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ÍNDICE

� INTRODUCCIÓN: DEFINICIONES � BIOENERGÉTICA � ATP � METABOLISMO CELULAR � ENZIMAS � INHIBICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA � REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

CAPITULO 4

Queda hecho el depósito que marca la ley 11.723. Prohibida su reproducción total o parcial

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INTRODUCCIÓN AL METABOLISMO El desarme de un virus mortal: las proteasas y sus inhibidores Todos los fármacos inhibidores de proteasa en uso en la actualidad para combatir el VIH, así como los que se utilizan para combatir otras enfermedades infecciosas e incluso el cáncer, deben su existencia a un descubrimiento realizado hace más de 120 años por el científico alemán Wilhelm Kühne. En 1876, Kühne descubrió una sustancia en el jugo pancreático capaz de degradar otras sustancias biológicas. El descubrimiento de Kühne fue el primer paso crucial en el desarrollo de los inhibidores de proteasa que se utilizan para combatir el VIH, pero aún tendría que pasar más de medio siglo para que los científicos llegaran a utilizarlo.

INTRODUCCIÓN A LA ENERGÉTICA MARCO TEÓRICO

Se enumeran algunas definiciones para comprender qué se entiende por energía y cuáles son las leyes que gobiernan sus transformaciones. Energía: es la capacidad de realizar un trabajo. Existen diferentes tipos de energía: cinética (del movimiento), calórica, eléctrica, radiante, química, etc. La

energía química, contenida en las uniones de los átomos que forman las moléculas, es la que utilizan los seres vivos. Primera ley de la termodinámica o ley de la conservación de la energía: la energía no se crea ni se destruye, sino que se transforma de un tipo de energía en otro. Por ejemplo, la energía química del combustible de un auto, se transforma en cinética (movimiento del auto) y en calórica (calor desprendido por el motor). Energía útil y energía no útil: la energía útil es la que permite realizar un trabajo determinado. Volviendo al ejemplo anterior, la energía útil del combustible permite el funcionamiento del auto, pero la energía calórica que se libera, no. Este calor no se pierde (porque la energía no se destruye) pero es “no útil”. Proceso espontáneo: en un proceso en el cual, el estado inicial de un sistema tiene mayor energía que el estado final. El combustible del auto tiene mayor energía útil que el combustible consumido (que está transformado dióxido de carbono y no sirve para hacer funcionar el auto). Proceso no espontáneo: es un proceso en el cual, la energía inicial de un sistema es menor que la energía final. Si se pudieran tomar las moléculas de dióxido de carbono, unirlas entre sí y volver a formar combustible, estaríamos en presencia de un proceso no espontáneo. Para lograrlo se necesita incorporar energía externa.


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Entropía: es una medida del desorden de un sistema. A mayor entropía, mayor desorden y viceversa. Segunda ley de la termodinámica: En todo cambio energético, los sistemas pasan a un estado de menor energía, ya que parte de la energía inicial se libera como calor. Si bien existen procesos espontáneos que hacen el camino inverso, éstos requieren energía, por lo cual, requieren de un sistema mayor que aporte energía y por ende, ese sistema mayor también estará pasando de un estado de mayor a menor energía, y liberando calor. La Segunda Ley también dice que el universo tiende al desorden, porque la energía no útil (que permite el orden) se transforma en no útil.

Consulta la bibliografía y explica por qué todo sistema tiende a aumentar su entropía.

MARCO TEÓRICO

BIOENERGÉTICA Las células permanentemente necesitan energía para realizar distintos tipos de actividades, como:

� Sintetizar moléculas (aminoácidos, proteínas, lípidos, nucleótidos, etc.). � Transportar sustancias a través de las membranas. � Realizar trabajo mecánico, como la contracción muscular o el movimiento

de organelas. Esa energía la obtienen de los alimentos; pero con ellos, también obtienen materia prima para fabricar nuevas moléculas. Por ende, el alimento es fuente de materia y de energía. Tras incorporar los alimentos, las células los degradan y transforman la energía química en cinética y en calórica, que es liberada al entorno. Por otra parte, los alimentos degradados producen desechos que también son liberados al entorno (dióxido de carbono, materia fecal, agua, orina). En consecuencia, los seres vivos obtienen materia y energía del entorno y también liberan materia y energía hacia él: son sistemas abiertos. Autótrofos y heterótrofos Todas organismos requieren energía de los alimentos, pero no todos los organismos obtienen el alimento del mismo modo. Los heterótrofos lo toman del ambiente; en otras palabras: comen. Los autótrofos, en cambio, lo fabrican utilizando la energía lumínica del sol. Luego, ambos tipos de organismos utilizan el alimento de manera similar: lo degradan y aprovechan su energía química.


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EL ATP: INTERMEDIARIO ENERGÉTICO Recordemos (ver capítulo de ácidos nucleicos) que el ATP es una molécula formada por una ribosa, una base nitrogenada (adenina) y tres grupos fosfatos. Si en lugar de dos fosfatos tuviera dos, en lugar de ATP es ADP (Figura 1).

Figura 1. ATP y ADP

Si bien todas las células utilizan energía proveniente de los alimentos, ésta no se utiliza directamente, sino que se requiere al ATP como intermediario, como se verá a continuación. En primer lugar, los alimentos presentes en la célula (monosacáridos, ácido grasos o aminoácidos) se oxidan (degradan) y liberan la energía química contenida en sus enlaces covalentes. Al mismo tiempo, en las células hay moléculas de ADP (previamente sintetizadas por ellas) y grupos fosfatos. Con la energía química liberada de los alimentos, los fosfatos se unen al ADP y se forma el ATP (el proceso se verá en el capítulo de respiración celular). La energía química de los alimentos se encuentra ahora en el enlace entre los fosfatos (Figura 2).

Cada vez que las células requieren energía, los enlaces entre los fosfatos se rompen y la energía contenida en ellos, se libera y es utilizada por la célula. En la figura 3 se muestra que la energía liberada por el ATP, se utiliza para fabricar una molécula.

Figura 2. El alimento se degrada y la energía de éste, pasa al ATP

Figura 3. El ATP se hidroliza y la energía liberada se utiliza para sintetizar otra sustancia


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Consulta la bibliografía y explica qué es el ciclo del ATP.

METABOLISMO Vimos que hay dos tipos de reacciones: reacciones en las que se degrada el alimento y se libera energía; y reacciones en las que se sintetizan moléculas y se consume energía.

� Las de degradación son catabólicas, y como liberan energía, son exergónicas. � Las de síntesis son anabólicas, y como consumen energía, son endergónicas.

El conjunto de ambos tipos de reacciones es el metabolismo. Ambas se resumen en la Tabla 1. Estos dos tipos de reacciones están acopladas: para que haya reacciones anabólicas que consumen energía, tiene que haber habido previamente, reacciones catabólicas que la liberen. El intermediario que las vincula es el ATP, que transporta la energía liberada en las reacciones catabólicas, hacia las anabólicas.

Reacciones catabólicas Reacciones anabólicas En cuanto a la transformación de la materia

Se produce una degradación: de sustancias complejas se obtienen sustancias más simples

Se produce una síntesis: de sustancias simples se obtienen sustancias más complejas

En cuanto a la energía

Son exergónicas: liberan energía

Son endergónicas: consumen energía

Tabla 1. Reacciones catabólicas y anabólicas

PARTICIPACIÓN DE LAS ENZIMAS EN EL METABOLISMO Reacciones sin enzimas

Para que se produzca una reacción química, por ejemplo, una anabólica (de síntesis) las moléculas reaccionantes, primero deben chocar entre sí. Estos choques son al azar, y muchos de ellos no producen la reacción porque las moléculas no se encuentran con la energía suficiente o no chocan de la manera adecuada (Figura 4)

Figura 4. Los reactivos chocan al azar hasta que se produce la reacción y el producto.


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A mayor energía cinética, habrá más probabilidad de choques y por ende, más probabilidad de que las moléculas se combinen de la manera adecuada. Esta energía cinética es la energía de activación: la energía necesaria para que se produzca una reacción química. Reacciones con enzimas

Figura 5. Los sustratos se unen al sitio activo de la enzima, se

forma un complejo enzima sustrato y finalmente, se libera el

producto.

Si bien los sustratos deben chocar con la enzima, se requiere menos energía para que se combinen de la manera adecuada y reaccionen. Lo que hacen las enzimas es disminuir la energía de activación, esto es, disminuir la cantidad y energía de los choques entre los reactivos. Las sustancias que aceleran las reacciones disminuyendo la energía de activación se llaman catalizadores. Existen catalizadores industriales y biológicos; las enzimas se ubican dentro de éstos últimos. Vías metabólicas A menudo una reacción anabólica o catabólica no consiste en una única reacción sino en varias reacciones sucesivas en las que participan varias enzimas. En este caso, el producto de una enzima será el sustrato para la enzima siguiente, y así sucesivamente hasta llegar a un producto final. Esta secuencia de reacciones es una vía metabólica A B C D Producto final A, B, C, D son los productos/sustratos (las enzimas no están graficadas)

Las enzimas son proteínas que permiten que la reacción se realice con mayor rapidez. Estas proteínas presentan una región llamada sitio activo, que es complementaria a los reactivos o sustratos. Los sustratos se unen al sitio activo, que los ubica de manera tal, que la reacción se facilite (Figura 5).


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Características de las enzimas (y de los catalizadores en general)

Clasificación de las enzimas: Tipos de enzimas

No se consumen durante la reacción, sino que pueden reutilizarse.

No modifican la reacción: los productos son iguales si se hacen con o sin enzimas

Son específicas: cada tipo de reacción requiere un determinado tipo de enzima, porque los sustratos son distintos (Figura 6)

Características

Figura 6. Especificidad

Simples: solo tienen una parte proteica

Conjugadas: tienen una parte proteica y una parte no proteica llamada cofactor, que puede ser:

Un ión orgánico

Una molécula orgánica o coenzima


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Reconocimiento del sustrato (Figura 7)

Figura 7. Modelos de llave–cerradura y ajuste inducido

Consulta la bibliografía y explica qué una holoenzima

CINÉTICA ENZIMÁTICA La cinética enzimática estudia la velocidad a la que se producen las reacciones. La forma de determinar la velocidad es midiendo el número de moléculas de producto formadas (o el número de moléculas de sustrato consumido) por unidad de tiempo. Factores que afectan la cinética enzimática Temperatura: a mayor temperatura habrá mas choques entre los sustratos y las enzimas. No obstante, si la temperatura es muy elevada, las enzimas se desnaturalizan y pierden actividad. Por el contrario, a bajas temperaturas, la enzima no se desnaturaliza, pero tampoco tiene actividad. pH: cuando cambia el pH, cambia la carga de los aminoácidos que forman las enzimas, lo que hace que cambian las interacciones entre ellos y por ende, la estructura espacial de la proteína. Esto hace que la enzima se active o se inactive. Concentración de sustrato: si la concentración de sustrato es elevada, las enzimas actuarán a mayor velocidad porque habrá mayor probabilidad de que una enzima se encuentre con el/los sustratos (Figura 8).

Se proponen dos modelos para explicar el reconocimiento enzima – sustrato 1. Modelo llave cerradura: el sustrato se une al sitio activo de la misma forma que una llave entra en una cerradura. Esto implica que el sitio activo es rígido. 2. Modelo de ajuste inducido: el sustrato se “amolda” al sitio activo de la enzima. Esto implica que el sitio activo no es rígido.


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En el primer recuadro, no todas las enzimas catalizan porque hay poco sustrato para ocupar los sitios activos (los productos no están graficados). En el segundo recuadro, hay suficiente sustrato como para que la mitad de los sitios activos estén ocupados y las enzimas produzcan más producto. En el último recuadro, la concentración de sustrato es tan alta, que todas las enzimas siempre tendrán el sitio activo ocupado, porque ni bien una enzima libere un producto, inmediatamente, otro sustrato se unirá a su sitio activo. Acá, las enzimas están saturadas: trabajan a máxima capacidad, no pueden catalizar más rápidamente de lo que lo hacen. Esto proceso puede graficarse en un eje de coordenadas, que muestra cómo varía la velocidad enzimática si se aumenta la concentración de sustrato (Figura 9). La parte A del gráfico equivale a la figura 8-1, la parte B a la 8-2 y la parte C, a la 8-3.

Figura 8. Enzimas con

distintas concentraciones de sustrato (productos no graficados)

Figura 9. Velocidad enzimática en función de la concentración de sustrato

Si en C, todos los sitios activos están ocupados y las enzimas trabajan a su velocidad máxima, se deduce que en B, donde la mitad de los sitios activos están ocupados, las enzimas trabajan a la mitad de su velocidad máxima. Ahora bien, en B (o en la figura 8-2) hay que tener en cuenta otro factor: la afinidad de la enzima por el sustrato. Si la afinidad es baja, se requiere mucho sustrato para ocupar la mitad de los sitios activos; pero si la afinidad es alta, la mitad de los sitios activos pueden ocuparse aunque haya poco sustrato (Figura 10).


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El Km es un valor que mide la afinidad de la enzima por el sustrato y corresponde a la cantidad de sustrato necesaria para ocupar la mitad de los sitios activos de la enzima: alto Km indica que se necesita mucho sustrato, por lo tanto, hay poca afinidad; inversamente, bajo Km, indica que se requiere poco sustrato y hay alta afinidad. La relación entre la velocidad de la actividad enzimática y la concentración de sustrato, se describe mediante la ecuación de Michaelis-Menten. Las enzimas cuya actividad en función de la concentración de sustrato, describe una hipérbole, como la de la figura 9, se denominan michaelianas (otras enzimas describen una curva distinta, como se verá luego).

Consulta la bibliografía e investiga qué indica la ecuación de Lineweaver-Burk.

INHIBICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA La actividad de una enzima puede aumentar o disminuir ante la presencia de sustancias inhibidoras. Los tipos de inhibición son los siguientes:

� Irreversible: el inhibidor se une a la enzima y le provoca un cambio permanente que le hace perder su actividad para siempre (plomo, compuestos del mercurio, arsénico, etc.).

� Reversible: el inhibidor se une a la enzima, pero también puede liberarse. La enzima

se inutiliza solo cuando está unida al inhibidor y vuelve a funcionar una vez que éste se libera. Puede haber tres tipos de inhibición reversible: competitiva, no competitiva y acompetitiva.

Figura 10. Enzimas con baja y alta afinidad por el sustrato (comparar los sitios activos ocupados, en ambos casos)


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La afinidad de la enzima por el sustrato disminuye en presencia de inhibidor (aumenta el Km) ya que éste impide que se una el sustrato. Por lo tanto, la enzima no alcanza la misma velocidad máxima que una enzima sin inhibidor. No obstante, si se aumenta mucho la concentración de sustrato, desplazará al inhibidor y el efecto de éste será prácticamente nulo. En consecuencia, la enzima alcanzará a la velocidad máxima como si no hubiera inhibidor .

A diferencia del caso anterior, el inhibidor no competitivo no modifica el Km porque al no unirse al sitio activo, no modifica la afinidad entre la enzima y el sustrato. Por la misma razón, un aumento del sustrato no desplazará al inhibidor ni permitirá alcanzar la velocidad máxima a la enzima.

Al igual que el caso anterior, como el inhibidor no se une al sitio activo, un aumento del sustrato no desplazará al inhibidor ni permitirá alcanzar la velocidad máxima. El Km disminuye, pero eso se debe a que gracias al inhibidor, hay gran cantidad de complejos enzima-sustrato-inhibidor, por eso se necesita poco sustrato para ocupar la mitad de los sitios activos de las enzimas libres.

Consulta la bibliografía realiza un cuadro comparativo entre los tres tipos de inhibiciones. Cómo se modifica el Km y la Vmax en cada una?

1. Competitiva: el inhibidor se asemeja al sustrato y se une al sitio activo, impidiendo que se una el sustrato (Figura 11)

2. No competitiva: el inhibidor se une a la enzima pero no impide que el sustrato se una al sitio activo. No obstante, el inhibidor impide la

formación de producto (Figura 12).

3. Acompetitiva: el inhibidor se une al complejo enzima sustrato, es decir, una vez que el sustrato

se unió al sitio activo (Figura 13).

Figura 11. Inhibición competitiva

Figura 12. Inhibición no competitiva

Figura 13. Inhibición

acompetitiva


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REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA La regulación de la actividad enzimática consiste en aumentar o disminuir la actividad de las enzimas. Existen distintos mecanismos para ello:

1) Regular la actividad catalítica. 2) Regular la síntesis. 3) Regular la degradación

1. Regulación de la actividad catalítica Efecto alostérico

Figura 14. Modulación negativa y positiva

El modulador puede ser una molécula diferente al sustrato (modulador heterotrópico) o bien, puede ser el sustrato (modulador homotrópico). En el segundo caso, la molécula de sustrato que hace de modulador positivo, puede unirse a un sitio alostérico distinto al sitio activo (como en la Figura 14) o bien, puede ocurrir que la enzima tenga varias subunidades con varios sitios activos. En este caso, la unión del sustrato a un sitio activo favorece la unión de otro sustrato al siguiente sitio activo, produciendo un efecto cooperativo similar al de la hemoglobina cuando se une al oxígeno (Figura 15). Si se grafica la velocidad enzimática en función de la concentración de sustrato, la curva será sigmoide, a diferencia de la curva hiperbólica de las enzimas michaelianas.

Figura 15. Modulación positiva con modulador homotrópico

Algunas enzimas, además del sitio activo presentan otro sitio denominado “alostérico”. Al sitio alostérico puede unirse una sustancia llamada modulador, que cambia la conformación de la enzima, haciendo que ésta tenga mayor o menor afinidad por el sustrato, lo que conduce a la mayor o menor formación de producto. Si el modulador aumenta la afinidad de la enzima por el sustrato, es “positivo”; si produce disminución de la afinidad, es “negativo” (Figura 14).


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Figuras 16. Inhibición por producto final. A, B y C son productos que luego act{uan como sustratos.

P es el producto final que actúa como modulador negativo

Sistemas multienzimáticos: En una vía metabólica, el producto final puede ser al mismo tiempo, modulador negativo de la primera enzima de la vía; de ese modo, si hay exceso de producto, se detiene su producción. En otras ocasiones, un exceso de sustrato hace de modulador positivo homotrópico para la primera enzima de la vía. El primer caso de regulación se denomina “inhibición por producto final” y el segundo, “activación por precursor” (Figuras 16 y 17 respectivamente)

Figuras 17. Activación por precursor. El sustrato es además modulador positivo que aumenta la afinidad de la enzima


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Modificación covalente: Compartimentalización: las enzimas que participan de una vía metabólica no se encuentran dispersas, sino físicamente cercanas o en compartimientos, de modo que el producto liberado por una enzima se encuentre rápidamente con la siguiente enzima a lo largo de la vía metabólica. Por ejemplo, enzimas de la respiración celular se encuentran en la mitocondria; las fotosintéticas en el cloroplasto, etc. Isoenzimas: en distintos tejidos (o en la misma célula) pueden existir variantes de una enzima, que catalizan la misma reacción, aunque pueden tener distintas afinidades por el sustrato en distintos tejidos, según los requerimientos de cada uno de ellos. 2. Regulación de la síntesis: En lugar de modificar las enzimas ya existentes aumentando o disminuyendo su actividad (como los ejemplos anteriores) las células puede sintetizar o dejar de sintetizar enzimas en los ribosomas. Este mecanismo se verá en capítulos posteriores.

Reversible: la enzima puede ser activada o desactivada cuando otra enzima le agrega o le quita un grupo químico. Por ejemplo, si se le agrega un grupo fosfato, puede activarse; si se le quita, inhibirse (Figura 18).

Figura 18. Modificación covalente reversible

Irreversible: una enzima puede sintetizarse en forma inactiva (zimógeno) y activarse cuando otra enzima rompe un enlace peptídico determinado. El proceso es irreversible (Figura 19)

Figura 19. Precursor inactivo que se hidroliza y pasa a una forma activa


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3. Regulación de la degradación de enzimas: En lugar de inhibir una enzima, la célula puede degradarlas. La ausencia de sustratos y cofactores puede alterar la conformación de las enzimas, haciéndolas susceptibles a la degradación.

Cuestionario

1. Según la primera ley de la termodinámica: a. la materia no puede crearse ni destruirse b. la entropía del universo disminuye c. la entropía del universo aumenta d. la energía del universo permanece constante

2. La segunda ley de la termodinámica postula que: a. la energía libre aumenta de forma constante b. la energía útil para los seres vivos es la calórico c. los procesos químicos y físicos tienden a aumentar la entropía d. la energía inútil para la célula devuelta al entorno disminuye la entropía del universo.

3. Los seres vivos, con respecto a las leyes de la termodinámica: a. cumplen con la 1° ley pero no con la 2°ley, ya que poseen un elevado grado de orden b. cumplen con la 2° pero no con la 1°ley, ya que se encuentran en un estado

estacionario c. cumplen con la 1°y 2° ley, porque son sistemas abiertos que mantienen su orden

aumentando la entropía del entorno.

4. Marque la frase correcta. a. El ATP se sintetiza acoplado a reacciones anabólicas b. La energía liberada por las reacciones exergónicas es recuperada, parcialmente, en

forma de ATP c. La energía requerida por las reacciones exergónicas es aportada por la ruptura de

ATP d. Todas las reacciones catabólicas son endergónicas.

5. Una enzima acelera una reacción metabólica porque: a. permite que dicha reacción ocurra espontáneamente b. aumenta la energía inicial de la reacción c. disminuye la energía inicial de la reacción d. disminuye la energía de activación

6. Las enzimas: a. modifican los estados iniciales y finales de una reacción b. Modifican solo el curso de la reacción c. Alteran el equilibrio de las reacciones que catalizan d. No se recuperan luego de la reacción


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7. Complete la siguiente frase Las enzimas se pueden clasificar enNNNNNN.si solo están constituida por proteínas con actividad catalítica y en enzimasNNNNNNsi requieren que otra sustancia no proteica, denominadaNNNNN, que interactúe con la porción proteica para ser activas. La porción proteica sola recibe el nombre deNNNN..y la no proteica pueden serNNNN.oNNNNNconstituyéndose la forma activa llamadaNNNNNN 8. ¿Cuál de las siguientes frases es aplicable a las enzimas?

a. el modelo de llave cerradura postula la complementariedad inducida entre la enzima y el sustrato

b. si se altera la estructura tridimensional se pierde su actividad catalítica c. actúan catalizando solo reacciones espontáneas d. las uniones entre las enzimas y sus sustratos son fuertes, son uniones covalentes

9. ¿Cuáles son los factores que determinan variaciones en la cinética enzimática? 10. La velocidad de una reacción catalizada por una enzima

a. aumenta siempre a cualquier concentración de sustrato b. aumenta cuando aumenta la concentración de enzimas c. no varia con cambios en la temperatura d. disminuye siempre a bajo pH

11. Los inhibidores: a. no competitivos disminuyen el Km aparente de una enzima b. acompetitivos no se unen nunca al complejo ES c. competitivos disminuyen la afinidad de la enzima por su sustrato pero no afectan la

Vmax d. no competitivos son estructuralmente similares al sustrato

12. En presencia de un inhibidor no competitivo se observará que

a. al eliminar el inhibidor varia el Km de la reacción b. al agregar un exceso de sustrato la velocidad máxima no se modifica c. la afinidad de la enzima por su sustrato aumenta d. al eliminar el inhibidor aumenta notablemente la velocidad máxima

13. Las enzimas que participan en el metabolismo del glucógeno se activan y/o inhiben por acción de quinasas/fosfatasas. Esto es un ejemplo de:

a. regulación por compartimentalizacion b. regulación por modificación covalente c. regulación alostérica d. regulación genética

14. El número de moléculas de una determinada enzima, en cierto momento podría aumentar por el mecanismo de

a. inhibición por producto final b. modificación covalente irreversible c. inducción génica d. represión génica

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