Curso Internacional de Ciencia y Tecnología

Curso de Ciencias Para Profesores Julio 2013

20 de Julio 2013

Universidad Ricardo Palma

Organizado por:

Científicos Peruanos Jóvenes en el Perú y el Extranjero

Centro de Preparación para la Ciencia y Tecnología

Universidad Ricardo Palma

http://escueladeciencias.hol.es

Pirazinamidasa de Mycobacterium tuberculosis

Msc. Daniel Rueda

Laboratorio de Bioinformática y Biología Molecular

LID - UPCH

Investigación en Biomedicina

• La Tuberculosis (TB) es una enfermedad que se transmite por el aire causada por Mycobacterium tuberculosis

• La Tuberculosis es la causante de la mas alta tasa de mortalidad a nivel muldial.

• El 80% de la tuberculosis es pulmonar

Tuberculosis

• Infected = 2 billion • Cases = 20 million • New cases = 8 million per year • Deaths = 2 million per year

Source: Organization, W.H., Global Tuberculosis Control Surveillance, Planning, Financing. 2007.

Tuberculosis : Epidemiología Global

• Compuesto activo contra M. tuberculosis, M. africanum, M. microti

• Es una pro-droga convertida por la Pirazinamidasa (PZase) en su forma activa

La Pirazinamida : PZA

20 aminóácidos :

Proteinas

Formación de puentes disulfuro

Unión covalente

entre 2 aminoácidos

Puentes di-sulfuro entre cisteínas

de una misma proteína, o de

distintas proteínas

Complejos protéicos

(dímeros, trímeros,.. etc)

Electroforesis de proteínas La carga neta de una

proteina depende del pH Proteina

SDS : carga ”–”

Buffer Solución reductora (rompe puentes disulfuro)

Azul de bromofenol

PI -

+

ADN

Pirazinamidasa de M. tuberculosis

Gen pncA (561bp)

Pirazinamidasa (181aa)

Maquinaria celular

α4 β6α2 β4 α3 β5β1 α1 β2 β3

Pirazinamidasa recombinante

α4 β6α2 β4 α3 β5β1 α1 β2 β3

Gen pncA (561bp) + 15 pb

Pirazinamidasa (181aa)

Maquinaria celular

H-H-H-H-H-H

histidinas

Se inserta el gen de la proteína en un vector y se le agrega 6 H

Inserción en una bacteria E.coli

Clonación de una Proteina

(Pirazinamidasa)

Se crece la bacteria en grandes cantidades

La bacteria produce la proteina de interés en grandes cantidades

Pirazinamidasa: Expresión – Purificación

Cromatografía de Afinidad

Tubos 10 11 12 13 14 M 15 16

12% SDS-PAGE

bajo condiciones reductoras (betamercapto etanol)

31 kDa

21 kDa

12% SDS-PAGE

bajo condiciones NO reductoras

sin DTT - sin Betamercapto etanol

PZAsa

75

50

15

37

25

20

10

PZAsa

¿dimero?

monómero

trímero

dímero

PZAsa : 10 mg/ml

PZAsa : 1-2 mg/ml

PZAasa: Homo - multímero

Generación de anticuerpos anti-Pirazinamidasa

Inmunización con la

Pirazinamidasa

Westen inmunoblot

¿ Dimero de PZAsa?

Westen inmunoblot

5X 4X 3X

. 2X

1X

¿ Homo-multímeros ?

PZAsa H37 Rv forma homo-multímeros

PZAasa: Homo - multímero

b₁₆⁺

1755.82874

b₁₅⁺

1656.75928

b₇⁺

734.36951

y₇⁺

791.44971

y₆⁺

654.39117

y₁₄⁺

1524.77612

y₆²⁺-H₂O, y₆²⁺-NH₃, y₃⁺

319.19672

y₁₁⁺

1211.61267

b₅⁺

550.24878

y₁₃⁺

1411.69275

[M+2H]²⁺, [M+2H]²⁺+H

1038.01343

500 1000 1500 2000

m/z

0

500

1000

1500

2000

2500

Inte

ns

ity [co

un

ts]

Extracted from: C:\Documents and Settings\LTQ XL\Desktop\Pirazymidase2 (2).raw #2967 RT: 64.13 FTMS, HCD, z=+2, Mono m/z=1037.51831 Da, MH+=2074.02934 Da, Match Tol.=0.8 Da

b₁₆⁺

1755.83252

b₁₅⁺

1656.76416

y₇⁺

791.45203

y₁₅²⁺

844.42505

y₆⁺

654.39282

y₁₄⁺

1524.78064

y₆²⁺-H₂O, y₆²⁺-NH₃, y₃⁺

319.19763

y₁₁⁺

1211.61633

b₅⁺

550.25031

y₁₃⁺

1411.69629

[M+2H]²⁺, [M+2H]²⁺+H

1038.01660

500 1000 1500 2000

m/z

0

200

400

600

800

1000

1200

Inte

ns

ity [co

un

ts]

Extracted from: C:\Documents and Settings\LTQ XL\Desktop\Pirazymidase2.raw #2332 RT: 54.41 FTMS, HCD, z=+2, Mono m/z=1037.51660 Da, MH+=2074.02593 Da, Match Tol.=0.8 Da

b₁₆⁺

1755.84265

b₁₅⁺

1656.77429

y₇⁺

791.45630

y₆⁺

654.39655

y₁₄⁺

1524.78882

y₆²⁺-H₂O, y₆²⁺-NH₃, y₃⁺

319.19934

y₁₂⁺

1340.66589

b₅⁺

550.25342

y₁₃⁺

1411.70398

[M+2H]²⁺-H, [M+2H]²⁺, [M+2H]²⁺+H

1037.52039

500 1000 1500 2000

m/z

0

100

200

300

400

500

600

700

Inte

ns

ity

[co

un

ts]

Extracted from: C:\Documents and Settings\LTQ XL\Desktop\Pirazymidase2 (1).raw #1355 RT: 36.64 FTMS, HCD, z=+2, Mono m/z=1037.52234 Da, MH+=2074.03740 Da, Match Tol.=0.8 Da

Purificación : Columna de

Exclusión Molecular

Purificación : Columna Niquel

Se midio la actividad de la PZAsa por el test de Wayne luego de 48 horas de incubación

PZAasa: Homo - multímero Los Complejos tienen actividad enzimática?

Pirazinamidasa recombinante

Cisteina138 – Cisteina184

Servidor HADDOCK - Predicción de los residuos de

interacción entre 2 monómeros de PZAsa

PZAsa 1 - PZAsa 2

Las energías mas bajas

de interacción se dan

entre C184 y C138

C14 - C72 - C138 - C184

residuo catalítico

residuo en la superficie

Al formarse los complejos se reduce la actividad de PZAsa

Modelo de formación de los complejos de PZAsa

Hipótesis

PZAsa activa

UPCH, Perú INSP, UNAM México

• Dr. Mirko Zimic

• Dr. Patricia Sheen

• Dr. Robert Gilman

• Carlos Bueno

• Marco Santos

• MSc. Daniel Rueda

• Dr. Victoria Pando

• Dr. Cesar Batista