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La ruta FUL-AP2 y la longevidad de los meristemos Bases moleculares y potencial biotecnológico Irene Martínez Fernández 1 Directora: Cristina Ferrándiz 1 . Tutor: Carmelo López del Rincón 2 1 Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (CSIC-UPV) 2 Instituto de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana (COMAV). APLICACIONES Programa de doctorado en Biotecnología Rutas genéticas de control del mantenimiento del SAM AP2 WUS CLV3 FUL miR172 semillas OBJETIVOS 1. Estudio de la ruta genética FUL-AP2 de control del cese de la actividad meristemática en Arabidopsis thaliana. Identificación de nuevos factores relacionados funcionalmente con FUL y AP2. 2. Búsqueda de nuevos mutantes con alteraciones en la parada de la actividad del meristemo apical del tallo mediante el rastreo de poblaciones mutageneizadas de Arabidopsis thaliana. Identificación de los genes afectados. 3. Diseño de estrategias biotecnológicas basadas en la manipulación de la ruta FUL-AP2 para aumentar la producción de frutos y semillas. 4. Estudio de la conservación funcional de la ruta FUL-AP2 de control de la actividad del meristemo en otras especies de interés agrícola. RESUMEN Todos los órganos de la planta se desarrollan a partir de los meristemos. En Arabidopsis thaliana, una planta monocárpica, durante la fase vegetativa el meristemo apical del tallo (SAM) forma hojas de roseta y tras la transición floral comienza a formar hojas caulinares en una primera fase inflorescente y flores en una segunda fase (Bowman, 1994; Meyerowitz y Somerville, 1994). El número de flores que llega a producir una planta monocárpica depende del tiempo durante el que se mantiene activa la actividad proliferativa del SAM. Es por esto por lo que el estudio de los factores genéticos que controlan el cese de la actividad del SAM adquiere gran importancia. El conocimiento exacto de los genes que regulan el mantenimiento de las células meristemáticas ayudaría en los programas de mejora de los cultivos a la obtención de variedades más productivas. En estudios previos se ha descrito que APETALA 2 (AP2), un factor de transcripción de la tipo AP2/ERF, además de estar implicado en el establecimiento de identidad de órganos florales externos (Bowman et al., 1991;), también participa en la regulación de la actividad meristemática, posiblemente a través de la regulación del ciclo de retroalimentación entre WUSCHEL (WUS) y CLAVATA 3 (CLV3) (Wurschum et al, 2006). A medida que avanza la edad de la planta, aumenta el nivel de expresión de ciertos factores que reprimen la expresión de AP2, como FRUITFULL(FUL) (Balanzá, 2011) y el microRNA 172 (miR172) (Wu et. al. 2009). Como resultado al final del ciclo de vida de la planta el nivel de expresión de AP2 se reduce y por tanto también el de WUS, deteniéndose la actividad meristémática (Balanzá, 2011). Como en los mutantes ful y ap2-170 (un alelo de AP2 parcialmente insensible a la represión del miR172), la expresión de AP2 permanece activa durante más tiempo, también se prolonga la activación de WUS y los meristemos son más longevos. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Col ful2 ap2-12 ful-2 ap2-12 35S:miR172 fenot. Fuerte 35S:miR172 fenotipo débil ful2 35S:miR172 fenot. Fuerte ful2 35S:miR172 fenotipo débil Flores/infloresc. 1al Nº flores producidas en el tallo principal Efecto de los factores de transcripción de la familia AP2/ERF sobre la parada de la actividad meristemática 1 TOE1, TOE2, TOE3, SNZ y SMZ podrían estar participando junto a AP2 en la activación de WUS en el SAM y su nivel de expresión estaría controlado por FUL y miR172. Rastreo de poblaciones estériles mutageneizadas para encontrar nuevos mutantes que permitan identificar los factores genéticos por los cuales el número de semillas producidas controla la parada del SAM 2 Mutagenesis EMS Mutagenesis Activation Tagging #1 #6 #2 #3 #4 #5 T1 Crecimiento de cer6 con humedad elevada para conseguir semillas T2 Selección de plantas donde el SAM pare su actividad antes o después que en el control Identificación del gen mutado mediante rescate plasmídico. 4 Biografía: Los mutantes ful y ap2-170 producen más frutos, pero con defectos en su desarrollo Expresando un RNAi contra FUL y el alelo ap2-170 bajo el control de promotores especificos de SAM hemos conseguido plantas más productivas y sin defectos en su desarrollo 5’ 3’ pTFL1 AP2 170 5’ 3’ pTFL1 FUL FUL intrón menor producción aumento producción 10-25% aumento producción 25-35% aumento producción 35-40% 0 10 20 30 40 50 60 70 Col 11 2 4 13 8 3 15 1 21 5 Col TFL1>>AP2 170 5’ 3’ pTFL1 AP2m3 5’ 3’ pFD AP2m3 5’ 3’ pFD AP2 170 5’ 3’ pFD FUL FUL intrón Nº frutos en el tallo principal 0 10 20 30 40 50 60 Col 4 2 3 5 6 Col 7 21 24 22 23 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Col 4 3 5 6 1 Col 15 17 13 19 30 16 12 27 Col TFL1>>AP2-170 TFL1>>RNAi-FUL TFL1 FD Incremento de producción de frutos 10-40% Col Se presentan defectos en la determinación del meristemo floral Se esperan resultados mejores o similares a los obtenidos con las construcciones TFL1>>AP2-170 y TFL1>>AP2m3 Caracterización de los ortólogos de FUL en Pisum sativum y evaluación del rendimiento en diferentes condiciones de cultivo. Aumentar la producción de frutos de los cultivos. El conocimiento que se adquiera con estos trabajos sobre las rutas genéticas que controlan la parada de la actividad meristemática en plantas monocárpicas podría ayudar a la obtención de cultivos más productivos. Meyerowitz, E. M. y Somerville, C. R. (1994). Arabidopsis. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Balanzá Pérez, Vicente (2011). Tesis doctoral: Nuevas Funciones y Dianas Moleculares del Factor de Transcripcion FRUITFULL en Arabidopsis thaliana. Bowman, J. L., Smyth, D. R. y Meyerowitz, E. M. (1991). Genetic interactions among floral homeotic genes of Arabidopsis. Development 112, 1-20. Bowman, J. L. (1994). Arabidopsis: an atlas of morphology y development, (ed., pp. 450. New York: Springer. Wu, G., Park, M. Y., Conway, S. R., Wang, J. W., Weigel, D. y Poethig, R. S. (2009). The sequential action of miR156 y miR172 regulates developmental timing in Arabidopsis. Cell 138, 750-9. Wurschum, T., Gross-Hardt, R. y Laux, T. (2006). APETALA2 regulates the stem cell niche in the Arabidopsis shoot meristem. Plant Cell 18, 295-307. TFL1>>AP2m3 Fourquin y Ferrandiz (no publicado) Col ful-2 ap2-12 35S:miR172 ful-2 35S:miR172 ful-2 35S:miR172 débil 35S:miR172 débil débil 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 Ler ful-1 ap2-170 Ler ap2-170 ful-1 3
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La ruta FUL-AP2 y la longevidad de los meristemos Bases moleculares y potencial biotecnológico
Irene Martínez Fernández1
Directora: Cristina Ferrándiz1. Tutor: Carmelo López del Rincón2 1 Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (CSIC-UPV) 2 Instituto de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana (COMAV).
APLICACIONES
Programa de doctorado en Biotecnología
Rutas genéticas de control del mantenimiento del SAM
AP2 WUS
CLV3
FUL
miR172
semillas
OBJETIVOS
1. Estudio de la ruta genética FUL-AP2 de control del cese de la actividad meristemática en Arabidopsis thaliana. Identificación de nuevos factores relacionados funcionalmente con FUL y AP2.
2. Búsqueda de nuevos mutantes con alteraciones en la parada de la actividad del meristemo apical del tallo mediante el rastreo de poblaciones mutageneizadas de Arabidopsis thaliana. Identificación de los genes afectados.
3. Diseño de estrategias biotecnológicas basadas en la manipulación de la ruta FUL-AP2 para aumentar la producción de frutos y semillas.
4. Estudio de la conservación funcional de la ruta FUL-AP2 de control de la actividad del meristemo en otras especies de interés agrícola.
RESUMEN Todos los órganos de la planta se desarrollan a partir de los meristemos. En Arabidopsis thaliana, una planta monocárpica, durante la fase vegetativa el meristemo apical del tallo (SAM) forma hojas de roseta y tras la transición floral comienza a formar hojas caulinares en una primera fase inflorescente y flores en una segunda fase (Bowman, 1994; Meyerowitz y Somerville, 1994). El número de flores que llega a producir una planta monocárpica depende del tiempo durante el que se mantiene activa la actividad proliferativa del SAM. Es por esto por lo que el estudio de los factores genéticos que controlan el cese de la actividad del SAM adquiere gran importancia. El conocimiento exacto de los genes que regulan el mantenimiento de las células meristemáticas ayudaría en los programas de mejora de los cultivos a la obtención de variedades más productivas. En estudios previos se ha descrito que APETALA 2 (AP2), un factor de transcripción de la tipo AP2/ERF, además de estar implicado en el establecimiento de identidad de órganos florales externos (Bowman et al., 1991;), también participa en la regulación de la actividad meristemática, posiblemente a través de la regulación del ciclo de retroalimentación entre WUSCHEL (WUS) y CLAVATA 3 (CLV3) (Wurschum et al, 2006). A medida que avanza la edad de la planta, aumenta el nivel de expresión de ciertos factores que reprimen la expresión de AP2, como FRUITFULL(FUL) (Balanzá, 2011) y el microRNA 172 (miR172) (Wu et. al. 2009). Como resultado al final del ciclo de vida de la planta el nivel de expresión de AP2 se reduce y por tanto también el de WUS, deteniéndose la actividad meristémática (Balanzá, 2011). Como en los mutantes ful y ap2-170 (un alelo de AP2 parcialmente insensible a la represión del miR172), la expresión de AP2 permanece activa durante más tiempo, también se prolonga la activación de WUS y los meristemos son más longevos.
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Col ful2 ap2-12 ful-2 ap2-12 35S:miR172fenot. Fuerte
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ful235S:miR172
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Nº flores producidas en el tallo principal
Efecto de los factores de transcripción de la familia AP2/ERF sobre la parada de la actividad meristemática
1
TOE1, TOE2, TOE3, SNZ y SMZ podrían estar participando junto a AP2 en la activación de WUS en el SAM y su nivel de expresión estaría controlado por FUL y miR172.
Rastreo de poblaciones estériles mutageneizadas para encontrar nuevos mutantes que permitan identificar los factores genéticos por los cuales el número de semillas producidas controla la parada del SAM
2
Mutagenesis EMS
Mutagenesis Activation Tagging
#1 #6 #2 #3 #4 #5
T1 Crecimiento de cer6 con humedad elevada para conseguir semillas
T2 Selección de plantas donde el SAM pare su actividad antes o después que en el control
Identificación del gen mutado mediante rescate plasmídico.
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Biografía:
Los mutantes ful y ap2-170 producen más frutos, pero con defectos en su desarrollo
Nº frutos en el tallo principal
Expresando un RNAi contra FUL y el alelo ap2-170 bajo el control de promotores especificos de SAM hemos conseguido plantas más productivas y sin defectos en su desarrollo
5’ 3’ pTFL1 AP2170 5’ 3’ pTFL1 FUL FUL intrón
menor producción
aumento producción 10-25%
aumento producción 25-35%
aumento producción 35-40%
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TFL1>>AP2170
5’ 3’ pTFL1 AP2m3
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Col TFL1>>AP2-170 TFL1>>RNAi-FUL
TFL1
FD
Incremento de producción de frutos 10-40%
Co
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Se presentan defectos en la determinación del meristemo floral
Se esperan resultados mejores o similares a los obtenidos con las construcciones TFL1>>AP2-170 y TFL1>>AP2m3
Caracterización de los ortólogos de FUL en Pisum sativum y evaluación del rendimiento en diferentes condiciones de cultivo.
Aumentar la producción de frutos de los cultivos.
El conocimiento que se adquiera con estos trabajos sobre las rutas genéticas que controlan la parada de la actividad meristemática en plantas monocárpicas podría ayudar a la obtención de cultivos más productivos.
Meyerowitz, E. M. y Somerville, C. R. (1994). Arabidopsis. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Balanzá Pérez, Vicente (2011). Tesis doctoral: Nuevas Funciones y Dianas Moleculares del Factor de Transcripcion FRUITFULL en Arabidopsis thaliana.
Bowman, J. L., Smyth, D. R. y Meyerowitz, E. M. (1991). Genetic interactions among floral homeotic genes of Arabidopsis. Development 112, 1-20.
Bowman, J. L. (1994). Arabidopsis: an atlas of morphology y development, (ed., pp. 450. New York: Springer.
Wu, G., Park, M. Y., Conway, S. R., Wang, J. W., Weigel, D. y Poethig, R. S. (2009). The sequential action of miR156 y miR172 regulates developmental timing in Arabidopsis. Cell 138, 750-9.
Wurschum, T., Gross-Hardt, R. y Laux, T. (2006). APETALA2 regulates the stem cell niche in the Arabidopsis shoot meristem. Plant Cell 18, 295-307.
TFL1
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Fourquin y Ferrandiz (no publicado)
Col ful-2 ap2-12
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