La translocación de GLUT-4 estimulada

por la INSULINA, está mediada

por una vía de señalización intracelular divergente.

Batista, Luizada Silva, DiegoPlazzotta, RenzoSanguinetti, YulianaVillanueva, Esteban CBCC V

RESUMEN La Insulina estimula el transporte de Glucosa.

En gran parte a través de la translocación del transportador de Glucosa sensible a la Insulina (GLUT- 4).

Microinyecciones de células individuales de los Adipocitos 3T3-L1, e Inmunofluorescencia de las proteínas de GLUT- 4, determinan que:

La inhibición del p21 ras endógeno, o la inyección de p21 ras oncogénica NO tienen efectos sobre la translocación de GLUT- 4 estimulada por insulina.

Por otra parte… Microinyecciones de anticuerpos anti-fosfotirosina. Inhibición de la Fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3-quinasa)

por microinyección de GST-p85 de fusión a SH2. (GST: Glutatión S-transferasa/p85: subunidad 85 de la proteína).

LA NOTABLE INHIBICIÓN DEL EFECTO BIOLÓGICO DE LA INSULINA

Lo anterior sugiere que: p21 ras/Proteína activada por mitógenos quinasas no está involucrada, mientras que la fosforilación de la Tirosina y la estimulación de PI3-quinasa, son los componentes críticos de esta vía de señalización.

determinan

INTRODUCCIÓN La Insulina tiene efectos pleiotrópicos biológicos:

Regula la producción hepática de Glucosa (Glu).

Regula la estimulación de la captación de Glu de los tejidos diana, debido a la translocación de los GLUT- 4, de un pool vesicular intracelular a la membrana plasmática, donde pueden captar a la Glu.

Mediada por una vía de señalización divergente de la vía oncogénica, que puede utilizar en parte, distintas moléculas de

señalización.

VIA DE SEÑALIZACIÓN METABÓLICA DE LA INSULINA

Vía metabólica de señalización:

Diabetes Mellitus tipo II Obesidad Síndrome de ovario poliquístico

La Insulina causa un aumento en la captación de Glu celular.

Para evaluar la vía, se utilizó:

- Microinyección de células individuales de los adipocitos 3T3-L1.

- Microscopía de inmunofluorescencia de las proteínas GLUT- 4; para evaluar la transmembrana de la vía de señalización que conduce a la translocación de GLUT- 4 estimulada por la insulina.

defectos en la misma, pueden causar:

-RESISTENCIA A LA INSULINA

-DISMINUCIÓN EN LA FUNCIÓN DE

GLUT- 4

PROCEDIMIENTO EXPERIMETALMATERIALES: Insulina porcina Anticuerpos policlonales anti-GLUT-4 (F349) Anticuerpos monoclonales anti-GLUT-4 (1F8) Anticuerpos policlonales anti-c-Fos Anticuerpos monoclonales anti-p21 Ras (Y13-259) Anticuerpo policlonal anti-Shc Anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina (PY20) Recombinante T24 Ras (oncogénico) Proteína N17 Ras (mutante dominante negativo) Proteína GST-p85 de fusión a SH2 Ig G de ovejas Isotiocianato de fluoresceína /Tetrametilrodamina Isotiocianato

(colorantes) AMCA (ácido 7-amino-4-metilcumarina-3-acético)

CULTIVO CELULAR Y MICROINYECCIÓN Se cultivaron fibroblastos Rat-1 (sobre-expresan el receptor de insulina humana

de tipo salvaje: HIRcB) 3T3-L1 fueron cultivados y mantenidas con DMEM (Dulbecco's Modified Eagle

Medium), con 50 un/ml de Penicilina, 50 mg/ml de Estreptomicina, y 10% de suero fetal bovino (FCS) en un 10% de CO2

Las células crecieron durante dos días, y luego se adicionó Isobutilmetilxantina (500 M), Dexametasona (25M), y la Insulina (4mg/ml) durante tres días.

El cultivó se produjo por aproximadamente 10 días, hasta que las células se diferenciaran totalmente.

Se tripsinizaron los adipocitos (antes del experimento) y se resembraron en cubreobjetos de vidrio lavados con ácido.

Las células fueron cultivadas en el mismo medio s/suero durante 2 hs. Se microinyectaron diversos reactivos. Todos se disolvieron en un buffer: fosfato de Na 5mM (PH 7,2),100mM KCl. Las proteínas N17 Ras, T24 Ras y GST-p85 SH2 fueron co-inyectadas con 10

mg/ml de Ig G de oveja con fines de detección. Las células se recuperan durante 1 hora, antes de la tinción.

INMUNOTINCIÓN Y MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA

GLUT-4 tinción de proteína

En cada célula microinyectada AMCA-positva se evaluó la presencia de GLUT-4 en la membrana plasmática, asociada a manchas. (ver figura 1)

TINCIÓN DE LA PROTEÍNA c-Fos (protooncogén) Las células se tiñen con anti-anticuerpos c-Fos (1/100)

durante 90 min a 37 0C, seguido de la incubación con el anticuerpo Ig G rodamina-conjugada.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Adipocitos 3T3-L1 diferenciados se microinyectaron con distintos reactivos, seguidos por la estimulación de la insulina.

A continuación, se observó la translocación de GLUT-4 a la superficie celular mediante microscopía de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-GLUT-4 seguidos por un segundo anticuerpo: fluoresceína-conjugada.

Figura 1: A y B, muestran un campo que contiene adipocitos antes (A) y después (B) de la estimulación de la insulina. Sin la estimulación de la insulina, la tinción de GLUT-4 es casi exclusivamente en el compartimento intracelular con discreta tinción perinuclear. Después de la estimulación de la Insulina, se ve una intensa coloración uniformemente distribuida en la superficie celular, acompañada de una disminución de la tinción de GLUT-4 intracelular, esto evidencia que las proteínas GLUT-4 teñidas del pool vesicular intracelular se translocaron a la membrana plasmática.

La translocación se produce con una evolución en tiempo (Fig. 1C) y curva dosis-respuesta (1D) típica del transporte de Glu estimulado por la insulina.

FIGURA 1

A: Tratados sin insulina.B: Tratados con insulina 10 ng/ml, durante 20 min.

Ambos campos se tiñeron con anticuerpos anti-GLUT4 (1F8), luego se incubaron con un conjugado anti-anticuerpos Ig G-fluoresceína.

Visualización de la translocación de GLUT-4 estimulada por la Insulina en los adipocitos 3T3-L1

C: Curso temporal de la translocación de GLUT-4: Los adipocitos en cubreobjetos se estimularon con 10 ng/ml de insulina para diferentes tiempos y se tiñen de GLUT-4.D: Respuesta de la translocación de GLUT-4 a la dosis de Insulina: Adipocitos en cubreobjetos fueron estimulados con las concentraciones de insulina indicadas durante 20 min y se tiñeron de GLUT-4. El % de células positivas para la translocación de GLUT4 se calculó contando por lo menos 100 células en cada punto.

EXPERIMENTO 2 OBJETIVOS: - Aclarar la cascada de señalización que media el efecto de la insulina sobre la translocación de GLUT-4.

- Verificar si alguna de las señales de la vía mitogénica participan en la translocación de GLUT-4, mediante la microinyección en adipocitos de una serie de reactivos Ras-relacionados.

- Demostrar si la divergencia de las vías mitogénica y metabólica se encuentra o no en el punto de señalización proximal a la formación de p21 Ras-GTP (activación de p21 ras).

VIA DE SEÑALIZACIÓN MITOGÉNICA DE LA INSULINA

Exp. 2 – PROCEDIMIENTO Microinyección de reactivos Ras-relacionados en los

adipocitos 3T3-L1.

Reactivos utilizados:

- N17 ras

- T24 ras

- anticuerpos anti-p21 ras

- anticuerpo anti-Shc

Evaluar los efectos de cada reactivo por separado, mediante gráfico y tinción, utilizando la coloración de GLUT4 y tinción de c-Fos.

RESULTADOS

Figura 2.Barras blancas: células estimuladas en ausencia de Insulina.Barras sombreadas: células estimuladas en presencia de Insulina (10 ng/ml durante 20 min).

Ig G= CONTROLN17= No ejerce ningún efecto sobre la insulina basal y tampoco sobre la translocación de GLUT4.Anticuerpos anti-p21 ras= Sin efectos.T24 ras= No induce la translocación de GLUT4, pero sí la expresión de las proteínas c-Fos (véase comparando con Fig. 3 - CG).Anticuerpo anti-Shc= No tiene efecto sobre la translocación; pero si sobre la síntesis de ADN.

RESULTADOS - Figura 3

- T24 Ras es microinyectada en los

adipocitos; se evaluaron sus efectos sobre la expresión de la proteína c-Fos y la

translocación de GLUT4

simultáneamente.- AD, se

microinyectaron con IgG de oveja (10

mg/ml) control.- EH, se

microinyectaron con T24 Ras (2 mg/ml) +

IgG de oveja (10 mg/ml).

- Las células se tiñeron de GLUT4 e IgG

inyectada, seguida de tinción de c-Fos.

Contraste de fase

Manchas de IgG, lo que demuestra las células inyectadas

Manchas de c-Fos

Tinción GLUT4

DISCUSIONES Los reactivos Ras-relacionados no tuvieron efectos sobre la

insulina o la translocación de GLUT4, o sea que la inhibición de la actividad Ras endógena mediante distintos anticuerpos anti-ras no afectaron la medida en que GLUT4 se transloca o la respuesta a la insulina del evento translocación.

T24 Ras es una proteína constitutivamente activa que estimula los efectos aguas abajo de p21 ras-GTP, y causa una marcada inducción de la proteína c-Fos (figura 3-CG).

La vía de señalización que conduce a la expresión de c-Fos fue activada por la microinyección de T24 Ras, pero la estimulación de la misma no influyó en la translocación de GLUT4 (figura 3-DH).

En suma, la activación de p21 ras no es ni necesaria ni suficiente para la translocación del GLUT4, esto indica que la ruta metabólica de la mediación de este efecto biológico se desvía de la ruta de señalización mitogénica proximal a la activación de p21 ras.

EXPERIMENTO 3 OBJETIVOS:

- Evaluar la relevancia de la PI3-K en los efectos metabólicos de la Insulina.

- Evaluar el papel de la fosforilación de la Tirosina en la vía metabólica.

Exp. 3 - PROCEDIMIENTO Microinyección de la proteína de fusión GST-p85

SH2 en adipocitos 3T3-L1.

Microinyección de anticuerpos anti-fosfotirosina en adipocitos 3T3-L1.

Evaluación de los efectos mediante gráfico.

RESULTADOS

Figura 4.

Barras blancas: células estimuladas en ausencia de Insulina.Barras sombreadas: células estimuladas en presencia de Insulina (10 ng/ml durante 20 min).- Por último las células se tiñen de GLUT4.

IgG= IgG de oveja (10mg/ml) CONTROL.

p85 SH2= IgG de oveja (10mg/ml) + GST- 85 SH2 (12mg/ml).

pY 20= anticuerpo anti-fosfotirosina (5mg/ml).

DISCUSIONES La microinyección de la proteína GST SH2-p85

inhibe la translocación de GLUT4 estimulada por la insulina en un 75%.

Se verifica la especificidad del efecto anterior ya que la proteína GST SH2-Shc utilizada en experimentos anteriores no afectó la translocación de GLUT4.

El anticuerpo anti-fosfotirosina inhibe la translocación de GLUT4, esto indica la necesidad de fosforilación de la Tirosina (Y), así como la participación de la PI3-K en este evento.

VIAS DE SEÑALIZACIÓN METABÓLICA Y MITOGÉNICA DE LA INSULINA

CONCLUSIONES El informe demostró que la vía del

Ras, componente crítico de señalización mitogénica, no es necesario para la translocación de GLUT4 estimulada por la insulina.

Se evidenció la divergencia de los eventos de señalización metabólica y mitogénica.

La PI3-K es una molécula de acoplamiento necesario, activada por la señal de fosforilación de la Tirosina generada por el receptor de insulina, que media el transporte de glucosa mediante la translocación de los GLUT-4.

FIN