INTERACCIÓN DEL SUPLEMENTO SELECTIVO E.COLI/COLIFORMES CON

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E.COLI/COLIFORMES CON FILTROS DE MEMBRANA

Edurne Gorostiaga

E.COLI Y COLIFORMES

• La presencia y el nivel de contaminación fecal constituyen un factor importante en la evaluación de la calidad de una masa de agua y del riesgo de infección que representa para la salud humana.

• El análisis de muestras de agua para detectar la presencia de Escherichia coli, que normalmente habita en el tracto intestinal de hombres y otros animales de sangre caliente, proporciona una indicación de este tipo de contaminación.

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• Los resultados del análisis de bacterias coliformes son más difíciles de interpretar ya que algunas bacterias coliformes viven en el suelo y en las aguas dulces superficiales y por lo tanto no tienen siempre origen intestinal.

• La presencia de bacterias coliformes, aunque no pruebe de forma concluyente una contaminación de origen fecal, si puede indicar fallos en el tratamiento o en la distribución del agua.

E.COLI Y COLIFORMES• Bacteria coliforme:

– Miembro de la familia Enterobacteriaceae que expresa el enzima B-D-galactosidasa.

• Escherichia coli:– Miembro de la familia Enterobacteriaceae

que expresa los enzimas B-D-galactosidasa y B-D-glucuronidasa.

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y B-D-glucuronidasa.

• anexo A de la ISO 9308, las bacterias coliformes son bacterias Gram negativas, no formadoras de esporas, oxidasa negativas y con forma de bastoncillo, que pueden crecer en medio aerobio y anaerobio facultativo en presencia de sales biliares y que, normalmente, son capaces de fermentar lactosa con producción de ácido y aldehído en 48 h cuando se incuban a una temperatura de (36± 2)ºC. Las bacterias E.coli son bacterias coliformes capaces de producir indol a partir de triptófano, en (21±3)h a (44±0.5)ºC.

E.COLI Y COLIFORMES

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1)fermentación de la lactosa con producción de ácid o y gas2)fermentación ácida de la lactosa

3)enzima B-Galactosidasa

CHROMOCULT• El Chromocult es un medio de

cultivo selectivo para la detección y recuento de coliformes y de E.coli. Contiene una combinación de dos sustratos cromogénicos de manera que se hace posible la detección simultánea de los dos tipos de bacterias coliformes.

• La enzima característica de los coliformes, ß-D-Galactosidasa

coliforme

No coliforme

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coliformes, ß-D-Galactosidasa se fija en el sustrato Salmon-GAL y es la causa del color rojo de los coliformes.

• La enzima característica de los E.coli, ß-D-Glucuronidasa se fija en el sustrato X-Glucuronida y es la responsable de que las colonias positivas E.coli presenten un azul oscuro o violeta.

E.coli

Suplemento E.coli/coliformes• El suplemento E.coli/coliformes es una mezcla de dos inhibidores;

la vancomicina inhibe el crecimiento de bacterias grampositivas, mientras que la cefsulodina suprime Pseudomonas spp. y Aeromonas spp.

• La composición por frasco es de 2.5mg de vancomicina y 2.5mg de cefsulodina. El liofilizado se resuspende con 2ml de agua destilada y se agrega a 500ml de medio cultivo estéril (chromocult).

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• La cefsulodina es un antibiótico perteneciente al grupo de las cefalosporinas de tercera generación.

• La vancomicina es un antibiótico perteneciente al grupo de los glucopéptidos. Posee un espectro restringido fundamentalmente a bacterias grampositivas. Prácticamente todos los bacilos gramnegativos y micobacterias son resistentes a vancomicina, así como ciertos grampositivos.

FILTRACIÓN MEMBRANA

• Filtrar 100ml de agua a través de una membrana de 0.45µm de poro.

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• Tras la filtración se coloca el filtro en la placa de medio de cultivo Chromocult y se incuba durante 18-24 horas a 37±1ºC.

SUPLEMENTO E.COLI/COLIFORMES

• Preparamos chromocult al que añadimos diferentes volúmenes de suplemento. Sobre estos medios ensayamos la recuperación de E.coli NCTC 9001(vr=53ufc) mediante filtración por membrana.

Ch sin supl.

Ch +.3 ml supl.

Ch + 2ml supl.

5mg/L

Ch + 1ml supl.

Ch + 0. 5ml supl.

ufc 50 9 9 27 37

8

ufc 51 8 13 18 39

Media 50.5 8.5 11 22.5 38

Recuperación 95% 16% 21% 42% 72%

En el certificado del producto (suplemento E.coli-coliformes) se especifica que por cada 500ml de medio de cultivo se añade 2ml de suplemento. A esta concentración de suplemento observamos que la recuperación obtenida es del 21%.

CEFSULODINA

• Preparamos chromocult al que añadimos diferentes cantidades de cefsulodina . Esta se hidrata de igual manera que el suplemento E.coli/coliformes. Sobre estos medios se ensaya la recuperación de E.coli NCTC 9001.

• Decidimos probar la eficacia de estos dos antibióticos por separado para ver la recuperación de E.coli ya que nos interesa disponer de un medio de cultivo en el que la mayor parte de flora acompañante sea inhibida.

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Ch sin antib. Ch + 3 ml ant. Ch +2ml ant. Ch +1ml ant. Ch + 0. 5ml ant.

ufc 67 67 69 76 63

ufc 70 67 67 69 67

Media 68.5 67 68 72.5 65

CEFSULODINA

• De acuerdo con estos resultados se observa que la cefsulodina no afecta a la recuperación de E.coli

• Se prueba el medio chromocult con cefsulodina en muestras naturales.

– En muestras tratadas, la mayor parte de flora acompañante es inhibida, creciendo únicamente algunas colonias color crema.

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– En muestras tratadas, la mayor parte de flora acompañante es inhibida, creciendo únicamente algunas colonias color crema.

– Las colonias presuntas E.coli y coliformes crecen igualmente en ambos medios (chromocult con y sin cefsulodina).

– Al utilizar este antibiótico en captaciones (aguas brutas) la mayor parte de flora acompañante no es inhibida. Crecen muchas colonias cremas y rosas de todo tipo, lo cual dificulta la posterior confirmación de los posibles E.coli y coliformes.

VANCOMICINA

• Preparamos chromocult al que añadimos diferentes cantidades de vancomicina. Esta se hidrata de igual manera que el suplemento E.coli/coliformes.

• Sobre estos medios se ensaya la recuperación de E.coli NCTC 9001, E.coli ATCC 8739 y K.oxytoca ATCC 49131.

E.coli NCTC 9001 Ch sin antib. Ch +2ml ant. Ch + 1ml ant. Ch + 0. 5ml ant.

ufc 71 27 18 37

ufc 70 10 26 35

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Media 70.5 18.5 22 36

Recuperación 26% 31% 51%

E.coli ATCC 8739 TSA Ch sin antib. Ch +2ml ant.

Ch + 1ml ant.

Ch + 0. 5ml ant.

ufc 50 57 13 11 28

ufc 68 56 10 24 46

Media 59 56.5 11.5 17..5 37

Recuperación 95.8% 19.5% 29.7% 62.7%

VANCOMICINA

K.oxytoca ATCC 49131

TSA Ch +2ml ant. Ch + 1ml ant. Ch + 0. 5ml ant.

ufc 36 29 29 36

ufc 33 45 25 28

Media 34.5 34.5 27 32

Recuperación 100% 78% 93%

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Según añadimos mayor volumen de vancomicina la recuperación de E.coli va disminuyendo. Aún añadiendo tan sólo 0. 5ml de antibiótico obtenemos una recuperación baja.

No podemos utilizar este antibiótico en ninguna concentración para la recuperación de E.coli.

La recuperación de K.oxytoca es en todos los casos superior al 70%.

cefsulodina vancomicina suplemento cefsulodina vancomicina suplemento cefsulodina vancomicina suplementoufc contadas en 67 70 69 27 9 76 18 27 63 37 37

placa 71 70 67 10 13 69 26 18 67 35 3950 51

Media 68 18,5 11 72,5 22 22,5 65 36 38Recuperación % 128,3 34,9 20,8 136,8 41,5 42,5 122,6 67,9 71,7

Recuperación respecto al Ch.sin

antibiótico

119,2

107,6

Chromocult sin

vancomicina

57,0

Chromocult +0,5ml antib.1,25mg/L

29,3 60,1

Chromocult +1ml antib.2,5mg/L

35,617,4

vancomicina

Chromocult sin

34,8114,7

1,25mg/LChromocult +0,5ml antib.

2,5mg/LChromocult +1ml antib.

Chromocult +2ml antib.5mg/L

102,8

MR: E.coli NCTC9001; valor referencia: 53ufc

E.coli ATCC8739; TSA: 45 y 55 valor referencia: 50u fc

5mg/LChromocult +2ml antib.

vancomicinaantibiótico

63,2

antibiótico

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ufc contadas en 1 1 31placa 0 4 19

MediaRecuperación %

ufc contadas en 40 56 51placa 42 51 46

MediaRecuperación %

Edurne G. 17/04/08

53,5 48,571,8 74,5 97,3 88,2

3346

39,5 41

2,5mg/L 1,25mg/Lvancomicina vancomicina vancomicina

antibiótico 5mg/LChromocult con Chromocult +2ml antib.

K.oxytoca ATCC49131; TSA: 56 y 54 valor referencia: 55ufc

1,0

Chromocult +1ml antib. Chromocult +0,5ml antib.

vancomicina

5,0 50,0100,02550,0 0,5 2,5

vancomicina4654

vancomicina

SUPLEMENTO E.COLI/COLIFORMES

• PRIMERAS CONCLUSIONES :• La vancomicina inhibe a E.coli en la misma

proporción que el suplemento E.coli/coliformes. Por tanto, la ineficacia del suplemento selectivo se debe a la vancomicina.

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selectivo se debe a la vancomicina.

• La recuperación de K.oxytoca es en todos los casos superior al 70% y su crecimiento no se ve afectado por ninguno de estos antibióticos.

FILTROS

• Decidimos probar la recuperación de E.coli ATCC 8739 y E.coli NCTC 9001 en Chromocult con y sin suplemento selectivo E.coli/coliformes por diferentes técnicas:

– en masa

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– en masa– filtración por membrana :

–Millipore EZHAWG474–Whatman 10407112–Schleicher & Schuell ME25/21–PALL GN-6

E.coli ATCC 8739

TSA

MASA MILLIPORE WHATMAN

SIN suplemento

CON suplemento

SIN suplemento

CON suplemento

SIN suplemento

CON suplemento

ufc en 58 57 39 33 16 43 0

placa 55 60 51 41 27 37 2

Media 56,5 58,5 45 37 21,5 40 1

Recuperación 103,5 79,6 65,5 38,1 70,8 1,8

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Recuperación 103,5 79,6 65,5 38,1 70,8 1,8

MR: E.coli NCTC 9001; 53ufc

chromocult con suplemento

chromocult sin suplemento

whatman nitrato celulosa

S and S ester celulosa

11 12 53

21% 23% 100%

FILTROS PALL

MASA FILTRACIÓN FILTRACIÓN NMP

Chromocult con suplemento Chromocult sin suplemento COLILERTTSA Pall GN-6 whatman87 8 64 74

UFC 78 8 73 83Media 82,5 8 68,5 78,5Recuperación 100% 9,7 83,0 95,2

E.coli ATCC8739

MASA FILTRACIÓN FILTRACIÓN NMP

K.oxytoca ATCC49131

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Chromocult con suplemento Chromocult con suplemento COLILERTTSA Pall GN-6 whatman

UFC 24 37 23 4133 34 22 38

Media 28,5 35,5 22,5 39,5Recuperación 100% 124,6 78,9 138,6

FILTRACIÓN

Chromocult con suplementoVR Pall GN-6

UFC 95 37283725

Media 31,8Recuperación 100% 33,4

E.coli NCTC 13216

FILTROS

• Observamos que la recuperación de E.coli en masa es buena (mayor del 70%), y que el suplemento selectivo no inhibe el crecimiento de esta cepa.

• Cuando utilizamos la técnica de filtración, observamos que la recuperación de E.coli en Chromocult con suplemento selectivo se ve afectada; – Con filtros Millipore la recuperación es de 38.1% ,

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– Con filtros Millipore la recuperación es de 38.1% ,– con filtros Whatman de 1.8% (21% dependiendo de la cepa),– con filtros Pall de 9.7% (34% dependiendo de la cepa).

• La recuperación de E.coli en Chromocult sin suplemento, con todos los filtros ensayados, es buena.

EJERCICIO IELAB ABRIL 2012Filtros Whatman

25

30

35

40

45

media laboratorioNMPmedia laboratorio

19

0

5

10

15

20

25

E.coli

media laboratorioCh.sin suplementomedia laboratorio Ch.con supl.VALOR CONSENSO

E.Coli NCTC 13216Chromocult con suplemento

Matriz:agua tratada

70

80

a b c media

Millipore EZHAWG474

60 40 67 58

Pall GN-6 29 35 34 33

Whatman Microplus

21 26 18 22

Colilert 88 74 74 79

20

0

10

20

30

40

50

60

ufc

Millipore PallWhatmanColilert

CONCLUSIONES• Tras todos los ensayos realizados podemos afirmar q ue la

vancomicina interacciona con algún componente de lo s filtros de membrana y hace que se inhiba el crecimiento de E.coli. Todos los filtros ensayados muestran una mala recup eración de E.coli. (incluso los recomendados por el fabrica nte del suplemento E.coli/coliformes).

El crecimiento de K.oxytoca no se ve en ningun caso afectado.

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• El crecimiento de K.oxytoca no se ve en ningun caso afectado.

• El fabricante del suplemento, tras ponernos en cont acto, no da solución al problema.

• No podemos utilizar la técnica de filtración para e l recuento de E.coli en nuestro laboratorio ya que disponemos de muestras en la que nos es necesario la utilización de un sup lemento que nos inhiba la flora acompañante.