INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

Departamento de Biotecnología

“Extractos de plantas micropropagadas deAristolochia elegans Mast. con actividadrelajante en la contracción inducida porveneno de alacrán (Centruroides limpidus

limpidus Karsch.) en íleon aislado de cobayo”

T E S I S

P R E S E N T A

ALEJANDRO MORA IZQUIERDO

DIRECTOR: Dr. ANTONIO JIMÉNEZ APARICIO

Que para obtener el grado de M a e s t r o e n C i e n c i a s e n Desarrollo de Productos Bióticos

Yautepec, Morelos Dic, 2004

EL TRABAJO EXPERIMENTAL DE ESTA TESIS SE REALIZÓ EN EL

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA DEL CEPROBI–IPN Y EN LOS

LABORATORIOS DE BIOTECNOLOGÍA VEGETAL Y DE

FARMACOLOGÍA DEL CENTRO DE INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA DEL

SUR–IMSS. EL DR. ANTONIO JIMÉNEZ APARICIO FUE EL DIRECTOR

DE ESTA TESIS Y SE CONTÓ CON LA VALIOSA ASESORÍA DE LA

DRA. ELSA VENTURA ZAPATA Y LA DRA. LIDIA OSUNA TORRES;

ADEMÁS DE LAS CONTRIBUCIONES DEL DR. ENRIQUE J. JIMÉNEZ

FERRER, LA DRA. SILVIA EVANGELISTA LOZANO Y EL DR.

ROBERTO MONTES BELMONT.

RECONOCIMIENTOS

AL CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA POR LA BECA

RECIBIDA PARA LA REALIZACIÓN DE ESTUDIOS DE MAESTRÍA Y EL

APOYO PARA LA REALIZACIÓN PARCIAL DE ESTE TRABAJO.

AL PROGRAMA DE FORMACIÓN DE INVESTIGADORES DEL IPN

POR EL APOYO RECIBIDO COMO BECARIO EN LOS PROYECTOS

CGPI 20030340, 20030343 Y 20040547.

A mis padres, su amor y respeto por la naturaleza ha sido un ejemplo que me ha impulsado a seguir esta disciplina del conocimiento.

A mi familia,

una de las razones mas importantes que me hacen continuar adelante.

A mis profesores, compañeros y amigos de hoy y de siempre…

CONTENIDO

ÍNDICE DE CUADROS ÍNDICE DE FIGURAS LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS GLOSARIO RESUMEN ABSTRACT 1 INTRODUCCIÓN 2 ANTECEDENTES 2.1 PLANTAS MEDICINALES 2.2 IMPORTANCIA DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS 2.3 MICROPROPAGACIÓN 2.4 GÉNERO Aristolochia 2.5 Aristoloch a elegans i 2.6 ENVENENAMIENTO POR PICADURA DE ALACRÁN

2.7 PLANTAS USADAS EN EL TRATAMIENTO DE PICADURA DE ALACRÁN 2.8 GÉNERO Aristolochia EN EL TRATAMIENTO DE PICADURA ALACRÁN 2.9 EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA 3 JUSTIFICACIÓN 4 OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GENERAL 4.2 OBJETIVOS PARTICULARES 5 MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 MATERIALES 5.1.1 Material biológico 5.1.2 Reactivos y material de laboratorio 5.2 METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

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5.3 MICROPROPAGACIÓN Y CULTIVO 5.3.1 Condiciones generales de preparación de medio de cultivo 5.3.2 Desinfestación de semillas 5.3.3 Inducción de brotes 5.3.4 Multiplicación y elongación de brotes 5.3.5 Inducción de raíces 5.3.6 Aclimatización 5.3.7 Cultivo en invernadero y cosecha 5.4 EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA 5.4.1 Obtención de extractos 5.4.2 Obtención de veneno 5.4.3 Animales de experimentación 5.4.4 Preparación de soluciones stock 5.4.5 Preparación del equipo y cámara de incubación 5.4.6 Contracción inducida por veneno de alacrán 5.4.7 Prueba de relajación 5.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS 6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1 MICROPROPAGACIÓN 6.1.1 Desinfestación de semillas 6.1.2 Inducción de brotes 6.1.3 Multiplicación y elongación de brotes 6.1.4 Inducción de raíces 6.1.5 Aclimatización 6.1.6 Desarrollo en invernadero y cosecha 6.2 EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA 6.2.1 Obtención de extractos 6.2.2 Cuantificación de la contracción inducida por el veneno 6.2.3 Prueba de relajación 7 CONCLUSIONES 8 PERSPECTIVAS 9 BIBLIOGRAFÍA

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ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Compuestos químicos encontrados en A. elegans. Cuadro 2. Tratamientos para la desinfestación de semillas de A. elegans mediante la

combinación de tres concentraciones de NaClO con tres tiempos de inmersión. Cuadro 3. Tratamientos con los fito-reguladores ANA y/o BAP para la inducción de

brotación múltiple en dos tipos de explante (yemas apicales y yemas axilares). Cuadro 4. Tratamientos con los fito-reguladores AIB y ANA para la inducción de raíces en

explantes de yemas axilares. Cuadro 5. Efecto de soluciones de NaClO a diferentes concentraciones y tiempos de

inmersión, en la desinfestación de semillas. Cuadro 6. Efecto del uso de etanol al 70% con diferentes tiempos de inmersión combinado

con el tratamiento E (NaClO 1.0 % / 10 min), en la desinfestación de semillas. Cuadro 7. Formación de brotes en yemas apicales y axilares por efecto de diferentes

tratamientos con fito-reguladores. Cuadro 8. Formación de raíces en yemas axilares por efecto de diferentes tratamientos con

los fito-reguladores AIB y ANA. Cuadro 9. Valores de velocidad específica de cambio de los cuatro parámetros de

crecimiento de las plantas, evaluados durante la etapa de aclimatización. Cuadro 10. Valores de humedad relativa (HR) y potencial hídrico (Ψ) dentro del sistema

hidropónico y la cámara de incubación, durante las primeras cinco semanas de aclimatización.

Cuadro 11. Material vegetal cosechado de plantas cultivadas de A. elegans. Cuadro 12. Rendimientos de extracción de las plantas cultivadas de A. elegans. Cuadro 13. Efecto de los extractos de las partes aéreas y raíces de A. elegans sobre la

relajación del íleon contraído por efecto del veneno de alacrán.

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Distribución en México de las especies de alacranes de mayor peligro para los

humanos, todas pertenecientes al género Centruroides. Figura 2. Flor de Aris olochia elegans. Figura 3. Diagrama de flujo del desarrollo experimental. Figura 4. Diagrama de flujo de la desinfestación de semillas. Figura 5. Representación de los sitios de corte en las plántulas para obtener los explantes. Figura 6. Esquema en el que se muestran las diferentes fases de micropropagación de A.

elegans. Figura 7. Equipo de prueba para el modelo de íleon aislado de cobayo. En (a), fotografía

del equipo y principales componentes; y (b), esquema que representa la cámara de incubación.

Figura 8. Ejemplo de los registros gráficos típicos proporcionados por el equipo y los

componentes para obtener el porcentaje de relajación. Figura 9. Efecto de diferentes tratamientos en la desinfestación de semillas de A. elegans.

En (a) se representan los valores obtenidos mediante tratamientos de NaClO y en (b) los valores de etanol 70 % en diferentes tiempos de inmersión combinado con el tratamiento E. En (a), los valores representan la media de tres unidades experimentales y en (b), de seis + error estándar.

Figura 10. Fotografías que representan los brotes formados por efecto de BAP 10 µM

(tratamiento 4) en yemas axilares (A) y yemas apicales (B). Figura 11. Efecto de los diferentes tratamientos de fito-reguladores, en la formación de

brotes en yemas apicales y yemas axilares. Los valores representan la media de tres unidades experimentales + error estándar.

Figura 12. Vistas diferentes de cuatro tratamientos de fito-reguladores para la inducción de

brotes en yemas axilares. Figura 13. Efecto de diferentes tratamientos de fito-reguladores en la formación de raíces en

yemas axilares. Los valores representan la media de tres unidades experimentales + error estándar.

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Figura 14. Cinética de desarrollo de las plantas durante la aclimatización. En (a), se

representa la longitud de la raíz y de la parte aérea. En (b), el número de raíces secundarias y de nudos. Los valores representan la media de 72 plantas ± desviación estándar.

Figura 15. Imagen de las plantas de A. elegans en el quinto mes de cultivo en el

invernadero. Figura 16. Efecto de la concentración de veneno de alacrán sobre la contracción del íleon.

En (a) la primera curva de la respuesta de contracción con concentraciones en intervalos logarítmicos y en (b), la segunda curva en el intervalo de concentración de 10-100 µg/ml. Los valores representan la media de tres determinaciones ± error estándar.

Figura 17. Dos registros sobrepuestos de la prueba de relajación. En (A), la respuesta de

contracción por aplicación del veneno (40 µg/ml) y en (B), la respuesta de relajación por la aplicación del veneno (40 µg/ml) + extracto metanólico de partes aéreas (200 µg/ml).

Figura 18. Efecto de relajación del íleon (contraído por acción del veneno de alacrán), como

resultado de la aplicación de los extractos en diferentes concentraciones. Los valores representan la media de seis determinaciones ± error estándar. La línea más gruesa corresponde con la curva del Extracto Hexánico de raíces de plantas silvestres reportado por Jiménez (2004) y en el reporte original los valores representan la media de cinco determinaciones.

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iii

LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS

AIA ácido indolacético

AIB ácido indolbutírico

ANA ácido naftalenacético

BAP 6-bencilaminopurina

DL50 dosis letal media

EE error estándar de la media

EH extracto hexánico

EM extracto metanólico

ES peso del extracto seco

EtOH etanol

F(ab´)2 fragmentos de anticuerpos purificados que se obtienen del suero de caballos hiper-

inmunizados con venenos.

FCA fuerza de contracción A

FCB fuerza de contracción B

H humedad

HR humedad relativa

IBE índice de brotes por explante

IRE índice de raíces por explante

MI peso de la muestra inicial (antes del secado)

MF peso de la muestra final (después del secado)

MS medio de cultivo Murashige-Skoog

MV material vegetal de inicio (en la extracción)

iv

NES número de explantes sembrados

NaClO hipoclorito de sodio

NSS número de semillas sembradas

NSD número de semillas desinfestadas

PA partes aéreas

PLA2 fosfolipasa-A2

p/v peso a volumen

RA raíces

RE rendimiento de extracción

RI valor de relajación del íleon

SD semillas desinfestadas

SE sistema entérico, que se refiere al sistema nervioso en el intestino

t tiempo de un intervalo

TBU número total de brotes por unidad experimental

TRU número total de raíces por unidad experimental

UE unidad experimental; es la entidad en la cual se aplicó un tratamiento

VE velocidad específica

VNI valor numérico inicial (del parámetro de crecimiento)

VNF valor numérico final (del parámetro de crecimiento)

Ψ potencial hídrico

% porcentaje

v

GLOSARIO

Aclimatización: es el fortalecimiento que desarrollan las plantas cultivadas in vit o para tolerar

las condiciones ex vitro mediante un sistema artificial controlado por el hombre.

r

Agrolita: material volcánico utilizado en la preparación de sustratos de cultivo. Está

compuesto de pequeñas piedras (1-4 mm de diámetro) muy ligeras y con excelentes

propiedades de aireación y retención de humedad.

Alacranismo: ocurrencia de picaduras de alacrán en personas y el problema de salud pública

que implica.

Anafilaxia: sensibilidad excesiva de algunas personas a la acción de ciertas sustancias

presentes en los alimentos y/o medicamentos.

Autacoide: sustancia formada por un grupo de células que a nivel local altera la función de

otras.

Bioprospección: la búsqueda de aplicaciones útiles de los organismos vivos o sus derivados.

Desinfestación de semillas: eliminación de esporas y otros microorganismos que se

encuentran en la superficie de las semillas.

Edema: hinchazón blanda de una parte del cuerpo, que cede a la presión.

Elongación: alargamiento.

Emenagogo: remedio que provoca la regla o evacuación menstrual de las mujeres.

Embriogénesis somática: proceso mediante el cual se obtienen embriones a partir de células

somáticas (no sexuales) de cualquier tipo de tejido.

Eritema: enrojecimiento persistente de la piel o las mucosas, generalizado o localizado,

debido a vasodilatación y congestión capilar.

Etnobotánica: rama de la botánica que estudia la interacción entre las plantas y los seres

humanos en las sociedades antiguas y actuales.

Explante: pequeño fragmento de una planta (hoja, tallo, raíz, yemas, anteras, etc.) para iniciar

un cultivo in vitro.

vi

Extracto: producto sólido o espeso obtenido por evaporación del disolvente utilizado para

extraer sustancias de algún material (vegetal o animal).

Fito-reguladores: sustancias naturales (fito-hormonas) o artificiales que controlan el

crecimiento y desarrollo de una planta.

Herbolaria: práctica terapéutica en la que se utilizan plantas medicinales.

Hidroponía: técnica de cultivo de plantas con la adición de soluciones nutritivas que no

incluye el uso de tierra.

Íleon: tercera porción del intestino delgado de los mamíferos que se encuentra entre el

yeyuno y el ciego.

Índice: expresión numérica de la relación entre dos cantidades.

Inducción: provocar el estímulo para obtener una respuesta.

Irradiancia: es el flujo de energía radiante recibido por unidad de superficie plana.

Laparotomía: operación quirúrgica que consiste en abrir las paredes abdominales.

Liofilizar: separar el agua de una sustancia, o de una disolución, mediante congelación y

posterior sublimación a presión reducida del hielo formado.

Macerar: mantener sumergido algún material sólido en un líquido a temperatura ambiente,

con el fin de ablandarlo o de extraer de él las sustancias solubles.

Medio: la suma de las influencias externas que modifican el crecimiento, la estructura y

reproducción de los organismos en un lugar dado.

Metabolitos secundarios: sustancias producidas por las plantas que tienen un papel muy

importante en su adaptación al ambiente.

Micropropagación: procedimiento que consiste en la multiplicación vegetativa in v o para

regenerar nuevas plantas a partir de un explante.

itr

Neurotransmisor: sustancia liberada selectivamente de una terminal nerviosa por la acción de

un potencial de acción, que transmite los impulsos nerviosos en la sinapsis.

Nudo: La parte de un tallo donde una o más hojas están pegadas, donde se encuentra la

yema axilar.

vii

Peat moss: materia orgánica seca proveniente de musgos que se utiliza en la preparación de

sustratos para cultivo.

Plántula: planta joven que resulta de la germinación de la semilla.

Potencial hídrico: es el potencial químico del agua en un sistema o parte de un sistema,

expresado en unidades de presión, comparado con el potencial químico del agua pura a la

presión atmosférica y a las mismas temperaturas y altura, y con el potencial químico del agua

de referencia fijado en cero.

Solución Tyrode: solución isotónica.

Sustentabilidad: es un proceso que hace referencia a una forma de desarrollo en la que se

busca el bienestar humano sin dañar el equilibrio del ambiente y sus recursos naturales.

Sustrato: material que sirve de soporte a una planta.

Totipotencia: se refiere a que cada célula vegetal tiene la misma información genética que le

permite desarrollar por sí misma un individuo idéntico a la planta de la cual se derivó.

Vermiculita: material volcánico (silicato de aluminio) utilizado en la preparación de sustratos

para cultivo, que tiene la característica de retener hasta cuatro veces su peso en agua.

Yema: tallo embriónico protegido por hojas jóvenes y es el sitio de crecimiento ubicado en la

punta de las ramas (yema apical) o en los nudos (yema axilar).

viii

RESUMEN

Aristolochia elegans Mast. es una planta que crece de manera silvestre en México y que

se utiliza en la medicina tradicional para aliviar los efectos de la picadura de alacrán. Como

una alternativa biotecnológica de producción, en este trabajo se estableció la metodología

para la micropropagación de A. elegans, que incluyó las siguientes etapas: desinfestación,

inducción de brotes, enraizamiento y elongación; así como aclimatización a condiciones ex

vitro (mediante un sistema hidropónico). Posteriormente, las plantas se cultivaron en

invernadero y al término de cinco meses se cosecharon las partes aéreas y raíces. Una

vez seco el material vegetal, se obtuvieron extractos con metanol y hexano. Finalmente,

como un indicativo de la actividad farmacológica anti-veneno de alacrán, se aplicaron

diferentes concentraciones de los extractos en un modelo biológico in vi ro; en el que se

evaluó la respuesta de relajación en íleon aislado de cobayo previamente contraído por

efecto del veneno de alacrán Centruroides limpidus limpidus.

t

r

Los principales resultados fueron los siguientes: se obtuvieron plántulas asépticas por la

germinación de semillas desinfestadas mediante un protocolo establecido en este trabajo,

que incluyó lavados con detergente, etanol e hipoclorito de sodio. Las plántulas asépticas

se utilizaron como fuente de explantes. El tratamiento con BAP 10 µM indujo la formación

del mayor número de brotes por explante (3.1 en promedio); mientras que con AIB 1.5 µM

se indujo la mayor formación del número de raíces por brote (12 en promedio). La

aclimatización mediante el sistema hidropónico permitió obtener el 100 % de supervivencia

de las plantas en condiciones ex vitro y las plantas en el invernadero alcanzaron una altura

de 1.33 m después de cinco meses de cultivo. Se obtuvo mayor rendimiento en los

extractos con metanol que con hexano. En la evaluación farmacológica in vitro, con la

mayor concentración de los extractos aplicados (300 µg/ml), se alcanzaron valores en el

intervalo de 42 al 73 % de relajación, semejantes a los reportados con extractos de raíces

de plantas silvestres. Se concluye que con la metodología establecida para la propagación

in vit o de A. elegans y su crecimiento en invernadero, se obtuvieron plantas que contienen

los metabolitos secundarios con la capacidad de relajar en íleon aislado de cobayo, la

contracción inducida por efecto del veneno de alacrán (C. limpidus limpidus), de manera

semejante a la reportada para plantas silvestres.

– 1 –

ABSTRACT

Aristolochia elegans Mast. is a plant that grows wild in Mexico and is used in folk medicine

to alleviate the effects of scorpion sting. As a biotechnological alternative of production, in

this work was established the methodology for the micropropagation of A elegans that

included the following stages: disinfestation, shoot induction, rooting and elongation; as

well as acclimatization to ex-vi ro conditions (using a hydroponic system). Further, the

plants were cultivated in the greenhouse and at the end of five months the aerial parts and

roots were harvested. Once the vegetal material was air dried, extracts were obtained with

methanol and hexane. Finally, as an indicative of the pharmacological action as anti-

scorpion venom, different concentrations of the extracts were applied in a in vit o biological

model, that consisted in evaluating the response of relaxation in isolated guinea-pig ileum

(contracted by the effect of scorpion venom Centruroides limpidus limpidus).

.

t

r

t

-

The main results were: aseptic plantlets were obtained by germination of disinfested seeds

by means of the established protocol in this work that included washes with detergent,

ethanol and sodium hypochlorite. The aseptic plantlets were used as a source of explants.

The treatment with BAP 10 µM induced the formation of the highest number of shoots for

explant (3.1 on the average); while the maximum number of roots by explant (12 on the

average) was induced with IBA 1.5 µM. The acclimatization by means of the hydroponic

system allowed obtaining 100% of survival of the plants in ex-vi ro conditions and the plants

in the greenhouse reached a height of 1.33 m after five months of cultivation. The yield of

the extracts with methanol was higher than the obtained with hexane. In the

pharmacological in-vitro test, values in the range of 42 to 73 % of relaxation were reached

with the highest concentration of the applied extracts (300 µg/ml), similar to those reported

with root extracts of wild plants. It was concluded that with the methodology established for

the in vitro propagation of A. elegans and growth in the greenhouse, were obtained plants

that contain secondary metabolites with the ability to relax the isolated guinea-pig ileum,

previously contracted by effect of the scorpion venom (C. limpidus limpidus), in a similar

way to the one reported for wild plants.

– 2 –

11 iinnttrroodduucccciióónn

INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN

El alacranismo se considera un problema de salud pública en México donde ocho especies

tóxicas para el ser humano se encuentran distribuidas a lo largo de su territorio y todas

ellas pertenecen al género Centruroides (Figura 1). La especie Centruroides limpidus

limpidus Karsch. es la segunda en orden de toxicidad y se localiza en la región que abarca

todo el estado de Morelos y parte de Guerrero, México, Puebla y Michoacán (Dehesa y

col., 1995). La presencia de C. limpidus limpidus se ve reflejada en los altos índices de

morbilidad por picaduras de alacrán reportados para dichos estados, entre los que resalta

Morelos donde se presenta la mayor tasa de incidencias a nivel nacional (Secretaría de

Salud, 2004).

C. suffusus suffusus

C. sculpturatus y pallidiceps C. limpidus limpidus C. limpidus tecomanus C. infamatus infamatus C. elegans C. noxius

Figura 1. Distribución en México de las especies de alacranes de mayor peligro para los humanos, todas pertenecientes al género Centruroides (Adaptado de

Dehesa y co ., 1995). l

r r t

Durante muchos años la medicina tradicional mexicana ha usado plantas para el

tratamiento de la picadura de alacrán, incluyendo especies pertenecientes al género

A istolochia. La etimología griega del término A is olochia podría ser ‘aristokeia, que da a

luz los mejores hijos’, lo que se relaciona con uno de sus principales usos que es el de

favorecer el parto y contribuir a la expulsión de la placenta (Camacho, 1990).

– 3 –

INTRODUCCIÓN

En náhuatl, estas plantas se conocen con el nombre de ‘ lacopatli, vara o junquillo

medicinal’ (Rojas, 1998). Francisco Hernández (1959) hace referencia de varios tlacopatli

y de sus aplicaciones como remedio en sus estudios realizados entre los años 1571-1576;

pero es notorio que no mencionó la pretendida propiedad contra veneno, o como remedio

al momento del parto; lo cual no se sabe si atribuirla a que los indígenas ocultaron esas

propiedades, o que Hernández no consideró esas plantas como remedio efectivo para

tales casos (Martínez, 1959).

t

.

Aristolochia elegans Mast. es una especie originaria de Brasil. En México se conoce

comúnmente como ‘guaco’, ‘pato’ o ‘tlacopatli’, donde crece de manera silvestre en varios

estados de la república. A. elegans podría ser la especie vegetal más usada en el estado

de Morelos para el tratamiento de picaduras de alacrán (Monroy y Castillo, 2000; Jiménez,

2004). Se ha demostrado mediante pruebas de laboratorio que las raíces de plantas

silvestres de A elegans tienen la capacidad de antagonizar algunos efectos causados por

el veneno de alacrán (Jiménez, 2004); esta propiedad resulta interesante para el desarrollo

de nuevos productos que permitan ofrecer una alternativa de solución a este problema de

salud como un tratamiento efectivo, económico, fácil de obtener, almacenar y administrar.

Nuestro país es reconocido como uno de los de mayor riqueza vegetal en el mundo, pues

se estima que existen más de 30 mil especies de plantas en su territorio. De esta

diversidad vegetal, se han registrado alrededor de 4 mil especies con atributos

medicinales; lo que ha llevado a México a ser clasificado en el 2° lugar a nivel mundial en

cuanto a riqueza de plantas medicinales (Conabio, 1998). Por otro lado, se estima que el

80% de la población mexicana usa plantas medicinales y la frecuencia de su uso puede

ser cotidiana o esporádica, dependiendo de la región y del nivel socioeconómico de la

población (Taddei y col., 1999; Castellanos, 2002). En las zonas rurales se utilizan

frecuentemente plantas como A. elegans para el tratamiento de los efectos del

envenenamiento por picadura de alacrán, debido a que los alacranes viven en las

cercanías de las viviendas y la atención médica es escasa.

Sin embargo, es preocupante saber que más del 90 % de las plantas medicinales que se

utilizan en México son de origen silvestre y que no existen programas agro-biológicos para

hacer un uso racional y sustentable de este recurso vegetal; por lo que su colecta

– 4 –

INTRODUCCIÓN

indiscriminada ha contribuido a la reducción de las poblaciones en su hábitat natural.

Particularmente, plantas como A. elegans son más susceptibles a la desaparición debido a

que de ella se aprovecha principalmente la raíz.

Por otro lado, se sabe que el uso de plantas medicinales de origen silvestre no siempre

garantiza la efectividad terapéutica (Castellanos, 2002), debido a la variabilidad en sus

componentes químicos; lo que se atribuye a diferentes factores inherentes a la planta,

ambientales o de manejo al ser colectadas en campo (Wheeler y col., 1992; Veerporte y

Beck, 1998; Raskin y col., 2002).

El panorama que se presenta parece contraponer los esfuerzos de conservación de

nuestra riqueza biológica y el aprovechamiento de los conocimientos etnobotánicos

heredados de nuestros antepasados; lo cual nos conduce al siguiente cuestionamiento:

¿Qué desarrollo tecnológico puede contribuir con la conservación de la forma tradicional

de uso de este recurso vegetal, que a su vez también contribuya a evitar la desaparición

de esta especie en estado silvestre?

La micropropagación es una alternativa biotecnológica mediante la cual se puede obtener

un suministro continuo y uniforme de plantas homogéneas, sanas, vigorosas y en menor

tiempo al que requiere la planta para multiplicarse en condiciones naturales (Rout y col.,

2000; Rates, 2001; Chawla, 2002); lo que además puede contribuir a la conservación de

las poblaciones en su hábitat natural. De esta manera, mediante el cultivo en invernadero

de plantas micropropagadas de A. elegans se puede disponer de un suministro de plantas

homogéneas con la capacidad de presentar actividad farmacológica semejante a la que

presentan individuos en estado silvestre, como se ha demostrado en especies de otros

géneros.

– 5 –

22 aanntteecceeddeenntteess

ANTECEDENTES

2.1 PLANTAS MEDICINALES

México es reconocido como uno de los países con mayor riqueza vegetal en el mundo, ya

que se estima que existen más de 30 mil especies de plantas en su territorio. Esta

diversidad vegetal se ha originado gracias a su ubicación geográfica con una amplia gama

de climas y suelos. Otra característica importante de nuestro país es su gran diversidad

cultural, que combinada con la riqueza biológica, favorecieron el valioso conocimiento

etnobotánico de las plantas; lo que ha llevado a México a ser clasificado en el 2° lugar a

nivel mundial en cuanto a riqueza de plantas medicinales con alrededor de 4 mil especies

registradas (Conabio, 1998). La medicina tradicional en nuestro país es una importante

manifestación cultural, y se estima que 80 millones de personas (80 % de la población)

utilizan plantas medicinales; de las cuales 20 millones recurren exclusivamente a la

medicina tradicional y el resto combinan su uso con la medicina institucional (Estrada y

Morales, 2002).

A pesar de que la investigación sobre el uso de plantas medicinales ha tenido una amplia

trayectoria a lo largo de la historia de México, el rescate y validación de estos

conocimientos son recientes; esta situación ha retrasado la incorporación de sus productos

como medicamentos en la medicina moderna de nuestro país (Rivera, 1999; Estrada y

Morales, 2002). En la actualidad se ha incrementado el interés a usar terapias alternativas,

especialmente aquellas derivadas de plantas (Conabio, 1998; Rates, 2001); lo cual se

puede atribuir a diferentes factores como:

▫ La ineficiencia de la medicina institucional en muchos casos.

▫ La dificultad para personas de bajos recursos de tener acceso a los tratamientos

farmacológicos convencionales.

▫ provoca

▫ ión primaria de la salud con costos

accesibles a la mayor parte de la población.

El abuso y/o uso incorrecto de medicamentos de origen sintético que

efectos colaterales o secundarios en las personas que los consumen.

▫ La tendencia a creer que todos los productos naturales son inocuos.

La herbolaria se puede utilizar para la atenc

– 6 –

ANTECEDENTES

Desafortunadamente, la sobreexplotación de las plantas medicinales está conduciendo a

la desaparición de las especies de su hábitat natural; ya que más del 90 % de las plantas

edicinales que se usan en México son de origen silvestre, y no existe una regulación

den alimentar de ellas, lo cual indica una

xicidad inusual y una estrecha relación evolutiva entre la planta y el insecto (Rojas, 2000;

os de bioprospección, pero al mismo tiempo buscar los mecanismos para no

obreexplotar los recursos biológicos en los diferentes ecosistemas (Massieu y Chapela,

ralmente, como en el conocimiento de las condiciones de su cultivo, lo que

ervirá para contribuir con la conservación de las poblaciones silvestres (Pelt, 1992; Bye y

ol., 1995).

m

legal para su uso personal.

Pero quizá la mayor amenaza a la conservación de las plantas medicinales es la alteración

de su hábitat natural (Craker, 1999); por lo que también es importante considerar el papel

que tienen algunas especies dentro de los ecosistemas que forman parte. El ejemplo más

ilustrativo se tiene en la India, donde Aristolochia indica es una especie medicinal que ha

sido declarada en peligro de extinción, lo cual ha colocado a la mariposa Tros aristolochae

(‘cola de golondrina’) también en riesgo, ya que ésta deposita sus huevecillos sobre la

planta; la cual no solo sirve como fuente de alimento para sus orugas, sino que éstas

aprovechan las sustancias químicas para utilizarlas como defensa contra sus

depredadores. De hecho, la mayoría de las orugas de la tribu Troidini se alimentan

exclusivamente del follaje de plantas de la familia Aristolochiaceae; y aparentemente

pocos insectos además de la tribu Troidini se pue

to

Sime y Feeny, 2000; Mebs y Schneider, 2002).

En este sentido, es importante buscar el aprovechamiento de la biodiversidad a través de

proyect

s

2002).

La necesidad de conservar plantas medicinales para los usos tradicionales, modernos y

futuros, requiere de muchos esfuerzos tanto en el hábitat donde las plantas medicinales

crecen natu

s

c

– 7 –

ANTECEDENTES

2.2 IMPORTANCIA DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS

De manera general, las plantas producen una gran variedad de compuestos químicos

involucrados en sus interacciones ecológicas llamados ‘metabolitos secundarios’

(Veerporte y Beck, 1998). Las funciones del metabolismo secundario se pueden referir

como mediadoras de la interacción de las plantas con el medio donde se desarrollan

como: interacciones planta-insecto, planta-microorganismo y planta-planta; estas

interacciones pueden desempeñar funciones de defensa (contra animales herbívoros,

microbios patógenos y virus), funciones de señal (atracción de animales polinizadores o

ispersores de semillas), y/o alelopáticos (fenómenos de competencia entre especies

stos bioactivos ha sido poco estudiada o se desconoce (Craker, 1999); sin

como:

▫ ntrar diferencias entre plantas de diferentes

▫ Tejidos, órganos y estados de desarrollo. En la mayoría de las plantas la

síntesis y acumulación de metabolitos secundarios esta regulada en espacio y

mente varía en los diferentes

tejidos y órganos de la planta y en algunos casos, se ha observado que existe

▫

tivos, que se convierten a compuestos

d

vegetales por espacio, luz y nutrientes), (Wink, 1999; Wink, 2003).

Aunque los metabolitos secundarios son muy comunes en el reino vegetal, esto no

significa que todas las plantas pueden producir cualquier metabolito. Para la mayoría de

las especies medicinales la relación entre los factores ambientales y la producción de

compue

embargo, se ha observado que en general su contenido es variable y depende de factores

Ecotipos o razas. Se pueden enco

poblaciones de una especie, e incluso diferentes genotipos entre individuos de

la misma población. (Wink, 1999).

tiempo; esto es, el perfil de los compuestos normal

una variación estacional e incluso diurna.

Estado de salud. Una planta herida o infectada puede contener compuestos que

no están presentes normalmente en plantas intactas y sanas; esto puede ser

por la presencia de precursores inac

activos por mecanismos de respuesta al estímulo; o bien, porque los

compuestos son sintetizados en el momento que se requieren para la defensa

(Veerporte y Beck, 1998; Wink, 2003).

– 8 –

ANTECEDENTES

▫

a los diferentes cambios del medio (temperatura, precipitación

pluvial, luz, altitud, tipo de suelo, etc.) con variaciones durante su ciclo de

n la industria farmacéutica (Bye y col., 1992). Cabe señalar que las

ondiciones de cosecha y procesamiento de las plantas también pueden influir en el

encionó anteriormente, diferentes factores pueden afectar su

omposición química. Para asegurar esa composición y por lo tanto la eficacia de las

lantas medicinales se requiere de cultivos uniformes en condiciones estandarizadas

otipotencia’ de las células vegetales, que significa que cada una de ellas tiene la misma

Medio. Es la suma de las influencias externas que modifican el crecimiento, la

estructura y reproducción de los organismos en un lugar dado. Las plantas son

susceptibles

desarrollo, lo que incluye la producción de metabolitos secundarios (Estrada y

col., 1992).

Una cantidad importante de metabolitos secundarios como alcaloides, terpenoides,

flavonoides, entre otros, han sido aprovechados por el hombre de diversas maneras: por

ejemplo, para la producción de colorantes, insecticidas, saborizantes, fragancias y

estimulantes (Wink, 1999; Veerporte y Memelink, 2002). Adicionalmente, sus propiedades

farmacológicas son la base del uso de las plantas en la medicina tradicional, así como de

su explotación e

c

contenido de metabolitos secundarios del producto destinado para ser explotado

comercialmente.

Las plantas pueden ser la fuente renovable más abundante y de menor costo para la

obtención de metabolitos secundarios complejos con propiedades farmacológicas; sin

embargo, como se m

c

p

(Raskin y col., 2002).

2.3 MICROPROPAGACIÓN

Micropropagación, propagación por cultivo de tejidos y propagación in vitro son sinónimos

de un procedimiento que consiste en la multiplicación vegetativa in vitro para regenerar

nuevas plantas a partir de un ‘explante’ que es un pequeño fragmento de cualquier parte

de la planta (hoja, tallo, raíz, yemas, anteras, etc.). Este procedimiento se basa en la

‘t

– 9 –

ANTECEDENTES

información genética que le permite desarrollar por sí misma un individuo completo

idéntico a la planta de la cual se derivó (Lozoya, 1985; Robert y col., 1993; Chawla, 2002).

La micropropagación puede llevarse a cabo por diferentes procedimientos; sin embargo,

como el principal objetivo de la micropropagación es multiplicar con eficacia una planta

produciendo individuos idénticos a la planta madre, los procesos más comúnmente

empleados son: a) la embriogénesis directa a partir de algún explante y, b) el cultivo de

yemas que es el método más comúnmente utilizado. En ambos casos se obtienen

rocesos eficientes de multiplicación y con estabilidad genética ya que se evitan las

a micropropagación difiere de otros métodos convencionales de propagación en que las

condicio ép

micropropagación

ase 0 Inducción. El explante es cortado de la planta, desinfestado y sembrado

ase 1 Multiplicación. Los brotes inducidos en la fase anterior son cortados y

Fase 3

as plantas requieren

ser aclimatizadas, mediante una reducción gradual de la humedad para

de microorganismos (Robert y col., 1993).

p

diversas fases que se tienen con los tejidos desdiferenciados conocidos como callos

(Robert y col., 1993).

L

nes as ticas de cultivo son esenciales para tener éxito. El proceso de

se puede dividir en cuatro fases:

F

en un medio de cultivo. En este medio se induce la formación de brotes

adventicios o de la embriogénesis.

F

resembrados para incrementar el número de individuos. Este proceso

puede repetirse varias veces.

Fase 2 Enraizamiento. El total de brotes obtenidos de la fase anterior son

tratados para inducir la formación de raíces y formar plantas completas.

Transplante. Las plantas salen del ambiente in vitro para iniciar su

desarrollo en condiciones externas. En esta fase, l

que las plantas no mueran por pérdida excesiva de agua o por el ataque

– 10 –

ANTECEDENTES

Son var

importante

▫ El origen del explante (raíz, tallo, hojas, etc.) y la edad fisiológica de la fuente

▫

lativa a la concentración de auxinas induce la

formación de brotes y por el contrario, alta concentración de auxinas relativa a la

concentración de citocininas induce la formación de callos y en algunos casos

▫ Factores físicos tales como: el pH del medio de cultivo; la iluminación, tanto la

aria; ya que el proceso está estrechamente ligado a la producción de plantas libres

e patógenos. Incluso se pueden establecer procesos de micropropagación para obtener

e una sola

lanta madre en cuestión de meses. Sin embargo, es muy importante tomar en cuenta la

fraestructura del sistema que es su principal desventaja, ya que se requiere personal

de energía y equipo de laboratorio (Lozoya, 1985).

ios los factores que determinan la inducción de brotes y raíces; algunos de los más

s son:

del explante, ya que los tejidos jóvenes tienen mayor capacidad de

diferenciación que los viejos.

La combinación de fito-reguladores para estimular una característica particular

del crecimiento y desarrollo a partir de los explantes. Las auxinas y las

citocininas son las más comúnmente empleadas. En general, una alta

concentración de citocininas re

de raíces (Robert y col., 1993).

duración diurna (fotoperíodo) como la calidad (longitud de onda e intensidad) y

la temperatura que dependerá de la especie (Lozoya, 1985; Rout y col., 2000).

La utilidad de la micropropagación con fines comerciales se basa en la uniformidad

genética del material, evitándose las variaciones genotípicas propias de poblaciones

generadas por semilla sexual en muchas especies. Otras ventajas de la técnica son la

disponibilidad de la planta todo el año, y la obtención de material de alta calidad

fitosanit

d

plantas libres de virus (Lozoya, 1985; Robert y col., 1993; Villarreal, 1993; Rout y col.,

2000).

En teoría, es posible producir cientos de miles de individuos clonales a partir d

p

in

capacitado, gran suministro

– 11 –

ANTECEDENTES

2 4

ias de ellas son endémicas; debido a la semejanza de su

orfología a muchas de ellas se les conoce comúnmente como ‘guaco’, ‘pato’ o ‘tlacopatli’

lacrán e inductor de contracciones uterinas (El-Tahir, 1991);

ntiasmático, contra mordedura de serpiente, infecciones generales, inducción de aborto

9), contra veneno de serpientes

eyes, 1995; Otero y col., 2000), tratamiento contra el SIDA (Achenbach y col., 2002), y

ca por su uso medicinal y como plantas de ornato. Al respecto,

ólo tres estudios con plantas del mismo género se encontraron disponibles en la

bibliogra

a)

n

. GÉNERO Aristolochia

Aristolochia es el género más grande de la familia Aristolochiaceae con aproximadamente

550 especies distribuidas en gran parte del mundo. En México existen cerca de 65

especies de Aristolochia y var

m

(Martínez, 1959; Kelly, 2000).

A las especies de este género, se les atribuyen diversas propiedades terapéuticas, entre

las que se pueden mencionar: purgante, antihelmíntico, antipirético, emenagogo, antídoto

contra veneno de a

a

(Lemos y col., 1993).

Recientemente se han reportado varios estudios de la actividad biológica de plantas

pertenecientes a este género como: citotóxico (Mongelli y col., 2000), antimicrobiano y

citotóxico (Murillo y col., 2001), antiespasmódico (Haruna y Choudhury, 1997),

antiinflamatorio (Hutt y Houghton, 1998), antifúngico (Gadhi y col., 2001), antibacteriano

(Shafi y col., 2002), insecticida (Broussalis y col., 199

(R

contra veneno de alacrán (Rojas, 2002; Jiménez, 2004).

Existen escasos reportes de micropropagación de las especies de éste género, a pesar de

su importancia económi

s

fía consultada:

En A. indica, mediante el uso de ácido naftalenacético (ANA) 0.5 µM + 6-

bencilaminopurina (BAP) 13.3 µM en el medio MS, se obtuvieron de 2 a 3

brotes por explante en 4 subcultivos de 28 días. Se indujo la formación de

raíces con ácido indolbutírico (AIB) 2.46 µM en el medio, con lo que se logró un

85 % brotes enraizados. Después de su aclimatización en un medio líquido co

– 12 –

ANTECEDENTES

vermiculita como soporte, las plantas se transfirieron a tierra y se cultivaron en

b)

nudos a partir de uno. La inducción de raíces se logró con la adición de AIB 2.5

c) edio de 4.2 brotes por explante

mediante el uso de BAP 2.0 µM en el medio MS. La inducción de raíces se

logró con la adición al medio de ácido indolacético AIA 5.0 µM, logrando un 24

o raizados (Svensson, 2000).

ia de Brasil, la cual se

ncuentra distribuida en el continente americano desde Florida (en E.U.) hasta Argentina

de diámetro de color verde-limón cuando inmadura, parda cuando madura.

emillas numerosas, planas, ovaladas, de 3-6.5 mm de largo, 2-5 mm de ancho, 0.5 mm

de grueso, la testa delgada, aceitosa, brillante, lisa, el endospermo abundante, el embrión

pequeño.

invernadero, donde se logró el 90 % de supervivencia (Manjula y col., 1997).

En A. fimbriata, mediante el uso de BAP 5.0 µM en el medio MS, se logró el

crecimiento de un solo brote (3.79 cm de largo), con el que se obtuvieron 8

µM al medio (MS al 50 %), con lo que se lograron poco mas de 10 raíces por

brote; mientras que ANA solo indujo la formación de callos (Bravo y col., 1999).

En A. manchuriensis, se reportó un prom

% de br tes en

2.5 Aristolochia elegans

Aristolochia elegans Mast., sin. A. littoralis, es una especie originar

e

(Ortega y Ortega, 1997); aunque también se reporta su cultivo como planta ornamental en

algunos países como Egipto y Taiwán (El-Sebakhy y col., 1984).

Ortega (1997), describe las plantas de esta especie con las siguientes características:

Lianas perennes, de 1-5 m de largo, el tallo rugoso. Hojas acorazonadas-triangulares, de

3.5-12.5 cm de largo, 4.5-12 cm de ancho. Flores axilares, solitarias de 14.5-27 cm de

largo, color verde-cremoso y púrpura (Figura 2). Cápsula cilíndrica, de 2.5-5 cm de largo,

0.7-2.5 cm

S

– 13 –

ANTECEDENTES

Figura 2. Flor de Aristolochia elegans

En México se ha identificado la presencia de esta especie en estado silvestre

principalmente, en zonas desde los 380 hasta los 700 m sobre el nivel del mar; dentro de

vegetación de tipo bosque caducifolio, bosque de encino, selva mediana subperenifolia y

selva baja caducifolia en los estados de Nuevo León, Tamaulipas, Estado de México,

Morelos, Chiapas y Veracruz (Ortega y Ortega, 1997). Sus nombres comunes más

conocidos son igualmente, guaco, pato y tlacopatli y su época de floración es de Marzo a

Julio.

Son amplios los estudios fitoquímicos que se han realizado en esta especie, de la que se

han identificado hasta 142 compuestos (Cuadro 1), muchos de los cuales podrían estar

relacionados con las diferentes propiedades terapéuticas que se le atribuyen.

– 14 –

ANTECEDENTES

Cuadro 1. Compuestos quím cos encontrados en A. elegans. i

PARTE DE LA PLANTA COMPUESTOS REFERENCIA

hoja y raíz Bisbencilisoquinolinas: (-)-temuconina y (-)-(R,R)-7´-O-metilcuspidalina

Alcaloide aporfínico: magnoflorina Alantoína

El-Sebakhy, 19841989

hoja, raíz y tallo

Se identificaron 58 compuestos volátiles: 4 monoterpenos (p.ej. α y β-pineno) 5 monoterpenos oxigenados (p.ej. 1,8 cineol, borneol

y acetato de bornilo) 28 sesquiterpenos (p.ej. cariofileno) 18 sesquiterpenos oxigenados (p.ej. nerolidol)

Vila y col., 1997

hoja, raíz y tallo

Ácidos aristolóquicos (AA): AA I, AA D y aristolósido Dímero (diterpeno+AA): Aristolina Metilesteres de AA: metilester de AA Ia, AA IV, AA D,

metil aristoloquiato Aporfinas: magnofolina, oxonuciforina,

isomoschatolina, 4,5dioxodehidroasimilobina Isoquinolinas: aristoquinolina A, B, C, pericampilinona-

A, coridaldina, talifolina, nortalifolina, N-metil-coridaldina

Aristolactamas: Aristolactama E, A II, A IIIa, C N-β-D-glucósido, A IIIa -6-O-β-D-glucósido, 9-metoxiaristolactama, isoaristolactama

Esteroides: β-sitosterol, β-sitosterilglucósido, felocriseina

Sesquiterpenoides: Aristololido Diterpenoides: ent-kauran-16β,17-diol, ent-16β,17-

epoxikauran, ent-kaur-15-en-17-ol, ent-15β,16-epoxikauran-17-ol

Tetralonas: Aristelegona A, B, C, D Amidas: N-trans-feruloiltiramina, N-cis-feruloiltiramina,

N-trans-cinamiltiramina, N-p-trans-cumariltiramina Lignanos: (-)-cubebina, α-metilcubebina, β-

metilcubebina, (-)-hinokinina, (-)-5’’-metoxihinokinina, (-)-kobusina, (+)-medioresinol, aristelegina A, B, C

Bifenil éteres: ácido 4-metoxi-3-4’-oxidibenzoico Aristogina A, B, C, D, E, F Bencenoides: metilparabeno, metilvainillato, p-

hidroxibenzaldehido, vainillina, metil4-hidroxi-metoxicinamato, ácido cinámico, ω-hidroxipropioguayacona, ficusol

Wu y col., 20002002

Shi y col., 2004

– 15 –

ANTECEDENTES

2.6 ENVENENAMIENTO POR PICADURA DE ALACRÁN

El veneno de los alacranes es producido por glándulas que se localizan en la cola. Al

ocurrir el piquete, el veneno se inyecta subcutáneamente y posteriormente se distribuye a

otras partes del cuerpo a través del sistema circulatorio (Hutt y Houghton, 1998). Se trata

de una mezcla compleja de diferentes sustancias entre las que se encuentran proteínas,

péptidos, aminoácidos libres y aminas activas entre otros (Osnaya y col., 2001; Rojas,

2002); sin embargo, los componentes responsables de la toxicidad del veneno son

principalmente los péptidos. Los péptidos, también llamados neurotoxinas, están formados

por 30-80 residuos de aminoácidos y tienen como blanco los canales iónicos de Na+, K+,

Cl- y Ca2+ en las membranas de células excitables (como las nerviosas y musculares); la

acción de estas toxinas en los canales iónicos provoca muchos de los síntomas tóxicos del

veneno.

Particularmente la toxicidad del veneno de la especie Centruroides limpidus limpidus Kash,

reside principalmente en péptidos de 60-70 residuos de aminoácidos; los cuales son

altamente estables por su bajo peso molecular y por 4 puentes disulfuro que consolidan su

estructura tridimensional. Estos péptidos afectan los canales iónicos de sodio (Na+)

modificando sus mecanismos de apertura y cierre. Como resultado de esto, ocurre la

alteración de la transmisión de impulsos nerviosos en los sitios presinápticos de los

nervios colinérgicos y adrenérgicos, favoreciendo la liberación súbita y masiva de

acetilcolina y catecolaminas respectivamente; lo que provoca a su vez alteraciones

funcionales de diversos órganos y tejidos (Possani y col., 1999).

Los efectos principales de la intoxicación se da en los sistemas cardiovascular y

respiratorio pero también hay estimulación de las actividades del sistema nervioso

simpático y parasimpático, lo que explica la mayoría de los síntomas clínicos del

envenenamiento. El veneno contiene además hialuronidasa que aumenta la permeabilidad

capilar para facilitar su absorción y 5-hidroxitriptamina (serotonina) de la que depende la

producción de dolor y edema en el sitio de la picadura (Montoya, 1996; Possani y col.,

1999; Osnaya y col., 2001).

– 16 –

ANTECEDENTES

En condiciones de laboratorio, la toxicidad del veneno depende principalmente de la

especie del alacrán; por ejemplo, C. limpidus limpidus presenta una dosis letal en ratones

de 0.61 a 3.31 mg de veneno por kg de peso corporal (promedio 2 mg/kg), para reducir en

un 50 % la población de animales de experimentación (parámetro conocido como DL50).

Otras especies como C. noxius, muestra una DL50 de 0.26 mg/kg; en otras palabras, es

casi 10 veces más letal (Dehesa y col., 1995). Sin embargo, también es muy importante

considerar las características de los animales de experimentación (generalmente ratones)

como la cepa, el sexo y la edad (Padilla y col., 2003).

Diferentes factores pueden contribuir a la variación de los efectos del envenenamiento por

la picadura de alacrán, como son: la especie del alacrán, la condición de la glándula

venenosa al momento de la picadura, la ruta de inyección, el número de picaduras, la parte

del cuerpo que sufrió la picadura, la cantidad de veneno inyectada, y la época del año;

además de factores propios de la víctima como: la edad, peso, estado nutricional y estado

de salud (Rangel y Gómez, 1997; Hutt y Houghton, 1998, Padilla y col., 2003).

Generalmente la población más afectada son los menores de edad sin distinción por el

género; las picaduras son más frecuentes en los miembros inferiores, ocurren

principalmente durante la noche (lo que demuestra sus hábitos nocturnos ya que durante

el día se esconden) y las picaduras son más frecuentes durante la temporada primavera-

verano (Marzo a Julio), lo que coincide con la temporada de su reproducción (Montoya,

1996; Rangel y Gómez, 1997; Osnaya y col., 2001). Las manifestaciones leves son dolor,

eritema e inquietud; además de entumecimiento y salivación excesiva, sensación de

hormigueo nasal y palpitaciones. El cuadro severo se manifiesta con fiebre, distensión

abdominal, movimientos oculares rápidos y visión borrosa; se acompañan de vómito,

sudoración profusa, insuficiencia cardiaca, edema pulmonar y choque. Los cuadros

severos también pueden acompañarse de convulsiones (Rangel y Gómez, 1997).

El anti-veneno de alacrán usado en México contiene fragmentos de anticuerpos

purificados [F(ab´)2]; este anti-veneno se obtiene a partir de suero de caballos hiper-

inmunizados con los venenos de los alacranes más peligrosos. El producto al ser

liofilizado, tiene la ventaja de que no requiere refrigeración y se puede mantener a

temperatura ambiente por varios meses por debajo de los 37 °C. El anti-veneno de alacrán

– 17 –

ANTECEDENTES

debe ser usado solo cuando se observen síntomas moderados o severos; y en general,

dos ámpulas son suficientes para controlar incluso casos severos. No obstante, dado que

el suero antialacrán proviene de anticuerpos de caballo, constituye a su vez un antígeno

ajeno al huésped y se corre el riesgo de alguna reacción anafiláctica (Osnaya y col., 2001;

Rojas, 2002).

2.7 PLANTAS USADAS EN EL TRATAMIENTO DE PICADURA DE ALACRÁN

El uso de plantas para aliviar los efectos de picaduras de alacrán es común en las

regiones donde existen alacranes, principalmente de países subdesarrollados. Hutt y

Houghton (1998) reportaron un total de 141 especies de 53 familias de plantas de

diferentes partes del mundo, a las que se les ha atribuido esta propiedad. La supuesta

propiedad anti-veneno de alacrán de estas plantas puede estar relacionada con diferentes

actividades, ya que los efectos terapéuticos de los productos naturales generalmente son

el resultado de mas de un compuesto activo y el resultado final puede deberse a diferentes

efectos (aditivos, complementarios, sinérgicos, antagónicos) de sus componentes.

(Blumenthal, 2000; Stermitz y col., 2000; Raskin y col., 2002; Loew y Kaszkin, 2002).

Sin embargo, son muy escasos los estudios para validar la efectividad de dichas

propiedades, para identificar los compuestos activos y sus mecanismos de acción contra el

efecto del veneno (Rojas, 2002; Jiménez 2004). El demostrar la efectividad de estas

plantas contra picaduras de alacrán es una tarea para países como México que sufre de

éste problema de salud y que tiene a su disposición recursos vegetales para explotarlos de

una manera racional.

2.8 GÉNERO Aristolochia EN EL TRATAMIENTO DE PICADURA DE ALACRÁN

Las plantas del género Aris olochia son ampliamente usadas en México para contrarrestar

los efectos del envenenamiento por picadura de alacrán (y otros animales ponzoñosos). Lo

anterior quedó establecido en los resultados de una encuesta realizada a nivel nacional

para conocer las plantas medicinales mas frecuentemente utilizadas por los terapeutas

t

– 18 –

ANTECEDENTES

tradicionales, donde se mencionó el uso del ‘guaco’ para alivio de este padecimiento en 18

sitios (aproximadamente el 50 % del total) donde se aplicó la encuesta (Lozoya y col.,

1987).

Como ejemplo, se puede mencionar la receta del uso de tlacopatli que describe Rojas

(1998): “… la raíz fresca o seca (10 g) se remoja en un cuarto de litro de alcohol durante 20

días, éste alcohol se unta en el piquete 2 o 3 veces”; aunque también otras recetas

recomiendan ingerir la infusión o tintura como lo menciona Cabrera (1996): “Tlacopatle.

Remedio: tomar uno o dos gramos de polvo de la raíz, o hacer una infusión con 20 grs. de

la misma en un litro de agua y tomar una tac ta. También puede prepararse una tintura con

50 grs. de la raíz machacada en 200 grs. de alcohol de caña puro, que se dejan reposar

durante una semana. Tomar una cucharadita cada hora, con un poco de agua”.

i

r t

r

r

El veneno de alacrán al ser inyectado ejerce una fuerte respuesta de inflamación en la

víctima; por lo tanto, no es de sorprender que ciertas plantas con propiedades anti-

inflamatorias como las del género A is olochia sean recomendadas para aliviar la picadura

(Hutt y Houghton, 1998). Es interesante que algunas plantas usadas para tratar el

envenenamiento por mordeduras de serpientes sean también usadas para dar alivio contra

picaduras de alacrán; dentro de este grupo se encuentran muchas especies del género

A istolochia. El ácido aristolóquico, un componente común de éste género, se ha

observado que interactúa con enzimas de venenos de serpientes como la fosfolipasa-A2

(PLA2), donde actúa como inhibidor no competitivo. PLA2 participa en la liberación de

ácidos grasos de fosfolípidos de membrana de la posición sn-2 (especialmente

araquidonato), necesarios para la biosíntesis de los eicosanoides; los cuales están

implicados en la cascada de reacciones de enfermedades inflamatorias (Chandra y col.,

2002). Puesto que las fosfolipasas tienen un papel importante en la respuesta de

inflamación y dolor, la inhibición de su actividad podría aliviar de manera similar esos

síntomas en el envenenamiento por picadura de alacrán (Hutt y Houghton, 1998; Rojas,

2002).

En particular, con respecto al uso de A. elegans como anti-veneno de alacrán, Jiménez

(2004) realizó una investigación con extractos de raíces de plantas silvestres en pruebas

farmacológicas tanto in vivo como in vit o. Los resultados mostraron en general, que los

– 19 –

ANTECEDENTES

extractos antagonizaron los efectos del veneno de Centruroides limpidus limpidus en los

modelos experimentales estudiados. Al respecto, A. elegans podría ser la especie vegetal

más frecuentemente usada para el tratamiento de picaduras de alacrán en el estado de

Morelos (Monroy y Castillo, 2000; Jiménez, 2004); aunque otros autores han reportado su

uso también contra picaduras de animales ponzoñosos (Avilés y Suárez, 1994) y como

anticrotálico Rojas (2002).

2.9 EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA

Una prueba farmacológica se aplica en un sistema biológico para conocer el efecto que le

provoca la interacción con una sustancia (extracto crudo, fracciones parcialmente

purificadas o compuestos puros) y puede ser mediante algún modelo in vivo o in vit o. Las

especies comúnmente utilizadas en animales intactos son los ratones, ratas y en algunos

casos gatos y cobayos; en tanto que en las pruebas in vi ro normalmente se utilizan

preparaciones aisladas de órganos o tejidos, y existen muchas modalidades dependiendo

del sistema fisiológico que se desea probar.

r

t

r

El modelo del ‘íleon aislado de cobayo’ se fundamenta en la capacidad de contracción del

íleon y es muy empleado para el estudio in vit o de los efectos de diferentes sustancias

como antiespasmódicas y en el sistema nervioso parasimpático. Sus principales ventajas

son: a) las contracciones son relativamente simples y rápidas de registrar, y b) se

requieren pequeñas cantidades de los compuestos. Sin embargo, la complejidad de los

posibles sitios y mecanismos de acción hace difícil la tarea de elucidar la manera exacta

en la cual la sustancia produce o inhibe las contracciones en el órgano (Samuelsson,

1991; Williamson y col., 1998).

El intestino delgado en los mamíferos está constituido de tres partes: duodeno, yeyuno e

íleon; el íleon es la parte más larga y constituye aproximadamente el 55 % de la longitud

total. La parte más externa del intestino se conoce como serosa. Bajo la serosa se

encuentran dos capas de músculo liso: en la primera las células musculares están

orientadas longitudinalmente, mientras que en la segunda están orientadas de forma

circular. Posteriormente se encuentra la submucosa y la mucosa.

– 20 –

ANTECEDENTES

Los intestinos contienen un sistema nervioso intrínseco: el sistema entérico (SE); pero

además contienen fibras nerviosas de origen extrínseco. Las fibras nerviosas y los

ganglios del SE están arregladas en varios plexos, que se encuentran en todas partes del

tubo digestivo y se extienden desde la parte del músculo liso del estómago hasta la parte

interna del esfínter anal. Los dos plexos dominantes son el plexo mientérico que se

encuentra entre las capas longitudinales y circulares de músculo y el plexo submucoso que

se encuentra dentro del tejido conectivo de la submucosa. Grupos de fibras nerviosas

conectan los ganglios en los plexos y forman redes continuas. La principal característica

del SE es la presencia de muchas diferentes substancias neurotransmisoras: acetilcolina,

noradrenalina, 5-hidroxitriptamina, sustancia P, etc. (Samuelsson, 1991).

Existen varias razones para considerar por separado el SE como una división específica

del sistema nervioso autónomo además de las divisiones del simpático y parasimpático:

▫ El SE es relativamente independiente del control central. El daño al sistema en

las rutas extrínsecas tiene poco efecto en las funciones digestivas.

▫ El número de neuronas en este sistema (107-108), es equivalente al número

total de neuronas en la médula espinal.

▫ Existen al menos diez diferentes tipos de terminales nerviosas en el SE.

ste cambio de estado

uede ser registrado durante todo el tiempo en que dura la prueba.

Las células musculares de un fragmento aislado del tejido están bajo la influencia de

señales de este SE y su estado contráctil depende del balance de la información que lo

controla (de estímulo o inhibición) transmitido mediante neurotransmisores, hormonas,

autacoides y otras sustancias; y este balance puede ser alterado por diferentes

compuestos. La adición de un compuesto bioactivo al baño en el cual está suspendido el

fragmento aislado del íleon, puede causar un cambio en el estado contráctil de los

músculos, provocando una contracción o relajación del tejido. E

p

– 21 –

ANTECEDENTES

Los cambios provocados por el o los compuestos bioactivos pueden ser el resultado de

ferentes mecanismos:

▫ ón de neurotransmisores.

▫ La interferencia con segundos mensajeros, p.ej. adenosina monofosfato (AMP)

influyen en los niveles de

▫ La acción directa sobre las células del músculo liso.

▫ Tratándose de extractos, los efectos pueden ser una combinación de diferentes

mecanismos, ya que son mezclas generalmente de una gran cantidad de

sustancias desconocidas.

di

La interferencia en la liberación o desactivaci

▫ La acción directa del compuesto en los receptores de los transmisores ó en los

receptores para las hormonas o autacoides.

o guanosina monofosfato (GMP) cíclicos, los cuales

calcio que participan de manera muy importante en la contracción muscular.

– 22 –

33 jjuussttiiffiiccaacciióónn

JUSTIFICACIÓN

La disminución de las poblaciones silvestres de Aristolochia elegans es una consecuencia

de la colecta indiscriminada para uso medicinal. La micropropagación y cultivo en

invernadero de ésta especie, es una alternativa biotecnológica para la obtención de

plantas sanas y homogéneas; con lo que se puede disponer de material vegetal para

futuras investigaciones de su aplicación en el tratamiento de la picadura de alacrán, lo que

además puede contribuir a evitar la desaparición de las poblaciones en estado silvestre.

En esta investigación se propone que mediante la micropropagación y cultivo de A.

elegans se pueden obtener plantas con capacidad de antagonizar en íleon de cobayo, el

efecto de contracción inducido por veneno de alacrán, semejante a la reportada de plantas

silvestres; lo cual será un indicativo de su efectividad terapéutica como anti-veneno de

alacrán.

– 23 –

44 oobbjjeettiivvooss

4.1 Objetivo general

• Determinar si los extractos de las plantas de Aris olochia elegans Mast. (obtenidas

por micropropagación y crecidas en invernadero), tienen la capacidad de relajar el

íleon de cobayo contraído por efecto del veneno de alacrán Centruroides limpidus

limpidus Karsch, de manera semejante a la reportada para plantas silvestres.

t

r

r

4.2 Objetivos particulares

• Establecer las condiciones de desinfestación y germinación in vit o de semillas de

A. elegans.

• Establecer las condiciones de micropropagación de A. elegans a partir de yemas

axilares y apicales.

• Obtener plantas por cultivo in vit o y aclimatizarlas a condiciones ex vitro mediante

un sistema hidropónico.

• Obtener extractos metanólicos y hexánicos de las plantas cultivadas.

• Evaluar el efecto relajante de los extractos en íleon aislado de cobayo, contraído

por veneno de alacrán C. limpidus limpidus.

– 24 –

55 mmaatteerriiaalleess yy mmééttooddooss

MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 MATERIALES

5.1.1 Material biológico

Se utilizaron semillas de plantas de A. elegans cultivadas en la parcela experimental del

Centro de Investigación Biomédica del Sur-IMSS en el Municipio de Xochitepec, Morelos.

Estas plantas fueron identificadas previamente por personal del herbario del IMSSH y

registradas con el número HPMIMSS13595.

5.1.2 Reactivos y material de laboratorio

Todos los reactivos usados fueron grado analítico de las marcas Merck, Sigma, Baker y

Mallinkrodt; el material de vidrio fue el común de laboratorio.

5.2 METODOLOGÍA EXPERIMENTAL.

En la Figura 3 se muestra el diagrama de flujo de las etapas experimentales. Cabe

mencionar que las etapas correspondientes a la micropropagación, aclimatización y cultivo

en invernadero fueron realizadas en el Laboratorio de Cultivo de Células Vegetales y en el

Invernadero del CeProBi en Yautepec, Morelos; mientras que la obtención de los extractos

de las plantas micropropagadas y la prueba farmacológica se efectuaron en las

instalaciones del CIBIS-IMSS en Xochitepec, Morelos.

Colecta de semillas

Plántulas asépticas Desinfestación Germinación

Factorial (explantes y fito-

reguladores) Aclimatización Enraizamiento Multiplicación

Transferencia a invernadero

Obtención de extractos

Cosecha Prueba farmacológica en íleon de cobayo

Figura 3. Diagrama de flujo del desarrollo experimental.

– 25 –

MATERIALES Y MÉTODOS

5.3 MICROPROPAGACIÓN Y CULTIVO

5.3.1 Condiciones generales de preparación de medio de cultivo

El medio de cultivo basal empleado fue el MS (Murashige y Skoog, 1962). En la

preparación del medio de cultivo, antes de la adición del agar, se ajustó el pH

(Potenciómetro Jenco Electonics, LTD mod. 1671) a un valor de 5.8 (con HCl 0.1 N).

Todos los componentes del medio fueron mezclados antes de la esterilización. La

esterilización se llevó a cabo en autoclave (AESA, modelo C.V. 250) a una temperatura de

120 °C durante 20 min. En los diferentes experimentos cada unidad experimental (UE)

consistió de un frasco de vidrio transparente tipo ‘gerber’ (6.0 cm de diámetro y 6.0 cm de

altura con tapa de plástico) conteniendo el medio de cultivo (20 ml) y los explantes. Las

condiciones generales en la cámara de incubación fueron: temperatura de 25±2 °C, 16

horas de fotoperíodo con una irradiancia de 310 µmol m-2 s-1 (luxómetro Mavolux digital

B400, Bélgica) generados con lámparas de luz blanca fluorescente.

5.3.2 Desinfestación de semillas

Con la finalidad de obtener plántulas asépticas, se buscaron las condiciones de

desinfestación de semillas; para ello se siguió el proceso señalado en la Figura 4.

b1) tratamientos con etanol al 70 %

a) lavado de semillas con sol. detergente 1 % b) enjuague

i

desionizada; c) inmersión de las semillas a diferentes tratamientos con soluciones de

Figura 4. D agrama de flujo de la desinfestación de semillas.

En la primera etapa se aplicó el siguiente proceso: a) lavado con solución de detergente al

1% p/v en agua desionizada durante 30 min; b) tres enjuagues sucesivos con agua

c) tratamientos con NaClO d) enjuague e) siembra b2) enjuague

1ª etapa2ª etapa

– 26 –

MATERIALES Y MÉTODOS

hipoclorito de sodio (NaClO) de acuerdo a lo que se describe en el Cuadro 2; d) enjuague y

e) siembra en medio nutritivo.

Cuadro 2. Tratamientos para la desinfestación de semillas de A. elegans mediante la

TRATAMIENTO (% re)

combinación de tres concentraciones de NaClO con tres tiempos de inmersión.

NaClO Tiempo de inmersión cloro lib (min)

A 10

10

10

B C D E F G H I

0.5 0.5 0.5 1.0 1.0 1.0 1.5 1.5 1.5

5

15 5

15 5

15

on base en los resultados de la primera etapa, se eligió un solo tratamiento de acuerdo

n la desinfestación se trabajó con lotes de 25 semillas. La aplicación de las soluciones de

dentro de ella.

C

con el porcentaje de desinfestación y de germinación obtenido. En la segunda etapa se

modificó el proceso en el inciso (b) de la Figura 4, donde se aplicaron tratamientos con una

mezcla de etanol al 70 % v/v en agua desionizada con tres tiempos de inmersión: 1, 3 y 5

min previos al tratamiento en NaClO. El proceso finalizó con el enjuague y la siembra de

las semillas en el medio de cultivo.

E

lavado, desinfestante y enjuague se hicieron en una proporción de 1 ml de solución por

semilla tratada. La solución de detergente y de NaClO se prepararon a partir de los

productos comerciales Roma® y Cloralex® respectivamente; éste último con un contenido

de cloro libre de 6 %. Las semillas en contacto con las soluciones de etanol se agitaron

manualmente, mientras que con las soluciones de NaClO se utilizó un agitador magnético.

Los lavados con detergente, etanol y los enjuagues respectivos se realizaron fuera de la

campana; mientras que la inmersión en NaClO y la siembra de las semillas se realizaron

– 27 –

MATERIALES Y MÉTODOS

En la siembra se utilizó el medio MS al 50 % de concentración de nutrientes, sacarosa al

1.5 % (p/v) y agar al 0.4 % (p/v). Se colocaron cinco semillas (NSS = número de semillas

% SD = NSD x 100 NSS (1)

na vez que comenzó la germinación (emergencia de la radícula), se incubaron las

plántulas en una irradiancia de 310 µmol m s y 16 horas de fotoperíodo.

manas de edad. Los explantes se obtuvieron por cortes de

s plántulas en segmentos de 0.5 cm de longitud que contenían la yema apical y

Figura 5. Representación de los sitios de corte en las plántulas para obtener los explantes.

sembradas) sobre el medio de cultivo en cada unidad experimental (UE). Cada tratamiento

se aplicó en tres UE en la primera etapa y en seis en la segunda. Las cuales se

mantuvieron dentro de la cámara de incubación durante dos semanas en oscuridad; al

término de este tiempo se realizó la evaluación del número de semillas desinfestadas

(NSD). Se consideraron como desinfestadas a aquellas semillas en las que no se observó

crecimiento de microorganismos a su alrededor. El porcentaje de semillas desinfestadas

(% SD) se obtuvo mediante la siguiente ecuación:

÷

U-2 -1

5.3.3 Inducción de brotes

Se utilizaron plántulas de 8 se

la

segmentos de tallo de 1 cm con un solo nudo que incluía la yema axilar (Figura 5).

yema axilar

yema apical

– 28 –

MATERIALES Y MÉTODOS

Se pla ción

últiple, donde se evaluaron las variab EXPLANTE (yemas apicales y yemas

ión se realizó al cumplirse la sexta semana de incubación; para lo cual se contó

l número total de brotes en cada unidad experimental (TBU). El índice de brotes por

Cuadro 3. Tratamientos con los fito-reguladores ANA y/o BAP para la inducción de brotación múltiple en dos tipos de explante (yemas apicales y yemas axilares).

nteó un diseño experimental bifactorial para obtener la respuesta de brota

les: TIPO DEm

axilares) y TRATAMIENTOS CON LOS FITO-REGULADORES ANA y BAP; éstos se adicionaron al

medio de cultivo en las concentraciones como se indica en el Cuadro 3, donde se incluyó

también un control sin fito-reguladores. Se utilizó el medio MS al 100 % de concentración

de nutrientes, sacarosa al 3.0 % (p/v) y agar al 0.8 % (p/v). En cada UE se sembraron tres

explantes (NES = número de explantes sembrados) y cada tratamiento se realizó por

triplicado.

La evaluac

e

explante (IBE) se obtuvo mediante la siguiente ecuación:

IBE = TBU ÷ NES (2)

ANA BAP

TRATAMIENTOConcentración (µM)

1

0.0

5.0

2

3

4

5

6

7

8

0.0

0.0 2.5

0.0

0.5

0.5

0.5

0.5

0.0

10.0

0.0

2.5

5.0

10.0

as diferentes fases que se siguieron para la micropropagación de A. elegans, se

presentan en la Figura 6.

L

re

– 29 –

MATERIALES Y MÉTODOS

Multiplicación

Inducción de brotes

Explantes asépticos

Aclimatización

Elongación y enraizamiento

Transferencia al sustrato

Figura 6. Esquema en el que se muestran las diferentes fases de

.3.4 Multiplicación y elongación de brotes

a multiplicación se realizó con diez explantes colocados en medio de cultivo con el

.3.5 Inducción de raíces

imultáneamente a la elongación de brotes y con base en los trabajos reportados sobre

micropropagación de A. elegans.

5

L

tratamiento que presentó el mayor rendimiento, incubados durante 4 semanas y al término

de éste período, se separaron los brotes mayores a 0.5 cm para subcultivarse. La etapa de

multiplicación concluyó al terminar el segundo período de cultivo y todos los brotes

resultantes se sembraron en medio de cultivo sin fito-reguladores para su elongación; en el

que permanecieron durante 3 semanas.

5

S

inducción de raíces en otras especies de Aristolochia, se desarrolló un diseño experimental

para definir las condiciones de inducción de raíces en brotes de A. elegans. Para ello se

– 30 –

MATERIALES Y MÉTODOS

utilizaron plántulas asépticas de 6 semanas de edad, de las que se cortaron las yemas

axilares, que se sembraron en el medio de cultivo MS al 100 % de concentración de

nutrientes, sacarosa al 3.0 %, agar al 0.8 % y los fito-reguladores: ácido indolbutírico (AIB)

y ANA en diferentes concentraciones de acuerdo con el Cuadro 4.

Cuadro 4. Tratamientos con los fito-reguladores AIB y ANA para la inducción de

AIB ANA

raíces en explantes de yemas axilares.

TRATAMIENTOConcentració ) n (µM

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0.0

0.0

0.5

1.5

2.5

5.0

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

0.5

1.5

2.5

5.0

ada UE consistió en la siembra de 2 explantes (NES = número de explantes sembrados)

IRE = TRU ÷ NES (3)

l término de la prueba de inducción de raíces, los brotes elongados se transfirieron al

C

y cada tratamiento se realizó con cuatro UE. La evaluación se hizo al cumplirse la sexta

semana de incubación y para ello se contó el número total de raíces en cada unidad

experimental (TRU). El índice de raíces por explante (IRE) se obtuvo mediante la siguiente

ecuación:

A

medio de cultivo adicionado con el tratamiento que indujo el mayor número de raíces.

– 31 –

MATERIALES Y MÉTODOS

5.3.6 Aclimatización

as plantas enraizadas se aclimatizaron mediante el método desarrollado por Ventura

a aclimatización se hizo al exponer gradualmente las plantas a las condiciones ex vitro,

urante el proceso de apertura de la cubierta de plástico, se tomaron lecturas de humedad

÷ HR) (4)

Donde T se debe expresar en ° K (Salisbury y Cleon, 1994).

L

(1998; 2001). Éste consistió en un sistema hidropónico, conformado por un frasco de vidrio

que contenía solución nutritiva de Hoagland (Hoagland y Arnon, 1950), el pH se ajustó a

5.5. Después el frasco se tapó con papel aluminio, al que se le hizo un corte en forma de

‘V’ de 1 cm por lado para insertar la raíz, de esta forma el sistema radical quedó inmerso

en la solución. La parte aérea de las plantas se cubrió con una bolsa de plástico

transparente de 10 x 20 cm (Figura 6). La bolsa quedó boca abajo y se sujetó con una liga

cubriendo la planta; de esta forma se creó un ambiente semi-hermético en el sistema

hidropónico.

L

para ello, se hicieron perforaciones circulares de 0.6 cm de diámetro en la bolsa (parte

superior), con una perforadora manual (en cada perforación se obtienen dos orificios: uno

de cada lado de la bolsa). La apertura gradual se realizó de la siguiente manera: en el

transcurso de la primera semana las bolsas se mantuvieron intactas; al cumplirse la

primera semana, se realizó una perforación y uno de los orificios se cubrió con cinta

adhesiva para dejar sólo uno abierto; al cumplirse la segunda semana se abrió el orificio

que estaba cubierto. Al término de la tercera semana se realizó la segunda perforación; al

cumplirse la cuarta semana se realizó la tercera y cuarta perforación; finalmente en la

quinta semana se abrió totalmente la bolsa mediante un corte con tijeras, de manera que

las plantas quedaron expuestas a las condiciones de la cámara de cultivo: 16 h de

fotoperíodo con irradiancia de 310 µmol m-2 s-1, temperatura de 25 ± 2°C y humedad de 45-

48 % HR (termo-higrómetro digital Cole Parmer modelo PT8708).

D

de la cámara de incubación y dentro del sistema hidropónico de diez plantas. Con estos

valores se determinó el potencial hídrico (Ψ) atmosférico en la cámara y dentro del sistema

hidropónico, mediante la siguiente ecuación:

Ψ (MPa) = –1.06 T log (100

– 32 –

MATERIALES Y MÉTODOS

Cabe mencionar que al cumplirse el primer mes de aclimatización se cambió la solución

on la finalidad de comparar los parámetros mencionados, se obtuvo la velocidad

VE = (VNF (t2 – t1) (5)

.3.7 Cultivo en invernadero y cosecha

e utilizó un sustrato preparado en el invernadero con una mezcla de peat-moss, agrolita y

as plantas del sistema hidropónico se transfirieron a vasos de unicel de 0.2 l de

contenida en los frascos por solución recién preparada; en estas condiciones las plantas

se mantuvieron hasta cumplirse el segundo mes. Durante la aclimatización (tiempo 0, 1 y 2

meses), se evaluaron los siguientes parámetros de crecimiento: 1) número de nudos, 2)

número de raíces secundarias (las formadas en la interfase raíz-tallo), 3) longitud de la raíz

y 4) longitud de la parte aérea (desde la interfase raíz-tallo hasta la yema apical).

C

específica (VE) de cambio de cada uno, mediante los valores numéricos de los parámetros

evaluados al final de cada tiempo (VNF) y los del inicio (VNI) en los intervalos de tiempo:

0-1 mes (t1 y t2) y de 1-2 meses (t1 y t2), de acuerdo con la siguiente ecuación:

– VNI) ÷

5

S

vermiculita en una relación 3:1:1 respectivamente. El pH se ajustó dentro del intervalo de

6.0-6.5, mediante el uso de óxido de calcio (CaO), el cual se agregó en polvo sobre la

mezcla seca. La medición de pH se realizó de la siguiente manera: se pesaron 5 g de la

mezcla seca y se agregaron 50 ml de agua desionizada; se filtró sucesivamente con gasa

y papel filtro de poro grande; finalmente se midió el pH del filtrado. Una vez ajustado el pH,

el sustrato se esterilizó en autoclave durante 1 h a 120 °C.

L

capacidad que contenían el sustrato estéril. Una vez plantadas, se agregaron en cada vaso

50 ml de la misma solución nutritiva utilizada en el sistema hidropónico. Debido a la

heterogeneidad de la altura de las plantas y para facilitar su manejo, se realizó una poda

en todas ellas, dejándolas con una altura de 0.1 m. Las plantas contenidas en los vasos de

unicel se mantuvieron durante 3 semanas dentro del laboratorio; posteriormente, se

transfirieron a macetas de 2 l de capacidad cuyo volumen fue cubierto con el sustrato

antes descrito.

– 33 –

MATERIALES Y MÉTODOS

En estas macetas, al inicio y al cumplimiento de cada mes se agregaron 100 ml de la

solución nutritiva de Hoagland; además de los riegos con agua de la llave una vez por

semana. En cada maceta se colocó un tutor de madera (1.20 m aprox.) que sirvió como

guía a la planta. Las macetas se colocaron dentro del invernadero sobre una mesa (2.50 x

1.20 m) que tenía una altura de 0.70 m del piso.

Adicionalmente, se colocó una red (tela de malla de apertura muy fina) para cubrir el

espacio sobre la mesa (1.5 m de altura) donde se desarrollaron las plantas; esto sirvió de

barrera física para evitar la invasión de insectos. En estas condiciones de cultivo las

plantas se mantuvieron durante 5 meses. Durante el período de cultivo en el invernadero,

se obtuvieron lecturas de temperatura, humedad e irradiancia.

En la cosecha, se cortó la parte aérea y la raíz de cada planta a partir de la interfase tallo–

raíz. Las raíces se separaron manualmente del sustrato y tanto las raíces como las partes

aéreas se lavaron a chorro de agua para eliminar polvo y material del sustrato. El material

vegetal se mantuvo durante una semana para su secado a temperatura ambiente, en un

lugar sombreado y con ventilación. Los diferentes materiales (raíces y partes aéreas) se

molieron y se pesaron.

Se determinó la humedad de cada material por diferencia de peso a 70° C durante 32 h en

estufa (Imperial V, modelo 3471 Lab line instruments) con muestras de aproximadamente

0.5 g colocadas en una caja petri de vidrio. Una vez que se retiraron de la estufa, se

dejaron enfriar dentro de un desecador y se pesaron nuevamente. El porcentaje de

humedad (% H) se calculó mediante la siguiente ecuación:

% H = (MI – MF) x 100 ÷ MI (6)

Donde MI es el peso de la muestra inicial y MF es el peso de la muestra después de 32 h.

– 34 –

MATERIALES Y MÉTODOS

5.4 EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA

5.4.1 Obtención de extractos

Las partes aéreas y raíces se maceraron sucesivamente con hexano y metanol en dos

etapas de 24 h para cada disolvente. El procedimiento fue el siguiente: cada material

vegetal se colocó dentro de un matráz erlenmeyer de 2 l, se agregó hexano en razón de

0.8 ml por gramo de material seco. Se tapó el matráz y se dejó en reposo durante 24 h; el

macerado (el producto líquido de la maceración) se filtró sucesivamente con gasa y con

papel Watman No 4. El extracto se obtuvo por evaporación del disolvente a presión

reducida en rotavapor (Buchi mod. R-114) hasta casi el punto de sequedad. El extracto se

transfirió a frascos viales previamente pesados y el disolvente recuperado se agregó

nuevamente al matráz con el material vegetal. En la segunda etapa se repitieron todos los

pasos excepto al final donde en lugar de agregar el mismo hexano al matráz, se agregó

metanol en la misma proporción.

Los extractos de las diferentes etapas del mismo disolvente se colectaron en un frasco vial

y se dejaron secar a temperatura ambiente durante tres días; posteriormente se colocaron

en un liofilizador (Heto drywinner, mod. DW3) para eliminar al máximo los residuos de

disolvente y se pesaron los frascos con los extractos secos. Los rendimientos de

extracción (RE) se obtuvieron con una base de cálculo de 100 g de material vegetal de

inicio (MV) y el peso de extracto seco (ES) mediante la siguiente ecuación:

RE (%) = ES x 100 ÷ MV (7)

5.4.2 Obtención de veneno

Se colectaron alrededor de 100 alacranes de la especie Centruroides limpidus limpidus√∫

en una zona rural del Municipio de Puente de Ixtla, Morelos; de los cuales se obtuvo el

veneno por medio de un impulso eléctrico aplicado al telsón; el veneno secretado fue

depositado en cajas petri de vidrio. Posteriormente, el veneno se redisolvió en agua

√ ∫ Que es la especie más abundante en la región y sus características de color y tamaño permiten identificarlo fácilmente.

– 35 –

MATERIALES Y MÉTODOS

destilada y se clarificó por centrifugación. El sedimento se eliminó y el sobrenadante se

repartió en alícuotas de 300 a 500 µl dentro de frascos viales con capacidad de 1 ml

(previamente tarados); éstos se liofilizaron y finalmente se pesaron para determinar la

cantidad de veneno en cada uno.

5.4.3 Animales de experimentación

Se usaron cobayos machos de la cepa Hartley de 3 a 5 meses de edad, con un intervalo

de peso de 400 a 600 g, los cuales se mantuvieron en el bioterio del CIBIS-IMSS bajo

condiciones de temperatura controlada (22 ± 2 °C), bajo un ciclo de 12 h de luz por 12 de

oscuridad y con acceso libre a agua y alimento. Los cobayos se sacrificaron por

dislocación cervical. El íleon distal se obtuvo por laparotomía y se lavó cuidadosamente

con solución Tyrode (concentraciones mM de: NaCl 136.9, glucosa 11.1, NaHCO3 11.9,

CaCl2 1.4, KCl 2.7, MgCl2 0.5, NaH2PO4 0.4; con pH de 7.4).

5.4.4 Preparación de soluciones stock

Se prepararon soluciones stock de carbamilcolina, veneno y de los extractos vegetales. La

solución stock de carbamilcolina se preparó como solución acuosa en concentración de 1

mg/ml. Las soluciones stock de veneno se prepararon partiendo de la de mayor

concentración (6000 µg/ml); de esta se prepararon las soluciones stock restantes con

alícuotas de: 50, 79, 125, 199, y 315 µl, las cuales se completaron a un volumen de 500 µl

(con solución Tyrode) para tener concentraciones finales de: 600, 950.88, 1507.08,

2388.60 y 3780.00 µg/ml. Las soluciones stock de extractos se prepararon de la siguiente

manera: 300 mg de extracto (con tres gotas de Tween 20) se mezclaron con agua

destilada a un volumen final de 10 ml; de esta solución se tomaron alícuotas de: 0.3, 0.6,

0.9, 1.2, 1.5 y 1.8 ml y se completó el volumen a 3 ml con agua destilada para tener las

soluciones en concentraciones finales de: 3, 6, 9, 12, 15 y 18 mg/ml.

5.4.5 Preparación del equipo y cámara de incubación

Se cortó una sección de aproximadamente 2 cm del íleon. Uno de los extremos se sujetó

con hilos de seda al fondo de la cámara y el otro al transductor de fuerza (FT 100, CB

– 36 –

MATERIALES Y MÉTODOS

Sciences Inc.) el cual a su vez está conectado a un equipo digital de adquisición de datos

(Maclab 8) que envía la señal a un procesador de datos (Figura 7).

(b)

(1) Cámara de incubación

(2) Transductor de fuerza

(3) Equipo digital de adquisición

de datos

(4) Tanque de gases (O2 / CO2)

(5) Procesador de datos

(6) Regulador de temperatura

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(a)

iF gura 7. Equipo de prueba para el modelo de íleon aislado de cobayo. En (a),

fotografía del equipo y principales componentes; y (b), esquema que representa la cámara de incubación.

La porción del íleon siempre se mantuvo sumergido en solución Tyrode dentro de la

cámara de incubación (3 ml de capacidad) con burbujeo de una mezcla de CO2 y O2 (5 y

95% v/v respectivamente). El flujo de la mezcla de gases fue en el intervalo de 20-30

burbujas/min a temperatura constante de 37 °C, donde el fragmento de íleon se estabilizó

a 1 gf de tensión (Jiménez, 2004). Por la parte inferior, la cámara tiene un sistema de

drenaje para eliminar las soluciones de prueba y enjuague, además de un tubo delgado

para administrar la mezcla de gases; el control de temperatura se logra mediante una

doble pared de la cámara, donde se hace circular agua a la temperatura requerida (Figura

7b). Después de 20-30 min necesarios para la estabilización del sistema, se procedió al

inicio de las pruebas de contracción y relajación del íleon.

– 37 –

MATERIALES Y MÉTODOS

5.4.6 Contracción inducida por veneno de alacrán

Se consideró como el 100 % de contracción del fragmento del íleon, la fuerza de

contracción inducida por una solución de carbamilcolina (análogo de acetilcolina) en

concentración de 10-4 M. Para obtener la concentración final requerida, se aplicó una

alícuota de 55 µl de la solución stock.

Para cuantificar la contracción del íleon provocada por el veneno, se realizaron dos curvas

de concentración-respuesta. La primera consistió de un intervalo amplio de

concentraciones de veneno: 1, 10, 100 y 1000 µg/ml. En la segunda curva, se delimitó al

intervalo donde se alcanzó la mayor respuesta 10–100µg/ml; las concentraciones probadas

fueron: 101, 101.2, 101.4, 101.6, 101.8 y 102 µg/ml. En todos los casos se aplicaron alícuotas

de 50 µl de las soluciones stock de menor a mayor concentración para obtener la

concentración final requerida en la cámara. Después de cada prueba, el íleon se lavó

durante 10 min con solución Tyrode para recuperar la condición de reposo.

5.4.7 Prueba de relajación

Se agregaron 50 µl de la solución stock de veneno para alcanzar la concentración de 101.6

µg/ml (40 µg/ml) en el volumen de la cámara. Esta concentración se mantuvo fija para el

resto de las pruebas y se derivó de la prueba de la contracción inducida por el veneno. A

partir de la aplicación del veneno se inició el conteo del tiempo; transcurridos 0.5 min se

agregaron 50 µl de la solución stock de cada uno de los extractos (de menor a mayor

concentración) para obtener concentraciones finales en la cámara de 50, 100, 150, 200,

250 y 300 µg/ml y éstos se mantuvieron en interacción hasta cumplirse 2 min. En la Figura

8 se ilustra la forma como se procesaron los datos a partir de la respuesta gráfica que

proporcionó el equipo, para obtener el valor de porcentaje de relajación de íleon (%RI)

mediante la siguiente ecuación:

% RI = RI x 100 ÷ FCA (8)

– 38 –

MATERIALES Y MÉTODOS

Figura 8. Ejemplo de los registros gráficos típicos proporcionados por el equipo y los componentes para obtener el porcentaje de relajación.

5.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS

El análisis estadístico de los experimentos de desinfestación e inducción de raíces

consistió de un Análisis de Varianza (ANOVA) de un solo factor completamente al azar,

mientras que para el diseño experimental de inducción de brotes, así como en la prueba de

relajación, se aplicó un ANOVA de dos factores. Cuando el ANOVA indicó una diferencia

significativa entre los tratamientos, se aplicó el método de comparación de medias de

Tukey para encontrar los grupos que fueron estadísticamente diferentes. En todas las

pruebas se aplicó un nivel de significancia del 5 % (α = 0.05). Se utilizó el software Sigma-

Stat versión 3.0.

Tiempo de aplicación (min)0.5 0.0 2.0

1.0

4.0

7.0

Fuerza de contracción A (FCA)

Fuerza de contracción B (FCB)

Relajación de la porción de íleon (RI = FCA - FCB)

Fuer

za d

e co

ntra

cció

n (g

)

veneno 40 µg·ml-1 extracto

– 39 –

66 rreessuullttaaddooss yy ddiissccuussiióónn

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 MICROPROPAGACIÓN Y CULTIVO

6.1.1 Desinfestación de semillas

En el Cuadro 5 se presentan los resultados de desinfestación de las semillas

correspondiente a la primera etapa con hipoclorito de sodio (NaClO). Después de realizar

el análisis estadístico, los porcentajes de desinfestación se clasificaron en dos grupos de

acuerdo con las diferencias significativas que presentaron entre ellos: el grupo 1 que

incluyó los tratamientos A, B, C y D con medias del % de semillas desinfestadas (%SD) en

el intervalo de 6.7–13.3; y el grupo 2 que incluyó los tratamientos E, F, G, H e I, con los que

se obtuvieron valores en el intervalo de 46.7-60 %SD.

Cuadro 5. Efecto de soluciones de NaClO a diferentes concentraciones yiempos de inmersión, en la desin estación de semillas.

t f

TRATAMIENTO

NaClO (% cloro libre)

t de inmersión (min)

% SEMILLAS DESINFESTADAS

A

B

C

D

E

F

G

H

I

0.5

0.5

0.5

1.0

1.0

1.0

1.5

1.5

1.5

5

10

15

5

10

15

5

10

15

6.7

6.7

6.7

13.3

46.7

46.7

40.0

53.3

60.0

±

±

±

±

±

±

±

±

±

6.7

6.7

6.7

6.7

6.7

6.7

11.5

6.7

11.5

b

b

b

ab

a

a

a

a

a

i

rLos valores de % de semillas desinfestadas representan la media de tres un dades

experimentales ± e ror estándar. Los valores seguidos por diferente letra son significativamente diferentes (prueba de Tukey, α=0.05).

– 40 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los tratamientos dentro de cada grupo no fueron estadísticamente diferentes entre sí. En

el caso de los tratamientos A, B y C los bajos %SD se atribuyen principalmente a la baja

concentración de NaClO (0.5 %) y en el tratamiento D, aunque se incrementó la

concentración de NaClO a 1.0 %, el tiempo de contacto (5 min) no fue suficiente para que

el efecto en la desinfestación fuera diferente a los tres primeros tratamientos. En el grupo 2

no se encontró diferencia entre los tratamientos a pesar del incremento tanto de la

concentración de NaClO como del tiempo de contacto. Es importante señalar que con los

tratamientos E, F, G, H e I se observó una disminución de la capacidad de germinación de

las semillas desinfestadas como respuesta al incremento del tiempo de inmersión o de la

concentración de NaClO. Bajo estas circunstancias, se eligió el tratamiento E, ya que

dentro del grupo con mayor capacidad desinfestante es el tratamiento en el que se utiliza

la menor concentración de NaClO con el menor tiempo.

En el Cuadro 6 se muestran los resultados de la desinfestación logrados con la segunda

etapa. En estos resultados se observó un efecto importante en la desinfestación de las

semillas con respecto a los resultados de la primera etapa. El %SD incrementó con

relación al tiempo de contacto y se hallaron diferencias significativas entre los tres

tratamientos. Con el tratamiento de inmersión en etanol 70 % durante 5 min combinado

con el tratamiento E (NaClO 1.0 % durante 10 min de inmersión), se logró eliminar la

contaminación superficial de las semillas al 100 %, de las cuales el 93 % germinaron.

Cuadro 6. Efecto del uso de etanol al 70% con diferentes tiempos de inmersión combinado con el tratamiento E (NaClO 1.0 % / 10 min), en la des nfestación de

semillas. i

TRATAMIENTO % SEMILLAS DESINFESTADAS

Ea [etanol / 1 min + trat E]

Eb [etanol / 3 min + trat E]

Ec [etanol / 5 min + trat E]

56.7

76.7

100.0

±

±

±

6.1

6.1

0.0

c

b

a

Los valores de % de semillas desinfestadas rep esentan la media de seis unidades experimentales ± e ror estándar. Los valores seguidos por diferente letra son significativamente

diferentes (prueba de Tukey, α=0.05).

rr

– 41 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la Figura 9 se representan comparativamente los resultados del proceso global de las

dos etapas para la desinfestación, en la que se puede observar la tendencia a incrementar

el porcentaje de desinfestación por la combinación de los tratamientos con NaClO y etanol.

Ea Eb Ec

TRATAMIENTO

0

20

40

60

80

(b) 100

A B C D E F G H ITRATAMIENTO

Sem

illas

Des

infe

stad

as (%

)

(a)

Figura 9. Efecto de di erentes tratamientos en la desinfestación de semillas de A. elegans. En (a) se representan los valores obtenidos mediante tratamientos

de NaClO y en (b) los valores de etanol 70 % en diferentes tiempos de inmersión combinado con el tratamiento E. En (a), los valores representan la

media de tres unidades experimentales y en (b), de seis + error estándar.

f

Para lograr la esterilización superficial de las semillas de A. elegans, se requirió de un

proceso que involucró tres agentes químicos (detergente, etanol y NaClO) Generalmente

se recomienda el uso de varios agentes en un solo proceso ya que ninguno es ideal como

desinfestante por sí mismo (Pelczar, 1982). Al respecto, se sabe que la actividad del

detergente provoca la disminución de la tensión superficial del agua, lo que incrementa su

capacidad humectante; la actividad del etanol para desnaturalizar proteínas y disolver

lípidos; y la alta capacidad oxidante del NaClO. Estas actividades al combinarse en el

mismo proceso contribuyeron a reducir el número de esporas y microorganismos en la

superficie de las semillas.

– 42 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1.2 Inducción de brotes

En el Cuadro 7 se presentan los resultados de la formación de brotes en los explantes por

la inducción de los diferentes tratamientos de fito-reguladores. En los dos tipos de explante

se observó una tendencia a aumentar el número de brotes con el incremento de la

concentración de BAP (tratamientos 2 y 3), hasta alcanzar el valor máximo de brotación

con BAP 10 µM (tratamiento 4) el cual fue significativamente diferente al resto de los

tratamientos; es decir, que indujo el mayor número de brotes (3.1 en promedio, Cuadro 7).

Cuadro 7. Formación de brotes en yemas apicales y axilares por efecto de diferentes tratamientos con fito-reguladores .

TRATAMIENTO ÍNDICE DE BROTES POR EXPLANTE

ANA BAP Concentración

(µM) Yemas Axilares Yemas Apicales

1

2

3

4

5

6

7

8

0.0

0.0

0.0

0.0

0.5

0.5

0.5

0.5

0.0

2.5

5.0

10.0

0.0

2.5

5.0

10.0

1.3

1.6

1.7

3.1

1.9

2.2

2.1

1.9

±

±

±

±

±

±

±

±

0.2

0.1

0.2

0.1

0.2

0.3

0.1

0.4

b

b

b

a

b

ab

b

b

1.0

1.0

2.0

3.1

1.0

0.9

1.0

1.4

±

±

±

±

±

±

±

±

0.0

0.0

0.6

0.4

0.0

0.1

0.0

0.2

c

c

b

a

c

c

c

bc

Los valores de índice de brotes por explante representan la media de tres un dades experimentales ± e ror es ándar. En cada tipo de explante, os valores seguidos por diferente

etra son significativamente diferentes (prueba de Tukey, α=0.05).

ir t l

l

En cuanto al tipo de explante, no se encontró diferencia significativa en el número de

brotes inducidos con en tratamiento 4; sin embargo, un aspecto importante a considerar

fue el tamaño de los mismos ya que con los de mayor longitud se requieren períodos

– 43 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

menores de elongación. Con yemas axilares se obtuvieron brotes con una altura de 1-2

cm; mientras que con yemas apicales de 0.5-1 cm (Figura 10).

A B

Figura 10. Fotografías que representan los brotes formados por efecto de BAP

10 µM (tratamiento 4) en yemas axilares (A) y yemas apicales (B).

La adición de ANA 0.5 µM (tratamiento 5), no tuvo efecto significativo en la formación de

brotes con respecto al tratamiento 1 (control), en ambos tipos de explantes.

Para analizar la interacción de los dos fito-reguladores en el mismo medio (tratamientos 6,

7 y 8), se compararon contra los tratamientos con la misma concentración de BAP

tratamientos 2, 3 y 4, con los que se formaron las siguientes parejas: (2 , 6) , (3 , 7) y (4 ,

8); la diferencia es que el segundo tratamiento de cada pareja, contenía ANA 0.5 µM. De

acuerdo con los resultados, los tratamientos mediante la combinación de ANA 0.5 µM con

concentraciones crecientes de BAP tuvieron un efecto negativo en la inducción de brotes;

ya que se observó una tendencia a disminuir el IBE que se obtuvieron mediante el uso solo

de BAP. Para el caso de yemas axilares no se encontró diferencia significativa entre las

parejas de tratamientos 2-6 y 3-7, pero sí entre los tratamientos 4-8 con valores de 3.1 y

1.4 brotes por explante respectivamente. En cuanto a yemas apicales, el efecto fue más

marcado, ya que se halló diferencia significativa entre los tratamientos 3-7 y 4-8.

– 44 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

0

1

2

3

1 2 3 4 5 6 7 8TRATAMIENTO

Índi

ce d

e Br

otes

por

Exp

lant

eyemas axilares yemas apicales

Figura 11. Efecto de los diferentes tratamientos de fito-reguladores, en laformación de brotes en yemas apicales y yemas axilares. Los valores

representan la media de tres unidades experimentales + error estándar.

r

t

Del género Aristolochia solo tres especies se han cultivado in vit o según los reportes

disponibles; con respecto a A. elegans, no se tiene conocimiento de su cultivo in vi ro, por

lo que en este trabajo sería la primera ocasión que se está reportando. En esta

investigación se indujo la formación de brotes principalmente por efecto de BAP en una

concentración de 10 µM, que es diferente a las condiciones de inducción de brotes

reportadas para A. indica con BAP 13.3 + ANA 0.5 µM (Manjula y col., 1997), A. fimbriata

con BAP 5.0 µM (Bravo y col., 1999) y A. manchuriensis con BAP 2.0 µM (Svensson,

2000).

Se sabe que los procesos del desarrollo en las plantas están regulados por la acción y el

balance de diferentes tipos de fito-reguladores, los cuales pueden actuar como promotores

o inhibidores de estos procesos. Los niveles endógenos de estos reguladores pueden ser

muy variables ya que están regulados en su síntesis, movilización de reservas, activación,

y degradación a otros compuestos (Ortuño y col., 1999). Las diferencias en las respuestas

a la inducción de brotes es algo que se puede relacionar principalmente con el balance

– 45 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

endógeno de fito-reguladores de las distintas especies, en este caso del género

A istolochia. r

En las plantas ocurre el fenómeno conocido como dominancia apical que se refiere a la

inhibición del desarrollo de brotes laterales dominado por el desarrollo de las yemas

apicales; esto se debe al flujo de auxinas (como AIA) de las yemas apicales hacia las

partes inferiores de la planta, siendo la forma como dirige su crecimiento. En trabajos de

micropropagación se busca la pérdida de esa dominancia apical para inducir el desarrollo

de brotes laterales, lo cual se logra mediante la aplicación exógena de citocininas en el

medio de cultivo.

Las citocininas tienen un papel importante como promotores de división celular y actúan en

la inducción y desarrollo de centros meristemáticos que conducen a la formación de

órganos, principalmente brotes (Moncaleán y col., 2003); BAP es la citocinina usada con

mayor frecuencia en procesos comerciales de micropropagación ya que induce mayor

proliferación de brotes que zeatina o cinetina que son otras muy conocidas. Por lo anterior,

se puede decir que las distintas especies presentan diferentes balances de fito-

reguladores y por lo tanto requieren también diferentes concentraciones de citocininas en

el medio de cultivo para romper esa dominancia apical.

Es importante mencionar que en el experimento realizado para buscar las condiciones de

inducción de brotes se pudieron observar también otras características en los diferentes

tratamientos como la formación de estructuras callosas principalmente en presencia de

ANA; también se presentó la formación de algunas raíces gruesas sobretodo en

concentraciones bajas de ANA y BAP (Figura 12); lo que nos da una idea de los cambios

que sufre el desarrollo de la planta en presencia de diferentes balances de fito-

reguladores.

En el cultivo control se observó el desarrollo vigoroso de uno o hasta dos brotes de cada

explante, con alturas aproximadas de 7 cm y que contenían de 7 a 9 nudos por brote;

además de la formación de algunas raíces finas y largas. Estas características podrían ser

interesantes para la propagación mediante micro-estacas, sin la necesidad de aplicar fito-

reguladores al medio de cultivo y con la ventaja de que se induce la formación de raíces, lo

– 46 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

que reduciría el tiempo de elongación y de inducción de raíces; aunque posiblemente la

productividad sea menor que mediante la propagación por brotes laterales.

Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Tratamiento 4

Vista abajo

Vista arriba

Vista frente

Figura 12. Vistas di erentes de cuatro tratamientos de fito-reguladores para la inducción de brotes en yemas axilares. f

En síntesis, en esta etapa se logró la mayor inducción de brotes (3.1 en promedio) y de

mayor tamaño (1-2 cm de altura) en yemas axilares con el medio de cultivo MS al 100 %

adicionado con BAP 10 µM.

6.1.3 Multiplicación y elongación de brotes

Se obtuvo un total de 41 brotes en el primer período de cultivo (4.1 brotes en promedio /

explante inicial) y en el segundo 135 (3.3 brotes / explante inicial). La diferencia en el

número de brotes por explante, podría atribuirse a que en el primer período de cultivo los

brotes no presentaron ramificaciones y el tamaño de éstos fue homogéneo (1-2 cm); sin

– 47 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

embargo, en el segundo, los brotes tuvieron la tendencia a ramificarse, en muchos de ellos

los brotes secundarios fueron muy pequeños (menores a 0.5 cm), los cuales no fueron

separados del brote primario, por esta razón el rendimiento de brotes fue aparentemente

menor en el segundo período de cultivo. Después de la etapa de elongación los brotes

alcanzaron alturas en el intervalo de 3-4 cm.

El rendimiento obtenido para A. elegans (3-4 brotes por explante) es semejante a los

reportados para otras especies: Svensson (2000) reportó un promedio de 4.2 brotes por

explante de A. manchuriensis mediante el uso de BAP 2.0 µM; Manjula y col. (1997) para

A indica mediante el uso de BAP 13.3 µM + ANA 0.5 µM, obtuvieron de 2-3 brotes por

explante; mientras que para A. fimbriata Bravo y col. (1999) reportaron para la formación

de un solo brote mediante el uso de BAP 5.0 µM.

.

6.1.4 Inducción de raíces

Los valores obtenidos de la prueba de inducción de raíces se presentan en el Cuadro 8. En

el control (tratamiento 1) se formaron 6.8 raíces por explante en promedio, lo cual sugiere

la inducción de raíces por la presencia de los fito-reguladores endógenos. En el

tratamiento 2 (AIB 0.5 µM), no hubo diferencia significativa con respecto al control. Por el

contrario, el tratamiento 3 (AIB 1.5 µM) sí resultó ser significativamente diferente al resto

de los tratamientos, ya que indujo la formación del mayor número de raíces por explante

(12 en promedio). Mientras que en los tratamientos 4 y 5 (AIB a 2.5 y 5.0 µM

respectivamente) se observó una tendencia de disminución del número de raíces.

En la Figura 13 se representan gráficamente los resultados de inducción de raíces en

donde es posible observar la tendencia del incremento de raíces con respecto al

incremento en la concentración de AIB, hasta llegar a una concentración de máxima

respuesta (1.5 µM); a partir de la cual, el incremento de la concentración provoca un efecto

de disminución de la cantidad de raíces formadas, incluso en menor cantidad que el mismo

control. Con respecto al uso de ANA, se observó principalmente la formación de

estructuras callosas alrededor del explante y no se logró la inducción de raíces.

– 48 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Cuadro 8. Formación de raíces en yemas axilares por efecto de di erentes tratamientos con los fito-reguladores AIB y ANA.

f

TRATAMIENTO

AIB ANA Concentración

(µM)

ÍNDICE DE RAÍCES POR EXPLANTE

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0.0

0.5

1.5

2.5

5.0

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

0.5

1.5

2.5

5.0

6.8

8.9

11.8

4.6

2.4

0.6

0.0

0.1

0.4

±

±

±

±

±

±

±

±

±

0.6

0.6

1.0

0.8

0.8

0.4

0.0

0.1

0.2

bc

b

a

cd

de

e

e

e

e

r

rLos valores de índice de raíces por explante rep esentan la media de tres unidades

experimentales ± e ror estándar. Los valores seguidos por diferente letra son significativamente diferentes (prueba de Tukey, α=0.05).

En la prueba de inducción de brotes sí se observó la formación de raíces en los explantes

en presencia de ANA 0.5 µM; sin embargo no se obtuvo el mismo resultado cuando se

realizó la prueba de inducción de raíces. Esto podría atribuirse a diferencia en la edad de

las plántulas (fuente de explante), ya que se sabe que la edad fisiológica determina el tipo

y la velocidad de morfogénesis en los explantes (Lozoya, 1985).

En el caso de la prueba de inducción de brotes se utilizaron plántulas de 8 semanas y en la

inducción de raíces de 6 semanas; lo que pudo influir en contenido endógeno de fito-

hormonas en los diferentes explantes, y se vio reflejado en el número de raíces formadas.

– 49 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

0

4

8

12

1 2 3 4 5 6 7 8 9

TRATAMIENTO

Índi

ce d

e R

aíce

s po

r Exp

lant

e

Figura 13. Efecto de diferentes tratamientos de fito-reguladores en la formación de raíces en yemas axilares. Los valores representan la media de tres unidades

experimentales + error estándar.

Es conocida la capacidad de las auxinas en bajas concentraciones para inducir la

formación de raíces y de las citocininas para inhibirlas (Rout y col., 2000); en los trabajos

reportados para otras especies de A istolochia, se logró la mayor inducción de raíces

mediante el uso de AIB en concentraciones de 2.5 y 5.0 µM; en cambio en A elegans se

logró la inducción del mayor número de raíces (12 en promedio) con una concentración de

1.5 µM (tratamiento 3), lo cual se puede atribuir también a las diferencias en el contenido

endógeno de fito-reguladores, el cual varía en las distintas especies (Salisbury, 1994).

r

.

Finalmente, debido a que el tratamiento 3 indujo la formación del mayor número de raíces,

los brotes multiplicados y elongados se cultivaron en el medio MS 100 % adicionado AIB

1.5 µM para inducir la formación de raíces.

6.1.5 Aclimatización

En la Figura 14 se muestra la cinética de desarrollo de las plantas de acuerdo con los

parámetros de crecimiento evaluados durante esta etapa. La velocidad específica (VE) de

cambio de los diferentes parámetros se presenta en el Cuadro 9.

– 50 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 14. Cinética de desarrollo de las plantas durante la aclimatización. En (a), se representa la longitud de la raíz y de la parte aérea. En (b), el número de raíces

secundarias y de nudos. Los valores representan la media de 72 plantas ± desviación estándar.

Cuadro 9. Valores de velocidad específica de cambio de los cuatro parámetros de crecimiento de las plantas, evaluados durante la etapa de aclimatización.

Parámetro Primer mes Segundo mes

Raíz mas larga (cm/mes) 2.6 6.7

Parte aérea (cm/mes) 2.4 15.8

Raíces (número/mes) 2.9 10.4

Nudos (número/mes) 4.7 7.3

En el segundo mes se incrementó la VE de todos los parámetros de crecimiento, en

comparación con el primero; este efecto es común del proceso de aclimatización donde las

plantas modifican su fisiología y desarrollan nuevos tejidos y órganos para soportar las

nuevas condiciones ambientales principalmente de menor humedad ambiental

(Pospíšilová, 1999).

Al respecto, se sabe de la incapacidad de las plantas cultivadas in vit o para regular la

transpiración; esto se deriva de su cultivo dentro de contenedores cerrados para prevenir

la contaminación por microorganismos, lo que genera un ambiente de alta humedad en el

interior con valores cercanos al 100 % HR. En estas condiciones las plantas desarrollan

r

0

10

20

30

40

50

Inicio 1 mes 2 meses

Núm

ero

RAÍCESNUDOS

0

10

20

30

40

50

Inicio 1 mes 2 meses

Long

itud

(cm

)RAÍZ M AS LARGA

PARTE AÉREA

(a) (b)

– 51 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

estomas anormales en su morfología y fisiología, particularmente en la apertura y cierre de

las células guarda (Santamaría y col., 1993). Cuando las plantas son expuestas al

ambiente exterior, se enfrentan a condiciones de humedad menor y muy variable (del 40 –

90 % HR dependiendo de la hora del día y de la temporada del año). La falla en el

funcionamiento de los estomas ocasiona la pérdida rápida de humedad por transpiración,

si esta situación no es corregida de manera eficiente, las plantas pueden marchitarse

rápidamente y morir (Santamaría y Kerstiens, 1994; Pospíšilová, 1999).

La situación mencionada anteriormente, es la principal razón por la que el uso de la

micropropagación haya sido restringido en sistemas comerciales, ya que a menudo se

presenta un alto porcentaje de pérdidas o daños cuando las plantas son transferidas a

condiciones de invernadero o campo. Por lo que durante el transplante a condiciones ex

vitro, las plantas generalmente requieren algunas semanas de aclimatización con una

disminución gradual en la humedad del aire.

Por otra parte, los resultados correspondientes a la humedad relativa (HR) y potencial

hídrico (Ψ) en la atmósfera del sistema hidropónico se muestran en el Cuadro 10. Con

estos valores se pueden conocer los cambios de humedad en el medio, que sirven para

relacionar el movimiento másico del agua en el sistema sustrato–planta–aire; debido a que

el agua se moviliza en respuesta a diferencias en el Ψ (Salisbury y Cleon, 1994). Cuando

el Ψ es mayor en una región del sistema que en otra y no hay una barrera impermeable

que impida la difusión del agua, ésta se difunde desde la región con potencial elevado

(cercano a cero) a la de bajo potencial (de mayor valor negativo).

Generalmente en los contenedores sellados que se utilizan para el cultivo in vit o, la

humedad se mantiene cercana al 100 % HR (Aguilar y col., 2000). En estas condiciones el

potencial hídrico adquiere un valor cercano a cero. Al comparar este valor con el de la

cámara de incubación (-100 aproximadamente), se produce una diferencia de dos órdenes

de magnitud de Ψ. Este gradiente es tan grande que habría provocado una gran pérdida

de agua por transpiración a través de las hojas, de no haberse establecido un sistema

eficiente de aclimatización. El utilizar el sistema hidropónico con la apertura gradual de la

cubierta de plástico durante el tiempo de aclimatización, permitió reducir el gradiente de

r

– 52 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

potencial hídrico entre la atmósfera de la cámara y el medio de desarrollo de la planta; con

lo que se logró regular la pérdida de agua por transpiración.

Cuadro 10. Valores de humedad relativa (HR) y potencial hídrico (Ψ) dentro delsistema hidropónico y la cámara de incubación, durante las primeras c nco

semanas de aclima ización.

i

t

Semana 1 2 3 4 5

HR sistema hidropónico (%) 90.2 ± 1.2 81.0 ± 1.8 80.1 ± 1.6 75.3 ± 1.1 55.7 ± 1.3

Ψ (MPa) –14.1 –28.9 –30.4 –38.9 –80.3

HR cámara de incubación 47.2 47.3 47.8 48.7 45.0

Ψ (MPa) –103.0 –102.7 –101.2 –98.7 –109.5

Los valores de HR de sistema hidropón co es la media de diez unidades experimentales ± error estándar y los valores de la cámara de incubación son únicos. T = 298 K (25 °C).

l i

r

Por otro lado, la misma solución nutritiva pudo haber contribuido a amortiguar el cambio de

humedad mediante un equilibrio entre las fases líquido–vapor de la solución con el aire; a

esto podría atribuirse el hecho de que en la quinta semana de aclimatización, a pesar de

que ya se habían abierto las bolsas que cubrían las plantas, la humedad del sistema (55.7

% HR) se mantuvo por arriba del valor de la cámara de incubación (47.2 % HR). No

obstante, bajo estas condiciones se logró tener el 100 % de supervivencia de las 72

plantas aclimatizadas en el sistema hidropónico.

Otros factores que pudieron haber influido en el desarrollo lento de la planta durante el

primer mes fueron: ausencia de fuente de carbono en el medio nutritivo, la baja capacidad

fotosintética de la planta y la acumulación de CO2 en el interior del frasco. Se ha reportado

que en las condiciones del cultivo in vitro, altas concentraciones de sacarosa en el medio

de cultivo y la acumulación de CO2 pueden limitar el desarrollo del sistema fotosintético en

las hojas (Davies y Santamaría, 2000). En el cultivo in vit o de A. elegans se adicionó

sacarosa como fuente de carbono, con lo cual la planta no requería realizar la fotosíntesis,

o hacerlo en una pequeña cantidad (cultivo mixotrófico); sin embargo, cuando las plantas

fueron transferidas a la solución nutritiva del sistema hidropónico (que no contenía

– 53 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

sacarosa), la planta se vio obligada a reactivar su capacidad de fijación de CO2 mediante

su sistema fotosintético (cultivo autotrófico).

Al comparar el desarrollo de las plantas en el segundo mes con respecto al primero, se

observó una tendencia de incremento en todos los parámetros de crecimiento. La VE de la

longitud de las partes aéreas se incrementó casi siete veces (Cuadro 9), sin embargo, la

VE del número de nudos sólo se incrementó casi al doble; lo que indicó que las plantas

presentaron un crecimiento principalmente en las secciones internodales, pero no en

cuanto al número de nudos. Por otro lado, la VE de la raíz más larga se incrementó en una

magnitud poco más del doble; y la del número de raíces secundarias aumentó a poco más

del triple, en comparación con la VE del primer mes. Estos parámetros indicaron que

durante esta etapa de aclimatización las raíces y partes aéreas se desarrollaron

vigorosamente.

6.1.6 Desarrollo en invernadero y cosecha

En la Figura 15 se presenta una imagen de las plantas en el invernadero. La cobertura con

malla resultó útil como barrera contra plagas al no presentarse ningún ataque masivo de

insectos en las plantas durante su cultivo. Las condiciones promedio dentro del

invernadero fueron: 23 °C de temperatura, 55 % de HR y 1554 µmol m-2 s-1 de irradiancia

(bajo la malla). Después de cinco meses de cultivo, se observó en las plantas que las

guías mas largas alcanzaron una altura de 1.33 m (promedio de 50 plantas). Dado que

todas las plantas se podaron a una altura de 0.1 m al inicio del cultivo en invernadero,

aumentaron casi 14 veces su longitud; sin embargo, este crecimiento no es sorprendente

ya que se trata de una planta que desarrolla lianas que le sirven para trepar. Incluso podría

esperarse un mayor crecimiento de no tener restricción para seguir trepando; ya que en

este caso, después de haber alcanzado la altura máxima del tutor (1.20 m) se observó una

tendencia a la disminución en el crecimiento.

– 54 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 15. Imagen de las plantas de A. elegans en el quinto mes de cul ivo en el invernadero.

t

t

De las 72 plantas cultivadas, 22 se mantuvieron vivas como reserva y las 50 restantes se

cosecharon para la preparación de extractos. En el Cuadro 11 se presentan las cantidades

del material vegetal seco y molido que se obtuvo en la cosecha.

Cuadro 11. Material vegetal cosechado de plantas cul ivadas de A. elegans.

Partes aéreas Raíces

Total 50 plantas base seca (g) 380.90 115.50

Humedad (%) 8.18 7.76

– 55 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.2 EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA

6.2.1 Obtención de extractos

En el Cuadro 12 se presentan los rendimientos de extracción que se obtuvieron a partir del

material vegetal proveniente de la micropropagación de A. elegans. Se observó que los

extractos metanólicos de raíces presentaron una consistencia viscosa de color ámbar y de

partes aéreas con color verde; en contraste, los extractos hexánicos presentaron una

consistencia pastosa de olor penetrante y color amarillento.

Cuadro 12. Rendimientos de extracción de las plantas cul ivadas de A. elegans. t

Extracto hexánico

EH (%)

Extracto metanólico

EM (%)

Partes aéreas (PA) 0.83 18.06

Raíces (RA) 0.37 9.44

Con los extractos hexánicos se obtuvieron rendimientos bajos a diferencia de los extractos

metanólicos, en los que se obtuvieron rendimientos altos para PA y RA equivalente en

proporción a 21 y 25 veces mayor respectivamente.

Los rendimientos de extracción a partir de raíces son diferentes a los reportados por

Jiménez (2004) de raíces silvestres (0.57 % EH y 5.50 % EM). Esta diferencia podría

atribuirse a la variabilidad estacional que influye en la composición química de las plantas,

donde las condiciones ambientales cambiantes, influyen en la biosíntesis y acumulación de

metabolitos. Un efecto semejante lo reportaron Vila y col. (1997), en un estudio de

compuestos volátiles de plantas de A. elegans, donde se analizaron hojas de dos meses

en diferentes estaciones del año, y se encontraron algunas diferencias en la composición

del aceite esencial principalmente de sesquiterpenos (72.8 y 85.1 % respectivamente) que

lo atribuyó a una mayor actividad enzimática en el estado de floración de una de las

muestras.

– 56 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.2.2 Cuantificación de la contracción inducida por el veneno

Con base en los resultados de la primera curva (Figura 16a), se estableció que dentro del

intervalo de 10–100 µg/ml de veneno se podría encontrar el valor máximo de respuesta;

mientras que con la segunda curva (Figura 16b) se encontró que 40 µg/ml fue la

concentración con la que se obtuvo la mayor respuesta de contracción.

0 20 40 60 80 100

Concentración de Veneno (µg/mL)

0

20

40

60

80

1 10 100 1000

Concentración de Veneno (µg/mL)

Con

tracc

ión

de T

ejid

o (%

)

(b)(a)

F gura 16. Efecto de la concentración de veneno de alacrán sobre la contracción del íleon. En (a) la primera curva de la respuesta de contracción con

concentraciones en intervalos logarítmicos y en (b), la segunda curva en el intervalo de concentración de 10-100 µg/ml. Los valores representan la media

de tres determinaciones ± error estándar.

i

Asimismo, en las respuestas de contracción del íleon se observaron tendencias de tipo

sigmoidal; en la Figura 16b, se pueden identificar las tres fases características de este tipo

de curvas (Williamson y col., 1998): la primera es una corta fase estacionaria en la

respuesta con las concentraciones de 10 a 20 µg/ml donde se alcanzó el umbral de

recepción del estímulo; la segunda fase de 20 a 40 µg/ml, que se caracteriza por la

tendencia lineal en la gráfica donde hay un incremento de la respuesta directamente

proporcional a la concentración donde alcanza un valor máximo de respuesta, que se

puede atribuir a una saturación de los receptores que perciben el estímulo; y finalmente la

tercera fase de 40 a 100 µg/ml, en donde la respuesta se mantiene constante a pesar del

incremento de la concentración de veneno. Con base en estos resultados, se estableció el

valor de concentración de veneno de 40 µg/ml para las pruebas de relajación.

– 57 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.2.3 Prueba de relajación

En la gráfica de la Figura 17 se muestran dos registros superpuestos típicos,

correspondientes a las respuestas de la prueba de relajación; en total se obtuvieron 144

registros de esta naturaleza para las concentraciones y extractos ensayados. La curva (A)

es la referente a la aplicación de veneno (40 µg/ml), donde se observa la contracción

sostenida del íleon; mientras que la curva (B), se refiere a la aplicación del veneno (40

µg/ml) al tiempo cero + la aplicación del extracto a los 0.5 min, que provocó la relajación

hasta los 2 min, que es el tiempo total en que dura la prueba.

Cabe mencionar que con las concentraciones más altas de extractos (250-300 µg/ml) se

observó que el efecto de relajación continuó aumentando aún después de los 2 min; sin

embargo, no se corrió la prueba en tiempos mayores, debido a que con concentraciones

bajas (50 y 100 µg/ml) no se presentó una respuesta de relajación importante, y el efecto

prolongado del veneno podría haber dañado el íleon, e incluso provocarle la muerte. De

estos registros se obtuvieron los valores de relajación correspondientes a cada

determinación, los cuales se presentan en el Cuadro 13.

Fuer

za d

e C

ontra

cció

n (g

)

4

0.5 0.0 2.0

1 B

A

7

Tiempo de aplicación (min)

Figura 17. Dos registros sobrepuestos de la prueba de relajación. En (A) la respuesta de contracción por aplicación del veneno (40 µg/ml y en (B), la respuesta de relajación por la aplicación del veneno (40 µg/ml) + extracto

metanólico de partes aéreas (200 µg/ml).

)

– 58 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Cuadro 13. Efecto de los extractos de las partes aéreas y raíces de A. eleganssobre la relajación del íleon contraído por efecto del veneno de alacrán.

CONCENTRACIÓN (µg/ml) EXTRACTO

50 100 150 200 250 300

EH – PA -0.17 ± 8.45 b 5.46 ± 6.71b 31.73 ± 7 .48 a 38.15 ± 3.16 a 39.96 ± 4.17 a 45.04 ± 4.28 a

EH – RA 15.14 ± 4.36 a 24.38 ± 7.13 a 35.56 ± 5 .16 a 39.05 ± 5.29 a 39.26 ± 8.90 a 42.32 ± 10.58 a

EM – PA -2.43 ± 4.88 c 13.44 ± 8.26 c 42.63 ± 13.58 b 58.99 ± 8.79 ab 74.38 ± 6.68 ab 73.17 ± 4.59 a

EM - RA 0.07 ± 8.04 b 10.91 ± 13.55 b 35.81 ± 9 .94 a 57.04 ± 3.74 a 57.40 ± 3.92 a 65.60 ± 7.93 a

r

l

Los valores de relajación representan la media de seis dete minaciones ± error estándar. En cada reng ón, los valores seguidos por diferente letra son significativamente diferentes (prueba

de Tukey, α=0.05). EH = extracto hexánico; EM = extracto metanólico; PA = partes aéreas; RA = raíces.

Dentro de los resultados del análisis estadístico, en la comparación de la variable

CONCENTRACIÓN en los diferentes extractos, se encontraron diferencias significativas

principalmente entre los valores más altos (300 y 250 µg/ml) con respecto a los más bajos

(50 y 100 µg/ml); y una zona de transición con las concentraciones de 150 y 200 µg/ml. El

extracto EH-RA fue la excepción de ésta tendencia, ya que no se encontraron diferencias

significativas en los valores de ninguna de las concentraciones.

En la comparación de la variable EXTRACTO, se encontraron diferencias significativas en

EM-PA con respecto al EH-PA. Es importante notar que cada tipo de extracto (metanólico

y hexánico), está constituido por uno o más compuestos activos (polares y no polares

respectivamente), inmersos en una mezcla compleja del resto de las sustancias extraídas.

El efecto de los extractos en la relajación del íleon se representan como curvas de

concentración–respuesta en las gráficas de la Figura 18, donde se incluyó una gráfica de

los resultados que obtuvo Jiménez (2004) con el extracto hexánico de raíces silvestres de

A. elegans.

– 59 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

50 100 150 200 250 300

Concentración de Extracto (µg/mL)

Rel

ajac

ión

de T

ejid

o (%

)

Extracto Metanólico Partes Aéreas (EM-PA)

Extracto Metanólico Raíces (EM-RA)

Extracto Hexánico Partes Aéreas (EH-PA)

Extracto Hexánico Raíces (EH-RA)

Extracto Hexánico Raíces Silvestres

Figura 18. Efecto de relajación del íleon (contraído por acción del veneno de alacrán), como resul ado de la aplicación de los extractos en diferentes

concentraciones. Los valores representan la media de seis determinaciones ± error estándar. La línea más gruesa corresponde con la curva del Extracto

Hexánico de raíces de plantas silvestres reportado por Jiménez (2004) y en el reporte original los valores representan la media de cinco determinaciones.

t

En general, se observan curvas con tendencia concentración–dependiente; es decir que el

incremento de la concentración de extracto provoca un incremento en la respuesta de

relajación; lo cual es una respuesta semejante al efecto que se mencionó en la prueba de

contracción de veneno.

– 60 –

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En las gráficas, también se pueden identificar las tres fases características de curvas de

tipo sigmoidal: la primera es una corta fase estacionaria donde se alcanzó el umbral de

recepción del estímulo; la segunda fase que se caracteriza por la tendencia lineal en la

gráfica donde hay un incremento de la respuesta directamente proporcional a la

concentración con un valor máximo de respuesta que se puede atribuir a la saturación de

los receptores que perciben el estímulo; y finalmente la tercera fase en que la respuesta se

mantiene constante a pesar del incremento de la concentración de extracto, precisamente

por la saturación de esos receptores (Williamson y col., 1998).

Jiménez (2004) evaluó la actividad relajante sólo de raíces de plantas silvestres y la

tendencia del EH que reportó (Figura 18), es semejante a los valores de relajación

obtenidos con los extractos de las plantas cultivadas. Una contribución interesante del

presente trabajo, son los resultados del extracto metanólico de partes aéreas; con los que

se alcanzó la mayor respuesta de relajación sobretodo en concentraciones de 250 y 300

µg/ml, incluso aparentemente mayores a los observados por Jiménez (2004) en raíces. Por

esta razón, el EM-PA se considera un prospecto interesante para la búsqueda de

compuestos bioactivos provenientes de A. elegans.

La evidencia experimental acumulada en el presente trabajo, indica que los extractos

(metanólico y hexánico) de las plantas de A. elegans obtenidas por micropropagación y

posterior cultivo en invernadero, presentaron actividad relajante en íleon de cobayo

contraído por efecto del veneno de alacrán, semejante a la actividad de las plantas

silvestres reportada en la literatura. Estas evidencias sugieren que las plantas de A.

elegans en campo o en invernadero, tienen la característica de producir de manera

constitutiva los compuestos bioactivos como estrategia de supervivencia, como se ha

reportado en especies de otros géneros (Dixon, 2001; Wittstock y Gershenzon, 2002).

– 61 –

77 ccoonncclluussiioonneess

CONCLUSIONES • El protocolo de desinfestación establecido permitió el 100 % de desinfestación de

semillas de A. elegans, de las cuales el 93 % germinaron.

• Mediante el uso de yemas axilares en el medio de cultivo MS al 100 % adicionado

con BAP 10 µM, se logró la inducción del mayor número de brotes y de mayor

tamaño.

• La presencia de ANA 0.5 µM en el medio de cultivo no indujo la brotación; y su

combinación con BAP disminuyó la capacidad de inducción de brotes de éste último.

• El tratamiento con AIB 1.5 µM indujo la formación del mayor número de raíces.

• Durante la aclimatización de las plantas, la apertura gradual de la cobertura de

plástico permitió la reducción paulatina del gradiente del potencial hídrico en el

ambiente del sistema hidropónico.

• Se logró el 100 % de supervivencia de las plantas después de la aclimatización.

• Se obtuvo mayor rendimiento en la extracción con metanol que con hexano.

– 62 –

• Los extractos (hexánicos y metanólicos) obtenidos de plantas cultivadas de A.

elegans, presentaron la capacidad de relajar de manera dependiente de la

concentración, el íleon de cobayo contraído por efecto del veneno de alacrán.

• Los valores de la respuesta de relajación de 300 y 250 µg/ml de los diferentes

extractos fueron mayores y significativamente diferentes a los de 50 y 100 µg/ml.

• Con la metodología establecida para la micropropagación de A elegans y su

crecimiento en invernadero, se obtuvieron plantas con la capacidad de relajar en íleon

aislado de cobayo, la contracción inducida por efecto del veneno de alacrán (C.

limpidus limpidus), de manera semejante a la reportada para plantas silvestres.

.

– 63 –

88 ppeerrssppeeccttiivvaass

PERSPECTIVAS

• Con respecto a la micropropagación, para tratar de incrementar la inducción de brotes

por explante, se sugiere estudiar el efecto de mayores concentraciones de BAP que

10 µM, con lo que se podría obtener un mayor número de plantas micropropagadas.

Por otro lado, estudiar la propagación in vit o mediante el cultivo de micro-estacas sin

el uso de fito-reguladores, podría facilitar el manejo del proceso e incluso disminuir el

costo de producción.

r

.

• En el proceso de aclimatización, el cultivo de A. elegans en el sistema hidropónico

podría ser un modelo interesante desde el punto de vista fisiológico, dado que se

logró el 100% de supervivencia de las plantas. Esta característica permitiría estudiar

la recuperación de la función estomatal y fotosintética de esta especie, para contribuir

al conocimiento de este fenómeno tan crítico en los sistemas comerciales de

micropropagación de otras plantas.

• Con relación al cultivo de las plantas de A elegans en invernadero, una de las

perspectivas de este trabajo sería evaluar la relación que existe entre la edad de la

planta y la producción de compuestos bioactivos. Otra perspectiva sería aplicar

diferentes elicitores bióticos y abióticos para inducir el metabolismo secundario en las

plantas, buscando incrementar la producción de compuestos con actividad

farmacológica. Adicionalmente, se sugiere cultivarlas en diferentes estaciones del

año dentro del invernadero, para evaluar la posible variación estacional de la

producción de los compuestos bioactivos. Con los extractos obtenidos de cualquiera

de estos experimentos, se podría evaluar la respuesta fisiológica en algún modelo

biológico.

– 64 –

• Por otro lado, se sugiere que mediante el fraccionamiento de los extractos se realice

el aislamiento e identificación de algunos compuestos, principalmente de los

extractos metanólicos de partes aéreas que fue con los que se obtuvo la mayor

respuesta de relajación en este trabajo. Asimismo, evaluar los perfiles químicos de

producción en plantas cultivadas en diferentes condiciones como las que se

mencionó en el punto anterior. Estos estudios químicos se podrían dirigir sólo a

aquellas fracciones en las que previamente se haya encontrado una actividad

importante como antagonista del efecto del veneno de alacrán; utilizando por ejemplo,

el modelo del íleon aislado de cobayo.

• Para dar continuidad a las pruebas de actividad de las plantas cultivadas, se sugiere

la evaluación de los extractos completos o fraccionados en los modelos biológicos

adecuados, como antagonistas de otros efectos del veneno de alacrán; como por

ejemplo: dosis letal media, respuesta inflamatoria, frecuencia y fuerza de contracción

cardiaca, etc.

• Estos estudios serían importantes para contribuir con la validación del uso de plantas

cultivadas de A. elegans, como punto de partida en la búsqueda de agentes

terapéuticos para el alivio de los efectos del envenenamiento por picadura de alacrán.

– 65 –

99 bbiibblliiooggrraaffííaa

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