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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALSECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO

INFORME TÉCNICO FINAL

Identificación del proyecto

ENCB 20070855

Escuela, Centro o Unidad Clave del Proyecto

TítuloActividad protectora de nutracéuticos en la teratogenicidad producida por el cadmio enratones.

GERMAN CHAMORRO CEVALLOS Nombre del Director(a) del proyecto

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Resumen

Los organismos en desarrollo son especialmente vulnerables al daño oxidativo por lo que seha propuesto que la embriotoxicidad de algunos agentes químicos teratogénicos, esmediada por especies reactivas de oxígeno (ROS).El cadmio produce efectos teratógenicos severos, siendo la principal malformación laexencefalia.La hidroxiurea, conocido agente quimioterapéutico es también un potente teratógeno envarias especies animales. Se ha propuesto que un mecanismo complementario para explicartal efecto involucra su capacidad de formar radicales libres en forma no enzimática. Así enambos casos la acción de diferentes agentes antioxidantes y secuestradores de radicaleslibres administrados a animales gestantes pueden reducir o evitar las anomalías.Debido a que los defectos de nacimiento son una de las primeras causas de mortalidadinfantil, es necesario conocer los mecanismos por lo cuales se producen. En este sentido, esimportante estudiar si los nutracéuticos o alimentos funcionales con actividad antioxidante,como la Spirulina son capaces de proteger contra las alteraciones del desarrolloembrionario producidas por agentes inductores de ROS.

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IntroducciónTeniendo como antecedentes las numerosas propiedades farmacologícas del alga Spirulinase propuso como propósito principal de este trabajo el probar el efecto protector contra elcadmio y la hidroxiurea.

Efecto teratogénico del Cadmio.El efecto teratogénico del cadmio se demostró por primera vez en hámster dorado. Lasprincipales malformaciones observadas fueron anoftalmía, exencefalía y defectos en lasextremidades, estas malformaciones se podían evitar con una dieta suplementada con zinc.La exposición aguda de ratones gestantes, se encontró que el saco vitelino es un órganoblanco para la acción del cadmio, donde altera el suministro de oxígeno y nutrimentos alembrión. Varios estudios han determinado que un importante mecanismo detrás de lateratogénicidad del cadmio es la alteración de la función placentaria.

Otro sitio para la acumulación de Cd2+ es el ectodermo del embrión, y más específicamenteen el endodermo visceral anterior (EVA). La absorción de cadmio por el endodermodepende del periodo gestacional, lo que ocurre hasta el día 9 de la gestación cuando elducto intestinal-portal / vitelino se cierra. A partir de este periodo, el cadmio no solo seacumula en el saco vitelino, sino también en la placenta, mientras que las concentracionesen el embrión son muy bajas. Este cambio en la acumulación de cadmio alrededor del día 9de la gestación debido al cierre del ducto portal/vitelino, es seguido de un cambio en lasmalformaciones observadas, cambiando de exencefalía (una abertura del tubo neuralanterior) a defectos en extremidades. Una combinación entre la alteración de la funciónplacentaria y la acumulación de cadmio en el endodermo, podría ser causante de lateratogénesis inducida por el cadmio.

Se ha observado en ratones que la exposición al cadmio en los inicios de la organogénesisproduce exencefalía, mientras que la exposición tardía en ese periodo produce defectos enlas extremidades.

Spirulina máximaLa Spirulina es un alga color azul-verdoso (cianofícea) de tamaño microscópico que tiendea formar plancton en aguas dulces. Presenta forma de espiral muy fina, siendo su longitudde apenas unas décimas de milímetro. Es uno de los seres unicelulares más simples yprimitivos formando parte del grupo procarionte.

Suele encontrarse en lugares donde abunda la .luz solar y en aguas alcalinas dulces (enespecial lagos), siendo su hábitat correspondiente a los territorios de México (Lago deTexcoco), Japón, Tailandia y algunos lagos de África (Lago de Chad). La alcalinidad deestos lagos, con un pH cercano a 11, hace que prácticamente no exista otro tipo de vida enlos mismos, de tal manera que la Spirulina crece como monocultivo.

Por su fácil recolección tuvo un uso ancestral en África y América. Cuando los aztecas seestablecieron en el valle de México, se dieron a la tarea de buscar fuentes alternativas parala obtención de alimento como la cacería, la pesca, la recolección del ahuahutli (hueva demosco) y del tecuitlat (excremento de piedra) o alga Spirulina, la cual utilizaban como una

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fuente invalorable de proteínas, con la cual producían varios tipos de alimentos. Esta algamicroscópica se unía en filamentos formando una "nata" sobre la parte superficial delentonces Lago de Texcoco; la nata se recolectaba, se secaba y se hacían "tortillas" o"panes" de alrededor de un centímetro de espesor, que después eran cortados en pequeñosbloques que se vendían o intercambiaban.

En 1940 científicos franceses, como el ficólogo Dangeard, descubren que en Chad, algunasetnias cercanas al Lago Chad tenían la costumbre sui géneris de recoger una espuma deciertos estanques salobres, ponerla a secar y después la venderla en forma de galletas,llamadas dihé. Al estudiar muestras de la espuma, Dangeard concluyó que era un verdaderopuré de algas azules, con la forma característica de espirales filamentosas, un tipo de algaSpirulina.

En México, a mediados de la década de los setentas, ingenieros mexicanos desarrollannuevamente, a escala industrial, la producción de alga Spirulina. En la denominadaestructura de El Caracol, una sección de la actual zona federal del ex Lago de Texcoco,ubicada en territorio del Estado de México, que inicialmente se había habilitado paraproducir sosa cáustica, carbonato de sodio, sal y cal, en el año de 1981 se llegó a producirhasta cuatro toneladas diarias de alga Spirulina para abastecer al mercado nacional eincursionar en el internacional; sin embargo, en 1985, por motivos de carácter laboral,lamentablemente la empresa cerró y se dejó de generar tan importante producto.

Alan Jasby, en una investigación documental, reportó que en el mundo se tenían registradosal menos 25 sitios donde se habían registrado hasta nueve especies diferentes de algas deagua dulce que forman parte de la alimentación tradicional de algunos pueblos de 15 países,distinguiéndose por ser una importante fuente de vitaminas y minerales.

El alga Spirulina, contiene aproximadamente entre un 15 y un 25% de carbohidratos, un 5 aun 15% de extracto etéreo y alrededor del 60 - 70% en peso seco son proteínas; su altovalor nutritivo está relacionado con el tipo de aminoácidos esenciales que contiene, como laleucina (10.9% del total de aminoácidos), valina (7.5%) e isoleucina (6.8%), así como sualto coeficiente de digestibilidad. También cuenta en su composición con tresficobiliproteínas: aloficocianina, ficoeritrina y ficocianina, siendo esta última muy valoradapor su actividad antioxidante.

El Cuadro 1 presenta una recopilación de los efectos farmacológicos estudiados en el algaspirulina, el modelo en que se estudiaron, así como los resultados obtenidos.

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Fuente:Chamorro y col., 2002

Actividad antioxidanteEn diferentes experimentos, se ha demostrado que Spirulina máxima tiene propiedadesantioxidantes. Así lo encontraron Miranda y col, (1998), mediante estudios en homogenadode cerebro, plasma e hígado de rata. Piñero Estrada y col., (2001), demostraron que elextracto proteico de la Spirulina es un fuerte secuestrante de radicales libres (hidroxilo yperoxido). Upsani y Balaraman (2003) demostraron la actividad antioxidante en pulmón ycorazón de rata. Así, algunas de las propiedades antes mencionadas como laantiinflamatoria, la protección contra el cáncer en hámster y la protección contra latoxicidad testicular producida por el plomo, han sido explicadas por la presencia desubstancias antioxidantes en el alga, tales como -caroteno y la enzimasuperóxidodismutasa. Miranda y col, (1998) atribuyen la actividad antioxidante a lapresencia de ácidos fenólicos, tocoferoles y -caroteno, mientras que Romay y col., (1998),Bhat y Madyastha (2000), Romay y González (2000) a su principal ficobiliproteína, laficocianina.

La Spirulina tiene contiene tres ficobiliproteínas: ficocianina, aloficocianina y ficoeritrina.De ellas, la ficocianina, ha demostrado tener una amplia variedad de actividadesfarmacológicas. Ha demostrado tener actividad neuroprotectora contra el daño neuronalproducido en el hipocampo de rata por el ácido kaínico. Asimismo, este pigmento, por suactividad antioxidante, protegió a las células cerebelares de la apoptosis inducida por lacarencia de potasio.

También tiene una actividad antinflamatoria debida a la actividad secuestrante de las ROS.Se observó que la gran actividad antioxidante de la ficocianina al ser capaz de secuestrar alradical OH, 02- y RO, e inhibir la lipoperoxidación microsomal.

Cabe mencionar que en algunos estudios, se ha demostrado que los extractos totales delalga son más efectivos que la administración de los compuestos por separado, habiendo laposibilidad de un efecto sinergista entre sus componentes.

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JustificaciónEl cadmio es uno de los principales contaminantes industriales y ambientales que entreotros efectos tóxicos ha dado lugar a teratogenicidad, consistente principalmente enexencefalia y ectrodactilia. Las malformaciones congénitas pueden contrarrestarse por laadministración simultánea de algunos agentes de origen natural. La Spirulina máxima esuna fuente natural de proteínas, ácidos grasos Q-3 y Q-5, vitaminas, minerales. Su valornutrimental hace de la Spirulina un excelente suplemento alimenticio. Además cuenta en sucomposición con la ficocianina, cuyo valor antioxidante es elevado.

HipótesisSi la toxicidad provocada por el cadmio promueve la formación de radicales libres, quepuede ser el mecanismo por el cual algunos agentes químicos producen dañosreproductivos, y por otra parte, la Spirulina y la ficocianina son agentes antioxidantes,pueden prevenirse tales daños con su administración.

Objetivos.Objetivo general:Estudiar el efecto protector de la Spirulina y ficocianina sobre el daño teratogénicoprovocado por el cloruro de cadmio.Objetivos particulares:1. Establecer la dosis mínima teratogénica del CdCl2.2. Conocer el tipo de alteraciones provocadas por el CdCl2.3. Determinar si la Spirulina y ficocianina previenen la teratogénicidad provocada por elCdCl2.4. Medir la capacidad antioxidante de la Spirulina y la ficocianina en embriones, comoposible mecanismo antiteratogénico.

Métodos y materiales.Materiales.Los ratones macho y hembra de la cepa ICR procedentes de Harlan se les acondiciono a suarribo a las instalaciones y tuvieron acceso a alimento especial para animales delaboratorio.

Métodos.

Debido a la necesidad de encontrar una dosis de CdCl2 que sea minimamente teratogénica,fue necesario realizar el ensayo donde se encontrara una dosis en donde el daño provocadopor el CdCI2 no fuera tan severo para que no pudiera apreciarse el efecto de la Spirulina.

Una vez seleccionada la dosis de CdCl2, se realizará el ensayo antiteratogénico y elantioxidante.Animales. Se emplearon ratones ICR, hembras y machos con un peso entre 28-30 g de 9 y10 semanas de edad. Todos los animales de experimentación se mantuvieron en unahabitación silenciosa con temperatura controlada de 22 ± 1°C, bajo un ciclo de iluminaciónde 12 h de luz artificial (9 a.m. - 9 p.m.) y 12 h de oscuridad.

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Dosis: La Spirulina máxima se suspendió en solución salina isotónica (NaCl 0.9%) con unagota de tween 80, inmediatamente antes de usarse y se administrará por vía intragástrica. Seemplearon las dosis de 250, 500 Y 1000 mg/kg Spirulina.

Se utilizará CdCl2 en dosis de 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 Y 4.0 mg/kg y se administrará por vía i.p.Se administrará el día 7 de la gestación.

Los grupos control, se mantendrán bajo las mismas condiciones que los grupos problema yse les administrará solución salina isotónica.

Selección de la dosis adecuada de CdCl2Los animales se aclimataron durante una semana en jaulas metálicas con piso de reja.Se colocaron cuatro hembras por jaula y los machos de forma individual. Al termino delperiodo de aclimatación se procedió al apareamiento de los animales, por lo que secolocaron los machos con las hembras entre las 6:00 a.m. y 9:00 a.m., verificándose elacoplamiento al final de ese tiempo por la presencia de un tapón espermático vaginal; seconsideró este día como el día cero de la gestación (00 DG). Las hembras acopladas sepesaron y distribuyeron aleatoriamente en los grupos de experimentación (10 animales cadauno) de la siguiente manera:

Lote 1. TestigoLote 2. 1.0 mg/kg CdCl2Lote 3. 1.5 mg/kg CdCl2Lote 4. 2.0 mg/kg CdCl2Lote 5. 2.5 mg/kg CdCl2Lote 6. 4.0 mg/kg CdCl2

Se llevó un registro diario del peso de las hembras acopladas. El CdCl2 se administró el día7 de la gestación vía i.p. El día 17 de la gestación las hembras se sacrificaron pordislocación cervical y se les practico una histerectomía, registrando lo siguiente:

Número y posición de los fetos vivos y muertos.Sexo, peso y medida de los fetos.Malformaciones y anormalidades externas.Numero, peso y medida de las placentasNúmero de cuerpos lúteos.Número y posición de implantaciones, reabsorciones tempranas y tardías.

El análisis de las anormalidades esqueléticas se llevó a cabo en la mitad del total de losfetos por la técnica de Peters; en la otra mitad se examinaron las malformaciones visceralespor la técnica de Wilson. Se evaluó el grado de madurez ósea como reflejo del retardo en elcrecimiento intrauterino. El nivel de osificación se estableció para los fetos de 18 días degestación al observar el desarrollo metacarpiano, metatarsiano y falangiano de susextremidades. Se consideró como:

Osificación normal. Presencia de cuatro o más metacarpos y metatarsos, así como cuatro omás falanges.

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Moderada. Desarrollo de cuatro metacarpos, metatarsos y menos de cuatro falanges.Severos. Aparición de tres o menos metacarpos, metatarsos y ausencia de falanges.

Efecto antiteratogénico de la Spirulina máxima y la ficocianina.Una vez que se eligió la dosis de CdCl2, se procedió a realizar el ensayo del efecto protectorde la Spirulina contra el daño por CdCl2. Los animales se aclimataran durante una semanaen jaulas metálicas con piso de reja. Se colocaran cuatro hembras por jaula y los machos deforma individual. Al término del periodo de aclimatación se procedió al apareamiento delos animales, por lo que se colocaron los machos con las hembras entre las 6:00 a.m. y 9:00a.m., verificándose el acoplamiento al final de ese tiempo por la presencia de un tapónespermático vaginal; se considerará este día como el día cero de la gestación (0° OG). Lashembras acopladas se pesaron y distribuyeron aleatoriamente en los grupos deexperimentación (10 animales cada uno) de la siguiente manera:Lote 1. TestigoLote 2. CdCl2Lote 3. Spirulina 1000 mg/kgLote 4. CdCl2 + Spirulina 250 mg/kgLote 5. CdCl2 + Spirulina 500 mg/kgLote 6. CdCl2 + Spirulina 1000 mg/kg

Se llevó un registro diario del peso de las hembras acopladas. La Spirulina se administródiariamente por vía oral del día 0° al 18° de la gestación. El CdCl2 se administró el día 7 dela gestación vía i.p. El día 18° de la gestación las hembras se sacrificaron por dislocacióncervical y se les practicó una histerectomía, registrando lo siguiente:

Número y posición de los fetos vivos y muertos.Sexo, peso y medida de los fetos.Malformaciones y anormalidades externas.Numero, peso y medida de las placentasNúmero de cuerpos lúteos.

Número y posición de implantaciones, reabsorciones tempranas y tardías.El análisis de las anormalidades esqueléticas se llevarón a cabo en la mitad del total de losfetos por la técnica de Peters; en la otra mitad se examinaron las malformaciones visceralespor la técnica de Wilson. Se evaluo el grado de madurez ósea como reflejo del retardo en elcrecimiento intrauterino. El nivel de osificación se estableció para los fetos de 18 días degestación al observar el desarrollo metacarpiano, metatarsiano y falangiano de susextremidades.

Resultados.Aumento ponderal. Para el aumento ponderal se llevó un registro del peso de cada hembraen los días de gestación 0°, 7º, 15° y 18°, con el objeto de ver si el CdCl2 administradoafectaba el peso de las hembras y en base a ello, saber si el cadmio presentaba efectomaternotóxico.

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Como puede observarse, no se presentaron diferencias significativas entre el grupo controly los cinco grupos problema. Era de esperarse un aumento gradual de peso conformeavanzaba la gestación. De acuerdo a esto, al no haber un descenso de peso en cada uno delos grupos, puede decirse que el CdCl2 no produjo toxicidad materna a ninguna de las dosisprobadas.

Cuerpos lúteos, implantaciones y reabsorciones. En el Cuadro 6, se muestra que no sepresentó diferencia significativa al comparar el número de cuerpos lúteos del grupo controlcon los grupos problema, lo mismo ocurrió al comparar el número de implantaciones y dereabsorciones tempranas. Esto nos índica que el CdCl2 no produce un efecto anti-implantatorio. En cuanto a las reabsorciones tardías solo el grupo tratado con la dosis de 4.0mg/kg de CdCl2, fue significativamente diferente, es decir, dicha dosis resultó tener unefecto embrioletal.

Cuadro 3. Cuerpos lúteos, implantaciones y reabsorciones por hembra.

Sobre vivencia fetal. Las Figuras 4 y 5 presentan el promedio de fetos vivos y muertos pormadre.

Figura 4. Promedio de los fetos vivos por hembra.

Prueba de Tukey, p<0.05

Figura 5. Promedio de los fetos muertos por hembra

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ANOVA, p<0.05

En el recuento de fetos vivos, solo hubo diferencia significativa en el grupo administradocon 4.0 mg/kg CdCl2. Con respecto al número de fetos muertos, no se presentarondiferencias significativas.

Talla y peso fetal. Un parámetro para saber si se produce efecto embriotóxico es ladisminución del peso corporal y la talla. Hubo diferencia significativa en cuanto al pesopromedio de los fetos en los grupos tratados con las dosis de 2.0 y 4.0 mg/kg CdCl2.Estonos indica un efecto embriotóxico en ambas dosis.

Para el promedio de talla fetal, sólo se presentaron diferencias significativas con el grupoadministrado con la dosis de 4.0 mg/kg CdCl2. La dosis de 4.0 mg/kg podría ser consideradaembrioletal si se asocia con la disminución de la talla fetal y el incremento en reabsorcionestardías.

Malformaciones externas. Las principales malformaciones encontradas con laadministración de CdCl2 en el día 7º de la gestación fueron: exencefalia, micrognatia y ojossin párpado (ausencia palpebral).

La Figura 9 nos indica la incidencia de las principales malformaciones congénitas causadaspor el CdCl2.

Se puede observar, que los grupos con mayor incidencia de exencefalia y micrognatia sonel de 2.0 y 4.0 mg/kg CdCl2. El grupo con la menor incidencia fue el de 1.5 mg/kgCdCl2

En cuanto al porcentaje de ojos abiertos (ausencia palpebral). Los grupos con dosis 1.5 y2.5 mg/kg CdCl2 presentaron la menor incidencia. También se presentaron otrasmalformaciones como anencefalia. celosomia y anoftalmia. Pero con una incidenciamínima.