EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES QUE CODIFICAN...

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EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES QUE CODIFICAN PARA

PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO HSP DE PLÁNTULAS DE ARROZ (Oryza

sativa) IRRADIADAS CON 60Co TOLERANTE, RESISTENTE Y SUSCEPTIBLE

AL ESTRÉS POR ALTAS TEMPERATURAS.

RODOLFO ELÍAS ARCE LOZANO

CINDY JOHANNA MARTINEZ SAAVEDRA

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN

PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA

BOGOTÁ D.C.

2017

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EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES QUE CODIFICAN PARA

PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO HSP DE PLÁNTULAS DE ARROZ (Oryza

sativa) IRRADIADAS CON 60Co TOLERANTE, RESISTENTE Y SUSCEPTIBLE

AL ESTRÉS POR ALTAS TEMPERATURAS.

RODOLFO ELÍAS ARCE LOZANO

CINDY JOHANNA MARTÍNEZ SAAVEDRA

Proyecto de Trabajo de Grado para optar al título de Licenciado en Química y

Licenciado en Biología

Dr. LUIS FRANCISCO BECERRA GALINDO

Licenciado en Biología. Msc. Ciencias Biológicas.

Director

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN

PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA

BOGOTÁ D.C.

2017

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LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

No se hace responsable de las ideas, ni del contenido del presente trabajo, aquí expuesto

por sus autores, según el artículo 117 Acuerdo 029 que el Consejo Superior de la

Universidad Distrital Francisco José de Caldas expidió en Junio de 1988.

4

Nota de Aceptaciónmmm

_________________________

Jurado (Nombre/Firma)

_________________________

Director (Nombre/Firma)

Bogotá, Junio 2017

5

AGRADECIMIENTOS

Le damos gracias en primera instancia a Dios, por darnos la vida, la sabiduría, paciencia y

la oportunidad de recorrer este camino, donde aprendimos y crecimos a nivel personal y

profesional.

A nuestros padres y hermanos por su cariño, paciencia y apoyo incondicional en cada una

de las etapas de este proceso.

Agradecemos al profesor Francisco Becerra ¨Pacho¨ y Luis Armando Quevedo por darnos

la oportunidad de ingresar al grupo de investigación de Biología Molecular BIOMOL y

confiar en nuestro trabajo, por sus consejos y por compartir sus conocimientos cuando lo

requeríamos. A los integrantes de BIOMOL quienes nos apoyaron para culminar este

trabajo, de igual manera a los integrantes del almacén de biología por su apoyo

incondicional, en especial a Andrés Caballero.

A la Universidad Distrital que nos abrió las puertas para formarnos como Licenciados en

biología y química y permitirnos conocer grandes personas, amigos y profesores.

Agradecemos a cada una de las personas que nos acompañaron de una u otra manera en

este camino.

Gracias.

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CONTENIDO

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABLAS

LISTA DE GRÁFICAS

RESUMEN ………………………………………………………………………………..1

1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 2

2. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA .............................................................................. 4

3. ANTECEDENTES ....................................................................................................... 5

4. JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................... 10

5. HIPÓTESIS ..................................................................................................................... 12

5.1. HIPÓTESIS DE VARIEDADES .............................................................................. 12

5.2. HIPÓTESIS DE TRATAMIENTOS ......................................................................... 12

6. OBJETIVOS ................................................................................................................... 13

6.1. OBJETIVO GENERAL .............................................................................................. 13

6.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................... 13

7. MARCO TEÓRICO ....................................................................................................... 14

7.1. GENERALIDADES DEL ARROZ........................................................................... 14

7.1.1. Clasificación taxonomía ..................................................................................... 14

7.1.2. Morfología del arroz .......................................................................................... 15

7.1.3. Crecimiento y desarrollo de la planta de arroz ................................................ 19

7.2. ESTRÉS POR FACTORES ABIÓTICOS ................................................................ 21

7.2.1. Estrés por altas temperaturas ............................................................................ 21

7.3. MEJORAMIENTO DEL ARROZ ............................................................................ 23

7.3.1. Fedearroz 473 .................................................................................................... 23

7.3.2. Fedearroz Mocarí .............................................................................................. 24

7.3.3. Línea Avanzada Lv 1645 .................................................................................... 24

7.4. PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO .................................................................. 24

7.4.1. Clasificación de las proteínas de choque térmico .............................................. 25

7.5. PCR EN TIEMPO REAL ........................................................................................ 37

7.5.1. Fases de una PCR .............................................................................................. 38

7.5.2. Cuantificación mediante PCR en tiempo real .................................................... 38

7.6. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA CON DODECIL

SULFATO DE SODIO (SDS-PAGE) .............................................................................. 39

7.6.1. Preparación del gel de poliacrilamida con SDS ................................................ 39

8. METODOLOGÍA ........................................................................................................... 42

8.1. DELIMITACIÓN Y ÁREA DE ESTUDIO .............................................................. 42

7

8.2. PRE GERMINACIÓN .............................................................................................. 42

8.3. MEDIO DE CULTIVO YANG XIAO´ER ............................................................... 42

8.4. GERMINACIÓN ...................................................................................................... 43

8.5. ESTRÉS TÉRMICO .................................................................................................. 43

8.6. DISEÑO DE CEBADORES .................................................................................... 43

8.7. EXTRACCIÓN DE ARN .......................................................................................... 45

8.8. QRT- PCR ................................................................................................................. 45

8.9. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES ......................................................... 46

8.10. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA TOTAL ..................................................... 47

8.10.1. Cuantificación por Bradford ............................................................................ 47

8.11. SDS-PAGE .............................................................................................................. 47

8.12. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO.......................................................................... 48

9. RESULTADOS Y ANÁLISIS ....................................................................................... 49

9.1. ESTANDARIZACIÓN DE PRIMER’S .................................................................... 49

9.1.1. Gen Hsp 16.9 ...................................................................................................... 49

9.1.2. Gen Hsp 18 ......................................................................................................... 50

9.1.3. Gen Hsp 26.7 ...................................................................................................... 50

9.2. TASA DE GERMINACIÓN ..................................................................................... 52

9.3. CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS .................................................................... 53

9.3.1. Características fenotípicas en el Tratamiento control (TC) .............................. 53

9.3.2. Características fenotípicas en el Tratamiento 1 (T1) ......................................... 56

9.3.3. Características fenotípicas en el Tratamiento 2 (T2) ......................................... 58

9.3.4. Crecimiento de las tres variedades en los tratamientos ..................................... 59

9.4. EXTRACCIÓN ARN ................................................................................................ 60

9.5. CURVA MELTING ................................................................................................. 61

9.6. CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA ........................................................................... 62

9.6.1. Gen HSP90 ......................................................................................................... 62

9.6.2. Gen Hsp70 .......................................................................................................... 71

9.6.2. Gen HSP26.7 ...................................................................................................... 79

9.6.4. Gen Hsp18 .......................................................................................................... 86

9.6.5. Gen Hsp16.9 ....................................................................................................... 96

9.8. CUANTIFICACIÓN RELATIVA .......................................................................... 104

9.9. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES POR VARIEDAD ................ 106

9.9.1. Variedad Fedearroz 473 ................................................................................... 106

9.9.2. Variedad Mocarí .............................................................................................. 108

9.9.3 Variedad Línea avanzada1645 .......................................................................... 109

9.10. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES ............................................. 110

9.10.1. Cuantificación de Proteínas totales Tratamiento Control ............................. 112

9.10.2. Cuantificación de Proteínas totales Tratamiento 1 ........................................ 112

9.10.3. Cuantificación de Proteínas totales Tratamiento 2 ........................................ 113

9.11. SDS-PAGE ............................................................................................................ 113

9.11.1. Geles SDS-Page Tratamiento Control (TC .................................................... 113

9.11.2. Geles de SDS-Page Tratamiento 1 (T1) ......................................................... 114

9.11.3. Geles de SDS-Page Tratamiento 2 (T2) ......................................................... 114

8

10. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO ........................................................................... 117

10.1. ANÁLISIS DE DISTRIBUCIÓN DE LOS DATOS ............................................ 118

10.2. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DESCRIPTIVO ....................................................... 118

10.2.1. Histograma ..................................................................................................... 118

10.2.2. BoxPlot ........................................................................................................... 119

10.2.3. Pruebas de significación ................................................................................ 121

10.3. ANALISIS DE VARIANZA (ANOVA) ............................................................... 122

10.4. CORROBORACIÓN DE HIPÓTESIS ................................................................. 129

11. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 130

12. RECOMENDACIONES ............................................................................................ 132

13. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 133

14. ANEXOS ..................................................................................................................... 143

ANEXO 1. SECUENCIAS DE CADN Y PRIMER’S .................................................. 143

ANEXO 2. PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN EN PLANTAS ................... 148

ANEXO 3. CUANTIFICACIÓN DE ADN ................................................................... 151

ANEXO 4. KIT PCR ...................................................................................................... 152

ANEXO 5. EXTRACCIÓN DE ARN EN PLANTAS ................................................. 153

ANEXO 6. KIT QRT-PCR ............................................................................................. 154

ANEXO 7. TINCIÓN CON AZUL DE COOMASIE. .................................................. 155

ANEXO 8. CUANTIFICACIÓN EXTRACCIONES DE ARN .................................... 156

ANEXO 9. TABLA ANÁLISIS ESTADÍSTICO ......................................................... 156

9

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Morfología de la planta de arroz [23]..................................................................... 15

Figura 2. Morfología de los órganos vegetativos. a. raíz; b. tallo; c. hoja ......................... 17

Figura 3. Morfología de los órganos reproductores. a. panícula de arroz; b. espiguilla y c.

semilla .......................................................................................................................... 18

Figura 4. Fases de crecimiento y desarrollo de la planta de arroz ...................................... 20

Figura 5. Función de las proteínas de choque térmico en la célula. ................................... 25

Figura 6. Clasificación y organización de dominios de proteínas de la familia Hsp100 .... 26

Figura 7. Estructura de la proteína ClpB. ............................................................................ 27

Figura 8. Estructura de proteínas de la familia Hsp90. ....................................................... 29

Figura 9. ciclo ATPasa de Hsp90 ....................................................................................... 29

Figura 10. estructura lineal de proteínas de la familia Hsp70. ............................................ 31

Figura 11. Mecanismo de acción de la Hsp70, que es dependiente de ATP, y co-chaperonas

como Hsp40. ................................................................................................................. 32

Figura 12. a. estructura lineal de las proteínas de la familia Hsp60 .................................... 33

Figura 13. a. Estructura primaria de las proteínas del a familia sHsp ................................. 35

Figura 14. Mecanismo de accion de las proteinas de la familia sHsp. ................................ 36

Figura 15. Representación gráfica de las fases de PCR junto con el ciclo umbral CT ........ 38

Figura 16. Polimerización de poliacrilamida....................................................................... 41

Figura 17. a. electroforesis en gel discontinuo de poliacrilamida con SDS; b. luego de la

electroforesis las proteínas se visualizan con azul de coomassie. ................................ 41

Figura 18. Visualización del gradiente de temperatura del gen Hsp 16.9 en Gel Doc XR

System Bio Rad, amplificado por PCR. ...................................................................... 49

Figura 19. Visualización del gradiente de temperatura del gen Hsp 18 en Gel Doc XR System

Bio Rad, amplificado por PCR. . .................................................................................. 50


System Bio Rad, amplificado por PCR. 1: 57ºC; 2:57.6ºC; 3:58.2ºC; 4: 59.1ºC;

5:60.2ºC; 6:61,6ºC; 7:62.8ºC; Marcador Hyperlader IV (M); Actina (Ac). ................. 51

Figura 21. a) Amplificación de los primer’s por PCR, visualización en Gel Doc XR System

Bio Rad. 1) gen Hsp 16.9; 2) gen Hsp 18; 3) gen Hsp 26.7; 4) Marcador Hyperladder

IV; 5) gen Hsp 70; 6) gen Hsp 90. b) Marcador de peso molecular Hyperladder IV . 51

Figura 22. a. semillas sembradas en cajas de Petri; b. 40 semillas de cada variedad por caja;

c. brote de raíz en la semilla, d; germinación de la semilla. ......................................... 53

Figura 23. F473 TC E1 ........................................................................................................ 54

Figura 24. F473 TC E2 ........................................................................................................ 54

Figura 25. F473 TC E3 ........................................................................................................ 54

Figura 26. F473 irradiada TC E1 ......................................................................................... 54



Figura 29. Mocari TC E1 .................................................................................................... 55

10



Figura 32. Mocari irradiada TC E1 ..................................................................................... 55

Figura 33. Mocari irradiada TC E2 ..................................................................................... 55

Figura 34. Mocari irradiada TC E3...................................................................................... 55

Figura 35. Lv 1645 TC E1 ................................................................................................... 55

Figura 36. Lv 1645 TC E2 ................................................................................................... 55

Figura 37. Lv 1645 TC E3 ................................................................................................... 55

Figura 38. Lv 1645 irradiada TC E1 ................................................................................... 56

Figura 39. Lv 1645 irradiada TC E2 .................................................................................. 56

Figura 40. Lv 1645 irradiada TC E3 ................................................................................... 56

Figura 41. F473 irradiada T1 E1 ......................................................................................... 57



Figura 44. Mocari irradiada T1 E1 ...................................................................................... 57



Figura 47. Lv 1645 irradiada T1 E1 .................................................................................... 57












Figura 59. Visualización del gel de poliacrilamida SDS-PAGE con tinción azul de Comassie.

.................................................................................................................................... 114

Figura 60. Visualización del gel de poliacrilamida SDS-Page con tinción azul de Comassie.

.................................................................................................................................... 115


.................................................................................................................................... 115

Figura 62. Conjunto de datos activos. ............................................................................... 118

Figura 63. ANOVA de Bloques relacionando. SQ (número de copias), Gen (Hsp90, Hsp70,

Hsp26.7, Hsp18 y Hsp16.9), Tratamiento (TC, T1 y T2) y las Variedades (F473,

MOCARÍ y Lv 1645). ................................................................................................ 122

11

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Clasificación taxonómica dela arroz...................................................................... 15

Tabla 2. Fases y etapas del desarrollo del arroz [17,19,20] ...................................................... 20

Tabla 3. Efecto de la temperatura en el desarrollo y crecimiento de la planta de arroz [5] .. 22

Tabla 4. Rango de separación de proteínas, según el porcentaje de acrilamida [81] ............. 40

Tabla 5. Composición nutricional para un litro de cultivo líquido r..Yang Xiao´er............ 42

Tabla 6. Condiciones de estrés térmico para cada uno de los tratamientos (TC, T1 y T2) . 43

Tabla 7. Secuencias de cebadores para los genes de interés realizados en Integrated DNA

Tecnologies (IDT). ....................................................................................................... 44

Tabla 8. Volúmenes para PCR para un tubo /muestra ......................................................... 44

Tabla 9. Programa PCR en tiempo real para Hsp70, Hsp90 y sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18,

Hsp26.7) ....................................................................................................................... 45

Tabla 10. Cronograma de extracción de ARN para un día .................................................. 45

Tabla 11. Volúmenes para qRT-PCR para un tubo /muestra .............................................. 46


Hsp26.7) ....................................................................................................................... 46

Tabla 13. Cronograma de extracción de proteínas totales para un día ............................... 47

Tabla 14. Concentraciones para la preparación de la curva de calibración con BSA y las

muestras [89] .................................................................................................................. 47

Tabla 15. SDS-PAGE 12.5% para proteínas de alto peso molecular .................................. 48

Tabla 16. Temperatura de anillamiento y pb para los primer’s de interés .......................... 52

Tabla 17. Porcentajes de germinación de las 3 variedades .................................................. 53

Tabla 18. Comparación del crecimiento de los genotipos F473, Mocarí, Lv 1645 control e

irradiadas, en las tres extracciones del tratamiento control. ......................................... 53

Tabla 19. Registro fotográfico de las tres variedades durante el tratamiento control. Tomado

por: Autoría propia Arce R, Martínez C (2016). .......................................................... 54

Tabla 20. Registro fotográfico de las tres variedades durante el tratamiento 1. Tomado por:

Autoría propia Arce R, Martínez C (2016). .................................................................. 57


Autoría propia Arce R, Martínez C (2016). .................................................................. 58

Tabla 22. Comparación del crecimiento de los genotipos F473, M, Lv 1645 irradiadas, en

las tres extracciones del tratamiento TC, T1, T2. ......................................................... 59

Tabla 23. Concentración de Hsp90 en estándar y muestras problema en la E1. ................. 64



Tabla 26. Concentración de Hsp70 en estándar y muestras problema en la E1 .................. 75


Tabla 29. Concentración de Hsp26.7 en estándar y muestras problema en la E1 ............... 81



12





Tabla 36. Concentración de Hsp16.9 en estándar y muestras problema en la E2 ............. 100

Tabla 37. Concentración de Hsp16.9 en estándar y muestras problema en la E3 ............. 101

Tabla 38. Cuantificación relativa de cada uno de los genes usando actina como gen de

referencia .................................................................................................................... 104

Tabla 39. Absorbancia de la curva patrón y las muestras del Tratamiento Control (TC),

Tratamiento 1 (T1) y del Tratamiento 2 (T2) en las tres variedades Fedearroz 473

(F473), Mocarí y Línea Avanzada 1645 (Lv1645)..................................................... 110

Tabla 40. Pruebas de significación. Anderson-Darling ..................................................... 121

13

LISTA DE GRÁFICAS

Gráfica 1. Comparación del crecimiento foliar de F473, Mocarí y Lv 1645 en los tres

tratamientos. ................................................................................................................. 60

Gráfica 2. Cuantificación de una muestra de ARN de Lv 1645 ..................................... 60

Gráfica 3. Curva melting. a) Hsp90; b) Hsp70; c) Hsp26.7; d) Hsp18; e) Hsp16.9. ......... 61

Gráfica 4. a. curva de amplificación estándar de Hsp90; b. curva estándar de Hsp90...... 62

Gráfica 5. Expresion de Hsp90 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades

F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar ......................... 63


F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ........................ 65



Gráfica 8. Comparación de la Expresión Hsp90 de las variedades en los tres tratamientos

...................................................................................................................................... 69

Gráfica 9. a. curva de amplificación estándar de Hsp70; ................................................... 71








...................................................................................................................................... 77

Gráfica 14. a. curva de amplificación estándar de Hsp70;b. curva estándar de Hsp70..... 79

Gráfica 15. Expresion de Hsp26,7 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades






Gráfica 18. Comparación de la Expresión Hsp26.7 de las variedades en los tres tratamientos.

...................................................................................................................................... 86

Gráfica 19. a. curva de amplificación estándar de Hsp18; b. curva estándar de Hsp18..... 88


F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ....................... 89





14

Gráfica 23. Comparación de la Expresión Hsp18 de las variedades en los tres tratamientos.

...................................................................................................................................... 94

Gráfica 24. a. curva de amplificación estándar de Hsp16.9; b. curva estándar de Hsp16.9

...................................................................................................................................... 96

Gráfica 25. Expresion de Hsp16.9 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades





F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar. ..................... 101

Gráfica 28. Comparación de la Expresión Hsp16.9 de las variedades en los tres

tratamientos. ............................................................................................................... 102

Gráfica 29. Cuantificación relativa de los genes Hsp16,9, Hsp18, Hsp26,7, Hsp70 y

Hsp90 en las tres variedades. ...................................................................................... 105

Gráfica 30. Expresión de los genes Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7, Hsp70 y Hsp90 en la

variedad F473 en el TC, T1 y T2................................................................................ 107


variedad Mocarí en el TC, T1 y T2. ........................................................................... 109


variedad Lv1645 en el TC, T1 y T2. .......................................................................... 110

Gráfica 33. Curva estándar por método de Bradford. ...................................................... 111

Gráfica 34. Valores de la extracción de proteínas del tratamiento control TC relacionados

con la curva estándar. ................................................................................................. 112

Gráfica 35. Valores de la extracción de proteínas del tratamiento 1 T1 relacionados con la

curva estándar. ............................................................................................................ 112


curva estándar. ............................................................................................................ 113

Gráfica 37. Histograma de frecuencias contrastando el número de copias (SQ) con las

variedades F473, Lv 1645 y Mocarí. .......................................................................... 119

Gráfica 38. a. BoxPlot contrastando SQ vs VARIEDADES. b. BoxPlot contrastando SQ vs

TRATAMIENTOS. .................................................................................................... 120

Gráfica 39. BoxPlot Variedades F473, MOCARÍ y Lv1645 vs Número de Copias (SQ).

.................................................................................................................................... 123

Gráfica 40. BoxPlot Tratamientos TC (28 °C), T1 (35 °C) y T2 (42 °C) vs Número de

Copias (SQ). ............................................................................................................... 124

Gráfica 41. Básica de Diagnostico. 1. Residuos Frente a Ajustados. 2. Residuos tipificados

frente a cuantiles teórico. 3. Escala-posición: raíz de valor absoluto de residuo frente a

valores ajustados. 4. Residuos tipificados frente a palancaje. ................................... 127

Gráfica 42. Gráfica de efectos. Relación entre las medias de Variedad, Tratamiento y Gen.

.................................................................................................................................... 128

1

RESUMEN

Las plantas son organismos que se encuentran constantemente expuestos a diferentes tipos

de estrés abiótico alterando su desarrollo óptimo y por ende la productividad de los cultivos

se ve afectada. Debido al estrés generado por la variación de temperatura, las plantas han

desarrollado un grupo de proteínas conocidas como proteínas de choque térmico (HSP), que

actúan como chaperonas moleculares, ayudando a la planta en los procesos de plegamiento

adecuado de proteínas, transporte a través de membranas, modulación de la actividad proteica

y regulación de la degradación de proteínas, aportando de esta manera, tolerancia a la planta

frente al cambio constante de temperatura.

El presente trabajo evaluó la expresión de los genes que codifican las proteínas de choque

térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7), Hsp70 y Hsp90 en variedades de arroz (Oryza

sativa): Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Línea avanzada Lv 1645 que han sido irradiadas

con una dosis de 60 Gy de 60Co en su primera generación. Para tal fin se realizaron cultivos

hidropónicos con medio Yang para cada una de las variedades; una vez alcanzaron el estadio

de plántula fueron sometidas a estrés térmico durante un día de 11:00 am a 3:10 pm de la

siguiente manera: un tratamiento control (TC) a una temperatura de 28°C, un tratamiento de

estrés moderado (T1) a 35°C y un tratamiento de estrés alto (T2) a 42°C. Durante cada

tratamiento se realizaron tres extracciones de ARN y proteínas totales para cada variedad en

tres momentos diferentes; la primera extracción se hizo a las 11:10 am, la segunda a la 1:10

pm y la última a las 3:10 pm

El ARN se cuantifico a través de Thermo Scientific NanoDrop 2000c UV-Vis

spectrophotometer, posteriormente se escogieron las muestras de mejores características para

el desarrollo del trabajo. Por medio de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real

(q-RT-PCR) se hizo una cuantificación absoluta de los genes de interés; se cuantificaron las

proteínas totales por el método de Bradford, adicional a ello se realizaron geles de

poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) al 12.5%.

Como resultados se obtuvo que los tres genotipos F473, Mocarí Lv 1645 no presentan

diferencias significativas en el crecimiento de las plántulas durante las cuatro horas de

exposición al estrés térmico por altas temperaturas, por otro lado una dosis de 60 Gy de 60Co

genera alteraciones físicas en las variedades Mocarí y Lv 1645, a nivel de expresión de

proteínas de choque térmico (Hsp) en los tres genotipos, esta incrementa a medida que

aumenta la temperatura como mecanismo de protección de la plántula y la expresión de estos

genes está relacionada con la tolerancia a altas temperaturas, siendo Fedearroz 473 tolerante,

Mocarí resistente y Línea avanzada 1645 susceptible a altas temperaturas. A nivel proteico

se concluye que la proteínas que presenta mayor intensidad corresponde a 50 kDa, siendo

está correspondiente a proteínas glutelinicas que constituyen entre el 70 y 90% de proteínas

totales en arroz.

Palabras clave: proteínas de choque térmico, estrés térmico, Oryza sativa,

2

1. INTRODUCCIÓN

Durante los últimos siglos se ha observado una serie de cambios en las condiciones climáticas

generales del planeta, este fenómeno denominado "cambio climático global” ha sido de gran

importancia en estudios en el aumento en la temperatura del planeta, encontrándose que

durante los últimos 30 años la temperatura media del planeta ha aumentado entre 0,5°C a 3°C [1]. A su vez, diversos modelos predicen que en los próximos 50 años la temperatura global

del planeta podría incrementarse entre 1,3°C a 5,8°C comparado con tiempos pre-industriales [1]. Si bien este aumento global de la temperatura afectará a todos los ecosistemas del planeta,

se ha establecido que algunos de ellos serán más sensibles que otros a dichas modificaciones

climáticas [2].

Las plantas al estar expuesta a este estrés abiótico (altas temperaturas), han desarrollado

adaptaciones fisiológicas que le permiten un mejor rendimiento. Diversos estudios

demuestran que una de estas adaptaciones es la producción de proteínas de choque térmico

(HSP) las cuales son conservadas evolutivamente y el estímulo para la transcripción de estas

proteínas es un fenómeno común en todos los seres vivos. Sin embargo, un cambio de

temperatura significativo en un periodo de tiempo corto, disminuye las posibilidades de

adaptación de los seres vivos en especial de las plantas, por esta razón, el fitomejoramiento

juega un papel importante en la creación de distintas variedades de plantas que sean capaces

de soportar todo tipo de estrés abiótico.

En los resultados de diversas investigaciones, la Federación Nacional de Arroceros en

Colombia, FEDEARROZ, ha creado ciertas variedades de la especie Oryza Sativa, de las

cuales algunas son implementadas en distintas regiones de Colombia. FEDEARROZ 473,

FEDEARROZ Mocarí y Línea Avanzada (Lv 1645), son plantas que se utilizan actualmente

en Colombia. Debido a la geografía del país, existen territorios con temperaturas que superan

los valores de resistencia térmica teóricos para el desarrollo óptimo de la planta, lo cual no

afecta la producción del grano en estos cultivos; una de las razones es la expresión de las

proteínas de choque térmico que cumplen diversas funciones fisiológicas, como colaborar en

la adquisición de la estructura terciaria de las proteínas en formación, interviniendo en su

ensamble, translocación y secreción así como también en la degradación o reparación de

proteínas anormales o actuando como chaperonas moleculares.

Por tal razón, el propósito del proyecto de investigación fue evaluar la expresión de los genes

que codifican las proteínas de choque térmico sHSP’s (subunidades: Hsp16.9, Hsp18,

Hsp26.79), Hsp70 y Hsp90 en tres variedades de arroz (Oryza Sativa), Fedearroz 473,

Fedearroz Mocarí, Línea Avanzada Lv 1645 irradiadas con 60Co las cuales se desarrollaron

en cultivo hidropónico y fueron sometidas a diferentes tratamientos de estrés térmico por

altas temperaturas en el estadio de plántula con el fin de inducir la expresión de HSP y

empleando la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) se realizó un

perfil analítico de la expresión de los genes que codifican para Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7,

3

Hsp70 y Hsp90, de igual manera se empleó geles de poliacrilamida con dodecilsulfto de

sodio (SDS-PAGE) para separar las proteínas expresadas durante el estrés de acuerdo a su

relación carga-masa. Como resultado la expresión de proteínas de choque térmico (Hsp) en

los tres genotipos incrementa a medida que aumenta la temperatura como mecanismo de

protección de la plántula y la expresión de estos genes está relacionada con la tolerancia a

altas temperaturas, siendo Fedearroz 473 tolerante, Mocarí resistente y Línea avanzada 1645

susceptible a altas temperaturas.

4

2. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

Las plantas de arroz Oryza Sativa, es uno de los cultivos de mayor importancia a nivel

mundial después del trigo. Su importancia radica debido a que el arroz es el alimento básico

de más de la mitad de la población mundial, ya que su producción se extiende en más de 100

países en los continentes de Asia, América, Europa y África, lo que conlleva a que sea una

de las fuentes económicas de mayor importancia en el mundo.

El cultivo de arroz se concentra en Asia, principalmente en la China, donde se produce cerca

del 90% de la producción mundial. En Colombia se cultiva esta planta en 211 municipios

produciendo más de 1 millón de toneladas al año. El cultivo de arroz, requiere de unas

condiciones de temperatura, humedad, y nutrientes adecuados para una producción óptima.

No obstante, los cambios en el clima que se han generado en los últimos años, han provocado

aumento en la temperatura de hasta 5°C, alterando la temperatura óptima en cada una de las

fases de crecimiento de la planta haciendo que esta entre en un periodo de estrés, lo que

conlleva disminución y pérdidas en la producción del cultivo.

Diversos estudios han demostrado que los organismos vivos sintetizan un grupo de proteínas

como respuesta al estrés térmico conocidas como Proteínas de Choque Térmico (HSP), que

están relacionadas con la defensa frente a los efectos del estrés por alta temperatura siendo

muy conservadas evolutivamente.

De acuerdo a lo mencionado anteriormente, en este trabajo de grado se aborda la siguiente

pregunta de investigación:

¿Existen diferencias en la expresión de los genes que codifican las proteínas de choque

térmico sHsp’s (Hsp16?9, Hsp18, Hsp26.7), Hsp70 y Hsp90 en variedades de arroz (Oryza

sativa) irradiadas con 60Co: Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Línea avanzada Lv 1645?

5

3. ANTECEDENTES

El presente trabajo toma como antecedentes los trabajos de grado y artículos internacionales

relacionados al estudio de las proteínas de choque térmico, bajo estrés abiótico. Dentro de

los cuales podemos citar:

En el año 2013, en Colombia, Cañate Olaya J y Novoa Sánchez C[3]. presentaron una

investigación en la Universidad Distrital Francisco José de Caldas sobre la relación en la

respuesta al estrés térmico por calor en plántulas de arroz Oryza sativa de la línea avanzada

Lv 1645 y las variedades FEDEARROZ 473 y MOCARÍ con la expresión de los genes que

codifican para las proteínas de choque térmico HSP70 y HSP90, donde demostraron que

dichas proteínas tenían mayor expresión en el tratamiento utilizado a mayor temperatura 42

°C con todos los genotipos y en los otros dos tratamientos de 28 y 35 °C existió una menor

expresión de estos genes. También comprobaron que entre los tratamientos de menor

temperatura no se presentaron diferencias significativas en los niveles de expresión. Al ser

esta la primera investigación donde se comparan los niveles de expresión entre las proteínas

HSP70 y HSP90 en estrés calórico en Colombia los resultados se convierten en un primer

reporte de la expresión de esta proteína para el país, debido a que existen pocos estudios de

la HSP70 en Oryza sativa.

En el mismo año en el mes de julio se publicó en la revista “Cell Stress & Chaperones” el

trabajo realizado en la India por Sarkar, N. K., Kundnani, P., & Grover, A [4] titulado

“Functional analysis of Hsp70 superfamily proteins of rice (Oryza sativa)” en el cual se

identificó y caracterizó la funcionalidad de genes Hsp70 en el genoma del arroz, para

entender la red funcional de chaperonas. También, analizaron ADN mitocondrial de arroz

mHsp70 y se propone como supresor de calor y muerte celular programada, inducida por

H2O2 corroborando la información de Qi et al. 2011 [5,6]. Se identificaron 32 genes de dominio

Hsp70 en el genoma del arroz, que constituyen esta superfamilia, esto incluye 24 Hsp70 y 8

genes Hsp110. Por último se realizó un análisis de la expresión de Transcripción que reveló

que varias Hsp70 se rigen bajo diferentes condiciones de estrés y los genes se expresan

constitutivamente o es regulado por el desarrollo.

En este mismo año en el mes de septiembre el estudio realizado por Mulaudzi-Masuku, T.,

Mutepe, R. D., Mukhoro, O. C., Faro, A., & Ndimba, B., [7] en Sudáfrica, fue publicado en

la revista “Cell Stress & Chaperones” y describen la primera caracterización molecular

detallada de la proteína de choque térmico 70 (Hsp70) en Sorghum bicolor, trabajo titulado

“Identification and characterization of a heat-inducible Hsp70 gene from Sorghum bicolor

which confers tolerance to thermal stress” en el cual, con el ADNc de longitud completa

realizaron un análisis de SbHsp70-1 que consta de 2524 pb con un marco de lectura abierto

de 1950 pb, y codifica una proteína de 649 aminoácidos. Los resultados muestran que la

expresión de SbHsp70-1 se induce a temperaturas de 37, 42, y 4 °C, además, la transcripción

6

SbHsp70-1 ARNm se expresa constitutivamente en hojas y el tallo, pero se incrementa

significativamente en choque térmico a 42 °C. Al choque de frío a 4 °C, el nivel de

transcripción de ARNm SbHsp70-1 aumentó en la hoja, pero no se observó ningún cambio

significativo en el tallo. La expresión de la pET28a-SbHsp70-1 en células de Escherichia

coli bajo el estrés por calor resultaron en su supervivencia incluso a temperatura más alta (65

°C). Los resultados de la investigación sugieren que SbHsp70-1 es una proteína inducible

por calor que confiere tolerancia térmica a las células bacterianas y puede ser un objetivo

prometedor para estudiar la tolerancia al estrés en los cultivos.

Con relación a las proteínas de choque térmico (HSP90) Chong, L. P., Wang, Y., Gad, N.,

Anderson, N., Shah, B., & Zhao, R [8]. publicaron en el mes de junio del año 2015 en la

revista “Journal of Experimental Botany” una investigación titulada “A highly charged

region in the middle domain of plant endoplasmic reticulum (ER)-localized heat-shock

protein 90 is required for resistance to tunicamycin or high calcium-induced ER stresses”

donde analizaron la secuencia de ER-localización en Arabidopsis de HSP90.7 y otras

proteínas ER Grp94 de plantas y animales, e identificaron una región corta, cargada,

específicamente presente en el dominio medio de proteínas Grp94 derivados de plantas. Para

entender el papel de esta región cargada, se analizaron en el estudio las plantas transgénicas

que expresan una proteína mutante, HSP90.7Δ22, que tenía esta región cargada eliminada

demostrando que las plántulas que expresan HSP90.7Δ22 habían mejorado significativamente

la sensibilidad al estrés inducida por tunicamicina o una alta concentración de calcio, aunque

su actividad chaperona en general es la prevención de la proteína modelo a partir de la

agregación inducida por calor no se vio afectada significativamente. También se analizó la

actividad de hidrólisis de ATP vinculante y de tipo salvaje y las proteínas mutantes HSP90.7,

en donde encontraron que tenían ligeramente diferentes afinidades de unión a ATP.

Finalmente, utilizando dos híbridos de levadura, se identificó un pequeño conjunto de

interactores HSP90.7 y se demostró que la región cargada no se requiere para la interacción

con el cliente candidato, aunque puede afectar su afinidad de unión, proporcionando así los

posibles objetivos para una mayor investigación HSP90.7 de funciones.

Por otra parte, en la investigación de Jie Z, Ailing L, Xinbo C, Xiaoyun Z, Guofu G, Wenfang

W & Zhang X., [9] publicada en el 2009 en la revista “Journal of Plant Physiology” titulada

“Expression analysis of nine rice heat shock protein genes under abiotic stresses and ABA

treatment” se realizaron perfiles de la expresión de nueve genes de arroz de proteínas de

choque térmico (OsHSPs) donde se analizaron por reacción en cadena de la polimerasa con

transcriptasa reversa semicuantitativa (RT-PCR) y los nueve genes exhibieron una expresión

distintiva en diferentes órganos. La expresión de nueve genes OsHSP se vio afectada

diferencialmente por estrés abiótico y el ácido abscísico (ABA). Todos los nueve genes

OsHSP fueron inducidos fuertemente por el tratamiento de choque térmico, mientras que

ninguno de ellos fue inducido por el frío. Las transcripciones de OsHSP80.2, OsHSP71.1 y

OsHSP23.7 se incrementaron durante el tratamiento de estrés salino. La expresión de genes

OsHSP80.2 y OsHSP24.1 se mejoraron con 10% de PEG. Sólo OsHSP71.1 fue inducido por

7

ABA mientras OsHSP24.1 fue suprimida por la ABA. Estas observaciones implican que los

nueve genes OsHSP pueden desempeñar diferentes funciones en desarrollo de la planta y las

respuestas de estrés abiótico. Los datos en la investigación sobre los nueve genes OsHSP

sugieren que OsHSPs se expresan bajo condiciones normales con preferencia de tejido;

OsHSPs expresión se mejora, en general bajo el estrés por calor y algunas HSPs pueden ser

inducida por estrés por sal y PEG; y ambas vías ABA-dependiente e -independiente pueden

existir en la transducción de señales de estrés para regular la expresión de HSP.

Teniendo en cuenta las investigaciones de HSPs de bajo peso molecular Chandel G, Dubey

M, Mena R [10]. En agosto del 2012 publican una investigación titulada “Differential

expression of heat shock proteins and heat stress transcription factor genes in rice exposed to

different levels of heat stress” en la revista “Journal of Plant Biohemistry and Biotecnology”

donde para dilucidar las diferencias genotípicas en arroz en respuesta al estrés de alta

temperatura, las plantas fueron expuestas a diferentes niveles de temperatura que varía de 37

°C a 48 °C. La expresión de los genes pertenecientes a Hsps y Hsf se analizó inicialmente

por microarray digital y más tarde por análisis semi-cuantitativa RT-PCR utilizando tejidos

de las hojas. Los genes que codifican para Hsps (OsHsp 16, OsHsp 17.7 y OsHsp 18), OsHsp

70, DnaK, OsHsp 100 y OsHsf A2a mostraron fuerte inducción al estrés por calor a diferentes

temperaturas. Los genotipos R-1389 RF-42 y Nagina22 (tolerante al calor) mostraron altos

niveles de expresión génica para la mayoría de los genes probados de hsp y Hsf demostrando

mejor forma de regulación que contribuyó a su mayor tolerancia al calor y superar el estrés.

El estudio de Xinhai C, Shoukai L, Qiulin L, Jian H, Wenfeng Z, Jun L, Yong fei W, Yuqin

K, Huaqin H y Ahmed A.[11,12], en relación con Proteínas de Choque Térmico de bajo peso

molecular publicada en el año 2014 en la revista “Biochimica et Biophysica ACTA” realizan

un estudio de Hsp26.7, Hsp23.2, Hsp17.9A, Hsp17.4 y Hsp16.9A con referencia a

Nipponbare durante las etapas de plántulas y etapas antesis en respuesta al estrés por calor.

Posteriormente, los niveles que expresan estas cinco sHsps en el cultivo de la variedad Co39

tolerante al calor, eran todos significativamente más altos. Esto indica que el nivel de

expresión de estos cinco sHsps se relaciona positivamente con la capacidad de las plantas de

arroz para evitar el estrés por calor. Por lo tanto, el nivel de expresión de estos cinco sHsps

puede considerarse como marcadores biológicos para el cribado de los cultivares de arroz

con diferentes habilidades para evitar el estrés por calor. Hsp18.1, Hsp17.9A, Hsp17.7 y

Hsp16.9A, en los tres cultivares de arroz bajo estrés por calor se encontró que estan

involucrados en un complejo de proteínas de Native-PAGE, y las interacciones de Hsp18.1

y Hsp 17.7, HSP18 0.1 y Hsp 17.9A y Hsp17.7 y Hsp16.9A fueron validados 2-hibridación

de la levadura. Con el ensayo Pull-down se confirmó la interacción entre Hsp17.7 y

Hsp16.9A en arroz bajo estrés por calor. La sobre regulación de los 5 genes sHsps es un paso

clave para el arroz de tolerar el estrés por calor, cuando las sHsps se ensamblan formando un

complejo de hetero-oligómeros. Además, a través de la interacción proteína-proteína,

Hsp101 regula la biosíntesis de tiamina, y Hsp82 interviene en el metabolismo del nitrógeno,

mientras que Hsp81-1esta involucrado en la síntesis de almidón en las plantas de arroz bajo

8

estrés por calor [13]. Los resultados de esta investigación proporcionan nueva información

sobre el mecanismo de regulación de sHsps en el arroz.

En noviembre del 2014 en la revista “PLoS ONE” fue publicada la investigación realizada

por Company, N., Nadal, A., Ruiz, C., & Pla, M [14]. titulada “Production of Phytotoxic

Cationic α-Helical Antimicrobial Peptides in Plant Cells Using Inducible Promoters”

demostrando que la producción de péptidos recombinantes fitotóxicos en plantas

transgénicas es posible gracias a la limitación estricta de la expresión transgénica de ciertos

tejidos y en diferentes condiciones, y principalmente en la minimización de esta expresión

durante la transformación y regeneración de las plantas transgénicas, lo cual es esencial para

obtener biofábricas vegetales viables. Sobre la base de todo el trancriptoma de datos

disponibles en línea, este estudio se identificó el promotor Os.hsp82 que fue altamente

inducida en respuesta a choque térmico. Con esta estrategia, se generaron líneas de arroz

transgénicas que producen rendimientos moderados de derivados gravemente fitotóxicos

BP100 sobre la exposición a altas temperaturas. Además, un umbral para la expresión génica

en tejidos y etapas seleccionadas se establece experimentalmente, por debajo del cual los

promotores correspondientes deben ser adecuados para la conducción de la expresión de

proteínas recombinantes en fitotóxicos plantas modificadas genéticamente. Se utilizaron

cuatro secuencias [AK063751.1 (Os.hsp82), X60820.1, AU165294 y AK071240

(Os.hsp18)] que codificadas proteínas de choque térmico que pertenecen a las familias de

Hsp90 (Os.hsp82) y Hsp pequeñas (sHsp). Específicamente, el gen Os.hsp18, que codifica a

Hsp18.0 citosólica de clase II, tenía muy alta expresión tras la inducción, aunque el análisis

de microarrays demostró que conserva algo de actividad en etapas y condiciones que son

fundamentales para la producción de plantas transgénicas de desarrollo. Os.hsp82 tenía

extremadamente baja expresión en tejidos de control y alcanzó altos niveles de expresión en

respuesta al calor, pero Os.hsp18 no fueron inducidos de manera significativa por otras

condiciones de estrés, tales como frío, NaCl y la sequía. Hemos producido péptidos

antimicrobianos a-helicoidales fitotóxicos derivados de BP100 en las plantas sobre la base

de una estricta regulación de la transcripción del transgén.

En el estudio de Kaur, H., Petla, B. P., Kamble, N. U., Singh, A., Rao, V., Salvi, P., Majee,

M. [15] en el 2015 titulado “Differentially expressed seed aging responsive heat shock protein

OsHSP18.2 implicates in seed vigor, longevity and improves germination and seedling

establishment under abiotic stress” publicado en la revista Frontiers in Plant Science reveló

que OsHSP18.2,es una HSP de clase II citosólica, es una proteína sensible en el

envejecimiento, su abundancia aumentó significativamente después del envejecimiento

artificial en semillas de arroz. En la transcripción de OsHSP18.2 se encontró un aumento

marcado en la etapa de maduración tardía al ser muy abundante en semillas secas y disminuyó

considerablemente después de la germinación. En un estudio bioquímico quedó demostrado

que la forma de OsHSP18.2 es un complejo homooligomérico y es de naturaleza

dodecamerica al igual que funciona como una chaperóna molecular. Por otra parte,

OsHSP18.2 mostró actividad de chaperona, ya que era eficaz en la prevención de la

inactivación térmica de Citrato sintasa. Además, para analizar la función de esta proteína en

9

la fisiología de la semilla, se generaron líneas de sobreexpresión específicos en Arabidopsis

de semillas para OsHSP18.2. El análisis funcional demostró que OsHSP18.2 tiene capacidad

para mejorar vigor de la semilla y la longevidad mediante la reducción de la acumulación de

ROS nocivo en las semillas. Además, las semillas de Arabidopsis transformadas también

mostraron un mejor rendimiento en la germinación y emergencia de cotiledón bajo

condiciones adversas. Por último el estudio demuestra que OsHSP18.2 es una proteína

sensible al envejecimiento que funciona como una chaperona molecular y, posiblemente,

protege y estabiliza las proteínas celulares del daño irreversible en particular durante la

maduración de secado, desecación y el envejecimiento en las semillas mediante la restricción

de la acumulación de ROS y por lo tanto mejora el vigor de la semilla, la longevidad y el

establecimiento de plántulas.

Por ultimo, en la investigación titulada “Rice sHsp genes: genomic organization and

expression profiling under stress and development” de Sarkar, N. K., Kim, Y.-K., & Grover,

A [16]. En el 2009 se publicó en la revista BMC Genomics un análisis de todo el genoma del

arroz para examinar la respuesta de estrés HT de estos genes, los microarrays de tejidos de

hojas de arroz se llevaron a cabo apoyado por el análisis RT-PCR de 20 genes. Los resultados

muestran la complejidad y diversidad de la familia de genes sHsp de arroz a nivel estructural

y de expresión. Se encontraron tres genes sHsp núcleo-citoplasma que sólo se encuentran en

las monocotiledóneas y en un análisis de los perfiles de expresión de genes sHsp reveló que

estos genes se expresan diferencialmente bajo estrés y en diferentes etapas en el ciclo de vida

de la planta de arroz. Por lo tanto, se muestra que sHsps pueden estar involucrados en las

funciones celulares en condiciones de no estrés y estrés, así como durante los procesos de

desarrollo y tienen diferente patrón de expresión dependiendo del órgano, tejido y etapa de

desarrollo, son importantes en la coordinación de la respuesta global de choque térmico.

Hasta el momento solamente se encuentra un trabajo con relación a la expresión de proteínas

de choque térmico Hsp70 y 90 en Colombia, pero no se ha registrado ningún trabajo a nivel

molecular de la evaluación de expresión de los genes que codifican las proteínas de choque

térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7), Hsp70 y Hsp90 en variedades de arroz (Oryza

sativa): Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Línea avanzada Lv 1645 que han sido irradiadas

con 60Co.

10

4. JUSTIFICACIÓN

Los enormes avances logrados en la investigación científica en el área de la Genética

Molecular durante las últimas décadas han posibilitado progresos trascendentales en la

aplicación de las tecnologías biológicas en el área productiva. El objetivo de las

investigaciones en Genética Molecular, actualmente se centra en usar estos conocimientos

para el desarrollo de una metodología técnica y económicamente competitiva, que a través

del uso inteligente y respetuoso de los sistemas vivientes y los organismos, facilite la

resolución de importantes problemas productivos y sociales. Los profesionales que trabajan

con este tipo de sistemas biológicos deben conocer profundamente las problemáticas que

estos sistemas presentan y consecuentemente, estar preparados para contribuir a la solución

de las mismas. Por lo tanto, deben adquirir herramientas que les permitan profundizar,

complementar y actualizar conocimientos y habilidades que completen su formación

profesional, en el área de la Genética Molecular. En la biología hay áreas especializadas en

el estudio de los organismos vegetales, que junto a la química se encargan de realizar

investigaciones con miras al mejoramiento de cultivos y cosechas, con el fin de lograr una

óptima producción de las especies y un mejoramiento en cuanto a su resistencia a los agentes

externos, tales como la temperatura, salinidad, humedad, metales pesados, entre otros.

La expresión de proteínas en especial de choque térmico (HSP) está determinada por diversos

factores que afectan el metabolismo de la planta, en particular por estrés térmico. Las plantas

de arroz son una de las principales fuentes alimenticias de la población mundial, y están

siendo afectadas por el calentamiento global, razón por la cual resulta relevante establecer la

expresión de los genes que codifican estas proteínas, lo anterior se enmarca en la rama de la

Genética Molecular.

Con éste proyecto de investigación, se busca ampliar el conocimiento sobre la expresión de

los genes que codifican las proteínas de choque térmico (HSP) en tres variedades Fedearroz

473, Fedearroz Mocarí, Lv 1645 de Oryza Sativa; la información obtenida con los datos

cuantitativos que se adquieran realizando la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo

real (qRT-PCR) y electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfto de sodio (SDS-

PAGE) permitirán evaluar la expresión de los genes que codifican las proteínas HSP de la

planta durante la inducción del estrés térmico, con el fin de entender la relación temperatura-

HSP en el estadio de plántula, lo cual ampliará la información molecular de la expresión de

estas proteínas; además, éste proyecto también permitirá conocer las condiciones de

temperatura necesarias para la producción de HSP y por ende las adaptaciones moleculares

de las plantas de arroz en respuesta al calentamiento global; el conocimiento que se obtenga,

sobre las proteínas HSP sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 y Hsp 90, permitirá su

posterior utilización, por parte de otros estudiantes de la Universidad Distrital Francisco José

de Caldas o de otras entidades, como material de referencia, consulta para otros estudios

moleculares, biotecnológicos o ecológicos, que estén involucrados en la producción de las

11

proteínas de choque térmico; la información, también podrá ser utilizada como material

pedagógico y didáctico, con fines informativos, sobre las adaptaciones de las plantas en

respuesta al calentamiento global.

12

5. HIPÓTESIS

5.1. HIPÓTESIS DE VARIEDADES

Hipótesis nula (H0): el estrés por alta temperatura no genera diferencias en la expresión de

genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7)

Hsp70 y Hsp 90 en las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 irradiadas

con 60Co.

Hipótesis alterna (H1): el estrés por alta temperatura si genera diferencias en la expresión de



con 60Co.

5.2. HIPÓTESIS DE TRATAMIENTOS

Hipótesis nula (H0): las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 no presentan

diferencias significativas en la expresión de genes que codifican las proteínas de choque

térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 y Hsp 90 en los diferentes tratamientos

(TC, T1 y T2).

Hipótesis alterna (H1): las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 si

presentan diferencias significativas en la expresión de genes que codifican las proteínas de

choque térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 y Hsp 90 en los diferentes

tratamientos (TC, T1 y T2).

13

6. OBJETIVOS

6.1. OBJETIVO GENERAL

Evaluar la expresión de los genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s

(Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 yHsp90 de tres variedades Fedearroz 473, Mocarí, Lv

1645 irradiadas con 60Co de Oryza Sativa, mediante qRT-PCR y SDS-PAGE.

6.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Germinar semillas de arroz Oryza Sativa de las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí,

Lv 1645 irradiadas con 60Co, mediante cultivo hidropónico.

Inducir a estrés térmico las plántulas de arroz Oryza Sativa de las variedades Fedearroz 473,

Fedearroz Mocarí, Lv 1645 irradiadas con 60Co.

Evaluar la expresión de los genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s

(Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 y Hsp90 de plántulas de arroz Oryza Sativa de las

variedades Fedearrodz 473, Fedearroz Mocarí, Lv 1645 irradiadas con 60Co a través de qRT-

PCR y SDS-PAGE.

Analizar la expresión de los genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s

(Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 yHsp90 de plántulas de arroz Oryza Sativa de las

variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí, Lv 1645 irradiadas con 60Co con los resultados

obtenidos con qRT-PCR y SDS-PAGE y los antecedentes bibliográficos.

14

7. MARCO TEÓRICO

7.1. GENERALIDADES DEL ARROZ

El origen del arroz se ubica en el continente asiático, donde comenzó a cultivarse

aproximadamente hace 10.000 años principalmente al sur de la India, de allí se extendió a

China, y posteriormente se estableció en Corea y Japón [17], probablemente hubo varias rutas

por las cuales se introdujo el arroz desde Asia a otras partes del mundo.

El género Oryza tiene más de 24 especies silvestres que crecen en regiones inundadas, semi-

sombreadas y bosques en el sureste Asiático, Austria, África, Sur y Centro América [18]

siendo la especie Oryza sativa L. la de mayor importancia económica en el mundo; dentro

de esta especie se presentan dos grupos: Índica y Japónica consideradas razas eco

geográficas. Estos grupos mantienen características particulares diferenciadas en cuanto a

porte o altura de plantas, coloración del follaje, tipo de macollamiento, tipo de grano,

tendencia al desgrane y sensibilidad al fotoperiodo [17].

El tipo Índica, se cultiva en los climas tropicales, pero también prospera en condiciones

climáticas templadas, representando así la mayor parte de la producción mundial de arroz y

es la que se utiliza actualmente en todo el territorio colombiano. Este grupo se caracteriza

por presentar mayor altura que otras variedades, macollamiento denso, hojas largas e

inclinadas de color verde pálido y grano de tamaño mediano a largo [19]. Debido al alto

contenido de amilosa, le da un aspecto blando y seco al grano, haciéndolo poco apto para la

desintegración en la cocción [19]. En torno a ellas, los trabajos de mejoramiento genético han

dado lugar a la producción de variedades de porte bajo, con excelente capacidad de

macollamiento y altos rendimientos [19,20].

El tipo Japónica, se cultiva y se consume sobre todo en zonas climáticas templadas y

tropicales de tierras altas, en Australia, China, Taiwán, la República Democrática de Corea,

la Unión Europea, Japón, Rusia, Turquía y los Estados Unidos (Estado de California). Está,

se distingue de la índica, por tener hojas erectas de color verde intenso, y una capacidad de

macollamiento menor que las de tipo índica, sus granos son cortos y anchos y su contenido

bajo de amilosa lo hace susceptible a la desintegración durante la cocción [19,20].

7.1.1. Clasificación taxonomía

En cuanto a la taxonomía (tabla 1), el arroz es una fanerógama, clasificada como especies

del grupo Oryza sativa [17,21]

15

Tabla 1. Clasificación taxonómica dela arroz

Reino Plantae

Subreino Tracheobionta

División Magnoliophyta

Clase Monocotiledóneas

Orden Poales

Familia Poaceas

Tribu Oryzeae

Genero Oryza

Especie Oryza Sativa L

Grupos Indica, Japonica

7.1.2. Morfología del arroz

El arroz es una gramínea anual, de tallos redondos y huecos compuestos por nudos y

entrenudos, hojas de lámina plana unidas al tallo por la vaina y su inflorescencia es en

panícula. El tamaño de la planta varía de 0.4 m (enanas) hasta más de 7.0 m (flotantes) [20].

Los órganos de la planta se dividen en dos grupos (figura 1): órganos vegetativos (raíz, hoja

y tallos), y órganos reproductivos (flor y semillas) [21,22].

Figura 1. Morfología de la planta de arroz. Recuperado de: Ávila L, (2010). Identificación

de genes que se expresan en la lámina foliar de plantas de arroz (Oryza sativa) [23].

16

7.1.2.1. Órganos vegetativos

Raíz

Las raíces son delgadas, fibrosas, y fasciculadas [21], durante su desarrollo la planta de arroz

comprende dos tipos de raíces (figura 2a): las seminales (temporales) y las adventicias o

principales (permanentes).

Las raíces seminales, temporales o primarias se originan en la radícula, viven un corto tiempo

después de la germinación y son reemplazadas por las raíces adventicias [22]. Las raíces

adventicias, secundarias o permanentes se forman a partir de los nudos inferiores del tallo

joven. En los estadios iniciales de crecimiento estas raíces son blancas, cortas y gruesas; a

medida que la planta crece las raíces se alargan, se adelgazan y se ramifican en abundancia [17,21].

Las puntas de las raíces están protegidas por una masa de células, llamada coleorriza, para

facilitar la penetración de la raíz en el suelo. La forma y el desarrollo de las raíces del arroz

dependen del medio de cultivo y el nivel de nitrógeno en el suelo. Cuando los suelos están

inundados la parte externa de las raíces toma una coloración amarillo rojiza, debido a la

presencia de compuestos férricos; en los suelos aireados las raíces conservan su coloración

blanca [17,19] cuando las raíces son de color negro es debido a una alta concentración de

sulfuros en el suelo.

Tallo

El tallo de arroz se forma de nudos y entrenudos alternados (figura 2b). El tallo de una planta

de arroz, en sus inicios, es una estructura muy corta (mucho menos de 1 cm) y subterránea

donde se encuentran bien diferenciados los nudos, en secuencia alterna con los entrenudos

que más tarde se alargan. En cada nudo se forma una hoja y una yema; este último puede

desarrollarse dando lugar a una macolla o hijo [19] Las macollas primarias emergen

sucesivamente del primero, segundo y de los demás nudos que siguen al nudo principal del

tallo; las macollas secundarias nacen del segundo nudo de cada hijo primario; y las macollas

terciarias, nacen del segundo nudo de cada macolla primaria. Entre los 50 y 55 días, el tallo

deja de ser subterráneo, al iniciar su proceso de alargamiento, para convertirse en una

estructura hueca y cilíndrica, donde los entrenudos basales se conservan muy cortos y los

superiores se alargan sobre los 10 o 15 centímetros [17].

El número total de macollas por planta es una característica del genotipo y se encuentra

influenciada por el sistema de siembra, la nutrición y el clima [17,19].

17

Hoja

Las hojas se distribuyen en forma alterna a un lado y otro a lo largo del tallo, son

envainadoras, con el limbo lineal, agudo, largo y plano La primera hoja que aparece en un

nudo basal del tallo principal se denomina profilo el cual no tiene lámina y está constituido

por dos brácteas aquilladas. En cada nudo, con excepción del nudo de la panícula, se

desarrolla una hoja. La última hoja que nace en el tallo debajo de la panícula es llamada hoja

bandera [22].

En el máximo desarrollo del estado de plántula el arroz muestra seis hojas, de las cuales tres

están completamente formadas, dos en proceso de crecimiento y una muerta [17]. En una hoja

completa se distinguen las siguientes partes (figura 2c): la vaina, el cuello y la lámina.

La vaina o base de la hoja, sale de un nudo y envuelve el entrenudo superior llegando en

algunos casos hasta el nudo siguiente. Es generalmente glabra y puede tener pigmentos de

antocianinas en su base o en sectores de la superficie. El pulvínulo de la vaina es una

protuberancia situada encima del punto de unión de la vaina con el tallo, en algunos casos es

confundido con el nudo [17,19]

Figura 2. Morfología de los órganos vegetativos. a. raíz; b. tallo; c. hoja. Recuperado y

modificado de: http://www7.uc.cl/sw_educ/cultivos/cereales/arroz.htm [24]]

La vaina y la lámina se unen en un punto intermedio llamado cuello, en el cual se distinguen

la lígula y las aurículas que en la plántula de arroz sirven para distinguirlas de algunas

malezas comunes [17,21]. La lígula es una estructura triangular apergaminada o membranosa

situada en el interior del cuello y contigua a la vaina, que difiere en tamaño, color y forma

según la variedad de arroz [19]. Las aurículas son dos apéndices del cuello que tienen forma

de hoz y abrazan el tallo; en su parte convexa tienen un tejido en forma de dientes pequeños [19].

http://www7.uc.cl/sw_educ/cultivos/cereales/arroz.htm

18

7.1.2.2. Órganos reproductores

Flor

Las flores (figura 3a) de arroz están reunidas en una inflorescencia compuesta llamada

panícula, está situada sobre el nudo apical del tallo, llamado nudo ciliar [20]. La panícula

consta de un eje principal, cuya parte superior corresponde al raquis y la inferior al pedúnculo

o cuello, el cual se encuentra más o menos cubierto por la hoja bandera. Sobre el raquis se

forman ramificaciones (primarias, secundarias y hasta terciarias), que finalmente rematan en

el pedicelo (ramificación terminal) y sobre éste se desarrollan las espiguillas, conformada

por tres estratos de piezas florales, de los cuales el más importante es el de las glumas fértiles,

denominadas lemma y pálea; estructuras que en definitiva van a conformar la cáscara del

grano [17,19].

Las flores comprenden seis estambres y un pistilo. Los estambres son filamentos delgados

que sostienen las anteras que son alargadas y bífidas y contienen los granos de polen; en el

pistilo se distinguen el ovario que es de cavidad simple y contiene un solo ovulo; el estilo es

corto y termina en un doble estigma plumoso, que presenta diferentes colores según la

variedad de arroz: puede ser blanco, verde pálido, amarillo, purpura pálido o purpura [19,20].

Los lodículos son dos protuberancias redondeadas y transparentes que se encuentran en la

base de la flor, al lado de la palea. Durante la antesis los lodículos se ponen turgentes logrando

que la lemma y la palea se separen, simultáneamente se alargan los estambres y las anteras

emergen. La dehiscencia de las anteras puede efectuarse antes o al mismo tiempo en que se

abren las lemmas, mostrando tendencia a la cleistogamia. Después de que las anteras hayan

derramado el polen las lemmas se cierran [17,19,20]. A diferencia del maíz, las flores del arroz

tienen los dos sexos en la misma flor.

Figura 3. Morfología de los órganos reproductores. a. panícula de arroz; b. espiguilla y c.

semilla. Recuperado y modificado de:

http://www7.uc.cl/sw_educ/cultivos/cereales/arroz.htm [24]


19

Semillas

La semilla de arroz corresponde a un ovario maduro, seco e indehiscente, que consta de las

siguientes partes (figura 3c):

La cascara formada por la lema, la palea y las partes asociadas a estas dos estructuras.

Las lemas estériles, la raquilla, la arista y el embrión que está situado en el lado ventral

de la semilla, cerca de la lemma.

El endospermo, que provee alimento durante la germinación.

Debajo de la lemma y la palea hay tres capas de células que constituyen el pericarpio; debajo

de éstas se encuentran dos capas, el tegumento y la aleurona [21]. El embrión consta de la

plúmula u hojas embrionarias y la radícula o raíz embrionaria primaria. La plúmula está

cubierta por el coleóptilo, y la radícula está envuelta por la coleorriza [21,22].

El grano de arroz descascarado se conoce como arroz integral, y pueden clasificarse de

acuerdo a su tamaño en [19]:

Grano extralargo (EL) : 7.5 mm o mas

Grano largo (L): de 6.6 a 7.4. mm

Grano medio (M): 5.6 a 6.5 mm

Grano corto (C): 5.5. mm o menos

7.1.3. Crecimiento y desarrollo de la planta de arroz

El crecimiento de la planta de arroz es un proceso fisiológico continuo, corresponde a un

ciclo completo desde la germinación hasta la maduración del grano [25] (figura 4).El ciclo de

vida de la planta está comprendido entre 100 a 210 días generalmente y siendo el más común

entre 130 a 150 días, el cual puede variar dependiendo de las características genéticas de la

planta o de la influencia del ambiente [20,25].

El crecimiento de la planta de arroz se divide en tres fases, donde se desarrollan nueve etapas [10], (tabla 2).

Fase vegetativa: desde la germinación hasta la iniciación de la panícula.

Fase reproductiva: desde la iniciación de la panícula hasta la floración

Fase de maduración: desde la floración hasta la madurez total del grano.

20

Figura 4. Fases de crecimiento y desarrollo de la planta de arroz Recuperado de: Sánchez C.

Identificación y cuantificación de especies del genero Merluccius mediante la utilización de

PCR a tiempo real [26].

Las fases reproductiva y de maduración tienen por lo general, una duración constante. La

fase vegetativa es la que determina la duración del ciclo de vida de las variedades [17].

Tabla 2. Fases y etapas del desarrollo del arroz [17,19,20]

Fase Etapa

Vegetativa (55 a

60 días)

0 Germinación de la semilla (5-7 días). Desde el humedecimiento

de la semilla hasta la aparición de la primera hoja a través del

coleoptilo.

1 Plántula (15-20 días). Desde la aparición de la primera hoja hasta

la aparición del primer hijo

2 Macollamiento (30 -35 días). Desde la aparición del primer hijo

hasta el máximo macollamiento (2Mx)

3 Elongación del tallo (5-7 días). Desde el alargamiento del cuarto

entrenudo hasta inicio (micro) del primordio floral.-

Reproductiva

(35 días)

4 Inicio de panícula (10-11 días). Desde la formación microscópica

del primordio floral hasta hacerse visible.

5 Desarrollo de panícula (20-25 días). Desde que se hace visible

hasta la emergencia a través de la hoja bandera

6 Floración (7-10 días). Desde la apertura de glumas en el tercio

superior hasta la emergencia total y fecundación.

Maduración (30

días)

7 Grano lechoso (7-10 días). Desde la fecundación hasta la

formación inicial del grano.

8 Grano pastoso (10-13 días)

21

7.2. ESTRÉS POR FACTORES ABIÓTICOS

Las plantas en la naturaleza, están constantemente expuestas a estrés abiótico o ambiental.

El estrés abiótico vegetal se define como todo factor externo que afecte negativamente el

crecimiento, productividad y capacidad reproductiva o de supervivencia de las plantas [10,27,28]. Si el estrés es demasiado intenso o el periodo de acción es demasiado largo los daños

latentes se transforman en daños irreversibles que pueden afectar a la planta entera o partes

de la misma [29]. Se estima que únicamente un 10% de la superficie de la tierra arable se

encuentra libre de estrés. Cerca del 20% de la tierra presenta algún tipo de deficiencia o

toxicidad mineral, el 26% es afectado por estrés de sequía y el 15% por congelación [29].

Incluso las plantas que se encuentran protegidas por invernadero y túneles presentan eventos

de estrés biótico y abiótico disminuyendo la productividad y calidad de los cultivos [29].

Son múltiples los factores ambientales que originan estrés en las plantas, entre ellos se

encuentra: deficiencias o excesos de agua y nutrientes minerales, pasando por altos

contenidos salinos de los suelos, altas o bajas temperaturas extremas, excesiva radiación solar

(PAR, UVB), excesiva alcalinización o acidificación de los suelos y factores mecánicos

(compactación de los suelos, viento, nieve, granizo) hasta la presencia de contaminantes

químicos en los suelos (metales pesados, agentes xenobióticos, etc.) o en el aire (SO2, O3,

óxidos de nitrógeno (NOx), HF, nitrato de peroxiacetilo, etc.) [27].

En los cultivos de arroz el estrés abiótico afecta la planta por dos vías, la primera perjudica

directamente los procesos fisiológicos involucrados en la producción del grano, tales como

crecimiento vegetativo, desarrollo de espiguillas y llenado de grano y la segunda vía afecta

indirectamente los rendimientos a través de la incidencia de enfermedades e insectos

fitófagos [30]. El estrés que sufre la planta está relacionado con la tolerancia al mismo, siendo

este la capacidad que tiene la planta para hacer frente a las condiciones desfavorables y se

mide mediante el rendimiento del cultivo, el crecimiento, o los procesos de asimilación

primaria (incorporación de CO2 y minerales) que están relacionados con el crecimiento [27,28].

7.2.1. Estrés por altas temperaturas

Los seres vivos están adaptados a desarrollarse en un rango óptimo de temperatura. Unas

temperaturas que superen dicho rango pueden provocar daños en los procesos fisiológicos,

incluso efectos letales sobre el individuo [31]. De acuerdo a esto, el rendimiento potencial de

la planta está relacionado con la temperatura a la que se encuentra expuesta. Cada una de las

etapas de desarrollo de la planta de arroz tiene una temperatura óptima en la cual la

productividad es favorable, no obstante las plantas de arroz se ven afectadas por estrés

abiótico por altas temperaturas afectando negativamente su desarrollo y crecimiento (tabla

3). Las temperaturas críticas para la planta de arroz están, generalmente por encima de 30°C

y varían según el estado de desarrollo de la planta [19].

22

Durante la germinación y crecimiento de la plántula temperaturas de 45°C provocan la

aparición de punta blanca, bandas cloróticas y manchas sobre la lámina de las hojas; cuando

la temperatura es de 35°C el macollamiento es reducido. En la fase reproductiva un estrés de

alta temperatura a 38°C o más da lugar a una reducción del número de espiguillas [32].Estudios

previos, por Yoshida [33] han mostrado que las espiguillas en antesis que son expuestas a

temperaturas superiores a 35°C por cerca de 5 días durante la etapa de floración resultan

estériles, la cual es causada por una pobre dehiscencia y una baja producción de polen, y de

allí que se presenta un bajo número de granos de polen que germinan en el estigma [20,34].

Así mismo, se ha encontrado que menos de una hora de exposición a altas temperaturas es

suficiente para inducir esterilidad en arroz (Jagadish et al, 2007).

Además, la fotosíntesis en el cultivo del arroz es severamente afectada por temperaturas

superiores a los 40°C, y se encuentra relacionada directamente con el contenido de clorofila

de la hoja [20]. Cuando se exceden los límites de temperatura óptimos se presentan

alteraciones fisiológicas importantes, como desnaturalización de proteínas, alteraciones de la

fluidez de membranas, inhibición en el transporte de electrones, entre otras, afectando el

crecimiento, desarrollo y el rendimiento final del cultivo [20,35].

Tabla 3. Efecto de la temperatura en el desarrollo y crecimiento de la planta de arroz [5]

Etapas de desarrollo

Temperatura

alta (°C) Efecto Temperatura

óptima (°C)

Germinación 45

Punta blanca, bandas

cloróticas y manchas en

las hojas

20-35

Emergencia y

establecimiento de la

plántula

35

25-30

Enraizamiento 35 25-28

Elongación de las hojas 45 31

Macollamiento 33 Reducido 25-31

Iniciación de la

panícula (primordio

floral)

- Panícula blanca

-

Diferenciación de la

panícula

38 Número reducido de

espiguillas -

Antesis (floración) 35 Esterilidad 30-33

Maduración 30 Menor llenado del

grano 20-25

23

7.3. MEJORAMIENTO DEL ARROZ

El objetivo principal del Fitomejoramiento es desarrollar variedades que presenten mayores

rendimientos de producción, mayor resistencia a plagas, enfermedades y efectos ambientales

que puedan alterar su ciclo su vida [19,20]. Encontrar una variedad que cumpla y satisfaga las

necesidades del agricultor requiere de un ardua investigación de casi siete a doce años. Los

tres métodos más usados en el mejoramiento son el masal, el de pedigree y el de

retrocruzamiento; no obstante, actualmente se está haciendo uso de agentes mutagénicos

tanto químicos como físicos [19,22].

Los mutagénicos físicos son un amplio grupo de radiaciones entre las que se encuentran los

rayos gamma, rayos X, neutrones, ultravioleta, partículas alfa, beta y protones. Estas

radiaciones pueden ser divididas en ionizantes y no ionizantes; la primera categoría incluye

aquellas radiaciones capaces de producir iones al interactuar con la materia (rayos X, gamma,

protones y neutrones), mientras que la segunda se refiere a los rayos ultravioleta que

transfieren la energía por excitación [20,36].

Las principales fuentes de rayos gamma son los isotopos 60Co, y 137Cs, utilizados

ampliamente en radiobiología [20,22]. Las radiaciones provenientes de estos isotopos rompen

las moléculas de agua, produciendo iones (H+, H-, OH+, OH-), radicales libres (Ho, OHo) y

peróxidos (O22-) que atacan las moléculas de ADN y ARN, los cromosomas y las enzimas

[22]. De este modo, se presentan cambios permanentes y heredables en el genoma del tejido

tratado [22]. Para el año 2000 la Agencia Internacional de Energía Atómica (AIEA) reporta

434 variedades de arroz obtenidas mediante esta técnica, para mejorar características como

la calidad del grano, la altura de la planta, el potencial de rendimiento, calidad culinaria,

tolerancia al frio, resistencia a Pyricularia , entre otros.

Estudios realizados en el 2010 por Castilla [36] mostraron que la variedad Fedearroz 473 y

Fedearroz Mocarí presentaron mayor adaptación a altas temperaturas (34°C) en Ambalema

y el Espinal municipios del Tolima; la variedad de mayor rendimiento fue Fedearroz 473.

Junto a ello se encontró que la variedad Fedearroz Lv 1645 presenta bajos rendimientos ante

este tipo de estrés. A partir de esto se escogieron para el presente estudio las variedades

Fedearroz 473 (resistente), Fedearroz Mocarí (tolerante) y Lv 1645 (susceptible) a estrés por

altas temperaturas, las cuales han sido irradiadas con 60Co.

7.3.1. Fedearroz 473

Es una variedad de porte bajo, pero a pesar de esta característica tiende al volcamiento, posee

buen vigor inicial, alto macollamiento, arquitectura de la planta erecta, ciclo vegetativo corto

y alto potencial de rendimiento. Si se atrasa el momento oportuno de cosecha, se afecta su

calidad de molinería; por tal motivo se sugiere cosecharla por encima de un 23% de humedad.

Al presentarse un “stress” por mal manejo del agua de riego o en su defecto en los lotes altos

24

de secano sin curvas a nivel, es afectada por Helmintosporiosis en hoja y en el cuello. Esta

variedad registra buen comportamiento en ambos semestres. Se siembra en la actualidad en

Caribe seco, húmedo y el Centro del país donde se encuentran las zonas con más altas

temperaturas debido a su buen rendimiento en dichos sitios [30].

7.3.2. Fedearroz Mocarí

Es un genotipo liberado hacia el año 2010 al mercado nacional, se caracteriza por un alto

vigor inicial, periodo vegetativo corto, buena capacidad de macollamiento, excelente calidad

molinera y buena sanidad foliar. En cuanto a la oferta ambiental, es de amplia adaptabilidad

y estabilidad. Está aprobada para las zonas del Caribe seco, húmedo y centro del país, sin

embargo, en los meses del año donde la temperatura alcanza su máximo, tiende a bajar su

producción. Un reciente trabajo realizado en el centro del país con respecto a la nutrición con

Nitrógeno, indica que se obtiene un aumento en el rendimiento significativo cuando se aplica

el 60% del Nitrógeno programado hacia el inicio del primordio floral [30].

7.3.3. Línea Avanzada Lv 1645

Esta línea avanzada en la actualidad se encuentra en la fase de ensayos de rendimiento,

pruebas que ha pasado con altos niveles de producción, sin embargo, estos ensayos al ser

ejecutados en la zona Caribe donde las temperaturas son elevadas merma significativamente

su rendimiento, por esta razón se ha clasificado como susceptible ante altas temperaturas, lo

que compromete su liberación como variedad, aunque aún es prematuro sacar conclusiones

ya que faltan más estudios para definir su viabilidad [3].

7.4. PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO

Debido a la sensibilidad de las fuerzas responsables del plegamiento de las proteínas a altas

temperaturas, las proteínas se desnaturalizan fácilmente, o se pliegan de manera incorrecta;

los organismos biológicos tienen un conjunto de proteínas que se expresan en respuesta a la

alta temperatura que previenen o revierten los efectos del calor sobre la desnaturalización de

las proteínas [37] estos se denominan proteínas de choque térmico (Heat shock proteins, HSP).

Es importante aclarar que estas proteínas de choque térmico también se expresan como

respuesta a otros tipos de estrés como temperaturas bajas, salinidad, metales pesados, sequia.

Las Hsps están relacionadas con la adquisición de termo tolerancia, siendo muy conservadas

evolutivamente, puesto que presentan función y estructura muy similar en archea, bacterias,

levaduras, plantas y animales [38], Todas las HSP se caracterizan por la presencia de un N-

terminal carboxílico llamado dominio de choque térmico [39].

Las HSP se conocen como Chaperones moleculares ya que facilitan una serie de procesos

que incluyen el plegamiento de proteínas, el transporte de proteínas a través de membranas,

25

la modulación de la actividad de la proteína, la regulación de la degradación de proteínas y

la prevención de la agregación de proteínas irreversibles [37,38] (figura 5).

7.4.1. Clasificación de las proteínas de choque térmico

Las proteínas de choque térmico se han agrupado en cinco familias denominadas: Hsp100,

Hsp90, Hsp70, Hsp60 y sHsp’s (de bajo peso molecular), de acuerdo a sus estructura, peso

molecular y grado de homología [10].

Figura 5. Función de las proteínas de choque térmico en la célula. Chaperonas de diversos

tipos se unen a los polipéptidos recién sintetizados en los ribosomas, otras se unen a las

proteínas que atraviesan las membranas de diversos organelos, o a proteínas que se han

desnaturalizado debido a cualquier tipo de estrés. En todos los casos la función de las

chaperonas es ayudar al correcto plegamiento de las proteínas, desagregación y reactivación

de las proteínas. Recuperado y modificado de: Doyle S, Genest O, Wickner S. (2015) Protein

rescue from aggregates by powerful molecular chaperone machines. [62].

7.4.1.1. Hsp100

Las proteínas de mayor tamaño se agrupan en la familia Hsp100 que a su vez pertenecen a

la superfamilia AAA (Atpasa asociada con varias actividades), esta familia se caracteriza por

la presencia de 200 a 250 aminoácidos que conforman el dominio α-helicoidal y un dominio

de unión de nucleótidos tipo Walker. Su peso oscila entre los 100 y 114 kDa de las que

26

algunas son inducidas por calor y otras son constitutivas tanto en eucariotas como

procariotas, y se localizan en el citosol, mitocondria y cloroplasto [28].

La primera Hsp100 fue descrita como componente de una proteasa dependiente de ATP en

Escherichia coli, la proteasa caseinolitica (Clp). Esta proteasa posee tres miembros de

regulación (ClpA, ClpB, ClpC) y un miembro catalizador (ClpP) [40]. La primera Hsp100

asilada en eucariotas fue la Hsp104 de Sacharomyces cerevisiae [41]. Esta proteína se expresa

en respuesta al estrés y juega un papel central en la tolerancia a condiciones extremas [42]. En

plantas superiores como arabidopsis, soja, tabaco, arroz, maíz, trigo, guisante y judía se ha

logrado aislar proteínas correspondiente a esta familia, donde su estructura se asemeja a la

ATP-dependiente ClpB de E. coli. [43]. Se ha demostrado que la expresión de Hsps100 en

plantas se induce por una gran variedad de condiciones ambientales estresantes como calor,

frio, salinidad, deshidratación y metales pesados. Además su expresión también está regulada

durante el desarrollo [42]. En Oryza sativa, se aisló la Hsp110 kDa, que es homólogo de la

Hsp104 de levadura y se expresa frente a estrés por altas y bajas temperaturas, salinidad y

ABA [43].

De acuerdo a la presencia de uno o dos dominios de unión a ATP las Hsps100 se dividen en

dos clases: clase I y clase II (figura 6). Las Hsp100 de clase I en su estructura contienen dos

dominios de unión a ATP (NBD-1 yNBD-2); en un extremos se encuentra el dominio N-

Terminal (domino N), seguido por un dominio de unión de nucleótidos (NBD-1), un dominio

medio (dominio M), y un segundo dominio de unión a nucleótidos (NBD-2), seguido del

dominio carboxilo (dominio C) [43]. Las proteínas de esta familia presentes en Oryza sativa,

se clasifican en la clase I tipo (ClpB) (figura 7).

Figura 6. Clasificación y organización de dominios de proteínas de la familia Hsp100. La

estructura de las proteínas Hsp100 están conformadas por dos clases. La Clase I posee un

dominio N-terminal, seguido de un dominio de unión a sustrato 1 (NBD-1), posteriormente

se encuentra el dominio M, le sigue una segunda región de unión a sustrato (NBD-2) y

finalmente el dominio c-terminal. La clase II está formada únicamente un dominio de unión

a sustrato similar al NBD-2 de la clase I. Recuperado de:

http://pdslab.biochem.iisc.ernet.in/hspir/hsp100.php


27

Las Hsp100 de clase II contienen solo un dominio de unión a ATP que es similar al dominio

NBD-2 de las Hsp100 de clase I [44]. Dentro de sus funciones se encuentra, facilitar la

solubilidadx y eliminación de agregados de proteínas desnaturalizadas, implicando la

participación de otras chaperonas como las HSP70 y proteasas [31,38]. Otra función descrita

para las Hsp100 de plantas es su papel como reguladores de la expresión de genes [31,37].

Figura 7. Estructura de la proteína ClpB. Compuesta por un dominio N terminal (gris), una

región de unión a sustrato 1 y 2 (NBD-1 y NBD-2) (azul y verde respectivamente, un dominio

medio en espiral (naranja), en amarillo se muestra la presencia de nucleótido unido a las

regiones NBD1 y NBD2. Protein rescue from aggregates by powerful molecular chaperone

machines. Recuperado de: Doyle S, Genest O, Wickner S. (2015) Protein rescue from

aggregates by powerful molecular chaperone machines. [62].

7.4.1.2. Hsp90

Las proteínas de esta familia tienen un tamaño que oscila entre 82 y 96 kDa, se encuentran

en el citosol y retículo endoplasmatico. Estas proteínas son muy conservadas evolutivamente

y esenciales para la viabilidad de las células eucariotas, siendo dependiente de ATP [45].

Hsp90 es una de las proteínas más abundantes en los eucariotas, representando

aproximadamente el 1% de proteínas solubles totales bajo condiciones normales. A

diferencia de otras proteínas la familia Hsp90 no actúa en el plegamiento de la proteína

naciente, si no que interviene en el plegamiento final de la proteína.

Las Hsp90 actúan como chaperonas moleculares durante un estrés térmico y a temperaturas

normales de crecimiento son indispensables para el funcionamiento de los receptores de

hormonas esteroides, la actividad o estabilidad de muchas proteínas esenciales para la célula,

fundamentalmente quinasas de proteínas implicadas en transducción de señales y en el

control del ciclo celular, convirtiéndose en un objetivo para la terapia del cáncer [46]. Por lo

tanto Hsp90 no solo interviene en el plegamiento de proteínas si no en diversos proceso

celulares, transducción de señales, transporte intracelular y degradación de proteínas [46].

28

Para lograr su función, la Hsp90 trabaja en conjunto con un grupo de cofactores denominados

co-chaperonas como p50, p23, Aha1 y proteínas con motivo TPR, que facilitan la maduración

de la proteína cliente.

En los animales Hsp90 es muy conocida como un componente de un complejo que ayuda a

doblar el receptor de glucocorticoides. En las plantas, Hsp90 participa en un complejo

multiproteico similar que también incluye Hsp70 y una pequeña proteína ácida conocida

como p23, [37] además son necesarias para el crecimiento y desarrollo normal de la planta.

Por otro lado las Hsp90 es regulada en respuesta a diversos estrés abióticos y bióticos y

también participan en la respuesta inmune de las plantas [47], aunque el mecanismo de acción

aún no se conoce.

Se han aislado genes de Hsp90 en diferentes especies de plantas, en Arabidopsis thalina, se

encuentra 7 proteínas de las cuales 4 se localizan en el citoplasma y se considera que las otras

3 se ubican en el retículo endoplasmatico y mitocondria [48]. También se han encontrado en

Licopersicum esculentum [49] Zea mays [49], y Brassica napus [48] y Oryza sativa. En el arroz

se expresó el gen Hsp90 en semillas y hojas bajo el estrés por sales (NaCl, NaHCO3 y

Na2CO3), desecación, pH y temperatura alta [50]. Sin embargo no está claro su mecanismo

molecular [47].

La familia Hsp90 es altamente conservada, en el citosol bacteriano se presenta la HtpG,

Grp94 / gp96 en el retículo endoplasmático de eucariotas, Hsp75 / TRAP1 en la matriz

mitocondrial y Hsp90 en el citosol de eucariotas. Hsp90 del citosol se denominan además

como Hsc82 y Hsp82 en la levadura, Hsp83 en Drosophila m., Hsp86 y Hsp84 en ratones,

Hsp90α (inducible) y Hsp90β (constitutiva) en los seres humanos. Todos estos homólogos

comparten una estructura común y por lo tanto tienen un modo de acción similar. Hsp90

forma un homodímero constitutiva a través de sus residuos carboxilo-terminal. Cada unidad

posee tres dominios (figura 8) [47]. Inicialmente se encuentra el dominio N-terminal (dominio

N) el cual es altamente conservado y posee el sitio de unión a ATP, está conectado mediante

una secuencia cargada al dominio medio (dominio M) donde se una la proteína cliente, y

finalmente se encuentra un dominio carboxilo-terminal (dominio C) que favorece la

homodimerizacion; junto a esta región se encuentra un motivo conservado MEEVD que sirve

como sitio de acople para la interacción con co-chaperonas que contienen tetratricopeptido

(TPR) [46,51,52] . Esta conformación es conservada desde levaduras hasta el ser humano [46].

Hsp90 es muy dinámica, ya que fluctúa rápidamente entre conformaciones que van desde

una forma de V abierta a una forma cerrada que asemeja a un par de manos ahuecadas (figura

9 a.) [51]. En el estado inicial la Hsp90 posee una conformación abierta.

29

Figura 8. Estructura de proteínas de la familia Hsp90. a. estructura lineal de proteínas Hsp90,

domino N-terminal (amarillo), seguido de una secuencia cargada, posteriormente se presenta

el dominio M (verde) y en el extremo un domino C-terminal (azul) junto con una pequeña

región MEEVD; b. Estructura terciaria de las proteínas de Hsp90. Recuperado y modificado

de Taipale M, Jarosz D, Lindquist S. (2015). Hsp90 at the hub of protein homoestasis:

emerging mechanistic insights.[53]

La unión de ATP desencadena una serie de cambios conformacionales incluyendo el

reposicionamiento de la tapa de la región N-terminal, y un cambio brusco en la orientación

del dominio N-M. Después de la unión de ATP, y de la proteína cliente al sustrato la Hsp90

alcanza el primer estado intermedio, en la que la tapa se cierra, pero los dominios-N aún están

abiertos, posteriormente se lleva a cabo la dimerización del dominio N-terminal que conduce

a un segundo estado intermedio, en el que el dominio M y N interactúan y la Hsp90 alcanza

un estado completamente cerrado en el que se produce la hidrolisis de ATP. Una vez la ATP

se hidroliza los dominios-N se disocian, se libera ADP, Pi y la proteína activa y la Hsp90

vuelve a su conformación abierta (figura 9 b.) [53].

Figura 9. a. ciclo ATPasa de Hsp90, esta fluctúa entre una conformación abierta en V y

cerrada para su funcionamiento; b. ciclo de la chaperona Hsp90, la cual requiere de ATP y

de co-chaperonas como Hsp40 y Hsp70, Recuperado de: Taipale M, Jarosz D, Lindquist S.

(2015). Hsp90 at the hub of protein homoestasis: emerging mechanistic insights. [53]

7.4.1.3. Hsp70

Las proteínas que pertenecen a la familia Hsp70, presentan un peso molecular entre 69 y 71

kDa. Se localizan en el citosol, mitocondria y cloroplasto. Es una de las familias más

estudiadas y conservadas en eucariotas y procariotas [37]. Algunos miembros de esta familia

30

se expresan constitutivamente y se conocen como Hsc70 (Heat Shock Cognate), mientras

que las Hsp70jk se expresan únicamente cuando el organismo se encuentra en un estrés por

temperaturas extremas, presencia de metales pesados como arsénico, cadmio, cobre,

mercurio, u otro tipo de estrés abiótico [54]. No se han establecido aun diferencias en la

función de las Hsc70 y Hsp70 [37,55]. La Hsp70 fue descubierto originalmente por Fm Ritosa

en la década de 1960 cuando la temperatura de Drosophila melanogaster fue impulsado por

accidente. Al examinar los cromosomas se observó una región sobresaliente que indicaba la

elevada transcripción de genes de una proteína desconocida. Más adelante estas proteínas

fueron denominadas como “proteínas de choque térmico (Hsp)” [54].

La función de las Hsp70 principalmente es actuar como chaperonas moleculares, pero no

sobre polipéptidos sintetizados de novo, sino sobre proteínas maduras, protegiéndolas del

choque térmico y facilitando su recuperación del mismo. Además son esenciales en el

plegamiento de proteínas, unión y desunión de oligómeros, translocación de proteínas de un

orgánulo a otro o degradación de las mismas [31,54]. Además de su función como chaperona,

las Hsp70 desempeñan un papel regulador de la expresión de otros genes asociados con el

estrés.

La proteína Hsp70 mas estudiada en procariotas se conoce como DnaK y sus co-chaperonas

DnaJ y GrpE. En eucariotas se han encontrado proteínas de la familia Hsp70 en todos los

compartimientos subcelulares. Las Hsp70 localizadas en el retículo endoplasmatico también

se denominan BiP (Binding Protein) o GRP78 (78kD Glucose-Regulated Protein). Esta

diferencia en la localización subcelular implica especificidad funcional [56]. Recientemente

se han identificado en eucariotas un grupo de proteínas de mayor tamaño, pero que de

acuerdo a sus propiedades estructurales y funcionales, se han considerado una subfamilia de

las Hsp70. Esta subfamilia conocida como Hsp110, incluye la Hsp110 de mamíferos, las

proteínas SSE de levaduras y sus homólogos en el retículo endoplasmático y los ortólogos

de Grp170 en mamíferos [56,57].

En plantas la familia de proteínas es relativamente grande, en Arabidopsis thaliana, se han

asignado 18 genes que codifican para proteínas de esta familia, ubicadas en el retículo

endoplasmático, cloroplasto, mitocondria y citosol [58]. Se han encontrado Hsp70 en Glycine

max, Cucumis sativus,Nicotiana tabacum, Oryza sativa, Ricinus communi, Solanum

tuberosum, Zea mays. La expresión de Hsp70 es inducido por el estrés térmico por altas y

bajas temperaturas [44]. La mayoría de Hsp70 en plantas muestra una fuerte inducción después

de 30 minutos a 2 horas de estrés de 37 a 45°C [59]. Además algunas Hsp70 se expresan en

respuesta a la infección por virus [58,59].

El amplio espectro de funciones celulares de las proteínas Hsp70 se logra a través de tres

factores. El primero es la amplificación y diversificación de los genes Hsp70 que ha generado

a lo largo de la evolución chaperonas especializadas, el segundo es el uso de co-chaperonas

por parte de las chaperonas para cumplir con funciones celulares específicas y tercero es la

31

cooperación del sistemas Hsp70 con otros sistemas de chaperonas como Hsp90, Hsp100 lo

que permite ampliar su espectro [60].

Las proteínas Hsp70 tanto procariotas como eucariotas comparten una estructura similar, por

lo cual tienen un modo de acción igual. Todas las proteínas Hsp70 contienen dos dominios

principales (figura 10). El primer dominio es el ATPasa N- terminal de 45kDa donde se une

el ATP y se hidroliza a ADP, este está unido al segundo dominio mediante una región

hidrofóbica que es susceptible a la escisión por proteasas. El segundo dominio es el dominio

de unión a sustrato (SBD) de 25kDa que puede interactuar con segmentos peptídicos lineales

cortos. Este dominio se subdivide en dos, en la región donde se une el péptido de 15kDa y el

dominio C-terminal de 10kDa que presenta una conformación de hélice α y actúa como una

tapa en el momento en el que la proteína se une al sustrato [52, 55,58]. Cuando la Hsp70 se une

a ADP el dominio de unión a sustratos está cerrado y el intercambio de sustratos es lento, la

unión de ATP hace que se abra este dominio, lo que produce un rápido intercambio de

sustratos [60].

Figura 10. a. estructura lineal de proteínas de la familia Hsp70, está conformada por un

dominio ATPasa N-terminal (azul), seguido de una región hidrofóbica, seguido se encuentra

el dominio de unión a sustrato (SBD) (verde y amarillo), que se divide en el sitio de unión a

sustrato (verde) y el dominio c-terminal que actúa como tapa (amarillo); b. conformación

abierta de una proteína Hsp70; conformación cerrada de una proteína Hsp70. Recuperado de

Kampinga H, Craig E (2010). The Hsp70 chaperone machinery J proteins as drivers of

functional specificity. [61].

El funcionamiento de la Hsp70 (figura 11) es regulada por dos actividades principales: unión

de péptido y la hidrolisis de ATP. Inicialmente el ATP se ha unido al dominio N-terminal

donde la Hsp70 adquiere una conformación abierta. Posteriormente la proteína cliente

interactúa con el sitio de unión del péptido que se encuentra “abierto”. La hidrólisis de ATP

32

es estimulada por co-chaperonas como la Hsp40 que generan mayor estabilidad al complejo

Hsp70, causando un cambio conformacional en Hsp70 que permite el cierre de la tapa sobre

la hendidura helicoidal y estabiliza la interacción con el cliente, en seguida la co-chaperona

abandona el complejo. Un factor de intercambio de nucleótidos (NEF), que tiene una mayor

afinidad por Hsp70-ADP que Hsp70-ATP se une a la Hsp70 para estimular la disociación de

ADP, después de esto se une ATP a Hsp70. El cliente adquiere una conformación nativa y

es liberado debido a su baja afinidad por Hsp70-ATP. Si no se alcanza la conformación

nativa, la proteína cliente se une de nuevo a la Hsp70 y el ciclo comienza de nuevo [61,62].

Figura 11. Mecanismo de acción de la Hsp70, que es dependiente de ATP, y co-chaperonas

como Hsp40. Recuperado de: Doyle S, Genest O, Wickner S. (2015) Protein rescue from

aggregates by powerful molecular chaperone machines. [62].

7.4.1.4. Hsp60

Las proteínas de esta familia se conocen como chaperoninas y se caracterizan por tener un

tamaño entre 53 y 62 kDa [63]. Las chaperoninas son indispensables para el funcionamiento

adecuado de procariotas y eucariotas a todas las temperaturas [63]. Son la familia más

conservada y participan en el correcto plegamiento de proteínas desnaturalizadas, recién

sintetizadas o bajo condiciones de estrés ayudándolas a conseguir su estructura terciaria y

por consiguiente su función, [64] también participa en el transporte y transducción de señales [65].

Las chaperoninas se clasifican en dos subfamilias, que son estructuralmente similares pero

se diferencian en su secuencia. El grupo I se encuentra en procariotas y orgánulos

endoplasmáticos como mitocondria y cloroplastos, una de ellas es GroEL en el citosol

bacteriano, Hsp60 en las mitocondrias y proteína de unión a Rubisco (RuBisCoBP) en el

cloroplasto que participa en el plegamiento de proteínas tan importantes como el Rubisco y

por lo tanto son esenciales en el desarrollo del cloroplasto [39,55]. Para su funcionamiento las

chaperoninas del grupo I requieren de las co-chaperonas Hsp10, que proporcionan la tapa

para el cierre de la cavidad del sustrato. El Grupo II se presenta en arquea y el citosol de

eucariotas, entre estas se tiene TF55 en arquea y TRiC/CCT en el citosol de eucariotas [54,64];

a diferencia de las Hsp60 del grupo I ellas no requieren la ayuda de co-chaperonas, pues

33

cuentan con una región que actúa como tapa. Las proteínas de los dos grupos presentan

funciones similares, pero se diferencian en la forma como encapsulan el sustrato lo cual está

relacionado con la estructura de cada una. Las chaperoninas al igual que las Hsp100, Hsp90

y Hsp70 son proteínas dependientes de ATP [66].

Las chaperoninas del grupo I (figura 12) forman estructuras oligomericas formadas por dos

anillos apilados de 7 unidades cada uno [66]. La cavidad central del cilindro proporciona el

ambiente adecuado para el plegamiento de la proteína sustrato. Las chaperoninas de

procariotas y mitocondrias presentan 14 subunidades, y las de cloroplasto están formadas por

dos tipos de subunidades α y β [64,68]. Cada subunidad consta de tres dominios: el dominio

ecuatorial que contienen el sitio de unión a ATP y es el lugar donde se producen las

interacciones entre subunidades, el dominio apical que contienen el sitio de unión a

aminoácidos hidrofóbicos y de unión a su co-chaperona, seguido del dominio intermedio que

está localizado entre los dominio ecuatorial y apical que transfiere la información alostérica

entre ellos [52, 54,66].

Figura 12. a. estructura lineal de las proteínas de la familia Hsp60, están conformadas por

un dominio apical (rojo) donde se une ATP y el sustrato, seguido de un dominio intermedio

(amarillo) que transfiere la información alostérica y el dominio ecuatorial (verde); b

Estructura terciaria de las chaperoninas. Recuperado y modificado de:


Las chaperonas de tipo II forman estructuras similares a las de tipo I pero con la diferencia

de que cada anillo está formado por 8 o 9 subunidades distintas [66]. El dominio apical de

estas chaperoninas tiene una extensión que podría realizar un papel similar al de las co-

chaperonas del tipo I [52,66].

Para el funcionamiento de las Hsp60, inicialmente la proteína cliente se une a la cavidad

central de la chaperona a través de las regiones hidrofóbicas expuestas en la proteína.

Posteriormente se une el ATP y la co-chaperona a la región ecuatorial, lo que produce un

cambio conformacional de la chaperona, que supone un aumento de tamaño de la cavidad

central y además pasa a ser hidrofilia, proporcionando así un ambiente adecuado para el

plegamiento de la proteína. Seguido a ello la hidrolisis de ATP es esencial para que la

proteína pueda liberarse de la chaperona [65,66].


34

En plantas se han estudiado principalmente las chaperoninas de tipo I. en Arabidopsis

thaliana sean identificado 11 genes que codifican para chaperoninas de tipo I, 7 de ellas se

encuentran en el cloroplasto y las otras 4 en la mitocondria. Las proteínas de tipo II en plantas

son poco abundantes, en Arabidopsis se han identificado 9 genes que codifican proteínas de

este tipo [64,65]. Las sHSps actúan como chaperonas moleculares frente al estrés térmico,

dentro de sus funciones esta unir y estabilizar las proteínas, controlar la unión y liberación

de las mismas, facilitar su correcta localización subcelular, su plegamiento, e incluso

controlar la destrucción por degradación [66]. Estas proteínas pueden ser importantes en la

protección de las plantas frente al estrés salino [66].

7.4.1.5. sHsp’s

Las proteínas de choque térmico de bajo peso molecular, tienen un tamaño que oscila entre

12 y 43 kDa, suelen encontrarse en el citosol, mitocondria, cloroplasto y retículo

endoplasmático [28,68]. Son un grupo de proteínas muy diverso que juegan un papel importante

en el mantenimiento y control de calidad de las proteínas en la célula [67]. La mayoría de las

sHsps comparten algunas características comunes como: la presencia de un dominio α-

cristalina conservado de aproximadamente 90 residuos, una pequeña masa molecular de 12

a 43 kDa, formación de grandes oligómeros de 200 a 300 kDa, e inducción por estrés a altas

temperaturas y otros tipos de estrés como metales pesados.

Las sHsps se encuentran en organismos eucariotas y procariotas pero el número de sHsps

encontrado en diferente especie varia significativamente. Los organismos procariotas suelen

tener una o dos sHsps, excepto algunas especies del genero Rhizobium que tienen diez sHsps [67]. En levaduras se han encontrado dos sHsps, mientras que en el resto de eucariotas el

número de genes que codifican sHsps es mucho mayor, por ejemplo en Drosophila

melanogaster se han identificado cuatro genes, dieciséis en Caenorhabditis elegans,[13] diez

en humanos y diecinueve en Arabidopsis thaliana. En Oryza sativa se han identificado la

expresión de doce genes de sHsps a los 5,15 y 45 minutos frente a estrés por temperaturas de

37, 42 y 48°C [9,13].

Las plantas se caracterizan por presentar una mayor abundancia y diversidad de sHsps que

en otros eucariotas, debido a su inmovilidad inherente lo que le impide evitar el estrés y les

obliga a lidiar con el mismo mediante la acción de las proteínas de choque térmico [48]. En

las plantas las sHsps son rápidamente inducidas por el calor, convirtiéndose en uno de los

ARN más abundantes en la célula [68,69], además pueden alcanzar hasta el 1% del total de

proteínas en hojas y raíces. Estas proteínas están codificadas por genes nucleares y se

agrupan en seis clases según el grado de homología en la secuencia de aminoácidos, donde:

las clases CI, CII y CIII están localizadas en el citosol [54] o en el núcleo, la clase P localizada

en los cloroplastos [48], la clase ER en el retículo endoplasmático [81] y la clase M se ubica en

35

las mitocondrias [54]. Actualmente se cree que hay un grupo de sHsps que actúa en el

peroxisoma [67]. Esta clasificación solo aplica para plantas terrestres.

A pesar de la diversidad de proteínas sHsps, en cuanto a su estructura todas las sHsp’s tienen

una organización estructural conservada (figura 13). Las sHsps se componen de una región

N-terminal que es altamente variable en longitud y secuencia entre las sHsps seguido por el

dominio α-cristalino altamente conservado en todas las sHsps y una región C-terminal [67].

Figura 13. a. Estructura primaria de las proteínas del a familia sHsp, poseen un dominio N-

terminal (verde), seguido de un dominio α-cristalino (rojo) que posee una extensión para el

C-terminal; b. Estructura terciaria de proteína sHsps. Recuperado y modificado de: Sun Y,

MacRae T. (2005). Small heat chock proteins: molecular structure and chaperone

function.[70].

El domino α-cristalino, está comprendido por aproximadamente 100 aminoácidos, consiste

en un β-sandwich con dos laminas β antiparalelas [54] por lo que se puede dividir en dos

subdominios, denominados consenso I y II, separados por una región hidrofílica de longitud

variable [68]. El consenso I tiene 27 aminoácidos de longitud, de los cuales el motivo Pro-

X(14)-Gly-val-Leu, es una secuencia conservada en la mayoría de sHsps. En el consenso II

existe un motivo de secuencia similar: Pro-X(14)-Val-Leu-Ile-Val-Leu-Ile [70,71].

El dominio amino terminal varia bastante entre las distintas clases de sHsps, además las

sHsps cloroplastidicas, mitocondriales y las de retículo endoplasmático tienen la secuencia

señal típica de exportación al orgánulo correspondiente [71]. Las sHsps cloroplastidicas de

clase I tienen en la región amino terminal un dominio de 28 aminoácidos rico en metionina,

las sHsps de clase II contienen una pequeña región de 11 aminoácidos conservada en mayoría

de las especies y en las sHsps citosolocias de clase I se presentan 17 aminoácidos [70,71]. Las

sHsps mitocondriales presentan dos secuencias amino terminal, localizadas entre los

aminoácidos 95-105 y 142-152 [68]; esta diversidad en la secuencia de la región amino

terminal puede ser muy importante, ya que les permite a las sHsps unirse a una amplia

cantidad de sustratos [70].

La extensión C-terminal también es bastante diversa entra las distintas clases de sHsps, con

la excepción del motivo Ile-Val-X-Ile-Val que esta conservado en todos los tipos de sHsps

36

[70,72]. Esta región aunque no tiene un papel directo en la unión de los sustratos, contribuye a

la actividad chaperona estabilizando los oligómeros de sHsps [82].

Los modelos actuales proponen que sHSPs actúan como chaperonas independientes de ATP

(figura 14), para ello las sHsps forman oligómeros de 200-300kDa, que en las plantas suelen

estar compuestos por 12 subunidades [67]. Cuando la proteína nativa se encuentra bajo estrés

esta se desnaturaliza y puede unirse a dímeros y oligómeros de sHsps conformando el

complejo proteína-sHsps para evitar de este modo la agregación irreversible. Este complejo

actúa con proteínas como Hsp70, Hsp40, Hsp110 que son dependientes de ATP, para así

permitir el replegamiento del sustrato y permitir su liberación [66].

Figura 14. Mecanismo de accion de las proteinas de la familia sHsp. Recuperado y

modificado de: http://mmbr.asm.org/content/76/2/115/F10.expansion.html

Las sHsps no solo se inducen en respuesta a altas temperaturas, sino que también responden

a otros estímulos ambientales. Las sHsps en animales se relacionan con proceso como la

apoptosis o la formación de tumores [44,54,55]. En el caso de las plantas, los procesos en los

que se evidencia mayor expresión de sHsps en ausencia de choque térmico son la formación

del polen, el desarrollo embrionario [44,55], la maduración del fruto [44] y la maduración de la

semilla. El papel de las sHsps en estos procesos aún no se conoce, pero se cree que

desempeñan un papel importante para desencadenar dichos procesos, quizás relacionado con

la activación y/o desactivación de proteínas relevantes en cada uno [44,67].

http://mmbr.asm.org/content/76/2/115/F10.expansion.html

37

7.5. PCR EN TIEMPO REAL

La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real o cuantitativa (qPCR), es una

modificación de la PCR convencional [72,73]. En principio es igual a una PCR tradicional, la

diferencia se basa en la inclusión de fluorocromos en la mezcla de reacción y un

termociclador especial para la detección de fluorescencia [74].

Mediante la detección por fluorescencia se puede medir durante la amplificación la cantidad

de ácidos nucleicos específicos en una mezcla, ya que la emisión de fluorescencia producida

en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado [73,74]. Debido a esto la q-PCR

presenta ventajas con respecto a la PCR convencional como la rapidez, la precisión en la

cuantificación de los amplicones presentes en la muestra, la ausencia de manipular geles de

agarosa, y menor riesgo de contaminación.

Los reactivos a usar en la PCR en tiempo real, son los mismos que se utilizan en una PCR

convencional, con la diferencia que en la PCR en tiempo real los primers deben ser diseñados

para garantizar una alta especificidad y generen ampliaciones de un tamaño que oscile entre

100 a 150 pb; si estos son más grandes, la eficiencia de la reacción disminuye

considerablemente [75], además se adiciona un fluorocromo para detectar los productos

amplificados. Los sistemas de fluorescencia pueden ser de dos tipos: agentes intercalantes y

sondas de hibridación específicas.

Los agentes intercalantes son fluorocromos que tienen afinidad por el ADN de doble cadena

que al ser oxidadas generan una señal fluorescente; la fluorescencia emitida es capturada en

la etapa de extensión de cada ciclo y es proporcional al número de copias de ADN de doble

cadena obtenidas en cada ciclo de la PCR. El más empleado es SYBER Green, este es

excitado a una longitud de onda de 480 nm, mientras que la longitud de onda de emisión

corresponde a 520 nm [75], el principal inconveniente es su baja especificidad, debido a que

se puede unir a cualquier cadena de ADN de doble cadena, para ello se recomienda hacer la

curva melting y corroborar que solamente amplifique una región de ADN.

Por otro lado, las sondas de hibridación específicas, son sondas marcadas con dos tipos de

fluorocromos, un donador y un aceptor. Este proceso sigue el principio de transferencia de

energía de resonancia fluorescente (FRET) para generar la señal; este método consiste en

transferir energía desde un donador o reportero fluorescente a un aceptor o quencher [75].

Sin importar el método que se utilice para detectar los productos amplificados los

termocicladores de PCR en tiempo real incorporan la tecnología de un termociclador de PCR

tradicional con fluorímetros integrados y detectores que proporcionan la capacidad de excitar

tanto un fluorocromo, detectar la luz emitida y realizar el análisis cuantitativo [74,75].

38

7.5.1. Fases de una PCR

Durante la amplificación por PCR, las secuencias cortas de ADN se copian en cada ciclo.

Teóricamente, la cantidad de ADN en la reacción debe duplicar en cada ciclo, lo que resulta

en una amplificación exponencial del ADN objetivo inicial [74]. El proceso se divide en tres

fases (figura 15).

Figura 15. Representación gráfica de las fases de PCR junto con el ciclo umbral CT.

Recuperado y modificado de: Kainz P. (2000) The PCR plateau phase – towaards and

understanding of its limitations [70].

La primera de ellas es una fase exponencial en la que, si la eficiencia de la reacción es del

100%, se produce en cada ciclo exactamente el doble de producto que en el ciclo anterior.

En esta fase la reacción es muy específica y precisa. A continuación tiene lugar la fase lineal,

en la que alguno de los reactivos puede ser limitante, la Taq polimerasa pierde actividad o

bien algún de los productos comienza a degradarse, la reacción se hace lenta y por lo tanto

aumenta la variabilidad en la cantidad del producto final. Finalmente se produce una fase de

meseta (“plateau”), en la que existe inhibición por producto y la reacción de síntesis se

detiene [76].

7.5.2. Cuantificación mediante PCR en tiempo real

El número de ácidos nucleicos diana en la muestra original puede determinarse con precisión

cuando se determina el número de ciclos de PCR donde la señal de fluorescencia se eleva

respecto a la línea base, el cual se conoce como ciclo umbral (CT) (figura 6), o punto de corte

(crossing point) [75].

La cuantificación de la PCR puede ser una cuantificación absoluta o cuantificación relativa

de acuerdo a los intereses del análisis.

39

En la cuantificación absoluta es necesario realizar una curva patrón con estándares conocidos [26]. Estas curvas producen relaciones lineales entre el CT y la cantidad inicial de RNA o

cDNA, permitiendo determinar la concentración de muestras desconocidas mediante el

análisis de sus CT y aplicando la ecuación de la recta. Esta cuantificación se emplea para

conocer la cantidad inicial de ADN molde, número de copias, o concentración en masa [26].

La cuantificación relativa se usa cuando se desean evaluar los cambios en la expresión de

genes en distintos estados fisiológicos. Estos cambios se basan en los niveles del ARNm del

gen blanco comparados con un gen de referencia que no cambia su expresión a pesar de que

los estados fisiológicos se modifiquen por diversas causas. Los datos son expresados como

relativos al gen de referencia y generalmente son referidos como el número de veces en el

que aumentaron o disminuyeron los niveles de ARNm [77]. En este caso se parte de los niveles

del transcrito o ARNm de las muestras, por lo que es necesario realizar la transcripción

reversa (RT) donde el ARN es retrotranscrito en cADN y los ensayos se conocen como RT-

PCR en tiempo real [75,77].

7.6. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA CON DODECIL

SULFATO DE SODIO (SDS-PAGE)

La electroforesis es una técnica de separación de moléculas cargadas en un campo eléctrico,

la velocidad de migración de las moléculas depende de su relación carga: masa [78]. La

electroforesis se utiliza para separar y visualizar proteínas, lo que permite estimar

rápidamente el número de diferentes proteínas en una mezcla o el grado de pureza de una

preparación de proteína particular. También permite la determinación de propiedades

significativas como el punto isoeléctrico y el peso molecular aproximado [79]. Generalmente

esta técnica de separación de proteínas se lleva a cabo en geles de poliacrilamida (PAGE).

La poliacrilamida, es un polímero reticulado, químicamente inerte, resistente a agentes

desnaturalizantes (Urea, detergentes), forma geles transparentes con estabilidad mecánica, y

permite buena visualización de las bandas durante tiempo prolongado, además tiene la

ventaja de que al variar la concentración de polímero se puede modificar de manera

controlada el tamaño del poro [80] que actúa como un tamizador molecular, garantizando la

migración de proteínas por medio de su relación carga- masa. Un método comúnmente

empleado en la electroforesis de proteínas hace uso del detergente dodecilsulfto de sodio

(SDS).

7.6.1. Preparación del gel de poliacrilamida con SDS

El soporte se prepara a partir del monómero de acrilamida que forma largas cadenas lineales,

con abundantes grupos polares que las hace solubles en medios acuosos. Al no estar las

cadenas unidas entre sí, formarían un gel sin consistencia mecánica y totalmente inmanejable.

Para evitar esto, se utiliza otro monómero, la N,N’-metilen-bisacrilamida que forma uniones

covalentes con las cadenas de acrilamida para formar un entramado [79,81] . En función de la

40

concentración de acrilamida se obtienen entramados más o menos densos, mientras que la

cantidad de N,N’-metilen-bisacrilamida condiciona el grado de entrecruzamiento de las

cadenas. Ambos componentes determinan, en conjunto, las características físicas del gel

resultante como su resistencia mecánica, fragilidad, elasticidad, y tamaño del poro, al

momento de realizar el gel es indispensable saber el porcentaje de acrilamida en el gel ya que

este determina el rango de peso molecular en (kDa) a separar [81] (tabla 4).

Tabla 4. Rango de separación de proteínas, según el porcentaje de acrilamida [81]

Porcentaje Rango peso molecular (kDa)

7.5 22-500

10 15-300

12 10-200

15 10-45

20 5-40

La polimerización de la acrilamida (figura 16) se obtiene por la adición de catalizadores como

el persulfato de amonio (PSA) generando radicales libres que catalizan la reacción de

polimerización y junto a ello tetrametiletilendiamina (TEMED) que aumenta la generación

de radicales libres por el PSA [81].

El SDS desnaturaliza por completo las proteínas y rompe las interacciones no covalentes que

determinan la estructura terciaria y cuaternaria, uniéndose una molécula de SDS por cada dos

aminoácidos de la cadena. Los grupos alifáticos dodecil se colocan en el interior, mientras

que los grupos sulfato en la superficie y todos los complejos SDS-proteína toman carga neta

negativa [79]. La fuerza iónica del sistema tampón debe mantenerse a un nivel adecuado para

garantizar la solubilidad de la muestra y suficiente capacidad amortiguadora, por lo general

se utiliza una solución o buffer de Tris-HCl.

Para obtener un alto poder de resolución se utiliza el sistema electroforético discontinuo,

donde el gel está formado por dos geles de distinta porosidad y pH, en la parte superior se

encuentra el gel compactador y en la parte inferior el gel separador [79].

41

Figura 16. Polimerización de poliacrilamida. Recuperado de:

https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/polyacrylamide-matrix

Una vez se realiza la electroforesis SDS-PAGE, se separa el gel de los vidrios y se visualiza

con un colorante, el más utilizado es el azul de Coomassie con el que se pueden observar

0.1-0.5 μg de proteína por banda, otro método de tinción es con sales de plata que debido a

su sensibilidad logra detectar hasta 0.1 ng de proteína por banda [82]. Una vez teñido el gel de

poliacrilamida, la imagen que se obtiene es un conjunto de bandas coloreadas sobre el gel.

Su análisis permite identificar el número mínimo de componentes (bandas) de cada muestra

(figura 17).

Figura 17. a. electroforesis en gel discontinuo de poliacrilamida con SDS; b. luego de la

electroforesis las proteínas se visualizan con azul de coomassie. Recuperado y modificado

de: https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/polyacrylamide-matrix



42

8. METODOLOGÍA

8.1. DELIMITACIÓN Y ÁREA DE ESTUDIO

Para el estudio se escogieron las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645

irradiadas con 60Co. Se pretende evaluar la expresión de proteínas de choque térmico sHsp’s

(OsHsp16.9, OsHsp18, OsHsp26.7), Hsp70, Hsp90 en las tres variedades por medio del

sometimiento a estrés por alta temperatura en condiciones de cultivo hidropónico, haciendo

uso de las técnicas qRT-PCR y SDS-PAGE.

El proyecto se desarrolló en las instalaciones del laboratorio de Biología Molecular, ubicado

en la sede B de la facultad de Ciencias y Educación de la Universidad Distrital Francisco

José de Caldas.

8.2. PRE GERMINACIÓN

La pre-germinación y germinación de las semillas de Oryza Sativa se realizó siguiendo el

protocolo de Cañate y Novoa [3]. En la fase de pre-germinación se dispusieron 30 semillas en

una caja de Petri que contiene previamente papel humedecido con agua y posteriormente se

llevaron al fitotrón donde la temperatura óptima fue de 28°C y una humedad del

70%, durante 7 días o hasta que se evidencio el desarrollo de la radícula. Una vez culminada

esta fase, las semillas estaban listas para el proceso de germinación.

8.3. MEDIO DE CULTIVO YANG XIAOÉR

Para el crecimiento de las plantas se utilizó el medio de cultivo Yang Xiaoér. Para el

desarrollo óptimo de las plantas el pH del medio debe estar entre 5.60 a 6.00, la composición

y concentraciones para un 1L de solución se presentan en la tabla 5:

Tabla 5. Composición nutricional para un litro de cultivo líquido r..Yang Xiaoér.

ID Reactivo Wt (g) Stock

(mol/L) Stock Elemento

Concentración

del elemento mL

A NH4NO3 80.04 0.715 57.29 g/L N 1.43 mmol/L 1

B NaH2PO4. 2H2O 156.01 0.16 24.81 g/L P 0.32 mmol/L 1

C K2SO4 174.25 0.2 34.50 g/L K 1.32 mmol/L 3.3

D CaCl2. 2H2O 147.03 0.5 73.52 g/L Ca 1.0 mmol/L 1

E MgSO4. 7H2O 246.48 0.82 202.11 g/L Mg 1.64 mmol/L 1

F

MnCl2. 4H2O 197.92 5.0 989.6 mg/L Mn 9.1 µmol/L

1 (NH4)6

. Mo7O24

.

4H2O

1235.8

6 0.075 92.689mg/L Mo 0.52 µmol/L

H3BO3 61.83 1.90 1117.47 mg/L B 18 µmol /L

43

8.4. GERMINACIÓN

Una vez pre-germinadas las semillas, se trasladó cada uno de los genotipos a una pl aca de

PCR, estas fueron puestas sobre una solución nutritiva de medio Yang para que floten sobre

ella, de tal forma que solo las radículas queden sumergidas en el medio de cultivo. Cada tres

días se realizó el cambio de medio.

El procedimiento se realizó en una cámara de crecimiento “fitotron” marca Binder donde se

mantuvieron las plantas durante 8 horas de oscuridad a una temperatura de 20°C y 16 horas

de luz a 28°C y una humedad relativa del 70%, durante cuatro semanas donde alcanzaron el

estadio de plántula.

8.5. ESTRÉS TÉRMICO

Los tres genotipos de Oryza Sativa (Fedearroz 473 (F473), Fedearroz Mocarí (Mocarí) y

Linea avanzada 1645 (Lv 1645) en estadio de plántula fueron sometidos a un estrés térmico

por un día entre las 11:00 am y las 3:10 pm, para ello se realizaron tres tratamientos térmicos:

uno control (TC; 28°C), uno con estrés moderado (T1; 35°C) y otro con estrés alto (T2;

42°C) [3], el fitotrón que se utilizó a lo largo del proyecto es de marca Binder, este permitió

programar los diferentes tratamientos con las variaciones de luz, temperatura y humedad

relativa requeridos.

Tabla 6.Condiciones de estrés térmico para cada uno de los tratamientos (TC, T1 y T2)

8.6. DISEÑO DE CEBADORES

En el diseño de los cebadores para el desarrollo de la qRT-PCR se utilizaron las secuencias

de “Rice Genome Annotation Project [83]”. En el caso de Hsp16.9, la secuencia utilizada fue

>LOC_Os01g04270.1 [84], para Hsp18, se empleó la secuencia >LOC_Os01g08860 [85], y

para la Hsp26.7 se utilizó la secuencia >LOC_Os03g14180.1 [86], cada gen correspondiente

al gen que codifica a la proteína de interés. Por otro lado para el diseño de cebadores para las

secuencias de Hsp70 y Hsp90 se utilizaran los propuestos por Cañate y Novoa[3]. (Anexo 1)

ZnSO4. 7H2O 287.56 1 287.66 mg/L Zn 0.15 µmol /L

CuSO4. 5HO 249.68 0.2 49.93 mg/L Cu 0.16 µmol /L

G FeCl3. 6H2O 270.3 Fe 36 µmol /L 1

Tiempo de

estrés

Hora toma

de muestra

Temperatura °C

Luz

%

Humedad

relativa TC T1 T2

11:00 am -

3:10 pm

E1: 11:10 am 28 35 42 Completa 70%

E2: 1:10 pm 28 35 42 Completa 70%

E3: 3:10 pm 28 35 42 Completa 70%

44

Los cebadores que fueron escogidos para llevar a cabo el estudio fueron realizados en

Integrated DNA Tecnologies (IDT) [87]. (Tabla 7).

Tabla 7. Secuencias de cebadores para los genes de interés realizados en Integrated DNA

Tecnologies (IDT).

Gen Secuencia Primer Tm Pb

Hsp16.9 >LOC_Os01g04270.1 F 5’-TACCACCGCTGTGTTGAAAG-3 63

104 R 3’-TCTCGTGACTCTCATCCTTATCC-5’ 68

Hsp18 >LOC_Os01g08860.1 F 5’- AGGAGGAGTCGTGCAAGTA-3’ 62

106 R 3’-CGATGGTCTTGGGCTTCTT-5’ 62

Hsp26.7 >LOC_Os03g14180.1 F 5’-GAGGATGCGGTTCGACAT-3’ 62

105 R 3’-TCGCCCTCCTCCTTCTT-5’ 62

Hsp70 X67711.2 F 5’-CGTCTCATTGGCAGGAGGTT-3’ 57

446 R 3’-TCTTCACCACCAAGATGGGT-5’ 55.6

Hsp90 AB037681 F 5′CACTCTACAGCAACAAGGAC-3′ 53.1 459 R 5′-CACGTACTCCT-TGGCTTCAT-3′ 54.4

8.7 EXTRACCIÓN DE ADN

Se realizaron seis extracciones de ADN en plántulas de Mocarí, traídas de Saldaña – Tolima,

haciendo uso del Ultra clean plant DNA Isolation Kit de MoBio (Anexo 2). Posteriormente

se cuantificaron las muestras. (Anexo 3).

8.8 PCR CONVENCIONAL

A partir de las extracciones de ADN obtenidas, se realizó una PCR convencional para

amplificar los genes de interés haciendo uso del kit (Anexo 4). A continuación se presentan

las cantidades de cada reactivo.

Tabla 8. Volúmenes para PCR para un tubo /muestra

Compuesto 1 Tubo (µl)

Agua 7.75

Buffer 1.25

MgCl2 0.625

DNTP´s 0.25

Primer Foward 0.75

Reverse 0.75

Taq 0.25

ADN 1

Total 12.5

45

Las condiciones utilizadas para la PCR se presentan en la tabla 9.


Hsp26.7)

No. de ciclos Proceso Temperatura (°C) Tiempo

1 Desnaturalización inicial 94 1 min.

40 - 45

Desnaturalización 94 30 s

Unión del primer

Hsp 16.9 57.6

45 s

Hsp 19 57

Hsp 26.7 61.6

Hsp 70 59.5

Hsp 90 59

Extensión 72 1 min

1 Incubación 4 2 min

Una vez terminada la PCR se realizó electroforesis en geles de agarosa al 1.5%. Cada gel se

corrió durante 50 minutos a 120V y 200 mA con el fin observar la amplificación de cada gen

en el gradiente de temperatura propuesto.

8.7. EXTRACCIÓN DE ARN

Se realizó la extracción de ARN de cada uno de los genotipos durante cada tratamiento, para

ello se pesó 2 gr de muestra vegetal de hoja y se macero con nitrógeno líquido, posterior a

esto se tomaron 0.5 gr de muestra de material vegetal macerado y se empleó el protocolo de

extracción de ARN UltraClean Plant RNA Isolation K de Mo – Bio (Anexo 5). La

extracción de ARN se realizó entre las 11:00 am hasta las 3:10 pm, por lo cual se obtuvieron

3 muestras de ARN para tener en total 6 muestras para genotipo en cada tratamiento. A

continuación, se presenta el cronograma de extracción. Las extracciones se realizaron por

duplicado.

Tabla 10. Cronograma de extracción de ARN para un día

Tratamiento Temperatura Max. (°C) Hora de extracción ARN

TC 28

11:10 am; 1:10 pm; 3:10 pm. T1 35

T2 42

8.8. qRT- PCR

A partir de las muestras de ARN de cada tratamiento y genotipo se procedió a realizar la

qRT-PCR mediante el KIT iScript one-step RT-PCR kit with SYBR® Green (Anexo 6). A

continuación, se presentan las cantidades de cada reactivo del kit para un tubo/muestra, las

cuales fueron modificadas por OrjuelaD, Martin D (2012) [90].

46

Tabla 11. Volúmenes para qRT-PCR para un tubo /muestra

Compuesto 1 Tubo (µl)

Agua libre RNasa 3.32

iSCRIPT 0.24

Syber Green Reaction Mix 6

Primer Foward 0.72

Reverse 0.72

ARN 1

Total 12

El programa para la PCR en tiempo real se realizó teniendo en cuenta las condiciones de la

PCR convencional.


Hsp26.7)

No. de ciclos Proceso Temperatura (°C) Tiempo

1 Desnaturalización inicial 94 1 min.

40 - 45

Desnaturalización 94 30 s

Unión del primer

Hsp 16.9 57.6

45 s

Hsp 19 57

Hsp 26.7 61.6

Hsp 70 59.5

Hsp 90 59

Extensión 72 1 min

1 Extensión final 72 7 min.

1 Incubación 4 2 min

8.9. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES

Se extrajo proteínas totales de cada uno de los genotipos durante cada tratamiento, para ello

se tomaron 0.5 g de tejido vegetal y se realizó la lisis celular con nitrógeno líquido,

posteriormente se adiciono buffer de glicina (glicina, 2-mercaptoetanol, glicerol, NaOH)

a 4°C para la extracción de proteínas, se homogenizo y se incubo durante 1 hora a 4°C, luego

se centrifugo a 4°C durante 30 minutos con 14000 rpm, finalmente se separó el sobrenadante

y se almaceno a 4°C. La extracción de proteínas totales se realizó entre las 11:10 am hasta

las 3:10 pm, por lo cual se obtuvieron 3 muestras de proteínas totales para cada tratamiento

y genotipo. A continuación se presenta el cronograma de extracción.

47

Tabla 13. Cronograma de extracción de proteínas totales para un día

Tratamiento Temperatura

Max. (°C)

Hora de extracción de

Proteínas totales

TC 28

11:10 am; 1:10 pm; 3:10 pm. T1 35

T2 42

8.10. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA TOTAL

La cuantificación de proteínas totales se hizo por el método de Bradford, utilizando como

patrón Albumina Sérica Bovina (BSA).

8.10.1. Cuantificación por Bradford

Para la cuantificación por Bradford se realizó una curva patrón a partir de Albumina sérica

bovina (BSA), la curva y las muestras se prepararon de acuerdo a la tabla 14.

Tabla 14. Concentraciones para la preparación de la curva de calibración con BSA y las

muestras [89]

Buffer

Glicina Blanco

Patrón

20

mg/dL

Patrón

40

mg/dL

Patrón

60

mg/dL

Patrón

80

mg/dL

Patrón

100

mg/dL

Patrón

120

mg/dL

Muestra

H2O 100 L 100 L 840 L 670 L 500 L 340 L 170 L 0 L

Patrón 120

mg/dL

160 L 330 L 500 L 660 L 830 L 100 L

Muestra 1 100 L

Reactivo

Bradford

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Una vez preparados los patrones, se dejó a temperatura ambiente y se midió la Absorbancia

a 595 nm frente al blanco. El color es estable 1 hora.

8.11. SDS-PAGE

La separación de proteínas se realizó por medio de electroforesis, utilizando geles de

poliacrilamida al 12.5%, tiempo de corrida 130 minutos a 100V y 43mA. La visualización

del gel se utilizó la tinción con azul de coomassie (Anexo 7).

48

Tabla 15. SDS-PAGE 12.5% para proteínas de alto peso molecular

Reactivo Concentración Volumen 4 mL Volumen 2 mL

Agua Destilada 1250 L 1040 L

Acrilamida + Bisacrilamida

Poliacrilamida 30 % 1650 L 400 L

Tris HCl pH 8.8 1,5 M 1000 L -

Tris HCl pH 6.8 1 M - 500 L

SDS 10 % 40 L 20 L

(PSA) 10% 40 L 20 L

TEMED 4 L 2 L

8.12. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO

El proyecto tendrá un Diseño Factorial Completamente al Azar (DCA), debido a que

cualquier número de tratamientos y cualquier número de réplicas pueden ser usados, en este

caso se realizaran dos replicas, ya que las unidades experimentales se mantendrán

homogéneas. Por otra parte el análisis estadístico es simple porque se espera que todos los

tratamientos tengan igual número de réplicas y se trata como un análisis balanceado.

49

9. RESULTADOS Y ANÁLISIS

9.1. Estandarización de primer’s

Para la estandarización de primer’s se utilizaron plántulas de campo de la especie Oryza

sativa – vr. Mocarí, traídas de Saldaña – Tolima (Colombia); con el fin de corroborar la

elaboración optima de los primer’s e identificar la presencia de los genes de interés sin la

formación de dímeros. Para verificar lo anterior se realizaron 6 extracciones de ADN, PCR

convencional y electroforesis en geles de agarosa (1.5%).

Para el desarrollo de la PCR convencional se realizaron los cálculos respectivos para

determinar la temperatura de anillamiento de los genes de interés; sin embargo, al

contrastarlos con los datos obtenidos de la literatura y del programa Integrated DNA

Tecnologies, se observaron diferencias significativas; por lo tanto se realizó la PCR con un

gradiente de temperatura de 57°C a 62.8°C y de esta manera definir la temperatura más

apropiada para cada juego de primer (tabla 15).

9.1.1. Gen Hsp 16.9


System Bio Rad, amplificado por PCR. Actina (Ac); 1: 57ºC; 2:57.6ºC; 3:58.2ºC; 4: 59.1ºC;

5:60.2ºC; 6:61,6ºC; 7:62.8ºC; Marcador Hyperlader IV (M). Tomado por: Autoría propia

Arce R, Martínez C (2016).

De acuerdo a los valores teóricos de temperatura se realizó la PCR con un gradiente de

temperatura de 57ºC a 62.8ºC. En la figura 19 se puede apreciar que la banda con mejor

característica está ubicada en el carril 2 y presenta una temperatura de anillamiento de 57.6

°C. La cual fue escogida para realizar la qRT-PCR.

Ac. 1 2 3 4 5 6 7 M

50

9.1.2. Gen Hsp 18

Figura 19. Visualización del gradiente de temperatura del gen Hsp 18 en Gel Doc XR System

Bio Rad, amplificado por PCR. 1: 57ºC; 2:57.6ºC; 3:58.2ºC; 4: 59.1ºC; 5:60.2ºC; 6:61,6ºC;

7:62.8ºC; Marcador Hyperlader IV (M); Actina (Ac). Tomado por: Autoría propia Arce R,

Martínez C (2016).



característica está ubicada en el carril 1, ya que aunque ninguno presenta dímeros es la que

se ve más pronunciada en comparación con las muestras de los demás carriles, en especial

las muestra 6 y 7. La muestra del carril 1 presenta una temperatura de anillamiento de 57°C.

La cual fue escogida para realizar la qRT-PCR.

9.1.3. Gen Hsp 26.7



característica está ubicada en el carril 6 ya que las demás bandas (1,2,3,4) presentan dímeros

y la 7 es muy tenue; por lo tanto la temperatura de anillamiento es de 61.6°C. La cual fue

escogida para realizar la qRT-PCR.

Para los primer’s correspondientes a Hsp 70 y Hsp 90 se utilizaron las temperaturas de

anillamiento estandarizadas por Cañate y Novoa (2013); siendo estas de 59°C.

1 2 3 4 5 6 7 M Ac. 100 pb

51


System Bio Rad, amplificado por PCR. 1: 57ºC; 2:57.6ºC; 3:58.2ºC; 4: 59.1ºC; 5:60.2ºC;

6:61,6ºC; 7:62.8ºC; Marcador Hyperlader IV (M); Actina (Ac). Tomado por: Autoría propia

Arce R, Martínez C (2016).

a) b)

Figura 21. a) Amplificación de los primer’s por PCR, visualización en Gel Doc XR System

Bio Rad. 1) gen Hsp 16.9; 2) gen Hsp 18; 3) gen Hsp 26.7; 4) Marcador Hyperladder IV; 5)

gen Hsp 70; 6) gen Hsp 90. b) Marcador de peso molecular Hyperladder IV. Tomado por:

Autoría propia Arce R, Martínez C (2016).

En la figura 21 se observa como las muestras sembradas amplificaron y se ubicaron en sus

bandas respectivas de acuerdo a su peso molecular (pb). Hsp 16.9 con un peso de 104 pb,

Hsp 18 con 106 pb, Hsp 26.7 con 105 pb, Hsp 70 con 476 pb y Hsp 90 con 459 pb. La

información anterior se resume en la tabla 16.

1 2 3 4 5 6 7 M Ac.

1 2 3 M 4 5

Dímeros

100 pb

500 pb

100 pb

52

Tabla 16. Temperatura de anillamiento y pb para los primer’s de interés

Primer

Temperatura de

anillamiento

teórica (°C)

Temperatura de

anillamiento Integrated

DNA Tecnologies (IDT)

(°C)

Temperatura de

anillamiento

experimental (°C)

Pares de

bases

(pb)

Hsp

16.9

F 60 F 63 57.6 104

R 62 R 68

Hsp 18 F 58 F 62

57 106 R 58 R 62

Hsp

26.7

F 56 F 62 61.6 105

R 54 R 62

Hsp 70 F 60 F 57

59 476 R 60 R 55.6

Hsp 90 F 62 F 53.1

59.5 459 R 60 R 54.4

9.2. Tasa de germinación

Para cada tratamiento y variedad se dispuso de 120 semillas repartidas en 3 cajas de Petri

(figura 22). En los tres tratamientos se utilizaron en total 360 semillas por cada variedad. En

la tabla 14 se muestran los porcentajes de germinación para cada genotipo; siendo la variedad

Fedearroz Irradiada la que mayor porcentaje de germinación tuvo, con un 90%, seguida de

Fedearroz 473 y Línea Avanzada 1645 con un 85.5% y 85% respectivamente. Por el

contrario, Mocarí y Mocarí Irradiada tienen la menor tasa de germinación de 2.7% y 2.5%,

obteniendo de esta manera el material vegetal preciso para el desarrollo del trabajo. Las

semillas de Mocarí y Mocarí irradiada estuvieron durante cinco años en el banco de semillas

de Saldaña – Tolima, lo que pudo afectar la calidad de la semilla si las condiciones de

almacenamiento no fueron las adecuadas. No obstante, los factores que afectan la

germinación de las semillas se dividen en internos y externos. La latencia puede ser generada

por procesos metabólicos lentos, originados por una baja humedad o alteración de la

temperatura interna necesaria para el desarrollo óptimo de los procesos fisiológicos, o por

presencia de sustancias inhibidoras en la envoltura de la semilla como compuestos fenólicos.

Para romper la latencia se recomienda realizar diferentes procesos tales como dejar las

semillas durante un tiempo considerable en agua, someterlas a temperatura de 45°C a 50°C

por cinco días o sumergirlas en ácido nítrico. Para la finalidad del trabajo las semillas se

dejaron en agua durante 2 días, y no se sometieron a tratamiento térmico ni químico ya que

de esta manera se estaría induciendo un estrés a la semilla desde su germinación.

53

a.

b.

c. d.

Figura 22. a. semillas sembradas en cajas de Petri; b. 40 semillas de cada variedad por

caja; c. brote de raíz en la semilla, d; germinación de la semilla. Tomado por: Autoría

propia Arce R, Martínez C (2016).

Tabla 17. Porcentajes de germinación de las 3 variedades

Variedad Semillas

sembradas

Semillas

germinadas

Porcentaje

Germinación (%)

F 473 360 308 85.5

F 473 i 360 324 90

Mocarí 360 10 2.7

Mocarí i 360 9 2.5

LV 1645 360 306 85

Lv 1645 i 360 80 22.2

9.3. Características fenotípicas

Se realiza un análisis de las características fenotípicas que presentaron cada una de las

variedades en los diferentes momentos de estrés en los tres tratamientos.

9.3.1. Características fenotípicas en el Tratamiento control (TC)

Las variedades de arroz Fedearroz 473, Fedearroz 473 Irradiada, Mocarí (M), Mocarí

Irradiada (MI), Línea avanzada 1645, Línea Avanzada 1645 Irradiada se mantuvieron a 28°C.

Para este tratamiento se realizaron tres extracciones E1: 11:10 am; E2: 1:10 pm y E3: 3:10

pm.

Tabla 18. Comparación del crecimiento de los genotipos F473, Mocarí, Lv 1645 control e

irradiadas, en las tres extracciones del tratamiento control.

Extracción F473 F473i Mocarí Mocarí

irradiada Lv 1645

Lv 1645

irradiada

E1

Hoja cm 13 12 11.5 15 13.25 14

Tallo cm 6.5 5.75 5 6 6.25 4

Raíz cm 7 4.75 7.5 7 7.5 8

E2 Hoja cm 12.6 13 15 14 14.5 14

Tallo cm 6 5.5 6 6 6 4

54

Raíz cm 6 5 7 5 7 7

E3

Hoja cm 12.5 13.5 13 14 12.5 13

Tallo cm 5.5 5 6 6 7 5

Raíz cm 7.5 5 6.7 6 7 6.5

En el momento de extracción de ARN durante el tratamiento control se midió la longitud de

cada una de las plantas a usar, se tomaron datos como la longitud de la hoja bandera, el tallo,

y la raíz (tabla 18). No se presentaron diferencias significativas en cuanto a la altura de la

planta entre las variedades en cada momento de extracción, aun así, Mocarí y Lv1645

irradiadas y control fueron más altas que F473 irradiada y control con una diferencia entre 1

y 2 cm puesto que esta última es una variedad que se caracteriza por presentar porte bajo.

Tabla 19. Registro fotográfico de las tres variedades durante el tratamiento control.

Tomado por: Autoría propia Arce R, Martínez C (2016).

Variedad E1 E2 E3

F 473

Figura 23

Figura 24

Figura 25

F 473

irradiad

a

Figura 26

Figura 27

Figura 28

55

Mocarí

Figura 29

Figura 30

Figura 31

Mocarí

irradiad

a

Figura 32

Figura 33

Figura 34

LV1645

Figura 35

Figura 36

Figura 37

56

LV1645

irrariada

Figura 38

Figura 39

Figura 40

En el TC a 28°C durante las tres extracciones (tabla 19), no se observaron alteraciones

relevantes a nivel morfológico, debido a que esta temperatura es la apropiada para el

crecimiento normal de la planta y por lo tanto no se encuentra bajo estrés térmico. Las

características como el color de la hoja y el tamaño de la planta no tuvieron cambios

significativos durante el tiempo en el que se realizaron las extracciones. Como consecuencia

de la radiación emitida se generaron procesos de mutación en la coloración de la hoja en las

variedades irradiadas de Mocarí y Lv 1645. Mocarí irradiada durante todo el proceso de

crecimiento presento despigmentación a lo largo de la lámina de la hoja lo que se conoce

como maculata (figura 33) y Línea avanzada 1645 irradiada (figura 39) presenta

despigmentación en las puntas de las hojas, y líneas blancas longitudinales conocido como

estriata[22]. Según estudios de La Federación Nacional de Arroceros (FEDEARROZ), en su

boletín 489[36], se refiere a Fedearroz 473 y Mocarí como plantas termo tolerante y termo

resistente respectivamente y Lv 1645 como susceptible a altas temperaturas en zonas costeras

del país, donde la temperatura es demasiado alta. Por otro lado, en las pruebas de germinación

y crecimiento realizadas en el laboratorio a condiciones normales de temperatura (28°C) y

humedad (70%) Lv 1645 sin irradiar presento mejores características que Fedearroz 473 y

Mocarí; debido a su porte, hoja vigorosa, tallo grueso y raíces fuertes, lo que permitió

escogerla como biotipo para realizar las curvas estándar de la qRT-PCR. Es importante

aclarar que en el T1 y T2 no se tomaron en cuenta plantas de cada variedad sin irradiar, puesto

que la finalidad del trabajo es mirar la expresión de los genes que codifican dichas proteínas

en plantas que han sido expuestas a radiación con 60Co.

9.3.2. Características fenotípicas en el Tratamiento 1 (T1)

Las plántulas de arroz Fedearroz 473 Irradiada, Mocarí Irradiada y Línea Avanzada 1645

Irradiada, fueron sometidas a estrés a 35°C de 11:00 am a 3:10 pm. Para este tratamiento se

realizaron tres extracciones E1: 11:10 am; E2: 1:10 pm y E3: 3:10 pm.

57



Variedad E1 E2 E3

F 473

irradiada

Figura 41

Figura 42

Figura 43

Mocarí

irradiada

Figura 44

Figura 45

Figura 46

LV1645

irrariada

Figura 47

Figura 48

Figura 49

Durante el T1 (35°C) (tabla 20) en la E1 no se presentaron grandes cambios a nivel

morfológico en cada una de las plantas (Figura 41,44,47); transcurridas dos horas de estrés

en la E2 del mismo tratamiento se observaron pequeños cambios en cada una de las

variedades. En F473 (figura 42) algunas de las hojas laterales comienzan a quemarse como

mecanismo de defensa para proteger la hoja bandera; en Mocarí (figura 45) las hojas

presentaron necrosis apical, deshidratación tomando una apariencia seca y a doblarse debido

al aumento de temperatura y Lv 1645 (figura 48) presento necrosis apical en mayor

proporción que Mocarí. Transcurridas cuatro horas del estrés, en la E3 las plantas de cada

una de las variedades conservaron las características que presentaron durante la E2.

58

9.3.3. Características fenotípicas en el Tratamiento 2 (T2)

Las plántulas de arroz Fedearroz 473 Irradiada, Mocarí Irradiada y Línea Avanzada Irradiada

fueron sometidas a estrés a 42°C de 11:00 am a 3:10 pm. Para este tratamiento se realizaron

tres extracciones E1: 11:10 am; E2: 1:10 pm y E3: 3:10 pm.



Variedad E1 E2 E3

F 473i

Figura 50

Figura 51

Figura 52

Mocarí

irradiada

Figura 53

Figura 54

Figura 55

LV1645

irrariada

Figura 56

Figura 57

Figura 58

59

En el T2 (42°C) (tabla 21) en la E1 no se observan cambios morfológicos considerables en

F473 y Lv 1645 (Figura 50, 56), en cambio en Mocarí las hojas laterales se doblan y algunas

toman una coloración naranja en la punta de la hoja, esto puede ser debido a una deficiencia

de magnesio [19] porque aumenta el ángulo que forman la vaina y la lámina foliar. En la E2 la

variedad F473 (figura 51) evidencio necrosis apical en comparación con la E2 del T1, junto

a ello las hojas laterales se comienzan a quemar como mecanismo de protección de la hoja

bandera en mayor cantidad en relación con el T1; las hojas de Mocarí presentan una

deshidratación significativa al punto de necrosis foliar (figura 54) y Lv 1645 presenta

necrosis apical en mayor cantidad que el T1, y manchas en las hojas producto de la

temperatura. Al finalizar el tratamiento, es decir transcurridas cuatro horas de estrés (E3) no

varía de manera relevante las condiciones de cada una de las variedades de estudio.

9.3.4. Crecimiento de las tres variedades en los tratamientos

En la tabla 22, se presenta el crecimiento de los genotipos F473, Mocarí y Lv 1645 irradiadas

en las tres extracciones de los TC, T1 y T2. Para cada caso se midió la longitud de la hoja, el

tallo y la raíz.

Tabla 22. Comparación del crecimiento de los genotipos F473, M, Lv 1645 irradiadas, en

las tres extracciones del tratamiento TC, T1, T2.

Extracción F473 irradiada Mocarí irradiada LV 1645 irradiada

TC T1 T2 TC T1 T2 TC T1 T2

E1

Hoja cm 12 12.5 12 12,7 13 12,7 13,4 14 14

Tallo cm 5.75 6.5 5.75 6 6.2 6 4 6 4

Raíz cm 4.75 4.5 4.75 7 4 7 8 5 8

E2

Hoja cm 13 11.5 13 14 12.5 14 14 14 13.6

Tallo cm 5.5 5.7 5.5 6 6.8 6 4 6.5 4

Raíz cm 5 4 5 5 4.5 5 7 6.4 7

E3

Hoja cm 12,8 13.2 13.5 14 13,7 14 13 13 13

Tallo cm 5 6.2 5 6 7 6 5 6 5

Raíz cm 5 3.8 5 6 4.7 6 6.5 4.8 6.5

Se realizaron mediciones de la longitud de la hoja, ya que esta era el órgano vegetativo del

cual se extraería el ARN para el trabajo, por lo tanto se pretendía mirar si durante el tiempo

de estrés las plantas podían presentar variaciones en su tamaño. De acuerdo a la gráfica 1, se

puede observar que no hay diferencias relevantes entre el tamaño de las hojas, estas están en

un rango de 12 a 14 cm de largo, lo que permite inferir que el tiempo de estrés (4 horas) al

que fueron sometidas las plantas no influyo en el tamaño de las mismas. Además se corrobora

que Fedearroz es una planta de porte bajo en comparación con Mocarí y Lv 1645, durante

todos los tratamientos es la que menor tamaño presenta siendo este entre 11.5 y 13.2 cm;

Mocarí y Lv1645 oscilan entre 12.7 y 14 cm, cerca de 2 cm por encima del tamaño de F473

60

Gráfica 1. Comparación del crecimiento foliar de F473, Mocarí y Lv 1645 en los tres

tratamientos.

9.4. Extracción ARN

Las extracciones de ARN con replica se realizaron de acuerdo a la metodología planteada,

siendo tres extracciones para cada variedad por tratamiento. Las muestras de ARN se

cuantificaron en el espectrofotómetro NANODROP 2000/2000c thermo scientific (Anexo 8)

con el fin de escoger las extracciones de mejor calidad que serían utilizadas para la curva

estándar y muestras problema para la qRT-PCR. Para determinar las muestras de mejor

calidad, se tuvieron en cuenta parámetros como la relación 260/280 que evalúa la

contaminación por proteínas y la relación 260/230 que evalúa la contaminación por sales y

otros interferentes. Para que una muestra de ARN se considere pura la relación 260/280 debe

esta estar entre 2.0 y 2.2; y la relación 260/230 debe ser mayor a 1.5. Las muestra problemas

fueron normalizadas a 100ng/µL, con la finalidad de observar si en la misma cantidad de

ARN había o no diferencias en la expresión de cada uno de los genes.

Gráfica 2. Cuantificación de una muestra de

ARN de Lv 1645

61

9.5. Curva melting

Aunque el SBYR Green es uno de los reporteros fluorescentes más utilizados, debido a su

bajo costo, la principal desventaja es que puede unirse a cualquier molécula de ADN de doble

cadena, incluyendo dímeros de primer´s [75]. Por tal razón, se realizó una qRT-PCR por gen,

para verificar que los primer´s escogidos amplificaran el gen diana sin la formación de

dímeros, lo cual puede observarse mediante la curva melting (gráfica 3). Cada uno de los

genes de estudio Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7, Hsp70, Hsp90, presentaron un solo pico lo que

indica que solo está amplificando una región, correspondiente al gen de interés para cada

caso.

a.

b.

c.

d.

e.

Gráfica 3. Curva melting. a) Hsp90; b) Hsp70; c) Hsp26.7; d) Hsp18; e) Hsp16.9.

62

Cada uno de los genes estudiados presentan una temperatura melting diferente, para Hsp16,9

es de 80C, Hsp18 87C, Hsp26,7 84,5C, Hsp70 83C, Hsp90 de 80C.

9.6. Cuantificación absoluta

Se realizó una qPCR-RT con las muestras de las tres variedades en los tres tratamientos por

cada gen. Se hizo una cuantificación absoluta para cada uno de los genes, lo que permitió

evaluar la expresión de los genes de estudio.

9.6.1. Gen HSP90

a.

b.

Gráfica 4. a. curva de amplificación estándar de Hsp90; b. curva estándar de Hsp90

63

En la Gráfica 4a se presenta la amplificacion del gen en la muestra utilizada; se puede apreciar

que el ciclo umbral (Ct) es inversamente proporcional a la concentracion de ARN. Por lo

tanto la muestra de mayor concentracion necesitara menor cantidad de ciclos que una muestra

de menor concentracion de ARN. En la Gráfica 4b se representa la curva estandar realizada

a partir de las diluciones, con nueve puntos, presentando un buen coeficiente de correlacion

de 0.995, lo que brinda una confiabilidad al momento de colocar las muestras problemas.

Se realizo una curva estandar tomando como patron una muestra de ARN de Lv 1645 con

una concentracion inicial de 260 ng/µL, se realizaron 9 diluciones en serie con un factor de

dos.

9.6.1.1. Expresion de Hsp90 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades

F473, Mocarí, Lv1645.

a.

b.


F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar

64

Tabla 23. Concentración de Hsp90 en estándar y muestras problema en la E1.

TRATAMIENTO VARIEDAD SQ Ct

Estándar

Estándar 1 260,0 24,49

Estándar 2 130,0 25,44

Estándar 3 65,0 27,01

Estándar 4 32,5 28,71

Estándar 5 16,3 29,63

Estándar 6 8,1 31,15




TC

F473 112,7 25,88

M 101,6 26,1

LV1645 208,9 24,56

T1

F473 202,3 24,63

M 214,3 24,51

LV1645 239,3 24,27

T2

F473 150,3 25,27

M 145,5 25,33

LV1645 208,4 24,57

Se realizó una extracción de ARN (E1), a los 10 minutos del estrés por alta temperatura en

cada una de las variedades, en los tres tratamientos (TC, T1 y T2) las cuantificaciones

obtenidas para el estándar y las muestras problema se presentan en la tabla 23.

En la Gráfica 5a. se presenta la curva estándar con nueve muestras, partiendo de una

concentración conocida y 8 diluciones, con un coeficiente de correlación de 0.996 lo que

indica una buena relación entre la curva estándar para determinar la concentración de las

muestras problema. Como se puede observar en la Gráfica 5b, el estándar 1, es detectado a

partir de 24,49 ciclos, siendo esta la de mayor concentración y el estándar 9 es detectado a

partir de 36,35 ciclos siendo la de menor concentración. Con respecto a las muestras

problemas en el TC (28 °C), la variedad que presenta mayor expresión del gen que codifica

la proteína Hsp90 es Lv1645 con un SQ de 208,9 con un Ct de 24,56, seguido de F473 y

Mocarí con un SQ de 112,7 (Ct de 25,88) y 101,06 (Ct de 26,1) respectivamente, ubicándose

dentro de la curva estándar.

En el T1 (35 °C), se observa una sobre expresión de este gen en cada una de las variedades,

las muestras problema salen de la curva estándar, por lo que requieren de menor cantidad de

ciclos para ser detectados. Al igual que en el tratamiento control TC el tratamiento 1 Lv 1645

es la variedad que presenta mayor expresión con un SQ de 239,3 (Ct24,27) seguido de Mocarí

y F473 con un SQ cada uno de 214,3 (Ct 24,51) y 202,3 (Ct 24,63).Por ultimo en el

65

tratamiento 2 (T2), en comparación con el tratamiento control (TC) y el Tratamiento 1 (T1),

la expresión de este gen transcurridos 10 minutos del estrés disminuye, sin alcanzar al

tratamiento control; es decir F473 en el T2 en la primera extracción disminuye su expresión

(SQ de 150,3 y Ct 25,27) con respecto al T1 pero es superior al TC, Mocarí (M) disminuye

su expresión en el T2 pero es mayor en comparación al TC (SQ de 145,5 y Ct de 25,33) y en

el caso de LV1645 el SQ disminuye en el T2 llegando a la similitud, mas no a la igualdad del

TC (SQ de 208,4 y Ct de 24,57).



a.

b.


F473, Mocarí, Lv1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar.

66

Se realizó una segunda extracción de ARN (E2), a 130 minutos del estrés por alta temperatura

en cada una de las variedades, en los tres tratamientos (TC, T1 y T2), las cuantificaciones

obtenidas para el estándar y las muestras problema se presentan en la tabla 24. En la Gráfica

6a. se presenta la curva estándar con nueve muestras, partiendo de una concentración

conocida y 8 diluciones, con un coeficiente de correlación de 0.996 lo que indica una buena

relación entre la curva estándar para determinar la concentración de las muestras problema.

Tabla 24.Concentración de Hsp90 en estándar y muestras problema en la E2.

Como se puede observar en la Figura 6b, el estándar 1, es detectado a partir de 24,49 ciclos,

siendo esta la de mayor concentración y el estándar 9 es detectado a partir de 36,35 ciclos

siendo la de menor concentración. Con respecto a las muestras problemas en el TC (28 °C),

la variedad que presenta mayor expresión del gen que codifica la proteína Hsp90 es Mocarí

con un SQ de 153,5 con un Ct de 25,22 seguido de F473 y Lv 1645 con un SQ de 150,7 (Ct

de 25,26) y 53,8 (27,46) respectivamente, ubicándose dentro de la curva estándar. En el T1

(35 °C), se observa una sobre expresión de este gen en las muestras de F 473, se presente una

disminución en la expresión en la variedad Mocarí, y Lv 1645 mantiene constantes los niveles

de expresión al compararlos con el TC. A diferencia del Tratamiento control (TC) las

variedades F473 y Lv 1645 aumentaron su expresión con un SQ de 325,1 (Ct de 23,62) y

60,8 (Ct de 27,2) respectivamente, la variedad Mocarí por el contrario disminuyo su

expresión en este tratamiento significativamente con un SQ de 135,5 a 56,2.


Estándar

Estándar 1 260,0 24,49

Estándar 2 130,0 25,44

Estándar 3 65,0 27,01

Estándar 4 32,5 28,71

Estándar 5 16,3 29,63





TC

F473 150,7 25,26

M 153,5 25,22

LV1645 53,8 27,46

T1

F473 325,1 23,62

M 56,2 27,36

LV1645 60,8 27,2

T2

F473 217,8 24,47

M 34,5 28,41

LV1645 14,6 30,25

67

Por ultimo en el tratamiento 2 (T2), en comparación con el tratamiento control (TC) y el

tratamiento control (T1), la expresión de este gen transcurridos 130 minutos del estrés

disminuye, es decir F473 en el T2 en la segunda extracción disminuye su expresión (SQ de

217,8 y Ct 24,47) con respecto al T1 pero es superior al TC, Mocarí (M) disminuye su

expresión en el T2 es menor que en el TC (SQ de 34,5 y Ct de 28,41) y en el caso de LV1645

el SQ disminuye en el T2 significativamente su expresión con un SQ de 14,6 con Ct 30,25.

9.6.1.3 Expresion de Hsp90 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades


a.

b.



68

Se realizó una tercera extracción de ARN (E3), a 250 minutos del estrés por alta temperatura

en cada una de las variedades, en los tres tratamientos (TC, T1 y T2), las cuantificaciones








la variedad que presenta mayor expresión del gen que codifica la proteína Hsp90 es Mocarí

con un SQ de 211,3 con un Ct de 24,53 seguido de Lv 1645 y F473 con un SQ de 147,9 (Ct

de 24,53) y 48,1 (Ct de 27,7) respectivamente, ubicándose dentro de la curva estándar. En el

T1 (35 °C), se observa una sobre expresión de este gen en las muestras de F 473 y Mocarí

mientras existe una disminución en la expresión en la variedad Lv 1645, las muestras están

dentro de la curva estándar. A diferencia del Tratamiento control (TC) las variedades F473 y

Mocarí aumentaron su expresión con un SQ de 211,3 (Ct de 24,53) y 207,5 (Ct de 24,57)

respectivamente; la variedad Lv 1645 por el contrario disminuyo su expresión en este

tratamiento significativamente con un SQ de 81,7 con un Ct de 26,57.

Tabla 25. Concentración de Hsp90 en estándar y muestras problema en la E3.


Estándar

Estándar 1 260,0 24,49

Estándar 2 130,0 25,44

Estándar 3 65,0 27,01

Estándar 4 32,5 28,71

Estándar 5 16,3 29,63





TC

F473 48,1 27,7

M 211,3 24,53

LV1645 147,9 25,3

T1

F473 211,3 24,53

M 207,5 24,57

LV1645 81,7 26,57

T2

F473 201,4 24,64

M 91,0 26,33

LV1645 175,4 24,93

69

Por ultimo en el tratamiento 2 (T2), en comparación con el tratamiento control (TC) y el

tratamiento 1 (T1), la expresión de este gen transcurridos 250 minutos del estrés disminuye,

es decir F473 en el T2 en la tercera extracción disminuye su expresión (SQ de 201,4 con un

Ct de 24,64) con respecto al T1 pero es superior al TC, Mocarí (M) disminuye su expresión

en el T2 (SQ 91,0 con Ct de 26,33) pero mayor que TC y en el caso de LV1645 el SQ

aumenta en el T2 con relación a TC y T1 con una expresión de SQ de 175,4 y Ct de 24,93.

9.6.1.4. Relación de la expresión de Hsp90 en las tres extracciones, en cada tratamiento

en las tres variedades


El gen Hsp90 se encuentra ubicado en el cromosoma 6 y codifica para proteína de choque

térmico denominadas “chaperonas moleculares” ya que se une a proteínas desnaturalizadas

para prevenir su mal plegamiento o agregación [52], desempeña funciones cruciales en la

señalización celular, el control del ciclo celular y en el mantenimiento de la integridad del

proteoma y la homeostasis de las proteínas. En las plantas, Hsp90s son necesarios para el

crecimiento normal de la planta y el desarrollo [47]. En plantas existen siete tipos de proteínas

de Hsp90, cuatro ubicadas en el citosol, una en el retículo endoplasma tico, una en la

mitocondria y una en los cloroplastos. Es una proteína dependiente de ATP y actúa en

conjunto con otras chaperonas. Estudios demuestran que este tipo de proteínas suelen actuar

en las últimas etapas de plegado del sustrato [51] y su producción incrementa bajo diferentes

tipos de estrés, entre ellos el estrés por altas temperaturas..

En la gráfica 8 se presenta una relación de la expresión del gen que codifica la proteína Hsp90

en las tres variedades en los tres tratamientos.

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

300,0

350,0

FTC FT1 FT2 MTC MT1 MT2 LVTC LVT1 LVT2

SQ

Fedearroz 473 Mocari Linea avanzada

Expresion HSP90 de las variedades en los tres tratamientos

E1

E2

E3

70

A los 10 minutos de estrés térmico la variedad F473 presenta un incremento a 35°C con

respecto al tratamiento control pero su producción disminuye a los 42°C. Por otro lado se

observa que al aumentar el tiempo de exposición de esta variedad al estrés térmico por 130

minutos la expresión del gen aumenta de manera considerable en cada uno de los

tratamientos, presentándose el valor más alto a 35°C con un SQ de 335; en los tres

tratamientos al aumentar el tiempo hasta 250 minutos la expresión del gen disminuye, en el

tratamiento control el valor disminuye por debajo de la E1, pero a 35 y 42°C los valores son

cercanos a la E1 del mismo tratamiento.

La variedad Mocarí a diferencia de F473 no presenta el mismo patrón en los tres tratamientos.

Como se observa en la gráfica 8, los niveles de expresión a 28°C aumenta de manera

proporcional, es decir hay un aumento de 50 copias entre la E1, E2 y E3. Al someter esta

variedad a una temperatura de 35°C, los niveles de expresión a los 10 minutos aumentan por

encima de 200 copias en comparación con la E1 del TC, sin embargo el nivel de expresión a

los 250 minutos disminuye por debajo del valor control y vuelve a aumentar al incrementar

el tiempo de exposición al estrés térmico alcanzando los niveles de expresión a los 10 minutos

del tratamiento 1. En el tratamiento 2 (42°C) se presenta el mismo patrón que en el

tratamiento 1 pero con valores inferiores, incluso los niveles de expresión de la E2 y E3 son

los más bajos para este gen en la variedad Mocarí.

La variedad Lv 1645 tiene un patrón similar en los tres tratamientos, ya que el nivel de

expresión de este gen a los 10 minutos de estrés es el más alto en los tres tratamientos, siendo

muy similares en el TC y T2, y aumentando de manera mínima en el T1; los valores

expresados a los 130 minutos son los más bajos, mostrando valores similares entre el TC y

el T1 y el más bajo se ubica en el T2; por último la cantidad de copias en la extracción 3 se

ubica por encima de la E2 pero por debajo de la E1. De acuerdo a la gráfica 8 no se observa

una diferencia considerable entre la expresión de este gen en las diferentes temperaturas de

estrés.

La variedad que mayor niveles de expresión presenta en los tres tratamientos es F473, en

Mocarí y Lv 1645 no hay una diferencia marcada entre los tres tratamientos. Estudios

realizados de este gen en Oryza sativa variedad Nipponbare por Liu et al., cuando la planta

se somete a estrés a 37°C durante dos horas de exposición no hay niveles significativos en

la expresión de Hsp90 en hoja, no obstante, al incrementar la temperatura hasta 42 y 50°C

los niveles de expresión aumentaron significativamente [91]. En el 2012 en la investigación

realizada por Chandel [10] en seis variedades de arroz a 37, 42 y 48°C, se evidencia que los

niveles de expresión más altos se generan a 37°C, pero no sobrepasan de manera significativa

los valores presentados en las otras temperaturas; en cinco de seis variedades los niveles de

Hsp90 disminuyen a los 42 y 48°C. En estudios realizados por Cañate y Novoa [3] en las

variedades F473, Mocarí y Lv 1645 a 28, 35 y 42°C pero con diferentes tiempos de estrés,

se encuentra que las plántulas al estar sometidas a un tiempo de cinco días al estrés térmico

generan un incremento en la expresión de este gen a 42°C. De acuerdo a esto se esperaría

que al aumentar la temperatura los niveles de expresión de este gen aumenten en los

71

diferentes momentos de estrés en cada variedad, no obstante la única variedad en la que se

genera es en F473 a los 130 minutos de estrés a 35°C, como ocurre en el estudio de Chandel.

9.6.2. Gen Hsp70

a.

b.

Gráfica 9. a. curva de amplificación estándar de Hsp70;

b. curva estándar de Hsp70.

En la Grafia 9a se presenta la amplificacion del gen en la muestra utilizada; se puede apreciar

que el ciclo umbral (Ct) es inversamente proporcional a la concentracion de ARN. Por lo

tanto la muestra de mayor concentracion necesitara menor cantidad de ciclos que una muestra

72

de menor concentracion de ARN. En la Gráfica 9b se representa la curva estandar realizada

a partir de las diluciones, con nueve puntos, presentando un buen coeficiente de correlacion

de 0.996, lo que brinda una confialidad al momento de colocar las muestras problemas.



a.

b.



73










la variedad que presenta mayor expresión del gen que codifica la proteína Hsp70 es Lv1645

con un SQ de 146,2 con un Ct de 22,32 seguido de F473 y Mocarí con un SQ de 143,9 (Ct

de 22,35) y 112,2 (Ct de 22,75) respectivamente, ubicándose dentro de la curva estándar.

En el T1 (35 °C), se observa una sobre expresión de este gen en cada una de las variedades,

las muestras problema salen de la curva estándar debido a la sobreexpresión, por lo que

requieren de menor cantidad de ciclos para ser detectados. A diferencia del tratamiento

control TC en el tratamiento 1 F473 es la variedad que presenta mayor expresión con un SQ

de 426.6 (Ct 20,06) seguido de Mocarí y Lv 1645 con un SQ de 388,2 (Ct 20,75) y 233,9 (Ct

21,57) respectivamente. Por ultimo en el tratamiento 2 (T2), en comparación con el

tratamiento control (TC) y el Tratamiento 1 (T1), la expresión de este gen disminuye, sin

alcanzar los valores del tratamiento control; es decir F473 en el T2 en la primera extracción

disminuye su expresión con un SQ de 274,8 y Ct 21,31 con respecto al T1 pero es superior

al valor del TC, Mocarí (M) disminuye su expresión en el T2 pero es mayor en comparación

al TC (SQ de 145,5 y Ct de 25,33) y en el caso de LV1645 el SQ disminuye en el T2

obteniendo un valor cercano al del TC (SQ de 208,4 y Ct de 24,57).



a.

74

b.











siendo la de menor concentración.

Con respecto a las muestras problemas en el TC (28 °C), la variedad que presenta mayor

expresión del gen que codifica la proteína Hsp70 es F473 con un SQ de 158,9 con un Ct de

22,19 seguido de Mocarí y Lv 1645 con un SQ de 144,5 (Ct de 22,34) y 36,6 (Ct de 24,55)

respectivamente, ubicándose dentro de la curva estándar. En el T1 (35 °C), se observa una

sobre expresión de este gen en cada una de las variedades, exceptuando la variedad Mocarí,

las muestras problema están dentro de la curva estándar y algunas salen debido a la

sobreexpresión, por lo que requieren de menor cantidad de ciclos para ser detectados.

Al igual que en el tratamiento control TC en el tratamiento 1 F473 es la variedad que presenta

mayor expresión con un SQ de 479,7 (Ct 20,41) seguido de Mocarí que disminuye su

expresión SQ de 116,7 (Ct 22,68) y Lv 1645 con un 57,4 (Ct 2,83) respectivamente. Por

último en el tratamiento 2 (T2), en comparación con el tratamiento control (TC) y el

Tratamiento 1 (T1), la expresión de este gen disminuye exceptuando la variedad Mocarí que

aumenta su expresión con un SQ de 302,7 y un Ct de 21,15 por lo que se expresa más en este

tratamiento que en TC y T1; por otra parte la variedad F473 es la variedad con mayor

75

expresión con un SQ de 368,1 y un Ct 20,83 sobrepasando el valor del TC y T1; por otra

parte la variedad Lv 1645 aumenta su expresión en el T2 con un SQ de 104,7 y Ct de 22,86.

Tabla 26. Concentración de Hsp70 en estándar y muestras problema en la E1


Estándar

Estándar 1 260.0 21.76

Estándar 2 130.0 22.29

Estándar 3 65.0 23.68

Estándar 4 32.5 24.52

Estándar 5 16.3 25.66

Estándar 6 8.1 26.8




Estándar 10 0.5 31,37

TC

F473 143.9 22,35

M 112.2 22,75

LV1645 146.2 22,32

T1

F473 426.6 20,06

M 388.2 20,75

LV1645 233.9 21,57

T2

F473 274.8 21,31

M 338.8 20,97

LV1645 193.6 21,87

9.6.1.3 Expresion de Hsp70 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades F473,

Mocarí, Lv1645.

a.

76

b.





obtenidas para el estándar y las muestras problema se presentan en la tabla 28.

En la Gráfica 12a. se presenta la curva estándar con nueve muestras, partiendo de una

concentración conocida y 10 diluciones, con un coeficiente de correlación de 0.996 lo que

indica una buena relación entre la curva estándar para determinar la concentración de las

muestras problema. Como se puede observar en la Figura 12b, el estándar 1, es detectado a

partir de 21,76 ciclos, siendo esta la de mayor concentración y el estándar 9 es detectado a

partir de 31,37 ciclos siendo la de menor concentración.

Con respecto a las muestras problemas en el TC (28 °C), la variedad que presenta mayor

expresión del gen que codifica la proteína Hsp70 es Mocarí con un SQ de 245,5 con un Ct

de 21,49 seguido de Lv 1645 y F473 con un SQ de 187,5 (Ct de 21,92) y 41,6 (Ct de 24,35)

respectivamente, ubicándose dentro de la curva estándar. Al igual que en el tratamiento

control TC en el tratamiento 1 Mocarí es la variedad que presenta mayor expresión con un

SQ de 426,6 (Ct 20,6) seguido de F473 y Lv 1645 con un SQ cada uno de 357,3 (Ct 20,88)

y 202,3 (Ct 23,1). Para F473 y Mocarí los valores presentan sobreexpresión por lo cual salen

de la curva estándar. Por ultimo en el tratamiento 2 (T2), en comparación con el tratamiento

control (TC) y el Tratamiento 1 (T1), la expresión de este gen transcurridos 250 minutos del

estrés disminuye en las variedades F473 y Mocarí pero en Lv 1645 aumenta; aun asi, la

variedad Mocarí es la que mayor valor obtiene en el T2 con un SQ de 323,6 y Ct 21,4, pero

con relación al T1 disminuye su expresión, la variedad F473 obtiene un SQ de 292,4 con un

Ct de 21,1 y relacionándolo con el T1 se conserva una disminución en la expresión del gen

entre los dos tratamientos, y Lv 1645 un SQ de 220,3 con un Ct de 21,66.

77





0,0

100,0

200,0

300,0

400,0

500,0

600,0


SQ


Expresión HSP70 de las variedades en los tres tratamientos

E1

E2

E3


Estándar

Estándar 1 260.0 21.76

Estándar 2 130.0 22.29

Estándar 3 65.0 23.68

Estándar 4 32.5 24.52

Estándar 5 16.3 25.66





Estándar 10 0.5 31.37

TC

F473 41.6 24,35

M 245.5 21,49

LV1645 187.5 21,92

T1

F473 357.3 20,88

M 426.6 20,6

LV1645 90.4 23,1

T2

F473 292.4 21,2

M 323.6 21,4

LV1645 220.3 21,66

78

La familia Hsp70 es una de las familias más amplias, en arroz cuenta con 32 genes que

codifican proteínas de esta familia. Estos pueden encontrarse en todos los cromosomas,

excepto el 4, 7 y 10, localizándose en compartimiento como el núcleo, citoplasma,

cloroplasto, mitocondria y retículo endoplasmático [41]. El gen Hsp70 que se escogió para el

estudio se encuentra ubicado en el cromosoma 1 y al igual que el gen Hsp90, codifica para

proteínas de choque térmico denominadas “chaperonas moleculares”. En animales es la

chaperona de mayor abundancia. Es una proteína dependiente de ATP y en asociación con

diversos cofactores realiza diversas funciones, incluyendo plegamiento de proteínas,

translocación a través de membranas de orgánulos y desagregación de agregados [52].

En la gráfica 13 se presenta una relación de la expresión del gen que codifica la proteína

Hsp70 en las tres variedades en cada uno de los tratamientos. La variedad F473 en el

tratamiento control a los 10 y 130 minutos de estrés presenta niveles similares de expresión

con un valor cercano a 160 copias, su expresión se ve disminuida a los 250 minutos de

exposición. En los T1 y T2 los niveles de expresión en los tres momentos de extracción

aumentan considerablemente frente al TC; esta variedad presenta la mayor expresión de este

gen a los 130 minutos de estrés a 35°C.

En la variedad Mocarí en el tratamiento control se presenta un incremento gradual entre las

tres extracciones, siendo la más alta la extracción 3 con un SQ de 250 copias. A 35°C los

niveles más altos se sitúan a los 10 y 250 minutos, presentando el valor más bajo en la E2 de

dicho tratamiento, incluso alcanza el valor de la expresión E1 del TC; a 42°C esta variedad

presenta un SQ promedio de 315 copias en los tres momentos de exposición a estrés térmico,

esta variedad no presenta un patrón en la expresión de este gen como si lo presenta F473 y

Lv1645.En comparación con F473 y Mocarí, Lv1645 es la variedad que presenta los niveles

más bajos de expresión. En esta variedad la expresión a los 10 y 250 minutos son las más

altas en los tres tratamientos y la expresión a los 130 minutos es la más baja; a pesar de que

si hay un aumento a los 35 y 42°C con respecto al tratamiento control no es un valor relevante.

En un estudio realizado por Zhang (2009) [92] en Hevea brasiliensis, se sometieron plantas a

8, 25 y 42°C, al realizar el análisis de la PCR-RT se encontró que los niveles de expresión de

Hsp70 aumentaron considerablemente a la hora del estrés a 42°C, mientras que a 25°C se

mantuvo constante la expresión de dicho gen. Lo que indica que a temperaturas altas como

42°C este gen se expresa en esta especie; sin embargo en plántulas de arroz la expresión más

alta se originó en el tratamiento 1, es decir a 35°C, difiriendo del tiempo dependiendo de la

variedad. Al igual que en la variedad Hevea brasiliensis los valores más bajos se presentan

en el tratamiento control (28°C), por lo cual la planta a esta temperatura no se encuentra bajo

estrés térmico. En el trabajo realizado por Cañate y Novoa [3] en las mismas variedades, se

encuentra que la mayor expresión de este gen se genera en el tratamiento 2 (42°C), aun así

no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos en cada una de las

variedades, en contraste con el trabajo realizado se encuentran diferencias en los patrones de

expresión ya que las plántulas de este estudio fueron sometidas a radiación con 60Co.

79

9.6.2. Gen HSP26.7

a.

b.

Gráfica 14. a. curva de amplificación estándar de Hsp70;b. curva estándar de Hsp70

Se realizo una curva estandar tomando como patron una muestra de ARN de Lv1645 con una

concentracion inicial de 260 ng/µL, se realizaron 10 diluciones en serie con un factor de dos.

En la Grafia 14a se presenta la amplificacion del gen en la muestra utilizada; se puede

apreciar que el cicloumbral (Ct) es inversamente proporcional a la concentracion de ARN.

Por lo tanto la muestra de mayor concentracion necesitara menor cantidad de ciclos que una

muestra de menor concentracion de ARN. con nueve puntos, presentando un buen coeficiente

de correlacion de 0.996, lo que brinda una confialidad al momento de colocar las muestras

problemas.

80

En la gráfica 14b se representa la curva estandar realizada a partir de las diluciones con nueve

puntos, presentando un buen coeficiente de correlación de 0.996, lo que brinda una

confiablidad al momento de colocar las muestras problemas.

9.6.1.1. Expresion de Hsp26,7 en la E1 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades


a.

b.



81


cada una de las variedades, las cuantificaciones obtenidas para el estándar y las muestras

problema se presentan en la tabla 29. En la gráfica 15a se presenta la curva estándar con

ocho muestras de concentración conocida, con un coeficiente de correlación de 0.986 lo que

indica una buena relación para determinar la concentración de las muestras problema. Como

se puede observar en la gráfica 15b, el estándar 1, es detectado a partir de 24.05 ciclos,

siendo esta la de mayor concentración y el estándar 8 es detectado a partir de 31.18 ciclos

siendo la de menor concentración.

Tabla 28. Concentración de Hsp26.7 en estándar y muestras problema en la E1


Estándar

Estándar 1 260.0 24.05

Estándar 2 130.0 24.5

Estándar 3 65.0 25.46

Estándar 4 32.5 26.83

Estándar 5 16.3 27.54




TC

F473 180 24.1

M 153 24.38

LV1645 85 25.31

T1

F473 508 22.45

M 753 21.81

LV1645 278 23.42

T2

F473 839 21.64

M 923 21.49

LV1645 445 22.66

Con respecto a las muestras problemas en el TC (28°C), la variedad que presenta mayor

expresión del gen que codifica la proteína Hsp26.7 es F473 con un SQ de 180 con un Ct de

24.1, seguido de Mocarí y Lv1645 con un SQ de 153 y 85 respectivamente, ubicándose


A 35°C (T1), se observa una sobre expresión de este gen en cada una de las variedades, por

lo cual las muestras problema salen de la curva estándar, ya que requieren de menor cantidad

de ciclos para ser detectados. A diferencia del tratamiento control, en el tratamiento 1 Mocarí

es la variedad que presenta mayor expresión con un SQ de 753 seguido de F473 y Lv 1645

con un SQ cada uno de 508 y 278 copias.

82

A 42°C (T2), en comparación con el tratamiento 1, la expresión de este gen transcurridos 10

minutos del aumenta al aumentar la temperatura; donde F473 tiene un SQ de 839, Mocarí

923 y Lv 1645 de 445 copias.

9.6.1.2. Expresion de Hsp26.7 en la E2 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades


a.

b.



83



problema se presentan en la tabla 30.

En el tratamiento control (28°C), las muestras del gen que codifican la proteína Hsp26.7 no

se ubican en la curva estándar , siendo Mocarí la que mayor expresión presenta con un SQ

de 251, seguido de F473 con 188 copias y Lv 1645 con 36 copias presentando el valor más

bajo y siendo el único ubicado en la curva estandar. En el tratamiento 1 a 35°C hay un

aumento considerable en la expresión de este gen en la variedad F473 con un SQ 804; por

otro lado, en la variedad Mocarí y Lv 1645 la expresión de este gen aumento pero no con la

misma magnitud que F473, para Mocarí y Lv1645 aumento en promedio 40 copias. A 42°C,

la expresión de F473 disminuye, siguiendo el patrón que presento en la E1. Por otro lado,

Mocarí y Lv 1645 aumentaron su expresión superando la concentración de las muestras

estándar con un SQ de 533 y 931 respectivamente, siendo Lv 1645 la que presento el valor

más alto.

Tabla 29.Concentración de Hsp26.7 en estándar y muestras problema en la E2


Estándar

Estándar 1 260.0 24.05

Estándar 2 130.0 24.5

Estándar 3 65.0 25.46

Estándar 4 32.5 26.83

Estándar 5 16.3 27.54




TC

F473 188 24.04

M 251 23.58

LV1645 36 26.68

T1

F473 804 21.71

M 298 23.3

LV1645 79 25.43

T2

F473 769 21.78

M 533 22.37

LV1645 931 21.45

84

9.6.1.3 Expresion de Hsp26,7 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades


a.

b.






En el tratamiento control (28°C), la variedad Mocarí es la que presenta una mayor expresión

del gen que codifica la proteína Hsp18, con un SQ de 248, seguido de Lv 1645 y F473 con

un SQ de 116 y 92 respectivamente. En el tratamiento 1 (35°C) aumenta considerablemente

85

la expresión de este gen en F473 con 593 copias y Mocarí con 685 siendo la más alta, pero

disminuye en la variedad Lv 164 hasta unSQ de 53. En el tratamiento 2 a 42°C la expresión

de F473, Mocarí y Lv 1645 aumentan por encima de 300 copias en comparación con el T1.

La expresión de este gen para F473 y Mocarí a los 250 minutos de estrés incremente con el

aumento de la temperatura.


9.6.1.4. Relación de la expresión de Hsp26,7 en las tres extracciones, en cada tratamiento


El gen que Hsp26.7 se encuentra en el cromosoma 3 y codifica para la proteína de choque

térmico small que se ubica en los cloroplastos. Esta proteína a diferencia de la Hsp70 y Hsp90

no requiere de ATP para su funcionamiento, por lo cual se dice que es independiente de ATP.

Así mismo se clasifica en las small heat shock protein (sHsp), debido a su bajo peso

molecular de 26kDa. Esta proteína es de gran importancia porque actúa como co-chaperona

formando complejos proteicos con proteínas como Hsp70, Hsp90 y Hsp100. Junto a ello

diferentes estudios han demostrado que este tipo de proteínas confieren tolerancia a las

plantas bajo deferentes tipos de estrés abiótico como altas y bajas temperaturas, salinidad,

ABA [10].


Estándar

Estándar 1 260.0 21.76

Estándar 2 130.0 22.29

Estándar 3 65.0 23.68

Estándar 4 32.5 24.52

Estándar 5 16.3 25.66





Estándar 10 0.5 31.37

TC

F473 92 25.18

M 248 23.6

LV1645 116 24.82

T1

F473 593 22.22

M 685 21.97

LV1645 53 26.06

T2

F473 839 22.08

M 783 21.75

LV1645 387 22.88

86

Gráfica 18. Comparación de la Expresión Hsp26.7 de las variedades en los tres

tratamientos.

El gen que Hsp26.7 se encuentra en el cromosoma 3 y codifica para la proteína de choque

térmico small que se ubica en los cloroplastos. Esta proteína a diferencia de la Hsp70 y Hsp90

no requiere de ATP para su funcionamiento, por lo cual se dice que es independiente de ATP.

Así mismo se clasifica en las small heat shock protein (sHsp), debido a su bajo peso

molecular de 26kDa. Esta proteína es de gran importancia porque actúa como co-chaperona

formando complejos proteicos con proteínas como Hsp70, Hsp90 y Hsp100. Junto a ello

diferentes estudios han demostrado que este tipo de proteínas confieren tolerancia a las

plantas bajo deferentes tipos de estrés abiótico como altas y bajas temperaturas, salinidad,

ABA [10].


Hsp26.7 en las tres variedades de estudio en cada uno de los tratamientos.

La variedad F473 en el TC presenta una baja expresión en los tres momentos de estrés, con

un SQ promedio de 150 copias, se observa una sobreexpresión a medida que aumenta la

temperatura. Al aumentar la temperatura hasta 35°C y 42°C la expresión de este gen aumento

hasta 700 copias en cada uno de los momentos de estrés; así mismo se ve que el valor de

expresión más alto corresponde a los 10 minutos del T2 y a los 130 minutos del T1. A

temperatura de 42°C los niveles de expresión a los 10, 130 y 250 minutos son los más altos

en comparación con los demás tratamientos.

Mocarí al igual que F473 tiene los niveles de expresión más bajos a 28°C, con un promedio

de 220 copias en las tres extracciones. La expresión de este gen en la variedad Mocarí es

semejante a la variedad F473 ya que esta aumenta al aumentar la temperatura; en los

tratamientos a 35 y 42°C los niveles más altos corresponden a los 10 y 250 minutos de estrés

0,0

100,0

200,0

300,0

400,0

500,0

600,0

700,0

800,0

900,0

1000,0


SQ


Expresión HSP26 de las variedades en los tres tratamientos

E1

E2

E3

87

y disminuye a los 130 minutos de exposición en el T1 y T2. Los SQ más altos se exponen en

el T2, alcanzando un SQ de 900 copias.

En la variedad Lv 1645 no se presenta un cambio significativo en los valores del SQ entre el

tratamiento control y tratamiento 1; se observa una sobreexpresión a 42°C siendo la

expresión más alta a los 250 minutos de estrés con un SQ alrededor de 900 copias muy similar

al de la variedad Mocarí.Al comparar la expresión del gen Hsp26.7 en las tres variedades se

puede inferir que la variedad F473 y Mocarí son las que mayor niveles presentan ya que Lv

1645 lo hace únicamente a temperaturas extremas como es el caso del T2 (42°C).

En el estudio realizado por Chandel [10], de las seis variedades de arroz, solo una presento

niveles altos en las tres temperaturas (37, 42, 48°C), las demás variedades tuvieron incluso

los niveles más bajos para este gen en comparación con genes como Hsp 16.9, Hsp90,

Hsp17.7 y Hsp18. En un estudio realizado por Xinhai Chen en el 2014 [93], se hizo uso de tres

variedades de Oryza sativa en estadio de plántula y antesis: Nipponbare, Azucena

(susceptible al calor) y Co39 (Tolerante al calor), se aprecia que los niveles de expresión de

Hsp26.7 en cada una de estas variedades aumento conforme lo hacia la temperatura pero en

mayor proporción en la antesis que en el estadio de plántula; al contrastar los niveles a 28°C

y 42°C los valores fueron significativos a las 12 horas de estrés, transcurridos las 24 horas

de estrés la producción de ARN disminuyo para cada variedad. Otras investigaciones

realizadas por Sarkar [94], muestran que los niveles de este gen aumentan de manera

considerable cuando la planta de arroz es sometida a temperaturas demasiado altas hasta los

50°C, cuando se encuentra a 37 y 42°C hay incremento pero en comparación a la temperatura

control no es significativa como ocurre a 50°C; esto mismo es lo que sucede en la variedad

Lv 1645, que aumenta sus niveles a 42°C mientras que a 28 y 35°C los niveles se mantienen

constantes.

9.6.4. Gen Hsp18

a.

88

b.

Gráfica 19. a. curva de amplificación estándar de Hsp18; b. curva estándar de Hsp18



dos.En la Grafia 19a se presenta la amplificacion del gen en la muestra utilizada; se puede

apreciar que el ciclo umbral (Ct) es inversamente proporcional a la concentracion de ARN.


muestra de menor concentracion de ARN.

En la Gráfica 19b se representa la curva estandar realizada a partir de las diluciones, con

nueve puntos, presentando un buen coeficiente de correlacion de 0.988, lo que brinda una

confialidad al momento de colocar las muestras problemas.


F473, Mocarí, Lv 1645.

a.

89

b.


F473, Mocarí, Lv 1645. a. curva de amplificación; b. Curva estándar.




En la gráfica 20a se presenta la curva estándar con nueve muestras de concentración

conocida, con un coeficiente de correlación de 0.989 lo que indica una buena relación para

determinar la concentración de las muestras problema. Como se puede observar en la gráfica

20b, el estándar 1, es detectado a partir de 25.71 ciclos, siendo esta la de mayor concentración

y el estándar 9 es detectado a partir de 34.38 ciclos siendo la de menor concentración.

Con respecto a las muestras problemas en el TC (28°C), la variedad que presenta mayor

expresión del gen que codifica la proteína Hsp18 es Lv 1645 con un SQ de 221.8 con un Ct

de 25.45, seguido de F473 y Mocarí con un SQ de 210.4 y 180.7 respectivamente, ubicándose


A 35°C (T1), se observa una sobre expresión de este gen en cada una de las variedades, por

lo cual las muestras problema salen de la curva estándar, ya que requieren de menor cantidad

de ciclos para ser detectados. A diferencia del tratamiento control, en el tratamiento 1 Mocarí

es la variedad que presenta mayor expresión con un SQ de 602.6 seguido de F473 y Lv 1645

con un SQ cada uno de 456.0 y 242.1

A 42°C (T2), en comparación con el tratamiento 1, la expresión de este gen transcurrido 10

minutos del estrés disminuye; incluso, en el caso de F473 y Lv 1645 el SQ es menor en

comparación al Tratamiento control.

90



Estándar

Estándar 1 260,0 25,71

Estándar 2 130,0 26,44

Estándar 3 65,0 27,21

Estándar 4 32,5 28,09

Estándar 5 16,3 29,29





TC

F473 210,4 25,53

M 180,7 25,78

LV1645 221,8 25,45

T1

F473 456,0 24,31

M 602,6 23,86

LV1645 242,1 25,31

T2

F473 156,0 26,01

M 299,2 24,97

LV1645 143,9 26,14



a.

91

b.



Tabla 32.Concentración de Hsp18 en estándar y muestras problema en la E2


Estándar

Estándar 1 260,0 25,71

Estándar 2 130,0 26,44

Estándar 3 65,0 27,21

Estándar 4 32,5 28,09

Estándar 5 16,3 29,29




Estándar 9 1.0 34,38

TC

F473 218,3 25,47

M 260,0 25,2

LV1645 127,6 26,32

T1

F473 749,9 23,52

M 155,6 26,01

LV1645 78,7 27,09

T2

F473 293,1 25,01

M 542,0 24,03

LV1645 498,9 24,17

92




En el tratamiento control (28°C), las muestras del gen que codifican la proteína Hsp18 se

ubican en la curva estándar , siendo Mocarí la que mayor expresión presenta con un SQ de

260, seguido de F473 y Lv 1645 con un SQ de 218.3 y 127.6 respectivamente.

En el tratamiento 1 a 35°C hay un aumento considerable en la expresión de este gen en la

variedad F473 con un SQ 749.9; en la variedad Mocarí y Lv 1645 la expresión de este gen

disminuyo en comparación con el tratamiento control. A 42°C, la expresión de F473

disminuye, siguiendo el patrón que presento en la E1. Por otro lado, Mocarí y Lv 1645

aumentaron su expresión superando la concentración de las muestras estándar con un SQ de

542.0 y 498.9 respectivamente.

9.6.4.3 Expresion de Hsp18 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades


a.

93

b.








Estándar

Estándar 1 260,0 25,71

Estándar 2 130,0 26,44

Estándar 3 65,0 27,21

Estándar 4 32,5 28,09

Estándar 5 16,3 29,29




TC

F473 79,8 27,07

M 339,6 24,77

LV1645 156,0 26,01

T1

F473 403,6 24,5

M 571,5 23,95

LV1645 101,2 26,69

T2

F473 327,3 24,83

M 375,8 24,62

LV1645 0,0 NA

94

En el tratamiento control (28°C), la variedad Mocarí es la que presenta una mayor expresión

del gen que codifica la proteína Hsp18, con un SQ de 339.6, seguido de Lv 1645 y F473 con

un SQ de 79.8 y 156.0 respectivamente. En el tratamiento 1 (35°C) aumenta

considerablemente la expresión de este gen en F473 y Mocarí, pero disminuye en la variedad

Lv 1645, siguiendo el patrón de la extracción 2. En el tratamiento 2 a 42°C la expresión de

F473 y Mocarí disminuyen siguiendo el patrón de la extracción 1 y 2, en el caso de Lv 1645

no se presenta un valor asociado al Ct y SQ probablemente fue un error al momento de

sembrar la muestra de ARN no logro mezclarse con la mix.


en las tres variedades.

El gen Hsp18 se localiza en el cromosoma 1 y codifica para la proteína de choque térmico

Hsp18, al igual que la hsp26.7 se clasifica como sHsp. Esta proteína hace parte del grupo de

HspCII, que se encuentran en el citoplasma, es una proteína independiente de ATP y está

relacionada con la respuesta ante el estrés abiótico en plantas, co-ayudando a la protección

de proteínas necesarias en el metabolismo de cada planta.


Hsp18 en las tres variedades en cada uno de los tratamientos. En la variedad F473 a los 10

minutos de estrés (E1) la expresión de este gen a 28°C es de 210 copias, su valor se ve

duplicado al aumentar la temperatura en el tratamiento 1, pero disminuye por debajo del valor

de 200 cuando es sometido a 42°C.

Gráfica 23. Comparación de la Expresión Hsp18 de las variedades en los tres tratamientos.

Al aumentar el tiempo de exposición a 130 minutos en el tratamiento control no se observa

un cambio considerable en la expresión de dicho gen, en el tratamiento 1 aumentó cerca de

300 copias por encima de la E1 en el T1, en el tratamiento 2 disminuye su valor a 293 copias.

0

100

200

300

400

500

600

700

800


SQ


Expresión HSP18 de las variedades en los tres

tratamientos

E1

E2

E3

95

Al culminar el tiempo de estrés, es decir, a los 250 minutos de exposición en el tratamiento

control y el tratamiento 1 los valores disminuyen en comparación con la extracción 1 y 2, a

diferencia del tratamiento 2 que es el valor más alto de este tratamiento para dicha variedad,

sobrepasando el valor expresado por la extracción 2 por 30 copias.

En la variedad Mocarí a los 10 minutos de estrés (E1) la expresión de este gen está por debajo

de 200 copias, siendo el valor más bajo de expresión en comparación con F473 y Lv 1645,

en el T1 este expresión aumenta en 400 copias para alcanzar un SQ de 602 siendo el más alto

de las tres variedades, al aumentar la temperatura hasta 42°C el nivel de expresión disminuye

300 copias. En la E2, es decir, a los 130 minutos de estrés en el tratamiento 1 es el que menor

valor presenta con un SQ de 155 y siendo el tratamiento 2 el que presenta el valor más alto

con un SQ de 542. A los 250 minutos de estrés la expresión más alta se presenta a 35°C con

un SQ de 571 y el más bajo en el tratamiento a 28°C con un SQ de 399 copias. Al comparar

los valores de esta variedad con F473 y Lv 1645, Mocarí es la que mayor expresión presenta

del gen que codifica la proteína Hsp18 al culminar el tiempo de estrés térmico.

En la variedad Lv 1645 no se presenta una variación significativa en los diferentes momentos

de estrés en el tratamiento control y tratamiento 1, por otro lado en el tratamiento la expresión

del gen en a los 130 minutos es menor que a los 10 minutos de estrés a los 28 y 35 C, pero

aumenta considerablemente a los 250 minutos del estrés. No se puede determinar el valor de

expresión a los 250 minutos, puesto que se presentó un error al momento de colocar la

muestra de ARN.

En el 2016 se hizo un estudio de la regulación fisiológica y de genes en raíces y hojas bajo

estrés por altas temperaturas en álamo [95], donde se encontró que los niveles del gen Hsp18

aumentaban conforme lo hacia la temperatura, lo cual le daba termotelarancia a la planta ya

que pueden evitar la desnaturalización de proteínas cuando hay un estrés abiótico como el

estrés térmico. En el trabajo de Chandel [10], en las seis variedades se presenta niveles de

expresión constante a 28, 37, 42 y 48°C, en la variedad NArgina22 y R-1389—RF-42 hay

un incremento de este gen a 42 y 48°C. Jiahn et al., sometió plantas de Oryza sativa a 28,

32,35, 38 y 41°C y evidenció que el gen Hsp18 se expresó únicamente a partir de 32°C con

un incremento moderado a 35, 38 y 41°C; así mismo sometió estas plantas a estrés a 41°C

durante 240 minutos y observó que al aumentar el tiempo de exposición los niveles de Hsp18

aumentaban [96]. En plantas de arroz [94], este gen comienza a expresarse a los 30 minutos de

estrés a 37°C, no se logra visualizar expresión en la temperatura control. Conforme aumenta

la temperatura, aumenta los niveles de expresión de manera moderada. A diferencia de los

estudios ya mencionados, en las variedades F473, Mocarí y Lv1645 se logra apreciar aunque

sea niveles bajos de expresión de este gen a 28°C (TC), se genera un incremento notable en

el tratamiento 1 (35°C) para F473 y Mocarí y un aumento en el tratamiento 2 (42°C) para las

tres variedades.

96

9.6.5. Gen Hsp16.9

a.

b.

Gráfica 24. a. curva de amplificación estándar de Hsp16.9; b. curva estándar de Hsp16.9



dos. En la Grafia 24a se presenta la amplificacion del gen en la muestra utilizada; se puede

apreciar que el ciclo umbral (Ct) es inversamente proporcional a la concentracion de ARN.


muestra de menor concentracion de ARN.En la Gráfica 24b se representa la curva estandar

realizada a partir de las diluciones, con ocho puntos, presentando un buen coeficiente de

correlacion de 0.993, lo que brinda una confiabilidad al momento de ubicar las muestras

problemas.

97



a.

b.



Se realizó la curva estándar con 8 muestras, a partir de una muestra de concentración de

260ng/µL, aplicando un factor de 2 hasta obtener un estándar de 2.0 ng/µL. El estándar 1

siendo la muestra más concentrada presenta la menor cantidad de Ct con un valor de 27.25,

y la más diluida presenta mayor Ct siendo de 35.19. Se realizó una extracción de ARN (E1)

a los 10 minutos del estrés por alta temperatura en cada una de las variedades, las

98

cuantificaciones obtenidas para el estándar y las muestras problema se presentan en la tabla

35. A los 10 minutos de extracción en el tratamiento control (28°C), F473, Lv 1645 y Mocarí

presentan valores similares de expresión del gen que codifica la proteína Hsp16.9, siendo

2082, 1934 y 2000 respectivamente. Al aumentar la temperatura hay un incremento en la

expresión del gen en F473 y Mocarí, con un incremento de más de 1500 copias; en Lv 1645

hay un incremento pero no de la misma magnitud que F473 y Mocarí. Cuando aumenta la

temperatura a 42°C, la expresión del gen disminuye en las tres variedades, consecuencia de

la degradación del ARNm. Los SQ obtenidos en cada una de las muestras no se ubicaron en

la curva estándar, producto de la sobreexpresión que presenta este gen en la hoja de cada una

de las plántulas.



Estándar

Estándar 1 260,0 27,25

Estándar 2 130,0 27,94

Estándar 3 65,0 28,89

Estándar 4 32,5 30,68

Estándar 5 16,3 31,59




TC

F473 2082 23,16

M 1934 23,29

LV1645 2000 23,23

T1

F473 3654 22,16

M 3721 22,13

LV1645 2109 23,16

T2

F473 3087 22,46

M 2272 23

LV1645 1930 23,29

99



a.

b.



Se realizó una extracción de ARN (E2) a los 130 minutos del estrés por alta temperatura en


problema se presentan en la tabla 36. Durante el tratamiento control (28°C) la variedad que

presenta mayor expresión es Mocarí con un SQ de 2683, seguido de F473 y Lv 1645 con

1914 y 1263 respectivamente. A medida que aumenta la temperatura incrementa la expresión

del gen en las tres variedades significativamente en F473 con 6048 copias, duplicando su

100

valor con respecto a la extracción 1; en el caso de Mocarí y Lv 1645 la expresión disminuye.

Cuando la temperatura alcanza los 42°C la expresión de F473 disminuye cerca de 1500

copias, pero en Mocarí y Lv 1645 aumentan, no obstante no sobrepasan el valor generado en

F473.


9.6.5.3 Expresion de Hsp16.9 en la E3 en los tratamiento TC, T1, T2 en las variedades


a.


Estándar

Estándar 1 260,0 24,49

Estándar 2 130,0 25,44

Estándar 3 65,0 27,01

Estándar 4 32,5 28,71

Estándar 5 16,3 29,63





TC

F473 1914 23,31

M 2683 22,71

LV1645 1263 24,04

T1

F473 6048 21,27

M 2078 23,16

LV1645 538,9 25,56

T2

F473 4635 21,74

M 3796 22,09

LV1645 3808 22,09

101

b.



Se realizó una extracción de ARN (E3) a los 250 minutos del estrés por alta temperatura en


problema se presentan en la tabla 37. A 28°C F473 es la variedad que presenta el nivel más

bajo de expresión, seguido de Lv 1645 y Mocarí presenta el mayor valor de expresión siendo

este SQ de 2811.



Estándar

Estándar 1 260,0 24,49

Estándar 2 130,0 25,44

Estándar 3 65,0 27,01

Estándar 4 32,5 28,71

Estándar 5 16,3 29,63




TC

F473 1129 24,24

M 2811 22,63

LV1645 1554 23,68

T1

F473 3256 22,36

M 4992 21,61

LV1645 709,3 25,07

T2

F473 3010 22,5

M 4461 23,29

LV1645 2650 22,73

102

Al someter las plántulas a estrés térmico de 35°C incremento la expresión del gen de la

varidedad F473 y Mocarí con un SQ de 3256 4992, pero Lv 1645 disminuyo el valor hasta

709.3 A 42°C bajo el nivel de expresión de F473 y Mocarí alrededor de 300 copias en cada

una, sin embargo en Lv 1645 aumento el nivel de expresión hasta 2650. Los datos obtenidos

en los tratamientos durante la extracción 3 no se ubicaron en la curva estándar debido a una

sobreexpresión del gen que codifica la proteína Hsp16.9.

9.6.5.4. Relación de la expresión de Hsp16.9 en las tres extracciones, en cada tratamiento


El gen Hsp16.9 se encuentra localizado en el cromosoma 1 y codifica para la proteína

Hsp16,9 que pertenece al grupo de sHsp CI (proteína citosolica). Ésta es una de las proteínas

más importantes en respuesta al estrés abiótico en plantas; está conformada por un

dodecaméro en su forma inactiva, una vez va a interactuar y ser parte del complejo de

proteínas que actúan en la respuesta al estrés presenta una conformación de dímeros lo que

le permite captar el sustrato para su posterior re naturalización. Al igual que Hsp26.7 y Hsp18

es una proteína independiente de ATP y actúa como co-chaperona de proteínas como Hsp70,

Hsp90 y Hsp100 [67].

Gráfica 28. Comparación de la Expresión Hsp16.9 de las variedades en los tres tratamientos.

Por lo tanto es uno de los genes de mayor interés y estudio en bioquímica y biología

molecular de plantas. En este caso se estudió la expresión del gen Hsp16, 9 en tres variedades.

La variedad F473 durante el tratamiento control (28°C) presenta una expresión promedio de

2000 copias a los 10 y 130 minutos de estrés, su valor disminuye a los 250 minutos cerca de

1000 copias. Los valores obtenidos en el tratamiento control son los más bajos en las tres

extracciones al momento de compararlos con los tratamientos 1 y 2. Tanto a 35 y 42°C se

observa un patrón similar en los tres momentos de extracción, ya que las E1 y E3 en ambos

tratamientos se ubican en el mismo nivel, es decir a 35°C estas expresiones están cerca de

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000


SQ


Expresión HSP16,9 de las variedades en los tres

tratamientos

E1

E2

E3

103

3500 copias, y a 42°C alrededor de 3000; siendo la extracción 2 la que sobresale en ambos

tratamientos aumentando considerablemente su expresión, para el tratamiento 1 se obtiene

un SQ de 6000 y en el tratamiento 2 de 4500 copias. En la variedad Mocarí se observan

diferencias tanto en los tratamientos como en los tiempos de extracción. A 28°C se observa

un aumento de expresión de este gen a medida que aumenta el tiempo de exposición, al

compararlos con el tratamiento 2 (42°C) se presenta la misma situación pero con valores de

SQ más altos que en el tratamiento control, en ambos tratamientos la diferencia entre los 130

y 250 minutos de estrés no es muy alto, siendo de 200 copias para el primer tratamiento y

1000 copias para el segundo. En el tratamiento 1 (35°C) se presenta una expresión más alta

a los 10 minutos de exposición que a los 130 minutos, se observa el valor más alto se observa

culminado el estrés con un SQ de 4992 copias.

Los niveles de expresión a 28°C y 35°C de Lv 1645 son los más bajos en comparación con

las demás variedades, se esperaría que al aumentar la temperatura los niveles de expresión

aumenten, en la E2 y E3 del tratamiento los niveles disminuyen con respecto al tratamiento

control. Los valores más altos para esta variedad se presentan en el tratamiento 2 es decir a

42°C, no obstante no alcanzan a superar los valores generados en las otras variedades.

En el estudio realizado en el 2004 por Guan et al. [96] en plantas de arroz no se observaron

niveles de expresión a 28 y 32°C, a 35°C comienza expresarse con niveles bastantes bajos,

pero a 38 y 41°C incrementa considerablemente con respecto a genes Hsp17.7 y Hsp18;

adicional a ellos se presenta un incremento a medida que aumenta el tiempo de exposición a

41°C, tal como ocurre en Lv 1645 en el T2 (gráfica 28). Para el 2009 el grupo de Sarkar[94]

estudio los niveles de expresión de diferentes genes en arroz, mostraba que los niveles del

gen Hsp16.9 aparecen a 37°C y aumentan con la temperatura, siendo el mayor nivel a los

50°C, lo cual concuerda con los estudios realizados por Jiahn. A diferencia de estos, en el

trabajo de Chandel [10] en el 2012 donde compara seis variedades de arroz, muestra que los

niveles de expresión se mantienen constantes en las variedades R-1389-RF-42 y Swarma, en

la variedad Dagad deshi y SL-62 los valores disminuyen a medida que aumenta la

temperatura, la variedad GP-145-103 no presenta ningún patrón de aumento o descenso, ya

que a 37°C tiene unos niveles de Hsp16,9 considerables, pero a 42°C estos niveles sobrepasan

los de la temperatura anterior y vuelve a disminuir a 48°C, la única variedad que incrementa

de manera considerable los niveles de este gen es Nagina 22. Igual ocurre con las variedades

F473, Mocarí y Lv 1645 (Gráfica 28), las tres plántulas tienen bajos niveles a 28°C, la

expresión más alta se presenta en F473 a los 130 minutos de estrés a 35°C y Lv 1645 es la

que menor de expresión presenta tanto para el tratamiento control y tratamiento 1; cada una

de las variedades difiere en los niveles de expresión de este gen.

104

9.8. Cuantificación relativa

Para confirmar si hay una sobre-expresión de los genes diana se realizó una cuantificación

relativa, usando como gen de referencia que amplifica para actina, debido a que su expresión

no varía sin importar la variedad y el tipo de estrés por temperatura al que esté sometido,

como gen calibrador se usó el estándar 2 que presentaba una concentración conocida de 150

ng/µL. Para realizar una cuantificación relativa se puede usar el método Livak conocido

también como el ΔΔCt, el ΔCt usando un gen de referencia y el método Pfaffl. Dichos

métodos no difieren en el resultado, por tal motivo se escogió el método Livak para comparar

la expresión del gen diana (target) con el gen de Actina (referencia) en cada una de las

muestras (test).

Para este método se requiere de tres pasos [97]:

1. Normalizar Ct(target) a Ct(gen de referencia)

2. Normalizar ΔCt de la muestra problema (test) al ΔCt del control

3. Calcular la proporción o diferencia

Para esto se utilizan cuatro ecuaciones

1. ∆𝐶𝑡𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 = 𝐶𝑡𝑡𝑎𝑟𝑔𝑒𝑡.𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝐶𝑡𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎.𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙

2. ∆𝐶𝑡𝑡𝑒𝑠𝑡 = 𝐶𝑡𝑡𝑎𝑟𝑔𝑒𝑡.𝑡𝑒𝑠𝑡 − 𝐶𝑡𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎.𝑡𝑒𝑠𝑡

3. ∆∆𝐶𝑡𝑡𝑒𝑠𝑡 = ∆𝐶𝑡𝑡𝑒𝑠𝑡 − ∆𝐶𝑡𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙

4. 2−∆∆𝐶𝑡

A partir de estas ecuaciones se determinó la relación entre el gen de referencia y cada uno

de los genes de estudio en las tres variedades, los resultados se presentan en la tabla 38.

Tabla 37. Cuantificación relativa de cada uno de los genes usando actina como gen de

referencia

Hsp16,9

Test Hsp16.9

Ct

Actina

Ct ΔCt (control) ΔCt (test) ΔΔCt

2- ΔΔCt

Control 27,94 24,53 3,41

F473 21,27 24,15 -2,88 -6,29 78,25

Mocarí 21,61 23,9 -2,29 -5,7 51,98

LV1645 22,09 24,12 -2,03 -5,44 43,41

Hsp18

Test Hsp18

Ct

Actina


2- ΔΔCt

Calibrador 26,15 24,53 1,62

F473 23,52 24,15 -0,63 -2,25 4,76

Mocarí 23,86 23,9 -0,04 -1,66 3,16

LV1645 24,17 24,12 0,05 -1,57 2,97

Hsp26,7 Test ΔCt (test) ΔΔCt

105

Hsp26,7

Ct

Actina

Ct

ΔCt

(calibrador)

2- ΔΔCt

Calibrador 24,5 24,53 -0,03

F473 21,64 24,15 -2,51 -2,48 5,58

Mocarí 21,49 23,9 -2,41 -2,38 5,21

LV1645 21,45 24,12 -2,67 -2,64 6,23

Hsp70

Test Hsp70 Ct Actina


2- ΔΔCt

Calibrador 22,29 24,53 -2,24

F473 20,41 24,15 -3,74 -1,5 2,83

Mocarí 20,6 23,9 -3,3 -1,06 2,08

LV1645 21,57 24,12 -2,55 -0,31 1,24

Hsp90

Test Hsp90 Ct Actina


2- ΔΔCt

Calibrador 25,44 24,53 0,91

F473 23,62 24,15 -0,53 -1,44 2,713

Mocarí 24,51 23,9 0,61 -0,3 1,231

LV1645 24,27 24,12 0,15 -0,76 1,693

Los valores obtenidos para todos los genes en la cuantificación relativa fueron positivos lo

que permite inferir que hay un aumento en la expresión de cada gen con respecto a un control,

es decir frente a una muestra que no ha sido sometida a estrés por alta temperatura. Los datos

de la tabla 38 se muestran en la gráfica 29.

Gráfica 29. Cuantificación relativa de los genes Hsp16,9, Hsp18, Hsp26,7, Hsp70 y Hsp90

en las tres variedades.

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

F473 Mocari Lv1645

Cu

an

tifi

caci

òn

rel

ati

va

Variedades

Cuantificación relativa de los cinco genes en las tres

variedades

Hsp16,9

Hsp18

Hsp26,7

Hsp70

HspH90

106

En la gráfica 29 se muestra que la variedad que presenta mayor expresión en cada uno de los

genes es F473, seguido de Mocarí y por ultimo Lv 1645. Así mismo el gen que codifica la

proteína Hsp16.9 es el que presenta mayor expresión entre 43 y 78 veces más con respecto

al control; seguido de Hsp26.7 que presenta valores similares en las tres variedades entre 5.2

y 6.2 más veces que el control. Hsp18 presenta un valor entre 3 y 4.7 siendo el valor más alto

en F473. Los genes que codifican las proteínas de choque térmico Hsp70 y Hsp90 son las

que presentan menor expresión al compararlas con los demás genes y los niveles más altos

se siguen expresando en F473, seguido de Mocarí y Lv 1645.

Las sHsp en este caso (Hsp16.9; Hsp18; Hsp26.7) son las más abundantes y diversas en

plantas, pueden incrementar su expresión cuando son sometidos a estrés hasta unas 200

veces, las otras proteínas como las de la familia Hsp70 y Hsp100 lo hacen solo 10 veces [98].

Lo que explica la alta expresión de los genes que codifican para Hsp16.9; Hsp18 y Hsp26.7

en las variedades F473, Mocarí y Lv 1645.

9.9. Análisis de la expresión de los genes por variedad

Se realizó un análisis de la expresión de los genes por cada variedad. Esto con la finalidad

de hacer una comparación entre los cinco genes de estudio en las diferentes condiciones de

temperatura (28, 35, 42°C) en los tres momentos de estrés térmico.

9.9.1. Variedad Fedearroz 473

La variedad Fedearroz 473 caracterizado por su porte bajo, buen vigor inicial, alto

macollamiento y alto potencial de rendimiento. Es una variedad que se cultiva en la zona del

Caribe seco, Caribe húmedo y el Centro del país, donde la temperatura oscila entre los 28 a

30°C, pero así mismo en ocasiones ha incrementado hasta los 34° y 36°C lo que puede afectar

el rendimiento en la producción de arroz en estas zonas del país.

En la gráfica 30 se presenta la expresión de cada uno de los genes de estudio a 28, 35 y 42°C

durante el periodo de estrés térmico. Se puede evidenciar que los niveles de expresión de

estos genes en el Tratamiento control (TC:28°C), son menores en comparación al tratamiento

1 (T1:35°C) y tratamiento 2 (T2:42°C) en los tres instantes del estrés por alta temperatura

(E1, E2, E3). La temperatura óptima para el establecimiento de la plántula de arroz es de 25

a 30°C. Por lo tanto en el tratamiento control (28°C) la planta se encuentra en condiciones

normales de temperatura para su óptimo desarrollo, por ende los niveles de expresión a los

10 y 130 minutos no presentan diferencias significativas entre los valores de cada uno de los

genes, transcurridos los 250 minutos (E3) se ve una disminución en cada uno de los genes

posiblemente a una degradación del ARN que codifica para dichas proteínas.

Cuando las plántulas de arroz se someten a temperaturas por encima de 35°C pueden

presentar alteraciones físicas como punta blanca, manchas cloróticas, y manchas en las hojas,

así mismo los procesos fisiológicos y bioquímicos se ven alterados. Dentro de estos cabe

mencionar la degradación de proteínas, generación de especies reactivas de oxigeno (ROS)

107

y prolongación de la fase S en el crecimiento celular, lo que provoca alteraciones fenotípicas,

malformaciones e incluso la muerte celular. Debido a ello las plantas buscan mecanismos de

defensa para hacer frente a este tipo de situaciones a las cuales están sujetas constantemente.

Uno de estos mecanismos es la producción de proteínas de choque térmico que actúan como

chaperonas moleculares, que se encargan de estabilizar y prevenir la agregación de las

proteínas y mantener su estado fundamental de manera que puedan replegarse y

reconformarse nuevamente [98]. Debido a esto, en el T1 es decir a 35°C se presenta un

incremento en los niveles de expresión en cada uno de los genes, llegando a duplicar el

número de copias a los 10 minutos del estrés térmico y a triplicarlo a los 130 minutos y

disminuye su expresión a los 250 minutos, producto de la degradación del ARN. En el T2

(42°C) hay un incremento de la expresión en cada gen comparado con el TC pero no alcanza

a superar los valores presentados en el T1. Como se puede observar en la gráfica 30 los genes

que presentan mayor expresión en esta variedad en orden creciente son Hsp18, Hsp26.7 y

Hsp16.9 denominadas como small heat shock protein (sHsp), ya que son proteínas que no

requieren de ATP para su funcionamiento y por lo tanto forman de manera inmediata grandes

oligomeros con las proteínas nativas para evitar su desnaturalización, una vez se establecen

estas conformaciones se unen a proteínas dependientes de ATP como las Hsp70 y Hsp90

para retornar a la proteína en su conformación inicial. Los niveles de Hsp70 y Hsp90

incrementan entre los tratamientos pero no de manera sustancial como se puede observar en

la tabla 38 de la cuantificación relativa, esto debido a que estas proteínas actúan como

chaperonas moleculares bajo cualquier tipo de estrés que presenta la planta.

Gráfica 30. Expresión de los genes Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7, Hsp70 y Hsp90 en la variedad

F473 en el TC, T1 y T2

La cuantificación relativa muestra que la variedad F473 es la que mayor niveles de expresión

presenta en todos los genes frente a la variedad Mocarí y Lv 1645. Al relacionar los valores

absolutos y relativos con los datos fenotípicos presentados en cada uno de los tratamientos,

se puede afirmar que F473 es la variedad que presenta resistencia al estrés térmico por altas

0,0500,0

1000,01500,02000,02500,03000,03500,04000,04500,05000,05500,06000,06500,0

E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3

SQ

TC T1 T2

Expresión de Hsp en Fedearroz 473 en los tres

tratamientos

Hsp90

Hsp70

Hsp26,7

Hsp18

Hsp16,9

108

temperaturas, puesto que en el TC y pese a estar irradiada no presento manchas cloróticas en

la lámina ni en la punta de la hoja, en el T1 algunas hojas laterales se quemaron para proteger

la hoja bandera y hasta los 130 minutos del estrés en el T2 comienza a manifestar necrosis

apical, lo que indica que los altos niveles de expresión de estas proteínas en especial de las

sHsp están relacionadas con la respuesta al estrés térmico, lo que lo hace un genotipo

apropiado para sembrar en zonas del país donde se presente temperaturas altas.

9.9.2. Variedad Mocarí

La variedad Mocarí es un genotipo que se liberó en el 2010 al mercado nacional y desde

entonces se ha caracterizado por su alto vigor inicial, periodo vegetativo corto y buen

macollamiento. Es una variedad que se cultiva en la zona del Caribe seco, Caribe húmedo y

el Centro del país, donde la temperatura oscila entre los 28 a 30°C, pero si el cultivo se

encuentra en temporadas donde estas regiones alcanzan la temperatura máxima (superior a

35°C), su producción tiende a disminuir.

En la gráfica 31 se presentan los valores de cada uno de los genes en los diferentes

tratamientos para esta variedad. Es posible observar que los niveles de expresión de cada gen

aumentan a los 35 y 42°C de temperatura en comparación con el tratamiento control (28°C).

Al igual que en la variedad F473 los niveles más altos de expresión los presentan las proteínas

sHsp, en orden creciente Hsp18, Hsp26.7 y Hsp16.9. El gen Hsp16.9 alcanza valores hasta

de 5000 copias a los 250 minutos del tratamiento 1, es decir cerca de 4000 copias por encima

del TC; seguido de este se encuentra Hsp26.7 que presenta los valores más altos en la E1 y

E3 del tratamiento 2 con 200 copias por encima de los valores del T1 y 400 copias del TC.

Los niveles de expresión de la Hsp18 no varían significativamente entre el estrés a 35 y 42°C,

pero si son superiores en comparación de los niveles expresados a 28°C. Los niveles de la

Hsp70 y Hsp90 son los más bajos en esta variedad; aunque los valores de Hsp70 son más

altos que las Hsp90.

Al comparar los valores absolutos con los valores relativos, Mocarí es la variedad que

presenta niveles de expresión por debajo de F473 y por encima de Lv 1645 (Gráfica 29). Pese

a que las plántulas de Mocarí presentaron manchas cloróticas conocidas como maculata

debido a la radiación, también se vio alterado el fenotipo por la exposición a altas

temperaturas. A los 35°C (T1) se observó necrosis apical, y deshidratación en las hojas, al

igual que a los 10 minutos de estrés a 42°C (T2).

A causa de esto es posible clasificar esta variedad como resistente a altas temperaturas en un

rango de 35 a 38°C; es posible notar que hay altos niveles de expresión de los genes a 42°C,

sin embargo esta temperatura genera manchas adicionales en la lámina y punta de las hojas,

lo que puede conllevar a una muerte celular si se deja en tiempos prolongados a esta

temperatura ya que puede verse afectada el aparato fotosintético y por lo tanto el rendimiento

de los cultivos se vería afectado.

109


Mocarí en el TC, T1 y T2.

9.9.3 Variedad Línea avanzada1645

Línea avanzada 1645 es una variedad que presenta altos niveles de rendimiento, su

productividad merma en regiones como el Caribe seco, donde la temperatura a logrado

alcanzar los 36C.

En la gráfica 32 se presentan los valores de cada uno de los genes en los diferentes

tratamientos para esta variedad. Es posible observar que los niveles de expresión de los genes

en el tratamiento control (28C) son más altos en comparación al tratamiento 1 (35°C), lo cual

puede tener una relación directa con la tolerancia de esta variedad al estrés térmico por alta

temperatura. Los niveles máximos en cada uno de los genes se manifiestan en el tratamiento

2 es decir a 42°C.

Los niveles más altos de expresión se presentan en las sHsp: 16.9, seguido de Hsp26.7, Hsp18

los más bajos son correspondientes a Hsp70 y Hsp90. Al comparar los valores absolutos y

los valores relativos (Gráfica 29) de F473, Mocarí y Lv1645, esta última es el genotipo que

presenta los menores niveles de expresión en los cinco genes de estudio, lo que puede estar

relacionado con la resistencia al estrés térmico, ya que de acuerdo a los datos fenotipos

obtenidos durante los tratamientos, Lv 1645 pese a presentar líneas longitudinales de color

blanco en las hojas conocida como estriata y despigmentación en las puntas de las hojas como

consecuencia de la radiación, presento en los tres tratamiento necrosis apical y manchas en

las hojas en mayor proporción que Mocarí.

Debido a esto es posible clasificar esta variedad como susceptible a altas temperaturas, no se

recomiendo sembrar en zonas del país donde la temperatura sobrepase lo 30C dado que se

0,0500,0

1000,01500,02000,02500,03000,03500,04000,04500,05000,05500,0

E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3

SQ

TC T1 T2

Expresión de Hsp en Mocarí en los tres tratamientos

Hsp90

Hsp70

Hsp26,7

Hsp18

Hsp16,9

110

generan alteraciones en el fenotipo lo que conlleva una disminución en la producción de

arroz.


Lv1645 en el TC, T1 y T2.

Para realizar la lisis celular, se sometió el tejido foliar a maceración mecánica y nitrógeno

líquido; la extracción de proteínas totales se realizó de acuerdo a la metodología

planteada con la solución de Buffer Glicina.

9.10. Cuantificación de Proteínas totales

Se realizó una cuantificación de proteínas totales, haciendo uso del método colorimétrico de

Bradford. A continuación se presenta en la tabla 39 la absorbancia para la curva de

calibración y las muestras problema.

Tabla 38. Absorbancia de la curva patrón y las muestras del Tratamiento Control (TC),

Tratamiento 1 (T1) y del Tratamiento 2 (T2) en las tres variedades Fedearroz 473 (F473),

Mocarí y Línea Avanzada 1645 (Lv1645).

Absorbancia

Buffer Glicina 0

Blanco 0

Patrón 120 mg/dL 2,279






Variedad Extracción Concentración

mg/dL

TRATAMIENTO

CONTROL

F473 1 32,71739857 1,005

F473 2 29,60591778 0,958

0,0400,0800,0

1200,01600,02000,02400,02800,03200,03600,04000,0

E1 E2 E3 E1 E2 E3 E1 E2 E3

SQ

TC T1 T2

Expresión de Hsp en Linea Avanzada 1645 en los tres

tratamientos

Hsp90

Hsp70

Hsp26,7

Hsp18

Hsp16,9

111

F473 3 25,96482323 0,903

MOCARÍ 1 30,33413669 0,969

MOCARÍ 2 39,93338595 1,114

MOCARÍ 3 27,75226965 0,930

LV 1645 1 21,59550978 0,837

LV 1645 2 28,54669028 0,942

LV 1645 3 34,04143295 1,025


mg/dL TRATAMIENTO 1

F473 1 44,76611143 1,187

F473 2 62,17716354 1,450

F473 3 56,88102601 1,370

MOCARÍ 1 55,35838648 1,347

MOCARÍ 2 55,62319335 1,351

MOCARÍ 3 52,04830053 1,297

LV 1645 1 74,2258764 1,632

LV 1645 2 53,63714178 1,321

LV 1645 3 60,05870853 1,418


mg/dL TRATAMIENTO 2

F473 1 28,48048856 0,941

F473 2 43,50827877 1,168

F473 3 29,27490918 0,953

MOCARÍ 1 30,59894356 0,973

MOCARÍ 2 49,33403005 1,256

MOCARÍ 3 20,80108915 0,825

LV 1645 1 43,04486674 1,161

LV 1645 2 34,24003811 1,028

LV 1645 3 48,4734077 1,243

Con los datos obtenidos se procedió a realizar una regresión lineal, (gráfica 33), donde se

representa la curva estándar realizada a partir de 6 soluciones, presentando un coeficiente de

correlación con un R2 de 0,9971 acercándose al 1, lo que permite determinar la concentración

de proteínas totales en las diferentes muestras problemas con un alto grado de confiabilidad.

Gráfica 33. Curva estándar por método de Bradford.

y = 0,0151x + 0,5139

R² = 0,9971

0

1

2

3

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

cia

Concentración (mg/dL)

CURVA CONTROL BSA

112

9.10.1. Cuantificación de Proteínas totales Tratamiento Control

Se contrastaron los valores obtenidos de proteínas totales en el tratamiento control en la curva

patrón (gráfica 34). Todos los valores se ajustaron a la curva, presentando una concentración

entre 20 y 40 mg/dL. El menor y mayor valor corresponde a Lv1645 con 21,59 y 34,04

respectivamente.

Gráfica 34. Valores de la extracción de proteínas del tratamiento control TC relacionados

con la curva estándar.

9.10.2. Cuantificación de Proteínas totales Tratamiento 1

Se cuantifico el contenido de proteínas totales en cada muestra para el tratamiento 1 (gráfica

35), de acuerdo a los datos obtenidos las muestras en este tratamiento, tienen una

concentración entre 40 y 70 mg/dL, siendo F473 E1 la de menos valor con 44,76 mg/dL y

Lv1645 E1 la de mayor concentración con 74,22 mg/dL.


curva estándar.

y = 0,0151x + 0,5139

R² = 0,9971

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

cia


TRATAMIENTO CONTROL Vs CURVA CONTROL

BSA

y = 0,0151x + 0,5139

R² = 0,9971

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

cia


TRATAMIENTO 1 Vs CURVA CONTROL BSA

113

9.10.3. Cuantificación de Proteínas totales Tratamiento 2

Para el tratamiento 2, las muestras disminuyeron su concentración con respecto al tratamiento

1, acercándose algunas de las muestras a los valores obtenidos en el tratamiento control

(gráfica 36). El rango de concentración está entre 20 y 50 mg/dL. A 42°C Mocari es la

variedad que presento el menor y mayor valor, siendo de 20,80 mg/dL y 49,33 mg/dL.


curva estándar.

9.11. SDS-PAGE

Para observar el perfil electroforético en cada uno de los tratamientos en las tres variedades,

se usaron geles de poliacrilamida discontinuos usando como desnaturalizante

sodiododecilsulfato; dichos geles fueron preparados a una concentración de 12,5% con la

finalidad de separar proteínas con peso molecular de un rango de 10 a 200 kDa [81], puesto

que las proteínas de interés Hsp16,9; Hsp18; Hsp26,7; Hsp70 y Hsp90 presentan pesos

moleculares de 16,9, 18, 27, 71 y 90 kDa respectivamente. Se utilizó el marcador de peso

molecular Dual Color Standards de Bio-Rad, que presenta un rango de 10 a 250 kDa.

De acuerdo a los datos obtenidos en la cuantificación de proteínas totales por el método de

Bradford, se normalizaron las diferentes muestras a 25mg/dL para poder comparar las bandas

proteicas entre las variedades en cada uno de los tratamientos.

9.11.1. Geles SDS-Page Tratamiento Control (TC)

En la figura 59 se presenta el perfil proteico para el tratamiento control (TC:28°C) , de las

variedades Fedearroz 473, Mocarí y Línea avanzada 1645 en los tres momentos de

extracción. En las tres variedades se presenta una alta presencia de proteínas con un peso

molecular de 50 kDa; las tres variedades presentan un perfil similar, pero con diferencias en

la intensidad en cada una de las bandas, siendo Mocarí la que menor cantidad de proteínas

presento con respecto a F473 y Lv1645. En las tres variedades se logra percibir 2 bandas

y = 0,0151x + 0,5139

R² = 0,9971

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

cia


TRATAMIENTO 2 Vs CURVA CONTROL BSA

114

entre 25 y 27 kDa. La variedad F473 presenta mayor intensidad en las bandas en la extracción

2 y 3 es decir a la 1:15 pm y 3:15 pm; por otro lado Mocarí presento menor cantidad de

proteínas en la última extracción; a diferencia de Lv1645 que presenta una intensidad similar

en los diferentes momentos de extracción.

kDa MP F1 F2 F3 M1 M2 M3 Lv1 Lv2 Lv3

250

150

100

75

50

37

25

Figura 59. Visualización del gel de poliacrilamida SDS-PAGE con tinción azul de Comassie.

9.11.2. Geles de SDS-Page Tratamiento 1 (T1)

Se realizó un perfil proteico de las tres variedades para el tratamiento 1 (T1:35°C), (Figura

60). Al igual que en el Tratamiento control, en el tratamiento 1 se presenta una fuerte

concentración de proteínas con un peso molecular de 50 kD (C). Las variedades F473,

Mocarí, Lv 1645 presentan un perfil proteico similar, la intensidad de las bandas cambia de

una variedad a otra y de los momentos de extracción. Se logra observar bandas cercanas a 90

kDa, (A) 75kDa (B), 26 kDa (D) y 18 kDa (E).y 16 kDa (F), que pueden estar relacionadas

con los pesos moleculares de las proteínas de interés.

9.11.3. Geles de SDS-Page Tratamiento 2 (T2)

Se realizó un perfil proteico para el tratamiento 2 (T2: 42°C) para las tres variedades (figura

61). F473, Mocarí y Lv1645 presentan un perfil proteico similar, junto a ello tienen el mismo

patrón que el Tratamiento 1, pero con una intensidad mayor en cada una de las bandas. Al

igual que en el TC y T1, T2 presenta la banda característica de 50 kDa (C) Lv 1645 es la

variedad que presenta mayor intensidad, seguido de F473 y siendo Mocarí la que menor

visibilidad presenta. En las tres variedades se logran apreciar las bandas de interés, siendo de

90 kDa (A), 70 kDa (B), 26 kDa (D), 18 kDa (E) y 16 kDa (F). La variedad F473 y Mocarí

presentan la mayor cantidad de proteínas en la extracción 2, al contrario de Lv 1645 que

presenta una cantidad similar en las tres extracciones.

115

kDa MP F1 F2 F3 M1 M2 M3 Lv1 Lv2 Lv3

250

150

100

75

50

37

25

20

15


kDa MP F1 F2 F3 M1 M2 M3 Lv1 Lv2 Lv3 250

150

100

75

50

37

25

20

15


En los tres tratamientos se observa que la banda de mayor intensidad corresponde a 50 kDa

con relación al marcador de peso, siendo está correspondiente a proteínas glutelinicas que

constituyen entre el 70 y 90% de proteínas totales en arroz. La fracción glutelina está

constituida por dos polipéptidos alfa y beta, ambos unidos por puentes disulfuro.

Actualmente se han identificado seis genes que las codifican y permiten establecer una

A

B

C

D

E

F

A

B

C

D

E

F

116

clasificación en dos subfamilias: GluA y GluB de acuerdo a la secuencia de nucleótidos que

generan. Estas diferencias se trasladan a sus propiedades nutricionales ya que GluB contiene

mayor cantidad del aminoácido esencial lisina y a sus propiedades estructurales ya que

presentan diferencias en su grado de polimerización [99].

117

10. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO

La investigación tuvo un Diseño Completamente al Azar (DCA), el cual consiste en la

asignación de unidades experimentales de manera completamente aleatoria en cada uno de

los tratamientos (en este caso la unidad experimental fue cada una de las placas de PCR con

los genotipos). Debido a su aleatorización irrestricta, se utilizaron unidades experimentales

lo más homogéneas posibles, esto se logró manteniendo los individuos de cada genotipo

iguales condiciones (medio, humedad relativa, temperatura y edad) para de manera esta

disminuir el error experimental. La ecuación general que se utilizó en este Diseño Factorial

Completamente al Azar fue:

𝑿𝒊𝒋𝒌 = 𝝁 + 𝜶𝒋 + 𝜷𝒌 + 𝜸𝒋𝒌 + 𝜹𝒊𝒋𝒌

Los datos obtenidos de la aplicación del modelo estadístico fueron utilizados en los

análisis de resultados. Las figuras de comparación de variables estadísticas que se

muestran a continuación y fueron obtenidas del programa de análisis estadístico “R i386

3.4.0”, los valores generados por el programa que corresponden a cada gráfica.

Obteniendo el Modelo y Programa para realizar el análisis estadístico se resolver las hipótesis

para cada una de las comparaciones que se llevaron a cabo.

A. HIPÓTESIS DE VARIEDADES

Hipótesis nula (H0): el estrés por alta temperatura no genera diferencias en la expresión de



con 60Co.

Hipótesis alterna (H1): el estrés por alta temperatura si genera diferencias en la expresión de



con 60Co.

B. HIPÓTESIS DE TRATAMIENTOS

Hipótesis nula (H0): las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 no presentan

diferencias significativas en la expresión de genes que codifican las proteínas de choque

térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 y Hsp 90 en los diferentes tratamientos

(TC, T1 y T2).

Hipótesis alterna (H1): las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 si


118


tratamientos (TC, T1 y T2).

10.1. ANÁLISIS DE DISTRIBUCIÓN DE LOS DATOS

Para la corroboración de las hipótesis planteadas se realizó un análisis estadístico descriptivo

evaluando la normalidad de los datos, se realizó un Histograma de Frecuencias y un Boxplot

con el fin de juzgar si estos proceden de una distribución y analizar la simetría para evaluar

mediante inspección visual la normalidad de las puntuaciones. Para determinar con un valor

numérico esta distribución de datos se realizó un test de Anderson-Darling con el objetivo de

certificar la normalidad o no de las variables.

10.2. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DESCRIPTIVO

Los datos a analizar (ver anexo 9) se presentan en la figura X. Las variedades F 473, Lv 1645

y MOCARÍ tienen 45 datos, los tratamientos TC, T1 y T2 presentan 45 datos, y las

extracciones que fueron a distintas horas (11:10, 13:10 y 15:10) muestran al igual que los

anteriores 45 datos.

Figura 62. Conjunto de datos activos.

Los genes Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7, Hsp70 y Hsp90 muestran un total de 27 datos para cada

uno. Por último el número de copias SQ presenta un mínimo de 0.0, en el 1st Cuartil con un

valor de 149.1, una mediana de 260, una media de 768.9, 3dr Cuartil de 697.4 y un valor

máximo de 6048.0.

10.2.1. Histograma

En la gráfica 37 se observa que el histograma presenta una distribución en forma de asimetría

positiva debido a que la concentración de los datos está dada hacia los valores inferiores y la

cola esta hacia los valores superiores.

119

Gráfica 37. Histograma de frecuencias contrastando el número de copias (SQ) con las

variedades F473, Lv 1645 y Mocarí.

10.2.2. BoxPlot

En la gráfica 38 se observa los BoxPlot que ofrece una representación gráfica en la que se

distinguen la tendencia central, la dispersión y la distribución de nuestros datos [100].

La asimetría del BoxPlot está dada por la posición de la mediana en la caja. Así, cuando la

línea que representa la mediana se situé en el centro de la caja estaremos ante una distribución

simétrica. Si se aproxima al Q3 la distribución será asimétrica negativa, y si se aproxima al

Q1, asimétrica positiva [100] lo cual es nuestro caso. La prolongación de los bigotes muestran

que no existe una equivalencia entre estos ya que el bigote inferior es de menor prolongación

que el bigote superior.

Curtosis, esta media queda representada en el BoxPlot por la relación entre la longitud de la

caja y la longitud de sus bigotes. Puesto que la caja representa el cuerpo central de los datos,

si es muy estrecha y sus bigotes son prolongados implica que los valores centrales están muy

concentrados o, lo que es lo mismo, la distribución es leptocúrtica [100].En nuestro caso sucede

lo contrario, la caja es muy ancha y los brazos muy estrechos, es decir que es menor es el

grado de apuntamiento de la distribución.

120

Gráfica 38. a. BoxPlot contrastando SQ vs VARIEDADES. b. BoxPlot contrastando SQ

vs TRATAMIENTOS.

Con relación a los valores anómalos, estos son los que están excesivamente alejados del

cuerpo central de la distribución y que, por este motivo, no son representativos del conjunto

de datos. Para ello se toma como unidad de medida la propia longitud de la caja, es decir, el

IQR [100].

Los Outliers son aquellos valores que se alejan del cuerpo central de la distribución entre 1.5

y 3 veces el valor del IQR; gráficamente, un outlier es una puntuación que se situa entre “una

caja y media” y “tres cajas” de del cuerpo central de los datos [, 00].en nuestro análisis tenemos

como outliers los valores de 103 que corresponde a 3087 SQ, 60 a 3256 SQ, 58 a 3654 SQ,

73 a 3721 SQ y 134 a 3808 SQ.

Los valores anómalos extremos son aquello que se alejan del cuerpo central de la distribución

más de 3 veces del valor del IQR [100], que en la gráfica se observa a 59 que corresponde a un

SQ de 6048, 75 con un SQ 4992, 104 con SQ de 4635 y 120 con un SQ de 4461.

Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente el BoxPlot nos da una distribución donde

los datos están concentrados en la caja y distribuidos en los bigotes, de manera asimétrica,

los datos con valores anómalos están generando en el BoxPlot la asimetría, pero no se sacaran

de los análisis ya que el interés de nuestra investigación son las sobreexpresiones de genes

que están representados en algunos de estos datos.

Las principales ventajas de los análisis de gráficas son la sencillez de interpretación, la

extensión a cualquier tipo de distribución y, en el caso de la distribución normal, la facilidad

de obtener el diagrama ya que está implementado en muchos paquetes estadísticos. Además,

no requieren muestras tan numerosas como algunos tests de normalidad.

121

10.2.3. Pruebas de significación

Debido a que el principal inconveniente de los análisis por gráficas es la subjetividad de la

interpretación visual, ya que al contrario de los tests de normalidad numéricos no se concluye

con una “p “ de probabilidad objetiva, por tal razón se procedió a realizar los test Anderson-

Darling.

Tabla 39. Pruebas de significación. Anderson-Darling

TEST VALOR TEST VALOR Pv

Anderson-Darling A = 19.817 p-value < 2.2e-16

La prueba Anderson-Darling es, en general, más potente que las pruebas χ2 de Pearson y la

de Kolmogorov-Smirnov; [101] es una prueba de bondad y ajuste, donde mide cuán lejos están

los puntos del grafico de la línea ajustada en un gráfico probabilistico (BoxPlot en nuestro

caso), el estadístico es una distancia al cuadrado ponderada de los puntos del grafico a la

línea ajustada con pesos mayores en las colas [103]. En particular, la prueba de Anderson-

Darling funciona mejor que cualquier otra, cuando hay casos extraordinarios o anómalos [101]

, por tal razón se escoge este test para determinar la distribución de los datos con un “p” valor.

La prueba de Anderson-Darling es una prueba omnibus EDF para la hipótesis compuesta de

normalidad. La estadística de prueba es

A = -n -\frac1n ∑_i=1^n [2i-1] [\ln(p_(i)) + \ln(1 - p_(n-i+1))],

Donde p _ (i) = Φ ([x _ (i) - \ overline x] / s). Aquí, Φ es la función de distribución acumulativa de la distribución

normal estándar, y \ overline x y s son la media y la desviación estándar de los valores de

los datos. El valor p se calcula a partir de la estadística modificada Z = A (1,0 + 0,75 / n +

2,25 / n ^ 2) \ según la Tabla 4.9 en Stephens (1986) [104].

Los valores p calculados a partir del estadístico ayudan a determinar qué modelo de

distribución se debe utilizar para un análisis de capacidad o un análisis de fiabilidad.

Las hipótesis para la prueba de Anderson-Darling son:

H0: Los datos siguen una distribución especificada.

H1: Los datos no siguen una distribución especificada.

El valor p para la prueba de Anderson-Darling es 2.2e-16 menor que el nivel de significancia

seleccionado (en este caso 0.05), por lo cual se concluye que los datos no siguen la

distribución especificada.

Teniendo en cuenta el histograma, el boxplot y el test de Anderson-Darling, llegamos a la

conclusión de que los datos no siguen una distribución específica o normal.

122

10.3. ANALISIS DE VARIANZA (ANOVA)

En ciertas situaciones experimentales, los grupos, muestras o unidades experimentales son

muy heterogéneas, debido a la presencia de factores genéticos, ambientales o de naturaleza

desconocida. Para estas situaciones el diseño de ANOVA más adecuado es el de bloques

aleatorizados. En un diseño de estas características, los individuos son agrupados en bloques,

contrayendo cada bloque una réplica de los tratamientos [104].

Por esta razón se realizó una prueba paramétrica de ANOVA con múltiples facetes, SQ

(número de copias), Gen (Hsp90, Hsp70, Hsp26.7, Hsp18 y Hsp16.9), tratamiento (TC, T1

y T2) y Variedad ( F473, MOCARÍ y Lv 1645) para la resolución de las hipótesis.

Figura 63. ANOVA de Bloques relacionando. SQ (número de copias), Gen (Hsp90,

Hsp70, Hsp26.7, Hsp18 y Hsp16.9), Tratamiento (TC, T1 y T2) y las Variedades (F473,

MOCARÍ y Lv 1645).

Según los niveles de significancia de la Figura X, observamos que entre la expresión de los

genes Hsp90, Hsp70, Hsp26.7, Hsp18 y Hsp16.9 si se generan diferencias significativas

debido a que el Pr es menor que el valor de significancia, es decir, Pr = 2.2e-16 < 0.001. Con

relación a los tratamientos TC, T1 y T2 se encuentra que existen diferencias significativas

entre ellos debido a que el Pr es menor que el valor de significancia, es decir, Pr = 4.235e-5

< 0.001. Por otro lado haciendo relación a la variedades estudiadas F473, MOCARÍ y Lv

1645 obtenemos que si existen diferencias significativas debido a que el Pr es menor que el

valor de significancia, es decir, Pr = 6.259e-5 < 0.001.

Observando las relaciones entre la expresión de cada gen y los tratamiento utilizados en el

experimento se observa que existen diferencias significativas entre cada uno de los

tratamientos con relación a la expresión del gen, debido a que el Pr es menor que el valor de

significancia, es decir, Pr = 0.0007537 < 0.001. Por otro lado teniendo en cuenta la relación

entre la expresión de los genes y la variedades del estudio tenemos que también existen

diferencias significativas ya que el Pr es menor que el valor de significancia, es decir, Pr =

123

0.0001765 < 0.001. Por ultimo teniendo en cuenta la relación entre los distintos tratamientos

utilizados y las variedades se observa que existen diferencias significativas debido a que el

Pr es menor que el valor de significancia, es decir, Pr = 0.0685944 < 0.1.

Por ultimo las relación entre los genes de estudio, los tratamiento a los que fue sometida cada

variedad y las variadas, se encuentran diferencia significativas entre sus medias debido a que

el Pr es menor que el valor de significancia, es decir, Pr = 0.0060544 < 0.01.

A continuación se presentan las gráficas de los BoxPlot, las gráficas básicas de diagnóstico,

el effect plot de cada relación.

En la gráfica 39 se observa los boxplot que ofrece una representación gráfica en la que se

distinguen la tendencia central, a la dispersión y la distribución de los datos de las variedades

utilizadas en nuestro experimento.

En la gráfica, se observa la relación entre las variedades objeto de estudio y los tratamientos.

La variedad F473 en el Q1 tiene valor de 209 y el Q3 con 704.4. Por lo tanto, el interior de

la caja contiene el 50% de los datos centrales de la muestra.

Gráfica 39. BoxPlot Variedades F473, MOCARÍ y Lv1645 vs Número de Copias (SQ).

La línea central representa el Q2 (327.3407) que coincide con la mediana de la distribución,

y la media con un valor 899.6649. El ancho de la caja es una medida de la variabilidad de

los datos, ya que se corresponde con el IQR (amplitud intercuartílica).Por tanto, cuanto

mayor sea la longitud de la caja, mayor será la dispersión de la distribución de datos [100],

para F473 corresponde a un valor de 580.7655. La asimetría del boxplot está dada por la

posición de la mediana en la caja. La línea que representa la mediana se aproxima al Q1,

asimétrica positiva lo cual es nuestro caso. La prolongación de los bigotes muestran que

no existe una equivalencia entre estos ya que el bigote inferior es de menor prolongación

que el bigote superior. A nivel de curtosis, la caja es muy ancha y los brazos muy estrechos,

124

es decir que es menor es el grado de apuntamiento de la distribución. Los Outliers en

nuestro análisis tenemos los valores marcados en la gráfica. Los valores anómalos

extremos son aquello que se alejan del cuerpo central de la distribución más de 3 veces del

valor del IQR [100], que se pueden observar bastantes en la gráfica.

Gráfica 40. BoxPlot Tratamientos TC (28 °C), T1 (35 °C) y T2 (42 °C) vs Número de

Copias (SQ).

Por otra parte la variedad Lv 1645 en el Q1 tiene valor de 189.7 y el Q3 con 406.7, por lo

tanto, el interior de la caja contiene el 50% de los datos centrales de la muestra. La línea

central representa el Q2 (187.4995) que coincide con la mediana de la distribución, y la media

con un valor 511.2233. El ancho de la caja es una medida de la variabilidad de los datos, ya

que se corresponde con el IQR (amplitud intercuartílica). Por tanto, cuanto mayor sea la

longitud de la caja, mayor será la dispersión de la distribución de datos [100], para Lv 1645

corresponde a un valor de 359.3213. La asimetría del boxplot está dada por la posición de la

mediana en la caja. La línea que representa la mediana se aproxima al Q1, asimétrica positiva

lo cual es nuestro caso. La prolongación de los bigotes muestran que no existe una

equivalencia entre estos ya que el bigote inferior es de menor prolongación que el bigote

superior. A nivel de curtosis, la caja es muy ancha y los brazos muy estrechos, es decir que

es menor es el grado de apuntamiento de la distribución. Los Outliers en nuestro análisis

tenemos los valores marcados en la gráfica. Los valores anómalos extremos son aquello que

se alejan del cuerpo central de la distribución más de 3 veces del valor del IQR [100]., que se

pueden observar bastantes en la gráfica.

Por ultimo para la variedad MOCARÍ en el Q1 tiene valor de 207 y el Q3 con 764.4. Por lo

tanto, el interior de la caja contiene el 50% de los datos centrales de la muestra. La línea

central representa el Q2 (323.5937) que coincide con la mediana de la distribución, y la media

con un valor 895.9213. El ancho de la caja es una medida de la variabilidad de los datos, ya

125

que se corresponde con el IQR (amplitud intercuartílica). Por tanto, cuanto mayor sea la

longitud de la caja, mayor será la dispersión de la distribución de datos [100], para MOCARÍ

corresponde a un valor de 572.6382. La asimetría del boxplot está dada por la posición de la

mediana en la caja. la línea que representa la mediana se aproxima al Q1, asimétrica positiva

lo cual es nuestro caso. La prolongación de los bigotes muestran que no existe una

equivalencia entre estos ya que el bigote inferior es de menor prolongación que el bigote

superior. A nivel de curtosis, la caja es muy ancha y los brazos muy estrechos, es decir que

es menor es el grado de apuntamiento de la distribución. Los Outliers en nuestro análisis

tenemos los valores marcados en la gráfica. Los valores anómalos extremos son aquello que

se alejan del cuerpo central de la distribución más de 3 veces del valor del IQR [100],

Por otro lado en la gráfica 40, se observa los boxplot que ofrece una representación gráfica

en la que se distinguen la tendencia central, al dispersión y la distribución de los datos de los

tres tratamientos utilizados en nuestro experimento.

En el TC tratamiento control, en el Q1 tiene valor de 96.6 y el Q3 con 352.1, por lo tanto, el

interior de la caja contiene el 50% de los datos centrales de la muestra. La línea central

representa el Q2 (180.3018) que coincide con la mediana de la distribución, y la media con

un valor 899.6649. El ancho de la caja es una medida de la variabilidad de los datos, ya que

se corresponde con el IQR (amplitud intercuartílica). Por tanto, cuanto mayor sea la longitud

de la caja, mayor será la dispersión de la distribución de datos [100], para TC corresponde a

un valor de 134.7332. La asimetría del boxplot está dada por la posición de la mediana en la

caja, la línea que representa la mediana esta central por lo cual es simétrica. La prolongación

de los bigotes muestran que existe una equivalencia entre estos ya que el bigote inferior de

igual prolongación que el bigote superior. A nivel de curtosis, la caja es muy ancha y los

brazos muy estrechos, es decir que es menor es el grado de apuntamiento de la distribución.

Los Outliers en nuestro análisis tenemos los valores marcados en la gráfica. Los valores

anómalos extremos son aquello que se alejan del cuerpo central de la distribución más de 3

veces del valor del IQR [100], que se pueden observar bastantes en la gráfica.

Para el T1 tratamiento 1, en el Q1 tiene valor de 352.1 y el Q3 con 876.3, por lo tanto, el





de la caja, mayor será la dispersión de la distribución de datos [100], para T1 corresponde a un

valor de 483.1863 La asimetría del boxplot está dada por la posición de la mediana en la caja.

la línea que representa la mediana se aproxima al Q1, asimétrica positiva lo cual es nuestro

caso. La prolongación de los bigotes muestran que no existe una equivalencia entre estos ya

que el bigote inferior es de mayor prolongación que el bigote superior. A nivel de curtosis,

la caja es muy ancha y los brazos muy estrechos, es decir que es menor es el grado de

apuntamiento de la distribución. Los Outliers en nuestro análisis tenemos los valores

marcados en la gráfica. Los valores anómalos extremos son aquello que se alejan del cuerpo

126

central de la distribución más de 3 veces del valor del IQR [100], que se pueden observar

bastantes en la gráfica.

Para el T2 tratamiento 2, en el Q1 tiene valor de 344.1 y el Q3 con 1026.4, por lo tanto, el





de la caja, mayor será la dispersión de la distribución de datos [100], para T2 corresponde a un

valor de 638.0876. La asimetría del boxplot está dada por la posición de la mediana en la

caja. La línea que representa la mediana se aproxima al Q1, asimétrica positiva lo cual es

nuestro caso. La prolongación de los bigotes muestran que no existe una equivalencia entre

estos ya que el bigote inferior es de mayor prolongación que el bigote superior. A nivel de

curtosis, la caja es muy ancha y los brazos muy estrechos, es decir que es menor es el grado

de apuntamiento de la distribución. Los Outliers en nuestro análisis tenemos los valores

marcados en la gráfica. Los valores anómalos extremos son aquello que se alejan del cuerpo

central de la distribución más de 3 veces del valor del IQR [100], que se pueden observar

bastantes en la gráfica.

En la gráfica 4 1 tenemos, la gráfica de los residuos frente a los datos ajustados donde se

representa los residuos (diferencias entre el valor real y el valor ajustado/predicho) frente a

los valores ajustados. Si la regresión es simple (Y = a + bX), sería equivalente a un gráfico

de residuos frente a la variable independiente (X). por tal razón si un punto está relativamente

muy por encima o muy por debajo de la recta horizontal, es un valor atípico (aparecen

destacados en el gráfico con sendas etiquetas) [104] en nuestro caso corresponden a los puntos

59, 74 y 75 etiquetados por el programa los cuales corresponden a 59 = F473 en el

Tratamiento 1 la extracción de las 13:10 para la proteínas Hsp16.9 con un SQ de 6048, 74 =

MOCARÍ en el tratamiento 1 en la extracción de las 13:10 para la proteína Hsp16.9 con un

SQ de 2078 y 75 = MOCARÍ en el tratamiento 1 en la extracción de las 15:10 en la proteína

Hsp16.9 con un SQ de 4999.

La gráfica de los residuos tipificados frente a cuantiles teóricos (de una distribución

gausiana), en una hipótesis de los modelos de regresión habituales una hipótesis es que los

residuos tienen distribución gausiana (normal). El gráfico cuantil-cuantil diagnostica el

cumplimiento de esa hipótesis. En el caso perfecto, todos los puntos estarían en línea recta.

Las desviaciones de la recta suelen apreciarse en los puntos de los extremos. Los puntos que

más se desvían de la hipótesis aparecen destacados con sendas etiquetas identificativas [104]

por lo cual los puntos que se representan en la desviación de los datos son los mismos de la

gráfica anterior 54, 74 y 75.

Por otra parte en la gráfica de escala-posición, que se define como la raíz de valor absoluto

de residuo frente a valores ajustados, cabe destacar que, en contraste con la primera gráfica,

en ésta se toma el valor absoluto, para comparar la magnitud del residuo independientemente

127

del sentido arriba/abajo; y se toma la raíz cuadrada para disminuir la asimetría, que suele

dificultar la interpretación. Por lo anterior, puede facilitar la diagnosis de la

homoscedasticidad. Sin embargo, puede dificultar la diagnosis de linealidad, precisamente

por las trasformaciones a que se someten los residuos [104].

Gráfica 41. Básica de Diagnostico. 1. Residuos Frente a Ajustados. 2. Residuos

tipificados frente a cuantiles teórico. 3. Escala-posición: raíz de valor absoluto de residuo

frente a valores ajustados. 4. Residuos tipificados frente a palancaje.

Por último la gráfica de residuos tipificados frente a palancaje, es una medida de la influencia

que tiene un punto en el cálculo de los coeficientes del modelo. El palancaje se basa en la

aportación del punto a las varianzas de las variables independientes. Por tal razón los puntos

a la derecha de la gráfica tienen gran palancaje. Tales puntos poseen una influencia notable

si el residuo correspondiente se separa mucho del cero; en concreto, se suele considerar muy

influyente si supera la distacia de Cook igual a 1 (que se corresponde con una de las líneas

rojas de la gráfica). Los puntos notables aparecen destacados con su etiqueta [104] que en

nuestro caso son los puntos 54, 74 y 75, cabe destacar en esta gráfica podemos concluir que

el gen que codifica a la proteína Hsp16.9 tiene gran expresión y hace que los datos en

contraste con los demás genes no se mantengan en una linealidad lo cual da a comprender

que presenta gran expresión de este gen en respuesta al estrés térmico.

La Gráfica de efectos principales (gráfica 42) se utiliza con el fin de ver cómo uno o más

factores categóricos influyen en la respuesta continua. Donde se observa la influencia de los

tratamientos en las distintas variedades de lo cual tenemos como resultado que la variedad

que más influencia presenta en la expresión de genes que codifica a proteínas de choque

térmico (Hsp) es la variedad F473 seguida de la variedad MOCARÍ y Lv 1645. En relación

a las proteínas observamos que la que mayor expresión presenta en todas las variedades es

Hsp16.9 seguida de Hsp26.7, Hsp18, Hsp90 y Hsp70.

128

La variedad F473 en el tratamiento control a 28 °C observamos una expresión media para los

genes Hsp90, Hsp70, Hsp26.7 y Hsp18, y para Hsp16.9 observamos una gran expresión. En

el tratamiento 1 a 35 °C se observa un aumento en la expresión de Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7

y Hsp70 mientras Hsp90 se mantiene. Entre los parámetros de la media del tratamiento

control. En el tratamiento 2 42 °C observamos que la expresión de estos genes disminuye

excepto el gen Hsp26.7 el cual aumenta con relación al tratamiento control y 1.

Gráfica 42. Gráfica de efectos. Relación entre las medias de Variedad, Tratamiento y

Gen.

La variedad MOCARÍ en el tratamiento control observamos una expresión media para los


el tratamiento 1 se observa un aumento en la expresión de Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7 y Hsp70

mientras Hsp90 se mantiene. Entre los parámetros de la media del tratamiento control. En el

tratamiento 2 observamos que la expresión de estos genes disminuye excepto el gen Hsp26.7

el cual aumenta con relación al tratamiento control y 1 y el gen Hsp16.9 que mantiene su

expresión.

La variedad Lv 1645 en el tratamiento control observamos una expresión media para los


el tratamiento 1 se observa un aumento no significativo en la expresión de Hsp16.9, Hsp18,

Hsp26.7 y Hsp70 mientras Hsp90 se mantiene. Entre los parámetros de la media del

tratamiento control. En el tratamiento 2 observamos que la expresión de estos genes

disminuye excepto el gen Hsp26.7 el cual aumenta con relación al tratamiento control y 1.

En conclusión el aumento de la expresión del gen Hsp16.9 se da en el tratamiento 1 a en las

variedades F473 y MOCARÍ mientras en Lv 1645 existe la sobre expresión pero no de

manera significativa. Con relación a Hsp 26.7 tiene una expresión mayor en los el tratamiento

2 en las tres variedades de estudio. El gen Hsp18 mantiene una expresión no significativa en

sus medias entre el tratamiento control, aumenta en el tratamiento 1 pero se mantiene en el

129

tratamiento 2 en las tres variedades y los genes Hsp70 y 90 presentan cambios no

significativos en la expresión a los diferentes tratamientos.

10.4. CORROBORACIÓN DE HIPÓTESIS

Según el análisis anterior obtenemos los resultados necesarios para determinar que el

planteamiento de cada una de las hipótesis. Con relación a la hipótesis de variedades

rechazamos la hipótesis nula (H0): “el estrés por alta temperatura no genera diferencias en la

expresión de genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18,

Hsp26.7) Hsp70 y Hsp 90 en las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645

irradiadas con 60Co” y aceptamos la hipótesis alterna (H1): “el estrés por alta temperatura si

genera diferencias en la expresión de genes que codifican las proteínas de choque térmico

sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18, Hsp26.7) Hsp70 y Hsp 90 en las variedades Fedearroz 473,

Fedearroz Mocarí y Lv 1645 irradiadas con 60Co”. Con relación a las hipótesis planteadas

según el tratamiento determinamos que rechazamos la hipótesis nula (H0): las variedades

Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 no presentan diferencias significativas en la

expresión de genes que codifican las proteínas de choque térmico sHsp’s (Hsp16.9, Hsp18,

Hsp26.7) Hsp70 y Hsp 90 en los diferentes tratamientos (TC, T1 y T2) y aceptamos la

hipótesis alterna (H1): “las variedades Fedearroz 473, Fedearroz Mocarí y Lv 1645 si



tratamientos (TC, T1 y T2)”.

130

11. CONCLUSIONES

Los tres genotipos F473, Mocarí Lv 1645 no presentan diferencias significativas en el

crecimiento de las plántulas durante las cuatro horas de exposición al estrés térmico por altas

temperaturas (28, 35 y 42°C).

Una dosis de 60 Gy de 60Co genera alteraciones físicas en las variedades Mocarí y Lv 1645,

en la primera se produce despigmentación conocido como maculata y en la segunda se

originan líneas blancas longitudinales y despigmentación en las puntas de las hojas conocido

como estriata.

La expresión de proteínas de choque térmico (Hsp) en los tres genotipos incrementa a medida

que aumenta la temperatura como mecanismo de protección de la plántula frente alteraciones

que se puedan originar a nivel bioquímico, fisiológico y morfológico que comprometan el

crecimiento, desarrollo y rendimiento del cultivo.

En los tres tratamientos de las tres variedades, los niveles de expresión más altos

corresponden a las proteínas de choque térmico de bajo peso molecular (sHsp) Hsp16.9,

Hsp26.7 y Hsp18, alcanzando valores de hasta 6000 copias.

Los niveles de expresión más bajos los presentan las proteínas de choque térmico de alto

peso molecular Hsp70 y Hsp90, aunque su expresión incrementa al aumentar la temperatura

sus valores no sobrepasan de manera significativa los niveles de la muestra estándar utilizada.

Aunque las expresiones más altas en cada una de las variedades corresponden a sHsp

(Hsp16.9, Hsp18, hsp26.7) y los más bajos a Hsp70 y Hsp90, se encuentran diferencias en

los niveles de expresión de los cinco genes entre las variedades y los tratamientos.

La variedad con los niveles de expresión más altos es Fedearroz 473, seguido de Mocarí y el

más bajo lo presenta Línea avanzada 1645.

La expresión más baja se generó en el TC, e incrementando en el T1 y T2 de acuerdo al gen

y el genotipo.

La expresión de estos genes está relacionada con la tolerancia a altas temperaturas, siendo

Fedearroz 473 tolerante, Mocarí resistente y Línea avanzada 1645 susceptible a altas

temperaturas.

Las variedades F473, Mocarí, Lv 1645 presentan un perfil proteico donde la intensidad de

las bandas cambia de una variedad a otra y de los momentos de extracción. Se logra observar

bandas cercanas a 90 kDa, 75kDa, 26 kDa y 18 kDa y 16 kDa, que pueden estar relacionadas

con los pesos moleculares de las proteínas de interés.

131

Las tres variedades F473, Mocarí y Lv1645 presentan un perfil proteico, en el tratamiento 1

y en el tratamiento 2, pero con una intensidad mayor en cada una de las bandas. La variedad

Mocarí presenta menor cantidad de proteínas totales con respecto a F473 y Lv1645.

En el TC, T1 y T2 se presenta la banda característica de 50 kDa con el ración al marcador de

peso donde la variedad Lv 1645 presenta mayor intensidad, seguido de F473 y siendo Mocarí

la que menor visibilidad presenta.

En las tres variedades se logran apreciar las bandas de interés, siendo de 90 kDa, 70 kDa, 26

kDa, 18 kDa y 16 kDa. La variedad F473 y Mocarí presentan la mayor cantidad de proteínas

en la extracción 2, al contrario de Lv 1645 que presenta una cantidad similar en las tres

extracciones.

132

12. RECOMENDACIONES

Se recomienda para próximos proyectos:

1. Escoger variedades que presenten una tasa de germinación alta, lo que facilite el

proceso de germinación e investigación.

2. Evaluar la expresión de los genes (sHsp; Hsp16.9, Hsp18 y Hsp26.7) en diferentes

estadios de crecimiento de Oryza sativa a 28 y 35°C.

3. Se recomienda hacer una evaluación de los genes (sHsp; Hsp16.9, Hsp18 y Hsp26.7)

en diferentes estadios de crecimiento de Oryza sativa a 28 y 35°C en campo, ya que

de esta manera se pueden obtener valores más precisos teniendo en cuenta las

variables no controladas en fase campo, como humedad, cambios de temperatura,

adaptación a las tierras, uso de fertilizantes y demás.

4. Se recomienda evaluar la expresión de los genes (sHsp; Hsp16.9, Hsp18 y Hsp26.7)

en variedades de arroz Colombiano sin irradiar para así determinar las diferencias que

se presentan a diferentes temperaturas.

5. Se recomiendo realizar un perfil proteico en 2 dimensiones para revisar con exactitud

la expresión de la proteína de interés.

133

13. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Gen: Hsp16.9

Cebador Secuencias Tm %G/C Pb

Forward 5’-TACCACCGCTGTGTTGAAAG-3’ 63 50 104

https://books.google.com.co/books?id=SaGNZ9CDle0C&pg=PA42&dq=prueba+anderson-darling&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwiq5KKQjPbUAhUDRiYKHXyqBbcQuwUIJzAB#v=onepage&q=prueba%20anderson-darling&f=false



http://www.rstudio.com/

144

Reverse 3’-TCTCGTGACTCTCATCCTTATCC-

5’ 68 47.8

Secuencia CDS: >LOC_Os01g04270.1

ATGGCATCCGCCGCTGCGCCAGGGAGACCCGGCCTCTGCTGCGTCGTTGTGCTA

GTGGCCACCACAATGCTGGGAGACGTGCCCGCCACTGCATGGCCACCGTGCTG

CCGCCATGTCGAGGAGCCACATCTACCACCGCTGTGTTGAAAGATGGGAGAGA

GGTGCGGAGAGAGAAGTGCAGAGGGAAGGAAACAAGGCGGGAGGACAAAGA

GGATAAGGATGAGAGTCACGAGACTTAA

Gen: Hsp18


Forward 5’- AGGAGGAGTCGTGCAAGTA-3’ 62 52.8 106

Reverse 3’-CGATGGTCTTGGGCTTCTT-5’ 62 61.1


ATGGAGAGCGCCATGTTCGGGCTGGAGACGCCGCTGATGACGGCGCTGCAGCA

CCTGCTCGACATCCCCGACGGCGAGGGCGGCGCCGCCGGGAAGCAGGGCGCG

ACCGGTGGCCCGACGCGTGCGTACGTGCGCGACGCCCGCGCCATGGCGGCGAC

CCCCGCCGACGTGAAGGATCTGCCCGGGGCGTACGCGTTCGTGGTGGACATGC

CTGGGCTCAAGTCCTCCGACATCAAGGTGCAGGTGGAGGAGGAGAGGCTGCTG

GTGATCAGCGGGGAGCGGCGGCGCGGCGGCGGGGAGGAGGAGAAGGAGGAGT

CGTGCAAGTACCTGCGGATGGAGCGGCGGATGGGCAAGTTCATGCGCAAGTTC

GTGCTCCCCGACAACGCCGACGTCGACAAGATCTCCGCCGTGTGCCAGGACGG

CGTGCTCACCGTCACCGTCGAGAAGCTCCCGCCGCCGGAGCCCAAGAAGCCCA

AGACCATCGAGGTCAAGGTCGCGTGA

Gen: Hsp26.7


Forward 5’-GAGGATGCGGTTCGACAT-3’ 62 55.6 105

Reverse 3’-TCGCCCTCCTCCTTCTT-5’ 62 58.8


ATGGCTGCTCCATTCGCTCTCGTCAGCCGTGTCTCGCCAGCGGCGCGCCTCCCC

ATCCGCGCCGCCTGGAGGAGGGCGAGGCCGACGGTCGGGCTCCCGTCCTCGGG

GAGGGCCCGCCAGCTCGCCGTGGCCTCCGCGGCGCAGGAGAACAGGGACAAC

ACCGCCGTCGATGTCCACGTCAACCAGGACGGCGGGAACCAGCAGGGGAACG

145

CCGTGCAGCGCCGCCCGCGCCGCTCGTCGGCGTTGGACGGCATCTCCCCGTTCG

GCCTCGTGGACCCGATGTCGCCGATGCGGACGATGCGGCAGATGCTGGACACG

ATGGACCGGATTTTCGACGACGTCGCGCTGGGGTTCCCCGCCACGCCGCGGAG

GTCGCTGGCGACGGGGGAGGTGCGGATGCCGTGGGACGTCATGGAGGACGAC

AAGGAGGTGAGGATGCGGTTCGACATGCCGGGCCTGTCGCGGGAGGAGGTGA

AGGTGATGGTGGAGGACGACGCGCTCGTCACCGCGGGGAGCACAAGAAGGAG

GAGGGCGAGGGCGCGGAGGGCTCCGGCGACGGGTGGTGGAAGGAGCGCAGCG

TGAGCTCCTACGACATGCGGCTCGCGCTCCCCGACGAGTGCGACAAGAGCAAG

GTCCGCGCCGAGCTCAAGAGGCGTGCTGCTCGTCACCGTGCCCAAGACGGAGG

TGGAGCGCAAGGTCATCGACGTGCAGGTCCAGTAG

Gen: Hsp70


Forward 5’-CGTCTCATTGGCAGGAGGTT-3’ 57.0 55 446

Reverse 3’-TCTTCACCACCAAGATGGGT-5’ 55.6 50

Secuencia CDS: >X67711.2.

CCAAGCGTCTCATTGGCAGGAGGTTTAGCGATGCTTCTGTTCAGAGTGACATTA

AGCTCTGGCCCTTCAAGGTGATTGCTGGACCTGGTGACAAGCCTATGATTGTTG

TCCAGTACAAGGGTGAGGAGAAGCAGTTTGCTGCCGAAGAGATCTCCTCCATG

GTCCTCATCAAGATGCGTGAGATTGCTGAGGCCTACCTTGGCACCACCATCAAG

AATGCCGTTGTCACTGTTCCTGCCTACTTCAATGACTCCCAGAGGCAGGCCACC

AAGGATGCTGGAGTGATTGCTGGTCTCAATGTCATGCGCATCATCAACGAGCC

AACTGCTGCCGCTATTGCCTATGGTCTTGACAAGAAGGCCACAGCGTTGGTGA

GAAGAATGTCCTCATCTTTGACCTTGGAGGTGGTACCTTTGATGTTTCCCTCCTT

ACCATTGAGGAGGGTATCTTTGAGGTCAAGGCCACAGCTGGTGACACCCATCT

TGGTGGTGAAGATTTTGACAACCGCATGGTCAACCACTTTGTGCAAGAATTCAA

GAGGAAGAACAAGAAGGATATCACTGGCAACCCCAGGGCTCTCAGGAGGTTG

AGGACAGCTTGTGAGAGGGCGAAGAGGACCCTGTCCTCCACTGCCCAGACCAC

CATTGAGATCGATTCCTTGTATGAGGGCATCGATTTCTACTCAACCATCACCCG

TGCCAGGTTTGAGGAGCTCAACATGGATCTCTTCAGGAAGTGTATGGAGCCTGT

GGAGAAGTGCCTCAGGGATGCTAAGATGGACAAGAGCTCTGTTCATGATGTTG

TTCTTGTTGGTGGCTCCACTAGGATCCCGAGGGTGCAGCAGCTCCTGCAGGATT

TCTTCAACGGCAAGGAGCTTTGCAAGAACATCAACCCAGATGAGGCTGTTGCT

TATGGTGCTGCTGTCCAGGCTGCCATCTTGAGTGGTGAGGGCAACGAGAAGGT

CCAGGACCTCCTCCTGTTGGATGTTACCCCTCTTTCTCTCGGTTTGGAGACTGCT

GGTGGTGTCATGACCGTCTTGATCCCAAGGAACACCACCATTCCCACCAAGAA

GGAGCAGGTCTTCTCCACCTACTCTGACAACCAGCCTGGTGTGCTCATCCAGGT

TTATGAGGGTGAGAGGACCAGGACACGTGACAACAACCTGCTGGGCAAGTTTG

AGCTCTCTGGAATCCCTCCTGCTCCCAGGGGTGTTCCACAGATCACTGTTTGCT

146

TCGACATTGATGCCAATGGTATCCTGAACGTGTCTGCTGAGGACAAGACCACC

GGGCAGAAGAACAAGATCACCATCACCAACGACAAGGGCAGGCTCAGCAAGG

AGGAGATTGAGAAGATGGTCCAGGGGGCCGAGAAGTACAAGTCAGAGGATGA

GGAGCACAAGAAGAAGGTGGAGTCCAAGAACGCGCTGGAGAACTACGCCTAC

AACATGCGCAACACCATCAAGGATGAGAAGATCGCCTCGAAGCTCCCGGCAGC

GGACAAGAAGAAGATCGAGGATGCCATCGACCAGGCCACCAGTGGCTGGACG

GCAACCAGCTCGCTGAGGCTGATGAGTTCGATGACAAGATGAAGGAGCTGGAG

GGCATCTGCAACCCCATCATCGCCAAGATGTACCAGGGCGCTGGCGCGGACAT

GGCCGGCGGCATGGACGAGGACGATGCTCCCCCGGCTGGCGGCAGCGGTGCTG

GCCCCAAGATCGAGGAGGTCGACTAAGCGCCAAATTTGGTTAAAAACTTGGGC

ATGAGTTCGAAACCTACAGATTTGGGGCTGAACTTTGGTTAGGTGATCCGCGCT

TCAAGTTATCTTATTGCATTATCAGTGTCTCTTTATTAGTTGTGTTAAAAACTTG

GGGATTATGTGGTGCTATGGTACCTTTTGGTCTGTTTGGGCAGTCTATTTGAAG

AACTTCGTTGGGAGCTCTATTGATCTC

Gen: Hsp90


Forward 5′-CACTCTACAGCAACAAGGAC-3′ 53.1 50 459

Reverse 5′-CACGTACTCCT-TGGCTTCAT-3′ 54.4 50

Secuencia CDS: >AB037681

ATGCGCAAGTGGGCGCTCTCCTCCGCGCTCCTCCTCCTCCTCCTCACCACACTC

CCCGATCCAGCTAAGAAGCTCCAAGTCAATGCTGATGACAGCACTGATGAGTT

AGTTGATCCGCCGAAGGTAGAGGAGAAGATTGGTGGTGTTCCCCATGGCCTGT

CCACGGACTCTGAGGTTGTTCAGAGGGAGGCTGAGTCAATCTCGAGGAAGACC

CTCAGGAGCTCAGCGGAGAAATTTGAGTTCCAGGCTGAGGTGTCCAGACTCAT

GGACATCATCATCAACTCACTCTACAGCAACAAGGACATTTTCCTGAGGGAGC

TCATCTCCAATGCTTCTGATGCTTTGGACAAGATTAGGTTCCTGGTCTCACTGAT

AAGGAGGTTTTGGGCGAAGGTGACACTGCTAAGCTTGAAATCCAGATTAAGCT

GGATAAGGAGAAGAAGATTCTCTCCATTCGGGATAGGGGTATTGGTATGACCA

AGGAAGATCTCATTAAGAACCTTGGGACCATTGCCAAATCTGGAACTTCAGCTT

TTGTGGAAAAGGTGCAGACTGGGGGTGACCTCAATCTCATTGGGCAATTGGTG

TTGGTTTCTATTCAGTATACTTGGTTGCTGACTATGTTGAAGTGATCAGCAAGC

ACAATGACGACAAACGCATGTCTGGGAGTCCAAAGCTGATGGATCATTCGCTA

TCTCTGAGGATACATGGAATGAACCCCTGGGCCGTGGAACTGAAATAAGACTG

CACCTCCGAGATGAAGCCAAGGAGTACGTGGAAGAAGACAAGCTAAAGGATT

TGGTGAAGAAGTACTCTGAGTTCATCAATTTCCCCATTTACTTGTGGGCAACCA

AGGAGGTTGATGTGGAAGTGCCGCTGATGAGGATGAGTCAAGTGAATCAAGTG

147

AAGAAGAGGAATCATCCCCTGAGTCTACAGAGGAAGAAGAGACAGAAGAGGG

TGAAGAGAAGAAGCCCAAGACAAAGACAGTAAAGGAAACCACTACTGAGTGG

GAGCTTCTGAATGATGTGAAGGCTATATGGCTTCGTAGCCCTAAGGAGGTTACT

GAAGAAGAATACACAAAGTTTTACCACTCACTTGCTAAGGACTTTGGTGATGA

CAAGCCCTTGTCTTGGAGCCACTTCACTGCTGAGGGAGATGTTGAGTTCAAAGC

TTTGCTCTTTGTTCCTCCCAAGGCTCCACATGATCTCTATGAGAGTTACTACAAC

TCTAACAAGTCAAACCTTAAGTTGTATGTTAGAAGGGTTTCCATCTCTGATGAA

TTTGATGAGCTTCTTCCGAAGTATCTCAGCTTTTGAAGGGTCTCGTCGACTCGG

ACACATTGCCTCTCAATGTATCACGAGAAATGCTCCAACAACATAGTAGCCTG

AAGACCATCAAGAAGAAACTAATCCGCAAAGCTCTTGACATGATTAGAAAACT

TGCTGAGGAAGATCCTGATAGTACAGCAACAAAGATAAGACAGATGAAGAAA

AAAGTGCAATGGAGGAGAAAAAGGGCCAGTATGCCAAGTTCTGGAATGAGTTT

GGAAAATCAGTCAAGTTGGGCATCATTGAAGACGCAACTAACAGGAACCGTCT

TGCAAAGCTTCTGAGATTTGAAAGTACCAAGTCGGAAGGCAAACTTGCCTCTCT

TGATGAGTACATTTCAAGGATGAAGCAGGGCAGAAGGACATCTTTTACATTAC

CGGAAGCAGCAAGGAACAATTAGAGAAATCACCGTTCCTTGAGAGGCTAACCA

AAAAGAACTACGAGGTTATCTACTTCACTGACCCTGTTGACGAGTACTTGATGC

AATACCTCATGGACTACGAGGACAAGAAGTTCCAGAACGTCTCCAAGGAGGGT

CTCAAACTCGGCAAGGACTCTAAGCTCAAGGACCTCAAGGAGTCCTTCAAGGA

GCTGACCGACTGGTGGAAGAAGGCTCTTGACACCGAGAGCGTGGACTCGGTGA

GATCAGCAACCGGCTGAGCGACACCCCCTGCGTGGTGGTGACATCCAAGTACG

GGTGGAGCGCCAACATGGAGAAGATCATGCAGTCACAGACCCTCTCGGATGCC

AGCAAGCGGCGTACATGCGCGGCAAGAGGGTACTCGAGATCAACCCCAGGCA

CCCCATCATCAAGGAACTCCGTGACAAGGTCGCCCAGGACAGCGAGAGCGAGA

GCTTGAAGCAGACGGCGAAGCTGGTGTACCAGACGGCCCTCATGGAGAGCGGC

TTCAACCTCCCTGATCCCAAGGACTTCGCCTTCAGCATCTACAGGTCGGTGCAG

AAGAGCCTTGACCTGAGCCCCGACGCGGCCGTGGAAGAGGAAGAGGAGGTCG

AGGAGGCCGAGGTTGAAGAGAAGGAATCATCCAACATCAAGGAGGAGGCGGA

GCCGTCGTCGTATGATAAGGACGAGCTGTAG

148

Anexo 2. Protocolo de extracción de ADN en plantas

151

Anexo 3. Cuantificación de ADN

152

Anexo 4. Kit PCR

153

Anexo 5. Extracción de ARN en plantas

154

Anexo 6. Kit qRT-PCR

155

Anexo 7. Tinción con Azul de coomasie.

Retirar los vidrios de la cámara

Colocar en 100 mL de solución fijadora y con cuidado retirar los vidrios

Dejar el gel 30 minutos en la solución con agitación constante y conservar.

Descartar la solución fijadora y agregar 100 mL de solución tinción

Dejar el gel toda la noche bien tapado

Retirar la solución tinción

Agregar 100 mL de agua destilada y colocar en agitación constante por 30 minutos

Retirar el agua

Agregar ácido acético al 30% para desteñir por 30 minutos en agitación constante. Realizar

hasta que no se observe coloración, ni ruido en el gel.

Retirar el ácido acético y agregar 100 mL de solución por 15 minutos

Descartar y agregar solución secante por 10 minutos.

156

Anexo 8. Cuantificación extracciones de ARN

Anexo 9. Tabla Análisis Estadístico

"VARIEDAD" "TRATAMIENTO" "EXTRACCION" "GEN" "SQ"

"1" "F473" "TC" "11:10" "HSP90" 112.719745617551

"2" "F473" "TC" "13:10" "HSP90" 150.660706618674

"3" "F473" "TC" "15:10" "HSP90" 48.0839348449729

"4" "F473" "TC" "11:10" "HSP70" 143.879857825585

"5" "F473" "TC" "13:10" "HSP70" 158.854674859778

"6" "F473" "TC" "15:10" "HSP70" 41.5910610494022

"7" "F473" "TC" "11:10" "HSP26.7" 180.301774085957

"8" "F473" "TC" "13:10" "HSP26.7" 188.36490894898

"9" "F473" "TC" "15:10" "HSP26.7" 92.4698173938223

"10" "F473" "TC" "11:10" "HSP18" 210.377843976648

"11" "F473" "TC" "13:10" "HSP18" 218.2729911843

"12" "F473" "TC" "15:10" "HSP18" 79.7994687267977

"13" "F473" "TC" "11:10" "HSP16.9" 2082

"14" "F473" "TC" "13:10" "HSP16.9" 1914

"15" "F473" "TC" "15:10" "HSP16.9" 1129

"16" "MOCARÍ" "TC" "11:10" "HSP90" 101.62486928707

"17" "MOCARÍ" "TC" "13:10" "HSP90" 153.461698279929

"18" "MOCARÍ" "TC" "15:10" "HSP90" 211.348903983665

"19" "MOCARÍ" "TC" "11:10" "HSP70" 112.201845430196

157

"20" "MOCARÍ" "TC" "13:10" "HSP70" 144.543977074593

"21" "MOCARÍ" "TC" "15:10" "HSP70" 245.470891568503

"22" "MOCARÍ" "TC" "11:10" "HSP26.7" 152.756605823807

"23" "MOCARÍ" "TC" "13:10" "HSP26.7" 250.610925303211

"24" "MOCARÍ" "TC" "15:10" "HSP26.7" 247.742205763329

"25" "MOCARÍ" "TC" "11:10" "HSP18" 180.717412601093

"26" "MOCARÍ" "TC" "13:10" "HSP18" 260.015956316527

"27" "MOCARÍ" "TC" "15:10" "HSP18" 339.625272590409

"28" "MOCARÍ" "TC" "11:10" "HSP16.9" 1934

"29" "MOCARÍ" "TC" "13:10" "HSP16.9" 2683

"30" "MOCARÍ" "TC" "15:10" "HSP16.9" 2811

"31" "LV1645" "TC" "11:10" "HSP90" 208.929613085404

"32" "LV1645" "TC" "13:10" "HSP90" 53.8269782516289

"33" "LV1645" "TC" "15:10" "HSP90" 147.910838816821

"34" "LV1645" "TC" "11:10" "HSP70" 146.217717445672

"35" "LV1645" "TC" "13:10" "HSP70" 36.5594791613125

"36" "LV1645" "TC" "15:10" "HSP70" 187.499450806742

"37" "LV1645" "TC" "11:10" "HSP26.7" 85.310011401759

"38" "LV1645" "TC" "13:10" "HSP26.7" 36.3915036127207

"39" "LV1645" "TC" "15:10" "HSP26.7" 115.877735615513

"40" "LV1645" "TC" "11:10" "HSP18" 221.819641980022

"41" "LV1645" "TC" "13:10" "HSP18" 127.643880881134

"42" "LV1645" "TC" "15:10" "HSP18" 155.955250282695

"43" "LV1645" "TC" "11:10" "HSP16.9" 2000

"44" "LV1645" "TC" "13:10" "HSP16.9" 1263

"45" "LV1645" "TC" "15:10" "HSP16.9" 1554

"46" "F473" "T1" "11:10" "HSP90" 202.301917867827

"47" "F473" "T1" "13:10" "HSP90" 325.087297385435

"48" "F473" "T1" "15:10" "HSP90" 211.348903983665

"49" "F473" "T1" "11:10" "HSP70" 426.579518801593

"50" "F473" "T1" "13:10" "HSP70" 479.73344863669

"51" "F473" "T1" "15:10" "HSP70" 357.272838151929

"52" "F473" "T1" "11:10" "HSP26.7" 508.159442560561

"53" "F473" "T1" "13:10" "HSP26.7" 803.526122185617

"54" "F473" "T1" "15:10" "HSP26.7" 592.92532458

"55" "F473" "T1" "11:10" "HSP18" 456.036915951296

"56" "F473" "T1" "13:10" "HSP18" 749.894209332457

"57" "F473" "T1" "15:10" "HSP18" 403.645392967605

"58" "F473" "T1" "11:10" "HSP16.9" 3654

"59" "F473" "T1" "13:10" "HSP16.9" 6048

"60" "F473" "T1" "15:10" "HSP16.9" 3256

"61" "MOCARÍ" "T1" "11:10" "HSP90" 214.289060112006

"62" "MOCARÍ" "T1" "13:10" "HSP90" 56.2341325190349

"63" "MOCARÍ" "T1" "15:10" "HSP90" 207.491351745491

"64" "MOCARÍ" "T1" "11:10" "HSP70" 388.150365990648

"65" "MOCARÍ" "T1" "13:10" "HSP70" 116.680961706096

"66" "MOCARÍ" "T1" "15:10" "HSP70" 426.579518801593

"67" "MOCARÍ" "T1" "11:10" "HSP26.7" 753.355563733717

158

"68" "MOCARÍ" "T1" "13:10" "HSP26.7" 297.851642942919

"69" "MOCARÍ" "T1" "15:10" "HSP26.7" 685.488226452662

"70" "MOCARÍ" "T1" "11:10" "HSP18" 602.559586074358

"71" "MOCARÍ" "T1" "13:10" "HSP18" 155.596563160508

"72" "MOCARÍ" "T1" "15:10" "HSP18" 571.478636671868

"73" "MOCARÍ" "T1" "11:10" "HSP16.9" 3721

"74" "MOCARÍ" "T1" "13:10" "HSP16.9" 2078

"75" "MOCARÍ" "T1" "15:10" "HSP16.9" 4992

"76" "LV1645" "T1" "11:10" "HSP90" 239.331575640539

"77" "LV1645" "T1" "13:10" "HSP90" 60.8135001278718

"78" "LV1645" "T1" "15:10" "HSP90" 81.6582371358592

"79" "LV1645" "T1" "11:10" "HSP70" 233.883723865936

"80" "LV1645" "T1" "13:10" "HSP70" 57.4116462207328

"81" "LV1645" "T1" "15:10" "HSP70" 90.3649473722302

"82" "LV1645" "T1" "11:10" "HSP26.7" 277.971326775929

"83" "LV1645" "T1" "13:10" "HSP26.7" 79.2501330480472

"84" "LV1645" "T1" "15:10" "HSP26.7" 53.4564359396972

"85" "LV1645" "T1" "11:10" "HSP18" 242.102904673618

"86" "LV1645" "T1" "13:10" "HSP18" 78.7045789695099

"87" "LV1645" "T1" "15:10" "HSP18" 101.15794542599

"88" "LV1645" "T1" "11:10" "HSP16.9" 2109

"89" "LV1645" "T1" "13:10" "HSP16.9" 538.9

"90" "LV1645" "T1" "15:10" "HSP16.9" 709.3

"91" "F473" "T2" "11:10" "HSP90" 150.314196609002

"92" "F473" "T2" "13:10" "HSP90" 217.770977235316

"93" "F473" "T2" "15:10" "HSP90" 201.372424986239

"94" "F473" "T2" "11:10" "HSP70" 274.78941531024

"95" "F473" "T2" "13:10" "HSP70" 368.128973642531

"96" "F473" "T2" "15:10" "HSP70" 292.415237784334

"97" "F473" "T2" "11:10" "HSP26.7" 839.459986519398

"98" "F473" "T2" "13:10" "HSP26.7" 769.13044028661

"99" "F473" "T2" "15:10" "HSP26.7" 638.263486190549

"100" "F473" "T2" "11:10" "HSP18" 155.955250282695

"101" "F473" "T2" "13:10" "HSP18" 293.089324525032

"102" "F473" "T2" "15:10" "HSP18" 327.340694878838

"103" "F473" "T2" "11:10" "HSP16.9" 3087

"104" "F473" "T2" "13:10" "HSP16.9" 4635

"105" "F473" "T2" "15:10" "HSP16.9" 3010

"106" "MOCARÍ" "T2" "11:10" "HSP90" 145.545908058197

"107" "MOCARÍ" "T2" "13:10" "HSP90" 34.5143739335856

"108" "MOCARÍ" "T2" "15:10" "HSP90" 90.9913272632252

"109" "MOCARÍ" "T2" "11:10" "HSP70" 338.844156139202

"110" "MOCARÍ" "T2" "13:10" "HSP70" 302.691342810131

"111" "MOCARÍ" "T2" "15:10" "HSP70" 323.593656929628

"112" "MOCARÍ" "T2" "11:10" "HSP26.7" 922.571427154763

"113" "MOCARÍ" "T2" "13:10" "HSP26.7" 533.334895487621

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"115" "MOCARÍ" "T2" "11:10" "HSP18" 299.226463660819

159

"116" "MOCARÍ" "T2" "13:10" "HSP18" 542.000890401624

"117" "MOCARÍ" "T2" "15:10" "HSP18" 375.837404288445

"118" "MOCARÍ" "T2" "11:10" "HSP16.9" 2272

"119" "MOCARÍ" "T2" "13:10" "HSP16.9" 3796

"120" "MOCARÍ" "T2" "15:10" "HSP16.9" 4461

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"132" "LV1645" "T2" "15:10" "HSP18" 0

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"134" "LV1645" "T2" "13:10" "HSP16.9" 3808

"135" "LV1645" "T2" "15:10" "HSP16.9" 2650

EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES QUE CODIFICAN...

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