I) IntroduccinLas bacterias son seres microscpicos, existe un grupo que son beneficiosas para la vida del hombre pero tambin otras pueden llegar a ser muy perjudiciales. No solo por ello es que su estudio es muy importante sino porque tambin forman parte de los ciclos biolgicos y geolgicos que rigen la vida en nuestro planeta y sin ellos la vida no se sustentara.

Segn Tortora ( 2007), una gran cantidad de microorganismos son casi incoloros cuando se les observa a travs de un microscopio ptico estndar, por ello a menudo es preciso prepararlos para la observacin y una de las maneras de hacerlo consiste en someterlos a tincin. Ello significa simplemente colorear los microorganismos con un colorante que destaque las estructuras. Sin embargo antes de teir los microorganismos se les debe de fijar (adherir) al portaobjetos, lo cual se realizar pasndolo varias veces sobre la mecha de un mechero Bunsen.

En el presente trabajo, lo primero que haremos es la preparacin que se debe de realizar para fijar una muestra en la lmina de vidrio, pues cada procedimiento por separado es muy importante. Y por ltimo, ya fijado las muestras, procederemos a la tincin simple de las muestras con colorantes bsicos, utilizaremos tres colorantes: azul de metileno, cristal violeta y fucsina. Estos ayudaran a teir las partes negativas de las clulas.

II) Objetivos: Fijar una muestra de bacterias para tincin, es decir, adherir al portaobjetos para realizar la tincin. Aprender el procedimiento a seguir para no contaminar la muestra a estudiar ni los materiales a usar. Realizar una Tincin Simple de la muestra con colorantes bsicos. Observar la muestras de: Bacillus sp, Staphylococcus sp, Escherichia coli una vez teidas en el microscopio y graficar sus formas.III) Marco TericoII.1 Fijacin de BacteriasProceso que tiene como finalidad inmovilizar las clulas bacterianas sobre el portaobjetos para que no sean arrastradas en los procesos posteriores de teido y de lavado. Aunque es inevitable que la fijacin cause la muerte de los microorganismos y altere alguna de sus caractersticas, con un procesamiento adecuado se minimizan estas alteraciones. (Gamazo, 2005) II.2 Tinciones Son procedimientos para teir bacterias que normalmente no seran visibles al microscopio ptico por ser transparentes. Las tinciones se efectan generalmente sobre bacterias se desecadas o calentadas para coagular protenas (fijacin). (Prieto, 2006)

II.2.1 Tincin Simple Es una solucin acuosa de o alcohlica de un colorante bsico. Aunque los diferentes colorantes se unen de forma especfica a las distintas partes de las clulas, el propsito principal de una tincin simple es destacar al microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares bsicas. (Tortora, 2007) II.3 Colorantes En trminos generales los colorantes se clasifican como cidos y bsicos; esta denominacin no indica necesariamente su pH de reaccin en solucin, sino en cambio, si una parte significativa de la clula es aninica o catinica. (Koneman, 2008)II.3.1 Colorantes BsicosDesde el punto de vista prctico, los colorantes bsicos tien estructuras cidas, como la cromatina del ncleo de las clulas. (Koneman, 2008) Dentro de estos encontramos al Azul de metileno, Cristal violeta y Fucsina.II.3.1.1 Azul de MetilenoEs una sal bsica. Un indicador de oxido-reduccin que , cuando se incorpora en el medio, denota cambios en el potencial de oxidacin-reduccin. (MacFaddin, 2003)II.4 Bacillus spSon organismos que se dividen exclusivamente a travs de sus ejes menores. La mayora de estos se observan como bastones aislados. Algunos bacilos presentan el aspecto hebras de paja y otros presentan extremos afinados y se asemejan a cigarros. (Tortora 2007)II.5 Staphylococcus spSon parsitos comunes de los humanos y animales y ocasionalmente causan infecciones serias. Son organismo aerobios, con metabolismo respiracin tpica. Son catalasa positivos, lo que permite diferenciarlos de las especies del gnero Streptococcus y otros gneros de coco Gram, que son relativamente tolerantes a medios con baja actividad de agua, resistiendo bastante bien hbitats secos y salinos. Estas tambin son caractersticas de los Staphylococcus sp los cuales son pigmentados para su identificacin. (Madigan )II.6 Escherichia coliEs un bacilo Gram negativo, con una cadena de ADN, aerobio facultativo, con flagelos pertricos, pilis y microcapsulas. Forma parte de la flora nativa intestinal y se encuentra en calidad de saprobio sin causar dao. (Romero 2007) IV) Materiales y MtodosEjercicio N1Preparacin de una muestra fija de bacterias para tincinIII.1.1 Materiales: Lmina porta objeto y cubre objeto Mechero de alcohol. Asa de klle. Algodn. Alcohol. Piseta con agua.

Muestra conteniendo bacterias Tubo de ensayo N1 con agar-agar y Staphylococcus sp Tubo de ensayo N2 con agar-agar y Escherichia coli Tubo de ensayo N3 con agar-agar y Bacillus sp

III.1.2 Mtodo:1. Desengrasar la lmina porta objeto con alcohol y algodn.2. Colocar una gota de agua en la lmina porta objeto.3. Prender el mechero de alcohol.4. Esterilizar el asa de klle (flamear).5. Colocar el tubo de ensayo delante del mechero de alcohol.6. Sacar el algodn cuidadosamente del tubo de ensayo (girar el algodn).7. Pasar de manera rpida la parte superior del tubo de ensayo por la llama del mechero.8. Raspar suavemente la muestra con el asa de klle; sin romper el agar-agar y esparcirla en la lmina porta objeto.9. Antes de tapar el tubo de ensayo se debe de pasar por la llama del mechero de alcohol, y flamear el asa de klle para dejarla libre de microorganismos.10. Secar la lmina porta objeto con la llama del mechero hasta que adquiera un color blanco.11. Repetir el mismo procedimiento de fijacin para las tres muestras.

Ejercicio N2Tincin simple con colorantes bsicosIII.2.1 Materiales: Lminas fijadas de microorganismos. Aceite de inmersin (aceite de cedro). Colorantes bsicos Azul de metileno Cristal violeta Carbolfucsina Soporte para tincin. Piseta con agua. Papel secante. III.2.2 Mtodo:1. Cubrir cada lmina fijada de microorganismos con unas gotas del colorante adecuado: Staphylococcus sp con azul de metileno, Escherichia coli con Cristal violeta y Bacillus sp con Carbolfucsina.2. Colocar cada una de las lminas en el soporte para tincin.3. Esperar el tiempo adecuado para cada colorante, en el caso del azul de metileno 60, cristal violeta 10 y carbolfucsina 5.4. Terminado el tiempo de teido, lavar con el agua de la piseta.5. Secar la lmina con el papel secante y agregar una gota de aceite de cedro en la parte teida.6. Llevar al microscopio y observarla con un G.A = 1000X , tener en cuenta que la distancia de trabajo entre la muestra y el lente objetivo es cero, es decir, se encuentra en contacto.V) Resultados Gnero: Staphylococcus sp G.A: 1000 Forma: cocos (esfrica) Agrupacin: Racimo Color: Azul de metileno

Gnero: Escherichia coli G.A: 1000 Forma: Cocobacilo Agrupacin: Ninguna Color: Cristal violeta

Gnero: Bacillus sp G.A: 1000 Forma: Abastonada (bastoncillo) Agrupacin: Streptobacilo Color: Carbolfucsina

VI) Discusiones Segn William (1965), afirma que si el espacio comprendido entre el objetivo y el cubre-objeto est ocupado por aire, los rayos ms divergentes sern refractados tan lejos que no penetraran en el objetivo, con lo que la imagen perder definicin , es por esta razn que en la presente practica se requiri de un aceite especial para llenar el espacio entre el lente y la muestra, para impedir la desviacin de los rayos luminosos, segn este autor este aceite no debe ser desecante para evitar que se endurezca durante sobre el objetivo o cubre objetos cuando estos tardan en limpiarse, siendo el aceite de cedro el ms conveniente para llevar a cabo esta prctica.

Segn William (1965): Las especies bacterianas no conservan una forma definida con carcter permanente. De hecho en algunos microorganismos pueden observarse tales cambios morfolgicos que, en determinadas circunstancias, resulta casi imposible su identificacin. Semejantes variaciones son causadas por el ambiente impuesto al microorganismo por el investigador. Este es el caso de la Escherichia coli, la cual al ser inoculada en un medio que contenga un agente tenso-activo, como el cristal violeta, las clulas que normalmente tienen forma de bastoncillo, aparecen a la vista como filamentos de mucha mayor longitud. Por otra parte, si se eleva la tensin superficial demedio por adicin de cloruro clcico, pueden aparecer esfricas. Es por esta razn que en la prctica realizada, se observ a esta bacteria como cocobacilo.

Segn Merchant (1975), describe a los grmenes pertenecientes al grupo de los bacilos aerobios y esporulados son cilndricos, generalmente flagelados, crecen en cadenas y forman colonias grandes e irregulares en los medios slidos. Asimismo, describe a la Escherichia coli como un bacilo corto de 0,5 micras de ancho por 1-3 micras de largo, variando desde formas coloides bipolares, hasta largos filamentos. Frecuentemente se presenta aislado, pero no son raras las cadenas cortas. Mientras que el gnero Staphylococcus sp tiene forma esfrica y ovoide, agrupados generalmente en racimos, aunque en los medios de cultivo se ven con frecuencia parejas y cadenas cortas.

Segn Carter (1985), las formas bacterianas bsicas son tres: bastones rectos(bacilos), esferas(cocos) y espirales o bastones curvos ( espiroquetas, espirilo y Vibrio). Existe una variacin considerable en estas formas bsicas, Con frecuencia se observan formas ovoides, filamentosas y cocobacilares, este es el caso de la Escherichia coli observada en la prctica de laboratorio. Carter afirma tambin que los cocos se encuentran formando diferentes agrupaciones de acuerdo a los planos en que se produce su divisin, los Staphylococcus sp se agrupan en forma de racimos tal y como se observ en laboratorio.

VII) Conclusiones

1. Se concluye que la fijacin de una muestra de bacterias es importante para la realizacin de una buena tincin y posterior observacin en el microscopio, ya que esta operacin pretende que las bacterias se adhieran al portaobjetos por coagulacin de sus protenas plasmticas mediante la accin del calor.2. Se concluye que es preferible una tincin simple, ya que esta operacin ofrece orientacin sobre la presencia, concentracin, morfologa y modo de agrupacin bacteriana.3. Se concluye que el colorante a usar para la tincin de la bacteria Eschericha coli es el cristal violeta, debido a su rpida reaccin y a que esta bacteria contiene abundante materia orgnica lipidia en su cpsula.

VII) Bibliografa

Caro C., Castaeda L., Castro V., Castro M., Mansilla R., Opisso J. y Quintana A, 2010 , Manual de Prcticas: Biologa General, Lima Per. Prieto Prieto, Rosa Jos. Microbiologa en ciencias de la Salud. Segunda Edicin. Editorial Elsevier. Ao 2006. Capitulo 2: La clula bacteriana. Pg 9. Gamazo, Lpez- Goi, Daz. Manual prctico de Microbiologa. Tercera Edicin. Editorial Masson. Ao 2005. Capitulo 3: Observacin de Microorganismos. Pg 24 Romero Cabello. Microbiologa y parasitologa humana. Tercera Edicin. Editorial Medica Panamericana. Ao 2007. Pg. 753

VIII) Cuestionario1.- Cules son las asociaciones ms frecuentes en bacterias?Se consideran: cocos, bacilos, espirilos y espiroquetas.1. Cocos o micrococos: Incluyen las bacterias de tamao variable, cuya forma es esfrica u ovoide y generalmente son aerobios estrictos. Algunas veces estas bacterias tienden a agruparse. Cuando se presentan asociadas dos bacterias reciben el nombre de diplococos. En otras ocasiones los micrococos se renen formando grupos de cuatro elementos dispuestos en cuadro, y se denominan entonces tetracocos, tetrgenos o ttradas.Las sarcinas, son especies de bacterias cocales que se dividen en tres planos perpendiculares para formar paquetes de ocho, diecisis, treinta y dos, o ms micrococos. Son anaerobios obligados y cido-tolerantes por lo que pueden crecer en un pH inferior a 2 despus de fermentar azcar. Algunas especies como Sarcina ventriculi producen una capa fibrosa y gruesa de celulosa que se dispone alrededor de la pared celular y funciona como cemento para mantenerse adheridas entre s.

Cuando los cocos se agrupan en tres, cuatro o ms clulas dispuestas en forma lineal reciben el nombre de estreptococos que desempean funciones importantes en la produccin de leche cida y otros fermentos. Para distinguir los estreptococos no patgenos de las especies patgenas, el gnero Streptococcus presenta tres divisiones: Lactococcus, importante en la industria lctea y Enterococcus que son principalmente de origen fecal. Algunos estreptococos se envuelven en una cubierta gelatinosa y constituyen una forma de agrupacin que recibe el nombre de leuconostoc, que pueden ser heterofermentativos, y descomponen el citrato para obtener diacetilo y acetona. Otro tipo de asociacin que utilizan las bacterias cocales es la formacin de agregados compactos denominados zoogleas, en las cuales se encuentran los microorganismos includos dentro de una envoltura gelatinosa. 2. Bacilos: Son bacterias que tienen forma de bastoncillo, se pueden encontrar en grupos de dos denominados diplobacilos, o en cadenas similares a las que presentan los cocos por los que se les llama estreptobacilos. El gnero ms representativo de esta morfologa lleva el nombre Bacillus, el cual se caracteriza por la formacin de endosporas. Son tiles en la produccin de antibiticos tales como bacitracina, gramicidina y polimixina, entre otros. Tambin se han utilizado como biocontroladores en la erradicacin de ciertas plagas en cultivos de importancia econmica, de las cuales son parsitos.3. Espirilos: Son bacterias bacilares, helicoidales con movilidad flagelar, que se clasifican dentro de las Gram negativas. Los espirilos con muchas vueltas a pesar de su semejanza morfolgica con las espiroquetas, se diferencian de ellas porque poseen flagelos bacterianos tpicos externos mientras las espiroquetas poseen flagelos periplsmicos o filamentos axiales internos. 4. Espiroquetas: Son bacterias filiformes, flexibles, muy largas, que presentan forma de espiral con diez o ms vueltas. En algunas ocasiones con un flagelo en cada extremo (como por ejemplo el espirilo responsable de la sfilis: Treponema). Habitualmente se hallan en ambientes acuticos o en el cuerpo de animales. El cilindro protoplsmico de estas clulas se encuentra rodeado por una membrana de tres capas conocida como cubierta celular externa, adems poseen una estructura nica que le permite la movilidad llamada filamento axial, compuesta de un flagelo que atraviesa el cuerpo celular y se sita entre la pared delgada flexible y la envoltura externa. Las espiroquetas pueden encontrarse como parsitos en humanos mientras otras viven libres en agua o madera. 2. En qu rango de tamaos se definen las bacterias?El micrmetro (m) es la unidad de medida que se utiliza para determinar el tamao bacteriano, equivale a 1/1.000 mm o 1/25.00 pulgadas. La mayora est dentro de un rango aproximado de 0.5 a 2.0 m de ancho y 1 a 10 m de largo. Hay especies bacterianas que pueden medir mucho ms, como las formas alargadas que pueden estar en el rango de 2 a 100 m de longitud a ms. 3. Cules son las formas bacterianas ms frecuentes?Bacilos (bacterias con forma de barras): Con forma de barras o varillas, los bacilos suelen ser bacterias de tipo Gram positivao negativa. Cocos (bacterias con forma de esferas): Con su caracterstica forma esfrica, lasbacteriasconocidas comococostienen la capacidad de vivir como clulas individuales o bien de enlazarse hasta forman cadenas y racimos. Espirilos (bacterias con forma de espirales): Los espirilos, como bien nos indica su nombre, poseen una marcada forma de espiral. stas sonbacterias Gram negativasy terribles para la salud. 4. Qu diferencia a una tincin directa de una tincin negativa?Tincin Directa: utiliza solo un colorante, el cual debe ser bsico para que la clula bacteriana se tia. Permite demostrar la morfologa general de una clula de manera rpida, en su conjunto se observarn del color de colorante empleado. Los ms empleados son cristal violeta, azul metileno y fucsina fenicada.Tincin Negativa: Este mtodo es ideal para observar inclusiones refrctiles que no se tien fcilmente, tales como grnulos de azufre, acido poli--hidroxibutrico, esporas o capsulas bacterianas. Por otra parte, no es adecuado para medir bacterias, pues estas generalmente se observarn de mayor tamao.Para hacer esta tincin se impregna una preparacin de bacterias con tinta china (suspensin coloidal de carbn) o nigrosina. Las partculas de carbn no penetran la clula bacteriana, sino que tien su entorno y la bacteria aparecer como un cuerpo refrctil sin teir. Generalmente se combina esta tincin con una simple.5.-Qu importancia le atribuye a las diferencias en reactividad de los colorantes empleados?Casi todos los colorantes empleados son sales, compuestos formados por iones cargados electrnicamente. El azul de metileno y el cristal violeta, usados en la experiencia, son colorantes bsicos los cuales el agente que tie es el ion cargado positivamente, y se combinan con los componentes cidos de la clula como ADN y ARN. Es decir se combinan con los componentes celulares en funcin a sus respectivas cargas por lo tanto los factores como fuerza inica, composicin del medio, temperatura y pH; afectan las tinciones y podran ser causantes de alteraciones de no preverlos. 6. Cul es la funcin del aceite de cedro?El aceite de cedro (aceite de inmersin) permite obtener una imagen de gran tamao y al mismo tiempo de gran nitidez. Cuando se trabaje con un lente de inmersin la distancia de trabajo ser mnima.7. Cul es la funcin del lente objetivo de inmersin?El lente objetivo de inmersin produce el aumento de las imgenes de las muestras, por lo tanto se hallan cerca de las mismas. Para observar a travs de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de cedro entre el objetivo y la preparacin, de manera que la lente frontal entre en contacto con el aceite de cedro.