INDUCCIÓN Y CULTIVO DE CALLO DE NICOTIANA PANICULATA

“TABACO CIMARRÓN”

MAURO QUIÑONES

ALLCCACO, J.CÁCERES, M.

Resumen

Nicotiana paniculata, conocida como tabaco cimarrón, es una Solanáceas endémica del Perú, que presenta propiedad antimicrobiana, antifúngica, antiinflamatoria y es utilizada como antídoto contra la picadura de arácnidos. El presente estudio se realizó con el propósito de lograr la desdiferenciación celular para obtener tejido calloso a partir de explantes de tallo y peciolo de Nicotiana paniculata “tabaco cimarrón”. Los explantes se esterilizaron con solución de Hipoclorito de Sodio (NaClO) al 2.5%, luego se les realizó pequeños cortes (heridas) y fueron introducidos in vitro en el medio Murashige y Skoog (1962) (MS) suplementado con 1mg/L de ácido 2,4- diclorofenoxiacetico (2,4-D), 30g/L de sacarosa y 100 mL/L de agua de coco; todo el trabajo se realizó dentro de la cámara de flujo laminar previamente esterilizada. Posteriormente,

olos explantes se incubaron en un cuarto oscuro a una temperatura de 20-22 C. Como resultado se obtuvo callos en los explantes de tallos a los seis, trece y veinte días de la introducción in vitro. A los 30 días de cultivo, se observó el proceso de fenolización como producto de la reacción de oxidación en los explantes, lo que causó el cambio de color de los callos de blanco amarillento a pardo claro. El análisis del callo con azul de metileno al 1% evidencia su viabilidad y capacidad de regenerar una nueva planta completa por organogénesis indirecta.

Palabras clave:

Nicotiana; explantes; cultivo; callo; in vitro; 2,4-D; proliferación.

Abstract

Nicotiana paniculata, known as ornamental tobacco is a Native American monocot, belonging to Solanaceae family, which has antimicrobial, antifungal and anti-inflammatory properties and is used as an antidote against the bite of spiders. This study was conducted in order to achieve cellular dedifferentiation to obtain callus tissue from stem and petiole explants of Nicotiana paniculata.

121

The explants were sterilized with sodium hypochlorite solution (NaClO) 2.5%, later on the surface of explants were cut to produce wounds and were introduced in vitro on Murashige & Skoog (1962) basal medium supplemented with 1 mg / L of acid 2,4 - dichlorophenoxyacetic (2,4-D), 30g / L sucrose and 100 mL / L coconut water, research was performed within the laminar flow cabinet previously sterilized. Subsequently, the explants were incubated in a dark room at a temperature of 20-22 °C. As a result were obtained callus tissue from stem explants six, thirteen and twenty days after in vitro introduction. After 30 days of culture, we observed the process of phenolization as reaction product of oxidation in explants, which changed the color of callus tissue from yellow-white callus to light brown. The analysis of the callus with methylene blue 1% demonstrates the viability and the ability to regenerate a new completed plant by indirect organogenesis.

Key words:

Nicotiana; culture; callus; in vitro; 2.4-D.

Introducción

El cultivo de plantas es una de las prácticas actuales más importantes, debido a que permite estudiar todos los factores que influyen sobre el metabolismo, crecimiento y desarrollo de las plantas. La Biotecnología vegetal promueve el uso de técnicas en el cultivo de tejidos de diferentes especies de plantas con propiedades benéficas, con la finalidad de utilizarlas como recursos para la elaboración de productos farmacéuticos, cosméticos, industriales, etc. Un ejemplo de estas es Nicotiana paniculata “tabaco

cimarrón”, una Solanáceas endémica del Perú, que presenta propiedad antimicrobiana, antifúngica, antiinflamatoria y es utilizada como antídoto contra la picadura de arácnidos.

Mediante la técnica de cultivo de tejidos in vitro se puede lograr la obtención de tejido calloso, el cual consiste en una masa amorfa de tejido desdiferenciado que surge debido a heridas producidas por cortes en los explantes donde se da la proliferación de células del parénquima. Una de las características importantes del callo es su irregular crecimiento, el cual permite desarrollar órganos (raíces, brotes y embriones) y la regeneración de plantas completas.

La técnica de cultivo in vitro consiste esencialmente en aislar una porción de la planta que se encuentra en crecimiento, producirle cortes superficiales (heridas) y colocarlo en medios semisólidos, en los cuales, dependiendo de los reguladores de crecimiento utilizados, es posible inducir con cierta facilidad la formación de callos (Ochoa A. 1990). Para el cultivo es necesario un medio con nutrientes, vitaminas y reguladores de crecimiento que las células, tejidos u órganos requieren para su desarrollo. En el cultivo de células vegetales la auxina más utilizada para la inducción y mantenimiento del tejido calloso es el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). (Calva, G. Y Perez, J. 2005).

Según Litz y Jarret (1993) los primeros trabajos de inducción y cultivo de callo fueron realizados por White (1939) en explantes de Nicotiana glauca y Nicotiana langsdorfii. Esta investigación respaldó la teoría de la totipotencialidad celular, que consiste en que todas las células vegetales tienen la capacidad para formar plantas completas. Así

122

SCIENTIA VOL XII, N° 12

mismo, Reinert y Steward (1958) describieron la inducción de embriones somáticos a partir de callos derivados del ápice radical de Daucus carota “zanahoria”.

Mediante la técnica biotecnológica de cultivo de callos y su posterior cultivo en biorreactores, se pueden obtener metabolitos secundarios de Nicotiana paniculata, aprovechando mejor las propiedades farmacológicas de esta especie sin causar daños en la biodiversidad y a su vez mejorar la calidad de vida.

La presente investigación tiene como propósito lograr la desdiferenciación celular y obtener tejido calloso de Nicotiana paniculata “tabaco cimarrón” en condiciones controladas.

Materiales y métodos

La planta madre de Nicotiana paniculata “tabaco cimarrón” fue adquirida del invernadero del laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Universidad Ricardo Palma. La muestra se trasladó al laboratorio, donde se cortaron los tallos y peciolos jóvenes en esquejes de 1-1.5 cm., se lavaron con detergente y se enjuagaron. En la cámara de flujo laminar previamente esterilizada, se sumergieron los explantes en alcohol al 96% por 30 segundos, luego en solución de Hipoclorito de Sodio (NaClO) al 2.5% por 15 minutos, enjuagándose cuatro veces con agua destilada previamente esterilizada con un intervalo de 5 minutos entre cada enjuague. Con la ayuda del bisturí y sobre una placa Petri previamente esterilizada, se realizó cortes (heridas) en los explantes de peciolo y tallo de diferente edad fisiológica los cuales se sembraron en 8 tubos de ensayo (4 de tallo y 4 de peciolo) de 150 x 25 mm. con medio de cultivo MS enriquecido con 1mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D), 30g/L de sacarosa y 100 mL/L de agua de coco. Luego se

oflameó, se selló con papel aluminio, se rotuló y se incubó en un cuarto oscuro a 20-22 C. Se observó interdiariamente para determinar el inicio de formación del tejido calloso y visualizar la presencia de agentes contaminantes en los cultivos. Se cuantificó el número de explantes que formaron callo durante las primeras 4 semanas de cultivo. Transcurrido los 30 días, los callos se transfirieron a un medio de cultivo fresco para mayor proliferación. Se determinó la viabilidad con azul de metileno al 1%. Resultados

Se lograron obtener callos de color blanco amarillento de aspecto granulado y seco en los explantes de tallo de Nicotiana paniculata en un 100% a los 6, 13 y 20 días de la introducción in vitro (Cuadro 1 y Foto 1). No presento fenolización ni contaminación.

Cuadro 1. Días de inicio de la formación del callo a partir de explantes de tallo de Nicotiana paniculata.

123

QUIÑONES, M.; ALLCCACO, J.; CÁCERES, M.

The explants were sterilized with sodium hypochlorite solution (NaClO) 2.5%, later on the surface of explants were cut to produce wounds and were introduced in vitro on Murashige & Skoog (1962) basal medium supplemented with 1 mg / L of acid 2,4 - dichlorophenoxyacetic (2,4-D), 30g / L sucrose and 100 mL / L coconut water, research was performed within the laminar flow cabinet previously sterilized. Subsequently, the explants were incubated in a dark room at a temperature of 20-22 °C. As a result were obtained callus tissue from stem explants six, thirteen and twenty days after in vitro introduction. After 30 days of culture, we observed the process of phenolization as reaction product of oxidation in explants, which changed the color of callus tissue from yellow-white callus to light brown. The analysis of the callus with methylene blue 1% demonstrates the viability and the ability to regenerate a new completed plant by indirect organogenesis.

Key words:

Nicotiana; culture; callus; in vitro; 2.4-D.

Introducción

El cultivo de plantas es una de las prácticas actuales más importantes, debido a que permite estudiar todos los factores que influyen sobre el metabolismo, crecimiento y desarrollo de las plantas. La Biotecnología vegetal promueve el uso de técnicas en el cultivo de tejidos de diferentes especies de plantas con propiedades benéficas, con la finalidad de utilizarlas como recursos para la elaboración de productos farmacéuticos, cosméticos, industriales, etc. Un ejemplo de estas es Nicotiana paniculata “tabaco

cimarrón”, una Solanáceas endémica del Perú, que presenta propiedad antimicrobiana, antifúngica, antiinflamatoria y es utilizada como antídoto contra la picadura de arácnidos.

Mediante la técnica de cultivo de tejidos in vitro se puede lograr la obtención de tejido calloso, el cual consiste en una masa amorfa de tejido desdiferenciado que surge debido a heridas producidas por cortes en los explantes donde se da la proliferación de células del parénquima. Una de las características importantes del callo es su irregular crecimiento, el cual permite desarrollar órganos (raíces, brotes y embriones) y la regeneración de plantas completas.

La técnica de cultivo in vitro consiste esencialmente en aislar una porción de la planta que se encuentra en crecimiento, producirle cortes superficiales (heridas) y colocarlo en medios semisólidos, en los cuales, dependiendo de los reguladores de crecimiento utilizados, es posible inducir con cierta facilidad la formación de callos (Ochoa A. 1990). Para el cultivo es necesario un medio con nutrientes, vitaminas y reguladores de crecimiento que las células, tejidos u órganos requieren para su desarrollo. En el cultivo de células vegetales la auxina más utilizada para la inducción y mantenimiento del tejido calloso es el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). (Calva, G. Y Perez, J. 2005).

Según Litz y Jarret (1993) los primeros trabajos de inducción y cultivo de callo fueron realizados por White (1939) en explantes de Nicotiana glauca y Nicotiana langsdorfii. Esta investigación respaldó la teoría de la totipotencialidad celular, que consiste en que todas las células vegetales tienen la capacidad para formar plantas completas. Así

122

SCIENTIA VOL XII, N° 12

mismo, Reinert y Steward (1958) describieron la inducción de embriones somáticos a partir de callos derivados del ápice radical de Daucus carota “zanahoria”.

Mediante la técnica biotecnológica de cultivo de callos y su posterior cultivo en biorreactores, se pueden obtener metabolitos secundarios de Nicotiana paniculata, aprovechando mejor las propiedades farmacológicas de esta especie sin causar daños en la biodiversidad y a su vez mejorar la calidad de vida.

La presente investigación tiene como propósito lograr la desdiferenciación celular y obtener tejido calloso de Nicotiana paniculata “tabaco cimarrón” en condiciones controladas.

Materiales y métodos

La planta madre de Nicotiana paniculata “tabaco cimarrón” fue adquirida del invernadero del laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Universidad Ricardo Palma. La muestra se trasladó al laboratorio, donde se cortaron los tallos y peciolos jóvenes en esquejes de 1-1.5 cm., se lavaron con detergente y se enjuagaron. En la cámara de flujo laminar previamente esterilizada, se sumergieron los explantes en alcohol al 96% por 30 segundos, luego en solución de Hipoclorito de Sodio (NaClO) al 2.5% por 15 minutos, enjuagándose cuatro veces con agua destilada previamente esterilizada con un intervalo de 5 minutos entre cada enjuague. Con la ayuda del bisturí y sobre una placa Petri previamente esterilizada, se realizó cortes (heridas) en los explantes de peciolo y tallo de diferente edad fisiológica los cuales se sembraron en 8 tubos de ensayo (4 de tallo y 4 de peciolo) de 150 x 25 mm. con medio de cultivo MS enriquecido con 1mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D), 30g/L de sacarosa y 100 mL/L de agua de coco. Luego se

oflameó, se selló con papel aluminio, se rotuló y se incubó en un cuarto oscuro a 20-22 C. Se observó interdiariamente para determinar el inicio de formación del tejido calloso y visualizar la presencia de agentes contaminantes en los cultivos. Se cuantificó el número de explantes que formaron callo durante las primeras 4 semanas de cultivo. Transcurrido los 30 días, los callos se transfirieron a un medio de cultivo fresco para mayor proliferación. Se determinó la viabilidad con azul de metileno al 1%. Resultados

Se lograron obtener callos de color blanco amarillento de aspecto granulado y seco en los explantes de tallo de Nicotiana paniculata en un 100% a los 6, 13 y 20 días de la introducción in vitro (Cuadro 1 y Foto 1). No presento fenolización ni contaminación.

Cuadro 1. Días de inicio de la formación del callo a partir de explantes de tallo de Nicotiana paniculata.

123

QUIÑONES, M.; ALLCCACO, J.; CÁCERES, M.

A los 23 días la proliferación alcanzó 2 cm. de diámetro manteniendo su apariencia inicial (Foto 2). A los 30 días de cultivo, se observó el proceso de fenolización como producto de la reacción de oxidación en los explantes, lo que causó el cambio de color de los callos de blanco amarillento a pardo claro (Foto 3)

El resultado de la prueba de viabilidad con azul de metileno al 1% muestra que los callos son viables y capaces de regenerar una planta completa por organogénesis indirecta (Foto 4).

En los explantes de peciolo no se logro la formación del tejido calloso debido a la contaminación con Cladosporium spp. y Bacillus sp. (Foto. 5).

Foto. 1 Inicio de la desdiferenciación celular y formación del callo de Nicotiana paniculata

Foto. 2. Callo de Nicotiana paniculata a los 23 días.

Foto. 3. Callo fenolizado de Nicotiana paniculata a los 30 días.

124

SCIENTIA VOL XII, N° 12

Foto. 4. Prueba de viabilidad del tejido calloso de Nicotiana paniculata (400x)

Foto. 5. Cladosporium spp. Discusión

Según estudios realizados por Gonzales, M. (2005), los requerimientos nutricionales y hormonales difieren cuando los tejidos cultivados provienen de plantas en diferentes edades fisiológicas. Asimismo Ruiz, B. 2000 afirma que la capacidad regenerativa de los órganos y tejidos de una planta disminuyen a medida que estos van madurando, siendo los tejidos jóvenes los más apropiados para el cultivo. Por otro lado, Geier 1990 recomienda el uso de explantes jóvenes en la regeneración in vitro de Anthurium andraeanum L., ya que por ser una monocotiledónea, al madurar aumenta la dureza del tejido y se disminuye la capacidad de regeneración perdiéndose finalmente. En nuestra investigación se utilizaron como explantes tallos jóvenes de Nicotiana paniculata, ya que por ser una monocotiledonea se debe tener en cuenta lo mencionado anteriormente por Geier.

Valdez, A. et al (2004) realizó ensayos para la formación de callo en caña de azúcar y determinó que a medida que la fracción o sección del explante se alejaba del meristemo apical, la fenolización tiende a incrementarse. En sus observaciones, los explantes de hojas que mostraron menos fenolización fueron las más cercanas al meristemo apical. Por otro lado Perl et al. (1996) mencionaron que el control de la fenolización es un aspecto crucial, ya que una vez que se desencadenan las reacciones de oxidación de fenoles en los tejidos dañados por la manipulación, este proceso se hace irreversible, lo que conlleva a una pérdida significativa de la calidad de los explantes. En nuestro caso, utilizamos explantes de tallo de diferentes edades fisiológicas de acuerdo a la

125

QUIÑONES, M.; ALLCCACO, J.; CÁCERES, M.

A los 23 días la proliferación alcanzó 2 cm. de diámetro manteniendo su apariencia inicial (Foto 2). A los 30 días de cultivo, se observó el proceso de fenolización como producto de la reacción de oxidación en los explantes, lo que causó el cambio de color de los callos de blanco amarillento a pardo claro (Foto 3)

El resultado de la prueba de viabilidad con azul de metileno al 1% muestra que los callos son viables y capaces de regenerar una planta completa por organogénesis indirecta (Foto 4).

En los explantes de peciolo no se logro la formación del tejido calloso debido a la contaminación con Cladosporium spp. y Bacillus sp. (Foto. 5).

Foto. 1 Inicio de la desdiferenciación celular y formación del callo de Nicotiana paniculata

Foto. 2. Callo de Nicotiana paniculata a los 23 días.

Foto. 3. Callo fenolizado de Nicotiana paniculata a los 30 días.

124

SCIENTIA VOL XII, N° 12

Foto. 4. Prueba de viabilidad del tejido calloso de Nicotiana paniculata (400x)

Foto. 5. Cladosporium spp. Discusión

Según estudios realizados por Gonzales, M. (2005), los requerimientos nutricionales y hormonales difieren cuando los tejidos cultivados provienen de plantas en diferentes edades fisiológicas. Asimismo Ruiz, B. 2000 afirma que la capacidad regenerativa de los órganos y tejidos de una planta disminuyen a medida que estos van madurando, siendo los tejidos jóvenes los más apropiados para el cultivo. Por otro lado, Geier 1990 recomienda el uso de explantes jóvenes en la regeneración in vitro de Anthurium andraeanum L., ya que por ser una monocotiledónea, al madurar aumenta la dureza del tejido y se disminuye la capacidad de regeneración perdiéndose finalmente. En nuestra investigación se utilizaron como explantes tallos jóvenes de Nicotiana paniculata, ya que por ser una monocotiledonea se debe tener en cuenta lo mencionado anteriormente por Geier.

Valdez, A. et al (2004) realizó ensayos para la formación de callo en caña de azúcar y determinó que a medida que la fracción o sección del explante se alejaba del meristemo apical, la fenolización tiende a incrementarse. En sus observaciones, los explantes de hojas que mostraron menos fenolización fueron las más cercanas al meristemo apical. Por otro lado Perl et al. (1996) mencionaron que el control de la fenolización es un aspecto crucial, ya que una vez que se desencadenan las reacciones de oxidación de fenoles en los tejidos dañados por la manipulación, este proceso se hace irreversible, lo que conlleva a una pérdida significativa de la calidad de los explantes. En nuestro caso, utilizamos explantes de tallo de diferentes edades fisiológicas de acuerdo a la

125

QUIÑONES, M.; ALLCCACO, J.; CÁCERES, M.

orientación de la planta, siendo los apicales los mas jóvenes, mientras que los basales los de mayor edad. Los explantes basales se fenolizaron en menor tiempo, causando el cambio de color del callo de blanco amarillento a pardo claro, sin embargo esta no afectó la proliferación celular ni la viabilidad del callo.

En las investigaciones realizadas en la regeneración de plantas de Coffea arabica “café” por Gatica, A. 2002, se utilizó distintos métodos de esterilización en los explantes de hojas. La esterilización con hipoclorito de sodio (NaOCl) al 1% por 30 minutos no fue el adecuado para desinfectar los explantes. Sin embargo, al aumentar la concentración de NaOCl a 5.25% por 30 minutos y utilizando Agrimycin (bactericida) y Benlate (fungicida) por 5 minutos logró reducir considerablemente la contaminación. En nuestra investigación los explantes de tallo de Nicotiana paniculata fueron esterilizados con hipoclorito de sodio (NaOCl) al 2.5% por 15 minutos, lo que permitió la esterilizacion de los explantes y por consiguiente la desdiferenciación celular.

Pedroza, J. et al. (2007) afirma que a medida que se incrementan las concentraciones de hipoclorito de sodio (NaOCl) y el tiempo de esterilización de los explantes, el estado fisiológico de estos es fuertemente alterado, generando la necrosis y la muerte de los tejidos cultivados. En nuestra investigacion, los explantes de peciolo de Nicotiana paniculata fueron expuestos por 30 minutos al hipoclorito de sodio (NaOCl) 2.5%, lo que ocasionó la perdida de pigmentación y muerte del explante.

En los cultivos in vitro el tipo de regulador de crecimiento y su concentración en el medio de cultivo juegan un papel fundamental en la formación del callo y su continua proliferación. De acuerdo a la literatura revisada, uno de los reguladores de crecimiento más utilizados es la auxina 2,4-D, ya que produce elongación celular, expansión de los tejidos y formación del callo en altos porcentajes. Reportes realizados indican que en ausencia de esta fitohormona, muy pocos explantes forman callo, por lo que se recomienda añadirla. Esta premisa fue corroborada por Matos, A. (2007) quien cultivó explantes de hojas de Aloe vera sin hormonas de crecimiento y obtuvo un 3% de formación de callo y estos eran pequeños y de textura no friable.

La concentración de las hormonas y la combinación de estas determinan el porcentaje de callos que se pueden obtener. Ruiz, B. (2000) indujo a la formación del callo en

-1Anthurium andraeanum utilizando una concentración de 0.2 mg.L de 2,4-D, bajo la -1cual obtuvo un buen resultado, pero al utlizar 0.05 mg.L de 2,4-D combinada con 0.5

-1mg.L de BAP obtuvo un mayor porcentaje de formación. Por otra parte, Matos. A (2007) obtuvo un 95% de explantes que formaron callo a los 30 dias de cultivo

-1 -1utilizando 1 mg.L de 2,4-D junto con 2 mg.L de BA y obtuvo 68% de formación de -1 -1 callo al combinar 2 mg.L de 2,4-D y 1 mg.L de Kinetina.

En nuestra investigación se utilizó 1mg/L de 2,4-D y 100mL/L de agua de coco como suplemento del medio M-S, esta combinación nos ha permitido obtener callo en todos los ensayos realizados en los explantes de tallo de Nicotiana paniculata. Analizando nuestros resultados y comparando con los estudios citados, se comprueba que la combinación de auxinas y citoquininas no es un factor determinante para la formación del callo.

En las investigaciones realizadas por Gonzales, M. (2005) la contaminación fúngica en el material vegetal se debe a la influencia de las condiciones ambientales, asociada a

126

SCIENTIA VOL XII, N° 12

incrementos de la humedad relativa y la temperatura. La presencia de agentes contaminantes en el cultivo interfieren en la formación del callo al competir por los nutrientes del medio de cultivo, liberar sustancias tóxicas y en consecuencia variar el pH (Gatica, A. 2002). En nuestros ensayos los explantes de peciolo se contaminaron con Cladosporium spp. y Bacillus sp., microorganismos que comúnmente se encuentran en el medio ambiente, corroborando lo mencionado por Gatica, A.

Conclusiones

! Se logró la formación de callos viables a partir de explantes de tallo a los 6, 13 y 20 días de la introducción.

! El medio de cultivo Murashige y Skoog suplementado con 1mg/L de ácido 2,4-D, 30g/L de sacarosa y 100 mL/L de agua de coco, permite la obtención de callos viables.

! El proceso de fenolización como producto de la reacción de oxidación en los explantes, induce el cambio de color en los callos.

! La exposición en hipoclorito de sodio (NaOCl) al 2.5% por 15 minutos permiten lograr la esterilización de los explantes.

Recomendaciones

! Realizar más ensayos utilizando explantes de otras partes de la planta para determinar cuál de estos permiten obtener un mejor resultado.

! Realizar ensayos de desdiferenciación celular con medio MS suplementado solo con 2,4D para determinar la influencia del agua de coco en la formación de callos viables.

! Realizar ensayos incorporando antioxidantes al medio de cultivo para evitar la fenolización.

! Se recomienda utilizar otras sustancias esterilizantes para determinar con cual se obtiene un mejor resultado.

Referencias bibliográficas

CALVA, G. y PEREZ, J. 2005. Cultivo de células y tejidos vegetales: Fuente de alimentos para el futuro. Revista Digital Universitaria. Vol.6 N° 11

GATICA, A. 2002. Regeneración de plantas de café (Coffea arabica cv. Caturra y Catuaí) por embriogénesis somática directa a partir de segmentos de hoja. Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular, Universidad de Costa Rica. pp. 70.

GEIER, T. 1990. Anthurium. In Handbook of plant cell culture. McGraw-Hill Publishing Company, New York. P. 228-251.

GONZÁLEZ, M. et al. 2005. Influencia de la época del año en la respuesta in vitro del Cafeto Coffea canephora P. Var. Robusta. Revista Colombiana de Biotecnología Vol. VII No. 1 pp. 5-14.

127

QUIÑONES, M.; ALLCCACO, J.; CÁCERES, M.

orientación de la planta, siendo los apicales los mas jóvenes, mientras que los basales los de mayor edad. Los explantes basales se fenolizaron en menor tiempo, causando el cambio de color del callo de blanco amarillento a pardo claro, sin embargo esta no afectó la proliferación celular ni la viabilidad del callo.

En las investigaciones realizadas en la regeneración de plantas de Coffea arabica “café” por Gatica, A. 2002, se utilizó distintos métodos de esterilización en los explantes de hojas. La esterilización con hipoclorito de sodio (NaOCl) al 1% por 30 minutos no fue el adecuado para desinfectar los explantes. Sin embargo, al aumentar la concentración de NaOCl a 5.25% por 30 minutos y utilizando Agrimycin (bactericida) y Benlate (fungicida) por 5 minutos logró reducir considerablemente la contaminación. En nuestra investigación los explantes de tallo de Nicotiana paniculata fueron esterilizados con hipoclorito de sodio (NaOCl) al 2.5% por 15 minutos, lo que permitió la esterilizacion de los explantes y por consiguiente la desdiferenciación celular.

Pedroza, J. et al. (2007) afirma que a medida que se incrementan las concentraciones de hipoclorito de sodio (NaOCl) y el tiempo de esterilización de los explantes, el estado fisiológico de estos es fuertemente alterado, generando la necrosis y la muerte de los tejidos cultivados. En nuestra investigacion, los explantes de peciolo de Nicotiana paniculata fueron expuestos por 30 minutos al hipoclorito de sodio (NaOCl) 2.5%, lo que ocasionó la perdida de pigmentación y muerte del explante.

En los cultivos in vitro el tipo de regulador de crecimiento y su concentración en el medio de cultivo juegan un papel fundamental en la formación del callo y su continua proliferación. De acuerdo a la literatura revisada, uno de los reguladores de crecimiento más utilizados es la auxina 2,4-D, ya que produce elongación celular, expansión de los tejidos y formación del callo en altos porcentajes. Reportes realizados indican que en ausencia de esta fitohormona, muy pocos explantes forman callo, por lo que se recomienda añadirla. Esta premisa fue corroborada por Matos, A. (2007) quien cultivó explantes de hojas de Aloe vera sin hormonas de crecimiento y obtuvo un 3% de formación de callo y estos eran pequeños y de textura no friable.

La concentración de las hormonas y la combinación de estas determinan el porcentaje de callos que se pueden obtener. Ruiz, B. (2000) indujo a la formación del callo en

-1Anthurium andraeanum utilizando una concentración de 0.2 mg.L de 2,4-D, bajo la -1cual obtuvo un buen resultado, pero al utlizar 0.05 mg.L de 2,4-D combinada con 0.5

-1mg.L de BAP obtuvo un mayor porcentaje de formación. Por otra parte, Matos. A (2007) obtuvo un 95% de explantes que formaron callo a los 30 dias de cultivo

-1 -1utilizando 1 mg.L de 2,4-D junto con 2 mg.L de BA y obtuvo 68% de formación de -1 -1 callo al combinar 2 mg.L de 2,4-D y 1 mg.L de Kinetina.

En nuestra investigación se utilizó 1mg/L de 2,4-D y 100mL/L de agua de coco como suplemento del medio M-S, esta combinación nos ha permitido obtener callo en todos los ensayos realizados en los explantes de tallo de Nicotiana paniculata. Analizando nuestros resultados y comparando con los estudios citados, se comprueba que la combinación de auxinas y citoquininas no es un factor determinante para la formación del callo.

En las investigaciones realizadas por Gonzales, M. (2005) la contaminación fúngica en el material vegetal se debe a la influencia de las condiciones ambientales, asociada a

126

SCIENTIA VOL XII, N° 12

incrementos de la humedad relativa y la temperatura. La presencia de agentes contaminantes en el cultivo interfieren en la formación del callo al competir por los nutrientes del medio de cultivo, liberar sustancias tóxicas y en consecuencia variar el pH (Gatica, A. 2002). En nuestros ensayos los explantes de peciolo se contaminaron con Cladosporium spp. y Bacillus sp., microorganismos que comúnmente se encuentran en el medio ambiente, corroborando lo mencionado por Gatica, A.

Conclusiones

! Se logró la formación de callos viables a partir de explantes de tallo a los 6, 13 y 20 días de la introducción.

! El medio de cultivo Murashige y Skoog suplementado con 1mg/L de ácido 2,4-D, 30g/L de sacarosa y 100 mL/L de agua de coco, permite la obtención de callos viables.

! El proceso de fenolización como producto de la reacción de oxidación en los explantes, induce el cambio de color en los callos.

! La exposición en hipoclorito de sodio (NaOCl) al 2.5% por 15 minutos permiten lograr la esterilización de los explantes.

Recomendaciones

! Realizar más ensayos utilizando explantes de otras partes de la planta para determinar cuál de estos permiten obtener un mejor resultado.

! Realizar ensayos de desdiferenciación celular con medio MS suplementado solo con 2,4D para determinar la influencia del agua de coco en la formación de callos viables.

! Realizar ensayos incorporando antioxidantes al medio de cultivo para evitar la fenolización.

! Se recomienda utilizar otras sustancias esterilizantes para determinar con cual se obtiene un mejor resultado.

Referencias bibliográficas

CALVA, G. y PEREZ, J. 2005. Cultivo de células y tejidos vegetales: Fuente de alimentos para el futuro. Revista Digital Universitaria. Vol.6 N° 11

GATICA, A. 2002. Regeneración de plantas de café (Coffea arabica cv. Caturra y Catuaí) por embriogénesis somática directa a partir de segmentos de hoja. Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular, Universidad de Costa Rica. pp. 70.

GEIER, T. 1990. Anthurium. In Handbook of plant cell culture. McGraw-Hill Publishing Company, New York. P. 228-251.

GONZÁLEZ, M. et al. 2005. Influencia de la época del año en la respuesta in vitro del Cafeto Coffea canephora P. Var. Robusta. Revista Colombiana de Biotecnología Vol. VII No. 1 pp. 5-14.

127

QUIÑONES, M.; ALLCCACO, J.; CÁCERES, M.

LITZ, R.E. Y R.L. JARRET. 1993. Regeneración de plantas en el cultivo de tejidos: Embriogénesis Somática y Organogénesis. En: W. Roca y L.A. Mroginski (Eds). Cultivo de Tejidos en la Agricultura. Fundamentos y Aplicaciones. Cap. 7. CIAT. Colombia: 143-172.

MATOS, A. 2007. Inducción de callo en plantas silvestres de Aloe vera “zábila” con diferentes combinaciones de 2,4-D, BA y Kinetina. Boletín del Centro de Investigaciones Biológicas Volumen 41, Nº. 4, 2007, PP. 503–516 Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela.

MURASHIGE, T. Y F. SKOOG. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473–497.

OCHOA, A. 1990. Establecimiento de cultivos in vitro. En fundamentos teórico-prácticos de cultivo de tejidos vegetales. Editor Codmo H. Rossell y Víctor M. Villalobos. 23-27. Roma: FAO.

PEDROZA, J. et al. 2007. Micro propagación de Dodonea viscosa L. Jacq: Una especie en vías de extinción. Revista Colombiana de Biotecnología, Vol. IX Nº002. Pp. 33-44.

PERL A, LOTAN O, ABU-ABIED M (1996) Holland D. Establishment of an Agrobacterium-mediated transformation system for Grape (Vitis vinifera L.): The role of antioxidants during the grape-agrobacterium interaction. Nature Biotechnology 8: 535-542.

REINERT Y STEWARD, F. et al 1958. Growth and organized development and cultured cells. II. Interpretation of the growth form free cells to carrot plant. American Journal of botany 45, 709-713.

RUIZ, B. 2000. Efecto de BAP y 2,4-D en la inducción de organogénesis indirecta in vitro de Anthurium andraeanum L. Proyecto especial del programa Ingeniero Agronomo, Zamorano, Honduras. 36p.

VALDEZ, A. et al 2004. Formación de callos de caña de azúcar var. 'SP 70-1284' en medio de cultivo líquido a partir de explantes de campo. Biotecnología Vegetal Vol. 4, No. 1: 9 - 13,

128

SCIENTIA VOL XII, N° 12