INFORME FINAL

DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

“Utilización de desechos agroindustriales en la remoción

de plaguicidas organoclorados”

CGPI No.20050337

PARTICIPANTES: M. en C. BLANCA ESTELA BARRAGAN HUERTA (ENCB-IPN)

DRA. REFUGIO RODRIGUEZ VAZQUEZ (CINVESTAV-MEXICO)

ING. CELESTINO ODÍN RODRÍGUEZ (ENCB-IPN)

México, DF., 22 de febrero de 2006

1

I. RESUMEN____________________________________________________ El café constituye uno de principales productos agrícolas generadores de divisas en varios

países en vías de desarrollo incluido México, quien ocupa el quinto lugar a nivel mundial res-

pecto a la producción de grano de café, con una producción promedio anual de 210 000 tone-

ladas (ASERCA, 2004). De la cantidad producida de grano verde de café, aproximadamente el

5% se retira del mercado por calidad inferior (DOF, 2001, 2002), siendo necesario realizar

trabajos de investigación para aprovechar los desechos de este recurso natural.

Por lo anterior, es importante realizar estudios acerca de la utilización de los desechos del gra-

no verde de café como sustrato en procesos de biodegradación de plaguicidas enfocándonos en

este estudio a plaguicidas organoclorados como el DDT y el endosulfan

Mediante técnicas de resiembra y enriquecimiento usando el plaguicida organoclorado penta-

cloronitrobenceno como única fuente de carbono e inhibidor de hongos, se aislaron e identifi-

caron cinco cepas bacterianas asociadas al grano verde de café con capacidad para degradar

plaguicidas organoclorados. Las cepas más activas se utilizaron para determinar la capacidad

de crecimiento y degradación en medio líquido, usando el grano verde de café como sustrato,

comparando su eficiencia dos fuentes de carbono tradicionales con son la glucosa y la pepto-

na.

Para determinar la capacidad de crecimiento de las diferentes cepas en los 3 medios propues-

tos y en presencia del plaguicida se estandarizó la metodología para la determinación de bio-

masa en peso seco. Para medir la degradación de plaguicidas se utilizó la técnica de cromato-

grafía de gases usando detector de captura de electrones. Para ello se estandarizó la técnica de

extracción y análisis a través de pruebas de recuperación en los diferentes medios y cepas. Se

trabajó con la técnica de extracción liquido-líquido.

.

2

II. INTRODUCCIÓN___________________________________________________

El uso de residuos agroindustriales en procesos de remoción de contaminantes es de gran inte-

rés, pues además de tener una contribución como material adsorbente, soporte para el creci-

miento y fuente de nutrientes, se utiliza un material de desecho de

bajocosto. Algunos residuos agroindustriales como la cascarilla del arroz (Adachi, 2001)

(Daifullah,2003), aserrín del árbol de mango (Ajmal,1998), aserrín de pino (Shukla, 2002),

café gastado y té (Minamisawa, 2004), entre otros han sido utilizados como adsorbentes en

procesos de remoción de metales y compuestos orgánicos, entre ellos plaguicidas de efluentes

industriales. La eliminación de plaguicidas se ha estudiado también utilizando paja de trigo

que sirve como fuente de carbono y soporte de los microorganismos (Aslan, 2004).

II.1. Café Las dos especies de café de mayor importancia mundial son Coffea arabica y Coffea canep-

hora conocidas comercialmente como Arábica y Robusta respectivamente. Por lo común el

café crudo se denomina de acuerdo a su origen, es decir por el país de procedencia. La califi-

cación del café crudo (categorización) se realiza atendiendo el tamaño, color, forma, consis-

tencia y corte de los granos. Los granos deficientes (semillas inmaduras, dañadas por las llu-

vias o resecos), se retiran puesto que alteran ostensiblemente el sabor en su conjunto.

El cultivo de café en México representa uno de los principales productos generadores de divi-

sas y es un importante generador de empleos en las zonas de alta marginación donde se ubica.

México ocupa el quinto lugar dentro de los países exportadores de café, con una producción

promedio de 210, 000 toneladas anuales en los últimos 5 años (ASERCA,2004).

Actualmente, el comercio mundial de café se ve afectado, entre otras causas, por la sobrepro-

ducción del aromático, lo que ha repercutido en la pérdida de valor del producto a niveles que

no permiten la recuperación de los costos del cultivo, por lo cual los principales países produc-

tores del aromático han acordado retirar del mercado el café de calidades inferiores.

Para tal efecto la Asociación de Países Productores de Café (APPC) emitió la Resolución

01/2001 que contiene la propuesta del Programa de Mejoramiento de la Calidad del Café,

3

misma que fue adoptada el 24 de mayo de 2001 por la Organización Internacional del Café

(OIC) en su resolución 399.

En junio de 2001 se concreta el Programa que considera la eliminación de 5% de la oferta ex-

portable, a partir de los cuales cinco países productores, incluidos México, Brasil y Colombia,

estructuraron los mecanismos de establecimiento del programa.

El 13 de diciembre de 2001 fue publicado en el Diario Oficial de la Federación el Decreto

que establece el Programa de Retiro de Café de Calidades Inferiores y el 22 de marzo del

2002 se emiten en el mismo Diario Oficial las Reglas de Operación del Programa de Retiro

de Café de Calidades Inferiores para el ciclo 2001-2002. Dentro de estas reglas se establece

que a través del Consejo Mexicano del Café, el café retirado, se pulverizará , acondicionará y

empleará para usos alternos no aptos para consumo humano, entre otros en la transformación

en combustible orgánico, composta, fertilizante, complemento de alimento para ganado ó des-

trucción definitiva.

Considerando la gran cantidad de café que se está desechando por esta razón adicionalmente a

la que se obtiene dentro del mismo proceso de selección en la producción de café , es necesa-

rio realizar trabajos de investigación con el fin de aprovechar este recurso natural.

II. 2. Componentes químicos del café.

La superficie del fruto al principio es verde, se colorea luego de rojo o violeta al madurar y

contiene en su pulpa dulce (mesocarpio) dos semillas que contactan por su cara lisa . Por 100

g de café seco (INCAP, 1978).se obtiene 29% pulpa seca (mesocarpio) de café, 12% cascari-

lla de pergamino (epicarpio), 4% mucílago y 55% granos de café verde ó grano oro (Fig 1)

a b

Figura 1. Fruto del grano de café maduro en el árbol (a) y grano verde de café (b)

4

La composición del café crudo depende de cual sea la clase de éste, su origen, obtención e

influencias climáticas. El cuadro 1 aporta información al respecto (Belitz and Grosh, 1997).

Cuadro 1. Composición del café crudo (cifras en % base seca)

Cantidad Componente Intervalo de variación

Extracto acuoso 29 - 36.2 Proteína bruta 8.7 - 12.2 Grasa 8.3 - 17.0 Azucares reductores (b) 0 - 0.5 Azucares reductores tras la inversión ( c ) 2 - 9 Sacarosa 6 - 7 Fibra bruta 10 - 11.7 Ácido cítrico 0.5 - 1.15 Ácido málico 0 - 0.5 Ácido oxálico < 0.2 Ácidos clorogénicos 4.5 –11.1 Cafeína 0.9 – 2.6 Trigonelina 0.24 - 1.2 Minerales 3 - 5.4

(b). Expresados como glucosa (c) Expresados como sacarosa

II.2.1. Carbohidratos.

Casi la mitad del grano verde de café está constituido por polisacáridos. De los polisacáridos

62.4% corresponde a celulosa y el 10.8% a lignina (Viegra, 2002).

Un estudio sobre Robusta y Arábiga (Bradbury,1990), mostró que el grano verde contiene

48% de polisacáridos, constituidos por manosa (22.4%), galactosa (12.4%), glucosa (8.7%) y

arabinosa (4%) con cantidades menores de ramnosa(0.3%) y xilosa (0.2%). Entre los polisa-

cáridos presentes se tiene celulosa , hemicelulosa y lignina.

Además de los polisacáridos, el grano verde de café contiene diversas clases de azucares de

bajo peso molecular (mono-, di- y trisacáridos). La sacarosa es el principal azúcar libre y está

presente en hasta el 8% en peso base seca.

II.2.2 Compuestos nitrogenados.

Contiene principalmente los alcaloides, aminoácidos y proteínas. La cafeína (I) es el alcaloide

mas conocido del café y se encuentra en un 1-2 % en base.

5

La trigonelina (II) es un componente del café que ha recibido mucha atención debido a su ac-

tividad antitumoral. Se encuentra presente en casi el 1% en base seca y es térmicamente ines-

table, produciendo otros compuestos nitrogenados como piridinas y pirroles durante el tostado.

NH+

O

O

-N

N

N

NO

O

(I) (II)

II.2.3 Ácidos carboxílicos.

Varios ácidos se encuentran presentes en el café que le proporcionan su sabor . El tipo y pro-

porción de los mismos cambia durante el tostado. Por ejemplo el ácido 2-Metilvalérico impar-

te sabor a cocoa o chocolate, mientras que el ácido pirúvico imparte un sabor a caramelo que-

mado. En café verde, los ácidos no volátiles como el cítrico, málico, oxálico y tartárico cons-

tituyen el 2 %. En café tostado cerca

de 30 ácidos alifáticos han sido identificado. Ellos incluyen 15 ácidos monocarboxílicos no

volátiles C1-C10, mientras que el resto son volátiles. En general durante el tostado disminuye

el contenido de ácidos.

El café verde contiene un 5-10% de ácidos clorogénicos (III), que poseen actividad antioxi-

dante.

(III)

6

II.2.4. Otros.

El café verde contiene pequeñas cantidades de tiamina (2ppm), niacina (14 ppm) y rifloflavi-

na (1ppm) y minerales como potasio, calcio fierro y magnesio .

Durante el tostado se producen en la zona térmica de los 200-250 °C transformaciones caracte-

rizadas exteriormente por un aumento de volumen (50-80%), modificaciones estructurales y

del color, disminución del peso y especialmente por la formación de un aroma típico que no

existe en el grano crudo.

II. 3 Plaguicidas

II.3.1 Definición de plaguicidas Plaguicida es cualquier sustancia o mezcla de sustancias que se destina a controlar cualquier

plaga, incluidos los vectores que transmiten enfermedades humanas y de animales, las espe-

cies no deseadas que causen perjuicio o que interfieran con la producción agropecuaria y fo-

restal. Se incluyen en esta definición las sustancias defoliantes y las desecantes (CICLOPLA-

FEST, 1998).

II.3.2 Clasificación.

Los plaguicidas se pueden clasificar de varias maneras. A continuación se presentan las más

comunes (CICLOPLAFEST, 1998):

II.3.2.1 Organismos que controlan

De acuerdo al organismo que controlan los plaguicidas pueden ser: insecticida, acaricida, fun-

guicida, bactericida, antibiótico, herbicida, rodenticida o molusquicida.

II. 3.2.2 Modo de acción

El ingrediente activo puede ser:

7

a) De contacto: actúa principalmente al ser absorbido por los tejidos externos de la plaga.

b) De ingestión: debe ser ingerido por la plaga para su acción efectiva.

c) Sistémico: Al aplicarse en plantas o animales se absorbe y traslada por su sistema vascular

a puntos remotos del lugar en que se aplica y en las cuales actúa.

d) Fumigante: Se difunde en estado gaseoso o de vapor y penetra por todas las vías de absor-

ción.

e) Repelente: Impide que las plagas ataquen.

f) Defoliante: Causa la caída del follaje de las plantas.

II.3.2.4 Composición química

Los ingredientes activos pueden ser:

a) Compuestos inorgánicos: Estos son compuestos que carecen de carbono. En este catalogo

sólo se Consideran los derivados de cobre, azufre, zinc y aluminio.

b) Compuestos orgánicos: Son aquellos que contienen átomos de carbono en su estructura

química .La mayoría son de origen sintético, fabricados a partir de compuestos químicos

básicos; algunos son extraídos de plantas, por lo que se conocen como botánicos.

c) Plaguicidas biológicos: Se llama así a los virus, microorganismos o derivados de su meta-

bolismo, formulados como insumos, que pueden controlar a una plaga en particular.

II.3.2.5 Por su estructura química. También se clasifican de acuerdo al grupo funcional químico presente en su estructura: Alifá-

ticos halogenados, cíclico alifáticos clorinados, aromáticos halogenados, fenoxialcanoatos

clorinados, acilanilidinas (derivados de la anilina), derivados del ciclodieno, carbamatos, pire-

troides, derivados de las triazinas y organofosfonatos

Ejemplos de algunas estructuras se dan en el cuadro 2.

8

Cuadro 2. Estructuras químicas de algunos pesticidas.

II.3.2.6 Por su persistencia Se define como la capacidad de cualquier plaguicida para retener sus características físicas,

químicas y funcionales en el medio en el cual es transportado o distribuido, durante un periodo

limitado después de su emisión.

Los plaguicidas se clasifican de acuerdo con su periodo de persistencia en:

Ligeramente persistentes: menos de cuatro semanas Poco persistentes: de cuatro a veintiséis semanas Moderadamente persistentes: de veintisiete a cincuenta y dos semanas Altamente persistentes: más de un año y menos de veinte.

Cl C

H

C ClCl

Cl

Cl

Aromáticos halogenados

ClCl

ClCl

Cl

Cl

Ciclicalifáticos clorinados

Lindano

C2H5

N

C2H5

CH2OCH3

C-CH2Cl

ODerivados de la anilina

AlaclorDDT

O2N OP

S

OCH2CH3

OCH2CH3

Organofosfonato

Paration

OCH2COOH

Cl

Cl

Fenoxialcanoatos clorinados

2,4-D

Cl

Cl

O

O

O

Piretroides

Permetrina

O

ClCl Cl

Cl

ClCl

Ciclodieno

Dieldrin

NOCH3S-C-CH

NHCH3

O

Carbamato

Aldicarb

CH3-CH-CH-CH3

Br Br

Halogenados alifáticos

2,3-dibromobutano

9

Permanentes: mas de veinte años Los plaguicidas que persisten más tiempo en el ambiente, tienen mayor probabilidad de inter-

actuar con los diversos elementos que conforman los ecosistemas. Si su vida media y su per-

sistencia es mayor a la frecuencia con la que se aplican, los plaguicidas tienden a acumularse

tanto en los suelos como en la biota. En el cuadro 3 se dan algunos ejemplos de la persistencia

y bioacumulación de plaguicidas.

Cuadro 3. Ejemplo de la persistencia y bioacumulación de plaguicidas

Plaguicidas Persistencia en suelos Factor de ( SEMANAS) bioconcentración Organoclorados 4,444(pez) Aldrín 530 3,300 (pez) Dieldrín 312 1,000 (ostra) Endrín 624 70,000 (ostra) DDT 546 60 (ostra) Hexaclorobenceno HCB) 208 60 (ostra) X- Hexaclorociclohexano (x- HCH)

728

Organofosforados 0(camarón) Malatión 2

Paratión 8 9(n.e.) Forato 2 0(pez) Carbamatos Carbaryl 2 0(ostra) Carbofuran 8-16 0 Varios

0(ostra) Diclorvos 8 Captan 1 0 2.4.5-T 1-12 0 Cloruro de etilmercurio permanente 3,000(pez)

II.3. 2.7 De acuerdo a su toxicidad Según la Organización Mundial de la Salud se clasifican de acuerdo al cuadro 4.

Por ejemplo el Pentaclorofenol con un LD50= D80 pertenece a la clase Ib, el DDT con un

LD50 = 113, pertenece a la clase II, el Endosulfán con LD50 = 80 pertenece a la clase II. El

Quintozeno (Pentacloronitrobenceno) con un LD50 >10000 no está clasificado, sin embargo

su metabolito principal es el Pentaclorofenol

10

Cuadro 4. Clasificación de los plaguicidas de acuerdo a su toxicidad

Clasificación de acuerdo a la OMS

Clase Toxicológica

Descripción

Ia Extremadamente peligroso

Ib Altamente peligroso

II Moderadamente peligroso

III Ligeramente peligroso

Tabla 5 No parece presentar toxicidad aguda con uso normal

Tabla 6 No clasificado : se cree obsoleto

LD50 en ratas (mg de químico/por kg de peso corporal)

Sólidos (oral)

Líquidos (oral)

Sólidos (dermal)

Líquidos (dermal)

‹ 5 ‹ 20 ‹ 10 ‹ 40

5-50 20-200 10-100 40-400

50-500 200-2,000 100-1,000 400-4,000

› 500 ›2,000 ›1000 › 4,000

› 2,000 › 3,000 --- ---

Tabla 7 Fumigantes no clasificados por la OMS

II.3. 3. Análisis de plaguicidas.

El análisis de plaguicidas es en general complejo debido a variedad en estructuras químicas

que presentan (organoclorados, organofosforados, carbamatos, piretroides, etc). Cada uno

puede ser analizado por un método analítico diferente dependiendo de su estructura química

particular.

Debido a que el efecto tóxico de los plaguicidas se manifiesta en concentraciones muy bajas,

el método utilizado para determinarlos debe ser muy sensible, como lo es la cromatografía.

La cromatografía de gases con Detector de Captura de Electrones (ECD), se recomienda para

evaluar plaguicidas organoclorados (Método EPA 8080). Para plaguicidas Organofosforados

es recomendable usar el Detector de Nitrógeno-Fósforo (NPD), para los carbamatos se reco-

mienda el uso de cromatografía de líquidos de alta resolución (Patnaik,1997).

En estos métodos, la identificación se realiza por comparación de los tiempos de retención del

problema contra un estándar, lo cual no es suficiente evidencia en la mayoría de los estudios

toxicológicos y de remediación. En estos casos la confirmación de la identidad por espectro-

metría de masas es recomendable.

11

La mayoría de los pesticidas pueden ser analizados por cromatografía de gases acoplada a ma-

sas, usando el metodo EPA 8270ª. En dicho método se describen las condiciones, los tiempos

de retención, los iones primarios y secundarios. En cuadro 5 se dan algunos ejemplos.

Cuadro 5. Iones primarios y secundarios de algunos ejemplos

Pesticida Ión primario Iones secundario Diclorvos 109 109, 185, 79,145 Pentaclorofenol 266 264,268 PCNB (quintozeno) 237 250,252,108,248, 215,254 Carbofuran 164 164,149, 131, 122 Aldrin 66 263,265,79,261 DDT 235 235,237,165,236,239 Clordano 373 375,377

Fuente: Metodo EPA 8270ª

Previo al análisis cromatográfico, se requiere un proceso de extracción y de limpieza de la

muestra. Para compuestos semivolátiles y no volátiles en suelo, como sería éste el caso, la

extracción de los analitos puede realizarse por el Método EPA 3540 basado en una extracción

Soxhlet.

Las técnicas de limpieza de los extractos se recomienda hacerla por cromatografía de adsor-

ción en florisil (Método EPA 3620), tanto para pesticidas organofosforados como organoclo-

rados.

II.3.4 Uso de plaguicidas en México

El volumen de la producción de plaguicidas formulados y técnicos no varió entre 1995 y 1998,

manteniéndose un consumo alrededor de las 50 mil toneladas para los primeros y en cerca de

20 mil toneladas para los segundos (INE,2000).

La producción de plaguicidas técnicos de acuerdo a su uso se muestra en la figura 2

12

Insecticidas34%

Otros8%

Fungicidas27%

Herbicidas31%

Figura 2. Producción de plaguicidas de acuerdo a su uso

De entre los insecticidas más utilizados se encuentran el Paratión metílico (37.47%), el Me-

tamidofos(10.62%) , el Endosulfán (6.14%) y el Clorpirifos (5.92%). Los herbicidas más utili-

zados son el 2,4-D (16%), el Paraquat (13.81%), y la Atrazina (12.80%). Los funguicidas más

utilizados son Mancozeb (43.08%) Clorotalonil (18.81%) y el Oxicloruro de cobre (9.62%).

En el cuadro 6 se listan los plaguicidas de mayor uso a nivel nacional reportados y resumen

sus posibles efectos al ambiente y a la salud humana.

Cuadro 6. Plaguicidas de mayor uso a nivel nacional Plaguicidas T* Persistencia Efectos ecológicos Efectos en salud humana si se mane-

jan inadecuadamente Paratión I Ligeramente Extremadamente peli-

groso para animales de sangre caliente (mamífe-ros y aves) y altamente tóxico para abejas

El paratión metílico es extremada-mente peligroso por inhalación, in-gestión y de rápida absorción por la piel. Produce efectos en la reproduc-ción, disminución del peso testicular. Teratogénico y potencialmente car-cinogénico

persistente

II Tóxico para abejas, pájaros y otras formas de vida silvestre

Altamente peligroso, irritante dérmi-co y del tracto respiratorio Metamidofos

IV Poco persisten-

te en suelo Altamente tóxico para peces y abejas

Irritante dérmico, de mucosas y del tracto respiratorio. Potencialmente teratogénico

Malation

13

III Poco persisten-te

No tóxico para peces y abejas

Irritante dérmico. Carcinogénico, teratogénico y mutagénico 2,4 D

IV Irritante ocular. El daño puede ser irreversible. Causa reacciones alérgi-cas. Carcinogénico en ratas

Clorotalonil Poco persisten-te

Tóxico para peces No aplicar donde los

mantos acuíferos sean poco profundos o los suelos sean muy per-meables. Evítese conta-minación de cuerpos de agua por arrastre pro-fundo

Irritante dérmico y ocular. Efectos de sensibilidad. Embriotóxico en anima-les a altas dosis y se ha relacionado con el aumento del riesgo de cáncer de ovario.

Atrazina IV Medianamente

persistente .

Irritante dérmico y de mucosas. Es-timulante del sistema nervioso cen-tral. Potencialmente teratogénico y carcinogénicoen humanos y animales

II Medianamente persistente

Tóxico para peces, aves y abejas Endosulfán

Si se ingiere produce fibrosis pulmo-

nar, irritante ocular, potencialmente teratogénico y carcinogénico en humanos

Paraquat II Poco persisten-te

Tóxico para peces y pájaros

Clorpirifos III Poco persisten-

te Tóxico para peces, crus-táceos,aves y abejas

Irritante dérmico Carbofuran: II Poco persisten-

te Tóxico para peces, abe-jas y vida silvestre Ex-tremadamente tóxico a aves

Neurotóxico. Se ha observado dege-neración testicular en perros bajo estudio de toxicidad crónica. Terato-génico y genotóxico.

Captan IV Poco persisten-te

Tóxico para peces Puede causar reacción alérgica en la piel. Teratogénico y carcinogénico en animales y potencialmente en humanos

* CT: Categoría toxicológica. Fuente: INE (2000)

II.3.5 Contaminación por plaguicidas en México.

Los plaguicidas contribuyen al incremento en los rendimientos de las cosechas y a limitar la

dispersión de ciertas enfermedades. Sin embargo los plaguicidas tienen efectos peligrosos,

pueden causar daño a la salud humana y al medio ambiente.

Con el incremento progresivo en la producción y aplicación de compuestos químicos en las

actividades agrícolas, se han generado en todo el mundo problemas de contaminación y aguas

superficiales y subterráneas ( Mansour, 2004).

El destino y comportamiento de los plaguicidas en el medio ambiente involucran varios fenó-

menos diferentes y frecuentemente simultáneos, tales como procesos de transformación quí-

mica y biológica, escorrentía, lixiviación , volatilización y erosión por el viento (Figura 3).

14

Como se puede deducir del inciso anterior, puede apreciarse que Existen pocos datos acerca de

la contaminación por plaguic

Figura 3. Contaminación por plaguicidas

A pesar de que aparentemente en nuestro país, los plaguicidas organoclorados como el Diel-

drín, Aldrín, DDT, BHC, entre otros, han dejado de producirse y usarse desde 1999, estudios

recientes demuestran la presencia de estos plaguicidas en muestras ambientales y humanas.

En el año 2002, Favari y colaboradores realizaron un estudio en la presa Ignacio Ramírez (Es-

tado de México), y reportaron la presencia en agua de los plaguicidas organoclorados Aldrin

(0.02470 mg/L, Dieldrin (0.2797mg/L) y Endrin (0.1770 mg/L), y de los plaguicidas Organo-

fosforados Metilparation (0.210 x10-3 -3 mg/L), Malation (0.13x10 mg/L). Tanto los insectici-

das organoclorados como organofosforados fueron bioconcentrados de 2-10 veces del agua a

las algas, 10 a 25 veces en zooplancton y de 8 a 140 veces en peces. El límite en aguas de

abastecimiento para uso público urbano y riego agrícola es de 0.001 mg/L (CNA, 2003).

15

Otro estudio realizado en el Estado de Morelos( López-Carrilo, 2001), indicó que el contenido

en leche materna en mujeres lactantes es del orden de 21.8 ng/mL de DDE y 2.93 ng/mL de

DDT respectivamente. El origen de estos plaguicidas pueden ser alimentos o agua contamina-

da.

Yánez y colaboradores (2002), determinaron los niveles de DDT y Dettametrina en suelos ,

sedimentos y sangre de la población en comunidades de Chiapas, Oaxaca, la Huasteca y San

Luis Potosí (control). La mayor contaminación por DDT se presenta en Chiapas con niveles de

DDT en suelo de 3316 a 8229 microgramos/Kg , de 1527 a 2562 microgramos/Kg en Oaxaca

y de 105 a 365 microgramas/Kg en San Luis Potosí. La cantidad máxima recomendada

(ODEQ, 2000) por el Departamento de Calidad Ambiental del Estado de Oregon con fines de

limpieza es de 2 mg/Kg.

Las concentraciones de DDT determinadas en sedimento de río estuvieron entre 20-35 micro-

gramos/Kg, de 551 a1899 microgramos/Kg en sedimento marino y de 194 a 4290 microgra-

mos/Kg en manglares. Todas las muestras rebasaron el valor de 4.48 microgramas/Kg reco-

mendado para sedimentos en la Guía canadiense (Environment Canada, 2001). Las concen-

traciones medias de DDT y DDE medidas en sangre fueron de 67.8 y 86.7 microgramos/L

para niños que viven en Chiapas y de 27.1 y 60.8 microgramos /L para adultos respectivamen-

te. Los fumigadores en Chiapas tiene los niveles más altos con 165.5 y 188.4 microgramos de

DDT y DDE respectivamente. Los niveles tan altos encontrados en niños son similares a los

que se presentan en Sudáfrica, donde el DDT está actualmente en uso para el control de la

malaria (Bouwman, 1991)

Un estudio más reciente (Barrientos, 2004), en tierras de cultivo del Estado de México, mues-

tran la presencia de : p,p’-DDT, p,p’-DDD, endosulfan I y II, alfa y beta HCH. El cultivo de

caña presenta la mayor concentración de p,p’-DDT tanto a los 20 cm como a los 40 cm

(0.1022 mg/Kg y 0.0900 mg/Kg), en segundo lugar el frijol a los 20 cm (0.0843 mg/Kg), en

tercero el maíz a los 40 cm (0.0784 mg/Kg) y por último el arroz tuvo una concentración

homogénea en los 40 cm (0.0623 mg/Kg).

No existe en México un inventario acerca de la contaminación de aguas o suelos por compues-

tos orgánicos peligrosos. En un reporte acerca de la contaminación de cuerpos de agua

16

(INE,2000), se muestra que las regiones Lerma-Balsas, Valle de México y Sureste son las más

contaminadas. Por ejemplo, la cuenca hidrológica del Valle de México contiene el 2.17% del

agua levemente contaminada, el 26% contaminada, el 23.91% fuertemente contaminada y el

47.83% fuertemente contaminada. Respecto a suelos sólo se ha considerado la contaminación

por hidrocarburos.

Los índices de Calidad (ICA) para cuencas hidrológicas considerados para determinar el grado

del agua no considera la presencia de compuestos químicos orgánicos (como los plaguicidas),

o inorgánicos, como los metales pesados, de manera que la clasificación de estos cuerpos de

agua y el grado de prioridad para su saneamiento pudieran cambiar de incluirse este otro tipo

de indicadores de riesgo ambiental.

Como parte del proyecto “Disminución de la contaminación de los suelos afectados por el uso

de pesticidas en la zona oriente del Estado de Tlaxcala” clave TLAX-2003-C02-12416 apro-

bado por el fondo Mixto CONACYT-TLAXCALA, se realizó un análisis cualitativo a mues-

tras de suelo colectadas en el estado de Tlaxcala encontrándose la presencia de DDT, Hepta-

cloro, endosulfan y sulfato de endosulfan.

Por lo anterior se ha considerado seleccionar al DDT como uno de los plaguicidas modelo

para realizar los estudios de biodegradación utilizando las bacterias asociadas al grano verde

de café de calidad inferior.

II. 3.6. Procesos de eliminación de plaguicidas.

El DDT pertenece a una clase de compuestos sintéticos de difícil degradación que se designan

como antropogénicos, xenobióticos, biorrefractarios ó biológicamente recalcitrantes.

Por muchos años se han utilizado grandes cantidades de ese tipo de compuestos con diversos

fines con los consecuentes daños a la salud y al ambiente. Sin embargo, es imposible eliminar

esas substancias del ambiente toda vez que su uso permite, como en el caso de los plaguicidas,

continuar manteniendo los niveles de producción agrícola que sustentan la vida de la pobla-

ción mundial.

17

Por lo tanto, la estrategia es limitar la descarga de esos contaminantes al ambiente tanto como

sea posible y de removerlos también tanto como sea posible. Para remover los pesticidas de

agua se han usado la ozonización (Okamura, 1992)9) o la hidrólisis alcalina (Drossman, H., et

al., 1988). El problema es el costo, además de que en algunos casos los productos generados

tienen mayor toxicidad que los reactantes.

La eliminación por adsorción ha sido utilizado como una alternativa, aunque el carbón usado

puede crear problemas de disposición final o si se quema puede conducir a problemas ambien-

tales adicionales (Alam et al., 2000).

A gran escala, los tratamiento biológicos son los proceso más económicos para la mineraliza-

ción tanto de compuestos orgánicos naturales como antropogénicos.

II.3.6.3 Biodegradación de compuestos orgánicos.

Eliminación Los modos metabólicos pueden ser, aeróbico o anaeróbico. Dadas sus caracterís-

ticas estructurales, los compuestos xenobióticos como los plaguicidas organoclorados, pueden

requerir condiciones de anaerobiosis (Knackmuss, 1996) para reducir la electrodeficiencia

molecular y facilitar así su posterior degradación .

Las estrategias para lograr mineralización de compuestos Xenobióticos incluyen la integración

de procesos anerobios y aerobios, la secuenciación de estos procesos, o bien la creación de

nichos microambientales con baja tensión de oxigeno (Knackmuss, 1997) (Middeldorp, 1997)

( Martins dos Santos,2001), (Barragán, 2004) .

II.3.6.3.1 Biodegradación de plaguicidas organoclorados

La literatura disponible sobre degradación microbiana de Xenobióticos muestra que los estu-

dios al respecto consideran dos aspectos : (1) las bases fundamentales de las actividades de

biodegradación y la evolución y transferencia de tales actividades entre los microorganismos,

y (2) la aplicación de técnicas de biorremediación para destoxificar ambientes severamente

contaminados.

Sin embargo el uso de los microorganismos para la biorremediación requiere de un entendi-

miento de los aspectos microbiológicos, fisiológicos y bioquímicos involucrados en la trans-

formación del contaminante. Se conocen muchos microorganismos del suelo capaces de de-

18

gradar plaguicidas. Para los plaguicidas organoclorados algunos microorganismos reportados

se muestran en el cuadro 8 (Singh et al., 1999 y referencias ahí citadas).

Cuadro 8. Microorganismos degradadores de plaguicidas organoclorados.

Plaguicida Microorganismo Plaguicida Microorganismo

Bacterias Bacterias DDT �-HCH

Aerobacter aerognenes Aerobacter aerogenes

Alcaligenes eutrophus A5 Bacillus cereus

Agrobacterium tumefaciens Bacillus megaterium

Arthrobacter sp Citrobacter freundii

Bacillus cereus Clostridium rectum

Bacillus coagulans E coli

Bacillus megaterium Peudomonas fluorescens

Bacillus subtilis Pseudomonas putida

Clostridium pasteurianum Pseudomonas paucimobilis

Clostridium michiganense Pseudomona sp

Enterobacter aerogenes

Erwinia amylovora Cianobacteria

Escherichia coli Anabaena sp

Hydrogenomonas sp Nostoc ellipssosum

Klebsiella pneumoniae

Kurthia zapfii Hongos

Microcccus sp

Nocardia sp Phanerochaete chrysospo-

rium

Serratia marsescens DT-1P

Streptomices annomoneus Trichoderma viride

Streptomyces aureofaciens Phanerochaete sordida

Cyathus bulleri Streptomyces viridochromogens

Xanthomonas sp.

Hongos Cianobacteria Endosulfan

Phanerochaete chrysosporium Anabaena sp

Trichoderma viride

19

La remoción de los sutituyentes halógeno es un paso clave en la degradación de plaguicidas

aromáticos halogenados. Esto puede ocurrir como un paso inicial de una ruta reductiva, hidro-

lítica u oxigenolítica, o después del rompimiento del anillo aromático en un estado final del

metabolismo ( Häggblom,1992).

La dehalogenación oxidativa donde el halogeno es perdido fortuitamente durante la oxidación

del anillo , ocurre sólo bajo condiciones aeróbicas. La dehalogenación hidrolítica (reemplazo

de un halógeno por un grupo hidroxilo), puede ocurrir tanto en aerobias y desnitrificantes. La

dehalogenación reductiva (reemplazo de halógeno por hidrógeno), ocurre sólo bajo condicio-

nes metanogénicas y sulfogénicas.

Adicionalmente, varias reacciones de biotransformación tales como la metilación y la polime-

rización pueden ocurrir y producir metabolitos más tóxicos o recalcitrantes.

Las principales reacciones químicas en la degradación microbiana de plaguicida organoclora-

dos incluyen la declorinación, la dehidroclorinación, la oxidación y la isomerización.

II. 3.6.3.2. Biodegradación de DDT

Se ha reportado (Nadeau et al., 1994) la capacidad para degradar DDT, t anto por hongos como

por bacterias. En condiciones aeróbicas Alcaligenes eutrophus A5, oxida al DDT a través de

una dioxigenasa, dando como producto final el acido 4-clorobenzoico. Un estudio más recien-

te (Bidlan and Manonmani, 2002), aislaron del suelo la bacteria Serratia marcescens DT-IP,

que degradaba completamente en condiciones aeróbicas al DDT en concentraciones no mayo-

res de 15 ppm. Después de sta concentración, se observaban efectos inhibitorios, perdiendo la

capacidad degradadora a 50 ppm del plaguicida. En este caso la degradación fue inhibida en la

presencia de fuentes de carbono auxiliares como citrato o hidrolizados de salvado de arroz. Sin

embargo, la presencia de extracto de levadura, peptona y glicerol favorecían la degradación. El

hongo de la pudrición blanca como Phanerochaete chrysosporium, es capaz de degradar va-

rios compuestos clorinados incluyendo DDT ( Kumar et al, 1996 y referencias ahí citadas).

Las reacciones de biodegradación para el DDT se muestran en la figura 8.

20

CCl3

OHClCl

HClCl

CN

CCl3

HClCl

CCl2

ClCl

CCl2

HClCl

CCl3

HClCl

OHH H

OH

CHCl

ClCl

CH2Cl

HClCl

CH2

ClCl

CH3

HClCl

CH2OH

HClCl

OH

HClCl

CH3

OH

HCl

O

ClCl

DDCN

DDE

DDMU

DDOH

DDMS

DDNU

DDNS

DBH DBPH

HClCl

OH

O

H

HCl

OH

HCl CHO

HClCl

COOHDDA

DDM

PCPA

p-clorofenilglicolaldehído

DDD

CCl3

HClCl

OH OH

CCl3

HCl

OCl

OH COOH

ClHOOC

B

C

Acido 4-clorobenzoico

D

A

OXIDACIÓN EN LODOS

KELTANO Dehidroclorinación

Declorinación reductiva

apertura del anillo

DDE: 1,1-dichloro-2,2-bis (4-chlorofenil)etileno); DDD: 1,1-dichloro-2,2-bis (4-chlorofenil) etileno; DBH: 4,4’-diclorobenzydrol; DBP: 4,4’-diclorobenzofenona; DDM: bis (4-clorofenil) metano; PCPA: ácido p-clorofenilacético

Figura 8 . Rutas de biodegradación del DDT por microorganismos. Las flechas gruesas indi-

can degradación aeróbica. Los compuestos A y B no han sido identificados; compuesto C, es

un producto de degradación color amarillo, determinado espectrofotométicamente (Singh,

1999).

21

III. JUSTIFICACIÓN___________________________________________________

Se ha demostrado que la adición de café en suelos contaminados por hidrocarburos del petró-

leo favorece la remoción del contaminante (Roldán, 2004). Si bien el proceso de degradación

se realiza por la microflora en su conjunto no se han realizado estudios que demuestren la par-

ticipación de las bacterias asociadas al café en la eliminación de contaminantes

Se han aislado e identificado en el Laboratorio de Xenobióticos del CINVESTAV, los siguien-

tes hongos asociados al café: Penicillium sp, Mucor sp , Aspergillus sp, Aspergillus Níger .

No se han realizado trabajos de aislamiento e identificación de las bacterias que pudieran aso-

ciarse al café, ni tampoco sobre su capacidad de degradar plaguicidas organoclorados.

Se dispone de varias toneladas de grano verde café de calidad inferior, considerado como un

desecho agrícola que puede ser utilizado en procesos de remoción de plaguicida (ProyectoTlax-

2003-C02-12416). Para ello se hace necesario realizar un estudio sobre el tipo de bacterias asocia-

das al grano verde y su capacidad de degradación de plaguicidas

En el presente trabajo se aprovechará el grano verde de café de calidad inferior para la remo-

ción de plaguicidas organoclorados en medio líquido, seleccionando al DDT como compuesto

modelo. Se determinará la contribución que tiene el grano de café de café desde el punto de

vista de aporte de microorganismos (bacterias) y nutrientes. Se determinará la capacidad que

el café tiene para soportar el crecimiento de bacterias degradadoras de plaguicidas organoclo-

rados y promover la degradación de estos contaminantes.

22

V. OBJETIVOS_______________________________________________________

Objetivo general

Utilizar los desechos de grano verde de café en la remoción de plaguicidas organoclorados

como el DDT y el endosulfán

Objetivos particulares

Aislamiento e identificación de las bacterias degradadoras de plaguicidas organo-

clorados.

Determinación del crecimiento de las bacterias asociadas al grano de café verde en

presencia de plaguicidas organoclorados y la capacidad degradadora.

Determinación de la capacidad de degradación de plaguicidas organoclorados por

bacterias asociadas al grano de café verde.

23

VI. PARTE EXPERIMENTAL__________________________________________

VI.1 Aislamiento de las bacterias asociadas al grano verde de café.

El café utilizado en este estudio proviene del rancho Rodríguez del Toro, situado en el estado

de Veracruz.

El aislamiento de las bacterias asociadas al café seleccionado se realizó utilizando el una mo-

dificación al método de Aitken et al ., (8), que consistió en la adición de café (2g) a matraces

conteniendo 40 mL de medio mineral a pH’s de 5.0, 5.5, 6.0 y 6.5. adicionado con el funguici-

da Pentacloronitrobenceno (PCNB), también conocido como quintozeno a 200 ppm. Se selec-

cionó el PCNB porque es un plaguicida aromático organoclorado y se usó con la finalidad de

eliminar los hongos del medio.

Los cultivos fueron incubados a 30°C con agitación a 100 rpm por 7 días. A partir de este cul-

tivo, se transfirieron 2 mL y se transfirieron a medio mínimo freso. Un mililitro del cultivo

resultante de la cuarta transferencia se adicionó a 9 mL de solución salina 0.85% y se realizó

una dilución serial, inoculando 100 microlitros de la dilución 5 y 6 en cajas de Petri en agar

nutritivo para la cuenta y aislamiento de bacterias (30°C, 24 horas) y 100 microlitros de la

dilución 2 y 3 sobre medio conteniendo rosa de bengala y estreptomicina para verificar la au-

sencia de hongos (28 °C, 5 días).

Por otra parte, el aislamiento de las bacterias que se desarrollaron en placa se realizó con base

la morfología colonial. Las cepas aisladas se identificaron por medio de pruebas bioquímicas.

VI. 2. Determinación de la capacidad de crecimiento en placa con plaguicidas organoclorados

como única fuente de carbono.

Se adicionó por separado 1 mL DDT (50ppm) , endosulfan (50 ppm) y PCNB (200ppm) di-

sueltos en acetona a cajas petri conteniendo agar noble. Se dejó evaporar el disolvente y se

sembraron las cajas con una de las cepas aisladas.

Se incubaron a 30 °C por 24 horas y se observó la formación de colonias sobre el agar.

24

Cl

ClCl

Cl

Cl

NO2

PCNB DDT ENDOSULFAN

Las cepas que se desarrollaron sobre agar noble con plaguicida se seleccionaron para los estu-

dios de degradación en medio líquido .

VI. 3 . Elaboración de la curva de peso seco de biomasa.

Mediante esta curva se transforman los valores de absorbancia obtenidos de la muestra del

medio de cultivo a valores de concentración en gramos de masa celular seca por mililitro

(g/ml).

Para ello se obtuvo una suspensión concentrada del microorganismo a evaluar (Pedroza,

2004), realizando un cultivo de la cepa aislada sobre 200 mL de medio mineral enriquecido

con peptona (2 g/L), e incubando 24 horas con agitación de 100 rpm a 30°C.

Después de este tiempo el cultivo (con Absorbancia a 600 nm mayor a 1.0) las células se la-

varon en condiciones de esterilidad dos veces con solución isotónica (0.85% de NaCl) centri-

fugando a 6000 rpm por 20 minutos, para retirar el medio. Se resuspendió al volumen inicial

(solución de células concentrada) con agua destilada estéril.

Esta suspensión se dividió en dos partes., una de ellas para determinar peso seco y la otra para

hacer las mediciones de absorbancia a 600 nm.

VI.3.1. Determinación de peso seco de biomasa

Se marca y se secan durante 8 horas a 105ºC, 10 tubos de vidrio con capacidad de 25 ml. Se

pasan los tubos secos a un desecador y se dejan enfriar durante 3-4 horas. Se pesan los tubos

en balanza analítica, teniendo siempre la precaución de manipularlos con pinzas limpias, no

con la mano.

25

Se transfieren 10 ml por tubo de la solución de células concentrada a 10 tubos secos. Se llevan

todos los tubos al horno a 105ºC aproximadamente por 24 horas, hasta que el líquido se haya

evaporado y se tenga peso constante para asegurar que no hayan restos de humedad.

Se pasan los tubos al desecador y se dejan enfriar y se pesan en balanza analítica. Se determina

el promedio del peso de los 10 tubos que contienen las células. Expresar la concentración en

gramos de biomasa seca por litro de solución (g biomasa seca/L).

VI 3.2. Construcción de la curva

De la solución concentrada de células se realizan diluciones (por triplicado), tomando 2, 4, 6

y 8 mL y se afora a 10 mL con agua destilada. se lee absorbancia a 600 nm (las lecturas de

absorbancia deben quedar en el intervalo de 0.2 – 0.9).

Con el dato obtenido en el inciso anterior de g biomasa seca/L se calculan las concentraciones

finales para las respectivas diluciones. Se grafica absorbancia promedio en función de concen-

tración celular en g biomasa seca/L.

Se obtiene la ecuación: Abs 600nm = m*C + b ; donde m es la pendiente, C la concentración (g

biomasa seca/l) y b el punto de corte.

VI.3.3. Determinación de biomasa en el medio de cultivo .

Se toman 5 mL del medio de cultivo y se hacen dos lavados con centrifugación a 5000 rpm

por 20 min cada una. Se resuspenden en 5 ml de agua destilada. se agita y se lee absorbancia.

Se interpola el valoe obtenido en la curva de calibración y se obtiene el valor correspondiente

a g biomasa seca/L.

Si la absorbancia es mayor a 0.9, hacer dilución y tenerla en cuenta para los cálculos de con-

centración por la ecuación encontrada.

VI.4 Cinéticas de crecimiento y degradación del plaguicida seleccionado en medio líquido.

Se colocaron por duplicado en un matraz erlenmeyer de 125 mL, 50 mL de medio mineral

estéril pH 6.5 cuya composición (g/L) fue: NaH PO ( 2.4), K HPO (2), CaCl2 4 2 4 2 (0.01),

NH NO ( 0.1), MgSO .7H O (0.1) y suplementado con 3 diferentes sustratos: glucosa (10 4 3 4 2

26

g/L), peptona (2 g/L) y café estéril malla 10/20 (2 g/L). Los dos primeros se agregaron al me-

dio antes de esterilizar y el último antes de inocular.

Se agregaron 40 microlitros de plaguicida (DDT y endosulfan) disueltos en acetona: etanol

(1:1) para obtener una concentración final de 50 ppm. Finalmente se adicionaron 5 mL de cé-

lulas lavadas con solución salina de NaCl (0.85%) y resuspendidas en agua destilada que con-

tenían una concentración de biomasa de 0.3 g/L . Los matraces se incubaron a 30°C a 100 rpm

por 6 días. Se determinó biomasa cada 24 horas y plaguicida residual después de los 6 días de

incubación.

VI.5 Determinación de plaguicidas organoclorados.

La determinación de plaguicidas organoclorados se realizó por cromatografía de gases acopla-

da a masas, previa extracción con cloruro de metileno del medio de cultivo. Se hicieron 3 ex-

tracciones de 10 mL de disolvente cada una dejando reposar 15 minutos antes de separar la

fase orgánica. La fase orgánica se secó con Na SO2 4 y se evaporó. El residuo fue redisuelto en

5 mL de metanol, se filtraron por membrana de Nylon 0.22 �m y 2 microlitos de esta solución

se inyectaron al cromatógrafo.

El método cromatográfico empleado fue el siguiente:

Columna: ZB-5 (5% Fenilmetilsilicona), 30 m, 0.32 mm, 0.25 �m película

Temperatura columna: 140°(2min) después elevar a 5°C/min hasta 240°C (27 min).

Temperatura del inyector: 250 °C, Temperatura línea transferencia: 280°C.

Gas acarreador: Helio Flujo: 1.5 mL/min.

Los plaguicidas utilizados en este estudio fueron de grado técnico, con las siguientes caracte-

rísticas:

Concentración Solubilidad (mg/L) Plaguicida Composición* (%)

Endosulfán 96 Endosulfán I/Endosulfán II 0.32 (64.7:35.3)

DDT 98 DDE/o,p’-DDT/p,p’-DDT 0.001 8.7: 29.8:61.5

PCNB 97.6 --- 0.44

* Determinada por Cromatografía de gases-masas

27

VII. RESULTADOS_Y DISCUSIÒN________________________________________ VII. 1 Aislamiento de las bacterias asociadas al grano verde de café

Con base en la morfología colonial de las cepas crecidas en agar nutritivo, se aislaron cuatro

bacterias diferentes designadas AN-1, AN2, AN-3 y AN-4 (Figura 11). En este medio se

aprecian además unas colonias muy pequeñas de apariencia acuosa con muy poco crecimiento.

En agar con rosa de bengala se comprobó la ausencia de hongos pero se aprecian dos colonias

de lento crecimiento (Figura 12), designadas RB-1 y RB-2.

Las bacterias aisladas son bacilos Gram negativos. Las características morfológicas de las

colonias y la identificación microbiológica realizada por ensayos bioquímicos se indican en

el cuadro 11.

Figura 11. Cepas aisladas del café sembradas en agar nutritivo

28

Figura 12. Cepas aisladas del café sembradas en Agar Rosa de Bengala.

Cuadro 11. Morfología de las colonias aisladas del café .

Cepa Descripción Pseudomona ae-

ruginosa AN-1 Colonias de 5 mm de diámetro color amarillo claro.

Stenotrophomonas maltophilia

AN-2 Colonias de 5 mm de diámetro color crema, crecimiento com-pacto circular muy regular de apariencia cremosa

Pseudomona ae-ruginosa

AN-3 Colonía de 7 mm casi transparente (“acuosa”), crecimiento difuso, libera un pigmento verde que se difunde en el agar. Pocas bacterias de este tipo

Morganella AN-4 Colonia de 3 mm de color amarillo claro, circular. Crece hacia adentro del agar en la orilla de la colonia. morgani

Pseudomonas pu-tida

RB-1 Colonia de 2 mm, se tiñen de rojo con un halo blanco alrede-dor, circulares

Flavimonas RB-2 Colonia de 4 mm color crema oryzihabitans

Se ha reportado la capacidad de algunas bacterias del género Pseudomonas para degradar una

gran variedad de contaminantes entre ellos compuestos cloroaromáticos, alquilaromáticos,

nitroaromáticos e incluso bifenilos policlorados (BSD, 2004).

29

Se han aislado a partir de una planta de lodos activos (Buitrón and González, 1996) varias

cepas capaces de degradar fenol, 4-clorofenol , 2,4-diclorofenol y 2,4,6-triclorofenol, entre

ellas una cepa de Flavimonas oryzihabitans.

También se ha demostrado que Stenotrophomonas maltophilia es capaz de degradar hidrocar-

buros aromáticos policíclicos de alto peso molecular (Boonchan, 1998).

Puesto que el café será usado en los estudios de degradación como soporte para el crecimiento

de las bacterias aisladas, se realizó un análisis por microscopía electrónica de barrido (MEB)

de la superficie del grano de café antes y después de los 30 días de incubación con Pentacloro-

nitrobenceno. En la figura 13 se observa la degradación bacteriana de la superficie del grano

producida durante el periodo de incubación, lo cual nos sugiere que el café puede servir como

fuente de carbono , además de soporte para el crecimiento.

(a) (b)

Figura 13. Análisis por MEB de la superficie del café sin tratamiento (a), y a los 30 días de

incubación (b).

Respecto a la cuenta total bacteriana en función del pH (Cuadro 12), en agar nutritivo no se

observa una diferencia en el crecimiento arriba del pH 5.5, en contraste con el cultivo sobre

Rosa de Bengala donde se manifiesta un mayor número de colonias RB-1 en general, pero

mayor cantidad a pH de 5.5

30

Cuadro 12. Cuenta bacteriana de los cultivos de café (UFC/g de café) pH Rosa de Bengala Agar nutritivo Colonias blancas Colonias rojas

(RB-2) (RB-1) 5.0 8.4 x 1011 1.2x108 8x109

5.5 19.6 x 1011 2. x108 12.6 x109

6.0 18.8 x 1011 6 x108 4 x109

6.5 18.4 x 1011 7.6 x108 3 x109

VII. 2. Determinación de la capacidad de crecimiento en placa con plaguicidas organoclora-

dos como única fuente de carbono.

En el cuadro 13 se indica la capacidad de desarrollar colonias (+), de las diferentes cepas so-

bre agar noble con los plaguicidas indicados. La cepa AN3 no fue considerada en este ensayo

debido a que en el cultivo en agar nutritivo se liberaba un pigmento verde fluorescente, indica-

tivo de Pseudomonas aeruginosa. Como puede observarse la cepa AN-1 y RB2 tienen capaci-

dad de degradar todos los plaguicidas ensayados por lo que se seleccionaron para la siguiente

etapa.

Cuadro 13. Crecimiento sobre placa utilizando DDT, PCNB Y ENDOSULFAN

como fuente de carbono Plaguicidas organoclorados ensayados Cepa

PCNB DDT Endosulfán AN-1 + + + AN-2 + - + AN-3

VII.3 Cinéticas de crecimiento y degradación de plaguicidas en medio líquido. Selección de la

fuente de carbono.

Estos ensayos se realizaron utilizando la misma cantidad de biomasa en todos los casos, la

cual se determinó haciendo uso de la curva de calibración realizada para tal fin (figura 14).

- AN-4 + +

RB-1 - + - RB-2 + + +

31

(b)

y = 2.0473x + 0.0156R2 = 0.9973

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 0.1 0.2 0.3

Peso seco RB-2 (g/L)

Abs

600n

m

(a)

y = 1.7802x + 0.004R2 = 0.9986

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 0.1 0.2 0.3

Peso seco AN-1 (g/L)

Abs

600

nm

Figura 14. Relación grafica de turbidez vs. peso seco para AN-1(a) y RB-2 (b)

Las curvas de crecimiento obtenidas para cada bacteria en cada medio, con las diferentes

fuentes de carbono y para cada plaguicida se encuentran en las figuras

15 -18. la producción de biomasa para cada medio se muestra en la figura 19.

0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

1.8

0 2 4 6Tiempo (días)

Abs

600

nm

P/DDT/AN1 G10/DDT/AN1Café2/DDT/AN1

Figura 15. Curva de crecimiento de la cepa AN-1 en presencia de DDT (50 ppm) 30°C, 100 rpm

32

0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

1.8

0 2 4 6Tiempo (días)

Abs

600n

m

P/DDT/RB2 G10/DDT/RB2Café2/DDT/RB2

Figura 16. Curva de crecimiento de la cepa RB-2 en presencia de

DDT (50 ppm) 30°C, 100 rpm.

0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

1.8

0 2 4 6

Tiempo (días)

Abs

600

nm

P/ENDO/AN1 G10/ENDO/AN1CAFE2/ENDO/AN1

Figura 17. Curva de crecimiento de la cepa AN-1 en presencia de endosulfan (50 ppm), 30°C, 100 rpm

33

0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

1.8

0 2 4 6Tiempo (días)

Abs

600n

m

P/ENDO/RB2 G10/ENDO/RB2CAFE2/ENDO/RB2

Figura 18. Curva de crecimiento de la cepa RB-2 en presencia

de endosulfan (50 ppm), 30°C, 100 rpm.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

DD

T/A

N1

End

o/A

N1

DD

T/R

B2

End

o/R

B2

DD

T/A

N1

End

o/A

N1

DD

T/R

B2

End

o/R

B2

DD

T/A

N1

End

o/A

N1

DD

T/R

B2

End

o/R

B2

Plaguicida/Cepa

Bio

mas

a g/

L

Peptona 2g/L Glucosa 10g/L Café 2 g/L

Figura 19. Efecto del medio en la producción de biomasa en presencia

de DDT (50ppm) y de endosulfan (50 ppm) para la cepa AN-1 Y RB-2

34

De acuerdo a los resultados anteriores, el máximo crecimiento para la cepa AN-1 y RB-2 se

alcanza entre las 24 y 48 horas, teniendo una buena producción de biomasa aún en presencia

de 50 ppm de DDT y endosulfan.

La determinación del plaguicida residual se hará por cromatografía de gases. Curvas estándar

para cada uno de los plaguicidas en estudio han sido elaboradas (Figura 20).

Endo I (6.5- 324ppm)

y = 77571x + 433226R2 = 0.9989

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

30000000

0 100 200 300 400

Concentración (ppm)

area

PCNB(10-500ppm)

y = 45941x + 226716R2 = 0.9989

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

0 100 200 300 400 500

Concentración (ppm)

Are

a

p,p-DDT(3.07-307.7ppm)

y = 109613x - 448860R2 = 0.9995

-5000000

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

30000000

35000000

0 100 200 300 400

Concentración (ppm)

Áre

a

o,p'- DDT(1.48-148.8 ppm)

y = 95527x + 73900R2 = 0.9982

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

0 50 100 150 200

Concentración (ppm)

Are

a

Figura 20. Curvas estándar para la determinación de plaguicidas por GC-MS

35

El cuadro 14 y 15 muestran la degradación de DDT y endosulfán por las dos bacterias selec-cionadas. Cuadro 14. Valores de biomasa de F. oryzihabitans y degradación de DDT y endosulfán.

Cuadro 15 . Valores de biomasa de P. aeruginosa y degradación de DDT y endosulfán

Se puede observar que existen diferencias en cuanto al crecimiento y la degradación entre me-

dios y entre cepas, favoreciéndose mayormente la degradación de DDT por las 2 cepas ensa-

yadas, cuando se utiliza el grano de café como sustrato.

DDT Endosulfan

Carbon source Biomass Degradation Biomass Degradation

(gL-1) (%) (gL-1) (%)

Glucose(10gL-1) 0.489 ± 0.040 39.5± 1.5 0.660± 0.009 0± 2.0

-1Peptone (2gL ) 0.436± 0.036 26.7± 7.3 0.428± 0.074 16.3±3.2

Coffee (2gL-1) 0.296± 0.084 63.2 ± 1.6 0.407± 0.102 0 ± 1.8

DDT Endosulfan

Carbon source Biomass Degradation

(%)

Biomass Degradation

(gL-1) (gL-1) (%)

Glucose(10gL-1) 0.264 ± 0.046 32.5 ± 5.4 0.342 ± 0.023 30 ± 11

-1Peptone (2gL ) 0.337 ± 0.012 16.1 ± 0.1 0.345 ± 0.079 30 ± 12.2

Coffee (2gL-1) 0.334 ± 0.010 67.4 ± 0.2 0.531 ± 0.071 51.2 ± 10.6

36

VIII. CONCLUSIONES

Se han aislado 6 cepas de bacterias asociadas al grano de café en presencia del fungicida Pen-

tacloronitrobenceno (PCNB): Pseudomonas aeruginosa (AN-1y AN-3), Pseudomonas putida

(RB-1), Stenotrophomonas maltophilia (AN-2), Morganella morgani (AN-4)y Flavimonas ory-

zihabitans (RB-2).

Las cepas AN-1 y RB-2 crecen en placa de agar noble con PCNB, DDT y endosulfán como

única fuente de carbono .

El grano verde de café promueve el crecimiento de bacterias que tienen la capacidad de degra-

dar DDT y endosulfán, en medio líquido a una concentración de 2 g/L.

El mayor crecimiento en medio líquido se observa para la cepa RB-2 (Flavimonas oryzihabi-

tans) utilizando glucosa como fuente primaria de carbono, tanto en presencia DDT y de endo-

sulfán a 50 ppm.

.

37

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