25

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

IV.1. Síntesis y Caracterización del Compósito de Hidroxiapatita-Wollastonita

IV.1.1. Análisis Térmico de los Geles Secos

Para conocer el efecto de la temperatura en los geles secos producidos al final

de la etapa sol-gel, se desarrollaron simultáneamente las técnicas de análisis

térmico gravimétrico y análisis térmico diferencial (ATD/ATG), con el objetivo de

detectar las diferentes etapas de transformación que se presentan en estos

materiales, hasta lograr los productos finales deseados.

La Figura 5, muestra las curvas de los análisis ATD/ATG del gel seco,

producido a partir de acetato de calcio y trietil fosfato inmersos en etanol,

formulado para obtener hidroxiapatita estequiométrica, tratado térmicamente

desde la temperatura ambiente hasta 1000°C. Por lo que corresponde a la

curva ATG, el comportamiento de este gel presenta algunas señales de pérdida

en peso al inicio del tratamiento, las cuales pueden atribuirse a pérdidas de

humedad en el sistema, así como la evolución de compuestos orgánicos

presentes aún en el gel, los cuales fueron añadidos como agentes precursores.

Asimismo, la primera transición térmica importante ocurre en el intervalo de

380-420°C, a la cual le corresponde una pérdida en peso de aproximadamente

un 20%, misma que podemos relacionar con un intenso pico exotérmico en la

curva ATD alrededor de 410°C. Esta primera transición ha sido reportada en

otros estudios [6, 8, 17], la cual se atribuye a la formación de hidroxiapatita

acompañada de carbonato de calcio. Alrededor de 650-700°C se observa la

segunda transición térmica importante correspondiente a la conversión del

carbonato de calcio a óxido de calcio.

La descripción anterior nos indica que al final del tratamiento a 1000°C, el

producto corresponde a hidroxiapatita con óxido de calcio como subproducto, lo

cual nos lleva a diseñar una etapa de purificación para eliminar esta segunda

fase indeseable.

26

0 200 400 600 800 10000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1100 200 400 600 800 1000

Endo

Exo

Curva ATD

Curva ATG

Temperatura (°C)

Peso

(%)

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Diferencia de Temperatura (°C/m

g)

Figura 5. Curvas ATD/ATG para la muestra de gel seco de hidroxiapatita-

wollastonita, tratado térmicamente desde la temperatura ambiente hasta 1000oC, con rampa de 10°C/min.

En la Figura 6 se observa el comportamiento de la wollastonita natural, utilizada

en este trabajo, bajo el mismo esquema de tratamiento térmico. El análisis

simultáneo ATD/ATG muestra que este material no presenta ninguna transición

térmica a lo largo de todo el intervalo de temperaturas evaluadas. Lo anterior

nos demuestra que la wollastonita como material de refuerzo, se mantendrá

como fase individual acompañando a la matriz de hidroxiapatita en el

compósito.

Para corroborar cada una de las etapas descritas en los análisis térmicos, se

procedió a desarrollar secuencialmente los tratamientos térmicos respectivos

en los geles secos producidos al final de la etapa sol-gel, y describir

posteriormente su caracterización por diversas técnicas.

27

0 200 400 600 800 10000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1100 200 400 600 800 1000

End

oE

xo

Curva ATG

Curva ATD

Temperatura (°C)

Peso

(%)

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Diferencia de Tem

peratura (°C/m

g)

Figura 6. Curvas ATD/ATG para la muestra de wollastonita tratada térmicamente

desde la temperatura ambiente hasta 1000oC, con rampa de 10ºC/min. IV.1.2. Difracción de Rayos-X

El análisis por difracción de rayos-X para este sistema ha sido caracterizado

extensamente en otros trabajos [6, 8, 17], mismos que han demostrado lo

siguiente: a) El patrón de difracción de rayos-X para el gel seco, producido al

final de la etapa sol-gel, no muestra ningún indicio de la presencia de

hidroxiapatita hasta esta etapa del procesamiento. b) Al tratar el material

térmicamente hasta 500°C, se presentan los primeros indicios de la presencia

de hidroxiapatita acompañada de carbonato de calcio. c) Como se indicó en el

análisis térmico al llegar a la temperatura de 1000°C el carbonato de calcio se

transforma en óxido de calcio, apareciendo como segunda fase junto a la

hidroxiapatita, de acuerdo a la siguiente reacción:

CaCO3 CaO + CO2 (1)

28

Para producir hidroxiapatita pura en los compósitos se desarrolló una etapa de

purificación para eliminar el óxido de calcio presente. Esta etapa consistió en

lavados con ácido clorhídrico diluido (0.01M), promoviendo la conversión de

óxido de calcio a cloruro de calcio, mediante la reacción siguiente:

CaO + 2HCl CaCl2 + H2O (2)

Aprovechando la alta solubilidad del cloruro de calcio en agua, así como la baja

solubilidad de la hidroxiapatita en este medio, se procedió a lavar los materiales

con agua deionizada, caracterizando finalmente el producto sólido purificado.

La Figura 7 muestra el patrón de difracción de rayos-X para el gel obtenido a

partir de acetato de calcio y trietil fosfato inmersos en etanol, con la cantidad de

wollastonita adecuada para producir un material compuesto final con 50 wt% de

hidroxiapatita y 50 wt% de wollastonita, tratado térmicamente hasta 1000°C y

lavado con HCl 0.01M y agua deionizada. La figura demuestra que hasta este

nivel de tratamiento se tiene como productos la fase de hidroxiapatita (JCPDS:

09-0432) conjuntamente con la fase de wollastonita (JCPDS: 84-0654), sin

apreciarse ninguna fase diferente que pudiera corresponder a la

descomposición térmica de las dos primeras.

Lo anterior pone de manifiesto, que el producto final será únicamente una

mezcla de hidroxiapatita y wollastonita con una distribución uniforme de ambas

fases en todo el compósito, como se mostrará más delante en los análisis de

MEB.

Por otro lado, estudios anteriores [6, 8, 17] han demostrado, por diversas

técnicas, que la fase de hidroxiapatita corresponde a hidroxiapatita

carbonatada del tipo-B, correspondiente a una estructura donde una parte de

los iones fosfato de la red de hidroxiapatita han sido sustituidos por iones

carbonato. Sin embargo, este tipo corresponde a la sustitución preferencial

existente en los tejidos duros de los organismos vertebrados, lo cual nos

asegura que nuestro producto es un material muy similar al componente

inorgánico de los tejidos óseos biológicos.

29

10 20 30 40 50 60 70 80

Inte

nsid

ad R

elat

iva

2 Theta (°)

**

*****

+*

**

*

*

***

++**

+

*

+

+++*

*

+

*+

++

+

*

+

*

*

Figura 7. Patrones de difracción de rayos-X para el compósito de Hidroxiapatita

50 wt% (*) y Wollastonita 50 wt% (+).

IV.2. Síntesis y Caracterización del Compósito de Hidroxiapatita-Wollastonita-Quitosana

IV.2.1. Espectroscopia Infrarroja de Transformadas de Fourier (FT-IR)

La Figura 8 muestra, comparativamente, los espectros FT-IR para la muestra

de quitosana grado reactivo (Fig. 8a) y la muestra del compósito formulado

para producir un material con 70 wt% de hidroxiapatita-wollastonita y 30 wt%

de quitosana, obtenido a partir del compósito hidroxiapatita 50 wt%-wollastonita

50 wt% (Fig. 8b). En la Figura 8a se detectan las bandas correspondientes a la muestra de

quitosana ubicadas a longitudes de onda de 3450 cm-1, las cuales

corresponden al grupo OH, 2862 cm-1 del grupo CH, 1658 cm-1, del grupo

Amida I, 1595 cm-1, del grupo –NH2, 1313 cm-1, del grupo Amida III y 1154

cm-1, de los puentes C-O-C [12]. En la Figura 8b referente al compósito de

hidroxiapatita-wollastonita-quitosana, se aprecian nuevamente las bandas

correspondientes a la quitosana; aunque algunas de las bandas de la

hidroxiapatita y wollastonita se encuentran ocluidas por la presencia de las

30

bandas de quitosana, se pueden distinguir algunas bandas distintivas de OH

(3573 cm-1), fosfatos (602 y 571 cm-1) y carbonatos (1469 y 1419 cm-1)

correspondientes a la hidroxiapatita, así como las bandas de silicatos (1100 y

890 cm-1) correspondientes a la wollastonita. Lo anterior pone de manifiesto

que las tres fases que constituyen al compósito permanecen separadas, sin

reaccionar entre sí. Asimismo, la ubicación de las bandas de carbonatos en la

estructura de la hidroxiapatita, corresponde a la fase de hidroxiapatita

carbonatada del tipo-B, de acuerdo con lo reportado en trabajos anteriores

[6, 8, 17].

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

C-O

-CA

mid

a III

NH

2-A

mid

a I

C-H

OH

-

PO

43-

PO

43-

CO

32-

SiO

32-

CO

32-

CO

32-

C-H

Am

ida

IOH

-

(b)

(a)

20%

Tran

smita

ncia

(u.a

.)

Número de Onda (cm-1) Figura 8. Espectros FT-IR de (a) Quitosana grado práctico y (b) Compósito de

Hidroxiapatita-Wollastonita-Quitosana. IV.2.2. Microscopia Electrónica de Barrido (MEB)

Previo al análisis de la morfología de las muestras en MEB, la Figura 9

presenta las fotografías de la quitosana disuelta en ácido acético y

posteriormente precipitada en hidróxido de sodio (Fig. 9a). En ella se puede

apreciar la estructura transparente de una película delgada, la cual aparece

ligeramente contraída dando una apariencia rugosa. Por otro lado, la Figura 9b

muestra la quitosana tratada de forma similar a la descrita anteriormente, pero

31

con un contenido de 70 wt% del compósito de hidroxiapatita-wollastonita. Esta

figura muestra de nuevo una película delgada de quitosana sirviendo como

soporte del compósito, el cual aparece perfectamente distribuido a lo largo y en

ambos lados de dicha película.

Esto pone de manifiesto la adecuada interrelación de las tres fases

involucradas en el material.

(a) (b)

Figura 9. Imagen de (a) Películas hechas a partir de quitosana de grado práctico y

ácido acético. (b) Película de Hidroxiapatita-Wollastonita contenida en una matriz orgánica de Quitosana.

Para ofrecer una idea más clara de la interacción de la fase de hidroxiapatita-

wollastonita, la Figura 10 muestra la imagen en MEB para el compósito 50 wt%

de hidroxiapatita y 50 wt% de wollastonita, en la cual se aprecian las partículas

de hidroxiapatita mostrando formas esféricas de tamaño submicrométrico, con

una fuerte tendencia a aglomerarse. Asimismo, se observa que esta se

encuentra uniformemente distribuida a lo largo de todas las fibras de

wollastonita, marcando una eficiente integración de ambas fases en el

compósito.

32

Figura 10. Imagen en MEB del gel seco formulado para producir Hidroxiapatita pura

50 wt% con Wollastonita 50 wt%. La Figura 11 muestra las imágenes en MEB para el compósito hidroxiapatita-

wollastonita-quitosana a diferentes escalas de magnitud. En todas se aprecia

la presencia del material hidroxiapatita-wollastonita recubriendo toda la

superficie del material orgánico de quitosana, donde se distinguen la presencia

de aglomerados de hidroxiapatita-wollastonita entre la matriz porosa de la

quitosana. Debido a esta porosidad, el compósito adquiere gran importancia, ya

que esta propiedad le confiere una mejor interacción con los fluidos fisiológicos

del organismo dando lugar a una óptima integración con el tejido óseo.

Otra característica importante de este material, es que a la par con la

neoformación ósea vía los materiales hidroxiapatita-wollastonita,

paulatinamente la quitosana se biodegrada, sirviendo únicamente como

material de soporte (scaffold) temporal mientras se completa la regeneración

total de la lesión.

Aunque la aplicación final que se pretende con este material es en forma de

películas, esto no descarta la posibilidad de utilizarlo también en forma de

polvos. Sin embargo, trabajos anteriores [6] demostraron que proporciones

33

alrededor del 50 wt% de quitosana en los compósitos hacen imposible su

pulverización, restringiendo su aplicación a la forma de películas. Por tal razón,

el producto de este trabajo contiene un 30 wt% de quitosana para poder

manipularlo con ambos propósitos.

(a) (b)

(c) (d)

Figura 11. Imágenes en MEB de la morfología del compósito de Hidroxiapatita-

Wollastonita-Quitosana con ampliaciones de (a) 200 µm, (b) 100 µm, (c) 20 µm y (d) 10 µm.

IV.3. Evaluación de las Propiedades Bioactivas del Compósito de Hidroxiapatita-Wollastonita-Quitosana

IV.3.1. Evaluación del comportamiento del compósito de Hidroxiapatita-Wollastonita-Quitosana en la solución SBF

Las Figuras 12 y 13 muestran las imágenes en MEB de las superficies del

compósito de hidroxiapatita-wollastonita-quitosana inmerso durante 1 y 4

semanas, respectivamente. La Figura 12 muestra desde la primera semana la

aparición de aglomerados de partículas presentando una apariencia densa,

producto de la formación de nuevas partículas sobre las partículas existentes

34

inicialmente. Esto queda demostrado con la amplificación mostrada en la

Figura 12b, donde se puede apreciar que algunas zonas de estas capas

densas conservan una estructura porosa, la cual tiende a desaparecer con el

tiempo de inmersión.

Por otro lado, también se aprecia la presencia de partículas de apariencia

esférica formando pequeños cúmulos débilmente condensados. Estudios

anteriores [8], han demostrado que el comportamiento de la fase de

wollastonita en la solución SBF da lugar a la formación de las capas densas,

mientras que la fase de hidroxiapatita genera la formación de los pequeños

cúmulos antes mencionados. A esta nueva capa la denominaremos “apatita

neoformada” por su semejanza con las apatitas biológicas formadas por los

materiales bioactivos al estar en contacto con fluidos fisiológicos.

(a) (b) Figura 12. Imágenes en MEB de las superficies del compósito de hidroxiapatita-

wollastonita-quitosana inmerso en la solución SBF durante 1 semana, con ampliaciones de (a) 100 µm, (b) 10 µm.

La Figura 13 muestra la apariencia de la capa de apatita neoformada después

de cuatro semanas de inmersión en la solución SBF, ésta aparece mejor

distribuida sobre la superficie del material, generando capas ligeramente más

densas y conservando una ligera apariencia porosa.

35

(a) (b)

(c)

Figura 13. Imágenes en MEB de las superficies del compósito de hidroxiapatita-

wollastonita-quitosana inmerso en la solución SBF durante 4 semanas, con ampliaciones de (a) 100 µm, (b) 50 µm y (c) 20 µm.

En la Figura 15 se muestran los cambios de pH y las variaciones en la

concentración de Ca, P y Si en la solución SBF, como resultado de la

inmersión del compósito de hidroxiapatita-wollastonita-quitosana durante varios

períodos de tiempo. Tales cambios son correlacionados con la bioactividad y

solubilidad de este material.

Esta figura muestra desde las etapas iniciales de inmersión, un incremento en

las concentraciones de Ca y Si, mientras que la concentración de P disminuye

constantemente desde las primeras etapas de inmersión. Asimismo, se

aprecia un incremento del pH durante las primeras dos semanas, el cual tiende

a disminuir a partir de la tercera semana, alcanzando un aparente equilibrio

entre ésta y la cuarta semana. En el material compuesto de hidroxiapatita-

wollastonita-quitosana los iones Ca se disuelven a partir de la hidroxiapatita y la

wollastonita, mientras que los iones Si y P se disuelven únicamente de la

wollastonita y la hidroxiapatita respectivamente. Sin embargo, existe un

36

aparente exceso de iones Ca en solución, lo cual indica que su disolución es

mayor que su consumo.

0 1 2 3 4

0

25

50

75

100

125

150

175

200

Si

pH

P

Ca

Tiempo de Inmersión (semanas)

Con

cent

raci

ón (p

pm)

7.0

7.1

7.2

7.3

7.4

7.5

7.6

7.7

7.8

7.9

8.0

pH

Figura 14. Variación en la concentración de Ca, P y Si, y valores de pH en la solución

SBF, cuando los compósitos de hidroxiapatita-wollastonita-quitosana fueron sumergidos durante 1, 2, 3 y 4 semanas en esta solución.

El cambio en la concentración iónica de la solución SBF, provoca reacciones

de precipitación de materiales neoformados sobre la superficie del compósito

mediante la siguiente secuencia de etapas: la disolución de iones Ca del

material inmerso en la solución SBF permite un incremento en el grado de

supersaturación local, causando un incremento en el pH de la solución, dando

como resultado la producción de apatita neoformada mediante el consumo de

Ca2+, PO43- y OH-, lo cual se refleja en una disminución de la concentración de

iones P en la solución. Por otro lado, aunque para la producción de la capa de

apatita neoformada se consumen iones Ca, aparentemente la disolución de

estos a partir del compósito es mayor que su consumo, por tal razón la

concentración de estos iones se mantiene siempre en aumento durante las

cuatro semanas de evaluación, mientras que la concentración de iones P se

mantiene siempre a la baja, lo que indica que prácticamente la totalidad de este

37

ion se consume para la producción de la capa antes mencionada. Asimismo,

esta figura muestra un aumento en la concentración de Si a lo largo de todo el

período. Es importante mencionar que aunque los iones Ca son liberados tanto

por la hidroxiapatita como por la wollastonita, estudios anteriores [8] muestran

que la wollastonita tiene un mayor aporte de estos iones a la solución en

relación con la hidroxiapatita.

En la wollastonita la disolución de iones Ca es más rápida que la de los iones

Si. Los iones Ca se liberan a la solución, con la cual se intercambian iones H

para formar una capa de sílica hidratada sobre la superficie de las fibras de

wollastonita, dando lugar a la formación de grupos silanol (Si-OH), los cuales

son considerados como catalizadores para la nucleación y crecimiento de la

capa de apatita neoformada (Figura 15).

Figura 15. Mecanismo de formación de apatita sobre wollastonita.

38

Por lo que corresponde a la hidroxiapatita, al ser expuesta a la solución SBF

presenta una carga superficial negativa, conferida por los iones fosfato e

hidroxilo. Lo anterior permite la interacción con los iones Ca de la solución,

formando una capa inicial de fosfato de calcio amorfo “rico en calcio”, dando

lugar a una capa superficial positiva. Esta interactúa con los iones fosfato de la

solución, transformando la capa anterior a una capa de fosfato de calcio amorfo

“pobre en calcio”, la cual cristaliza finalmente en la capa de apatita neoformada

(Figura 16).

Figura 16. Mecanismo de formación de apatita sobre hidroxiapatita.

En base a lo anterior, el material estudiado mostró buena habilidad para la

formación de una nueva capa de apatita sobre su superficie al ponerse en

contacto con la solución SBF. Los cambios en las concentraciones de los iones

Ca, P y Si, así como el comportamiento del pH de la solución SBF demuestra

que, durante las pruebas de inmersión tiene lugar la disolución superficial de

los materiales, con un consumo simultáneo de P a partir de la solución. Al final

del período de evaluación, las concentraciones de estos iones, así como el

valor de pH permanecen prácticamente constantes, lo cual indica un aparente

estado de equilibrio entre los mecanismos de disolución y precipitación.