Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Departamento de Microbiología

Informe final del proyecto

Diversidad de microorganismos y genes de fijación del nitrógeno en rizosferas de plantas metalofitas y tracto

digestivo de insectos descortezadores

SIP 20080688

Por: Dr. César Hugo Hernández Rodríguez

Enero, 2009

RESUMEN Este proyecto estudia dos modelos en muy diferentes: la rizosfera de una planta que crece en jales fuertemente contaminados con metales pesados y el tracto digestivo de un insecto descortezador del género Dendroctonus. Ambos modelos de estudio tienen algunos rasgos ecológicos comunes ya que son ambientes con un contenido de nitrógeno disponible o combinado muy limitados, lo que permite suponer que este elemento ingresa al microecosistema por la vía de la fijación de nitrógeno. La fijación de nitrógeno a partir del nitrógeno molecular (N2) disponible en la atmósfera es una actividad restringida a los procariotes (arqueas y bacterias), por lo que este trabajo pretende reconocer a los microorganismos de este nicho ecológico o a los genes implicados en esta actividad biogeoquímica en ambas muestras. El entendimiento del flujo del nitrógeno en estos ambientes permitirá entender como las plantas e insectos estudiados han podido adaptarse a entornos aparentemente muy limitados en el contenido de este macronutriente. Debido al carácter dual de este proyecto, las secciones de este informe son dobles, con excepción de los materiales y métodos, que son esencialmente los mismos. 1. INTRODUCCIÓN A. PLANTAS METALOFITAS: RIZOSFERA Y MICROORGANISMOS Los metales pesados son un grupo de elementos de importancia industrial y biológica. Dentro de este grupo se encuentran el cadmio, cobre, cromo, manganeso, mercurio, níquel, plomo y zinc (Duffus, 2002). Algunos metales son esenciales en concentraciones pequeñas para el desarrollo adecuado de humanos, animales y plantas; mientras que de otros no se les conoce alguna función biológica, por lo que su acumulación en el ambiente genera problemas de toxicidad (Alloway, 1995; Johnson et al., 2007). En México, como en otros países, existe un gran número de sitios contaminados con metales pesados como resultado de diversas actividades; tales como, el uso de agroquímicos y fertilizantes, el riego con aguas residuales y la actividad minera (Kamnev y van der Lelie, 2000; Puga et al., 2006). Durante el proceso de extracción de los minerales, se generan grandes cantidades de residuos, los cuales son acumulados en depósitos conocidos como presas de jales, que generalmente se encuentran a la intemperie. Los jales constituyen una fuente de contaminación importante ya que las sustancias depositadas en las presas liberan metales y otros componentes tóxicos al ambiente, mismos que pueden ser transportadas por aire, agua y suelo, siendo este último uno de los más afectados (Puga et al., 2006) Considerando que los recursos obtenidos de la minería no son renovables, es necesario realizar la búsqueda de nuevos yacimientos, de manera que el abandono de las minas es común lo que conlleva a problemas ambientales serios porque el deterioro de las zonas aledañas dificulta el desarrollo de otras actividades productivas.

1.1 Efecto de la contaminación por metales pesados Los metales no pueden ser degradados, solo se transforman a otros estados de oxidación en el suelo disminuyendo así su movilidad y toxicidad, dicho proceso puede tardar varias decenas de años. En suelos agrícolas, la acumulación de metales pesados causa efectos adversos en la calidad de los alimentos debido a que son adsorbidos y acumulados en diferentes partes de las plantas ocasionando cambios en las características fisiológicas y morfológicas (detrimento de biomasa y producción) (Singh et al., 2007). Por otro lado, la ingestión de vegetales contaminados deriva en problemas graves para la salud humana. La contaminación ambiental en sitios mineros se considera un problema de salud pública debido a que millones de personas están expuestas a los metales (Yanez et al., 2003). Se ha observado que la exposición prolongada a estos agentes puede ocasionar patologías como: alteración en la regulación de la respuesta inmune, desórdenes hematológicos, disfunción renal, daño hepático, cardiaco o a nivel del sistema nervioso central, incluso algunos compuestos pueden ser carcinógenos (Martelli et al., 2006; Mishra et al., 2006; Schober et al., 2006; Wise et al., 2006). La presencia de metales pesados también puede causar un efecto nocivo sobre el ecosistema del suelo. Se han realizado diversos trabajos, donde se describe que la exposición a metales pesados, a corto o largo plazo, resulta en la reducción de la diversidad microbiana y de la actividad metabólica del suelo (Sandaa et al., 1999; Gremion et al., 2004; Wang et al., 2006). Se han propuesto diversas técnicas físicas y químicas con el fin de recuperar suelos contaminados con metales pesados. Dichas estrategias pretenden la eliminación de los contaminantes o bien disminuir su disponibilidad en el suelo. Entre las más utilizadas están la excavación y relleno de minas, lixiviación ácida, inmovilización con sales o agentes quelantes como el EDTA, electroósmosis, entre otros. Estos procedimientos tienen la desventaja de ser caros ya que requieren de equipos y personal especializado, además de que tienen efectos adversos para el ambiente (Dybowska et al., 2005). Una metodología alterna, ecológica y rentable es la fitorremediación. En esta, se utilizan plantas asociadas a microorganismos para eliminar o disminuir la contaminación ambiental (Pilon-Smits, 2005). La fitorremediación puede clasificarse en 5 subgrupos (Khan, 2005):

a) Fitodegradacion: Degradación de contaminantes por plantas y su asociación con microorganismos.

b) Rizofiltración: Absorción de metales por las raíces de las plantas en aguas contaminadas.

c) Fitoestabilización: Inmovilización y reducción de la disponibilidad de contaminantes por las raíces de las plantas y su asociación con microorganismos.

d) Fitovolatilización: Volatilización de contaminantes por las plantas. e) Fitoextracción: Remoción y concentración de metales en diferentes partes

cosechables de la planta. 1.2 Fijación biológica de nitrógeno y biorremediación El nitrógeno constituye aproximadamente el 78% de la atmósfera misma que representa el mayor reservorio de este elemento. Forma parte de las macromoléculas, de manera que todos los organismos vivos requieren de nitrógeno combinado para incorporarlo a su biomasa. La presencia de este elemento es un factor limitante para el desarrollo de plantas y otros organismos, y por ende, también lo es para el establecimiento de ecosistemas. La fijación biológica de nitrógeno es el proceso en el que se convierte el nitrógeno atmosférico en amonio, y se lleva a cabo únicamente por procariotes, mediante el complejo de la nitrogenasa. La reacción general de la reducción catalizada por dicha enzima es representada con la siguiente ecuación:

N2 + 8e- +16 ATP + 8H+ 2 NH3 + 16 ADP + 16 Pi + H2

El complejo de la nitrogenasa consiste en 2 componentes, la dinitrogenasa, también denominada proteína hiero-molibdeno que es el producto de los genes nifD y nifK y la dinitrogenasa reductasa que está codificada por el gen nifH. Los genes nif están organizados en una unidad transcripcional altamente conservada. En Azotobacter vinelandii se han descrito 3 sistemas de nitrogenasa diferentes codificadas por los genes nif, vnf y anf. La nitrogenasa codificada por nif contiene el cofactor hierro molibdeno; la codificada por vnf contiene el cofactor hierro vanadio y la codificada por anf contiene solo el cofactor Fe. La expresión de una u otra depende de la disponibilidad de los metales (Igarashi y Seefeldt, 2003). La fijación de nitrógeno es uno de los procesos con mayor implicación en la fertilidad de un suelo, de ahí que se considere que la fijación biológica de nitrógeno puede ser útil para la recuperación de suelos áridos o contaminados. En muestras ambientales, el estudio de la diversidad diazótrofos se lleva a cabo mediante la amplificación del gen nifH. De esta forma se ha podido observar que existe un gran número de bacterias fijadoras de nitrógeno que no han sido cultivadas hasta ahora (Zehr et al., 2003; Bürgmann et al., 2004). La desventaja de las técnicas moleculares es que no

aporta información acerca de la fijación de nitrógeno in situ; para lo cual se han propuesto otras estrategias, como el uso de isótopos estables (Buckley et al., 2007). Se sabe que la fijación de nitrógeno se ve afectada por variables como son la salinidad, el pH, deficiencia de nutrientes, toxicidad de algunos minerales, temperaturas extremas, humedad y en el caso de la fijación simbiótica, el estado fisiológico de la planta (Zahran, 1999). No obstante como ya se mencionó, en suelos contaminados con metales pesados se ha observado el desarrollo de plantas, lo que sugiere la participación de bacterias fijadoras de nitrógeno que podrían estar modificando las condiciones extremas. Por otro lado, se ha demostrado que algunas especies de plantas influyen en la estructura de las comunidades de diazótrofos, lo cual indica que las plantas pioneras modifican la diversidad y actividad de las bacterias fijadoras de nitrógeno (Héry et al., 2005). Se han realizado estudios del efecto de los metales pesados sobre la fijación de nitrógeno, observándose que metales como el cadmio, en elevadas concentraciones puede causar la disminución de la capacidad de fijación de nitrógeno (Chen et al., 2003). Son pocos los trabajos que se han realizado para explicar la participación de las bacterias fijadoras de nitrógeno en la mejora de ambientes contaminados. En ellos se reconoció la participación de los diazótrofos en la degradación de hidrocarburos (Chen et al, 2004; Sánchez et al, 2005). Eckford y cols. (2002) aislaron diazótrofos de vida libre en suelos contaminados con derrames de combustibles. A pesar de que su trabajo no aportó la evidencia de la fijación de nitrógeno in situ, propuso una hipótesis en la cual las bacterias fijadoras de nitrógeno proveen de nitrógeno a los microorganismos que son capaces de degradar hidrocarburos dentro del consorcio. En el caso de suelos contaminados con metales pesados no existen reportes en el que se demuestre la presencia de bacterias fijadoras de nitrógeno. 2. INTRODUCCIÓN B. LA SIMBIOSIS DENDROCTONUS SPP. Las interacciones simbióticas son definidas como una asociación estrecha y persistente entre dos o más especies. Los integrantes de una simbiosis son llamados simbiontes y la relación puede ser parasítica, mutualista o comensal. (Ahmadjian, 1986; Boucher, 1982; de Bary, 1878; Douglas, 1989; Kneip et al., 2007). Los microorganismos simbióticos (bacterias, algas, hongos y protozoarios) son ubicuos en el cuerpo de los insectos, algunos de ellos poseen una distribución restringida a órganos especializados llamados micetomas, mientras que otros se localizan en una gran variedad de tejidos. De manera intracelular o extracelular (Nardi et al., 2002). El intestino de los insectos ofrece un ambiente en el cual los microorganismos simbióticos extracelulares establecen poblaciones estables y adquieren sustratos que les proveen energía, contribuyen en la reproducción, digestión, nutrición y producción de feromonas para los

insectos (Brand et al., 1975; Buchner, 1965; Campbell, 1989; Ishikawa, 2003; Mittler, 1988). 2.1 Microorganismos del intestino En el tracto digestivo de los insectos se albergan una gran variedad de microorganismos; algunos de cuales habitan cavidades concretas, están rodeados por las células de tejido epitelial o se mantienen como simbiontes intracelulares (endosimbiontes). Los microorganismos del intestino están compuestos por una amplia variedad de especies, que incluyen bacterias, arqueas y eucariotes. En general, la región del proctodeo es la más densamente poblada y con mayor diversidad de especies de microorganismos asociados (Anklin-Mϋhlemann et al., 1995; Bignell et al., 1980; Cazemier et al., 1997; Cruden y Markovetz, 1987; Werner, 1926; Wiedenmann, 1930). El proctodeo de termitas, grillos y cucarachas; que sobreviven a base de dietas de difícil asimilación y limitadas en nutrientes, tienen poblaciones de bacterias firmemente adheridas al integumento (Breznak y Pankrast, 1977; Cruden y Markovetz, 1979; Fogelsong et al., 1975; Ulrich et al., 1981). Sin embargo, otros microorganismos del intestino de insectos, como los protozoarios y las espiroquetas, establecen grandes y persistentes poblaciones sin estar adheridos a las superficies del canal alimentario (Breznak, 2000). La dieta influye claramente en la densidad y proporción de los diferentes microorganismos que podemos encontrar en el canal alimentario de mamíferos y artrópodos (Hungate, 1966; Kauffman et al., 2000). Mientras que algunas bacterias de los tractos digestivos son capaces de utilizar una amplia variedad de nutrientes, otras sólo sobreviven empleando nutrientes específicos. El crecimiento y supervivencia de diferentes especies microbianas está en función de las condiciones ambientales que se pueden encontrar en el tracto digestivo de los huéspedes. Estas condiciones pueden variar temporal y espacialmente dentro del mismo individuo o entre diferentes individuos (Nardi et al., 2002). La naturaleza facultativa u obligatoria de las interacciones insecto-microorganismo es dinámica y compleja. La interrelación entre las funciones microbianas y la fisiología de los insectos es una área aún pobremente estudiada de la biología de los insectos. De los microorganismos del intestino de los insectos, sólo los de las termitas se han estudiado ampliamente y la interdependencia obligada de esta asociación se ha reconocido (Breznak, 1982). Otros insectos en los cuales también se ha estudiado con cierta profundidad a los microorganismos del intestino son las cucarachas y los áfidos (Cruden y Markovetz, 1979; Douglas, 1998). Figura 1. Transformaciones microbianas del nitrógeno. La porción inferior del ciclo representa los procesos anaeróbicos, la porción superior muestra los procesos aeróbicos. Tomado de Francis et al., 2007. La nitrogenasa es un complejo enzimático que consiste de dos enzimas: la dinitrogenasa y la dinitrogenasa reductasa. La dinitrogenasa es un tetrámero conformado de dos subunidades codificadas por el gen nifD y el gen nifK (Lammers y Haselkorn, 1984; Mazur

y Chui, 1982), que además tiene como cofactores al hierro y molibdeno (MoFe). Por su parte, la dinitrogenasa reductasa está constituida por dos subunidades idénticas codificadas por el gen nifH y contiene un átomo de hierro como cofactor (Mevarech et al., 1980). Actualmente, se conocen dos sistemas de nitrogenasas alternativas: la vanadio nitrogenasa que está codificada por el gen vnfH/cnfDGK y contiene vanadio como cofactor en lugar del molibdeno y la nitrogenasa codificada por el gen anfHDGK que sólo emplea al hierro como cofactor (Bishop y Joerger 1990). El gen nifH es uno de los genes funcionales más antiguos cuya secuencia está altamente conservada (Raymond et al., 1990). La filogenia bacteriana basada en la divergencia de las secuencias del gen nifH es generalmente concordante con la filogenia que se puede inferir utilizando las secuencias del 16S rRNA (Falcon et al., 2002; Ueda et al., 1995; Zehr et al., 1995). 2.2 Ciclo del nitrógeno en insectos El estudio de los microorganismos que participan en el ciclo del nitrógeno y que se asocian con insectos se ha enfocado casi exclusivamente al estudio de los organismos que fijan nitrógeno. De este modo, se ha encontrado alguna evidencia de la participación de los microorganismos en la fijación de nitrógeno en insectos que se alimentan con dietas pobres en nitrógeno como las termitas (Benemann, 1973; Breznak et al., 1973); el escarabajo descortezador Dendroctonus terebrans (Bridges, 1981); la cucaracha comedora de madera, Criptocercus punctalatus (Breznak et al., 1974); los escarabeidos Cetonia spp. (Citernesi et al., 1977); la mosca mediterránea de la fruta, Ceratitis capitata (Behar et al., 2005); y el escarabajo venado, Dorcus rectus (Kuranouchi et al., 2006). 2.3 El nitrógeno en la relación planta-microorganismo El contenido de nitrógeno en las plantas es una de las características que son de vital importancia para los herbívoros. El nitrógeno posee un papel central en todos los procesos metabólicos, la estructura celular y la síntesis de proteínas, es decir, es un elemento crítico en el crecimiento de todos los organismos. El suplementar nitrógeno asimilable generalmente mejora la salud, el crecimiento, la reproducción y la supervivencia de muchos organismos. Sin embargo, en la naturaleza frecuentemente las fuentes de nitrógeno están limitadas. De este modo, las plantas se enfrentan con la falta de nitrógeno combinado (nitrato ó amonio) y los animales a la falta de nitrógeno orgánico (proteínas específicas ó aminoácidos) (Mattson, 1980). El contenido de nitrógeno en los tejidos de las plantas es relativamente bajo para satisfacer las necesidades de este elemento de los herbívoros. Como consecuencia, una dieta pobre de nitrógeno puede limitar el crecimiento y la reproducción de los herbívoros y la evolución ha seleccionado los atributos que aumentan la adquisición de nitrógeno asimilable (Mattson, 1980). Los herbívoros pueden potencialmente resolver el problema de las dietas bajas en nitrógeno por el incremento de la eficiencia en el uso del nitrógeno, el aumento en la tasa de consumo, prolongando la duración de la etapa de alimentación, ajustando sus historias

de vida para explotar los pulsos estacionales del contenido de nutrientes en las plantas, alimentándose de tejidos con un contenido relativamente alto de nitrógeno y manipulando la dieta para incrementar el contenido de nitrógeno (Ayres y MacLean, 1987; Clancy et al., 1988; Clancy,1992; Forcella, 1981; Robbins, 1983; Slansky, 1993; Slansky y Wheeler, 1992; Tabashnik,1982; Trier y Mattson, 1997; White, 1993; Yang y Joern, 1994). Los escarabajos descortezadores (Coleoptera: Scolytinae) presentan un reto particularmente severo debido al bajo valor nutricional del floema (Scriber y Slansky, 1981; Slansky y Scriber, 1985). Por ejemplo, el contenido de nitrógeno en el floema de un pino saludable es aproximadamente del 0.38% (Hodges y Lorio, 1969) comparado con el 1-5% en el follaje de la misma planta (Mattson, 1980). Los escarabajos descortezados típicamente contienen del 6 al 10% de nitrógeno y para poder crecer deben consumir en su dieta y concentrar alrededor de 16 a 26 veces el nitrógeno presente en el floema. D. frontalis aparentemente tiene tasas de consumo de nitrógeno relativamente bajas, pero éste es beneficiado por la asociación que tiene con los hongos micangiales Ceratocystiopsis ranaculosus y Entomocorticium sp. y otros microorganismos que mejoran la calidad nutricional del floema ingerido (Barras y Perry, 1975; Becker, 1971; Henry, 1962; Martin, 1979). Cuando la hembra adulta de este escarabajo construye las galerías de ovoposición, los hongos del micangio son exudados y empiezan a crecer dentro del tejido del floema, consecuentemente cuando la larva se desarrolla se alimenta del complejo formado por el floema y los hongos (Ayres et al., 2000). La posible contribución de otros microorganismos a la dieta del escarabajo no se ha estudiado. En la mosca mediterránea la fruta Ceratitis capitata se ha estimado que los microorganismos asociados a su tracto digestivo son capaces de fijar cantidades de nitrógeno equivalentes a 6 g de proteína al día, lo cual permite a la mosca cubrir parte de ・

los 15 g de prote・ ína que consume una mosca hembra en condiciones de laboratorio. Muchos artrópodos terrestres como las termitas y los escarabajos descortezadores tienen dietas en las cuales la relación carbono-nitrógeno (C:N) es muy alta, alrededor de 1000:1. Algunos procariotes fijadores de nitrógeno presentan una asociación estable con los tractos digestivos de las termitas (Benemman, 1973; Breznak et al., 1973). De hecho, se ha reconocido que la fijación de nitrógeno por los microorganismos simbiontes del intestino de las termitas es uno de los aspectos cruciales para su supervivencia (Noda et al., 1999, Ohkuma et al., 1999). La relación C:N de la mayoría de los tejidos animales es de 10:1, por lo que las termitas y los escarabajos descortezadores podrían depender de la interrelación que tienen con los microorganismos de su intestino para incorporar una cantidad sustancial de nitrógeno a la dieta. Las bacterias pueden proporcionar aminoácidos esenciales que pueden ser una ventaja nutricional para algunos insectos que se alimentan de los tejidos del floema y de la savia de las plantas, donde estos aminoácidos se encuentran a concentraciones bajas o son indetectables. Los microorganismos también pueden participar en el reciclado de los compuestos del nitrógeno y aumentar la eficiencia en su utilización, lo cual permite al insecto sobrevivir y crecer con una ingesta relativamente baja de nitrógeno. Sin embargo, el reciclado del nitrógeno aún no se ha demostrado inequívocamente en alguna

asociación, aunque existe fuerte evidencia de que los simbiontes del micetocito de las cucarachas, las levaduras de los saltamontes, y las bacterias del intestino de las termitas pueden consumir todos los productos nitrogenados de desecho producidos por sus propios hospedadores insectos (Douglas, 1998). 2.4 ESCARABAJOS DESCORTEZADORES Los escarabajos descortezadores se encuentran en la subfamilia Scolytinae, éstos típicamente se alimentan de sustratos pobres. Ellos colonizan y se alimentan de una gran variedad de tejidos de las plantas que incluyen los tejidos de la madera (corteza y floema), frutos y la médula de las ramas. Solamente los escarabajos de la ambrosia no se alimentan de los tejidos de las plantas, sino de sus hongos asociados. Los escolítidos se pueden agrupar en tres categorías con base en sus estrategias de alimentación: saprófagos, los cuales se alimentan exclusivamente de tejidos de árboles muertos o decaídos; fitófagos, que se alimentan de de tejidos de plantas vivas o recientemente muertas y los micetófagos, que viven en la madera ó en otros tejidos de las plantas donde cultivan hongos, de los que se alimentan (Six, 2003). 2.5 Dendroctonus El orden Coleóptera agrupa más de 300,000 especies de escarabajos, integradas en aproximadamente 150 familias. La familia Curculionidae; es la más basal y diversa dentro del orden, en ella destaca la subfamilia Scolytinae integrada por 185 géneros, siendo uno de los más importantes el género Dendroctonus (Wood, 1982). En México se encuentran 11 especies de este género, varias de las cuales tienen gran importancia económica, ya que algunas de ellas pueden bajo determinadas circunstancias convertirse en plagas forestales. La identificación específica se fundamenta en las características morfológicas, distribución geográfica y huéspedes colonizados. Entre los caracteres morfológicos internos y externos empleados destacan: los órganos genitales externos de los machos, el color del cuerpo de los adultos maduros, características de antenas y pronoto, así como las vestiduras del declive elitral (Cibrían et al., 2000). 3. OBJETIVO Estudiar la diversidad de microorganismos y genes nifH vinculados a la fijación de nitrógeno en rizosferas de plantas metalofitas y tracto digestivo de insectos descortezadores del género Dendroctonus 4. MATERIAL Y MÉTODOS DE LAS RIZOSFERAS Las muestras de suelo rizosférico en estudio se obtuvieron de seis especies de plantas (Cuadro 2) que crecen en jales de minas en Zacatecas. Estas fueron proporcionadas por la Dra. Ma del Carmen González Chávez, del Departamento de Edafología del Colegio de Posgraduados.

Cuadro 2. Plantas recolectadas en la Mina de San Martín y Noria de los Ángeles

Localidad Familia Planta

San Martín, Sombrerete

Compositae Aster gymnocephalus Viguiera linearis

Polygonaceae Polygonum aviculare Suelo no rizosférico

Noria de los ÁngelesCompositae

Bahia xylopoda Haplopappus venetus

Gramineae Chloris virgata Suelo no rizosférico

4.1 Enriquecimiento de poblaciones de bacterias fijadoras de nitrógeno Para el enriquecimiento de diazótrofos heterótrofos de vida libre se realizaron transferencias repetidas en el medio líquido libre de nitrógeno desarrollado por Winogradsky (Hashidoko et al., 2002), el cual se preparó con la siguiente composición por litro de agua desionizada: 10 g de sacarosa, 0.1g de CaCO3 y 5 mL de solución mineral. La solución mineral contenía 50 g/L de K2HPO4, 25g/L de MgSO4 · 7 H2O, 25 g/L de NaCl, 1 g/L de FeSO4 ·7 H2O, 1 g/L de Na2MoO4 ·2 H2O y 1g/L de MnSO4 · 4 H2O. El medio fue ajustado a un pH de 6.5 a 6.8 y esterilizado en autoclave. Se pesó 1 g de suelo rizosférico y se suspendió en 100 ml de agua destilada estéril. Se disgregó con agitación durante 5 min a 200 rpm. Se inoculó 1.5 mL de la suspensión del suelo en 13.5 mL de medio de cultivo. Se incubó a 28 ºC y de manera estacionaria hasta observar turbidez e inferirlo como crecimiento microbiano. Luego de cinco subcutivos se procedió al aislamiento de las posibles bacterias fijadoras de nitrógeno inoculando 50 µL de los cultivos de enriquecimiento en placas de medio de Winogradsky adicionado con 0.1% de extracto de levadura. 4.2 Selección de bacterias fijadoras de nitrógeno Como una prueba preliminar de la capacidad de fijar nitrógeno de los microorganismos aislados se procedió a sembrar cada uno de los morfotipos encontrados en medio líquido libre de nitrógeno. Se seleccionaron solo aquellos que fueron capaces de crecer después de tres subcultivos. 4.3 Amplificación de los genes nifD y nifH La amplificación de los genes nifD y nifH se utilizaron los iniciadores descritos en el cuadro 3. Se usó la siguiente mezcla de reacción: 10 – 100 ng/µL de DNA templado, 2.5 μL de

buffer 10X (5 mM KCl, 1 mM Tris-HCl, pH 9), 3 mM MgCl2, 0.2 mM de DNTP’s, 35 pM de cada iniciador, 1.5 U de Taq polimerasa, ajustando la reacción a 25 µL con agua destilada.

Cuadro 3. Oligonucleótidos empleados para la amplificación de los genes nifD y nifH

Iniciadores Secuencias (5’ – 3’) Fragmento esperado (pb) Tm (°C)nifHEntero-F nifHEntero-R

ACACCATTATGGAGATGG CTGATGGAGTTCGGCATC

660 63

nifHAzo-F nifHAzo-R

GACTCCACCCGCCTGATCCT ATGACCGTGATCGAATACGATC

550 60

nifHRFZ-F nifHRFZ-R

TYGGCAAGTCCACCACC TCCGGYGAGATGATGGCGC

400 55

nifD – F nifD – R

CGCGGCTGCGCCTAYGCMGG GARTGCATCTGRCGGAAMGG

1100 64

nifH – F nifH – I

TACGGNAARGGSGGNATCGGCAAAGCATGTCYTCSAGYTCNTCCA

780 60

Las condiciones de PCR se muestran a continuación.

Temperatura Tiempo °C min

No. de ciclos

Desnaturalización inicial 94 10 1 Desnaturalización Hibridación Polimerización

94 1.20 Tm* 1.20 72 1.20

35

Extensión final 72 10 1 Tm*. Se utilizó la temperatura adecuada para cada gen 4.4 Actividad de la nitrogenasa Se realizó la técnica de la reducción del acetileno para verificar la capacidad de fijación de nitrógeno de por partes de los aislados. Para esto, se utilizaron los medios semisólidos de Winogradsky, WAT4C (Bergue et al,.1991) y WAT4C modificado; que incluye glucosa, almidón, ácido málico y manitol como fuentes de carbono y el WAT4C modificado en el que se sustituyó el almidón por sacarosa. Los cultivos puros se crecieron en frascos de 10 mL de volumen con 5 mL de medio de cultivo. Después de 48 h de incubación a 30°C se les inyectó acetileno a una concentración de 0.5% por reemplazo de un volumen idéntico de aire. La reducción del acetileno se determinó mediante cromatografía de gases acoplada a ionización de flama después de una incubación de 4 días a 30°C. Se realizaron tres replicas para validar el

resultado, se empleó la cepa de Klebsiella variicola FR29 como testigo positivo y frascos sin inocular se emplearon como testigo negativo. La cantidad de etileno formado fue expresado en nanomoles de etileno (C2H4) por hora por cultivo. 4.5 Identificación molecular mediante la amplificación del gen 16S rRNA Los fragmentos del gen 16S rRNA se amplificaron utilizando la siguiente mezcla de reacción: 4 ng/µL de DNA templado, 2.5 μL de buffer 10X, 50 mM MgCl2, 0.25 mM de DNTP’s, 10 pM de cada iniciador, 1 U de Taq polimerasa, ajustando la reacción a 25 µL con agua destilada. Los iniciadores que se utilizados fueron 8 (5’-GCG GAT CCG CGG CCG CTG CAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’) y 1492 (5’-GGC TCG AGC GGC CGC CCG GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’) (Relman, 1993). Las condiciones de PCR fueron las siguientes:

Temperatura Tiempo °C min

No. de ciclos

Desnaturalización inicial 94 7 1 Desnaturalización Hibridación Polimerización

94 1 55 1 72 1

35

Extensión final 72 7 1 4.6 Secuenciación Los amplificados obtenidos se purificaron con el paquete de reactivos “DNA Purification Kit” (QIAGEN). La secuenciación de productos de PCR purificados se realizó de manera automatizada con un secuenciador ABI PRISM 310 Genetic Analyzer PE (Applied Biosystems), realizando reacciones de secuenciación a partir del extremo 5’ y 3’. Las secuencias obtenidas se sometieron a una búsqueda de secuencias similares en GenBank por medio del programa BLASTN versión 2.2.3 en la página de la NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Para obtener el mejor alineamiento, se realizaron alineamientos múltiples de las secuencias utilizando el programa CLUSTALX, versión 2.0.5, mismos que fueron editados manualmente con el programa Seaview. Las relaciones filogenéticas entre las secuencias se estableció por métodos de distancia. El modelo de sustitución nucleotídica para estimar las distancias evolutivas (ED) se eligió con base en las frecuencias nucleotídicas determinadas con el programa DAMBE y el índice de transiciones y transversiones se calculó con el programa MEGA versión 2.1. Para obtener los árboles filogenéticos se empleó el paquete de programas computacionales MEGA

versión 2.1, se utilizó el método de agrupamiento de Neighbor Joining y se realizó un análisis de remuestreo (bootstrap) con 1,000 aleatorizaciones. MATERIAL Y METODOS DE MICROORGANISMOS ASOCIADOS A DENDROCTONUS 4.7 COLECTA DE INSECTOS

Los insectos se colectaran en bosques de pinos de diferentes localidades de la

República Mexicana, se extraerán de los árboles hospederos y se colocaran en

recipientes plásticos con un papel húmedo y debidamente etiquetados indicando fecha y

localidad. Los insectos se mantendrán a 4ºC y se transportaran al laboratorio donde se

procederá a su disección.

4.8 DETERMINACIÓN ESPECIE

La especie de los insectos se determinará mediante la morfología externa del

organismo con ayuda de las claves propuestas por Wood (1982).

4.9 DISECCIÓN Y EXTRACCIÓN DEL TUBO DIGESTIVO DE LOS INSECTOS

Los escarabajos se limpiaran superficialmente con etanol al 96%, se expondrán

durante 10 min a luz UV y se lavarán en una solución reguladora de fosfatos (50 mM, pH

7.2), en esta solución se sacrificarán por ahogamiento.

Una vez sacrificado el insecto, se colocará en una caja Petri con regulador de

fosfatos y se iniciará la disección quitando los élitros y las alas, posteriormente se cortará

la parte abdominal y se separará el cuerpo graso del tubo digestivo. Una vez obtenido el

tubo digestivo se pasará a otra caja Petri con PBS, se dividirá en las distintas secciones:

mesenterón anterior, mesenterón posterior y proctodeo y cada sección se colocará en

tubos Eppendorf estériles con 100 μL de PBS 120 mM pH 8. Se almacenarán a -20ºC

hasta su posterior uso.

4.10 FIJACIÓN DE NITROGENO 4.11 REDUCCION DE ACETILENO EN INSECTOS COMPLETOS

Para estimar la fijación de nitrógeno in vivo, se llevaran a cabo ensayos de

reducción del acetileno empleando insectos y adultos vivos colectados recientemente. El

acetileno será producido mediante la disolución de carburo de calcio en agua empleando

una trampa de agua para capturar el acetileno formado en la reacción. El acetileno se

inyectará en viales (10 mL) a una concentración del 1% por reemplazo de un volumen

idéntico de aire. El ensayo se realizará en frascos viales que contendrán un individuo

(larva o adulto), insectos esterilizados por calor húmedo serán utilizados como testigos.

Los insectos se mantendrán en este sistema cerrado durante 68 h a 25°C. La reducción

de acetileno se medirá por cromatografía de gases utilizando un detector de ionización de

flama (Varian 3300 gas chromatograph). Se realizará una ANOVA de un factor para

comprobar estadísticamente si existen diferencias significativas entre todos los

tratamiento formados y posteriormente para saber si hubo diferencias significativas entre

dos grupos en específico se realizará la prueba secuencial de Tukey HSD con el

programa estadístico OpenStat4 ver 7 (Miller, 2005).

4.12 REDUCCIÓN DE ACETILENO EN EL TRACTO DIGESTIVO Y AISLAMIENTO DE BFN. La actividad de la nitrogenasa en el canal alimentario de D. valens se determinará

mediante la prueba de reducción de acetileno en diluciones decimales por triplicado a

partir de 1 tracto digestivo completo cada serie. Los ensayos se realizarán en viales de 10

mL de volumen con 4.5 mL medio semisólido WAT4C (Berge et al., 1990). Los viales se

inocularán con 0.5 mL de un homogenizado del canal alimentario e inmediatamente se les

inyectará acetileno a una concentración del 1% por reemplazo de un volumen idéntico de

aire. La reducción de acetileno se medirá por cromatografía de gases acoplada a

ionización de flama después de 48 h de incubación a 280C. Los tubos positivos nos

permitirán calcular la población de bacterias fijadoras de nitrógeno presentes en el canal

alimentario empleando las tablas del NMP. A partir de los tubos positivos se efectuaran

diluciones seriadas para posteriormente por extensión en superficie de 100μL obtener

colonias aisladas.

4.13 REDUCCIÓN DE ACETILENO EN LAS CEPAS AISLADAS

La actividad de la nitrogenasa de las cepas aisladas se determinará mediante la

prueba de reducción se acetileno. Los ensayos se realizarán en viales de 10 mL de

volumen con 5 mL medio semisólido WAT4C (Berge et al., 1990). Los viales se inocularán

y después de 24 h de incubación se les inyectará acetileno a una concentración del 1%

por reemplazo de un volumen idéntico de aire. La reducción de acetileno se medirá por

cromatografía de gases acoplada a ionización de flama después de 48 h de incubación a

280C. Los ensayos se harán por triplicado y viales sin inocular se utilizarán como testigos.

Se realizará una ANOVA de un factor para comprobar estadísticamente si existían

diferencias significativas entre las diferentes cepas probadas y posteriormente para saber

si hubo diferencias significativas entre dos cepas en específico se realizar la prueba

secuencial de Tukey HSD con el programa estadístico OpenStat4 ver 7 (Miller, 2005).

4.14 EXTRACCIÓN DE DNA.

Se descongelaran los tubos conteniendo las partes del tubo digestivo y se

agregaron 200 μL de DNAzol® (Invitrogen, CA) y 100 mg de perlas de vidrio de 0.5 mm

previamente esterilizadas. Se agitaran con Vortex hasta el rompimiento total del tejido y

se centrifugarán 10 min a 14,000 rpm. Se harán extracciones del sobrenadante con 200

μL de fenol-cloroformo 25:25, el DNA de la fase acuosa se precipitará con un volumen de

isopropanol e incubación a -20ºC por 30 min. Finalmente, el DNA se lavará con 0.5 mL de

etanol 70% y se resuspenderá en 50 μL de agua desionizada estéril y se almacenará a -

20ºC hasta su uso.

Para la obtención de DNA a partir de cepas aisladas se cosechará la biomasa de

un cultivo de 72 h y el DNA genómico de cada cepa se obtendrá empleando una técnica

previamente descrita (Cullen y Hirsch, 1988).

4.15 CUANTIFICACIÓN Y VISUALIZACIÓN DEL DNA. Para cuantificar y determinar la pureza el DNA, se empleara un espectrofotómetro de UV

y se tomarán lecturas de absorbencia a 260 y 280 nm del DNA en la muestra (Sambrook

et al., 1989). También se visualizara el DNA extraído por electroforesis en gel de agarosa

al 0.7% en amortiguador TAE 1X.

5. RESULTADOS 5.1 Enriquecimiento de poblaciones de bacterias fijadoras de nitrógeno de suelos rizosfericos Para obtener los enriquecimientos de diazótrofos a partir de los suelos rizosféricos fueron requeridos 40 días de incubación y cada subcultivo se incubó durante 20 días. Se realizó el aislamiento de probables bacterias fijadoras en medio libre de nitrógeno de Winogradsky encontrando 47 morfotipos de bacterias en los 8 suelos analizados (Cuadro 4).

Cuadro 4. Morfotipos aislados en cada una de las rizosferas de las plantas estudiadas

Localidad Planta Morfotipos

San Martín

Aster gymnocephalus 10

Viguiera linearis 13

Polygonum aviculare 2 Suelo no rizosférico 3

Noria de los Ángeles

Bahia xylopoda 9

Haplopappus venetus 8

Chloris virgata 8 Suelo no rizosférico 7

Total 60 La morfología microscópica muestra la presencia de bacilos Gram positivos y bacilos Gram negativos, siendo estos últimos los más abundantes. 5.2 Selección de bacterias fijadoras de nitrógeno El hecho de que una bacteria pueda crecer en un medio que no contiene fuente de nitrógeno, la sugiere como una posible bacteria fijadora de nitrógeno. Sin embargo, es posible que se pueda desarrollar por las trazas de N2 que están presentes en el agar. Por esta razón, los aislados obtenidos se sembraron en medio líquido libre de nitrógeno, encontrando que de los 60 morfotipos, 13 fueron capaces de crecer en medio líquido después de 3 subcultivos. Dichos aislados fueron los utilizados para los ensayos posteriores. Cuadro 5. Aislados utilizados en el estudio

Origen Clave asignada Número del aisladoSuelo no rizoférico (San Martín Sombrete) A -- Aster gymnocephalus B 2, 7 y 8 Viguiera linearis C 5, 7 Polygonum aviculare D -- Bahia xylopoda E -- Haplopappus venetus F 2, 6 y 7 Suelo no rizosférico (Noria de los Ángeles) G 1 Chloris virgata H 2, 3, 5 y 6

5.3 Amplificación de los genes nifD y nifH Las características de cultivo de los diazótrofos son muy diversas. Uno de los factores que afecta el proceso de fijación de nitrógeno es la tensión de oxígeno debido a que el complejo de la nitrogenasa es sensible a este elemento. De ahí que el desarrollo de algunas bacterias fijadoras de nitrógeno pueda ser inhibido cuando se cultivan en placa. Se propuso realizar minilibrerías de los genes nifD y nifH a partir del DNA metagenómico de los cultivos de enriquecimiento para tratar de captar aquellas poblaciones que pudieran estar desarrollando solo en medio líquido. En la figura 3 se muestran los productos de PCR del gen nifD amplificados a partir del DNA metagenómico de los cultivos de enriquecimiento correspondientes a las rizosferas de Poligonum aviculare y Haplopappus venetus. La detección del gen nifD, particularmente en la rizosfera de P. aviculare, resulta interesante ya que no se aislaron bacterias con potencial biológico de fijación de nitrógeno. En el caso de nifH se utilizaron 4 pares de oligonucleótidos, sin embargo no se obtuvieron productos de PCR para este gen en el DNA metagenómico de los cultivos de enriquecimiento.

NO INCLUIDA POR LIMITACIONES EN EL TAMAÑO DEL ARCHIVO Figura 3. Amplificación del gen nifD a partir de DNA metagenómico de los cultivos de enriquecimiento de los suelos no rizosféricos y rizosféricos de plantas tolerantes a metales pesados Por otro lado, se obtuvo el DNA genómico (figura 4) a partir de los cuales se hizo la amplificación de los genes nifD y nifH.

NO INCLUIDA POR LIMITACIONES EN EL TAMAÑO DEL ARCHIVO

Figura 4. Extracción de DNA genómico de algunos de los aislados obtenidos en medio de Winogradsky. De los aislamientos analizados se obtuvo amplificación del gen nifD en la cepa B2, C5 y F6, mismos que se muestran en la figura 5.

NO INCLUIDA POR LIMITACIONES EN EL TAMAÑO DEL ARCHIVO

Figura 5. Amplificación del gen nifD de los aislados obtenidos en medio de Winogradsky. Por otro lado, se utilizaron los 4 pares de oligonucleótidos sugeridos para la amplificación del gen nifH en cada uno de los aislados. Con los primer’s denominados RFZ (Rhizobium-

Frankia- Azospirillum) se obtuvo una banda de aproximadamente 400 pb (figura 6) en la cepa F6, en tanto que con los iniciadores nifH-F y nifH-I (descritos para Rhizobium) se obtuvo un amplicon de aproximadamente 780 pb en la cepa C5 (figura 7).

NO INCLUIDA POR LIMITACIONES EN EL TAMAÑO DEL ARCHIVO Figura 6. Amplificación del gen nifH con los inciadores RFZ-1 y RFZ-2

NO INCLUIDA POR LIMITACIONES EN EL TAMAÑO DEL ARCHIVO Figura 7. Amplificación del gen nifH utilizando los iniciadores nifH-F y nifH-I La presencia de los genes nifD y nifH permiten inferir la capacidad de fijación biológica de nitrógeno por parte la microbiota presente en la rizosfera de algunas plantas que crecen en suelos contaminados con metales pesados. 5.4 Determinación de la actividad de nitrogenasa Los ensayos de reducción de acetileno se realizaron para determinar la capacidad de fijar nitrógeno por parte de los 13 aislamientos que crecieron en medio líquido sin fuente de nitrógeno en tres pases. Se encontró que dos cepas redujeron acetileno cuando fueron cultivadas en el medio WAT4C modificado (cuadro 6). Cuadro 6. Actividad de la nitrogenasa determinada por la reducción de acetileno de los aislados obtenidos a partir de las rizosferas de plantas tolerantes a metales pesados

Cepa Actividad de reducción de acetileno (nmol C2H4 /h/tubo)

B2 0.84 + 0.12 F6 0.91 + 0.12

Klebsiella variicola F2R9 64.46 + 0.75 En el caso de las cepas B8, C5 y C7 se observó actividad de reducción de acetileno inconsistente cuando se realizaron las réplicas del mismo ensayo. Se descartó la contaminación de las cepas. Según Estrada-de los Santos y colaboradores (2001), con frecuencia uno o dos de las tres réplicas no muestran actividad, sin embargo no se ha determinado cual es la causa de este fenómeno. El resto de los aislados incluidos en el ensayo no mostraron actividad, sin embargo, es difícil asegurar que no son bacterias fijadoras de nitrógeno debido a que la prueba de reducción de acetileno se ve afectada por diversos factores como la fuente de carbono

utilizada en el medio de cultivo (Estrada-de los Santos et al., 2001; Tejera et al., 2004) y la concentración de acetileno inyectada (Staal et al., 2001). 5.5 Identificación molecular Para la identificación de los aislados se realizó la amplificación del gen 16S rRNA. Los productos de PCR se muestran en la figura 10.

NO INCLUIDA POR LIMITACIONES EN EL TAMAÑO DEL ARCHIVO

Figura 10. Amplificación del gen 16S rRNA de los aislados obtenidos a partir de suelo no rizosférico y rizosférico de plantas tolerantes a metales pesados. La identificación molecular basada en el análisis de la secuencia del gen 16S rRNA de las bacterias aisladas las ubica como miembros de los géneros Azospirillum, Brevundimonas, Inquilinus, Rhizobium y Sphingomonas (figura 11). En el cuadro 7 se resumen los resultados obtenidos hasta el momento.

NO INCLUIDA POR LIMITACIONES EN EL TAMAÑO DEL ARCHIVO Figura 11. Filogama de las secuencias parciales del gen 16S rRNA com 1,000 aleatorizaciones tipo “Bootstrap” agrupada por el método de agrupamiento “Neighbor Joining” usando el índice de distancia de Jukes-Cantor.

Cepaa Secuencia con mayor homología (No. De acceso al Genbank)

% Similitudb Identificaciónc

Reducción de

acetileno nifH nifD

B2 Azospirillum lipoferum (DQ787330)

96.3 Azospirillum sp. + + +

B8 Inquilinus ginsengisoli (AB245352)

97.5 Inquilinus ginsengisoli

+*

B11 Sphingomonas xenophaga (AY611716)

99.2 Sphingomonas xenophaga

C5 Bradyrhizobium japonicum (FJ025097)

99.4 Bradyrhizobium japonicum (FJ025097)

+* + +

C7 Sphingomonas xenophaga (AY611716)

99.2 Sphingomonas xenophaga

+*

C8 Agromyces mediolanus (D45052)

98.5 Agromyces mediolanus

F2 Rhizobium etli (AY509210)

95.0 Rhizobium sp.

F6 Azospirillum lipoferum (DQ787330)

96.3 Azospirillum sp. +

+

F7 Rhizobium etli (AY509210)

96.3 Rhizobium sp.

G1 Brevundimonas vesicular (AJ227781)

99.3 Brevundimonas vesicular

H2 Rhizobium huautlense (AF025852)

100.0 Rhizobium huautlense

H3 Rhizobium huautlense (AF025852)

100.0 Rhizobium huautlense

H5 Rhizobium etli (AY509210)

96.1 Rhizobium sp. +*

H6 Rhizobium huautlense (AF025852)

100.0 Rhizobium huautlense

+

a Seleccionada por crecimiento en tres pases em médio líquido b El proceso de similitud se obtuvo considerando el número de sustituciones nucleotídicas entre las secuencias analizadas dividida entre el total de pares de bases comparadas x 100. c Los porcentajes de similitud nucleotídica entre la secuencia problema y la secuencia con más homologia define género y especie, 95 y 97.5 % respectivamente (Rosello-Mora y Amam, 2001) * Aislados que muestran insosistencia en el ensayo de reducción de acetileno

5.6 Colecta de insectos

Se colectaron de árboles de Pinus arizonica infestados, insectos adultos jóvenes y

maduros; huevos y larvas en el último instar de Dendroctonus rhizophagus en San

Juanito, Chihuahua (27o55’22’’ N 107º55’47’’ O) (Figura No. 4)

Se colectaron de árboles de Pinus engelmannii infestados, insectos adultos jóvenes

y maduros; huevos y larvas en el último instar de Dendroctonus valens en Los pozos,

Gómez Farías, Jalisco. (19º88’ N 103º40’ O)

NO INCLUIDA POR LIMITACIONES EN EL TAMAÑO DEL ARCHIVO

Figura No. 4 A. Sitio de muestro en San Juanito, Bocoyna, Chihuahua. B. Árbol de Pinus arizonica infestado por Dendroctonus rhizophagus.

5.7 Bacterias heterótrofas aerobias

Se realizó la cuenta viable de las bacterias heterótrofas aerobias aisladas a partir

de un solo canal alimentario en ambas especies de insectos en medio LB y gelosa

nutritiva. Se encontró que el número de bacterias oscila entre 8160-54600 UFC/canal

alimentario en los estadios de larva, adulto joven y adulto maduro. Sin embargo, en el

estadio de huevo no se logró obtener crecimiento bacteriano en ninguno de los medios

probados (Luria-Bertani, Gelosa nutritiva).

5.8 Bacterias fijadoras de nitrógeno

Se ha logrado la obtención de un cultivo mixto con actividad de reducción del

acetileno obtenido a partir de larvas de D. valens que presentaron la misma actividad.

Se ha efectuado la extracción de DNA metagenómico de este cultivo para

posteriormente amplificar los genes 16S rDNA y nifH e identificar a la posible bacteria

responsable de la fijación de nitrógeno in vivo en D. valens.

5.9 RAPD

A partir de las cuentas viables de bacterias heterótrofas aerobias y de

microorganismos celulolíticos se aislaron y purificaron dos o tres representantes de los

diferentes morfotipos observados en los diferentes medios de cultivo utilizados. A cada

una de las cepas aisladas se le realizó la extracción de DNA. Empleando el oligo OPE-18 se

agruparon en 19 conjuntos todos los aislados, de acuerdo su perfil de RAPD (Figura No 5).

Uno o dos representantes de cada grupo se seleccionó para que se le secuenciará el gen

16S rDNA para su identificación.

NO INCLUIDA POR LIMITACIONES EN EL TAMAÑO DEL ARCHIVO

Figura No. 5 Patrones obtenidos por la técnica de RAPD con el oligonucleótido OPE-18 del DNA genómico de aislados bacterianos obtenidos del canal alimentario de D. valens

(larvas) y D. rhizophagus (Adultos)

5.10 Identificación molecular de los aislados

Empleando la secuencia del gen 16S rDNA se efectuó la identificación molecular de

los aislados realizando inferencias filogenéticas utilizando métodos de máxima

verosimilitud y de distancia. Hasta el momento se han identificado las siguientes especies:

Stenotrophomonas maltophilia, Rahnella aquatilis, Pseudomonas fluorescens, Serratia

proteomaculans y Pseudomonas brenneri. Todas las especies mencionadas se encontraron

en insectos adultos maduros y jóvenes (hembra y machos) y en larvas de ambas especies

de escarabajos descortezadores (D. valens y D. rhizophagus)

5.11 DNA metagenómico

Los canales alimentarios de los diferentes estadios, sexos y especies de

escarabajos se dividieron en sus diferentes secciones (Mesenterón anterior y posterior,

proctodeo). A cada una de las secciones se les extrajo el DNA metagenómico y se

comprobó la integridad del mismo en geles de agarosa.

5.12 Amplificación de los genes 16S rDNA y nifD

Se amplificó el gen 16S rDNA de todas las secciones, estadios, sexos y especies de

escarabajos para la posterior construcción de librerías.

Se ha logrado amplificar el gen nifD en todas las secciones del canal alimentario

de las hembras de D. valens y D. rhizophagus. Por otra parte, en el caso de los machos

se ha logrado amplificar el gen en ocasiones esporádicas.

IMPACTO

Este proyecto exploró la diversidad microbiana y de genes asociados a la fijación de nitrógeno en dos modelos biológicos: la rizosfera de plantas pioneras que crecen en terrenos contaminados con metales pesados y el tracto digestivo de insectos descortezadores del género Dendroctonus. En ambos casos se trata de trabajos de ciencia básica que mantienen algunos rasgos en común: están expuestos a una fuente de nitrógeno combinado muy limitada y albergan comunidades microbianas y gremios de microorganismos implicados en la fijación biológica de nitrógeno. Actualmente contamos con una descripción detallada de estos microorganismos y hemos identificado los gremios de microorganismos fijadores de nitrógeno importantes. Las implicaciones que estos trabajos pueden tener para el uso de las plantas y su comunidad microbiana asociada a la raíz en la fitoremediación de los cerros de jales a través de la propagación y siembra de estas plantas in situ es difícil de predecir en este momento. Sin embargo podemos reconocer el potencial que estas plantas, que se han adaptado a este entorno extremo o relativamente hostil (suelos relativamente pobres, con un contenido muy bajo de nitrógeno y materia orgánica, con periodos de sequía extensos, una alta concentración de metales pesados), tienen en fitorremediación. Asimismo, el entender cómo es que insectos que se constituyen en importantes plagas de los bosques de pinos en México se han adaptado a los árboles. Estas plantas ofrecen un substrato muy pobre en nutrientes, y en particular la fuente de nitrógeno, y reaccionan a la invasión arrojando compuestos tóxicos. Ante estas presiones de selección, los insectos descortezadores mantienen simbiosis en su tracto digestivo, con microorganismos que modifican los compuestos tóxicos del árbol y con otros que complementan la dieta del insecto por medio de la fijación biológica de nitrógeno. Si esta información puede ser utilizada para romper el ciclo de vida y de ese modo controlar la plaga es de momento prematuro, pero el impacto científico de estas observaciones será en breve publicado.

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