

Dilución FPB

Dilución

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

pendiente

Actividad (mmolmin-1mg-1)

7. Realizar una gráfica de Absorbancia vs Tiempo (minutos) para cada una de las fracciones y

obtener la pendiente de la recta. 8. Para calcular la actividad de la enzima se utiliza la siguiente ecuación.

donde:

m: es la pendiente de la recta (ΔAbs/Δt) en unidades de abs / min ε: es el coeficiente de extinción molecular para el NADH, 6.22 x 103 M-1 cm-1. b: es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cm Vensayo: es el volumen total del ensayo. F: es el factor de dilución para la enzima

9. Con los datos de actividad y los obtenidos en la práctica de purificación de proteínas llena la

Tabla 3.2.


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Tabla 3.2. Tabla de purificación de la LDH de músculo esquelético de bovino. Procedimiento Volumen de

la fracción (mL)

Proteína total en la fracción

(mg)

Actividad enzimática

(mmol min-1mg-

1)

Actividad específica

mmolmin-1mg-

1total de la fracción

Veces de purificación

Rendimiento

Homogeneizado (F1)

1 100

Sobrenadante de la precipitación con sulfato de

amonio 45% (F2)

Precipitado obtenido de la ppt. con sulfato de amonio

70% (F3)

Primera Fracción que salió de la cromatografía* (FPA)

Segunda Fracción que salió de la cromatografía*

(FPB)

Anotar cual cromatografía se realizó, ¿de intercambio iónico o de afinidad?. 10. Analizar los resultados.

Cuestionario 1. ¿Por qué se usó H2O como blanco para calibrar el espectrofótometro en la práctica? 2. Menciona los pasos que deben seguirse para obtener la fórmula que se propone para calcular

la actividad de la enzima. 3. ¿Cuáles son las diferentes unidades en que se puede reportar la actividad de una enzima? 4. Proponga un protocolo para determinar la actividad de la enzima que no sea el de realizar una

curva temporal de aparición de productos. 5. Analizando los resultados que se encuentran en la tabla 3.1 menciona cual fue el paso en el

que la proteína se enriqueció más. ¿Por qué? 6. Al analizar en conjunto los datos obtenidos en la electroforesis y los de actividad ¿en qué

pasos de la purificación se eliminan más contaminantes?. 7. ¿Sería de utilidad realizar una tabla de purificación en la que se tome en cuenta la actividad

de la enzima? 8. Si la respuesta es afirmativa explica por qué.

Referencias • Devlin TM. 1992. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Ed. Wiley- Liss, pp. 135-

190. Localización QP514.2 • Kopperschläger G, Kirchberger J. 1996. Methods for separation of lactate dehydrogenases

and clinical significance of the enzyme. Journal of chromatography B, 684, 25-49. • Mathews C. 1992. Bioquímica, 2da edición, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localización

QP514.2 • Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 202-

233. QH345 L43 • Pardo-Vázquez JP. Cap 10. Cinética enzimática. En Bioquímica de Laguna. El Manual

Moderno, SA de CV., 2002, pP185 • Voet D, Voet JG. 1992. Bioquímica. Ed. Omega S. A. pp. 342-378. Localización QP514.2


34

PARTE II. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO Y DE UN INHIBIDOR. Objetivos:

- Determinar la concentración de sustrato en la cual la enzima alcanza su velocidad máxima. - Entender el significado de los parámetros cinéticos Vmax y Km. - Calcular los parámetros cinéticos de la reacción catalizada por la lactato deshidrogenasa

utilizando diferentes gráficos de la ecuación linealizada de Michaelis-Menten. - Determinar el efecto de una inhibidor en la actividad de la lactato deshidrogenasa - Analizar el efecto de un inhibidor sobre los parámetros cinéticos de la enzima.

Introducción El término cinética enzimática implica el estudio de la velocidad de una reacción catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener varios factores como los inhibidores. Uno de los principales estudios que se realizan en una enzima es medir el efecto en la velocidad de la reacción cuando se modifican las concentraciones del sustrato de la enzima y se mantienen constante la concentración de enzima, el pH, la fuerza iónica del medio, la temperatura, entre otros. Curva de velocidad en función de la concentración de sustrato. Tanto en una reacción catalizada por una enzima como en una reacción química, se espera que la velocidad de la reacción de conversión de sustratos a productos, sea directamente proporcional a la concentración de los reactantes que participan en la reacción, es decir si se duplica la concentración de cualquiera de los sustratos la velocidad de la reacción también se duplica. A una reacción así se denomina reacción de segundo orden y se representa como una línea recta con pendiente positiva y diferente de cero. Pero en una reacción que es catalizada por una enzima, sólo a concentraciones bajas del o los sustratos se obtiene una reacción de segundo orden. A concentraciones altas de sustrato la velocidad es independiente de la concentración de sustrato, debido a que no hay más enzima que lleve a cabo la reacción. La reacción a concentraciones altas de sustrato se llama reacción de orden cero y también se representa como una línea recta pero con pendiente casi igual a cero. En resumen, en una reacción catalizada por una enzima la variación en la concentración del o los sustratos presenta diferentes ordenes de reacción. Para un gran número de enzimas la gráfica que se produce se puede describir mediante la expresión matemática de una hipérbola rectangular. Como en cualquier expresión matemática se expresan en ella la relación entre las variables junto a 1 o más constantes. El trabajo pionero de Michaelis y Menten y Bringgs y Haldane llevó a describir la ecuación de la hipérbola rectangular, ahora conocida como ecuación de Michaelis-Menten, con ella es posible predecir el comportamiento de la enzima en condiciones experimentales diferentes. Entonces, la ecuación se describe así:

Donde las dos variables de la ecuación son la velocidad (v) y la concentración de sustrato (s). Mientras que las dos constantes son la Km y la Vmax. La Km es llamada la constante de Michaelis-Menten. La Km de una enzima para un sustrato específico es la concentración del sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la velocidad máxima. La Vmax es la velocidad teórica máxima de una reacción. A concentraciones muy altas de sustrato el valor de la velocidad se aproxima al de la velocidad máxima de la reacción, pero nunca se llega a ésta. Los valores de Km y Vmax son característicos de una enzima, aunque dependen de las condiciones en las que se llevó a cabo la


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reacción, ya que hay que recordar que la enzima es una proteína que responde modificando su estructura y carga eléctrica cuando los componentes de la solución cambian. Una manera para obtener los valores de Km y Vmax de una enzima también llamados parámetros cinéticos de una enzima, es graficando los valores de velocidad contra la concentración de sustrato. Este método tiene la desventaja de que se grafica una una curva y no una línea recta por lo que la interpolación es difícil. Otra manera, es la de utilizar alguna de las expresiones matemáticas que producen una línea recta como la de Lineaweaver-Burk, la de Eadie-Hosftie o la de Hanes. Todos ellos son métodos simples y aunque cada una tiene sus problemas de interpretación son útiles para obtener los valores de Km y Vmax. Una de las formas de regulación de la actividad de una enzima es a través de moléculas que disminuyen su velocidad de reacción, inhibidores. Los inhibidores pueden encontrarse de manera natural en las células para controlar la velocidad de una reacción metabólica, o bien pueden ser compuestos sintéticos que se utilizan como herramientas experimentales para el estudio de las reacciones enzimáticas. Muchos compuestos tóxicos como antibióticos, pesticidas o herbicidas son inhibidores de enzimas que son responsables de reacciones vitales para la célula. La interacción de un inhibidor y la enzima no es siempre la misma, ya que depende de la naturaleza química del inhibidor así como de la reacción química que cataliza la enzima. Para dilucidar el tipo de interacción entre ambas moléculas se recurre a determinar el efecto del inhibidor en las constantes cinéticas de la enzima. Inhibidores competitivos. Son moléculas que tienen una similitud estructural y química al sustrato de la enzima. Debido a lo anterior el inhibidor se puede unir al sitio activo de la enzima. Pero como el inhibidor no es idéntico al sustrato, la enzima no es capaz de convertir el inhibidor a producto. El inhibidor simplemente bloquea el sitio activo, por regla no es posible que tanto el inhibidor como el sustrato se encuentren al mismos tiempo en el sitio activo. Si se adiciona más sustrato y el inhibidor es reversible, el aumento en la concentración de sustrato reduce la inhibición. El inhibidor afecta exclusivamente la Vmax de la reacción catalizada por la enzima. Inhibidor no competitivo. El inhibidor no se une al sitio activo de la enzima sino a un sitio alejado del sitio activo y ocasiona un cambio conformacional en el sitio activo de la enzima. Un inhibidor no competitivo puro es aquel en el que sólo se altera la capacidad de unir al sustrato. La mayor parte de los inhibidor son inhibidores mixtos es decir no sólo se afecta la unión del sustrato sino también la conversión del sustrato a producto. Debido a lo anterior, los inhibidores mixtos alteran tanto la Vmax como la Km de la enzima.

Inhibidor acompetitivo. Es un inhibidor que no es capaz de unirse a la enzima libre, es decir sólo se une al complejo Enzima-Sustrato. Lo anterior puede deberse a que la unión del sustrato expone o crea sitios de acceso o unión para el inhibidor, en el o fuera del sitio activo. Una vez que el inhibidor se une la enzima se previene la formación de producto. El inhibidor acompetitivo altera la Km de la enzima.

En la práctica se determinarán las constantes cinéticas, Km y Vmax, de la lactato deshidrogenasa de músculo de bovino, para la reacción en el sentido de piruvato a lactato, manteniendo constante la concentración de enzima, el pH y la temperatura de reacción. También se determinará el tipo de inhibición que un ácido carboxilico produce en la actividad de la enzima, el oxamato (Figura 3.2) a través de medir la actividad de la enzima a diferentes concentraciones de sustrato y a una sola concentración de inhibidor su efecto en las constantes cinéticas de la reacción catalizada por la enzima.


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Figura 3.2 Estructuras del piruvato y el inhibidor que se usará en la práctica, el oxamato.

Material biológico Fracción 3 obtenida en la práctica de purificación. Materiales y equipo 10 celdas de plástico Tubos para microfuga 1 Recipiente para hielo 1 Vaso de precipitados de 25 mL 3 Tubos de ensayo 13x100mm 1 Micropipeta de 1000 µL 1 Micropipeta de 200 µL 1 Micropipeta de 10 µL 1 Micropipeta de 50µL Puntas para micropipeta diferentes capacidades 1 Vortex Parafilm Espectrómetro (por grupo) Reactivos

− 1 M Amortiguador de fosfatos pH 7.0 − 10 mM Piruvato de sodio − 10 mM Oxamato de sodio − 4 mM NADH. Reactivo que debe de disolverse justo antes de usarlo.

Desarrollo experimental. Efecto de la concentración de sustrato.

1. Numerar las celdas. 2. En una celda de plástico se adicionan el amortiguador de fosfatos 100 mM, el agua y el

piruvato 10 mM de acuerdo a lo que se indica en la tabla 3.3. Justo antes de medir se añaden 50 µL de NADH 4 mM y 10 µL de la muestra de enzima diluida, fracción 3 obtenida en la práctica de purificación.


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Tabla 3.3. Efecto de la concentración de sustrato.

Solución 1

2 3 4 5 6

*Concentración final de piruvato (mM) 0.06* 0.09* 0.15* 0.25* 0.36* 0.5*

100 mM Amortiguador de fosfatos pH 7.0 515 515 515 515 515 515

H2O c.b.p. 815µL (µL) 235.1 232.7 227.8 219.6 210.7 200

10 mM Piruvato (µL) 4.9 7.3 12.2 20.4 29.3 40

4 mM NADH (µL) 50 50 50 50 50 50

ENZIMA (1:200) (µL) 10 10 10 10 10 10

3. Tapar la celda con parafilm y agitar 2 veces por inversión. 4. Ajustar el espectrofotómetro con agua y leer la absorbancia de la muestra a una longitud de

onda de 340 nm. 5. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.4).


38

Tabla 3.4. Lecturas de absorbancia de la actividad de la LDH a diferentes concentraciones de sustrato.

Piruvato (mM) Tiempo (seg) 0.06 0.09 0.15 0.25 0.36 0.5

30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

6. Obtener la pendiente y calcular la actividad de manera similar al punto 6 de la práctica

anterior. 7. Posteriormente se grafican: A) Actividad vs concentración de sustrato (gráfica de Michaelis-

Menten); B) La gráfica de actividad de acuerdo a Lineweaver-Burk y C) La curva de acuerdo al método de Hanes-Wolff.

8. Calcular las constantes cinéticas Km y Vmax, con los datos obtenidos de los tres gráficos anteriores.

Efecto de un inhibidor en la actividad de la LDH. Al igual que en la sección anterior se mide la actividad de la lactato deshidrogenasa a diferentes concentraciones de piruvato, pero ahora se adiciona el oxamato de sodio, compuesto que inhibe la actividad de la LDH (Tabla 3.5). Tabla 3.5. Composición de medio de reacción para medir el efecto del oxamato en la actividad de la lactato deshidrogenasa.

Solución 1 2 3 4 5 6

*Concentración final de piruvato (mM) 0.06* 0.09* 0.15* 0.25* 0.36* 0.5*

100 mM Amortiguador de fosfatos pH 7.0 515 515 515 515 515 515

H2O c.b.p. 815µL 235.1 232.7 227.8 219.6 210.7 200

10 mM Oxamato (µL) 27.2 27.2 27.2 27.2 27.2 27.2

10 mM Piruvato (µL) 4.9 7.3 12.2 20.4 29.3 40

4 mM NADH (µL) 50 50 50 50 50 50

ENZIMA (1:200) (µL) 10 10 10 10 10 10

1. Se adiciona en una celda de plástico los reactivos de acuerdo a los volúmenes y el orden que

se encuentra en la Tabla 3.5. 2. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.6).


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Tabla 3.5. Registro de absorbancias de la actividad de la LDH en presencia de un inhibidor.

Piruvato (mM) + Oxamato 0.35 mM Tiempo (seg) 0.06 0.09 0.15 0.25 0.36 0.5

30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

3. Obtener la pendiente y calcular la actividad enzimática. 4. Realizar los siguientes gráficos: A) Actividad vs concentración de sustrato; B) La gráfica de

actividad de acuerdo a Lineweaver-Burk y C) La curva de acuerdo al método de Hanes-Wolff. 5. Calcular las constantes cinéticas Km y Vmax, con los datos obtenidos de los tres gráficos

anteriores. 6. Determinar el tipo de inhibición que oxamato ejerce sobre la LDH.

Cuestionario

1. ¿Por qué es importante determinar los valores de Km y Vmax de una enzima? 2. Diseña un protocolo diferente al presentado en está sección para determinar la actividad de la

lactato deshidrogenasa. 3. ¿Cuál fue el blanco de la reacción? 4. ¿En que intervalo de concentración la reacción de la LDH muestra un comportamiento de

primer orden? 5. ¿En que intervalo de concentración la reacción de la LDH muestra un comportamiento de

orden cero? 6. ¿Qué orden de reacción es cuando no es de cero o primer orden? 7. ¿Qué significado tiene? 8. Define Km e indica qué unidades tiene 9. Define Vmax e indica qué unidades tiene 10. ¿Qué tipo de inhibidor es el oxamato? Fundamenta tu respuesta.. 11. ¿Cuáles son los inhibidores naturales de la LDH de músculo? 12. ¿Porqué la célula reduce la actividad de la LDH?

Referencias

• Mathews C. 1992. Bioquímica, 2da edición, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localización QP514.2

• Nelson D. 2004. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 202-233. QH345 L43


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• Voet D, Voet JG. 1992. Bioquímica. Ed. Omega S.A. pp. 342-378. Localización QP514.2 Sitios recomendados para

1. aprender utilizar los conceptos de Km, Vmax • http://csm.jmu.edu/biology/courses/bio220/aotw3.html en la página pulsar la tecla

kinetics_model.xls, después regresa a la página inicial y contesta las preguntas que se te hacen.

• http://www.mhhe.com/biosci/genbio/biolink/j_explorations/ch07expl.htm

Sección 4: Genética

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4. GENÉTICA DETERMINACIÓN DEL TIPO DE HERENCIA EN BASE A FRECUENCIAS

FENOTÍPICAS Y GENOTÍPICAS. Objetivos:

− Entender los principios de la transmisión de los caracteres hereditarios. − Explicar y usar la terminología relevante: dominante, recesivo, portador, mutación,

heterocigoto, homocigoto, síndrome, alelo y locus. − Resolver problemas aplicando las leyes de Mendel: Determinación de frecuencias − Distinguir entre enfermedades autosomales y ligadas al sexo.

Introducción La descripción morfológica o funcional de un organismo vivo en cualquier momento dado de su desarrollo es el fenotipo de ese organismo. Mientras que el genotipo se define como el conjunto de instrucciones o genes, contenidos en su material genético heredable; es decir, la información contenida en las secuencias de su ácido desoxirribonucleico (DNA), que se transmite de generación en generación entre los miembros de una especie. Este conjunto de instrucciones es una amplísima, pero finita, predeterminación de las posibilidades fenotípicas de un organismo. Por otro lado, existen los factores epigenéticos, tales como las influencias o eventos que no están escritos en el material genético heredable de los seres vivos, pero que modifican los fenotipos. Los fenómenos epigenéticos como por ejemplo el ambiente, pueden determinar, en un momento dado, el modo en que se expresan las instrucciones genotípicas y por lo tanto, el fenotipo del individuo. Una característica del genotipo es su heredabilidad. Los mecanismos implicados fueron publicados por Gregor Johann Mendel en 1866. Él identifico ciertos rasgos fenotípicos que se transmiten de manera predecible en plantas de chícharos y Propuso que estos caracteres están determinados por factores genéticos que segregan independientemente, es decir, que se heredan de padres a hijos en forma de unidades de herencia individuales, los genes. Los estudios de Mendel se basaron realizando cruzas entre individuos de líneas puras que diferían en un par de caracteres de fácil identificación fenotípica y la observación del aspecto de la primera generación híbrida (F1 o primera generación filial, formada por plantas monohíbridas). Posteriormente, cruzó las plantas híbridas entre sí y obtuvo la segunda generación filial (F2). Contó el número de individuos de la F2, que presentaron cada uno de los caracteres utilizados que podrían ser comparados, tales como color de las flores, el color y textura de la testa de las semillas y la longitud de los tallos. Mendel, a partir de sus experimentos, concluyó que los chícharos tienen una dotación genética doble. Es decir, que son organismos diploides, en los que existen dos copias o alelos del gen causante de un rasgo fenotípico. En los organismos diploides cada copia alélica proviene de cada uno de los progenitores. Mendel, también postuló que, frecuentemente, una de estas copias en particular puede ser dominante sobre su contraparte heredada del otro progenitor. Cuando en la descendencia se encuentra un alelo recesivo del gen y uno dominante, el fenotipo observado en esta combinación heterocigota, corresponderá al tipo dominante. Para la aparición de un fenotipo recesivo es indispensable la transmisión, por ambos progenitores, de una combinación homocigota de alelos recesivos. Obviamente, la combinación homocigota de las variantes alélicas dominantes resultará en un fenotipo dominante. Las interpretaciones que Mendel dio a sus observaciones han resultado correctas para un tipo de herencia que hoy llamamos Mendeliana, precisamente por manifestarse de la manera en que Mendel lo descubrió. En este caso un rasgo fenotípico está determinado por la combinación de dos copias alélicas de un gen, cada una de ellas en distinto grado de dominancia,


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combinaciones que se heredan en los miembros de una familia en una forma matemáticamente predecible. Con los datos que obtuvo, formuló una explicación teórica con postulados, que ahora constituyen las leyes de la herencia. La primera Ley de Mendel o Ley de la segregación dice que durante la formación de los gametos, los pares de factores se separan o segregan al azar, de manera que cada gameto recibe uno u otro miembro del par con la misma probabilidad. Segunda Ley de Mendel o Ley de la distribución independiente postula que la segregación de diferentes pares de factores se realiza de manera independiente durante la formación de los gametos. Enfermedades genéticas y la herencia mendeliana Se cree que cerca de 400 enfermedades en humanos son resultado de cambios en un solo gene. Muchas de ellas son enfermedades raras, pero discapacitantes que pueden llevar a la muerte del individuo. Aunque las enfermedades genéticas en un individuo son raras, el número total de personas afectadas es significativo, alrededor del 2% de todos los nacimientos al año. Actualmente no existen medios totalmente efectivos de tratamiento o cura para la mayor parte de ellos. Muchos de los desórdenes genéticos pueden ser mantenidos en la población, ya sea por la transmisión de genes desde los padres hacia los hijos o por la aparición de mutaciones. Los cambios en el DNA o en los cromosomas, mutaciones, pueden provenir desde la formación de las células sexuales (óvulos y esperma) o en el estadío temprano del desarrollo del feto. Un ejemplo de esto último es la aparición del síndrome de Down, el cual causa retardo mental, estatura baja y algunos otros cambios. Proviene de un error durante la división celular (meiosis) llevando a contener 47 cromosomas en el niño en lugar de 46, generalmente causado por la disyunción o separación incompleta del cromosoma de uno de los progenitores (cromosoma 21). Los humanos presentamos células diploides en la mayor parte de nuestras células. Con un contenido de 23 pares de cromosomas, donde sólo un par es diferente entre hombres y mujeres y es el que define el sexo. Las mujeres presentan 2 cromosomas X similares, mientras que los varones un cromosoma X y otro más pequeño denominado Y. A los genes que se localizan en el par 23 de cromosomas son a menudo denominados genes ligados al sexo, mientras que los otros 22 son denominados genes autosomales. Todas las enfermedades causadas por el cambio de sólo un gene tiene patrones claros de herencia, lo cual significa que es posible determinar las probabilidades de que alguien herede una condición particular. Tres patrones de herencia están involucrados: Condiciones recesivas, dominantes y ligadas al sexo. Condición recesiva. Para presentar los síntomas de la enfermedad, el individuo debe presentar las dos copias del gen afectado. Su descendencia presentará la enfermedad sólo que el otro padre también sea portador del gen, como en la fibrosis quística (Figura 4.1). Condición dominante. La enfermedad es causada por un alelo dominante, por lo que un individuo sólo tiene que heredar una copia para presentar la enfermedad. Los hijos de padres que presentan la enfermedad, tienen 50% de probabilidades de presentarla también. Un ejemplo grave de está condición es la enfermedad de Huntington, la cual se desarrolla entre los 35 a 45 años, disminuyendo la movilidad motora y ocasionando demencia.


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Figura 4.1. Frecuencia fenotípica de la aparición de la fibrosis quística cuando ambos padres son portadores (progenitores heterozigos). La fibrosis quística es una disfunción o síndrome producido por la alteración en un gen presente en el cromosoma 7. En este ejemplo, la descendencia de progenitores heterozigotos siempre tendrá una distribución de frecuencias NN=25%, cfcf=25% y Ncf=50%.

Condición ligada al sexo. Debido a que los varones sólo poseen un cromosoma X frente a los dos que poseen las mujeres, las enfermedades de un solo gen recesivas localizadas en el cromosoma X, aunque raras, afectan con mayor frecuencia a los hombres que a las mujeres. Como ejemplos tenemos al daltonismo y a la hemofilia. Otro tipo de herencia de gran relevancia médica es la llamada herencia poligénica. Un gran número de enfermedades, entre las cuales destacan el asma, la diabetes y la hipertensión, tienen un componente genético poligénico. Se dice que un rasgo fenotípico es poligénico cuando está determinado por más de un gen; mientras que los ejemplos discutidos anteriormente, son casos de herencia monogénica. Existen otros tipo de herencia que no siguen las reglas mendelianas. Esto ocurre cuando los genes que causan el fenotipo son “móviles”, es decir que a diferencia de los genes que siguen una segregación mendeliana, hay genes que no tienen una residencia o locus fijo en el genoma o cromosoma, lo cual hace imposible predecir su heredabilidad de acuerdo a las leyes de Mendel. Actualmente, se han desarrollado técnicas para la determinación de mutaciones o modificaciones en los cromosomas. Sin embargo, sólo cubren una gama limitada de alteraciones, por lo que el diagnóstico y la prevención es difícil. Para aquéllos en los que hay protocolos de detección de si se es o no portador de una enfermedad congénita, es posible orientarlos sobre el tratamiento, las posibilidades de transmitir la enfermedad a sus hijos y las técnicas de detección una vez que se está esperando a un hijo. Material y equipo Computadora conectada a internet, por cada 2 personas. Libreta y lápiz para anotar. Desarrollo experimental


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Primera parte: Conceptos básicos sobre la herencia. Se utilizará un programa interactivo que fue desarrollado por la compañía Glaxo Smith Kline, el cual se encuentra disponible al público en general a través del siguiente portal:

http://genetics.gsk.com/kids/index_kids.htm 1. Entrar a la página indicada.

2. Hay varias opciones de actividades a realizar, como se observa en la parte izquierda de la pantalla. Se sugiere empezar con genes, después herencia y por último Enfermedades y respuesta a medicamentos. Para realizar cualquiera de las actividades se sigue el mismo protocolo:

A) Pulsar la tecla de la actividad a realizar, por ejemplo genes. Una vez que se despliegue la ventana hay que pulsar el ovalo que dice genes learning activity.

B) La actividad consiste en utilizar los alelos que se proporcionan para que al final se logré construir u obtener un escarabajo como el que se ve en la figura, el cual tiene las siguientes características

A)


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fenotípicas: ojos redondos, color verde y lunares amarillos. Para lograrlo hay que entrar a la actividad a través de teclear el ovalo que dice play the game. Pero se sugiere que antes de comenzar a “jugar” se utilicen las ayudas que se encuentran en las 2 ventanas just the facts, please y how to play.

C) Conforme vas llenando los espacios vacíos, se te dará información adicional. Cuando ya hayas concluido la primera parte, presiona go to the next level, hasta que llegues al último nivel. D) Después puedes regresar a la primera ventana y escoger la siguiente actividad por ejemplo, herencia y/o enfermedades y respuesta a medicamentos. Segunda parte. Problemas de determinación del tipo de herencia en base a frecuencias fenotípicas y genotípicas. Para resolver problemas sobre las leyes de Mendel se recomienda utilizar el simulador de cruzas genéticas que se encuentra disponible en el siguiente portal:

http://www.brooklyn.cuny.edu/bc/ahp/MGInv/MGI.Intro.html 1. Las instrucciones se encuentran al inicio. Brevemente, se te pedirá seleccionar dos

características para un padre y otros dos para otro de los padres. Las tres características disponibles son: Altura de la planta y el color de la vaína y las flores. Para iniciar la simulación pulsa en el texto Plant hybridization.

2. Escoge las características de cada padre. Después presiona el botón que dice Collect peas. Lo que haz hecho es llevar a cabo una cruza genética entre dos plantas con las características que definiste. El producto de la cruza son las semillas.

3. Si siembras las semillas que obtuviste en el punto 2, obtendrás a la progenie (F1) y hasta entonces observarás cuales son sus características fenotípicas, tal y como Gregor Mendel hizo. En la simulación que estás llevando a cabo, aparece otro botón que dice Plant peas. Al pulsar el botón se llenará el recuadro de resultados, en donde encontrarás el número de plantas que presentan cada una de las características fenotípicas de la progenie, además del número total de semillas que se sembraron.

B)


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4. Con los resultados del simulador, calcula la frecuencia con la que el fenotipo ocurre, utiliza los

datos para predecir la frecuencia genotípica de los caracteres que seleccionaste, ayúdate realizando un cuadro de Punnett.

Genes de uno de los padres

Gen

es d

e ot

ro d

e lo

s pa

dres

5. Después tienes la opción de volver a empezar y para ello pulsa el botón que dice Start Again


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Cuestionario

1. ¿Cómo se aplican las Leyes de Mendel a las enfermedades hereditarias en humanos? 2. ¿Cuáles son las características principales de la herencia autosómica dominante, autosómica

recesiva, recesiva ligada al X y dominante ligada al X? 3. ¿Es posible determinar todas las características fenotípicas a través de las reglas de Mendel? 4. Fundamente su respuesta. 5. Dé un ejemplo de una enfermedad autosómica diferente a las señalas en la introducción. 6. Proporcione un ejemplo de una enfermedad ligada al sexo diferente a la indicada en la

introducción. 7. ¿Cuáles son los pasos a seguir para la prevención o tratamiento si se sospecha ser portador

de una enfermedad congénita? 8. ¿Cuáles son los pasos a seguir si su pareja se encuentra embarazada y usted es portador de

una enfermedad congénita? 9. ¿Qué aplicaciones tienen en su práctica profesional o en su vida cotidiana los conceptos

adquiridos al realizar esta práctica? Referencias

• Gardner JE. Garder E. Principios de genética. 1998, 4a edition Ed. Limusa, pp. 390-407. Localización QH581.2 M 65

• Garvin W, Adley C, Dixon B, Frings J, Madden D, Marcussen L, Turner J, Wymer PEO. Unit 4. Issues in human genetics. European initiative for biotechnology education 1995. http://www.reading.ac.uk/NCBE

Sección 5. Estructura, propiedades y función de ácidos nucleicos

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5. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO I: CONJUGACIÓN Objetivos − Identificar al DNA como portador de la información genética − Conocer los mecanismos por los que una bacteria puede adquirir un plásmido. − Reconocer a la conjugación bacteriana como un fenómeno de transferencia horizontal de material

genético. − Entender el mecanismo por el cual se realiza la conjugación bacteriana. Introducción Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico, covalentemente cerrados y generalmente, de tamaño pequeño que se encuentran en muchas especies bacterianas y que se pueden replicar de manera independiente del DNA cromosómico. A diferencia de éste, los plásmidos no son necesarios para la viabilidad general de la célula, pero pueden contener genes que contribuyen a la sobrevivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia a antibióticos, a metales, etcétera. Algunas clases de plásmidos poseen además la propiedad conocida como "replicación relajada", esto es, están presentes en muchas copias por célula, lo que facilita enormemente su aislamiento y su purificación. Una bacteria sólo puede adquirir un plásmido a partir de otra bacteria que lo contenga, ya sea por transmisión vertical o por cualquiera de los tres mecanismos conocidos de transferencia horizontal de material genético. Estos son: la transformación, la transducción y la conjugación. En la transformación, el DNA liberado de una célula bacteriana entra a otra célula, generalmente de la misma especie. En la transducción, un virus bacteriano accidentalmente toma DNA del cromosoma o de un plásmido de la bacteria a la que ha infectado y lo inyecta a otras bacterias. La conjugación bacteriana es un proceso de transferencia de material genético, en el que la información genética de un plásmido con o sin parte del cromosoma bacteriano es transferido a otra célula (Figura 5.1). Este proceso, a diferencia de la transducción, tiene como condición esencial el contacto celular. A la célula que aporta el material genético se le llama donadora y aquella que lo recibe, receptora. No todos los plásmidos pueden llevar a cabo la conjugación, es decir ser conjugativos, solamente aquellos que poseen un grupo de genes denominados genes tra. Dentro de este grupo de plámidos se encuentra el factor de fertilidad o plásmido F de E. coli. El plásmido F confiere a la célula bacteriana la capacidad de conjugarse con otra célula que no lo posea. El plásmido F se presenta en una sola copia por cromosoma bacteriano. Cuando se integra al cromosoma bacteriano, suprime su sistema de replicación y se replica como parte del cromosoma bacteriano. El plásmido F contiene más de 40 genes tra, la mayoría de los cuales son necesarios para la construcción de un organelo llamado pili sexual o pili F constituido por una proteína, la pilina, codificada por uno de los genes tra. El Pili F es necesario para promover el contacto entre las bacterias donadora y receptora y para la formación de un puente citoplasmático por donde pasará el material genético. La transferencia se inicia a partir de un sitio determinado en el plásmido y que forma parte de los genes tra, denominado oriT


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Figura 5.1. Conjugación bacteriana. Paso del plásmido F de una célula donadora a una receptora a través del conducto proteico denominado pili. Al centro se muestra como sólo una de las hebras del DNA del plásmido se inserta en la célula hospedera, por lo que la DNA polimerasa de cada una de las bacterias se encarga de sintetizar la hebra faltante. Al final ambas células presentan al plásmido F. Algunos plásmidos no son capaces de llevar a cabo la conjugación por sí mismos, pero pueden ser transferidos (plásmidos movilizables) a otras bacterias cuando coexisten con plásmidos con genes tra, debido a que contienen un grupo de genes denominados genes mob, los cuales incluyen un sitio oriT, pero carecen de otros genes necesarios para la conjugación, incluyendo los que codifican para la formación del pili.

En relación al plásmido F, existen cuatro tipos de cepas bacterianas: Cepa F-. Célula bacteriana que no posee un plásmido F, y que actúa como célula receptora en la conjugación. Cepa F+. Célula bacteriana que posee un plásmido F independiente del cromosoma bacteriano, actúa como célula donadora en la conjugación y transfiere al plásmido F a la célula receptora transformándola en célula F+. Cepa Hfr (High frequency of recombination). Bacteria que posee un plásmido F integrado a su cromosoma. Las cepas Hfr tienen la capacidad de transferir porciones de su cromosoma (célula donadora) y por ello confieren alta frecuencia de recombinación. No transfieren el plásmido F, por lo que al término de la conjugación de las células receptora permanece como F. Cepa F’. Célula bacteriana que posee un plásmido F extracromasómico, pero que antes estuvo integrado al cromosoma y que se encidió llevando consigo genes bacterianos. Actúa como célula donadora en la conjugación y transfiere el factor F junto con los genes bacterianos, transformando a la célula receptora en una célula F′, la cual será un diploide parcial o merocigoto. Es decir, tendrá dos copias de los genes bacterianos que están presentes en el plásmido F′. A ese tipo de transferencia se le conoce como sex-ducción. Una bacteria Hfr transfiere los genes bacterianos a una célula F- en un tiempo constante. Se calcula en aproximadamente 100 minutos la transferencia total del cromosoma de Escherichia coli. Esta característica ha sido utilizada en el mapeo genético localizando un determinado marcador genético en un tiempo dado. En esta práctica se comprobará la conjugación bacteriana mediante la transferencia de un marcador genético, la resistencia a la kanamicina. El marcador genético de selección que se utilizará para la cepa receptora será la resistencia a la estreptomicina.


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Material biológico Un cultivo de E. coli JM1452StrR (cepa receptora), cultivada por una noche en caldo Luria a 37ºC. Un cultivo de E. coli W3110/F´KmTn3 (cepa donadora), cultivada por una noche en caldo Luria a 37ºC.

Materiales y equipo 1 tubo 13 X 100 mm con 1 mL de caldo Luria estéril 5 cajas Petri con medio Luria-agar-2% estreptomicina (25 µg/ml) 2 cajas Petri con medio Luria-agar-2% sulfato de kanamicina (30 µg/ml) 3 pipetas de 1 mL estériles 100 palillos de madera estériles 1 asa bacteriológica 1 propipeta 1 mechero Incubadora a 37°C Baño María a 37°C Refrigerador a 4°C

Por grupo para controles de las cepas − 1 cajas Petri con medio Luria-agar 2%-estreptomicina (25 µg/ml) − 1 cajas Petri con medio Luria-agar-2% sulfato de kanamicina (30 µg/ml)

Desarrollo de la práctica

1. En condiciones estériles tomar el tubo de 13X100 con 1 mL de caldo Luria estéril y hacer la siguiente mezcla de conjugación: 0.5 mL del cultivo de E. coli JM1452Str más 0.2 mL del cultivo E. coli W3110/F´KmTn3 (Figura 5.2).

2. Incubar el tubo a 37ºC SIN AGITACIÓN durante 30 min. 3. Dividir una caja Petri con medio Luria-agar 2% sulfato de estreptomicina en 3 partes. Marcar la

zona 1 como “bacteria receptora”, la zona 2” como conjugación” y la zona 3 como “bacteria donadora”. Colocar una gota pequeña de cada cultivo en el sitio correspondiente y dejar que se absorba.

4. Incubar a 37ºC durante 24 h o hasta que aparezca crecimiento en la zona de conjugación. 5. Testigo por grupo: Dividir una caja petri con Luria-agar 2% sulfato de estreptomicina y una

caja petri con Luria-agar-2% sulfato de kanamicina. Sembrar por estría las cepas donadora y receptora en cada mitad respectivamente. Incubar a 37°C durante 24 h. Al observar crecimiento refrigerar las cajas.

6. Después del tiempo de incubación trabajar con la caja del paso 3. Tomar una asada de las zonas ”receptora y de “conjugación” y sembrar por estría en una caja petri con Luria-agar-2% sulfato de estreptomicina, cada una en una caja diferente. Incubar a 37ºC durante 24 h.

7. De las colonias aisladas, parchar colonias de cada caja en una caja Petri con Luria-agar-2% sulfato de estreptomicina y 50 colonias en otra de Luria-agar 2%-estreptomicina y después la replica en la caja de Luria-agar-2% sulfato de kanamicina. Parchar consiste en tomar bacterias de una colonia aislada al picar con un palillo la colonia y luego picar una caja de medio de cultivo para así transferir la bacteria. En la práctica una colonia se transferirá con el palillo del cultivo de bacterias aisladas a dos diferentes cajas Petri, empezando por la que contiene el antibiótico estreptomicina. Para facilitar y agilizar el parchado, marcar divisiones por la parte de atrás de las 4 cajas (ver Figura).

8. Incubar a 37ºC durante 24 h o hasta que aparezca crecimiento. Observar y analizar los resultados. Reportar el porcentaje de colonias transconjugantes. Refrigerar las cajas.


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Incubar 24 h, 37°C

Sembrar por estría las cepas receptora y transconjugante en Agar Luria-estreptomicina

Incubar 24 a 37°C

Cepa receptora Cepa transconjugante

Marcar las cajas

Figura 5.2. Esquema experimental de conjugación bacteriana. Producción de una cepa transconjugante, a partir de una cepa receptora resistente a estreptomicina, con una cepa que es capaz de proporcionar la información genética para la resistencia a kanamicina. No olvidar realizar hacer los testigos.

E. coli JM1452Str cepa receptora

E. coli W3110/F´KmTn3 cepa donadora

Mezcla de conjugación

Incubar 30 min a 37°C sin agitación

0.5 mL 0.2 mL

Luria-Estreptomicina

Luria- Kanamicina Luria-Estreptomicina Luria-Estreptomicina Luria-Kanamicina

Parchar 50 colonias


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Cuestionario

1. ¿Qué es un plásmido? 2. ¿Cuáles son los mecanismos de transferencia horizontal de material genético en bacterias? 3. ¿Qué es la conjugación? 4. ¿Qué diferencia existe entre la conjugación y los otros mecanismos de transferencia horizontal

de material genético? 5. ¿Cuáles son las principales características del plásmido F y qué genes contiene? 6. ¿Cuáles son los genes del plásmido F necesarios para la transferencia de material genético

por conjugación y para qué codifican? 7. ¿De acuerdo al plásmido F cuántos tipos de cepas bacterianas se conocen? y ¿qué diferencia

existe entre ellas? 8. Señale que tipo de transconjugantes se obtiene en cada una de las siguientes “cruzas”:

a) F+ X F- b) F’ X F- c) Hfr X F-

9. ¿Qué características tiene las cepas empleadas en la práctica? 10. ¿Por qué tanto la cepa donadora como la receptora tienen un marcador de resistencia? 11. ¿Hubo crecimiento de las cepas empleadas en la práctica en las cajas controles con

antibióticos? ¿Por qué son importantes estas cajas control? 12. ¿Por qué se parchan la cepa receptora y la transconjugante tanto en medio con

estreptomicina como kanamicina? ¿Qué resultados se obtuvieron en esas cajas? 13. ¿Cómo se comprobó la conjugación en la práctica? ¿Qué porcentaje de bacterias

transconjugantes se obtuvo? 14. ¿Cuál es el genotipo de la cepa transconjugante obtenida en la práctica? 15. ¿Qué diferencias existen entre que un plásmido sea conjugativo o sea movilizable? 16. ¿La conjugación puede realizarse entre las bacterias Gram positivas o solo se da en las

bacterias Gram negativas? 17. ¿Con qué frecuencia y dónde se realiza la conjugación en forma natural? 18. ¿Cuál es la importancia biológica de la conjugación? 19. Indique los mecanismos por los que se da la resistencia de las bacterias a los antibióticos

utilizados en la práctica. 20. ¿Qué aplicaciones tienen en su práctica profesional o en su vida cotidiana los conceptos

adquiridos al realizar esta práctica?

Referencias • Brown T.A. Genetics. A Molecular Approach. 2nd ed. Chapman & Hall. USA. 1992. pp 467. • Lewin B. Genes V. Oxford University Press. USA. 1994. pp 1272. • Genética General, Manual de prácticas de laboratorio. Regulación genética en el operón lac.

Facultad de Química, UNAM. Ciudad Universitaria. México, 2002.


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TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II: TRANSFORMACIÓN

Objetivos − Conocer el fundamento para transformar células bacterianas. − Realizar la técnica de transformación bacteriana. − Aprender a identificar células transformantes mediante su fenotipo. − Conocer la definición de organismo transgénico. − Conocer las aplicaciones de la transformación bacteriana: beneficios y riesgos.

Introducción

Desde épocas antiguas, el hombre ha seleccionado animales y plantas con características fenotípicas deseables. La domesticación ha proporcionado importantes beneficios a la humanidad incrementando la producción de insumos para consumo humano, por ejemplo, hace 100 años una vaca producía en promedio 2000 a 3000 litros de leche al año. Actualmente, las vacas Holstein proporcionan un promedio de 6000 litros al año, y las mejores vacas son capaces de producir de 8000 a 10,000. Asimismo, una gallina hace 100 años producía en promedio 70 huevos al año, en este siglo las mejores razas producen cerca de 250 al año. Las técnicas convencionales de reproducción han llevado a nuevas combinaciones de genes. Sin embargo, la recombinación cruzada entre miembros de especies distintas no ha sido exitosa. Por ejemplo, la cruza entre la yegua y el burro, llevó a producir a la mula, organismo estéril. Así, el número de combinaciones nuevas es limitado, debido a que los genes pueden recombinarse sólo entre los miembros de la misma especie o con organismos muy relacionados. La barreras impenetrables entre especies han sido parcialmente superadas con el surgimiento de técnicas de manipulación y de selección del material genético, la ingeniería genética. Debido a que el DNA contiene un código genético esencialmente similar para todos los organismos, en principio se pueden transferir secuencias de genes de organismos totalmente no relacionados y producir organismos con características útiles y particulares, que de otra manera sería imposible de obtener, los denominados organismos transgénicos. Un número amplio de genes ha sido identificado y caracterizado, conocimiento que abre la posibilidad de buscar métodos para introducir o modificar un gene para adquirir una característica deseable, como por ejemplo, para curar enfermedades. No obstante los posibles beneficios, hay que considerar que al introducir genes no propios al huésped, se pueden ocasionar efectos no deseados, como que la característica introducida lleve a una respuesta general alterada y, por tanto, modifique la fisiología y sobrevivencia del individuo, o bien que se “escape” la nueva información de manera indiscriminada a otros organismos. Requisitos para construir un vector de clonación Aún cuando el código genético es básicamente el mismo para todos los organismos, los detalles finos del control genético difieren. Un gene bacteriano no siempre puede expresarse eficientemente si es introducido en una célula eucarionte. Para la producción de un organismo genéticamente modificado se tienen que hacer algunas consideraciones, producir o construir un transgene, es decir el gene de interés más una parte extra de DNA que controle correctamente la función del gene en el nuevo huésped. Por ejemplo, para que un gen procarionte se pueda expresar en un organismo eucarionte se le debe agregar una región promotora en el extremo 5’ del gen para que sea reconocido por el aparato transcripcional del organismo receptor. Asimismo, se debe añadir una secuencia de poli A en la porción 3’ del gen para que el RNAm pueda ser traducido.


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Figura 5.3. Vector de clonación pET-24. Se muestran algunas características del vector, como el sitio origen de la transcripción (ori), el sitio múltiple de clonación (SMC), el sitio que confiere resistencia a kanamicina, KanR; fl ori, origen de replicación fl y el sitio que servirá para controlar la expresión del transgene una vez que sea insertado en el sitio múltiple de clonación, el sitio de unión al represor lacI. Los plásmidos poseen un interés singular en la Ingeniería Genética por ser uno de los sistemas vectores más sencillos de usar. Un vector de clonación es un sistema que permite introducir en una célula hospedera un fragmento de DNA que se pretende clonar (obtener múltiples copias); en esta célula hospedera el vector se replica y se expresa. La molécula que resulta de la unión de un DNA vector con el DNA de interés (inserto) se denomina molécula vector recombinante. Para ser utilizado como vector de clonación, un plásmido ideal debe poseer al menos tres características (Figura 5.3): 1) Debe tener su propio origen de replicación y, por tanto, la capacidad de replicación autónoma e independiente del genoma del hospedero. 2) Debe tener un sitio de clonación múltiple (SCM) que permita la apertura del DNA con enzimas de restricción (enzimas que cortan secuencias internas de DNA de manera específica) y hace posible la clonación de insertos de DNA en la forma y orientación deseada. 3) Debe poseer marcadores genéticos seleccionables que permitan aislar a las células hospederas que contengan al vector, generalmente resistencia a un antibiótico. La mayoría de los plásmidos naturales no cumplen todas estas condiciones, por lo que una primera tarea de la Ingeniería Genética ha consistido en la construcción de plásmidos artificiales, combinando en una misma molécula diversos rasgos útiles procedentes de los plásmidos naturales. La presencia en el plásmido del gen de resistencia a ampicilina, kanamicina o tetracilina permite seleccionar las bacterias que portan estos plásmidos, gracias a su capacidad para crecer en presencia de dicho antibiótico. Adicionalmente, hay que considerar que muchos genes se expresan sólo bajo ciertas circunstancias metabólicas y/o en tejidos específicos, por lo que usualmente es necesario sustituir el promotor del


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donador por uno que asegure su expresión, denominados promotores fuertes, que también pueden ser inducibles bajo ciertas condiciones de crecimiento. Transformación Existen varias técnicas para la introducción del transgene en la célula u organismo, como son la microinyección, la infección de una célula huésped con virus que contenga al vector o bacterias. En este último caso Agrobacterium tumefaciens es capaz de infectar a plantas y producir tumores, el factor Ti ocasiona los síntomas. Sin embargo, al removerlos e incluir en ese sitio el transgene, se conduce a la expresión del transgene en la planta. En el caso de la transformación de bacterias, generalmente se introduce el DNA extraño por microelectroporación o por choque térmico. En el caso del choque térmico, las bacterias que serán las hospederas son pre-tratadas con agentes que ocasionan la disminución en su permeabilidad membranal como son un aumento en la temperatura, así como de iones que se encargan de cambiar la carga eléctrica de la membrana al recubrir las cabezas polares de lípidos (por ejemplo con iones Ca2+), lo que disminuye la repulsión de cargas eléctricas entre los fosfatos de los nucleótidos y la membrana y además facilita la entrada del plásmido al interior celular. A las células que han recibido un tratamiento apropiado para llevar a cabo la introducción de material genético se denominan células competentes. Posteriormente a la introducción del material genético a las células competentes, se disminuye la temperatura y se diluye el calcio, con lo que se restaura la permeabilidad membranal. Al colocarlas en una condición óptima de crecimiento se obtienen las células transformantes. En la práctica utilizaremos el vector recombinante que se muestra en la Figura 5.4, en donde se encuentra insertado el gen de la β-lactamasa. Se realizará la transformación mediante la técnica de choque térmico y la resistencia a kanamicina se utilizará como indicador de que las células son transformantes.

Figura 5.4. Vector recombinante pET-TEM-1. El vector pET24 (Figura 5.3) fue utilizado para la construcción del vector pET-TEM-1. Se inserto el gen que codifica para la β-lactamasa en el sitio de clonación múltiple del vector pET24. El transgene, ompA-βlac, contiene la secuencia completa de la proteína TEM-1 β-lactamasa. Adicionalmente se colocó hacia la región 5’ del gen, a la secuencia que codifica para la secuencia señal o de tránsito de una proteína que se encuentra en la membrana externa de bacterias, en este caso la ompA. A diferencia de la proteína OmpA, la β-lactamasa es una enzima soluble, por lo que la secuencia señal permitirá que la bacteria transformante secrete a la enzima.


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Material biológico Células competentes de E. coli Plásmido PET-TEM-1 Materiales y equipo 2 cajas Petri con medio LB/Kanamicina (30 µg/mL) Tubos de microfuga de 1.5 mL Varilla de vidrio en forma de L Recipiente para hielo Mechero Bunsen Micropipeta de 100-1000µL Micropipeta de 10-100 µL Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 µL estériles Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 µL estériles Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 µL estériles Material por grupo Baño de incubación a 42°C Incubadora con agitación a 37°C Reactivos

− Medio SOC. Medio Luria adicionado con 20 mM Glucosa. 5 mL por grupo. Desarrollo experimental Las células competentes se proporcionarán congeladas. En el apéndice se encuentra el protocolo de preparación de las células competentes. Preparativos

1. Revisar y/o equilibrar el baño de incubación a 42°C. 2. Colocar el medio SOC a temperatura ambiente. 3. Se sugiere colocar las placas de Agar-LB-Kanamicina en la incubadora a 37°C por 30 min

antes del plaqueo. Transformación de células competentes con el vector PET-TEM-1 por el método de choque térmico.

1. Tomar un tubo de células competentes del congelador y colocarlas directamente en el hielo. Descongelar las células competentes en el hielo (las células competentes son muy sensibles a los cambios de temperatura).

2. Añadir 1 a 5 µL (1 a 50 ηg) del plásmido a un microtubo que contiene 100 µL de células competentes.

3. Mezclar invirtiendo el tubo. 4. Dejar en hielo por 30 minutos. 5. Dar choque térmico a 42°C durante 45 segundos NO AGITAR. 6. Agregar 450 µL de medio SOC e incubar por 60 minutos a 37°C con agitación (225 a 250

rpm). 7. Si es necesario, concentrar las células por centrifugación a 14,000 rpm por 1 min. Eliminar el

sobrenadante y resuspender el paquete celular en 100 µL de medio SOC. 8. Esparcir los 100 µL de las bacterias transformadas, en las cajas con el medio de selección

(Agar-LB-kanamicina), ayudados con una varilla de vidrio. 9. Incubar a 37°C por 24 h. Observar crecimiento y guardar la caja a 4°C. 10. Como control negativo incubar 100 µL de células competentes en una caja con LB-

Kanamicina por 24 h a 37°C.


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Cuestionario 1. ¿Qué es un organismo transgénico? 2. ¿Cuáles son las principales diferencias entre los métodos de reproducción asistida y la de

producción de organismos transgénicos para la producción de organismos mejorados? 3. ¿Cuáles son las consideraciones éticas que consideras se deben de tomar en cuenta para

producir los organismos transgénicos? 4. ¿Qué es un vector de clonación? 5. ¿Cuáles son los requisitos que debe cumplir un vector de clonación para ser utilizado para

transformar a un organismo? 6. ¿Cuál es el método de transformación que se utilizará en la práctica? 7. Describe al menos otros dos métodos para transformar células ya sea de animales, hongos o

plantas. 8. ¿Cuál fue el marcador de selección de cepas transformantes que se utilizó en la práctica? 9. Después de obtener un organismo transgénico, ¿cuáles son los cuidados que se deben tener

para su manipulación o almacenamiento? Referencias

• Devlin T. Biochemistry. 1992 Ed. Wiley- Liss, pp. 768-773. Localización QP514.2 • Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003 DNA Science. A first course. 2nd edition. Cold spring

Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA. Localización QH442. • Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 279-

317. QH345 L43 • Seidman C, Brent R. 1998. Introduction of plasmid DNA into cells. Current protocols in protein

science. A.4D.1-A.4D.2. • Sosa-Peinado A. Mustafi D, Makinen MW. 2000. Overexpression and biosynthetic deuterium

enrichment of TEM-1 beta-lactamase for structural characterization by magnetic resonance methods. Protein Expression & Purification 19: 235-45.

• Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed. Reverté, pp.745-773. • http://www.colvema.org/PDF/amg1.pdf • http://www.revista.unam.mx/vol.1/num3/art3/ • http://es.geocities.com/picodelobo/transgenesis.html


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TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II: AISLAMIENTO DE PLÁSMIDOS

Objetivos

− Conocer los fundamentos para la purificación del DNA plasmídico y su separación del DNA genómico.

− Realizar el aislamiento del DNA plasmídico.

Introducción Desde finales de la década de los años 70 del siglo pasado, se desarrolló un gran número de métodos de aislamiento de plásmidos. La mayoría tomando en cuenta las diferencias topológicas entre los plásmidos circulares y los fragmentos cromosomales lineales, así como el tamaño de ambos. Cuando los puentes de hidrógeno entre las cadenas complementarias del DNA del plásmido circular se rompen, ya sea por calentamiento o por un pH alcalino, las cadenas permanecen cercanas ya que el enrollamiento de las dos cadenas no se ha perturbado grandemente. En contraste, las cadenas lineales o rotas de DNA se liberan o separan completamente. Si una mezcla de plásmido desnaturalizado y de DNA cromosomal se renaturalizan rápidamente ya sea por enfriamiento o al restaurar el pH neutro de la solución, la fidelidad de la reasociación es substancialmente diferente para ambas macromoléculas. La renaturalización de los plásmidos circulares es rápida debido a que las cadenas están próximas. Mientras que, las moléculas lineales de DNA se renaturalizan menos precisamente, formando redes de DNA o agregados que pueden ser removidos de la suspensión por centrifugación. El plásmido permanece en la solución y puede ser precipitado con alcohol después de que el DNA cromosomal ha sido removido.

Material biológico Células de E. coli transformante obtenidas en la práctica anterior. Materiales y equipo Tubos para microfuga Recipiente para hielo Microcentrifuga Micropipeta de 100-1000 µL Micropipeta de 20-200 µL Micropipeta de 0.5-10 µL Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 µL Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 µL Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 µL Reactivos

− Tubo de ensayo de 16X150 mm con 3 mL de medio Luria-Kanamicina (30 µg/mL) − Solución GTE. 50 mM Glucosa, 25 mM Tris/HCl pH 8.0 y EDTA 10 mM pH 8.0. − 3 M Acetato de potasio pH 4.8 − 70% Etanol − Isopropanol − 10 N NaOH − 10% SDS − Para preparar 500 µL de solución de lisis (0.2 N NaOH y 1% SDS p/v), tomar 10 µL de 10 N

NaOH y 50 µL 10% SDS, aforar con agua destilada. De preferencia cada equipo deberá hacerla justo antes de usarla.

Desarrollo experimental (Figura 5.5) Trabajo previo


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1. Inocular una colonia de las células transformadas en 3 mL de medio Luria que contenga kanamicina a una concentración de 30 µg/mL, e incubar a 37°C por 12 h.

Obtención de plásmido por el método de lisis alcalina

2. Tomar la mitad del cultivo y colocarlo en 1 tubo de microfuga de 1.5 mL y centrifugar a 10,000 rpm por 1 min a 4°C. Descartar el sobrenadante eliminando totalmente el medio Luria. Repetir este paso en el mismo tubo.

3. Eliminar el sobrenadante por decantación. 4. Resuspender el paquete celular en 300 µL de solución GTE fría, agitando en el vórtex. Incubar

a temperatura ambiente por 5 minutos, preparar la solución de lisis durante este tiempo de incubación.

5. Adicionar 300 µL de la solución de lisis. Mezclar suavemente por inversión del tubo. IMPORTANTE no agitar en el vórtex. Incubar en hielo por 5 min.

6. Agregar 300 µL de la solución fría de acetato de potasio 3 M, pH 4.8 y mezclar suavemente por inversión del tubo. Incubar en hielo por 5 min.

7. Centrifugar a 12,000 rpm durante 5 min a 4°C. 8. Separar el sobrenadante en un tubo limpio y adicionar un volumen igual de isopropanol frío. 9. Incubar por 20 min a -20°C. 10. Centrifugar a 12,000 rpm por 5 min, a 4°C. 11. Eliminar el sobrenadante y para lavar el DNA añadir 1 mL de etanol al 70% y centrifugar a

12,000 rpm durante 5 min. 12. Remover el sobrenadante por decantación y eliminar el etanol residual por evaporación a

temperatura ambiente (aproximadamente 5 a 10 min). 13. Resuspender el DNA en 30 µL de agua estéril, guardar a –20°C.


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Repetir a. y b. en el mismo tubo con el resto del cultivo

Células transformantes

Inocular Medio LB + Kanamicina

Incubar a 37 0C / agitación durante 12- 16 h

a. Tomar 1.5 mL del cultivo y centrifugar

b. Eliminar el sobrenadante

Resuspender el paquete celular con sol. GTE fría.

Adicionar sol. de lisis

Agitar e incubar por 1 a 5 min a Tamb

Mezclar por inversión (no agitar). Incubar en hielo máximo 5 min.

Adicionar sol. de acetato de potasio fría

Mezclar por inversión (no agitar).

Incubar en hielo máximo 5 min.

Centrifugar y tomar sobrenadante

Adicionar isopropanol (v/v)

Incubar en hielo por 20 min y centrifugar.

Añadir etanol al 70%, agitar en vórtex Centrifugar

Resuspender el DNA en 30 µL de agua estéril.

Eliminar sobrenadante por decantación y eliminar el etanol residual por evaporación

Eliminar el sobrenadante

Figura 5.5. Protocolo de obtención de DNA plasmídico a partir de las células transformantes que se obtuvieron en la práctica anterior.


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Cuestionario 1. ¿Cuáles son las propiedades del DNA plasmídico que nos permiten separarlos del DNA

cromosomal o genómico? 2. Explica por qué se usa NaOH y SDS, acetato de potasio y etanol en la purificación de

plasmidos. 3. ¿Cuáles son los principales contaminantes de una preparación de plásmidos? 4. ¿Cómo los eliminas? 5. ¿Cuáles son los usos que se le dan a los plásmidos una vez purificados? 6. ¿Cuáles son los métodos utilizados para cuantificar a los nucleótidos? 7. ¿Qué experimento realizarías para determinar si el plásmido que obtuviste se encuentra puro? 8. ¿Porqué a veces es necesario utilizar RNAasa para visualizar el DNA plasmídico?

Referencias • Tümmler B y Mekus F. Genomic DNA: Purification. Encyclopedia of life sciences & 2005,

John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net. • Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Reverté, pp.745-773. • Watson JD, Gilman M, Witkowski JA, Zoller M. Recombinant DNA. Segunda edición, WH

Freeman.


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TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II:

ENSAYOS DE RESTRICCIÓN DE PLÁSMIDO. Objetivos

− − Conocer el principio de separación y detección de ácidos nucleicos en geles de agarosa. − Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar ácidos nucleicos. − Determinar el tamaño de fragmentos de ácidos nucleicos separados en geles de agarosa. − Conocer la utilidad de las enzimas de restricción en la transformación genética y la

biotecnología.

Introducción Las endonucleasas de restricción se caracterizan por su habilidad de reconocer una secuencia usualmente de 4 a 6 pares de bases (pb) y cortarla específicamente en ambas cadenas de la molécula de DNA. Existen tres tipos de endonucleasas, las de tipo II son las que se utilizan en biología molecular, debido a que son capaces de cortar sobre la secuencia que reconocen y a que han perdido su capacidad de ser metilasas de DNA. Las endonucleasas se denominan enzimas de restricción, debido a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasión por bacteriofagos, es decir, restringen la invasión por el DNA viral. Las enzimas de restricción generalmente reconocen secuencias palindrómicas, es decir segmentos de DNA que se leen igual de derecha a izquierda que de izquierda a derecha. Algunas enzimas de restricción (EcoRI, HindIII)rompen las dos cadenas del DNA en posiciones no simétricas del centro del palíndrome y producen fragmentos con secuencias complementarias de una cadena, denominados extremos cohesivos. Mientras que otras enzimas (HaeIII) cortan exactamente sobre los dos ejes de simetría, produciendo extremos romos (Figura 5.6).

EcoRI HindIII HaeIII

Figura 5.6. Dos diferentes formas de corte de las enzimas de restricción en una secuencia de DNA. Las dos primeras enzimas EcoRI y HindIII producen extremos cohesivos al cortar la secuencia que se muestra y en el último ejemplo, HaeIII produce fragmentos de DNA con extremos romos. Las primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del género y especie de la bacteria de donde se aisló y se escribe en itálicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la enzima proviene de Escherichia coli.

Las enzimas de restricción son una herramienta experimental muy importante en el desarrollo de las técnicas para el análisis y la manipulación de los ácidos nucleicos. Han sido utilizadas en la eliminación de secuencias genómicas desde un nucleótido hasta cientos de bases, así como en la introducción de secuencias distintas a un genoma, lo que ha permitido la producción de proteínas recombinantes. Diferentes factores afectan la reacción de restricción por endonucleasas. Se inhiben usualmente con los contaminantes que se pueden encontrar en las preparaciones de DNA, tales como otras proteínas, el fenol, el cloroformo, el etanol, el EDTA, el SDS y la alta concentración de sales. Los


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efectos de la contaminación pueden disminuir si se aumenta la cantidad de enzima añadida a la reacción, arriba de 10 a 20 U /µg DNA, incrementando el volumen de reacción, lo que diluye a los inhibidores potenciales, o aumentando la duración de la incubación. La digestión del DNA genómico puede facilitarse por la adición de policationes como espermidina, la cual actúa uniendo contaminantes cargados negativamente. Cuando un plásmido está superenrollado es necesario añadir más enzima o bien desnaturalizarlo.

El tratamiento de una molécula de DNA con enzimas de restricción permite producir fragmentos definidos que pueden ser separados mediante electroforesis horizontal. En soluciones alcalinas, los fosfatos de los nucleótidos se encuentran cargados negativamente, entonces al imponer un campo eléctrico, estas moléculas migran hacia el electrodo positivo o ánodo. Cuando la migración toma lugar en un gel, las moléculas de DNA se separan de acuerdo a su tamaño, en donde las moléculas pequeñas se mueven más rápidamente a través del poro del gel que las más grandes. Generalmente, un segmento de DNA contiene secuencias blanco para varias enzimas de restricción. Si un fragmento de DNA a analizar es lo suficientemente extenso, se puede cortar con una o varias enzimas de restricción, de manera individual o en mezclas. Un diagrama de una molécula de DNA en donde se muestran los sitios de corte de las enzimas de restricción se denomina mapa de restricción. El análisis de los mapas de restricción constituyen una importante herramienta para localizar secuencias de bases específicas en un cromosoma y para estimar el grado de diferencias entre cromosomas relacionados. Existen varias aplicaciones de los mapas de restricción, como la obtención de los patrones de RFLP (“Restriction Fragment Length Polymorphism”) utilizados en las pruebas de paternidad, así como también en la identificación de individuos a partir de evidencias forenses como saliva, sangre, semen, cabellos etc. En la práctica se utilizarán dos enzimas de restricción en una mezcla, debido a que el vector utilizado en la transformación no presenta dos sitios de restricción para la misma enzima (Figuras 5.3 y 5.4). De tal manera que sólo se podrá liberar el fragmento de DNA de interés al cortar por los extremos con dos enzimas distintas. Material biológico DNA plasmídico purificado de la práctica anterior. Materiales y equipo Recipiente para hielo Tubos para microfuga Recipientes para teñir el gel. Micropipeta de 100-1000 µL Micropipeta de 20-200 µL Micropipeta de 0.5-10 µL Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 10 µL estériles Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 200 µL estériles Caja de puntas para micropipeta con capacidad de 1000 µL estériles Cámara de electroforesis horizontal Fuente de poder Vórtex Horno de microondas Microfuga Baño de incubación a 37°C Baño de incubación o bloque de calentamiento a 100°C Transiluminador


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Pantalla de acrílico Cámara fotográfica Reactivos

− NdeI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a –20°C. − BamHI. Solicitar al profesor justo antes de usarse. Se almacenan a –20°C. − Amortiguador TANGO de restricción. Reactivo que es proporcionado por el proveedor junto

con la enzima NdeI. − TAE 1X. Ver preparación en el apéndice. − Agarosa − Amortiguador de muestra − Estándar de peso molecular − Bromuro de etidio 10 mg/mL (GIBCO BRL)

Desarrollo experimental Ensayo de restricción

1. Etiquetar dos tubos de microfuga. 2. Colocar en cada tubo los siguientes reactivos: 10 µL de Plásmido y 3 µL de Amortiguador

Tango10X 3. Incubar a 100°C por 5 min. 4. Transferir al recipiente con hielo e incubar por 5 min. 5. Pasado el tiempo de incubación añadir al tubo 1 solo una de las dos enzimas de restricción

que fueron proporcionadas, se sugiere que un par de equipos coloque 1 µL BamHI y otro par de equipos 1 µL NdeI. Mezclar suavemente después de añadir la enzima.

6. Al tubo 2 añadir 1 µL de BamHI y 1µL de NdeI. Mezclar suavemente con ligeros golpes al tubo de microfuga.

7. Centrifugar los dos tubos de microfuga por 5 segundos, para que todo el líquido se deposite en el fondo.

8. Incubar a 37°C por 1.5 h. 9. Se sugiere añadir 0,5 µl de una solución de RNasa (1 µg/ml) e incubar 30 min a 37°C. Este

procedimiento eliminará el RNA y facilitará la visualización de los productos de la restricción en el gel.

10. Al término de la incubación colocar los tubos en hielo. 11. Tomar una alícuota de 6 µL de cada tubo para correr en un gel de agarosa.

Preparación del gel Durante el tiempo de incubación del DNA con las enzimas de restricción, preparar el gel de agarosa, se sugiere utilizar 1 gel por cada 2 equipos y utilizar el peine para hacer 8 pozos o carriles en el gel. Sellar con cinta adhesiva el contorno de la bandeja del gel, colocar el peine (Figura 5.7 A). Preparar un gel de agarosa al 1.2%. Pesar 0.42 g agarosa en un matraz Erlenmeyer, añadir 35 mL de amortiguador TAE 1X, tapar con algodón o una servitoalla. Se calienta la mezcla en microondas por 1 a 3 min o hasta que la agarosa se disuelva bien. Esperar a que la temperatura baje hasta 45-60°C, añadir entonces 2 µL bromuro de etidio (MANEJAR CON GUANTES, REACTIVO MUTAGÉNICO) para obtener una concentración final de 0.5 µg/mL, agitar el matraz para mezclar. Depositar el gel en la bandeja de la cámara (Figura 5.7 B), evitando la formación de burbujas. Se deja enfriar hasta que polimerice (aproximadamente 20 min). Quitar la cinta adhesiva y colocar la bandeja con el gel en la cámara de electroforesis. Añadir el amortiguador TAE en la cámara. La cámara de electroforesis se llena con aproximadamente 275 mL de TAE 1X o hasta que se cubran los pozos.

A


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Figura 5.7. Preparación de un gel de agarosa. A. Sellado de la bandeja que contendrá el gel y B. Adición de la

agarosa disuelta en TBE. Preparación y cargado de las muestras. 1. Etiquetar 4 tubos de microfuga: E, P, R1, R2 2. Añadir los reactivos como se indica en la tabla 5.1. Usar una punta de micropipeta distinta

para cada tubo, de esta manera se evita la contaminación cruzada. 3. Centrifugar por 3 segundos en microfuga. 4. Se retira el peine de la bandeja. Muy importante, los pozos del gel tiene que estar orientados

hacia el cátodo, generalmente el electrodo se presenta de color negro. Nota: Procurar colocar la cámara de electroforesis en hielo para evitar que la temperatura se incremente durante la corrida del gel.

Tabla 5.1. Preparación de muestras para aplicar en el gel de agarosa. Reactivos Estándar

(E) Plásmido sin digerir

(P) Plásmido digerido con una enzima

(R1)

Plásmido digerido con dos enzimas

(R2) Muestra 6 �L 3 �L 6 �L 6 �L H2O 4 �L 7 �L 4 �L 4 �L Amortiguador de muestra

3 �L 3 �L 3 �L 3 �L

5. Se toman los 13 µL de cada una de las muestras y se colocan en los pozos como se muestra en la Figura.

Figura 5.8. Cargado de la muestras en los pozos del gel de agarosa.

6. Una vez depositadas las muestras, se coloca la tapa con los electrodos (rojo con rojo y negro

con negro) y se conecta a la corriente. Aplicar 80 V por 10 min y posteriormente incrementar el voltaje a 100V por 40 min. Verificar que las muestras migren hacia el lado positivo de la cámara.

7. Al concluir la electroforesis se desconecta el equipo y se retira la bandeja para la observación de DNA (USAR GUANTES). El gel puede ser inmediatamente colocado sobre una lámpara de luz UV para visualizar las bandas de DNA. La radiación ultravioleta es peligrosa, usar lentes especiales o colocar una pantalla de acrílico entre el observador y la fuente de luz UV.

B


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8. Tomar la foto del gel. Posteriormente desechar el gel en el recipiente colocado para ese propósito, los geles serán incinerados, junto con los guantes y puntas que estuvieron en contacto con el bromuro de etidio.

9. Utilizando la foto, medir la distancia desde el centro del pozo hasta cada una de las bandas de DNA detectadas. Estimar el tamaño aproximado de cada uno de los fragmentos de DNA así como del vector sin restringir, utilizar para ello los valores del estándar de peso molecular que se proporcionaran durante la práctica. Llenar la siguiente tabla.


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Tabla 5.2. Valores estimados de peso molecular de las bandas de DNA que se detectaron en las muestras analizadas.

Estándar de DNA Plásmido sin restringir Plásmido restringido con 1 enzima de

restricción

Plásmido restringido con 2 enzimas de

restricción

Bandas

Distancia en mm

Pares de bases

Distancia en mm

Pares de bases

estimado

Distancia en mm

Pares de bases

estimado

Distancia en mm

Pares de bases

estimado 1 2 3 4 5 6 7

10. Analizar los resultados. Cuestionario

1. ¿Qué parte de la molécula de DNA le confiere la carga negativa? 2. ¿Cuál es el papel de cada componente del amortiguador de carga? 3. ¿A que se le denomina topoisomeros? 4. ¿En la práctica se pudieron observar topoisomeros?. 5. ¿Qué peso molecular tienen los topoisomeros? 6. ¿Qué tipo de extremos producen las enzimas utilizadas en la práctica, romos o cohesivos? 7. ¿Cuántos fragmentos de DNA o restricción se obtuvieron al utilizar las dos enzimas NdeI y

BamH1? 8. ¿Cuántos fragmentos se obtuvieron al utilizar sólo una de las enzimas de restricción? ¿Por

qué? 9. ¿Cuál fue el peso molecular del DNA liberado y del plásmido o vector? 10. ¿Cuáles son las aplicaciones de rutina de las enzimas de restricción?

Referencias

• Devlin T. Biochemistry. 1992 Ed. Wiley- Liss, pp. 768-773. QP514.2 • Kenneth D. Digestion of DNA with Restriction Endonucleases. Current Protocols in Protein

Science (1998) A.4I.1-A.4I.3. • Mitsis P, Exonucleases. Encyclopedia of life sciences © 2001, John Wiley & Sons, Ltd.

www.els.net. • Micklos DA, Freyer GA y Crotty DA. 2003. DNA Science. A first course. 2ndedition. Cold spring

Harbor Laboratory Press, CSH, New York, USA. Localización QH442 • Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 279-

317. Localización QH345 L43 • Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold

spring Harbor Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA. • Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da.

Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp848-914.


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TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II: INDUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE.

Objetivos

− Conocer el fundamento de la inducción de la síntesis de proteínas recombinantes en E. coli. − Realizar la inducción de una proteína recombinante (β-lactamasa) − Obtener la curva temporal de inducción de una proteína recombinante. − Interpretar el patrón electroforético de producción de una proteína recombinante − Conocer las aplicaciones biotecnológicas de las proteínas recombinantes

Introducción La necesidad de producir proteínas heterólogas o recombinantes para varias aplicaciones científicas como comerciales ha influido en el desarrollo de diversas herramientas para purificar y manipular proteínas. Los sistemas bacterianos han sido los sistemas más utilizados para este fin, debido a que son fácilmente manipulables genéticamente, se propagan en periodos de tiempo corto, son económicos y se requiere sólo un entrenamiento mínimo para su manejo. Además, muchas de las características inherentes a los sistemas bacterianos permiten que los sistemas se automaticen en proyectos de producción a gran escala, donde se requiere la producción y muestreo de cientos de clonas. A pesar de lo anterior, los sistemas bacterianos tienen sus limitantes, las proteínas de eucariotes o las proteínas de membrana, generalmente no se expresan o no son funcionales. El carácter químico del citoplasma de las bacterias y de sus chaperonas, así como las enzimas que se encargan de las modificaciones post-transduccionales son muy diferentes entre los organismos eucariotes. Por ejemplo, los sistemas de expresión de bacterias no glicosilan a las proteínas. Otros sistemas de expresión como los sistemas de células de mamífero o de insecto o levadura, tienen la capacidad de procesar las proteínas eucariotes de manera correcta y son utilizados cuando la funcionalidad de las proteínas es crítica, aunque el costo de éstos sistemas es considerablemente más alto y la tecnología que se necesita es más complicada. Adicionalmente, la producción de grandes cantidades de proteínas como algunos productos terapéuticos, se pueden lograr tanto en plantas como en sistemas animales. Muchas compañías ofrecen una serie de diferentes vectores con capacidades de expresión muy variadas, con o sin proteínas de fusión que funcionan como etiquetas para la detección y/o purificación de la proteína deseada. La presencia de marcadores selectivos de la cepa transformante y con promotores distintos. Los vectores de expresión como el pET son usados comúnmente para la expresión de proteínas heterólogas. En los sistemas pET, los plásmidos son clonados bajo las señales de expresión fuerte del bacteriofago T7, la expresión de la proteína es inducida cuando la célula hospedera provee una cantidad de RNA polimerasa T7. En unas pocas horas de inducción, la formación del producto puede llegar a ser más del 50% de la proteína total en la célula. Otro beneficio importante es que en ausencia del inductor la transcripción del transgene no se lleva a cabo. Adicionalmente, los sistemas pET cuentan con una copia del gen cromosomal de la RNA polimerasa T7 bajo el control del operador de la lactosa, sistema que se estudiará con más detalle en el siguiente protocolo experimental del curso. Basta mencionar ahora, que para que se exprese la RNA polimerasa T7 y por tanto se lleve a cabo la expresión de nuestra proteína de interés, se tiene que introducir lactosa o un análogo de ésta, el más utilizado es el Isopropil β-D tiogalactosido (IPTG), análogo no hidrolizable de la lactosa que sirve como un inductor artificial o gratuito del operón de la lactosa. La producción de la proteína recombinante en una organismo no relacionado, como se mencionó anteriormente, puede llevar a que la proteína no sea funcional, ya sea porque no presenta las


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modificaciones postraduccionales necesarias o bien porque adquirió un plegamiento inadecuado. Cuando las proteínas se aglomeran formando agregados que sólo pueden solubilizarse a través del uso de soluciones de detergentes, se dice que están formando cuerpos de inclusión. Una proteína que no se encuentra soluble aumenta los costos en su producción y/o recuperación. En la práctica se llevará a cabo el monitoreo de la inducción de la β-lactamasa, en células completas de E. coli transformadas con el vector pET-TEM-1 (Figura 5.4), vector que fue producido a partir del vector pET-24a-d(+) que se mostró en la Figura 5.3. Material biológico por grupo 25 mL cultivo líquido saturado de células transformadas de E. coli (crecidas por 12 a 16 horas). Material y equipo 1 recipiente para hielo Tubos para microfuga de 0.5 mL 2 vasos de precipitados 25 mL 1 Pipeta Pasteur con bulbo Recipiente de plástico para la tinción. Micropipeta de 2 a 10 µL Micropipeta de 20 a 200 µL Micropipeta de 200 a 1000 µL 1 caja de puntas de 10 µL para micropipeta 1 caja de puntas de 200 µL para micropipeta 1 caja de puntas de 1000 µL para micropipeta Placas de vidrio Peine Separadores Pinzas para sujetar las placas Cámara para electroforesis Fuente de poder Vórtex Incubadora a 37°C con agitación Cámara fotográfica Reactivos

− 1 matraz con 15 mL de medio LB-kanamicina (30 µg/mL) − 100 mM IPTG − Estándar de peso molecular de proteínas − 8 mL de LB por grupo para ajustar a cero el espectrofotómetro.

Desarrollo experimental Inducción de proteína recombinante, β-lactamasa (Figura 5.8).

1. Tomar 1.5 mL de un cultivo saturado de células de E. coli transformadas con el vector PET-TEM-1 y añadirlos a 15 mL de medio LB-kanamicina e incubarlos con agitación vigorosa a 37°C. El cultivo celular debe llegar a una absorbancia entre 0.6 a 0.8 en aproximadamente 2 h.

2. Para verificar que se llegó a la absorbancia indicada, tomar una alíquota de 1 mL y leerla en el espectrofotómetro a 600 ηm contra un blanco de medio Luria. Si aún no llega volver a incubar el matraz con agitación vigorosa.

3. Al llegar a la absorbancia apropiada, tomar una alícuota a la que llamaremos tiempo 0 (mantener en hielo el tubo de microfuga). Después agregar el IPTG para tener una


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concentración final en el tubo de 0.5 mM. El volumen del medio con células puede variar, dependiendo del número de alícuotas que se hayan tomado para determinar que la absorbancia corresponde a 0.6-0.8. Hacer el calculo tomando en cuenta el volumen final de medio con células.

4. Incubar nuevamente a 37°C y tomar alícuotas de 1 mL cada 30 min por 1.5 o 2 h. Guardar todas las alícuotas en tubos de microfuga y a 4°C.

Preparación de un gel de poliacrilamida-SDS

Durante el tiempo de inducción de la proteína recombinante, preparar un gel de poliacrilamida-SDS por cada dos equipos, utilizar un peine que genera 10 carriles o pozos. Las instrucciones de elaboración se encuentran en la sección II, parte III del manual.

Preparación de las muestras y separación en un gel de poliacrilamida-SDS 1. Directamente de cada una de las alícuotas que fueron recolectadas se toman 15 µL y se

mezclan con 10 µL de amortiguador de muestra en un tubo de microfuga. También hacer una mezcla apropiada de estándares de peso molecular, se sugiere 7.5 µL de los estándares de peso molecular más 17.5 µL de amortiguador de muestra.

2. Ensamblar el gel en la cámara de electroforesis. 3. Aplicar las muestras en el gel. 4. Iniciar la electroforesis aplicando una corriente de 10 a 15 mA y hasta que el frente del

colorante haya entrado en el gel separador. Después incrementar el amperaje a 25 mA, siempre y cuando no se caliente el gel.

5. Terminar la corrida una vez que el frente haya alcanzado el borde inferior del gel. 6. Enseguida el gel se desprende de las placas y se realiza la tinción depositando el gel en una

charola que contenga solución teñidora y colocando la bandeja en agitación constante. 7. Decantar la solución teñidora, lavar el exceso con H2O destilada y añadir la solución

desteñidora. Poner a agitar suavemente. 8. Tomar la foto del gel. 9. Analizar los resultados. La proteína tiene un peso molecular aproximado de 32 kDa.


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Células del cultivo saturado Incubar a 370C / agitación vigorosa

durante 2 h

Incubar a 37 0C / agitación. Tomar una alícuota cada 30 min

1 mL t = 30 min

Medio LB-kanamicina

1.5 ml

Leer a 600 ηm. hasta obtener 0.6-0.8 Abs.

Agregar__________µL 100mM IPTG (concentración final 0.5 mM)

1 mL t = 60 min

1 mL t = 90 min

Aplicar 4 de las fracciones a un gel de poliacrilamida-SDS.

t = 0

Figura 5.8. Proceso de inducción de proteína recombinante en E. coli.

1 mL t = 0

1 mL t = 120 min

Elegir entre incubar hasta 90 o 120 min, ya que sólo hay 5

pozos disponibles/equipo. RECORDAR QUE uno de los pozos

contendrá al estándar de peso molecular.


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Cuestionario

1. ¿Qué es una proteína recombinante? 2. ¿Por qué el cultivo de células debe de llegar a una densidad óptica de 0.6 a 0.8 antes de

comenzar el proceso de inducción de la proteína recombinante? 3. ¿Cuál es la función del IPTG? 4. ¿Cuál fue el tiempo en el que produjo la máxima cantidad de proteína recombinante? 5. ¿Qué otros parámetros se podrían modificar para obtener el mayor rendimiento de la

proteína? 6. ¿Qué son los cuerpos de inclusión? 7. ¿Qué experimento realizarías para determinar si la proteína se encuentra en forma soluble o

en forma agregada? 8. ¿Qué método propondría para purificar a la proteína recombinante obtenida? 9. Describe tres ejemplos de proteínas recombinantes que se producen actualmente de manera

comercial, explicando sus usos. Referencias • Ghrayeb J, Kimura H, Takahara M, Hsiung H, Masui Y, Inouye M. 1984. Secretion cloning

vectors in Escherichia coli. The EMBO Journal 3, 2437-2442. • Hammlev D, Madden D, Nørby S, Turner J. Unit 2. DNA profiling. European initiative for

biotechnology education 1995. http://www.reading.ac.uk/NCBE. • LaVallie E. 1995. Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Current Protocols in

Protein Science 5.1.1-5.1.8. • Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold

spring Harbor Laboratory. CSH, New Harbor Laboratory. CSH. New York, USA. • Sosa-Peinado A. Mustafi D, Makinen MW. 2000. Overexpression and biosynthetic deuterium

enrichment of TEM-1 beta-lactamase for structural characterization by magnetic resonance methods. Protein Expression & Purification 19: 235-45.

• Voet y JG Voet. Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da. Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp906-914.

Sección 6. Regulación del metabolismo

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6. REGULACIÓN DEL METABOLISMO PARTE I: REGULACIÓN GENÉTICA EN EL OPERÓN lac

Objetivos

- Comprender la importancia de la regulación genética como mecanismo para controlar los niveles de enzimas en la célula.

- Conocer los elementos que integran el operón de la lactosa. - Entender el funcionamiento del operón de la lactosa en presencia y ausencia de este

carbohidrato. - Conocer el concepto de represión catabólica y cómo se lleva a cabo.

Introducción La regulación metabólica es el incremento o el decremento de una reacción enzimática o de toda una secuencia de reacciones enzimáticas de las rutas metabólicas. Esto surge de la necesidad de la célula de estar en equilibrio normal, distinto al equilibrio que tiene en un estado de enfermedad. La célula logra el equilibrio entre sus reacciones enzimática, a través, principalmente, de la modificación de la actividad simultánea de sus enzimas presentes. Dado que el número de enzimas es alto, lo logra a través de algunos mecanismos globales de regulación metabólica. Una de las modalidades de regulación es la que involucra la expresión diferencial en aumento o disminución de la concentración de enzima, la regulación de la expresión genética. El DNA de una célula puede contener miles de genes dependiendo de su complejidad. Sin embargo, sólo una parte de esta conformación genética es requerida por la célula en todo momento. Además, existen genes con una función más especializada y cuya participación sólo es requerida por la célula bajo ciertas circunstancias. Por ello, todos los organismos son capaces de regular la expresión de sus genes. En el caso de las bacterias, la regulación de la expresión genética les permite responder metabólicamente a los cambios en su ambiente de manera rápida y precisa. Las bases de nuestro entendimiento sobre la regulación de la expresión génica en bacterias fueron propuestas por Francois Jacob y Jacques Monod en 1961. Ambos, junto con André Lwoff, compartieron el Premio Nobel de 1965 por su teoría del operón. El operón de la lactosa está formado por los genes estructurales lacZ, lacY y lacA, que codifican para las enzimas β-galactosidasa, permeasa y transcetilasa respectivamente. Todos ellos se transcriben en una molécula de RNA mensajero (RNA policistrónico), a partir de un promotor localizado río arriba de lacZ. También descubrieron el gen lacI, que no se encuentra adyacente al operón, pero cuyo producto proteico es un represor que se une al operador, localizado entre el promotor y lacZ. De hecho, el operador y el promotor están traslapados, de manera que cuando el represor esta unido al operador la RNA polimerasa no puede unirse al promotor y por lo tanto no hay transcripción de los genes estructurales. Cuando hay lactosa presente, la bacteria toma unas pocas moléculas de ellas y las convierte en alolactosa que es capaz de unirse al represor, impidiendo que éste se pegue al operador. La subsecuente unión de la RNA polimerasa al promotor ocasiona la transcripción de los genes estructurales y la posterior traducción en las enzimas necesarias para la utilización de la lactosa como fuente de carbono y energía. Cuando se termina la lactosa, el represor se vuelve a unir al operador bloqueando la expresión de los genes estructurales. La presencia o ausencia de la lactosa no es el único factor que influye sobre la expresión del operón de la lactosa. Si la célula tiene una fuente de glucosa suficiente para sus requerimientos energéticos, no necesita metabolizar lactosa aún cuando esté presente. El proceso por el cual esto ocurre se


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denomina represión catabólica e involucra una segunda proteína reguladora, CAP (proteína activadora de catabolito), y un segundo sitio de unión, el sitio CAP, adyacente al promotor. La CAP se une al sitio CAP sólo en presencia de AMP cíclico (AMPc), un nucleótido modificado derivado del ATP por la adenilato ciclasa. La cantidad de AMPc en la célula depende de la concentración de glucosa, y por ende de ATP, que inhibe a la adenilato ciclasa. Si los niveles de glucosa son altos (nivel de ATP alto) hay poco AMPc y si son bajos hay mucho AMPc (niveles de ATP bajos). Al controlar la cantidad de AMPc en la célula, la glucosa indirectamente regula la unión del complejo CAP-AMPc al sitio CAP. Esto es muy importante porque cuando el complejo CAP-AMPc está unido, se estimula la unión de la RNA polimerasa al promotor (regulación positiva), lo que ocasiona la transcripción de los genes estructurales del operón de lactosa. Material biológico Cultivo de E. coli W3110 en medio M9-glicerol. Material y equipo de laboratorio 4 tubos 13x100 mm estériles con tapón de gasa y algodón 1 pipeta de 5 mL estéril 3 pipetas de 1 mL estériles 5 pipetas de 1 mL 1 propipeta 1 gradilla 1 mechero Centrífuga clínica Baño María a 37ºC Reactivos

− 1 tubo de 13X100 mm con 4 mL de medio M9-glicerol estéril − Solución de glucosa al 2% estéril − Solución de lactosa al 2% estéril − Solución de glucosa 2% + lactosa 2% estéril − Amortiguador Z − Reactivo ONPG − SDS al 0.1% − Na2CO3 1M − Cloroformo

Desarrollo de la práctica (Figura 6.1)

1. Coloca 4 mL del cultivo de E.coli W3110 en cada uno de los 4 tubos de 13x100 mm estériles y rotularlos de la A a la D. Rotular el tubo que contiene el medio M9-glicerol como E (blanco).

2. Añadir a cada tubo lo siguiente:

Tubo A 1 mL de glucosa 2% Tubo B 1 mL de lactosa 2% Tubo C 1 mL de glucosa 2% + lactosa 2% Tubo D 1 mL de glucosa 2% Tubo E 1 mL de glucosa 2% + lactosa 2%

3. Incubar los tubos a 37ºC con agitación ocasional. A los 15 minutos de incubación añadir,

únicamente al tubo D, 1 mL de lactosa 2% y reintegrarlo a la incubadora a 37ºC.


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4. Cuando hayan transcurrido 45 minutos de incubación, centrifugar los tubos a 3000 rpm durante 25 minutos. Quitar los tapones de los tubos antes de centrifugar. Este paso y los siguientes requieren condiciones de esterilidad.

5. Decantar y resuspender cada paquete celular en 1 mL de amortiguador Z. 6. Añadir a cada tubo 0.1 mL de cloroformo y 50 uL de SDS 0.1%. Agitar durante 10 segundos. 7. Añadir a cada tubo 0.2 mL de reactivo ONPG y agitar. 8. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos o hasta el desarrollo de color amarillo. 9. Parar la reacción con 0.5 mL de Na2CO3 1M. 10. Anotar que tubos desarrollan color amarillo y con qué intensidad. 11. Analizar y reportar los resultados obtenidos.


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Colocar 4 mL / Tubo

Cultivo E. coli

Incubar a 37 0C / 45 min (*A los 20 min de incubación añadir 1 mL de lactosa 2% al tubo D)

Centrifugar a 3000 rpm / 25min

Decantar el sobrenadante

Resuspender el paquete celular en 1 mL amortiguador Z

Añadir 100 µL de CHCl3 + 50 µL SDS 0.1%

Agitar suavemente 10 seg

Añadir 0.2 mL de reactivo ONPG

Agitar Incubar a Tamb / 30 min

Añadir 0.5 mL Na2CO3 1 M

Observar la intensidad de color amarillo

Figura 6.1. Protocolo de inducción de expresión de los genes involucrados en la utilización de lactosa

1 mL 1mL 1 mL 1 mL 1 mL Glucosa 2% Lactosa 2% Glucosa 2% Glucosa 2% Glucosa 2% Lactosa 2% Lactosa 2%


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Cuestionario

1. ¿Qué es la regulación genética? 2. ¿Cuáles son las diferencias entre la expresión genética constitutiva, la inducible y la

represible? 3. ¿Cómo funcionan los mecanismos de control positivos de la expresión genética? 4. ¿Cómo funcionan los mecanismos de control negativos de la expresión genética? 5. ¿Qué son un activador y un inductor? 6. ¿Qué son un represor y un co-represor? 7. ¿Qué es un operón y cuáles son sus componentes? 8. ¿Cuál es la estructura del operón de lactosa de E.coli? 9. ¿Cómo funciona este operón en ausencia y en presencia de lactosa? 10. ¿Qué es la represión catabólica y como se ejerce este proceso sobre el operón de lactosa? 11. ¿Por qué la bacteria utilizada en la práctica fue cultivada inicialmente en medio M9-glicerol? 12. ¿Para qué se utiliza cada reactivo de la práctica? 13. Explique que ocurre en los tubos A-E en la práctica. 14. ¿Qué reacción es responsable del color amarillo observado en los tubos? 15. ¿Qué ocurriría si a los tubos B y C se agregara ATP? 16. ¿Cuál será el fenotipo en ausencia y en presencia de lactosa de cada uno de los siguientes

mutantes del operón lac: i-, is, z-, y-, a-, p-, y oc? Explique por qué. 17. ¿Qué diferencias existen en la regulación de una vía metabólica como la de la degradación de

la lactosa y una vía anabólica, como la de la síntesis de triptófano? 18. ¿Qué importancia tiene la regulación de la expresión genética en procariontes? 19. ¿Cuáles son las principales diferencias en la regulación genética entre procariontes y

eucariontes? 20. ¿Qué aplicaciones tienen en su práctica profesional o en su vida cotidiana los conceptos

adquiridos al realizar esta práctica?

Referencias • Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Regulation of gene expression.

Ed John Wiley & Sons, INC, New York, 1997. Pp. 20-52. Localización QP514.2 • Gardner JE. Garder E. Principios de genética. 1998, 4a edition Ed. Limusa, pp. 390-407.

Localización QH581.2 M 65 • Genética General. Manual de prácticas de laboratorio. Regulación genética en el operón lac.

Facultad de Química, UNAM. Ciudad Universitaria. México, 2002. • Klug SW, Cummings RM. Conceptos de genética. Ed. Prentice Hall. Madrid 1999. Pp. 51-71. • Lodish H, Molecular Cell Biology, 2003, Ed. Freeman and company, pp. 115-125. Localización

QH581.2 M 65 • Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Reverté, pp.868-873.


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PARTE II: REGULACIÓN HORMONAL DEL METABOLISMO DE LA GLUCOSA

Objetivos

- Conocer la definición de hormonas. - Conocer que las hormonas participan en la regulación del metabolismo. - Conocer los mecanismos de acción y transducción de la señal por insulina: activación de

proteínas cinasas y de proteínas involucradas en transporte y metabolismo. - Manejar un modelo experimental animal para medir el efecto de insulina sobre la toma de

glucosa por diferentes tejidos. - Analizar el efecto de un inhibidor de la cascada de transducción de señales en el transporte de

glucosa. Introducción Los seres vivos coordinamos los eventos intracelulares a través de complejos sistemas de señales químicas. La comunicación intracelular mantiene la síntesis o la alteración de una gran variedad de moléculas, por ejemplo, controla la actividad de las vías metabólicas. Las hormonas, los factores de crecimiento y los neurotransmisores, son las señales químicas que alteran o regulan la actividad celular. Una gran variedad de moléculas mensajeras (primeros mensajeros) no entran a la célula para iniciar sus acciones biológicas, sino que interaccionan con diferentes receptores en la superficie de éstas. La unión de los ligandos con sus receptores induce un cambio conformacional en el receptor que lo convierte en una forma activa, capaz de interaccionar directa o indirectamente sobre diversas moléculas, tales como factores de acoplamiento. La asociación con otras proteínas activan o inhiben una cascada de sucesos moleculares (proceso de transducción de señales) que llevan a una respuesta biológica específica y determinada de acuerdo al ligante que se unió al receptor. La insulina es una hormona polipeptídica que al interaccionar con su receptor estimula una compleja cascada intracelular de eventos dependientes de la fosforilación o defosforilación específica de proteínas y culmina con una variada respuesta celular. Ocurren cuatro cambios principales por la presencia de la insulina: la activación del receptor, el control del transporte de la glucosa, la estimulación del metabolismo como la glucólisis y el almacenamiento de lípidos y la regulación de la transcripción de genes. La insulina tiene un papel importante en la regulación de la homeostasis de la glucosa en sangre, debido a que incrementa el transporte y utilización (metabolismo) de glucosa en ciertos tejidos. La insulina incrementa la toma de la glucosa en las células de músculo y de tejido adiposo de mamíferos. La principal causa es la movilización del transportador de glucosa, GLUT4, desde el interior celular hacia la membrana celular. El incremento en moléculas de GLUT4 en la membrana plasmática causa un incremento de 10 a 40 veces en la toma de glucosa. El mecanismo que lleva a la translocación de GLUT4 hacia la membrana celular no se ha descrito totalmente, pero se conoce que una vez que la insulina se une a su receptor, éste se autofosforila en un residuo de tirosina, lo que desencadena la fosforilación de proteínas como IRS-1 y Shc, las cuales se asocian a proteínas que contienen residuos -SH2 (Cys) como p85, SYP o GRb. La formación del complejo IR-1-p85 activa a una cinasa denominada PI3 cinasa, proteína clave involucrada en la movilización hacia la superficie celular de las vesículas de membrana que contienen al transportador GLUT4 (Figura 6.2).


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Figura 6.2. Vía de transducción de señales por insulina. P, residuos de tyr fosforilados; GSK-3, glucógeno sintasa cinasa-3; PP1, proteína fosfatasa tipo 1; GluT, transportador de glucosa; PI3’-K, fosfatidil inositol 3’-cinasa subunidad catalítica; p85, PI3’-K subunidad regulatoria; PKB, proteína cinasa B; IRS, substrato del receptor de insulina; MAPK, proteína cinasa activada por mitógenos. Las vías conocidas se muestran con líneas continuas y las vías que aún no se demuestran pero que podrían encontrarse relacionadas a insulina se indican con líneas discontinuas. Tomado de Bradey y Saltiel, 2001.

Una de los enfoques experimentales que ha ayudado a encontrar los blancos moleculares de la acción de insulina y así describir la vía de transducción de señales implicada, es el uso de inhibidores de proteínas cinasas o fosfatasas. Existen inhibidores específicos de algunas cinasas como las MAPK, p70S6 cinasas y PI3-cinasas. Un defecto en alguna de las respuestas celulares por el uso del inhibidor, nos permite asociar a la proteína inhibida como parte de los intermediarios dentro de la vía de transducción de señales encendida en este caso por insulina.

Material biológico Hígado, músculo y tejido adiposo de rata. Material y equipo 7 Tubos falcón 50 mL 1 Recipiente para hielo 1 Micropipeta con capacidad de 200-1000µL 1 Caja de puntas para micropipeta de 1000µL 1 Probeta de 50 mL 1 Piceta con agua destilada Tubos para microfuga 1 Pinzas de disección 1 Tijeras 1 Vaso de precipitados 1 Caja Petri 1 Cámara para el sacrificio de las ratas (por grupo)


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1 Tanque de CO2 (por grupo) Reactivos - Solución Krebs-Ringer-Glucosa-Hepes (ver composición en el apéndice). - 0.9% NaCl - Solución de insulina 2000 µU/mL - 4 µM Wormanina Desarrollo experimental Se ha dividido está sección en tres partes, la extracción de los tejidos de las ratas, la inducción de la toma de glucosa por insulina en los tejidos y tercero la cuantificación de glucosa residual en los tubos en donde se incubó el tejido. Debido a que el procedimiento es largo, se sugiere realizar el experimento en dos sesiones. Inducción de toma de glucosa por insulina (Figura 6.3) Se recomienda que por grupo midan el efecto de insulina sobre la captación de glucosa en tres tejidos distintos: hígado, músculo y tejido adiposo. A continuación se describe el protocolo experimental a seguir en un tejido. Preincubación del tejido con wormanina y posteriormente la incubación con insulina.

1. Colocar 2 mL de solución Krebs-Ringer-Hepes-Glucosa (KRH-Glu) en un tubo falcón de 50 mL marcado como W. Adicionarle 50 µL wormanina para una concentración final de 100 nM.

2. Pesar el tubo con el líquido. 3. Añadir un trozo del tejido. Volver a pesar el tubo. Es necesario conocer la cantidad de tejido

que se coloca en el tubo. 4. Incubar por 30 min a 37°C. Este paso es la preincubación del tejido con wormanina. 5. Al finalizar la incubación añadir 0.5 mL de la solución de insulina 2000 µU/mL y 0.5 mL de

NaCl 0.9%. 6. Mezclar e Incubar con agitación moderada a 37°C por 30 min. CUIDAR DE QUE LA

TEMPERATURA DEL BAÑO NO EXCEDA LA RECOMENDADA. 7. Añadir 47 mL de agua. 8. Filtrar el tejido y pesarlo. 9. Guardar en un tubo de microfuga 1.2 mL del sobrenadante. Rotular el tubo con una W, el

número de equipo y el grupo. Almacenar a –20°C hasta su uso. 10. Se determinará el contenido de glucosa en la siguiente clase.

Incubación del tejido con insulina. 11. Etiquetar 6 tubos falcón de 50 mL de la siguiente manera.

I. 1000 µU II. 500 µU III. 250 µU IV. 125 µU V. 62 µU VI. 0 µU

12. Añadir a cada tubo 1 mL de NaCl 0.9%. 13. Añadir al tubo 1, 1 mL de la disolución de insulina. Agitar bien. 14. Tomar 1 mL de la solución de insulina del tubo I y pasarlo al tubo II. Agitar. 15. Tomar ahora 1 mL del tubo II y pasarlo al tubo III. Agitar y continuar de esa manera hasta el

tubo V. 16. Tomar 1 mL del tubo V y desecharlo.


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17. El tubo 6 no deberá contener insulina. 18. Añadir a cada matraz 2 mL de solución de KRH-Glu. 19. Pesar los tubos en balanza analítica y ponerlos en hielo. 20. Sacrificar las ratas una por una y aislar el hígado y el tejido adiposo de las testículos (ver

descripción del procedimiento). 21. Mantener los tejidos en 0.9% NaCl y a 4°C una vez aislados. 22. Adicionar a cada tubo un fragmento de tejido de aproximadamente del mismo tamaño. Para

exponer la mayor superficie posible del tejido al medio se sugiere cortar en pedazos el trozo de tejido seleccionado.

23. Volver a pesar los tubos, pero ahora con los tejidos. 24. Colocar los tubos en un baño de incubación con agitación moderada a 37°C y se incuba por

30 min. 25. Añadir 47 mL de agua al tubo, mezclar y filtrar cada tubo. Se pesa el tejido que queda en el

filtro y el sobrenadante se utilizará para determinar la cantidad de glucosa residual. 26. Debido a que sólo se necesita una pequeña fracción del volumen para medir el contenido de

glucosa residual, tomar 1.2 mL de cada uno de los sobrenadantes y guardarlo en un tubo de microfuga. Rotular los tubos y almacenar congelado hasta su uso.

27. Se determinará la cantidad de glucosa en la siguiente sesión experimental.


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Etiquetar tubos Añadir a cada tubo 1 mL 0.9% NaCl, excepto al W

Realizar diluciones seriadas de insulina

(excepto los tubos VI y W)

Añadir a todos 2 mL Krebs Ringer-Glucosa

Añadir a W _________µL de wormanina

Sacrificar las ratas una por una y aislar tejido.

Incubar todos los tubos a 37°C/30 min

Tubos I al VI Tubo W Añadir 0.5 mL Insulina 2000 µU/mL

+ 0.5 mL 0.9% NaCl

Incubar a 37°C/30 min

Tomar el tejido y pesarlo Ajustar el volumen del sobrenadante añadiendo 47 mL de H2O

Guardar 1.2 a 1.5 mL sobrenadante en tubo de microfuga Congelar

Determinar contenido de glucosa

-Distribuir en todos los tubos -Pesar tejido


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Aislamiento de tejidos. Las instrucciones para el manejo de los animales del laboratorio y el sacrificio de las ratas serán proporcionadas por un profesional en el área. En nuestro caso, será el jefe del bioterio de la Facultad de Química. No obstante, a continuación se enlistan algunas recomendaciones que les pueden ser útiles en el manejo de las ratas. Manejo y sacrificio de las ratas.

− Recuerden mantener la calma, los animales perciben el miedo. − Para capturar a las ratas dentro de la jaula, la manera más práctica es tomarla con una mano

de la cola y con la otra sujetar la piel del cuello, con esto no puede atacar y queda inmovilizada. También es posible sujetar a la rata con una sola mano, rodeando el cuello con el pulgar y el índice, cuidando de no ejercer mucha presión.

− El método de sacrificio será el químico, utilizando una cámara saturada con CO2 por 5 min. − Posteriormente se realiza la dislocación cervical, sujetando la base de la cola del animal y

jalando firmemente, al hacer presión sobre la región cervical debe producirse un espacio de 2 a 4 mm entre el cráneo y las primeras vértebras cervicales.

− Una vez realizado lo anterior, colocar al animal en posición decúbito dorsal (boca arriba) sobre la mesa previamente cubierta con una papel. Se sujetan los miembros con el fin de que el animal se encuentre firme a la manipulación. Para tener acceso a las cavidades torácicas y abdominal se debe sujetar y levantar la piel con unas pinzas de “dientes de ratón” y hacer una incisión a lo largo de la línea media con unas tijeras y posteriormente abrir la piel a cada lado. Una vez expuestas estas cavidades se puede proceder a la recolección de los órganos que se requieran utilizando unas pinzas rectas y tijeras (Figura 6.4).

Figura 6.4. Localización de algunos órganos de la rata. Obtención de tejido adiposo

• Abrir el abdomen ampliamente haciendo una ligera presión en la cavidad abdominal para desplazar los testículos, levantar hacia arriba el testículo izquierdo y de un solo corte separar el tejido adiposo de tal manera que no lleve sangre, en caso contrario, quitar la sangre con solución de NaCl 0.9%

Figura 6.3. Protocolo de inducción de la toma de glucosa por insulina y determinación del efecto de wormanina en el proceso de transducción de señales iniciado por insulina.


84

• Sujetar el tejido adiposo con pinzas por la parte más angosta procurando manejarlo lo menos posible.

• Hacer lo mismo con el tejido adiposo que cubre el testículo del lado derecho y repetir la operación con cada una de las 2 ratas.

• Cortar rápidamente 7 fragmentos de tejido adiposo por rata, de aproximadamente el mismo tamaño y depositarlos en cada uno de los 7 tubos falcón previamente pesados.

Obtención de hígado

• Extraerle el hígado a las 2 ratas que se sacrificaron. • Lavar los hígados con solución de 0.9% NaCl, para lograrlo se sugiere introducir la aguja de la

jeringa por alguna de las dos vías por las que el hígado recibe sangre, la vena porta o la arteria hepática, bombear la solución de 0.9% NaCl fría a través de ellas, hasta que la sangre que quedo atrapada en el tejido salga (el proceso se llama “perfundir”), lo que llevará a que el hígado tome su color natural, de rosa a rojo. Procurar hacerlo rápidamente.

• Cortar un hígado en 7 fragmentos de aproximadamente el mismo tamaño y distribuirlos en 7 tubos que contienen concentraciones de insulina similares al del tejido adiposo.

Músculo

• Cortar el músculo de las patas y de la región ventral. Lavar el tejido en solución 0.9% NaCl. • Cortar en 7 segmentos, pesar y distribuir en los tubos indicados en el protocolo anterior.


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Determinación del contenido de glucosa transportada. Objetivos

− Conocer el fundamento de la determinación de glucosa, método de Nelson-Somogyi. − Determinar de manera indirecta la toma de glucosa por un tejido.

Introducción Los carbohidratos son una de las fuentes principales de carbono y de energía en las células y los podemos encontrar en alimentos y en bebidas, así como también en la sangre. Dada la importancia de los carbohidratos, se han desarrollado varios métodos para su determinación: Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-Hensen, etc., pero todos ellos se basan en el mismo principio. Todos los carbohidratos con un grupo aldehído libre o un grupo cetónico se clasifican como azúcares reductores y se transforman fácilmente en enedioles al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fácilmente en presencia de oxígeno u otros agentes oxidantes. Por lo tanto, los carbohidratos en solución alcalina rápidamente reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)6

3-, el carbohidrato oxidado forma mezclas complejas de ácidos. Esta acción reductora es la que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas. El método que se utilizará en la práctica utiliza como reactivos al Cu2+ y al arsenomolibdato. Técnica de Nelson-Somogyi empleada desde 1952 para la determinación de actividad de enzimas que degradan polisacáridos. Material biológico Los sobrenadantes obtenidos anteriormente Material y equipo Tubos de microfuga 1 Mechero 1 tela de alambre 1 tripié 15 tubos de 16X150 13 Canicas Gradilla 1 Pipeta de 5 mL 3 Pipetas de 2 mL 1 Propipeta 1 Micropipeta de capacidad 200-1000 µL Caja de puntas para micropipeta 1000 µL 6 Celdas de plástico Vórtex Espectrofotómetro Reactivos - Solución patrón de glucosa, 200 µg/mL. - Solución A para determinación de glucosa. Contiene Na2CO3, tartrato de Na y potasio, NaHCO3 y

Na2SO4, ver apéndice. - Solución B para determinación de glucosa. CuSO4 y H2SO4, ver preparación en el apéndice. - Reactivo de cobre mezclado (RCuM): 24 partes de solución A + 1 parte de solución B. Prepararlo

justo antes de usarlo. - Reactivo de arsenomolibdato ((NH4)6Mo7O24, Na2HAsO4 y H2SO4). Ver preparación en el

apéndice. Desarrollo experimental


86

1. Numerar los tubos de ensayo según se indica en la tabla 6.1. 2. Descongelar los sobrenadantes y agitar. 3. Añadir los reactivos en la cantidad y orden señalados.

Tabla 6.1. Cantidades y orden en el que se realiza la cuantificación de carbohidratos

Tubo

200ug/mL Glucosa

(mL)

Sobrenadantes H2O (mL)

RCuM NH4(AsMoO4)2 (mL)

H2O (mL)

Abs 520nm

1 - - 2.0 2.0 2.0 4.0 2 0.1 - 1.9 2.0 2.0 4.0 3 0.2 - 1.8 2.0 2.0 4.0 4 0.3 - 1.7 2.0 2.0 4.0 5 0.4 - 1.6 2.0 2.0 4.0

Cur

va p

atró

n

6 0.5 - 1.5 2.0 2.0 4.0 I - 1.0 - 2.0 2.0 4.0 II - 1.0 - 2.0 2.0 4.0 III - 1.0 - 2.0 2.0 4.0 IV - 1.0 - 2.0 2.0 4.0 V - 1.0 - 2.0 2.0 4.0 VI - 1.0 - 2.0 2.0 4.0

Tejid

o

W - 1.0 - 2.0

Mez

clar

bie

n y

colo

car l

os tu

bos

en a

gua

en

ebul

lició

n po

r 10

min

(ta

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ien.

2.0 4.0 Cálculo de la toma de glucosa por el tejido.

a) Elaborar la curva patrón de la glucosa. • Graficar absorbancia vs contenido de glucosa en µg. • Obtener los valores de ajuste o regresión lineal de la curva.

b) Determinar el contenido inicial de glucosa. Recordar que la solución KRH-Glu contenía 150 mg Glucosa/100 mL de solución y que al final de la incubación de los tejidos, se realizo una dilución de la solución.

c) Glucosa incorporada en los tejidos. • Calcular el contenido de glucosa de cada uno de los sobrenadantes, utilizando los valores

de regresión lineal obtenidos en el inciso a). • Calcular la diferencia entre el valor de la glucosa inicial (valor obtenido en el inciso b) y la

determinada para cada muestra problema. • El resultado se divide entre el peso en gramos del tejido que se coloco en cada matraz

correspondiente para obtener lo µg de glucosa transportada por gramo de tejido. d) Realizar la gráfica de toma de glucosa (µg de glucosa incorporada/ g tejido) vs concentración

de insulina y añadir el resultado de insulina más wormanina. e) Interpretar los resultados.


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Cuestionario

1. ¿Cuál es la función de la solución de Krebs-Ringer-Hepes en el experimento? 2. ¿Por qué el aislamiento del tejido debe ser rápido? 3. ¿Qué se esta removiendo al lavar el hígado con solución salina? 4. ¿Por qué deben mantenerse en hielo los tejidos? 5. En el sistema experimental que utilizamos, ¿qué componente representa la sangre? 6. ¿Cuáles son los procesos celulares que se están evaluando en el tejido incubado o no con

insulina? 7. ¿Cuál es el metabolito que se debe cuantificar para la determinar si la insulina tiene o no

efecto en el transporte? 8. ¿Dónde se cuantifica este metabolito? 9. Describa la reacción química que utiliza para cuantificarlo. 10. ¿Cuál es el fundamento del uso de wormanina en éste trabajo? 11. ¿Qué efecto produce la wormanina en la toma de glucosa por los tejidos? 12. Elabore una gráfica comparativa del efecto de insulina en la captación de glucosa por los

diferentes tejidos. 13. Analice la gráfica anterior.

Referencias

• Brady MJ, Saltiel AR. 2001. Insulin and glucagon. Encyclopedia of Life Science. John Wiley & Sons, Ltd. DOI: 10.1038/npg.els.0000638

• Devlin TM. 1997. Textbook of biochemistry with clinical correlations. 4ta. Ed John Willey & Sons, INC. Biochemistry of hormones I: polypeptide hormones Pp 878-883. Localización QP514.2

• Hashiramoto M, James D. 2000. Characterization of insulin-responsive GLUT4 storage vesicles isolated from 3T3-L1 adipocytes. Molecular and cellular biology 20, 416–427.

• Román-Palacios R. 1998. Regulación metabólica. Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, UNAM.

• Svetlana E, 2001. Impaired muscle glycogen synthase in type 2 diabetes is associated with diminished phosphatidylinositol 3-kinase activation. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 86, 4307–4314.

• Voet y JG Voet Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da. Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp785-794.

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