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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSTGRADO E INVESTIGACIÓN Caracterización genómica de cepas de Staphylococcus epidermidis aisladas de infecciones oculares TESIS QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS PRESENTA: Q.B.P. MARÍA VIRGEN GARCÍA RANGEL DIRECTORES DR. JUAN CARLOS CANCINO DÍAZ DR. CESAR HUGO HERNÁNDEZ RODRÍGUEZ México, D. F. Enero 2011.
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSTGRADO E INVESTIGACIÓN
Caracterización genómica de cepas de
Staphylococcus epidermidis aisladas de infecciones
oculares
TESIS
QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS
PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS
PRESENTA:
Q.B.P. MARÍA VIRGEN GARCÍA RANGEL
DIRECTORES
DR. JUAN CARLOS CANCINO DÍAZ
DR. CESAR HUGO HERNÁNDEZ RODRÍGUEZ
México, D. F. Enero 2011.
El trabajo práctico de esta tesis se desarrolló en el Laboratorio de Infectología, Microbiología
e Inmunología clínicas del Departamento de Medicina experimental de la Facultad de
Medicina de la Universidad Nacional Autónoma de México, a cargo de la Dra. María Dolores
Alcántar Curiel y con la colaboración de la Q.F.B. María Dolores Jarillo Quijada.
El trabajo complementario se llevó a cabo en el laboratorio de Microbiología General de la
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, bajo la asesoría
de el Dr. Juan Carlos Cansino Díaz y el Dr. César Hugo Hernández Rodríguez.
DEDICATORIAS
A mi familia:
Porque los sueños son posibles estoy segura de que cada uno
continuará realizando los propios.
Y porque este logro también les pertenece.
------*------
AGRADECIMIENTOS
A Dios.
A Juan Carlos y César por la oportunidad, la paciencia y la confianza
que me brindaron.
A los miembros del jurado por su guía y comprensión.
A Ray, Lolita y Martha por su ayuda desinteresada.
Y a todos los compañeros y amigos que intervinieron en la realización
de esta tesis con su esfuerzo, motivación y/o apoyo.
A Becky y Yesi.
¡Gracias!
------*------
i
CONTENIDO
Contenido i
Índice de abreviaturas ii
Índice de tablas iii
Índice de figuras iv
Resumen vi
Abstract vii
Introducción 1
Justificación 26
Hipótesis 27
Objetivo 28
Objetivos específicos 28
Materiales y Métodos 29
Resultados 36
Discusión 45
Conclusiones 54
Apéndice 55
Bibliografía 63
ii
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
ACP Análisis de Componentes Principales
H Conjuntivas sanas
IS Secuencias de inserción
MLST Sistema de tipificación por secuenciación de multilocus (Multilocus
System Typing).
O Infección de ojo
OUT Unidades taxonómicas operativas
P Piel sana
Past Paleontologic Analisys Stadistic Test
PFGE Electroforesis en campos pulsados (Pulse Field Gel Electrophoresis).
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
TSB Caldo soya tripticaseína
UPGMA Método de agrupamiento por reducción de pares de grupos por
promedio aritmético (Unweighted pair group method, arithmetic
average).
VC Varianza – Covarianza
iii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Características generales del género Staphylococcus y diferencias entre S. aureus y
S. epidermidis ............................................................................................................................ 6
Tabla 2.- Genes involucrados en la virulencia de Staphylococcus epidermidis. ............................. 7
Tabla 3. Genes que codifican para factores de virulencia presentes en S. aureus N315 y S.
epidermidis ATCC 12228. ...................................................................................................... 17
Tabla 4. Factores de virulencia en S. aureus en comparación con los presentes en S.
epidermidis detectados en aislados de casos clínicos e individuos sanos. .............................. 18
Tabla 5. Microorganismos aislados de infecciones oculares en pacientes del Instituto de
Oftalmología “Conde de Valenciana” de la Cd. de México. .................................................. 21
Tabla 6. Fragmento de la matriz de datos de los patrones de bandas de PFGE en las cepas
de S. epidermidis. .................................................................................................................... 32
Tabla 7. Fragmento de la matriz de datos: patrones de bandas de PFGE en las cepas de S.
epidermidis y marcadores de patogenicidad. .......................................................................... 33
Tabla 8. Análisis de los patrones de macrorrestricción con PFGE de S. epidermidis.. ................. 36
Tabla 9. Análisis del fenotipo y genotipo presentes en las cepas de S. epidermidis
distribuidas en la gráfica de componentes principales. ........................................................... 48
Tabla 10 Marcador de peso molecular relación de los fragmentos generados y su tamaño en
kilobases (kb). ......................................................................................................................... 61
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Anatomía del ojo humano. ............................................................................................... 2
Figura 2. Formación de la biopelícula en Staphylococcus epidermidis. ....................................... 10
Figura 3. Organización del operón ica. Se representan los genes regulados por los
promotores P1 y P2. ................................................................................................................ 11
Figura 4. Síntesis del homopolímero de Poli-N-acetilglucosamina (PNAG), mediada por las
proteínas del operón ica en S. epidermidis. ............................................................................ 12
Figura 5. Estructura del péptido autoinductor de S. epidermidis................................................... 14
Figura 6. Organización del operón agr (gen accesorio regulador) de los estafilococcos. ............. 15
Figura 7. Localización de las infecciones oculares más frecuentes .............................................. 20
Figura 8. Identificación de bandas en el gel de electroforesis de campos pulsados de cepas
de S. epidermidis de infecciones oculares con macrorrestricción con la enzima SmaI. ......... 35
Figura 9. Presencia de las bandas en las cepas de S. epidermidis analizadas por PFGE con la
enzima Sma I .......................................................................................................................... 37
Figura 10. Relación clonal-SM de S. epidermidis aislados de infecciones oculares (O),
conjuntivas sanas (H) y piel sana (P). ..................................................................................... 38
Figura 11. Relación clonal-Dice de S. epidermidis en aislados de infecciones oculares (O),
conjuntiva sana (H) y piel sana (P). ........................................................................................ 39
Figura 12. Ubicación de las cepas de o Pr aisladas de infecciones oculares (O), conjuntivas
sanas (H) y piel sana (P) según el análisis por componentes principales con varianza-
covarianza con el programa Past ............................................................................................ 41
v
Figura 13. Carga asociada al componente 1 para los marcadores analizados por
componentes principales para las cepas de S. epidermidis aisladas de infecciones
oculares, conjuntivas sanas y piel sana con varianza-covarianza y el programa Past. ........... 42
Figura 14. Carga asociada al componente 2 para los marcadores analizados por
componentes principales para las cepas de S. epidermidis aisladas de infecciones
oculares, conjuntivas sanas y piel sana con varianza-covarianza y el programa Past. ........... 42
Figura 15. Concentrado de datos integrados al estudio de PFGE de las cepas de S.
epidermidis. ............................................................................................................................. 45
Figura 16. Estado más probable de los marcadores en estudio agrA, agrB, agrC, icaA,
icaD, IS256 y producción de biopelícula (Biopel), según ubicación de las cepas de S.
epidermidis aisladas de infecciones oculares (O), conjuntivas sanas (H) y piel sana (P)
según el análisis por componentes principales con varianza-covarianza con el programa
Past .......................................................................................................................................... 46
Figura 17. Correlación del análisis de similitud empleando Dice-UPGMA-WARN y el de
Componentes Principales para las cepas de S. epidermidis aisladas de infecciones
oculares (O), conjuntiva sana (H) y piel sana (P) con el programa Past. ............................... 49
Figura 18. Correlación entre los grupos en análisis y las cepas productoras de biopelícula,
asociada a los marcadores presentes. ...................................................................................... 51
Figura 19 Corrimiento del marcador de talla molecular en agarosa al 1% a 4.5 V/cm,
15°C/48 h. ............................................................................................................................... 61
vi
RESUMEN
El papel que desempeña Staphylococcus epidermidis, como componente de la
microbiota normal de la piel y de las mucosas humana, es ampliamente conocido. Sin
embargo, en la actualidad se ha reportado a S. epidermidis como agente causal de las
infecciones en el ojo, lo que conduce a pensar en la existencia de cepas de S. epidermidis
con carácter de patógeno oportunista. Con la finalidad de probar esta hipótesis, en este
trabajo se estudió la genotipificación de 121 cepas de S. epidermidis provenientes de tres
fuentes de aislados: una de infección ocular (O), otra de conjuntiva sana (H) y otra de piel
sana (P).
Los genotipos de estas cepas fueron caracterizados en base al perfil de restricción de
su DNA cromosómico con la enzima Sma I y electroforesis en gel de campos pulsados
(PFGE). Los patrones de los perfiles de restricción de los tres ceparios se compararon
visualmente, se identificaron sus bandas y se analizó su relación genética con programas
estadísticos mediante el uso del coeficiente de asociación simple de SM y por el método de
agrupación UPGMA con el Programa NTSYSpc 2.02j.
El análisis de los resultados obtenidos con estos métodos indicó que las cepas de S.
epidermidis aisladas de O se agrupan principalmente en 9 clados, con algunas de las cepas
aisladas de H y con menor frecuencia con las cepas aisladas de P. Posterior al analisis de
agrupameinto de los genotipos encontrados en las cepas, se sumaron al estudio estadístico
algunos genes y un fenotipo que están asociados con el factor de virulencia de esta bacteria
como son: icaA, icaD, IS256, agrA, agrB, agrC y la producción de biopelícula. Estos
genes, el fenotipo y los perfiles de restricción fueron evaluados por el coeficiente de Dice -
UPGMA y mediante un análisis de componentes principales por varianza-covarianza
utilizando el programa Past (versión 1.89). El resultado de la integración de estos
marcadores de virulencia con la genotipificación aporto mayor evidencia de la relación
clonal entre las cepas de S. epidermidis aisladas de O, el cual se formo 8 grupos al usar el
coeficiente de Dice. El análisis por componentes relacionó a las cepas con el estado de sus
marcadores (ica, agr y biopelícula) lograndose obtener una segregación en cuatro grupos y
entre estos grupos la existencia de dos grupos principales, uno donde predominan las cepas
que carecen de los maracadores y el otro grupo donde predominan las cepas con la
presencia de éstos.
vii
ABSTRACT
Staphylococcus epidermidis roll as a normal microbiota component of human skin
and mucous membrane is widely known. Although it is actually disturbing, the fact that it is
reported on several occasions as a principal agent causing eye infections, this conducts to
think on the existence of S. epidermidis strains with opportunistic pathogen character. To
test this hypothesis, It was studied the gene typing of 121 strains of S. epidermidis on this
project, coming from three isolation sources: from eye infection (O), from healthy
conjunctive (H) and from healthy skin (P).
The strains genotypes were characterized by their chromosomal DNA restriction
profile with the enzyme Sma I and pulsed fields gel electrophoresis (PFGE). The three
strains groups patterns were compared visually, their bands were indentified and their
genomic relations were analyzed by means of statistical programs: It was used SM simple
association coefficient and the group average method UPGMA with the program:
NTSYSpc 2.02j.
The results analysis, obtained with these methods show that the S. epidermidis
strains isolated from O are appertaining to themselves in 9 clades, with some H strains, and
with less frequency with P strains. Later of the group analysis of found genotypes on the
strains, some genes and one phenotype associated with the bacteria virulence factor, were
added to the statistic study, like: icaA e icaD IS256 AgrA, AgrB, AgrC and biofilm
production. These genes, the phenotype and restriction profiles were evaluated using
coefficient Dice-UPGMA and by means of principal components analysis of variance-
covariance using Past program (ver. 1.89). The integration of these virulence markers with
the gene typing gave more evidence on the clone relation between S. epidermidis strains
isolated from O, with 8 groups founded using the Dice coefficient. The analysis by
components relates strains with their markers status (ica, agr and biofilm), and found 4
group segregation and between these groups, two main groups were identified, one with
mainly markers lacking strains and one with mainly markers presenting strains.
1
INTRODUCCIÓN
Anatomía del ojo humano
El globo ocular es protegido por la estructura ósea llamada órbita en aproximadamente dos
terceras partes (Figura 1). La órbita está circunscrita principalmente por la porción inferior del
hueso frontal, la apófisis ascendente del maxilar y el hueso cigomático. El resto del globo ocular
está protegido por la conjuntiva, por los parpados (superior e inferior) y las pestañas.
El globo ocular es mantenido en el centro de la órbita por los ligamentos suspensorios y por
seis músculos estriados extraoculares (los músculos rectos medial y lateral a cada lado del ojo,
los músculos recto superior y oblicuo por encima del ojo y los músculos recto inferior y oblicuo
por debajo del ojo), estos músculos extraoculares le permiten tener movimiento al globo ocular.
La forma del globo ocular es prácticamente esférica y su pared está compuesta de tres capas:
La esclerótica. Esta capa es la externa de color blanco y dura.
La úvea. Es la capa media compuesta de tres zonas diferentes: la coroides pigmentada y
altamente vascularizada que se modifica al frente del globo ocular para dar origen junto con
la retina al cuerpo ciliar y al iris.
La retina. La capa interna del globo ocular con una amplia red de células nerviosas, contiene
los fotoreceptores (conos y bastones) y las células ganglionares retinianas que extienden sus
axones hasta el cerebro a través del nervio óptico. En el centro de la retina se encuentra la
mácula lútea, es una zona muy sensible rica en conos. El punto de unión de la retina y el
nervio óptico es llamado disco óptico o punto ciego.
En el polo anterior del globo ocular se encuentra la córnea, compuesta de un tejido conjuntivo
especial y transparente que carece de vasos sanguíneos, bañada en su cara externa
2
constantemente por las lágrimas y en su parte interna por el humor acuoso; líquido secretado por
el cuerpo ciliar que mantiene y nutre por difusión a la cornea y al cristalino.
El iris es la estructura pigmentada con apertura central (pupila) que permite el paso de la luz
desde la cornea a la retina. La apertura de la pupila está regulada por dos músculos, el esfínter de
la pupila y el dilatador pupilar del iris. La cámara anterior del globo ocular es el espacio que
existe entre la cornea y el cristalino y esta cámara contiene al humor acuoso. La cámara posterior
del globo ocular se extiende desde la cara posterior del cristalino al centro de la retina y contiene
al humor vítreo (Figura 1).
El cristalino es la estructura en forma de lente biconvexo transparente y elástico constituido
por una serie de capas de células. Estas células son las células epiteliales cuboides en su
superficie anterior y las células del cristalino productoras de cristalinas. La transparencia del
cristalino es debida principalmente a la presencia de proteínas con arreglos determinados y la
carencia de vasos sanguíneos. El cristalino se encuentra unido al cuerpo ciliar por una serie
circular de fibras denominadas zónula de Zinn o ligamentos suspensorios. Estos ligamentos están
encargados en modificar la tensión
del cristalino modificando la forma
de éste, esto se le conoce como
acomodación y es controlado por
los músculos ciliares permitiendo el
enfoque de los objetos en la retina
(Pocock y Richards 2005, Curtis 2005 y Page y col.
1998).
Figura 1. Anatomía del ojo humano.
3
La microbiota normal de la conjuntiva.
El desarrollo de la microbiota normal en un órgano depende de varios factores como son:
la exposición del órgano al medio externo, los mecanismos de protección del órgano, las
condiciones ambientales propias del órgano y la continuidad con otro órgano. El ojo es un órgano
expuesto al ambiente y debería estar asociado con una gran cantidad de microorganismos, sin
embargo el lavado lagrimal continuo proporciona una protección eficaz contra los
microorganismos, ya que se ha visto que más del 50% de la población no presenta colonización
por microorganismos en el ojo. La lágrima es un líquido isotónico con un pH de 7.14 a 7.82, con
iones Na+, Cl
-, Ca
2+, HCO3
-, K
+ y Mg
2+ y con seis tipos de proteínas: albumina,
inmunoglobulinas, enzimas (lisozima, lactato deshidrogenasa y amilasa), antiproteinasas,
lactoferrina y péptidos con actividad antimicrobiana. Las proteínas totales pueden tener una
concentración de 0.3 a 2.0 g/dL. Por otro lado, la lágrima también contiene glucosa, lactato, urea,
colesterol, lípidos y ácidos grasos que pueden servir como fuente de carbono, como fuente de
nitrógeno y como fuente de energía para algunos microorganismos que posean las enzimas que
les permitan utilizar estos compuestos como es el caso de los géneros Staphylococcus y
Corynebacterium. En efecto, se ha visto un claro predominio de las bacterias Gram positivas
entre las que se encuentra, Staphylococcus epidermidis con aproximadamente el 40% y
Corynebacterium sp con el 20 % de los aislados, siendo estos microorganismos integrantes de la
microbiota normal de la conjuntiva (García-Sáenz y col. 1999). En los lactantes y adultos mayores de 65
años se ha observado un mayor porcentaje de colonización, pero no hay variaciones importantes
con respecto al tipo de microbiota a lo largo de la vida. Se ha visto que en recién nacidos la
microbiota normal presente en el ojo tiene como principal fuente de adquisición la vagina debido
al paso del recién nacido por ella durante el parto, los recién nacidos por cesárea generalmente no
4
presentan colonización, sus conjuntivas son prácticamente estériles. Posteriormente la fuente
principal de la microbiota normal en la conjuntiva es la piel y se modifica rápidamente. A los
cinco días de nacido predominan los microorganismos de forma de cocos y coagulasa negativos,
siendo el tipo de microorganismos aislados de la microbiota cutánea periocular (Avendaño 1997, Ueta y
col. 2007).
A pesar que S. epidermidis es componente de la microbiota normal de la conjuntiva, se ha
observado su participación en la queratitis postoperatorias. Un 42.2% y 88.8% de los pacientes
mexicanos y pakistaníes, respectivamente, que sufrieron una cirugía refractiva y de catarata
presentaron colonización por cocos Gram positivos y en la mayoría de los aislados se presentó S.
epidermidis con resistencia a antibióticos (sulfas y trobamicina) (Fernández y col 2008, Ansari y col 2008).
Resultados similares fueron observados en Japón donde el 45% de los pacientes presentaron
colonización en sus conjuntivas por S. epidermidis (Ueta y col. 2007). Esto indica que existe la
posibilidad de que S. epidermidis pueda comportarse como un microorganismo patógeno
oportunista.
Características principales del género Staphylococcus.
Los microorganismos del género Staphylococcus son cocos Gram positivos que utilizan
compuestos orgánicos como fuentes de carbono, hidrógeno y fuente de energía
(Quimioorganótrofico heterótrofo). La pared celular está compuesta de péptidoglicana y contiene
ácido teicóico y es sensible a la acción de la lisostafina y la lisozima. Son osmotolerantes lo que
les permite crecer en concentraciones mayores a 3 M de NaCl. Pueden fermentar la glucosa en
anaerobiosis, producen catalasa, poseen citocromos pero son negativos a la prueba de oxidasa. Se
5
han descrito 30 especies y al menos 17 subespecies. Las características generales para el género
se enlistan en la tabla 1 (Prescott y col. 1996).
La tabla 1 muestra las características fenotípicas y genéticas del género Staphylococcus y
algunas diferencias entre sus dos representantes principales. La Tabla 1 muestra también
diferencias en sus genomas, donde resalta la talla molecular de sus cromosomas, la presencia de
plásmidos y la cantidad de secuencias de inserción (IS) presentes.
6
Tabla 1. Características generales del género Staphylococcus y diferencias entre S. aureus y S. epidermidis.
Características fenotípicas 1 Staphylococcus
Morfología microscópica Cocos 0.5 a 1.5 m, Gram positivos, no presentan esporas
Y agrupación en racimos.
Temperatura óptima de
crecimiento
30 - 37 °C
Mesofílico.
Requerimientos de oxígeno Anaerobio facultativo o microaerofílico.
Osmotolerantes Pueden crecer en NaCl a concentraciones mayores a 3 M.
Catalasa Positiva
Oxidasa Negativa
Movilidad No móviles
Diferencias entre S. aureus S. epidermidis
Puente de la peptidoglicana 5 Glicinas -L-alanina – (4-5) glicinas-
Morfología colonial Crecen en una amplia variedad de
medios, produciendo generalmente
colonias de 1-2 mm de diámetro que
producen pigmentos que pueden
variar de blanco a amarrillo intenso
Crecen en una amplia variedad de
medios, produciendo generalmente
colonias de 1-2 mm de diámetro que
producen pigmentos que pueden
variar de blanco a gris
Coagulasa Positiva Negativa
Fermentación de Manitol Positiva Negativa
Características Genotípicas2
Número de moléculas de DNA 1 cromosoma y 1 plásmido 1 cromosoma y 6 plásmidos
Tamaño de cromosoma (bp) 2814816 24999279
Tamaño de los plásmidos (kbp) 1 plásmido de 24.6 6 plásmidos (24, 17, 8, 6.6,
4.7 y 4.4)
% de G+C 32.8 32.1
Total de genes 2673 2495
Genes codificantes de proteínas 2595 2419
Genes de tRNA 62 60
Genes de rRNA 16 16
Secuencias de inserción (IS)
presentes
17 58
(incluidas IS truncas o fuera
de marco de lectura)
1.- Prescott y col. 1996, 2.- Zhang y col. 2003
7
Staphylococcus aureus representa al patógeno de este género con mayor importancia para
el ser humano, se le conocen diversos factores de virulencia como enzimas, toxinas, adhesinas
entre otros, mientras que S. epidermidis, como ya se mencionó, es parte de la microbiota normal
del ojo, de la piel y las mucosas. Sin embargo, los factores de virulencia de S. epidermidis han
sido estudiados con mayor interés en los últimos años y se abordan brevemente en la Tabla 2
(Prescott y col. 1996, Yufeng y col. 2005, Zhang y col. 2003).
Factores de virulencia descritos en Staphylococcus epidermidis.
A pesar de que S. epidermidis había sido considerado de bajo potencial de virulencia, en
su genoma se han encontrado genes de resistencia hacia las estrategias de defensa del hospedero.
En el cuadro 2 se muestran los factores de virulencia descritos para este microorganismo.
Tabla 2.- Genes involucrados en la virulencia de Staphylococcus epidermidis.
Formación de la biopelícula a través del ataque a superficies abióticas (adhesión)
Gen Función
AtlE atlE
Funciona como autolisina y adhesina que
afecta superficies hidrofóbicas
Aae Aae Tiene un papel bifuncional como
autolisina y adhesina
Acido teicóico Múltiples genes
biosintéticos
En S. aureus los ácidos teicóicos afectan
el ataque a la superficie
Formación de la biopelícula a través del ataque a matriz proteica (adhesión)
SdrF sdrF Unión a colágeno
SdrG (también conocido
como Fbe)
sdrG o Fbe Unión a fibrinógeno
SdrH sdrH Putativa función de unión
Ebp ebp Unión a elastina en Staphylococcus
aureus
AtlE y Aae atlE y aae Unión a varias matrices proteicas
8
Agregación intercelular (adhesión)
Gen Función
PNAG (poli-N-
acetilglucosamina)
icaA, icaD, icaB e
icaC
Polisacárido de adhesión intracelular
Proteína Bap asociada a
biofilm (Bap = Bhp)
bap o bhp Proteína de adhesión intercelular
Proteína Aap asociada a
acumulación
aap Precursor de la proteína de adhesión
intercelular la cual requiere proceso
proteolítico para su activación
Exopolímeros protectores
PNAG (poli-N-
acetilglucosamina)
icaA, icaD, icaB e
icaC
Protección contra inmunoglobulinas,
moléculas AMPs (péptidos antimicrobianos),
fagocitosis y depósitos de complemento
PGA (poli gama ácido
glutámico)
capA, capB, capC y
capD
Participan en la formación de una estructura
tipo capsular crucial para la resistencia a la
fagocitosis por neutrófilos y resistencia a
moléculas AMPs
Resistencia a péptidos antimicrobianos (PAM)
Proteasa SepA sepA Involucrado en la degradación de AMPs
Dlt, MprF, VraF y VraG dltA, dltB, dltC,
dltD, mprF, vraF y
vraG
Análogos a S.aureus, la función de estas
proteínas es la D-alanilación de los ácidos
teicoicos (Dlt), lisilación de los fosfolípidos
(MprF) y un putativo exportador AMP (VraF
y VarG)
Sistema Aps apsR, apsS y apsX Es un sistema sensor a moléculas AMPs y
regula los mecanismos de resistencia AMP
Toxinas
PSM (modulinas solubles en
fenol)
psmα, psmδ, psmε,
hld, psmβ1 y psmβ2
Citolisinas Pro-inflamatorias
Exoenzimas
Cisteína proteasas (SspB y
Ecp)
sspB No se conoce: daño al tejido
Metaloproteasa o elastasa
(SepA)
sepA Involucrada en la maduración de lipasas,
resistencia a moléculas AMP, daño al tejido.
Glutamilendopeptidas y serina
proteasa (GluSE, SspA y Esp)
sspA Degradación de fibrinógeno y factor C5
del complemento
Lipasas GehC y GehD gehC y gehD Persistencia en secreción de ácidos grasos
Otros factores
Staphyloferrinas sfna locus (S. aureus
staphyloferrina A)
Adquisición de hierro
SitA, SitB y SitC sitA, sitB y sitC Un exportador de hierro
Ortiz y Cancino 2010
9
Adhesión celular.
Dentro de los factores de virulencia con que cuenta S. epidermidis se encuentra la
adhesión celular a superficies bióticas o abióticas. Esta puede ser interpretada como un factor de
adaptación previa a la colonización. En superficies bióticas, la adhesión constituye el primer paso
para iniciar un proceso infeccioso, en el cual las interacciones entre la respuesta inmune del
hospedero y el agente infeccioso determinan el establecimiento o no de dicho proceso. Uno de los
mecanismos para escapar de la respuesta inmune del hospedero durante la infección es la
producción de una matriz extracelular llamada biopelícula.
Biopelícula.
La biopelícula es una estructura tridimensional especializada resultado de la adhesión y
acumulación de un conjunto de microorganismos en una superficie biótica o abiótica, la cual
tiene como soporte una matriz extracelular de composición diversa (carbohidratos y/o proteínas
y/o DNA) que proporciona a los microorganismos que la forman características estructurales y
fisiológicas que permite la resistencia a una amplia variedad de antibióticos y la evasión de la
respuesta inmune del hospedero.
Formación de la biopelícula en Staphylococcus epidermidis.
De manera general la formación de la biopelícula en S. epidermidis está dada en 4 etapas,
las cuales se ilustran en la figura 2.
La primera etapa es la adhesión de la bacteria a la superficie mediada por hidrofobicidad
de la misma y la participación de las siguientes proteínas: la autolisina (AtlE), la
autolisina-adhesina (Aae) así como de los ácidos teicóicos.
10
La segunda etapa comprende la expresión de proteínas de adhesión a la matriz extracelular
entre las cuales se encuentran: SdrF, SdrG, SdrH, Ebp, AtlE y Aae.
La tercera etapa es la producción del exopolisacárido de poli-N-acetilglucosamina,
producido por las proteínas codificadas por el operón de adhesión intracelular (ica).
Además de la expresión de las proteínas llamadas: proteína de biopelicula asociada a la
pared celular (Bhp) y la proteína de asociación-acumulación (Aap).
La cuarta etapa comprende la maduración y degradación de la biopelícula, la cual no ha
sido totalmente estudiada, pero se ha observado una importante participación del proceso
denominado quorum sensing, En el cual se censa la población presente en el medio. En S.
epidermidis el operón responsable de esta función es el operón agr.
Figura 2. Formación de la biopelícula en Staphylococcus epidermidis. Los números sobre las flechas indican los pasos de la
formación de la biopelícula. Intervienen varias proteínas de superficie de la bacteria que se unen específicamente a los
componentes de la matriz extracelular como son: SdrF, SdrG, y Ebp que reconocen respectivamente al colágeno, fibrinógeno, y
elastina, SdrH se supone una proteína de unión. AtlE y Aae son proteínas bifuncionales, con actividad de adhesina y autolisina.
Bap es una proteína de adhesión intercelular, Aap es la proteína precursora de una adhesina intercelular. El polisacárido de
adhesión intercelular PNAG (poli-N-acetilglucosamina) y péptidos con actividad proinflamatoria llamados PSM (modulinas
solubles en fenol) muy probablemente son clave en el control del cambio de estado de las células de bajo metabolismo a
plantónicas (Yao y col. 2005 y Otto. 2009,).
1
3
4
2
´
11
Formación de la biopelícula dependiente del operon ica.
Adicionalmente se ha reportado que la síntesis del la biopelícula puede ser de dos tipos:
independiente y dependiente del operón ica. La síntesis de la biopelícula dependiente de la
expresión del operón ica principalmente se compone de carbohidratos, el PNAG (poli-N-
acetilglucosamina) (Tabla 2) y la regulación de su producción está dada por la actividad de dos
promotores (P1, P2) (Figura 3).
Figura 3. Organización del operón ica. Se representan los genes regulados por los promotores P1 y P2. (Ortiz y Cancino
2010).
El promotor P2 controla la cotranscripción de los genes: icaA, icaD, icaB e icaC. Las
proteínas IcaA e IcaD se encargan de la activación de los monómeros de N-acetilglucosamina así
como su polimerización, para la posterior síntesis del homopolímero PNAG. La proteína
transmembranal IcaC tiene un papel importante en la exportación del polímero. Después de la
exportación la proteína IcaB, la cual es una desacetilasa localizada en la superficie celular,
remueve algunos grupos acetilo los cuales le confieren al polímero una carga catiónica que
contribuye al ataque a la superficie (Figura 4). Adicionalmente se ha descrito que el factor de
trascripción SarA promueve la transcripción del promotor P2. Por otro lado, el promotor P1
controla la transcripción del represor del promotor P2, denominado ica R.
12
Figura 4. Síntesis del homopolímero de Poli-N-acetilglucosamina (PNAG), mediada por las proteínas del operón ica en S.
epidermidis. (Ortiz y Cancino 2010)
Quorum sensing
El término quorum sensing fue acuñado por Fuca, Winans y Greenberg en 1994, para
describir un fenómeno que se conocía desde la década de 1930. Este fenómeno había sido
conocido hasta ese momento con el término de autoinducción, que era utilizado para describir los
fenómenos que dependían de la densidad poblacional presente en el medio. El término
autoinducción se utilizó por primera vez por Kenneth Nealson en 1977 para describir el proceso
de bioluminiscencia de Vibrio fischeri. En esta bacteria la producción de bioluminiscencia no
ocurría hasta que no se alcanzaba una cierta densidad poblacional.
El termino quorum sensing fue utilizado en principio para describir fenómenos
dependientes de la densidad poblacional mediados por acil-homoseril-lactonas (AHL) en
bacterias Gram negativas, este término se ha extendido a sistemas que utilizan señales distintas a
las AHL.
Las características de las moléculas que sirven como señales de comunicación intercelular
(cell to cell signal molecules, CCSM) son de forma general, las siguientes: las moléculas tienen
13
que ser pequeñas y de fácil difusión en el medio y su concentración debe ser mayor en la fase
estacionaria del crecimiento, que en la fase logarítmica de crecimiento. Además de las
características mencionadas, se utilizan los siguientes criterios para definir moléculas con ésta
función:
La producción de CCSM debe tener lugar durante la fase de crecimiento, en respuesta a
condiciones fisiológicas o en respuesta a cambios en el ambiente (concentración de NaCl,
presencia de antibióticos, etc.).
Las CCSM se deben acumular extracelularmente y ser reconocidas por sus receptores.
La acumulación de CCSM debe generar una respuesta concertada, una vez alcanzada la
concentración umbral.
La respuesta celular debe ser distinta de los cambios fisiológicos necesarios para metabolizar
o detoxificar la CCSM.
Quorum sensing en bacterias Gram positivas.
En bacterias Gram positivas la coordinación intercelular se realiza mediante la acción de
pequeñas moléculas de naturaleza peptídica, denominados péptidos autoinductores (autoinducing
peptides) (Figura 5). Los péptidos son transportados activamente al medio y en algunos casos se
modifican para interaccionar con los dominios externos de las proteínas encargadas de censar la
población. La transducción de la señal se produce por la fosforilación de proteínas blanco que
culminan con la activación de una proteína que modula la transcripción de los genes que están
bajo el control del quorum sensing y controlando así los procesos como la secreción de factores
de virulencia, esporulación y competencia.
14
Figura 5. Estructura del péptido autoinductor de S. epidermidis. El octapéptido está compuesto por los siguientes
aminoácidos, Asp: Aspartato, Ser: Serina, Val: Valina, Cys: Cisteina, Ala: Alanina, Ser: Serina, Tyr: Tirosina, Phe: Fenilalanina.
Se muestra el enlace tiolactona entre la cisteína y la fenilalanina (recuadro gris). (Ortiz y Cancino 2010)
Quorum sensing en Staphylococcus epidermidis.
En S. epidermidis se ha reportado que el operón responsable de censar la población es el
operón agr. Este sistema se encuentra regulado por dos promotores denominados P2 y P3 (Figura
6). El promotor P2 es el responsable de la transcripción de los genes encargados de censar la
población y este transcrito es conocido como RNAII, este lleva la información de los genes
denominados: agrB, agrC, agrD y agrA. El AgrB es la proteína receptora de la feromona (en
S.epidermidis es un octapéptido), el AgrC es la proteína encargada de modificar la preferomona
codificada por el gen agrD, la proteína AgrA es el regulador de la transcripción de los
promotores P2 y P3. El promotor P3 promueve la transcripción del RNAIII. El RNAIII está
compuesto por dos fracciones, la primera codifica para la δ-toxina de S. epidermidis y la segunda
es un RNA mensajero el cual es llamado RNAIII, este último se encarga de la regulación de
varios genes implicados en la adherencia y en la formación de la biopelícula así como la
producción de toxinas y de proteínas encargadas de la degradación de la biopelícula.
O
Ala
H2N-Asp- Ser-Val-Cys
S
C
Phe
Tyr
Ser
15
Figura 6. Organización del operón agr (gen accesorio regulador) de los estafilococcos. El mapa del locus del operón agr
muestra los dos principales transcritos RNA II y RNA III (Flechas). (Ortiz y Cancino 2010)
Características del genoma de Staphylococcus epidermidis.
Por otra parte, el proyecto Genoma de S. epidermidis ha logrado secuenciar el genoma de
la cepa ATCC12228 (no asociada a infecciones) y la cepa RP62A (aislada de un caso clínico). En
estas secuencias genómicas se han identificado diferencias entre las cepas, en un estudio
comparativo se detectaron 40 genes que presumiblemente son o están relacionados con los
factores de virulencia presentes en la cepa RP62A y estos genes están ausentes en la cepa
ATCC12228 (Wei y col. 2006).
En comparación con S. aureus, S. epidermidis carece de factores de virulencia que son
comunes en cepas de S. aureus. En la Tabla 3 se observa que S. epidemdis tiene factores de
adhesión principalmente, enzimas como proteasas, nucleasas, lipasas y fosfolipasas, además de
algunos marcadores de resistencia a antibióticos. Sin embargo, la comparación que se muestra en
la tabla 3 sólo es entre dos cepas de S. epidermidis y esto puede variar al comparar una población
16
más amplia de cepas aisladas de diferentes fuentes (Tabla 4). En cepas de S. aureus y S.
epidermidis aisladas de infecciones hay un alto porcentaje de receptores de la fracción
cristalizable (Fc) de las inmunoglobulinas de tipo G (IgG) y formación de biopelícula para ambas
especies. Aunque las cepas aisladas de individuos sanos también pueden producir estos factores,
el porcentaje entre ellas suele ser menor. En la Tabla 4 se muestra un resumen de algunos
trabajos en donde evaluaron marcadores en ambas poblaciones e incluyendo la resistencia a
antibióticos (Juárez-Verdayes y col. 2006, Ansari y col 2008).
17
Tabla 3. Genes que codifican para factores de virulencia presentes en S. aureus N315 y S. epidermidis ATCC 12228.
Factores de virulencia S. aureus N315 S. epidermidis 12228
Operon ica Presente Presente
Genes mec Presentes Ausentes
IS256, IS257 Presente Ausentes
Islas de patogenicidad 3 Ausentes
alfa-hemolisina Presentes Ausentes
beta-hemolisina Truncado Presentes
gama-hemolisina Presentes Ausentes
delta-hemolisina Presentes Presentes
Enterotoxinas Presentes Ausentes
Leucotoxinas Presentes Ausentes
Toxina -1 Presentes Ausentes
Proteína de adhesión
intercelular
Presentes Ausentes
Proteína de unión a
fibronectina
Presentes Presentes
Proteína de unión a Elastina Presentes Presentes
Autolisina E Presentes Presentes
Lipasa Presentes Presentes
Serin proteasa Presentes Presentes
Termonucleasa Presentes Presentes
Exonucleasa Presentes Presentes
Liofosfolipasa Presentes Presentes
Estafilocinasa Presentes Ausentes
Hialuronidasa Presentes Ausentes
Estafilocoagulasa Presentes Ausentes
Marcadores de Resistencia a antibióticos
Proteína de resisencia a
Bleomicin
Presente Ausente
Proteína de unión a penicilina Presente Ausente
Beta-lactamasa Presente Presente
Aminoglicosido fosfotransferasa Presente Ausente
Proteína de resistencia a
Tetraciclina
Presente Ausente
Otros marcadores
Osmoprotección Presente Ausente
Zhang y col. 2003
18
Tabla 4. Factores de virulencia en S. aureus en comparación con los presentes en S. epidermidis detectados en aislados de
casos clínicos e individuos sanos.
Factores de Virulencia presentes S. aureus S. epidermidis
Receptores de Fc de IgG (prot. A).1
(Funciona como camuflaje contra
la respuesta Inmune).
79% de las cepas de casos
clínicos
89 % de los casos clínicos
41% de los individuos
sanos.
Formación de biopelícula1 y 4
Colonización de superficies
45% de las cepas de casos
clínicos
32% de casos clínicos
74% de individuos sanos.
Multiresistencia 2, 3 y 4
Aproximadamente el 42%
fueron resistentes a
oxacilina, gentamicina,
tetraciclina y trimetropin
con sulfametoxazol
Aproximadamente el 44%
fueron resistentes a
oxacilina, tetraciclina y
trimetropin con
sulfametoxazol
Sensibilidad a la vancomicina y la
cefalotina2, 4 y 5
> 90 % de casos clínicos
e individuos sanos
> 90 % de casos clínicos
e individuos sanos
1.- Chaves y col. 2000, 2.- Hernández-Rodríguez y col. 2005, 3.- Yufeng y col. 2005, 4.- Juárez-Verdayes y col. 2006 y 5.- Ansari y col 2008
Resistencia a antibióticos:
Hay varios mecanismos para la resistencia a antibióticos que presentan en un
microorganismo: las mutaciones que modifican al sitio blanco del antibiótico, modificación de la
permeabilidad en las envolturas del microorganismo, la producción de enzimas específicas que
modifican e inactivan al antibiótico y las bombas de eflujo. La resistencia puede estar contenida
a nivel cromosómico o plasmídico, siendo el caso para la resistencia a penicilinas, tetraciclinas,
aminoglucósidos y eritromicinas. Las cepas de S. epidermidis generalmente presentan resistencia
a varios antibióticos, probablemente por mecanismos no específicos como la producción de la
biopelícula. Sin embargo, la mayoría de las cepas de S. epidermidis han conservado su
sensibilidad a la vancomicina y cefalotina (Tabla 4) (Juárez-Verdayes y col. 2006, Hernández-Rodríguez y col. 2005 y
Ansari y col 2008).
19
Infecciones oculares producidas por Staphylococcus epidermidis.
A pesar de su carácter comensal de S. epidermidis se ha reportado que esta bacteria es
capaz de producir diferentes patologías como: la bacteremia, la endocarditis con válvula nativa o
protésica, la osteomielitis, la infección del tracto urinario, la meningitis en portadores de válvulas
de derivación de líquido cefalorraquídeo, la peritonitis en pacientes con diálisis, las infecciones
de prótesis articulares y las infecciones oculares. Entre las infecciones oculares producidas por S.
epidermidis se encuentran la conjuntivitis, la endoftalmitis, la úlcera corneal, la queratitis y la
blefaritis. En la Figura 7 se muestra la localización anatómica de estos padecimientos, algunos de
ellos o sus complicaciones pueden ser causa de pérdida de visión como es el caso de la queratitis
(Bodé y col. 1985, Manners y Canning 1991, Sechi y col.1999 y Zhang y col. 2003, ).
Conjuntivitis.
La conjuntivitis es una inflamación de la membrana conjuntival, causada principalmente
por infección, reacción alérgica y sustancias irritantes; presenta edema, secreción conjuntival
serosa, mucosa y purulenta con ardor, irritación y lagrimeo. La conjuntivitis junto con la blefaritis
son los cuadros infecciosos más frecuentes.
Blefaritis.
Esta infección es una inflamación del borde palpebral con enrojecimiento que puede estar
acompañado de escamas, costras e incluso ulceras y puede estar dado por agentes infecciosos.
Endoftalmitis.
Es un proceso inflamatorio en la cavidad ocular y estructuras circundantes que surge como
una complicación de la extracción de cataratas (aproximadamente el 1% de los casos) y es
provocada por el resultado de la retención de material del cristalino o sangre intraocular,
neoplasias o en traumatismo accidental (Wilson 2005, Bannerman y col.1997).
20
Queratitis.
Es una inflamación de la cornea con enrojecimiento que predomina en la zona central
próxima al iris, generalmente la cornea muestra enturbiamiento grisáceo amarillento con
disminución de la agudeza visual acompañado de dolor, lagrimeo e hipersensibilidad a la luz y
puede acompañarse de úlcera corneal.
Úlcera corneal.
Es una erosión no penetrante o lesión en la capa externa de la córnea de etiología
infecciosa o no infecciosa (abrasiones accidentales o por uso excesivo de lentes de contacto).
Figura 7. Localización de las infecciones oculares más frecuentes
La presencia de S. epidermidis en las infecciones oculares no puede ser considerada como
un caso casual, sí se toma en cuenta que es parte de la microbiota normal del ojo. Lo anterior
puede apoyarse debido a que históricamente S. epidermidis ha sido aislado constantemente en
endoftamitis desde 1898, según el estudio retrospectivo realizado por Bodé y col. 1985. El
aislamiento de S. epidermidis como agente etiológico único en endoftalmitis es común pero en
algunos casos se ha asociado a otros microorganismos como Propionibacterium acnes (Manners y
Queratitis y
21
Canning 1991). Al no considerarse S. epidermidis como un agente invasivo y al incremento de los
aislamientos de esta bacteria a partir de infecciones y el aumento en las cepas con resistencias a
antibióticos han despertado la controversia sobre su papel comensal y existe un mayor interés en
su estudio.
En México se realizó un estudio retrospectivo de cinco años (1999-2003) de las bacterias
aisladas en las infecciones oculares en el que se observó que las bacterias Gram positivas y
particularmente S. epidermidis y S. aureus fueron las más frecuentemente aisladas (Tabla 5) (Juárez-
Verdayes y col. 2006). Estos resultados han sido similares en Colombia (Hernández—Rodríguez y col. 2005).
Tabla 5. Microorganismos aislados de infecciones oculares en pacientes del Instituto de Oftalmología “Conde de
Valenciana” de la Cd. de México.
Bacterias
Gram-positivas
Conjuntivitis
n=2,997
(%)
Endoftalmitis
n = 94
(%)
Ulcera
corneal
n= 16
(%)
Bacterias
Gram-negativas
Conjuntivitis
n = 97
(%)
Endoftalmitis
n = 10
(%)
Ulcera
corneal
n = 53
(%)
Staphylococcus
epidermidis 60.3 38.3 28.1
Pseudomonas
aeruginosa 7.4 20 26.4
Staphylococcus
aureus 9.4 15.9 11.9
Klebsiella
pneumoniae 5.3 1 3.7
Micrococcus
spp. 15.0 7.4 3.1
Morganella
morganii 3.2 0 0.0
Corynebacterium
spp. 3.9 5.3 8.7
Serratia
marcescens 7.4 20 9.4
Streptococcus
mitis 3.4 7.4 9.4 Proteus mirabilis 10.6 1 1.9
Staphylococcus
hominis 2.2 2.1 2.5 Escherichia coli 10.6 1 1.9
Staphylococcus
warneri 2.2 6.4 1.9
Enterobacter
cloacae 9.6 1 1.9
Streptococcus
oralis 1.1 1.0 5.0
Haemophilus
aegyptus 9.6 0 0.0
Streptococcus
pneumoniae 0.3 1.0 5.0
Pseudomonas
fluorescens 3.2 1 17.0
Estudio retrospectivo de pacientes clínicamente diagnosticados con conjuntivitis (n = 3,769), endoftalmitis (n=167) y úlcera
corneal (n= 611) (Juárez-Verdayes y col. 2006).
Métodos de genotipificación bacteriana.
22
Las características fenotípicas de los microorganismos tales como propiedades
antigénicas, metabólicas o de resistencia antibiótica son limitadas para establecer diferencias o
similitudes entre los microorganismos. Sin embargo, los métodos moleculares son herramientas
que permiten el establecimiento de relaciones entre los microorganismos mediante análisis
estadísticos y su uso ha sido ampliamente difundido en los últimos años.
Los métodos moleculares se han aplicado a diferentes campos de investigación y su
disponibilidad ha mejorado nuestro conocimiento en la:
- Identificación y tipificación.
- Detección de brotes y epidemias.
- Patogénesis e historia natural de ciertas infecciones.
- Diseño de medidas de control de propagación de la infección.
- Evolución genética de poblaciones microbianas.
Las técnicas más utilizadas se basan en:
Estudios de restricción del ADN cromosómico o extracromosómico (PFGE).
Análisis del número de copias de determinadas secuencias de inserción o secuencias
repetitivas a lo largo del cromosoma, o de las regiones entre secuencias de inserción o
repetitivas adyacentes (por ejemplo rep-PCR; polimorfismo IS6110 en Mycobacterium
tuberculosis).
Amplificación arbitraria de fragmentos genéticos (AP-PCR).
Hibridación y su combinación con otras técnicas.
Secuenciación parcial o total del genoma (MLTS).
La principal ventaja de estos métodos es la estabilidad de los marcadores genéticos utilizados
y su aplicación universal a distintos géneros y especies de microorganismos. Un objetivo
23
primordial en la aplicación de estos métodos es de definir la relación clonal o no entre diferentes
cepas. El término grupo clonal es una definición probabilística, que hace referencia al grupo de
aislados relacionados que descienden de un ancestro común; dicho de otra manera, un clon es un
elemento que forma parte de una cadena de replicación y transmisión de la expansión clonal de
un precursor único y poseen un nivel de similitud entre sus genotipos y fenotipos
significativamente superior al que se encontraría entre aislados no relacionados de la misma
especie seleccionados arbitrariamente (Coll y col. 2005).
La macrorrestricción del ADN cromosómico, utilizada en la técnica de Electroforesis en gel
de campos pulsados (PFGE), tiene la característica de explorar todo el cromosoma, detectando
variabilidad existente en los sitios blanco de la enzima de restricción utilizado para la digestión
del ADN, así como la inserción o deleción de grandes fragmentos entre dos lugares de restricción
generando polimorfismos en la talla de los fragmentos producidos por la digestión. En general la
PFGE es muy discriminativa, ya que es muy sensible a la microvariación existente en una
colección de cepas y es una de las más utilizadas, ya que presenta gran versatilidad y permite
conocer la clonalidad de diferentes aislados en situaciones epidémicas con tiempo y espacio
definido. También, se ha reportado una alta correlación en las relaciones clonales que arroja la
PFGE y las producidas por el método de Tipificación por secuenciación multilocus (MLTS). En
el método de MLTS se estudian las secuencias de 7 genes indispensables, lo que permite
establecer relaciones en aislados que difieren en tiempo y espacio para las cepas de S.
epidermidis. En función de lo anterior, la PFGE es un marcador ―ideal‖ con excelente poder de
discriminación, reproducibilidad y tipificación, así como relativa facilidad para realizarla y de
interpretación, a pesar de su costo (Coll y col. 2005, Miragaia y col. 2008).
24
Wang y Col. 2003, evaluaron a S. epidermidis, mediante el método de MLST, comparando 47
aislamientos de infecciones clínicas en diferentes regiones geográficas y en diferente tiempo
(1995 – 1996). Seis cepas correspondían a Sudáfrica, 2 a Brasil, 2 a Perú y una a México. Los
aislados de S. epidermidis fueron de heridas en la piel y abdomen, cara, extremidades superiores
e inferiores, órganos internos, sangre y prótesis o catéteres; sin embargo ningún aislado fue del
ojo. El resultado obtenido de este estudio fue la detección de 34 patrones diferentes por PFGE y
por MLST 23 alelos diferentes, 17 de los cuales están representados por sólo una cepa.
En el período 1997 – 1998 se estudiaron, en Italia, 19 aislamientos de S. epidermidis de
conjuntivitis o infección corneal durante un tiempo de 12 meses. El ADN de las cepas fue
restringido con la enzima Hind III, separado por electroforesis e hibridado con sondas marcadas
con luminiscencia para la búsqueda de IS (secuencias de inserción) mediante los genes mboI y
mspI. De las 19 cepas probadas se encontraron 12 patrones de hibridación (Sechi y col. 1999).
S. epidermidis aislada de piel sana se estudió su genotipificación por medio de PFGE
encontrándose que los patrones de restricción son muy variados e incluso en aislados de un
mismo individuo (Ueta y col. 2007).
En resumen, los trabajos anteriormente mencionados demuestran que S. epidermidis
presenta una alta variabilidad genética. Sin embargo, aún cuando se han analizado cepas de S.
epidermidis obtenidas de pacientes con infecciones o provenientes de personas sanas, no hay un
estudio comparativo de ambas poblaciones (cepas de S. epidermidis aisladas de infección y de
sujetos sanos) para detectar si hay diferencias importantes entre las diferentes cepas. Por lo tanto,
en este trabajo pretendió resolver esta faltante, comparando las cepas de S. epidermidis aisladas
de diferentes fuentes (piel sana, conjuntiva sana e infección ocular).
25
JUSTIFICACIÓN
S. epidermidis se ha reconocido como un claro comensal. Sin embargo, se ha aislado como
único agente etiologíco en múltiples infecciones, entre ellas las oculares. Los detalles de una
posible relación huésped-parásito y mecanismos de virulencia no están suficientemente
estudiados. Lo mismo sucede con la diversidad genética de esta especie.
Aunque se han genotipificado cepas de S. epidermidis asociadas a diversas infecciones del
humano, no se ha explorado suficientemente la diversidad y los genotipos responsables en
cepas provenientes de infección ocular, donde diversos estudios señalan que es la bacteria
más frecuentemente aislada.
Consideramos que estudiar y comparar los genotipos de diferentes poblaciones de esta
especie puede contribuir a responder la siguiente pregunta:
¿Las cepas de S. epidermidis también presentan una amplia variedad genética aún cuando
fueron aisladas de un órgano en particular y en condiciones similares?
26
HIPÓTESIS
Verdadera:
S. epidermidis, presenta una variabilidad genética amplia, a pesar de ello existen diferencias que
distinguen al grupo de infecciones oculares, de los comensales aislados de conjuntiva y piel sana.
Nula:
Los tres ceparios presentan una variabilidad genética similar para los aislamientos de S.
epidermidis, en la que no hay diferencias entre los grupos de estudio.
27
OBJETIVO
Determinar la similitud y la relación genética entre las cepas de S. epidermidis aisladas de
infección ocular y las cepas de S. epidermidis aisladas de conjuntiva y piel sana mediante su
genotipificación por patrones de macrorestricción.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Generar por Macrorrestricción SmaI-PFGE los patrones del DNA genómico de las cepas de S.
epidermidis aisladas de infecciones oculares, de conjuntivas sanas y de piel sana.
Realizar el análisis estadísticos de los patrones de bandas mediante sus coeficientes de
similitud obtenidos utilizando los programas NTSYSpc 2.02j.
Ampliar el análisis estadístico de similitud integrando al patrón de restricción los datos de la
presencia de los operones agr e ica, IS256 y la producción de biopelícula.
28
MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas:
Se estudiaron 121 cepas de S. epidermidis de las cuales 38 cepas fueron aisladas de
infecciones de ojo (O) de pacientes con diagnostico de infección bacteriana durante el período
comprendido entre 03-2001 al 08-2006 en el Instituto de Oftalmología Fundación Conde de
Valenciana de México; 36 cepas de conjuntivas sanas (H) aisladas del 09-2007 al 11-2007 de
pacientes en estudios preoperatorios en la unidad de Cirugía de Catarata en el Hospital General
de México y 47 cepas de piel sana (P) aisladas del antebrazo izquierdo de voluntarios que
refirieron no haber presentado un cuadro de infección ocular previo a la toma de muestra, en el
Laboratorio de Microbiología General de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.
Todas las cepas fueron caracterizadas por métodos fenotípicos y conservadas en glicerol a
-70°C.
Los datos de los marcadores genéticos icaA, icaD, IS256, agrA, agrB, agrC y la
producción de biopelìcula de todas las cepas en estudio se integraron al análisis estadístico y
estos datos de presencia y ausencia de los genes fueron generados por PCR realizados por el M.
en C. Marco Adán Juaréz Vayadares y del Q.B.P. Cesar Ismael Ortiz García. Se decidió integrar
estos datos de los marcadores genéticos a los de macrorrestricción con el fin de analizar las
relaciones entre las cepas con la mayor cantidad de elementos posible en espera de que se
obtenga una mejor resolución al establecer la relación entre ellas.
La técnica de macrorrestricción con PFGE fue adaptada en el Laboratorio de Infectología,
Microbiología e Inmunología clínica del Departamento de Medicina experimental de la
Universidad Nacional Autónoma de México con base en lo reportado por Miranda y col 1996.
29
Otras fuentes relacionadas con las modificaciones para Staphylococcus fueron de Dijkshoorn y
col 2001 y Coll y col. 2005.
Recuperación de las cepas:
Se sembraron 30 L del cultivo congelado en un tubo de ensayo con 3 mL de caldo soya
tripticaseína (TSB) para su incubación a 37°C durante 24 h. Posteriormente se verificaron
algunas características fenotípicas de esta especie tomando una asada del cultivo y sembrándolo,
por estría cruzada, sobre cajas de gelosa soya tripticaseína (TSA), para observar la morfología
colonial, y en cajas de agar sal manitol (SMA), para observar la pureza del cultivo y la
fermentación del manitol. Todos los medios se incubaron a 37°C/24 h.
Macrorrestricción:
Nota: Las soluciones y reguladores, así como sus componentes y preparación se describen en el apéndice.
1. Preparación del cultivo para PFGE.
Del aislamiento en SMA se tomó una colonia (con la siguiente morfología colonial: tamaño
de 1-2 mm, de color blanca, convexa, lisa, húmeda y no fermentadora de manitol) y se
sembró en 8 mL de TSB para su incubación a 37 °C durante 18 a 24 h en agitación.
2. Preparación e inmovilización del inoculo en agarosa.
El cultivo anterior fue homogenizado, se transfirió una alícuota de 400 L a un tubo tipo
Eppendorf, se centrifugó a 10000 xg durante 2 min, se eliminó el sobrenadante y al botón
celular se le adicionó 400 L de regulador PVI, se resuspendió y se centrifugó nuevamente a
10000 xg durante 2 min, eliminando el sobrenadante. Finalmente se resuspendieron las
células en 125 L de regulador PVI y se mantuvieron en hielo hasta su uso. Cada tubo con la
30
suspensión celular se llevó a un baño maría a 50 °C, después de 5-10 min. se le adicionó 1 L
de lisostafina y 125 L de agarosa al 1.6% previamente fundida y mantenida a 50 °C. Se
homogenizó evitando la formación de burbujas. Posteriormente se llenaron 2 o 3 moldes para
bloques, permitiendo su solidificación a temperatura ambiente o a 4°C durante 10 min.
3. Lisis celular in situ.
Se prepararon tubos Eppendorf con 1 mL de regulador EC lysis, 2.5L de RNAsa y 2.5 L
de lisostafina. En cada tubo se depositaron cuidadosamente los bloques correspondientes a
cada muestra y se incubaron en un baño agitado a 37 °C durante toda la noche.
4. Desproteinización del DNA in situ.
En tubos nuevos se mezclaron 1mL de regulador ESP con 10L de proteinasa K, los bloques
se transfirieron cuidadosamente y se incubaron a 37°C en agitación a toda la noche. Al día
siguiente, los bloques se lavaron con 10mL de TE depositándolos cuidadosamente en tubos
con capacidad de 50 mL y se incubaron a 40 °C en un baño agitado por 30 min, al termino se
decantó el regulador con ayuda de un colador y se repitió el lavado 5 veces. Finalmente, los
bloques se guardaron en regulador TE y refrigeración a 4°C.
5. Restricción con Sma I.
Se colocó medio bloque en un tubo Eppendorf con 300L de regulador para la enzima Sma I,
se incubaron a 30 °C durante 3 h. Se cambió el regulador con 250L de regulador nuevo y se
le adicionaron 25 U de enzima SmaI, continuando la incubación a 30 °C con agitación toda la
noche.
6. Corrimiento electroforético en campos pulsados.
Se prepararon 100 mL de agarosa al 1% en regulador TBE 0.5 X, fundida previamente y
enfriada a 50 °C y se vació sobre la placa metálica del molde, ya nivelado para el gel de
31
corrimiento, evitando hacer burbujas. Se dejó solidificar a temperatura ambiente ó a 4°C.
Al remover el peine se colocó en cada pozo un fragmento (1/3) de los bloques tratados con la
enzima de restricción, de igual forma se introdujo un fragmento del marcador de talla
molecular (Apéndice: Tabla 10 y Figura 19) en el carril del extremo izquierdo y todos los
pozos se sellaron con gotas de agarosa de bajo punto de fusión al 1 % fundida.
En la cámara de corrimiento se colocaron 1800 mL de TBE 0.5 X, el gel se sumergió y se
inició el sistema de enfriamiento, hasta alcanzar los 14°C. Para el corrimiento de las muestras
se utilizó el programa (StA) para Staphylococcus spp (GenePath Program Upgrad Kit versión
1.0), tiempo inicial del pulso 5.3 seg, tiempo final de pulso 34.9 seg, cambio lineal, tiempo de
corrimiento 20 h, 6 V/cm; ángulo de 120°.
Al término de las 20 h de corrimiento se sacó el gel de la cámara de corrimiento.
7. Revelado y digitalizado del gel de agarosa.
El gel de agarosa se cubrió con 500 ml de TBE con 10L de bromuro de etídio a 5 mg/ml de
10 a 15 min. Posteriormente, se lavó cubriéndolo con agua tridestilada por 1 h. El perfil de
bandas se observó en un transiluminador con luz UV a 260 nm.
Normalización del gel y registro de datos.
La normalización de los geles se hizo en forma manual con el siguiente procedimiento:
El primer paso se realizó la digitalización del gel que obtenemos de manera directa a
través del transiluminador, al estar acoplado a una computadora las imágenes pueden guardarse
en varios formatos para su uso posterior o impresión.
En segundo lugar se observaron de forma directa los patrones de bandas para identificar
aquellos que sean idénticos comparando gel por gel y muestra por muestra
32
El tercer paso fue la identificación de cada banda asignándole un número o código,
teniendo como referencia el marcador de talla molecular para la ubicación de las bandas con
respecto a su distancia de corrimiento, puede introducirse una segunda referencia que puede ser el
patrón de cepas de S. epidermidis ya conocido y estandarizado.
Finalmente cuando se definió la totalidad de las bandas presentes se construye una matriz
rectangular de datos donde la presencia de una banda tiene el valor de 1 mientras que la ausencia
de una banda se representa con el valor de 0 para cada cepa (Tabla 6). Esta matriz se requiere
para alimentar los programas NTSYSpc 2.02j.o Past (Austin y Priest 1992 y Dijkshoorn y col 2001).
Tabla 6. Fragmento de la matriz de datos de los patrones de bandas de PFGE en las cepas de S. epidermidis.
O50 O51 O53 O60 O61 O63 O68 O71
A01 1 0 0 0 0 0 0 0
A02 1 1 1 1 0 1 1 1
A03 1 1 1 0 0 1 0 1
A04 1 1 1 1 0 1 1 0
A05 1 0 0 0 0 1 0 0
A06 1 0 0 0 0 0 0 0
La primera columna indica la identificación de la banda y el primer renglón la identificación de las cepas
O=Infección ocular.
Análisis estadístico.
A partir de la matriz de datos se construyó una matriz de similitud o triangular al calcular
el coeficiente de apareamiento simple (SM = Simple matching coefficient), seguiendo del método
matemático para construir dendrogramas; el método de agrupamiento por reducción de pares de
grupos no ponderado por promedio aritmético UPGMA (Unweighted pair-group method,
33
arithmetic average). Este método asume que el "reloj molecular" es idéntico para todas las cepas
y da lugar a un árbol "con raíz" (o punto de partida) a partir del cual tienen lugar las divisiones
(Crisci y López 1983, Austin y Priest 1992 Dijkshoorn y col 2001 ) .
Los datos de los marcadores genéticos icaA, icaD, IS256, agrA, agrB, agrC y la
producción de biopelìcula se integraron al estudio y se codificaron en la matriz de datos (Tabla 7)
de la siguiente manera:
Marcadores Presencia Ausencia Técnica
Biopelícula = Biopel DO420nm >= 0.12 = 1 DO420nm < 0.12 = 0 Microplaca/safranina1%
agrA, agrB, agrC 1 0 PCR
icaA, icaD, IS256 1 0 PCR
Tabla 7. Fragmento de la matriz de datos: patrones de bandas de PFGE en las cepas de S. epidermidis y marcadores de
patogenicidad.
O50 O51 O53 O60 O61 O63 O68 O71
Biopel 0 0 0 1 1 1 1 0
agrA 1 1 1 1 1 1 1 1
agrB 0 1 1 1 1 1 1 1
agrC 0 1 1 1 0 1 0 0
icaA 0 0 0 1 1 0 1 0
icaD 0 0 0 1 1 0 1 0
IS256 0 0 0 0 1 0 0 0
A01 1 0 0 0 0 0 0 0
A02 1 1 1 1 0 1 1 1
La primera columna indica el marcador o la identificación de la banda y el primer renglón la identificación de las cepas
O=infección ocular.
34
Se utilizó del programa Past 1.89 para calcular la matriz de similitud mediante el coeficiente de
Dice que se basa en la posición de las bandas y con la siguiente fórmula:
Donde:
nAB = número de bandas presentes en las dos cepas
a = número de bandas presentes en la cepa A pero no en la cepa B
b = número de bandas presentes en la cepa B pero no en la cepa A
A continuación se aplicó el método de agrupamiento UPGMA para la construcción de un
dendograma (Hammer y col. 2001).
Análisis de componentes principales (ACP)
A partir de la misma matriz de datos (Tabla 7) se alimentó el programa para el cálculo de
la Varianza-Covarianza (VC) aplicable para datos multivariables y con la ventaja de analizar la
variación de cada marcador en estudio evitando la pérdida de información que representa el uso
de promedios en el método UPGMA. Este último análisis genera tres gráficas para ser
interpretado: La ubicación de las OTUs, (Unidades taxonómicas operativas) (OTU = cepas) en un
plano dividido en cuadrantes, la carga asociada al componente 1 y la carga asociada al
componente 2 con el uso del programa Past (Dijkshoorn y col 2001, Crisci y López 1983 y Hammer y col. 2001).
35
RESULTADOS Con la finalidad de observar si existe un agrupamiento entre las cepas de los diferentes
aislados se realizo el PFGE de todas las cepas estudiadas. En la figura 8 se muestra un resultado
representativo de los corrimientos electroforéticos generados por PFGE. Se puede observar que
existe un perfil de bandeo amplio entre estas cepas, es decir hay 10 perfiles diferentes en 14 cepas
estudiadas. Este mismo comportamiento se presento en todos los corrimientos electroforéticos
generados. Nosotros esperábamos muy pocos perfiles de bandeo ya que se trata de la misma
especie, sin embargo esto fue todo lo contrario, indicando que existe una gran variabilidad
genética en S. epidermidis.
Figura 8. Identificación de bandas en el gel de electroforesis de campos pulsados de cepas de S. epidermidis de infecciones
oculares con macrorrestricción con la enzima SmaI. Los números sobre el gel corresponden a las identificaciones de las cepas
de O, los números en azul indican una nueva asignación en la identificación de las bandas, los números en rojo indican las bandas
ya identificadas en otros patrones, se observa el marcador de peso molecular y la cepa O50 se tomó como una segunda referencia
para comparan los patrones. La línea en verde es un auxiliar para localizar las bandas a pesar de las variaciones del gel.
36
Para tener una mejor visión de lo anteriormente comentado, en la tabla 8 se muestra el
resumen de todos los patrones de macrorrestricción generados por PFGE. Se encontró que la
mayoría de las cepas de S. epidermidis presentan patrones únicos y no se comparten entre los tres
grupos de cepas (Tabla 8). De 121 cepas analizadas se obtuvieron 112 patrones diferentes, 7 de
ellos se repitieren en dos cepas cada uno y sólo uno pertenece a 3 cepas.
Tabla 8. Análisis de los patrones de macrorrestricción con PFGE de S. epidermidis.
Fuente de
aislamiento
No. de Cepas
probadas
No. de
patrones
únicos
No. de
patrones
repetidos
No. de cepas
en las que se
repiten
Patrones
compartidos
por los grupos
Infecciones
oculares 38 27 5 11 0
Conjuntiva
sana 36 34 1 2 0
Piel sana 47 43 2 4 0
Totales 121 104 8 17 0
Durante la identificación de bandas para cada uno de los patrones se encontraron 52
bandas consideradas diferentes al relacionarlas con las que presenta el marcador y sus tallas
moleculares van desde < 48.5 hasta 485 Kb (el número de identificación no refleja
proporcionalidad en su talla molecular ya que se dieron por orden de asignación). Algunas de
estas bandas están, prácticamente, en todas las cepas como la A02, A09, A12, A13 y A14, las
menos frecuentes son: A35, A43, A47, A49, A50, A51 y A52 mientras que el resto es variable.
En la gráfica siguiente (Figura 9) se indican los porcentajes de las cepas que presentan las bandas
y la identificación que le corresponde.
37
Figura 9. Presencia de las bandas en las cepas de S. epidermidis analizadas por PFGE con la enzima Sma I
Una vez que las bandas se identificaron, se construyó la matriz de datos y el dendrograma
de la figura 10 mediante el uso del índice SM y el método UPGMA-WARM. En él se puede
observar que las cepas aisladas de O (infección ocular; marcado en rojo) se encuentran con mayor
frecuencia en la zona alta donde las asociaciones tienen índices más altos con valores cercanos a
1, lo que indica mayor similitud y por lo tanto mayor relación clonal. Se observa la formación de
grupos o clados marcados con las flechas cortas en rojo, por ejemplo las cepas O2038, O2050 e
O2938 son idénticas con un índice igual a 1. Entre tanto las cepas aisladas en H (conjuntiva
sana), con marcas en azul, tienen una distribución similar pero con índices de similitud menores
al ser relacionadas entre ellas y con las de otros grupos. Por otro lado, las cepas aisladas de P
(piel sana), con marcas en negro, tienen una distribución invertida encontrándose con mayor
frecuencia en la zona baja del gráfico con índices mucho menores y siendo las menos
relacionadas entre sí y con las cepas aisladas de O o H. Las flechas delgadas sobre el
dendrograma marcan los intervalos de valores del coeficiente en que se encuentran la mayoría de
las asociaciones para cada grupo de aislamiento.
38
Figura 10. Relación clonal-SM de S. epidermidis aislados de infecciones oculares (O), conjuntivas sanas (H) y piel sana (P).
Analizadas por macrorrestricción con PFGE y el programa NTSYSpc 2.02j empleando los siguientes parámetros
SM-UPGMA-WARN.
Coefeiciente SM
39
La introducción de los datos de los marcadores ica, agr, IS y producción de biopelícula
permitió realizar el estudio de asociación genética con 99 cepas, que se analizaron por el índice
de Dice-UPGMA-WARN para generar un dendrograma (Figura 11). Se obtuvieron varios grupos
con valor de coeficiente Dice de 0.7 a 0.97 aproximadamente y en algunos casos con una fuerza
de nodo igual o mayor a 50 (números sobre las líneas del dendrograma), lo cual indica alta
similitud y que las asociaciones no son aleatorias.
Figura 11. Relación clonal-Dice de S. epidermidi en aislados de infecciones oculares (O), conjuntiva sana (H) y piel sana
(P).
Analizadas por Macrorrestricción con PFGE y el programa Past 1.89 empleando los siguientes parámetros Dice-UPGMA-
WARN.
El Análisis de Componentes Principales aplicado a las mismas 99 cepas dio origen a las
gráficas de las Figuras 10, 11 y 12. Este análisis ubica las OTU en una gráfica de dos
dimensiones. Cada eje representa una variable hipotética independiente que se compone de una
parte de la variabilidad total de los caracteres estudiados. El primer Componente principal
Í n d i c e d e D i c e
40
(Figura 13) tiene la mayor variabilidad, el segundo Componente principal tiene una parte de la
variabilidad restante por lo tanto menor pero no incluida en el primero (Figura 14) y así
sucesivamente pueden generarse un número igual o menor al número de caracteres en el estudio
pero sólo es posible graficar un máximo de 3, en ejes ortogonales (con 90° entre los ejes). Esto
puede explicarse de otra forma; como una reducción de caracteres considerando la variabilidad de
los mismos en la nueva variable (Dijkshoorn y col 2001). La variabilidad de los caracteres puede
expresarse mediante la desviación estándar o como en este caso la varianza-covarianza (VC) lo
que ofrece la ventaja de tener una menor pérdida de información en comparación con los tres
métodos de agrupación, ya que generan matrices derivadas con pérdida de información sucesiva.
El ligamiento simple elimina los valores de similitud más bajos, el ligamiento completo elimina
los valores más altos y el ligamiento promedio hace un promedio del valor de similitud para los
dos grupos o elementos a asociarse, aunque en algunos casos no es el reflejo de los valores que le
dieron origen. En el ACP la ubicación de las OTUs está dada por las nuevas variables;
componentes principales 1 y 2 que acumulan el 57 % (para este caso) de la variación total. (Austin y
Priest 1992, Crisci y López 1983).
En la gráfica (Figura 12) del ACP las cepas de los diferentes grupos de aislamiento se
representan en círculos rojos para O, azules para H y negros para P. Las cepas de los diferentes
aislados son distribuidas por todo el plano sin embargo, la mayoría de las cepas aisladas de O
están en los cuadrantes inferiores y en el cuadrante inferior derecho hay una mayor proporción de
cepas aisladas de O que de cepas aisladas de H y P considerando el total de las cepas para este
cuadrante. De forma contraria en los cuadrantes superiores se presentan en mayor proporción las
cepas aisladas de H y P que las de O.
41
La interpretación de esta distribución debe relacionarse con respecto a los caracteres de
mayor variación para cada componente, lo que puede apreciarse en las gráficas de la carga
asociada al componente (Figuras 11 y 12) y el valor de corte de carga (0.087; que generó el
programa) permite ver cuáles son los marcadores que más contribuyen positiva o negativamente
en la ubicación dada por ese componente. En la Figura 13 por ejemplo algunos de los caracteres
con mayor contribución positiva son: agrB, agrC y las bandas A25 y A34, en cuanto a la
contribución negativa son las bandas A03, A04, A08 y A10 entre otras. Así la presencia de agrB
colocará a una OTU en los valores positivos para este componente pero se verá afectada
negativamente si además posee la banda A08.
Figura 12. Ubicación de las cepas de S. epidermidis aisladas de infecciones oculares (O), conjuntivas sanas (H) y piel sana
(P) según el Análisis por Componentes principales con varianza-covarianza con el programa Past
Lo mismo ocurre con el componente 2 (Figura 14) donde la mayor contribución positiva es
mediante la presencia de las bandas A21, A28 y A31 y la mayor contribución negativa es por los
marcadores de Biopelícula (Biopel), agrC, icaA y la banda A07 de tal manera que la mayor
42
Figura 13. Carga asociada al componente 1 para los marcadores analizados por Componentes Principales para las cepas
de S. epidermidis aisladas de infecciones oculares, conjuntivas sanas y piel sana con varianza-covarianza y el programa
Past.
Figura 14. Carga asociada al componente 2 para los marcadores analizados por Componentes Principales para las cepas
de S. epidermidis aisladas de infecciones oculares, conjuntivas sanas y piel sana con varianza-covarianza y el programa
Past.
43
probabilidad de encontrar una cepa que porte el marcador agrC se encuentra en el cuadrante
donde el componente 1 tiene valores positivos y el componente 2 valores negativos es decir el
cuadrante derecho inferior, siendo este precisamente esta área donde encontramos el mayor
porcentaje de cepas de infecciones oculares (Figura 12).
44
DISCUSIÓN En base a los resultados obtenidos podemos decir que las cepas de S. epidermidis
analizadas presentan gran variabilidad genética, ya que las 121 cepas probadas presentaron 112
patrones de bandeo diferentes por PFGE. Se encontraron 8 patrones repetidos 5 de los cuales
pertenecen a las cepas aisladas de O, 2 a las cepas aisladas de H y solo uno a las cepas de P
(Tabla 8), este hecho puede ser importante al considerar que las cepas requieren algunos
marcadores genéticos (factores de virulencia) para establecer un cuadro infeccioso y dada la alta
variabilidad genética que se presenta en estas cepas los patrones que se repiten en las cepas
aisladas de O pueden representar las clonas que presentan una mayor actividad patogénica ya que
incluso no se encuentran en los otros dos grupos de aislamiento. Lo anterior es consistente con la
variabilidad genética reportada en otros trabajos. Por ejemplo en aislados de S. epidermidis de
conjuntivas de 42 portadores sanos se analizaron sus patrones de restricción por PFGE y solo en
dos de ellos se aislaron clonas idénticas, mientras que el resto de los aislamientos fueron
policlonales. En cinco sujetos sanos (dos sujetos que presentaron cepas de S. epidermidis
monoclonales y tres sujetos con cepas de S. epidermidis policlonales) de los 42, se les tomaron
muestras a lo largo de seis meses observando que las clonas de S. epidermidis presentes en las
conjuntivas sanas pueden variar en el tiempo. En este trabajo se sugiere que la policlonalidad de
S. epidermidis en la microbiota normal es un reflejo de un buen balance entre las cepas
comensales y el huésped sano (Ueta y col. 2007). En otro trabajo se encontró que los pasientes de
infecciones nosocomiales presentaron aislamientos monoclonales en su mayoria pero los patrones
no se repitieron de pasiente a pasiente (Sloos y col 2000). Utilizando los métodos de MLST, PFGE u
otro se ha encotrado que las clonas de S. epidermidis aisladas de infecciones tienen una gran
variabilidad genética,pero su relación clonal es cercana ya que al asociarse las cepas de
45
infecciones presentan indices de similitud SM mayores o iguales a 0.7 para la mayor parte de los
grupos formados (Sloos y col 2000, Wang y col. 2003, Monck y col. 2008). De igual manera en este trabajo
encontramos que las cepas aisladas de O se asocian con los coeficientes más altos, por lo tanto
están más relacionadas entre sí, seguidas por las cepas aisladas de H, y las menos relacionadas
son las cepas aisladas de P.
Al sumar los datos de los marcadores genéticos a los de macrorestricción se observa que
los clados con cepas aisladas de O se hacen más grandes y se reducen de 9 a 8 quedando
excluidas de estas agrupaciones la mayoría de las cepas de H y P con índices de Dice altos
mayores a 0.7 y fuerzas de nodo por arriba de 50% (Figura 11) indicando que su asociación no es
aleatoria. Los valores menores de 50% no aparecen en el gráfico pero es importante indicar que
estas asociaciones en su mayoría tienen correlación con las presentes en la Figura 10 lo que da
mayor certeza en la asociación.
La distribución de los marcadores adicionales en el ACP se muestra en la Figura 15 en ella
podemos observar que las cepas aisladas de O son las que los presentan con mayor frecuencia en
comparación con los otros grupos de aislamiento.
Figura 15. Concentrado de datos integrados al estudio de PFGE de las cepas de S. epidermidis.
Los genes agr se expresan según el tipo de operón agr o polimorfismo (T-agr I, II y III) que presenta la cepa.
46
Es importante analizar la contribución o carga de cada marcador en cada componente para
tener un aproximado de la información que portan las cepas según su ubicación tal como ya se
indicó antes (Figuras 13 y 14). El resultado de este análisis se expresa en los diferentes
cuadrantes de la Figura 16 donde se indican los genotipos en las cepas, más probables para cada
marcador en cada cuadrante. Literalmente es el más probable porque su posición es la resultante
de todas las cargas de los marcadores implicados para cada cepa, por lo tanto la combinación de
la ausencia o presencia de los marcadores y las bandas de su patrón de restricción que modifican
su ubicación (Crisci y López 1983). Las bandas y los marcadores que menos contribuyen a la carga en
cada componente son aquellas que están presentes o ausentes en todas o casi todas las cepas
como agrA o con un porcentaje igual o mayor al 90% y menor o igual al 10% si se correlaciona
con los datos de la Figura 15.
Figura 16. Estado más probable de los marcadores en estudio agrA, agrB, agrC, icaA, icaD, IS256 y producción de
biopelícula (Biopel), según ubicación de las cepas de S. epidermidis aisladas de infecciones oculares (O), conjuntivas sanas
(H) y piel sana (P) según el análisis por componentes principales con varianza-covarianza con el programa Past
47
De acuerdo a la hipótesis verdadera propuesta:
S. epidermidis, presenta una variabilidad genética amplia, a pesar de ello existen diferencias que
distinguen al grupo de Infecciones oculares, de los comensales aislados de conjuntiva y piel sana.
La distribución en el gráfico anterior (Figura 16) de las cepas aisladas de P deberían estar
muy probablemente en el cuadrante superior izquierdo con los marcadores ausentes, las cepas
aisladas de H podrían estar en los cuadrantes superior derecho e inferior izquierdo siendo una
población diferente o más probablemente de transición al variar en los marcadores que posee o la
funcionalidad de los mismos y por último en el cuadrante derecho inferior podrían ubicarse las
cepas aisladas de O.
Sin embargo lo anterior no ocurre, pero si se observa que la mayor parte de las cepas
aisladas de O que producen biopelícula, se encuentran los cuadrantes inferiores y con mayor
proporción en el derecho, lo que indicaría que las cepas aisladas de O tienen mayor probabilidad
de poseer todos los marcadores en estudio que el resto de las cepas.
Ya que los genes icaA e icaD son requeridos necesariamente para dar estructura a la
biopelícula poliglucosidica es de esperarse que en los cuadrantes superiores prácticamente no se
encuentren las cepas productoras tal como se observa en la Figura12 (Izano y col. 2008). Por lo tanto los
ceparios no tienen diferencias que los separen contundentemente pero existen caracteres que se
presentan con mayor frecuencia en alguno de ellos, no sucede igual con las bandas: no hay alguna
que predomine en un grupo de aislamiento en particular. Por otra parte dada su diversidad y
variabilidad las cepas que no se encuentran en los extremos de la ausencia y presencia de
caracteres pueden estar en un proceso transitorio de adquisición o pérdida de los mismos (Zhang y
col. 2003,Yao y col. 2005).
48
Lo anterior puede ser apreciado más claramente en la Tabla 9 donde se identifica cada
cuadrante con un color, los marcadores en el primer renglón, el número de cepas ubicadas en
cada cuadrante y su estado más probable se encuentran en el segundo renglón de cada cuadrante,
el porcentaje de las cepas que presentan cada marcador, seguido del tipo de agr y finalmente el
porcentaje de las cepas que lo poseen.
Así los porcentajes nos indican que su distribución se acerca a la propuesta hipotética de
tres poblaciones; una con marcadores ausentes (cuadrante azul), una de transición (cuadrantes
verde y lila) y una con los marcadores presentes y seguramente funcionales (cuadrante naranja).
Tabla 9. Análisis del fenotipo y genotipo presentes en las cepas de S. epidermidis distribuidas en la gráfica de componentes principales.
cepas Biopel agrA agrB agrC icaA icaD IS256 cepas Biopel agrA agrB agrC icaA icaD IS256
26 0 1 0 0 0 0 0 21 0 1 1 1 0 0 0
% de 1c 3.8 100 38.4 7.6 0 3.8 15.3
% de 1 14.2 100 80.9 42.8 14.3 19.0 14.3
T-agr I III II T-agr I III II
%
61.5 30.8 7.7
%
19.0 38.1 42.9
cepas Biopel agrA agrB agrC icaA icaD IS256 cepas Biopel agrA agrB agrC icaA icaD IS256
33 0 1 1 0 0 0 0 19 1 1 1 1 1 1 0
% de
1 21.2 100 72.7 33.3 24.2 15.1 6.1
% de 1 68.4 100 100 73.7 57.9 63.2 10.5
T-agr I III II T-agr I III II
%
27.3 39.4 33.3
%
0 26.3 73.7
Cepa : total de cepas por cuadrante, marcadores analizados: agrA, agrB, agrC, icaA, icaD, IS256 y producción de biopelícula
(Biopel), 0=Ausencia, 1=Presencia, % de 1=% de cepas con el marcador presente, tipo de operón agr o polimorfismo (T-agr I, II
y III) y %=% del polimorfismo presente en las cepas del cuadrante.
49
1 2 3 4 5 6 7 8
Figura 17. Correlación del análisis de similitud empleando Dice-UPGMA-WARN y el de Componentes Principales para
las cepas de S.epidermidis aisladas de infecciones oculares (O), conjuntiva sana (H) y piel sana (P) con el programa Past.
Finalmente al correlacionar los métodos de agrupamiento con el de ACP esto es más
evidente ya que los clados formados por las cepas en la figura 11 muestran que las cepas
agrupadas con mayor fuerza y similitud son en su mayoría las cepas aisladas de O productoras de
biopelícula, la Figura 17 resume todo lo anterior y observamos que las cepas aisladas de O
agrupadas son en su mayoría las cepas productoras de biopelícula (marcadas con cuadros
rellenos) y que no tiene relación con el diagnostico que se indica con los números en la parte
superior mientras que los colores de los cuadros indican el cuadrante donde se ubican en el
análisis por componentes principales
50
Por lo tanto considerando que S. epidermidis forma parte de la microbiota normal
conjuntival y que el ojo tiene un sistema de defensa que le permite eliminar o controlar
eficientemente las poblaciones bacterianas, es probable que tal equilibrio se pierda cuando S.
epidermidis adquiere factores de patogenicidad funcionales que le dan la posibilidad de
establecer una infección activa (García-Sáenz y col 1999, Wilson 2005, Fernández y col. 2008, Bannerman y col.1997).
La presencia de los marcadores en el genoma no es suficiente ya que se han reportado por
ejemplo la presencia de genes agr o ica sin producción de biopelícula, así como ausencia de
biopelícula en cepas que se consideran infectivas al ser aisladas de pacientes con endoftalmitis y
tener sus factores de adherencia funcionales, además se probó en el desarrollo experimental
positivo de endoftalmitis (Ruiz-Galindo y col. 2010, Ortiz y Cancino 2010). Ya que son muchos los factores
implicados en la formación de biopelícula puede pensarse que su producción será más eficiente si
todos o la mayor parte de ellos están presentes y en función.
Algunos de ellos se encuentran en elementos móviles como la proteína asociada a
biopelícula (Bap) que interviene en su producción y es independiente del operón ica, el gen bap
forma pare de la isla de patogenicidad SaPlbov2 ( de S. aureus) y posee cerca de su extremo 5’
una secuencia de inserción con un 97% de identidad con la IS257L del transposon Tn4003. Bap
puede ser la proteína involucrada en la formación de la biopelícula para el caso de aquellas cepas
que no tienen los genes ica pero son productoras de biopelícula (Figura16). Sin embargo aun no
ha sido identificado el gen bap en cepas aislados a partir de humanos, sólo en aislados de mastitis
bovina (Tormo y col 2002).
Así que la idea de que las cepas tengan un intercambio y recombinación genética
frecuente no es poco probable ya que varios de los marcadores de patogenicidad y de resistencia
que presenta S. epidermidis como ya se mencionó se portan en elementos móviles e incluso
51
conjugativos además de contar con otros mecanismos como transformación o transfección
(Rodríguez-Martínez y Pascual 2006). También se ha observado la selección de cepas resistentes debido a la
aplicación de terapias con antibióticos, encontrándose que la población de cepas se modifica
inmediatamente después del inicio del tratamiento. Las cepas resistentes a los antibióticos, en
pocos días han sido detectandas mediante PFGE y su persistencia puede llegar a cuatro años
después del término del tratamiento lo cual aumenta la probabilidad de que ocurra un intercambio
intra e interespecífico de estos marcadores (Sjölund y col. 2005).
Figura 18. Correlación entre los grupos en análisis y las cepas productoras de biopelícula, asociada a los marcadores
presentes.
En la figura 18 puede observarse que las cepas aisladas de O y las que se ubican en el 4°
cuadrante (naranja) tienen una mayor cantidad de marcadores que el resto y de igual manera las
cepas productoras de biopelícula.
De esta forma es probable que haya cepas con carácter patógeno y otras con actividad
comensal por lo tanto a pesar de su variabilidad podría ser útil poner a disposición de los
investigadores los patrones encontrados principalmente en cepas relacionadas con infección de
52
ojo o cualquier otro órgano para identificar si en México existen cepas que puedan asociarse con
brotes nosocomiales y en la población abierta para facilitar su prevención tratamiento y control
ya que parece haber patrones que se repiten con mayor frecuencia en infecciones sistémicas o
localizadas en relación al órgano de aislamiento (Bannerman T.L. 1997).
53
CONCLUSIONES
Las cepas de S. epidermidis muestran una gran diversidad genética mostrando diferencias
entre los ceparios con respecto a los marcadores genéticos que presentan predominantemente.
De manera independiente no parece haber bandas asociadas a un grupo de aislamiento en
particular o a un genotípo.
La mayoría de las cepas aisladas de infecciones oculares forman grupos que se asocian
principalmente entre sí, después con las de conjuntiva sana y con menor frecuencia con las de
piel.
Al aumentar el número de marcadores en el análisis la mayoría de las cepas de infección de
ojo se concentran en 8 grupos, en estos sólo algunas de conjuntiva y piel sanas están
presentes y la mayor parte son de infección de ojo o productoras de biopelícula.
Lo anterior abre la posibilidad de que existan cepas comensales y otras que pueden
considerarse patógenas, lo que también implica una población dinámica en transición.
En las cepas de infecciones oculares no se observó una asociación definida con respecto al
diagnostico descrito.
54
APENDICE
SOLUCIONES CONCENTRADAS PARA PREPARACION DE REGULADORES:
Solución de Brij-58 10%:
Brij-58 10.0 g
Agua bidestilada
Solubilizar en baño María a 50ºC, esterilizar por filtración y almacenar a temperatura ambiente
(TA).
Solución de Desoxicolato 10%:
Desoxicolato 10.0 g
Agua bidestilada 100 mL
Solubilizar en baño María a 50ºC, esterilizar por filtración y almacenar a TA.
Solución de EDTA 0.5M, pH 7.5:
EDTA Na2 x 2H2O 93.05g
Agua bidestilada (Aforar a) 500 mL
Solubilizar en 400 mL de agua bidestilada con agitación, agregar 8g de NaOH en lentejas. Medir
el pH y ajustar a 7.5 con NaOH 1N o HCl 1N y Aforar. Esterilizar en autoclave 121ºC/15Lb,
almacenar a TA.
55
Solución de EDTA 0.5M, pH 9-9.5:
EDTA Na2 ·2H2O 93.05g
Agua bidestilada (Aforar a) 500 mL
Solubilizar en 400 mL de agua bidestilada con agitación, agregar 10g de NaOH en lentejas.
Medir el pH y ajustar a 9-9.5 con NaOH 1N o HCl 1N y Aforar. Esterilizar en autoclave
121ºC/15Lb. Almacenar a TA.
Solución de NaCl 5M:
NaCl 146.125g
Agua bidestilada (Aforar a) 500 mL
Solubilizar en 400 mL de agua bidestilada con agitación, agregar 10g de NaOH en lentejas.
Medir el pH y ajustar a 9-9.5 con NaOH 1N o HCl 1N y Aforar. Esterilizar en autoclave
121ºC/15Lb, almacenar a TA.
Solución de Sarcosil 20%:
Sarcosil 20.0 g
Agua bidestilada 100 mL
Solubilizar en baño María a 50ºC, esterilizar por filtración y almacenar a TA.
Solución de Tris-HCl, pH 7.5:
Tris Base 121.4 g
Agua bidestilada (Aforar a) 1000 mL
56
Solubilizar en 400 mL de agua bidestilada con agitación, agregar HCL concentrado. Medir el pH
y ajustar a 7.5 con NaOH 1N o HCl 1N y Aforar. Esterilizar en autoclave 121ºC/15Lb, almacenar
a TA o en refrigeración.
Solución de Tris-HCl, pH 8.0:
Tris Base 121.4 g
Agua bidestilada (Aforar a) 1000 mL
Solubilizar en 800 mL de agua bidestilada con agitación, agregar HCL concentrado. Medir el pH
y ajustar a 8.0 con NaOH 1N o HCl 1N y Aforar. Esterilizar en autoclave 121ºC/15Lb, almacenar
a TA o en refrigeración.
Proteinasa K 20mg/mL:
Proteísnasa K 0.10 g
Agua bidestilada estéril 5.0 mL
Solubilizar con agitación y almacenar a -20ºC. Durante su uso mantener en baño de hielo.
RNAsa 20mg/mL:
RNAsa 0.10 g
Agua bidestilada esteril 5.0 mL
Solubilizar con agitación y almacenar a -20ºC. Durante su uso mantener en baño de hielo.
Lisostafina20mg/mL:
Lisostafina 0.10 g
57
Agua bidestilada 5.0 mL
Solubilizar con agitación y almacenar a -20ºC. Durante su uso mantener en baño de hielo.
TBE 10X:
Tris Base 108.4 g
Na2EDTA 9.3 g
Acido Bórico 55.0
Agua bidestilada (Aforar a) 1000 mL
Solubilizar en 800 mL de agua bidestilada con agitación. Medir el pH y ajustar a 8.3 con NaOH
1N o HCl 1N y Aforar. Esterilizar en autoclave 121ºC/15Lb, almacenar a TA o en refrigeración.
TE 10 X pH8 (Tris·HCl 10 mM /EDTA 0.1 mM):
Tris Base 108.4 g
Na2EDTA 9.3 g
Acido Bórico 55.0
Agua bidestilada (Aforar a) 1000 mL
Solubilizar en 800 mL de agua bidestilada con agitación. Medir el pH y ajustar a 8.3 con NaOH
1N o HCl 1N y Aforar. Esterilizar en autoclave 121ºC/15Lb, almacenar a TA o en refrigeración.
Agar osa 1.6% para bloques:
Agarosa 0.16 g
Agua bidestilada 10 mL
Solubilizar la agarosa en el horno de microondas y mantener a 50ºC. Almacenar a TA
58
Agar osa 1% para sellar los pozos:
Agarosa 0.1 g
Agua bidestilada 10 mL
Solubilizar la agarosa en el horno de microondas y mantener a 50ºC. Almacenar a TA
Agarosa 1% gel para corrimiento
Agarosa 1.0 g
TBE 100 mL
Solubilizar la agarosa en el horno de microondas y mantener a 50ºC hasta su uso. Mantener a TA
REGULADORES:
Regulador PIV:
Tris-HCl, pH 7.5 5.0 mL
NaCl 5M 100.0 ml
Agua bidestilada (Aforar a) 395.0 mL
Preparar inmediatamente antes de su uso. Mezclar en agua bidestilada en aproximadamente la
mitad del volumen final (500 mL) y completar el volumen. Esterilizar en autoclave 121ºC/15Lb,
almacenar a TA o en refrigeración.
Regulador EC-liysis:
Tris-HCl, pH 7.5 3.0 mL
NaCl 5M 100.0 mL
59
EDTA 0.5M, pH 7.5 100.0 mL
Brij-58 10% 25.0mL
Desoxicolato 10% 10.0 mL
Sarcosil 20% 12.5 mL
Agua bidestilada 249.5 mL
Preparar inmediatamente antes de su uso. Mezclar en agua bidestilada en aproximadamente la
mitad del volumen final (500 mL) y completar el volumen.
Esterilizar en autoclave 121ºC/15Lb, almacenar a TA o en refrigeración.
Regulador ESP:
Lauril sulfato de Sodio 5.0 g
EDTA 0.5M, pH 7.5 500.0 mL
Preparar inmediatamente antes de su uso. Mezclar en agua bidestilada en aproximadamente la
mitad del volumen final (500 mL) y completar el volumen.
Regulador TE:
Tris-HCl, 1 M pH 8 10.0 mL
EDTA 0.5M, pH 8 0.2 mL
Agua bidestilada 990.0 mL
Regulador TBE:
TBE 10 X pH 8.3 200.0 mL
Agua bidestilada 2000.0 mL
60
Preparar inmediatamente antes de su uso. Mezclar en agua bidestilada en aproximadamente la
mitad del volumen final (2000 mL) y completar el volumen.
Enzima de restricción Sma I:
Producida por Serratia marcescens posee una diana de restricción en el ADN de cadena doble
no metilada, palindrómica, sobre la cual su actividad catalítica genera extremos romos (Enzimas de
restricción 2009). La diana de restricción puede representarse según este diagrama:
Diana 5' CCCGGG Corte 5' CCC GGG
3' GGGCCC 3' GGG CCC
Tomando en cuenta que S. epidermidis tiene 32.1% de G+C la probabilidad de encontrar esta
secuencia en baja por lo que para esta especie se considera una enzima de corte raro.
Su preparación sigue las indicaciones del fabricante inmediatamente antes de su uso.
Marcador de peso molecular ():
Descripción: Este marcador es construido por concatómeros de fragmentos de restrición del DNA
del fago lambda (sucesivamente de mayor tamaño a una concentración de 50 μg/ml embebidos
en agarosa de bajo punto de fusión al 1% y embasados en jeringa dosificadora ―GelSyringe™
dispenser‖. Para su uso en gel de electroforesis de campo pulsado (PFGE). Intervalo de tamaño:
50-1,000 kb.
61
Tabla 10. Marcador de peso molecular relación de los fragmentos generados y su tamaño en kilobases (kb).
Fragmento Tamaño (kb) Fragmento Tamaño (kb)
21 1,018.5 10 485.0
20 970.0 9 436.5 8
19 921.5 8 388.0 7
18 873.0 7 339.5
17 824.5 6 291.0 5
16 776.0 5 242.5
15 727.5 4 194.0
14 679.0 3 145.5
13 630.5 2 97.0
12 582.0 1 48.5
11 533.5
Figura 19 Corrimiento del Marcador de peso molecular en agarosa al 1% a 4.5 V/cm, 15°C/48 h.
Tiempo de cambio en la dirección del campo de 5-120 seg. Rango efectivo de tamaño: 48.5 kb to 1,018.5 kb.
62
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![Trabajo de investigacion tsb rana[1]](https://static.fdocuments.ec/doc/165x107/54b4db474a7959e55c8b466b/trabajo-de-investigacion-tsb-rana1.jpg)
