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8/19/2019 Informe glucogeno.docx

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AISLAMIENTO - CUANTIFICACIÓN Y CUALIFICACIÓN DE GLUCÓGENO EN HÍGADO YMUSCULO DE RES

Otalora L,Ochoa L,Roa D1.

Ayala, A.2

Palabras claves: cuantificación, glucógeno, tejido hepático, tejido muscular, glucogenólisis, hidrolisis acida,hidrolisis ásica.

Res!e":#$

!n el siguiente informe se lle"ó a cao el procedimientode aislamiento y cuantificación para la determinacióndel porcentaje de glucógeno presente en el h#gado ym$sculo de res. !l proceso de aislamiento se reali%ó alromper el tejido por hidrolisis ácida o ásica, mientras&ue la cuantificación se reali%ó al hidroli%ar el

glucógeno aislado para la formación de glucosa' laglucosa fue deshidratada con ácido sulf$rico paraformar furfurales &ue al reaccionar con la Antronagenera un aumento de asorancia le#da en elespectrofotómetro a una longitud de onda de (2)nm. A

partir de los datos registrados y la interpolación en lacur"a de caliración se determinó la cantidad deglucógeno otenida, se determinaron los porcentajes deerror respecto a lo esperado, estos resultados pueden ser e*plicados por la posile p+rdida en el momento delaislamiento.I"%r&'cc()":!l glucógeno es la forma de almacenamiento de la

glucosa en los tejidos animales. e encuentra principalmente en el h#gado y en el m$sculorepresentando hasta un (- y un 12- de sucomposición, respecti"amente. !l glucógeno stáformado por unidades de glucosa unidas por enlacesα/1→0 y ramificaciones α/1→(.omo se presenta enla figura 1. 314

1 Estudiantes VIII Semestre Licenciatura enquímica. Universidad Distrital Francisco José deCaldas

2 Docente de Bioquímica. UDFJC3 ru!o "#

F(*+# !structura del 5lucógeno

!l glucógeno tiene como función regular la glucosasangu#nea,es por tanto la forma en la &ue el cuerpoalmacena glucosa durante la alimentación/gluconeog+nesis y lierándola por fosforolisis/glucogenólisis en tiempos de ayuno,en estascircunstancias no hay asorción intestinal' la duracióndel glucógeno hepático es de apro*imadamente 20horas. A partir de ese momento, la concentración en lasangre se dee mantener por s#ntesis de glucosa a partir de sustancias distintas a los carohidratos/gluconeog+nesis. 6er figura 7.

Dentro de las enfermedades &ue se pueden asociar a

errores de degradación de glucógeno y por tantodepósitos de glucógeno8 se caracteri%an por unaconcentración anormal /9 7: mg ; g de h#gado o 9 1)mgm$sculo, con estructura anormal de la mol+cula deglucógeno o amas.

Glucogénesis8 i e*iste una deficiencia de las en%imas&ue ponen en marcha la "#a glucol#tica, el glucógeno sealmacenara en los m$sculos y al e*istir dificultad en lalieración de glucosa y producción de energ#a se perciedeilidad generali%ada. Dependiendo de la distriuciónde la en%ima especifica &ue presenta anomal#a en lostejidos y órganos, el depósito del glucógeno puede ser

sectori%ado o tener una distriución sistemática. !stadistriución puede di"idirse en tres grupos principales8

Formas hepáticas8 el h#gado desempe


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del glucógeno pro"ocan depósito en el h#gado y ladisminución de los "alores de glucosa en sangre/hipoglucemia. Formas miopatías: los m$sculos estriados usan el

glucógeno como fuente de energ#a, a partir de unaglucosa se da la formacion de lactato. i hay unadeficiencia de las en%imas responsales de la "#aglucol#tica el glucógeno se almacenara en los m$sculos

pro"ocando nue"amente deilidad muscular por ladificultad para producir energ#a.

Las principales enfermedades &ue pueden presentarse enrelación a estos defectos en la "ia glucogenetica son lassiguientes8La glucog+nesis tipo 1 o enfermedad de "on5ier>e esuna enfermedad autonómica recesi"a &ue se presenta

por una deficiencia de glucosa (p fosfatasa limitando lasalida de glucosa hacia la sangre por lo &ue en tiemposde ayuno los ni"eles disminuyen dramáticamente,losnie pero tienen un menor gradode intensidad,los ni"eles de glucosa (p fosfatasa son

normales.

La glucog+nesis tipo ?6 o enfermedad de Andersen estami+n llamada amilopectinosis y consiste en unadeficiencia en la celula hepática &ue no reconoce alglucógeno y da formación de tejidos firosos, suss#ntomas son similares a la glucog+nesis tipo ? y ?? engeneral se oser"a un aunmento de la acti"idad de la

A@ y la AL@,al ser el glucógeno menos ramificado esmas solule,este hecho genera una sintomatolog#a en los

primeros meses de "ida y puede desencadenar la muertedel neonato en el segundo a


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Aun&ue la deficiencia en%imática puede "ariar entre losdiferentes enfermos, la e*presión cl#nica de laenfermedad suele relacionarse con el h#gado o losm$sculos.

!*isten numerosos m+todos de cuantificación deglucógeno por colorimetr#a ,en este traajomencionaremos ,el m+todo por acción del reacti"o de C)dinitrosalicilico /C)D y el m+todo de la antronay el m+todo de Anson.

Las propiedades f#sicas y &u#micas de muchos polisacáridos neutros difieren lo astante de las demás

iomol+culas por lo &ue es permisile su fácilaislamiento, el glucógeno por su parte posee unaestructura ramificada con cadenas lineales de restos deglucosa unidos por enlaces E/10 y por enlaces E/1(en los puntos de ramificación, la acción de ácidos

minerales puede facilitar la hidrolisis de estos enlacesdando formación intermediaria de oligosacáridos y lacon"ersión final a glucosa. La naturale%a polisacaridadel glucógeno es consecuente con el aumento de gruposreductores durante dicha hidrolisis, el reacti"o C)dinitrosalicilico en presencia de a%ucares reductores secon"ierte en acidoCamino)dinitrosalicilico &ue es un

producto coloreado anaranjado &ue asore a )0: nm.!l proceso consiste en la disposición de F tuos conglucógeno y la solución de Bl en un a


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a


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humectante, estaili%ante y te*turi%ante. in emargocasi la mitad de la producción del almidón es destinadaa la industria no alimentaria para confección de

plásticos iodegradales, cartones, adhesi"os,detergentes y en la producción de iocomustiles por

la fermentación del mismo.Las dextrinas son un grupo de oligosacáridos de ajo

peso molecular &ue surge a partir de la hidrólisis delalmidón. =ese a &ue tienen la misma fórmula general&ue los polisacáridos tienen una cadena más corta,figura 0. Las de*trinas son solules en agua y encondiciones normales son sólidos lanco amarillo,ópticamente acti"os. =uede ser determinada consolución de yodo dando una coloración roji%a.on usados industrialmente como pegamentos solulesen agua, para espesar alimentos procesados y comoagentes aglutinantes en productos farmac+uticos.

F(*+ !structura de las De*trinas=ertenecen a la fórmula industrial de fuegos artificialesya &ue solidifican como estrellas. @ami+n sonutili%adas en la industria te*til y como tinturas deido asu acción penetradora.

Me%&'&l&*.a:

@omada de la gu#a nG7 y nG F aislamiento ycuantificación de glucógeno, análisis cualitati"odel glucógeno /=rofesora8 Adis Ayala 3)4.

Resl%a'&s / D(scs()":

!l almidón es un polisacárido &ue tiene por funciónreser"a de energ#a en plantas. e compone por dos

polisacáridos, la amilosa y la amilopectina, !n la primera los residuos de glucosa están unidos por enlaces

alfa 10 como se presenta en la figura ), lo &ue da ra%ónde la cadena lineal.!n el caso de la amilopectina, tiene ramificaciones cada2: a C: glucosas enla%adas en los caronos alfa 1(seg$n muestra en la figura (. Las cadenas de lasramificaciones tienen ramificaciones &ue producen unaestructura helicoidal.

F(*+0 !structura de la Amilosa. 3(4

!l glucógeno es tami+n un polisacárido cuya función principal es la de reser"a de energ#a en los animales.!stá compuesto por residuos de glucosa pero conenlaces alfa 10 y ramificaciones en alfa 1(, difiere delalmidón en &ue las ramificaciones aparecen cada F a 12residuos de glucosa y no cada 2: : C: como el almidón.

F(*+1 !structura de la Amilopectina 3(4

!n consecuencia la diferencia más importante entre elalmidón y el glucógeno es &ue la amilopectina de este$ltimo tiene una estructura más ramificada &ue en elalmidón. !s importante recalcar &ue el glucógenotami+n posee una estructura helicoidal.

!l glucógeno en musculo es la principal fuente primariade energ#a por lo &ue dee ser una fuente de fácil

disponiilidad de unidades de he*osa para la glucólisisdentro del propio m$sculo.

!l glucógeno en h#gado por su parte lo usa en no comofuente primaria de energ#a sino como e*portador deunidades de he*osa para estaili%ar los ni"eles deglucosa en sangre entre las comidas. =asadas 12 o 1Fhoras de ayuno esta fuente de reser"a en h#gado seagota.

!l proceso de e*tracción de glucógeno, se lle"ó a cao atra"+s de dos m+todos, hidrolisis acida e hidrolisis

ásica. !n primer lugar, la muestra /h#gado y musculo pre"iamente pesada se tritura con arena autocla"ada y secolocó en Bl, en solución salina y ácido tricloroac+tico/@A, La adición de este $ltimo por ser un ácido d+ilgenera un e&uilirio, la desprotonación de este ácidohace &ue el pB del medio camie permitiendo ladesnaturali%ación, al adicionar ácido clorh#drico se

pro"oca una repulsión y se pro"oca la p+rdida de la

http://es.wikipedia.org/wiki/Pegamentohttp://es.wikipedia.org/wiki/Pegamentohttp://es.wikipedia.org/wiki/Pegamentohttp://es.wikipedia.org/wiki/Industria_farmac%C3%A9uticahttp://es.wikipedia.org/wiki/Industria_farmac%C3%A9uticahttp://es.wikipedia.org/wiki/Industria_farmac%C3%A9uticahttp://es.wikipedia.org/wiki/Pegamentohttp://es.wikipedia.org/wiki/Industria_farmac%C3%A9utica


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estructura, mientras &ue el al act$a como precipitante.

F(*+2 Degradación de glucógeno.

!ste m+todo permite la precipitación de las prote#nas,ácidos nucle#dos y l#pidos de alto peso molecular, sedesnaturali%an las prote#nas y compuestos por coagulación de la prote#na, este proceso es irre"ersile

pues destruye la estructura terciaria y cuaternariacausando la p+rdida total de soluilidad.!l segundom+todo consistió en colocar las muestras iológicas, enmedio ásico KOB para e*traer el glucógeno endisolución.=ara romper el e&uilirio del medio se agrega

etanol &ue al ser un disol"ente de monosacáridos separae*itosamente el glucógeno &ue es un polisacárido. !ste$ltimo se precipita. na "e% se lle"e a cao la

precipitación se trato con antrona,este ultimo hidroli%ael glucógeno y dejando residuos de glucosa &ue por acción del acido forma furfurales figura F, formando uncomplejo coloreado /a%ul"erdoso &ue puede ser leidoen el espectrofotómetro a una má*ima de asorancia a(2: nm.

Las reacciones &ue tu"ieron lugar en la prectica fueronlas siguientes8

Compuesto coloreado

F(*+3 Reacción Reacti"a de Antrona

C4LCULOS AN4LISIS CUANTITATI5O

=eso tejido Bigado y usculo es&ueleticoBidrolisisacidahigado

Bidrolisisacidamusculo

Bidrolisis ásicahigado

Bidrolisis ásicamusculo

:,:0(g :,:Cg :,1:)g :,::Fg

Datos de la cur"a de caliración de glucógeno y "aloresde glucógeno en muestras prolema por el m+todo de laantrona.

5lucógenomg

6Resuspendidoml

Hd

mg;dl

A s

oncentracionmg;ml

M :,)C(

! 1 2,)

:,)N1

!2 ) :,7C(

!C 1: 1,:F0

Big 1)mg :,) ml 1 :, FF,27)


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ado/a

1 C21

mg;ml

usculo

/a

1:mg :,2)ml

1,2

:,02

(

12,7Fmg;ml

Bigado/

C)mg

:,) ml ( 1.F:F

oentroen lacur"a

usculo/

2,((mg

:,2)ml

C :,02(

C1,N)mg;ml

AN4LISIS CUANTITATI5O

=ara el análisis del factor de dilución correspondiente alas muestras de h#gado y m$sculo cuantitativo.

• Bidrólisis cida en higado8 =eso de la muestras deh#gado,se di"ide en C por&ue el peso otenido fue

h$medo.e otu"ieron 0(mg de glucógeno total , para loscálculos se di"idió esta cantidad en C dando unarelación de 1)mg &ue fueron resuspendidos en :,)ml, la concentración se e*presa en C: mg;mlsupuestos y se le aplico un factor de Hd/1;11 paraser le#do en la cur"a de caliración con unaasorancia de :,C21.

(6,684 gtuboglucogeno−6,638 gtubovacío )

1,::7g 1::-

P (-PQ :,:(:02 g de glucógeno teóricos,se recuperaron:,:0( g de glucógeno por hidrolisis acida en h#gado,see"idencia una deficiencia de glucógeno en deficiencia.

• Bidrolisis acida en musculo8 =eso de las muestrasde musculo,se di"ide en C por&ue el peso otenidofue h$medo.

e otu"ieron C:mg de glucógeno total ,para loscálculos se di"idio esta cantidad en C dando unarelación de 1:mg &ue fueron resuspendidos en :,2)ml,la concentración se e*presa en 0: mg;mlsupuestos y se le aplico un factor de Hd/);( para

ser le#do en la cur"a de caliración con unaasorancia de :,02(.(6,801gtuboglucogeno−6,771gtubo vacío )=

1,101g 1::-P 1-

PQ :,:1101 g de glucógeno teóricos,se recuperaron:,:C g de glucógeno por hidrolisis acida en

musculo,se e"idencia un e*ceso de glucógeno.

• Bidrolisis ásica en h#gado8 =eso de las muestra dehigado , se di"ide en C por&ue el peso otenido fue

h$medo.e otu"ieron 1:Cmg de glucógeno total ,para loscálculos se di"idio esta cantidad en C dando unarelación de C)mg &ue fueron resuspendidos en :,)ml,la concentración se e*presa en 7: mg;mlsupuestos y se le aplico un factor de Hd/1;( paraser le#do en la cur"a de caliración con unaasorancia de 1,F:F.

(1,091gtuboglucogeno−0,988gtubo vacío )=

:,:(:g 1::-P (-

PQ C,(P1:C g de glucógeno teóricos ,serecuperaron por hidrolisis ásica en h#gado :,1:C gde glucógeno,se e"idencia un e*ceso de glucógeno.

• Bidrolisis ásica en musculo8 =eso de las muestrasde musculo,se di"ide en C por&ue el peso otenidofue h$medo.

e otu"ieron Fmg de glucógeno total, para loscálculos se di"idió esta cantidad en C dando unarelación de 2,((mg &ue fueron resuspendidos en:,2) ml, la concentración se e*presa en 1:,((mg;ml supuestos y se le aplico un factor de Hd/1;C

para ser le#do en la cur"a de caliración con unaasorancia de :,20F.

(0,994 gtuboglucogeno−0,986 gtubo vacío )=

:,:(Fg 1::- P 1-


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PQ(,FP1:0 g glucógeno teóricos, se recuperaronF*1:Cg de glucógeno por lo &ue se e"idencia un

e*ceso de glucógeno.

ANALISIS CUALITATI5O

!n esta parte del proceso se reali%ó un arrido espectralde cada uno de los estándares preparados de glucógeno1,( mg;ml , almidón 2- y 1,)- ,amilopectina :,)- y:,2)-,celulosa 2- y :,)- y por ultimo de*trina 2- y:2- con el fin de comparar las muestras propuestas

para los grupos espec#ficos y una muestra gloale"aluada por todos los grupos.

A partir de la comparación se estaleció &ue la muestra prolema conten#a glucógeno pero no fue posiledeterminarlo por pruea con solución temperada deyodoyoduro deido a &ue el reacti"o con el &ue fue

preparada la muestra prolema estaa en ni"eles deconcentración m#nimas para ser detectada por colorimetr#a, sin emargo si fue posile estalecer la

presencia de glucógeno en la muestra por la pruea delugol.

Imagen de prueba de lugol, glucógeno estándar ymuestra problema.

Se a"e6a" l&s barr('&s 'e ca'a "& 'e l&s es%7"'ares

evala'&s: A"e6& #

AN4LISIS DE RESULTADOS

A partir de las concentraciones encontradas por hidrolisis acida se estaleció &ue las concentraciones enh#gado están por encimas de los 7: mg;ml &ue seconsideran datos normales /FF,27)mg;ml,sin emargo

en musculo se e"idencia &ue los ni"eles están por deajo de 1)mg;ml por lo &ue se consideran "aloresnormales /12,7Fmg;ml,en este punto es importanteaclarar &ue por "alores ajos de glucógeno en musculose consideran los C: mmol;>g de musculo.31C4.De

acuerdo a esto el aumento en el h#gado puede e*plicarsea una condición de glucogenosis tipo 1 o enfermedad de6on 5ier>e, esta enfermedad es e*plicada por ladeficiencia en la glucosa ( fosfatasa &ue fosforila laglucosa (p en dicho tejido y por la cual se liera laglucosa (p al torrente sangu#neo, al no e*istir estaen%ima se oser"a una acumulación de glucosa (p en elinterior de la c+lula ,acumulándose glucógeno. Otro delos factores determinantes &ue conlle"a la acumulaciónde glucosa ( fosfato es la inhiición sore la glucógenofosforilasa y acti"a la glucógeno sintasa y por ende seacumula glucógeno.

La glucogenosis tipo 1 puede ser tratada con

alimentación adecuada , ajo dietas estrictas ymantenidas ya &ue esto puede pro"ocar talla aja,retraso pueral, pancreatitis, susceptiilidad adesarrollar anterioesclerosis, aparición de adenoemascon potencial maligno, afecciones renales, entre otros.!s de "ital importancia &ue la determinación de estaafección se de tami+n por análisis de glucosa ensangre, ya &ue este $ltimo factor es efica% en sudiagnostico temprano.

=or lo anterior se puede e"idenciar &ue la res tiene un uen proceso de sisntesis de glucógeno pero un defectoen degradación, la lieración a sangre de glucosa no

dee estar en optimas condiciones por lo &ue puedeconducir a hipoglucemia,efectos asociados ahepatomegalia,hipoglicemia asociada a lactiacidosis ehiperlipemia.

CONCLUSIONES

Se 'e%er!("& 8e l&s "(veles 'e *lc)*e"& e" 9.*a'&s&" a")!al&s

;I;LIOGRAFIA

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