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Implementación en el Banco Nacional de...
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Implementación en el Banco Nacional de
Germoplasma del INIAP de una Unidad de
Crioconservación de Germoplasma Vegetal.
Documentación escrita de los protocolos básicos a aplicar.
Informes técnicos del proyecto.
Prof. Dr. César F. Pérez Ruiz
Investigador Prometeo INIAP
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INDICE
CONTEXTO…………………………………………………………………. Página 3
APARATOS Y EQUIPOS
NECESARIOS……………………………………………………………… Página 7
LISTADO DE PRODUCTOS Y MATERIAL FUNGIBLE DE LABORATORIO NECESARIO….……………………………………..… Página 10
PROTOCOLOS DE
CRIOCONSERVACIÓN………………………………………………….. Página 15
SECUENCIA LÓGICA DE LOS PROCESOS E INDICADORES
DE ÉXITO………………………………………………………….………. Página 27
CONTROL DE SEGURIDAD Y CALIDAD………….………………….. Página 33
BIBLOGRAFÍA RECOMENDADA………………………………………. Página 36
DISTRIBUCIÓN DE LOS EQUIPOS DE CRIOCONSERVACIÓN
Y CONSERVACIÓN IN VITRO…….………………………………….... Página 42
DISTRIBUCIÓN DEL MATERIAL FUNGIBLE
PARA CRIOCONSERVACIÓN Y CONSERVACIÓN IN VITRO…….. Página 46
PLANO DE DISTRIBUCIÓN……………..……………………………… Página 52
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CONTEXTO
Ecuador es uno de los países más ricos en biodiversidad en todo el mundo. Su
ubicación geográfica, sus orígenes geológicos, la presencia de la cordillera de
los Andes, la influencia de corrientes marinas, los vientos amazónicos y la
existencia de innumerables hábitats húmedos determinan que sea un país
megadiverso con una gran cantidad de bosques y microclimas (Tapia et al.
2008).
En el país existe un elevado número de especies de plantas por unidad de área.
La flora comprende de 22 000 a 25 000 especies de plantas vasculares, con un
endemismo estimado de 32.25 %. Las diversas regiones geográficas del país
son muy ricas en parientes silvestres de las especies cultivadas. Por ejemplo,
los materiales silvestres de papa, frijol, tomate y frutales tropicales y
subtropicales, así como los parientes silvestres de especies como el aguacate
(Persea spp.) y la papaya (Carica spp.), reflejan el gran potencial de la
agrobiodiversidad ecuatoriana (Tapia et al. 2008).
Frente a la riqueza botánica que presenta el Ecuador, es de vital importancia su
conservación in situ y ex situ. El Sistema Nacional de Áreas Protegidas cuenta
con 40 reservas que abarcan aproximadamente 96 000 km2, en las cuales se
realizan grandes esfuerzos para manejar adecuadamente ecosistemas que
albergan gran parte de nuestra biodiversidad. En cuanto a las estrategias de
conservación ex situ, es importante resaltar que con el apoyo de organismos
nacionales e internacionales en el país se han realizado actividades de
recolección y conservación de material vegetal. El banco de germoplasma en
que se conserva el mayor número de especies es el del Instituto Nacional
Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP).
El Departamento Nacional de Recursos Fitogenéticos (DENAREF) del INIAP
conserva alrededor de 13 711 muestras de semillas pertenecientes a 170
géneros de cultivos y 4209 muestras en campo o duplicadas en colecciones in
vitro pertenecientes a 399 especies forestales, alimenticias, medicinales y
forrajeras, lo que suma un total de 17 920 accesiones de especies de plantas
que se conservan en varias estaciones experimentales (Tapia et al. 2008).
Dentro de las accesiones conservadas caben destacar las siguientes especies:
papa (Solanum tuberosum), ajíes y pimientos (Capsicum annuum), quinua
(Chenopodium quinoa), oca (Oxalis tuberosa), melloco (Ullucus tuberosus), fréjol
(Phaseolus vulgaris), amaranto (Amaranthus spp.), granadilla silvestre
(Passiflora spp.), uvilla (Physalis peruviana), maní (Arachis hypogaea), arroz
(Oryza sativa), sorgo (Sorghum bicolor), chocho (Lupinus sp.), cucurbita
(Cucurbita ficifolia), tortas (Phaseolus lunatus), haba (Vicia faba), arveja (Pisum
sativum), maíz (Zea mays), mashua (Tropaeolum tuberosum), zanahoria blanca
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(Arracacia xanthorrhiza), jícama (Smallanthus sonchifolius) y cacao (Theobroma
cacao). Además de conservar ese material vegetal, se han realizado estudios de
diversidad genética y de los patógenos que afectan esas especies, así como
actividades de regeneración del 40 % de las accesiones mantenidas (Tapia et
al. 2008).
El germoplasma vegetal es el material genético del que se pueden regenerar
nuevas plantas. Se puede entender como un "recurso genético vivo" conservado
para el mejoramiento, conservación e investigación de plantas. El germoplasma
es el componente fundamental en todos los programas de fitomejoramiento. La
conservación del germoplasma es, por lo tanto, imprescindible para la obtención
de futuras plantas cultivables capaces de crecer bajo condiciones ambientales
cambiantes, utilizar recursos, como el agua, de manera más eficaz, y producir
más alimentos para una población mundial creciente. La conservación del
germoplasma vegetal preserva la diversidad genética, que es el mayor número
posible de genes presentes en un cultivo en particular, y en cualquier especie
relacionada, de modo que puedan utilizarse en el futuro, en cualquier momento
y lugar.
El germoplasma se conserva "convencionalmente" en forma de semillas, que
pueden almacenarse en seco, a temperatura ambiente. Sin embargo, el
almacenamiento convencional tiene muchas limitaciones, por ejemplo, la
existencia de semillas de corta vida, la presencia de enfermedades en las
semillas y los altos costos asociados con el espacio de almacenamiento y
mantenimiento. Mientras que las semillas almacenadas a temperatura ambiente
tienen a menudo una vida de almacenamiento limitada, niveles bajos de
humedad de las semillas combinados con almacenamiento a temperaturas bajas
(-18 ° C a -20 ° C) o ultrabajas (-135 ° C a -196 ° C), reducen la actividad
metabólica de las semillas para que puedan permanecer viables por mucho más
tiempo.
Si bien el almacenamiento a baja temperatura puede ser un medio eficaz para
almacenar germoplasma, el método definitivo para el almacenamiento a largo
plazo y el único eficaz y económico para algunas plantas, como las plantas con
semillas recalcitrantes, las propagadas clonalmente o las plantas que no
producen semillas viables es la crioconservación. La crioconservación es un
conjunto de técnicas versátiles que implican el almacenamiento de
germoplasma, en forma de semillas, polen, brotes latentes, ápices, embriones,
células o tejidos vegetales aislados, en nitrógeno líquido (LN) a -196 ° C, o en la
fase de vapor de LN a -140° C.
La crioconservación tiene aplicaciones relevantes no sólo para el
almacenamiento a largo plazo de especies de semillas no ortodoxas, sino
también para las semillas ortodoxas, como lo demuestran varios resultados de
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investigación (Engelmann & Rao, 2012; Harding, 2004). Pritchard (1995) sugirió
que la longevidad de la semilla a -196 ºC podría ser aproximadamente 175 veces
mayor que la obtenida a -18ºC, es decir, la temperatura utilizada para el
almacenamiento de semillas en las colecciones de base.
El material vegetal es pre-acondicionado, utilizando tratamientos químicos y
físicos, de manera que se mantiene viable cuando se congela y durante el
almacenamiento a temperaturas ultrabajas. Una ventaja importante de la
crioconservación sobre el almacenamiento ambiental o a bajas temperaturas, es
que, una vez enfriadas a temperaturas del LN, las muestras viables pueden, en
teoría, conservarse indefinidamente, ya que no hay actividad metabólica a dichas
temperaturas.
Después de la descongelación, las semillas y los embriones pueden germinar,
los brotes o brotes pueden ser inducidos a crecer, y pueden regenerarse las
plantas completas a partir de células o tejidos crioconservados, utilizando
técnicas de cultivo in vitro. Estas técnicas de cultivo in vitro de plantas también
permiten producir un gran número de plantas clonales a partir de muestras de
tejido muy pequeñas.
Las técnicas de la crioconservación de plantas comenzaron con la congelación
de brotes de mora en LN en 1965 (Sakai, 1965). Desde entonces, se han
desarrollado, y se desarrollan actualmente, métodos para la crioconservación de
una amplia gama de especies vegetales. Hoy en día cultivos importantes, como
el trigo, la papa y varios árboles frutales y forestales, pueden ser
crioconservados, descongelados y luego crecer hasta convertirse en plantas
completas (Williams, 1991; Day et al., 2008).
A diferencia de las colecciones de semillas convencionales o de las colecciones
de plantas en campo, que requieren mantenimiento, el único costo asociado con
el crio-almacenamiento de los materiales vegetales, a menudo llamado
"cryobanking", es la adición a los recipientes de almacenamiento de una
pequeña cantidad de LN cada semana. El cryobanking se está convirtiendo
actualmente en un método muy rentable para la conservación a largo plazo de
los recursos fitogenéticos, permitiendo el almacenamiento prolongado de
grandes cantidades de material vegetal genéticamente diverso, en un espacio
relativamente pequeño, durante largos períodos de tiempo (Kaczmarczyk et al.,
2011; Pritchard, et al 2013). Por ejemplo, un recipiente de almacenamiento de
tamaño mediano puede almacenar de 5.000 a 10.000 muestras de plantas
individuales en LN.
Otra ventaja de la crioconservación sobre las técnicas convencionales de
almacenamiento es que, durante el almacenamiento criogénico, prácticamente
no hay riesgo de contaminación microbiana nueva y el desarrollo enfermedades.
De hecho, se ha demostrado que la "crioterapia" es una herramienta eficaz para
producir plantas libres de virus, fitoplasma y bacterias (Wang et al., 2009). La
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crioterapia se puede utilizar para producir plantas libres de enfermedades y
puede eliminar el riesgo de enfermedades transmitidas por semillas, y, por lo
tanto, reducir los obstáculos asociados con el transporte de germoplasma de
plantas a través de fronteras nacionales e internacionales.
La Dirección del DENAREF considera que la crioconservación es un medio muy
eficiente para almacenar el germoplasma vegetal en poco espacio y durante
tiempo indefinido. Que para utilizar adecuadamente y conservar la rica
biodiversidad que existe en el Ecuador es de suma importancia impulsar el
desarrollo de proyectos de investigación en el campo de la crioconservación de
especies vegetales, e implementar en el Banco Nacional de Germoplasma del
Ecuador un criobanco dotado de unas instalaciones y métodos eficientes. Esto,
sin duda, contribuirá a reforzar las estrategias nacionales de desarrollo agrícola,
forestal, florícola y económico.
La crioconservación aún constituye un campo poco explorado en el Ecuador por
lo que se solicitó, a través del Programa Prometeo, la colaboración del Dr. César
Pérez, Catedrático de la Universidad Politécnica de Madrid y Director del Banco
de Germoplasma de esta Institución, especialista en estas técnicas, para la
implementación del mencionado criobanco.
Referencias:
Day, J. G.; Harding, K. C.; Nadarajan, J. and Benson, E. E. (2008).
“Cryopreservation, Conservation of Bioresources at Ultra Low Temperatures,” in
J. M. Walker and R. Rapley (eds), Molecular Biomethods Handbook (Totowa,
NJ.: Humana Press), 917-47.
Engelmann, F. and Rao, V. R. (2012) “Major Research Challenges and
Directions for Future Research,” In: M. N. Normah, H. F. Chin and B. M. Reed,
Eds., Conservation of Tropical Plant Species, Springer Verlag, Berlin.
Harding, K. (2004) Genetic Integrity of Cryopreserved Plant Cells: A Review.
Cryoletters, Vol. 25, No. 1, pp. 3-22.
Kaczmarczyk, A.; Turner, S.R.; Bunn, E.; Mancera, R.L. and Dixon, K.W. (2011)
“Cryopreservation of threatened native Australian species—what have we
learned and where to from here?” In Vitro Cellular and Developmental Biology-
Plant. 47:17-25.
Pritchard HW (1995) Cryopreservation of seeds. In: Day JG, McLellan MR (eds)
Cryopreservation and freeze-drying protocols, vol 38. Humana Press Inc.,
Totowa, pp 133–144.
Pritchard, H.W.; Stuppy, W. and Nadarajan, J. (2013) “How many species of
higher plants need conserving by cryopreservation?” Abstract of the 2nd
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International Symposium on Plant Cryopreservation (Fort Collins,Colorado, USA)
15.
Sakai, A. (1965) “Survival of plant tissue at super-low temperatures III. Relation
between effective prefreezing temperatures and the degree of frost hardiness,”
Plant Physiology, 40:882-7.
Tapia, C; Zambrano, E; Monteros, Á. (2008). Estado de los recursos fitogenéticos
para la agricultura y la alimentación en Ecuador. Quito, EC, INIAP.
Wang, Q.C.; Panis, B.; Engelmann, F.; Lambardi, M. and Valkonen, J.P.T. (2009)
“Cryotherapy of shoot tips: a technique for pathogen eradication to produce
healthy planting materials and prepare healthy plant genetic resources for
cryopreservation,” Annals of Applied Biology, 154:35-63.
Williams, J.T. (1991) “Plant Genetic Resources: Some New Directions,”
Advances in Agronomy, 45:61-91.
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APARATOS Y EQUIPOS NECESARIOS
• Sistema de purificación de agua. Resistividad de, al menos, 200,000 ohms/cm y conductividad de 5.0 micromhos/cm.
• Balanza analítica (0.01 g de resolución; 200 g capacidad mínima).
• Balanza de precisión desde 5 Kg/0,001 g.
• pH metro (rango 0-14 +/- 0.01; compensación automática de temperatura 0-60º C; dos puntos de calibración).
• Agitador magnético con placa calefactada. Temperatura regulable hasta 350ºC. (velocidad variable 50-150 rpm; resistente a reactivos).
• Refrigerador capaz de mantener una temperatura de 2-6º C y con una temperatura en el congelador de –20º C.
• Cabina de flujo laminar horizontal con filtro HEPA que retenga partículas mayores de 0.3μm; zona de trabajo Clase 10 definida según las normas U.S. Fed Std 209 y B.S. 5295.; que mantenga un flujo de 90 fpm +/- 20% a una presión estática de 0.6-1.2.
• Autoclave; control de procesos por microprocesador. Sistema de secado y purgado. Para temperaturas regulables desde 105 °C hasta 134 °C (0,21 a 2 bar). Modelo vertical de, al menos, 80 litros.
• Lavavajillas industrial. Capacidad de carga: 120 frascos de laboratorio. Acero inoxidable (AE). Panel de control táctil en acero inoxidable con display incorporado. Programas. Trazabilidad de procesos. Sistema de filtrado de 4 niveles. AutoClose- cierre automático de la puerta.Indicación óptica y acústica de fin de programa. Bomba propulsora de alto rendimiento. Descalcificador de agua. Condensador de vapor. Sistema antifugas.
• Esterilizador para instrumental en cabina de flujo laminar, por calor seco con bolas de cristal o cerámica.
• Una fuente de luz fría regulable sin etapas, que no modifique los colores
y que disponga de una lámpara reflectora halógena de larga duración.
Potencia de la lámpara reflectora halógena: 150W (15V). Flujo de Luz:
600 lm. Intensidad regulable por ajuste eléctrico estabilizado (continuo 0-
100%) y mecánico, Diámetro guía de luz: Máximo Ø9mm. Alimentación:
220-240V aprox.50/60Hz.
• Lupa Binocular (Estereomicroscopio) 20/40x. Cabeza binocular inclinado
45º. Con distancia interpupilar variable de 55 - 75 mm. Portaocular con
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ajuste de dioptrías ± 5 D. Par oculares gWF10x20 mm. Objetivos de 2x y
4x en torreta giratoria. Distancia de trabajo de 80 mm. Aumentos totales
40x. Iluminación incidente y transmitida 12v/10w.
• Baño termostatizado. Medidas internas útiles: 300 x 170 x 120 mm de prof. o
300 x 170 x 170 mm de profundidad. Termostato: Hidráulico. Precisión:
Más/menos 0.5ºC. Rango de temperatura: ambiente + 5ºC hasta 100º C.
Uniformidad de la temperatura: Más/menos 0,25ºC. Resistencia Blindada de
inmersión: 1000 W. Aislación de lana de vidrio: 25 mm de espesor. Gradillas
para: 39 tubos de 12 mm de diámetro. 33 tubos de 16 mm de diámetro. 24 tubos
de 18 / 20 mm de diám. 16 tubos de 25 mm de diámetro. Presentación: Dos, tres,
cuatro, cinco y seis, ocho, diez y doce gradillas. Interruptor principal y luz piloto.
• Horno Microondas Industrial con 2 magnetrones de alta calidad que cumple
normas sanitarias. Bandeja intermedia de cerámica extraíble. Programable.
Interior y exterior en acero inoxidable. Temporizador: 99 min. Volumen interior:
30 l.
• Cámara de crecimiento: Rango de temperatura de 7º a 35ºC. Estabilidad
±1.0°C. Uniformidad ±1.0°C. Lectura digital resolución 0.1ºC. Regulación
electrónica de temperatura. Flujo de aire: del techo a las paredes y retorno
al pasillo central a través de las estanterías. Max. velocidad entre
estanterías 0.5 m s-1. Intercambio de aire fresco por hora: 4 volúmenes.
Iluminación con fluorescentes o leds hasta un mínimo de 12000 lux;
Máxima radiación fotosintética activa (500 mol m-2 s-1). Distancia a las
lámparas: Min 30 cm. Tipo de lámparas fluorescentes T8/HF/58W/840
Potencia 58W. Suplementarias dos lámparas de 60W tungsteno.
Programador horario de fotoperiodo y termoperiodo. Termostato de
seguridad contra fallos de temperatura. Alarma óptica y acústica.
• Cámaras frías. Se cuenta con las instalaciones del Banco para semillas
ortodoxas (-18ºC) y la cámara para conservación in vitro (desde 5ºC).
• Congelador –40ºC. Temperatura de trabajo de -40 °C a -20°C.
Controlador de temperatura con pantalla digital. Controlador protegido por
llave. Sonda de temperatura, resolución 0,1 °C. Alarmas: acústica y visual
para temperatura máxima y mínima, así como fallo de tensión;
alimentadas por batería.Indicador para puerta abierta, con alarma. Puerta
con dispositivo de cierre de fácil apertura, incorpora cerradura con llave.
Control digital de la temperatura con panel táctil integrado. Interruptor
principal protegido por llave. Aislamiento de 110 mm, fabricado en
poliuretano inyectado de alta densidad. Gas refrigerante, libre de CFC y
HCFC, biodegradables. Sistema de evaporador envolvente. Compresor
hermético muy silencioso montado sobre amortiguadores para disminuir
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el ruido <48 dB. Sello magnético perimetral doble, marco de la puerta
calefactado, evita la formación de hielo en las juntas; asegurando la
estanqueidad. Cámara interior construida en acero inoxidable. Estantes
en varilla de acero plastificado. Estructura exterior en acero con
recubrimiento epoxi. Sistema soporte con 4 ruedas, facilita el movimiento.
Tratamiento tropicalizado que permite trabajar con temperatura ambiente
hasta 32 °C y un 85-90% de H.R.
• Tanques de NL de 120 l con capacidad para 4000 crioviales de 2 ml.
Base con ruedas para el tanque. Sistema de almacenamiento de cajas
criogénicas de fácil recuperación. Métodos manuales de manejo de
registro de inventarios. Aislamiento de vacío avanzado que minimice las
pérdidas de nitrógeno por evaporación que asegure una temperatura de
–190°C, aun cuando solo quede unos 5 cm de nitrógeno líquido
remanente en el tanque. Sistema de bloqueo para prevenir manipulación
no autorizada de muestras.
• Tanque de reserva de nitrógeno líquido de 35 litros.
• Crioconservador Crioplus. Capacidad para 22.100 a 24.000 viales.
Cierre bajo llave y ruedecillas en estándar. Impresora térmica en opción
sobre Crioplus. Presión de llegada máxima de nitrógeno: 1,5 bar. Relleno
automático. Testigos de relleno. Control automático de las funciones.
Control de nivel por termistancias. Indicación del nivel de nitrógeno líquido
o vapor. Indicación de la temperatura sobre pantalla. Salvaguarda de los
programas. Llave de acceso al programa. Puerto RS 232. Alarma visual
y sonora.
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LISTADO DE PRODUCTOS Y MATERIAL FUNGIBLE DE
LABORATORIO NECESARIO
• Pinzas 23 cm para cultivo in vitro (4 unidades en stock)
• Soporte acero inoxidable (2 unidades en stock)
• Mango bisturí 12,5 cm nº3 (4 unidades en stock)
• Mango bisturí 14cm nº3 (4 unidades en stock)
• Hojas de bisturí nº 11 no estériles 100 u (2 unidades en stock)
• Hojas de bisturí nº 22 100 u (2 unidades en stock)
• Agujas enmangadas para disección (2 unidades en stock)
• Espátulas para pesado (2 unidades en stock)
• Cinta indicadora de esterilización en autoclave (2 unidades en stock)
• Varilla magnética 6x10mm (2 unidades en stock)
• Varilla magnética 6x20mm (2 unidades en stock)
• Varilla magnética 6x30mm (2 unidades en stock)
• Papel Parafilm 10cmx75m (2 unidades en stock)
• Resma papel filtro 42x52cm (5 unidades en stock)
• Guantes látex t/mediana 100u (2 unidades en stock)
• Frascos lavadores de 500 ml (2 unidades en stock)
• Bidón de plástico con grifo de 10 l (1 unidad en stock)
• Guantes protectores de quemado (2 pares en stock)
• Micropipetas graduables 100- 1000 l (mínimo 4 en stock)
• Puntas de pipeta bolsa de 500 puntas (2 unidades en stock)
• Pesa substancias (4 unidades en stock)
• Frascos lavadores (4 unidades en stock)
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• Tarro de vidrio de 38 cl para cultivo in vitro (al menos 400 unidades en
stock)
• Tapa de polipropileno 82mm p/tarros (al menos 400 unidades en stock)
• Placas Petri de 90 mm (al menos 400 unidades en stock)
• Matraces Erlenmeyer:
o 100 ml (4 unidades en stock)
o 250 ml (4 unidades en stock)
o 500 ml (4 unidades en stock)
o 1000 ml (4 unidades en stock)
• Pipetas pasteur 50 mm con chupete (20 unidades en stock)
• Pipetas graduadas:
o 0,1 ml (2 unidades en stock)
o 0,2 ml (2 unidades en stock)
o 0,5 ml (2 unidades en stock)
o 1,0 ml (2 unidades en stock)
o 2,0 ml (2 unidades en stock)
o 5,0 ml (2 unidades en stock)
o 10,0 ml (2 unidades en stock)
o 20,0 ml (2 unidades en stock)
• Probetas graduadas (pueden ser de plástico)
o 5 ml (2 unidades en stock)
o 10 ml (2 unidades en stock)
o 25 ml (2 unidades en stock)
o 50 ml (2 unidades en stock)
o 100 ml (2 unidades en stock)
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o 250 ml (2 unidades en stock)
o 500 ml (2 unidades en stock)
o 1000 ml (2 unidades en stock)
o 2000 ml (2 unidades en stock)
• Vasos de precipitados forma baja (pueden ser de plástico)
o 25 ml (2 unidades en stock)
o 50 ml (2 unidades en stock)
o 100 ml (2 unidades en stock)
o 250 ml (2 unidades en stock)
o 500 ml (2 unidades en stock)
o 1000 ml (2 unidades en stock)
o 2000 ml (2 unidades en stock)
• Murashige & Skoog Medium Macro, Micro y Vitaminas (5 unidades en
stock)
• Sucrose double-crystallized (Sacarosa) 5Kg (2 unidades en stock)
• Phyto Agar 1Kg (4 unidades en stock)
• Sodio hipoclorito sol 10% P/V 1000ml (2 unidades en stock)
• Ácido alfa-naftalenacético ANA 25g (1 unidad en stock)
• indole-3-butyric acid IBA 25 g (1 unidad en stock)
• 6-benzilaminopurina BAP 5g (1 unidad en stock)
• Thidiazuron 250 mg (1 unidad en stock)
• Alcohol etílico 96 10 l (1 unidad en stock)
• Ácido clorhídrico 1N 1000 ml (1 unidad en stock)
• Hidróxido sódico 1N 1000 ml (1 unidad en stock)
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• Solución antibiótica-antimicótica estabilizada para PTC (mínimo 100 ml
en stock)
• Ácido Ascórbico (500 g en stock)
• Prolina (100g en stock)
• Melatonina (2 g en stock)
• Desferroxiamina (5 ml en stock)
• Tampones de calibración de pHmetro
• Glicerol (mínimo 2Kg en stock)
• Etilenglicol (mínimo 1 Kg en stock)
• Dimetilulfóxido (mínimo 1l en stock)
• Sacarosa (mínimo 1 Kg en stock)
• Alginato de sodio (400g en stock)
• Cloruro de calcio (500 g en stock)
• Papel de aluminio 50m (2 unidades en stock)
• Gel de sílice naranja (2,5 Kg en stock)
• Crioviales 2 ml (500 unidades en stock)
• Termo para nitrógeno líquido 500 ml
• Cuatro bastidores para 10 cajas de 100 crioviales de 2 ml
• Cajas para 100 crioviales de 2 ml (10 unidades en stock)
• Guantes crioprotectores (2 pares en stock)
• Gafas crioprotectoras (2 unidades en stock)
• Sustrato
• Macetas
• Fertilizante
• Plaguicidas
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• Lejía
• Detergente
• Suministro permanente de NL. Calcular para una tasa de evaporación de
0,6 l/día
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PROTOCOLOS DE CRIOCONSERVACIÓN
Recomendaciones para seleccionar un método adecuado (+) para la
crioconservación de diferentes formas de cultivo in vitro de plantas (Según
González-Arnao y Engelmann, 2013, modificado).
Método Suspensiones celulares y
callos
Ápices y meristemos
Embriones cigóticos y somáticos
Semillas
Congelación gradual programada
+++ + - -
Encapsulación-deshidratación
- +++ ++ -
Vitrificación y derivados: gota-vitrificación,
encapsulación/vitrificación y crio-placa
- +++ ++ -
Precultivo-Desecación - - ++ -
Desecación - - - ++
PROTOCOLOS (Según González-Arnao y Engelmann, 2013, modificado):
Congelación gradual programada:
Procedimiento
1. Colocar el material vegetal (células y/o callos) en crioviales de 2 ml, en baño
con hielo aproximadamente a 0oC.
2. Adicionar la solución crioprotectora fría a los crioviales con las muestras y
mantenerlos durante una hora a 0oC.
3. Colocar los crioviales con las muestras en el congelador programable
(temperatura inicial de 0oC).
4. Disminuir la temperatura para inducir la nucleación heterogénea (2oC-3oC
inferiores al “punto de congelación” de la solución crioprotectora).
5. Mantener a la temperatura de inducción de la nucleación (ejemplo: a -10oC,
10 minutos) y continuar con el programa de enfriamiento de disminución gradual
de la temperatura hasta la precongelación a -40oC.
6. Realizar una inmersión rápida de las muestras en NL.
7. Mantener las muestras almacenadas a -196 oC.
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8. Llevar a cabo una descongelación rápida (40oC).
9. Eliminar los crioprotectores colocando las muestras sobre papel filtro en placas
de Petri.
10. Cultivo de recuperación en oscuridad, si son células y callos. Cultivo al menos
la primera semana en la oscuridad, si son estructuras organizadas.
ESQUEMA DE PROTOCOLO CON CONGELADOR PROGRAMABLE SEGÚN
KAMI (2012).
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ESQUEMA DE PROTOCOLO CON CONGELACIÓN ESCALONADA SEGÚN
KAMI (2012).
Encapsulación-deshidratación
1. Disección del tejido (meristemos, ápices o embriones) en condiciones
asépticas: Utilizar un estereomicroscopio (40X) en campana de flujo laminar.
2. Recuperación del tejido: Colocar el material extraído 24 horas sobre el medio
de cultivo sólido estándar o medio suplementado con sacarosa (por ejemplo, con
0.3 M de sacarosa).
1. Preparación para la encapsulación:
a) Preparar la solución de alginato de sodio al 3 %, en medio de cultivo que
contiene los macros y micronutrientes, pero desprovisto de calcio; luego ajustar
el pH de la solución a 5,7 y esterilizarla bajo las mismas condiciones del medio
de cultivo.
b) Preparar una solución de cloruro de calcio a 0.1 M, ajustar el pH (a 5,7) de la
solución y esterilizarla bajo las mismas condiciones del medio de cultivo.
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c) Preparar puntas de micropipetas estériles con el extremo inferior cortado a un
diámetro aproximado de 4-5 mm.
2. Encapsulación:
a) Colocar los tejidos en la solución de alginato de sodio.
b) Succionar los tejidos embebidos en el alginato y gotearlos progresivamente
sobre abundante solución de cloruro de calcio. Preferiblemente, sobre agitador
orbital.
c) Mantener las gotas en la solución de calcio por 20 minutos después de la
última gota, para lograr un buen grado de gelificación durante la formación de las
cápsulas de alginato de calcio.
d) Decantar la solución de calcio y transferir las cápsulas a una caja de Petri
sobre papel filtro para la siguiente manipulación.
3. Precultivo: Transferir el tejido encapsulado a un erlenmeyer que contiene
medio de cultivo líquido suplementado con sacarosa (por ejemplo, 0.5, 0.75 o 1
M de concentración de sacarosa por 24 h).
4. Desecación: Decantar el medio líquido de precultivo y secar superficialmente
las cápsulas colocándolas en cajas de Petri sobre papel filtro. Seguidamente
exponerlas en cajas destapadas a la corriente de aire de la campana del flujo
laminar o en desecadores que contienen gel de sílice. Determinar con antelación
el tiempo de desecación requerido, para garantizar la reducción del contenido de
humedad en las cápsulas hasta alrededor de 20-25 %.
5. Congelación: Transferir las muestras encapsuladas a crioviales (hasta 10
cápsulas por criovial), y realizar la inmersión directa en nitrógeno líquido.
6. Descongelación: La descongelación puede ser rápida, para lo cual se
sumergen los crioviales, cerrados, con las muestras en agua a +40ºC, o lento
(más usual), para lo cual se extraen las muestras del criovial y se exponen a la
corriente de aire del flujo laminar de dos a tres minutos.
7. Cultivo de recuperación: Transferir el material encapsulado a los recipientes de cultivo, colocando las cápsulas sobre el medio sólido y manteniendo las muestras la primera semana en oscuridad con el posterior pase a las condiciones de fotoperiodo establecidas para cada caso.
20
ESQUEMA DE PROTOCOLO DE ENCAPSULOCIÓN-DESHIDRATACIÓN
SEGÚN KAMI (2012).
Método de vitrificación
1. Disección del tejido (ápices o embriones) en condiciones asépticas: Utilizar un estereomicroscopio dentro de una campana de flujo laminar.
2. Recuperación del tejido: Colocar el material extraído 24 horas sobre medio de cultivo solido estándar o medio suplementado con sacarosa (por ejemplo, con 0.3 M de sacarosa). 3. Tratamiento de carga: Colocar los tejidos sobre papel filtro en una caja de Petri que contiene la solución de carga a temperatura ambiente y durante 20-30 minutos (Solución de carga: 0.4 M de sacarosa + 2 M de glicerol).
21
4. Exposición a la solución vitrificadora (PVS) después del tratamiento de carga: Transferir los tejidos a una caja de Petri que contiene la solución vitrificadora para establecer diferentes tiempos de exposición o colocar los tejidos directamente en crioviales que contienen 1 o 2 ml de la PVS (por ejemplo, PVS3: 50 % de glicerol + 50 % de sacarosa; PVS2: 30 % de glicerol + 15 % de etilenglicol + 15 % DMSO en medio de cultivo con 0.4 M de sacarosa). Los tratamientos se realizarán a 0 °C por periodos a establecer en cada caso, pero nunca superiores a una hora. 5. Congelación: Realizar la inmersión rápida de los crioviales con las muestras al nitrógeno líquido. 6. Descongelación: Extraer los crioviales del nitrógeno líquido y sumergirlos en agua a +40 °C de dos a tres minutos. 7. Lavado de crioprotectores: Extraer la solución vitrificadora y adicionar la solución de lavado durante 20 minutos (Solución de lavado: medio de cultivo liquido suplementado con 1.2 M de sacarosa). 8. Cultivo de recuperación: Secar superficialmente los tejidos lavados sobre papel filtro en una caja de Petri y luego transferirlos al medio de cultivo sólido. Mantener las muestras durante la primera semana a la oscuridad y transferirlas posteriormente a las condiciones de fotoperiodo establecidas para cada caso.
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ESQUEMA DE PROTOCOLO DE VITRIFICACIÓN SEGÚN KAMI (2012).
Gota-vitrificación
1. Disección del tejido (ápices o embriones) en condiciones asépticas: Utilizar un estereomicroscopio dentro de una campana de flujo laminar. 2. Recuperación del tejido: Colocar el material extraído 24 horas sobre el medio de cultivo solido estándar o el medio suplementado con 0.3 M sacarosa. 3. Tratamiento de carga: Colocar los tejidos durante 20-30 minutos sobre papel filtro en una caja de Petri que contiene la solución de carga (Solución de carga: 0.4 M de sacarosa + 2 M de glicerol). 4. Exposición a la solución vitrificadora (PVS) después del tratamiento de carga: Transferir los tejidos a una caja de Petri que contiene la solución vitrificadora para estudiar diferentes tiempos de exposición o colocar los tejidos directamente sobre gotas de PVS (por ejemplo, PVS3: 50 % de glicerol + 50 % de sacarosa; PVS2: 30 % de glicerol + 15 % de etilenglicol + 15 % DMSO en medio de cultivo
23
con 0.4 M sacarosa). Los tratamientos se realizan generalmente a temperatura ambiente. 5. Preparación de las láminas con las gotas: a) Recortar láminas de papel de aluminio de aproximadamente 20 x 7 mm. b) Colocar gotas de la PVS de aproximadamente 15 μl por cada lamina. c) Colocar los tejidos en las gotas. 6. Congelación: Realizar la inmersión rápida de las láminas de papel de aluminio con las muestras directamente al nitrógeno líquido. 7. Descongelación: Extraer las láminas del nitrógeno líquido y sumergirlas directamente en abundante medio de cultivo liquido suplementado con 1.2 M de sacarosa a temperatura ambiente durante 15-30 minutos. 8. Cultivo de recuperación: Secar superficialmente los tejidos lavados sobre papel filtro en una caja de Petri y luego transferirlos al medio de cultivo sólido. Mantener las muestras durante la primera semana a la oscuridad y transferirlas posteriormente a las condiciones de fotoperiodo establecidas.
25
ESQUEMA DE PROTOCOLO DE ENCAPSULACIÓN VITRIFICACIÓN SEGÚN
KAMI (2012).
Precultivo-desecación 1. Realizar el precultivo de los embriones en medio sólido suplementado con azúcares como agente crioprotector. 2. Efectuar la desecación mediante la exposición de los embriones a corriente de aire en una campana de flujo laminar o a cantidades definidas de gel de sílice en contenedores herméticamente cerrados. 3. Realizar el enfriamiento rápido de las muestras, previamente introducidas en crioviales, mediante inmersión directa en nitrógeno líquido. 4. Llevar a cabo la descongelación rápida, para lo cual los crioviales cerrados se sumergen en agua a 40oC.
26
5. Realizar la recuperación en el medio de cultivo normal, la primera semana a la oscuridad, y luego en las condiciones de fotoperiodo establecidas. ESQUEMA DE PROTOCOLO DE DESECACIÓN SEGÚN KAMI (2012).
ESQUEMA DE PROTOCOLO DE DESECACIÓN SEGÚN KAMI (2012). Algunas recomendaciones adicionales para la crioconservación de germoplasma vegetal Selección del material • Para la congelación de suspensiones celulares, las células deben tomarse cuando se encuentran en la fase exponencial de crecimiento. • Para la congelación de callos y estructuras organizadas, el material generalmente se toma después de 15 días del último subcultivo en medio fresco. En el caso de las especies de crecimiento lento (por ejemplo, algunas especies de orquídeas), lo importante es que el material de partida refleje un estado vigoroso.
27
• Los embriones cigóticos inmaduros y los somáticos (globular-torpedo-corazón) son más tolerantes a la congelación que otras fases más tardías de desarrollo. • El material proveniente de cultivos in vitro (por ejemplo, ápices aislados de vitroplántulas) es más homogéneo y permite estandarizar mejor las condiciones de crioconservación que el material obtenido de plantas in vivo. Protección y crioconservación de germoplasma • Los tratamientos con soluciones crioprotectoras muy concentradas son menos tóxicos si se realizan a 0ºC. • En la utilización de protocolos de congelación gradual, es muy importante inducir la nucleación heterogénea en una etapa temprana del enfriamiento dependiendo del punto de congelación de la solución crioprotectora. • La descongelación rápida es la más apropiada, sobre todo si el material no está suficientemente deshidratado. • La crioconservación de ápices de especies de propagación vegetativa asegura el mantenimiento de la estabilidad genética y la manipulación del material libre de virus; además, puede ser una estrategia apropiada para el saneamiento por crioterapia. • Para la crioconservacion de ápices, después de la disección los tejidos deben recuperarse en un medio de cultivo al menos de un día para otro, a fin de que superen el estrés del corte. • Temperaturas muy superiores (por ejemplo, de entre -20 oC y -70 oC) a la temperatura del nitrógeno líquido (-196 oC) con el transcurso del tiempo provocan el deterioro del material biológico almacenado. • Después de la crioconservacion, el material debe recuperarse en la oscuridad durante, al menos, una semana, con el fin de evitar la fotoxidación. • Las pruebas colorimétricas de supervivencia pueden falsear los resultados. La verdadera forma de medir la supervivencia y recuperación del material crioconservado es mediante la regeneración de nuevos brotes y/o de plantas. REFERENCIAS: González, M., & Engelmann, F. (2013). Crioconservación de plantas en América Latina y el Caribe (No. IICA F30 52). IICA, San José (Costa Rica). Kami, D. (2012). Cryopreservation of plant genetic resources. INTECH Open Access Publisher.
28
SECUENCIA LÓGICA DE LOS PROCESOS E INDICADORES DE
ÉXITO
Etapa 1.- Material de partida (Material vegetativo)
Selección de los genotipos a crioconservar
Por sus características agronómicas
Por su riesgo de desaparición
Selección de plantas vigorosas
Plantas en crecimiento activo
Buenas condiciones sanitarias
Toma de estaquillas, esquejes, plantones o planta entera
Selección de material vegetal con yemas en buen estado
Preparación de los materiales para el traslado al DENAREF
Adaptación al invernadero del DENAREF
Selección de sustrato
Selección de riego
Tratamientos fitosanitarios
Fertilización
Indicador de éxito: Al menos 10 plantas y/o estaquillas de cada genotipo se
adaptan a las condiciones del invernadero del DENAREF y presentan un
aspecto saludable y un crecimiento vigoroso de las yemas
Etapa 2.- Material de partida (Material in vitro)
Selección de los cultivos in vitro previamente cultivados o almacenados
Por sus características agronómicas
Por su adaptación al cultivo in vitro
Por su capacidad embriogénica
Mantenimiento in vitro de las líneas en los laboratorios
29
Subcultivo en medios definidos para cada especie o variedad
Mantenimiento en las condiciones de temperatura e iluminación
definidos para cada especie o cultivar
Repicado periódico de los cultivos
Indicador de éxito: Se mantienen con crecimiento vigoroso y libres de
contaminación los cultivos in vitro. Si se trata de embrioides, se detectan
las distintas etapas de desarrollo: globular, corazón, torpedo y cotiledonar.
Si son callos o suspensiones celulares, proliferan y aumenta su biomasa.
Si son meristemos, ápices o yemas, se desarrollan.
Etapa 3.- Introducción in vitro (ápices caulinares)
Método de asepsia.
Tratamiento previo de los explantos
Fungicidas
Antioxidantes
Desinfección de los explantos
Tamaño de las yemas
Concentración de Hipoclorito de sodio y detergente
Tiempo de contacto con la solución desinfectante
Tratamiento posterior con alcohol
Establecimiento del medio de cultivo
Medio Base
Se ensayarán diluciones del medio MS u otro específico
caso de ser necesario.
Se ensayará el agente gelificante: agar y fitagel
Reguladores de crecimiento
Se probarán combinaciones de auxinas y citoquininas
Antioxidantes
Se probará el efecto del ácido ascórbico, prolina y
melatonina en el medio de cultivo
30
Establecimiento de las condiciones de cultivo
Temperatura
Se ensayarán dos temperaturas de cultivo
Fotoperiodo
Se ensayarán dos fotoperíodos
Indicador de éxito: Se establecen las condiciones de cultivo in vitro
adecuadas para que los ápices caulinares de todos los genotipos broten in
vitro, libres de contaminación, y continúen su desarrollo. Se cuantificará,
para cada ensayo, el % de contaminación, el % de supervivencia, % de
brotación, longitud media de los brotes, nº medio de entrenudos por brote
y nº medio de hojas por tallo.
Etapa 4.- Selección de los explantos a crioconservar.
Obtención de ápices culinares con crecimiento vigoroso in vitro.
Determinación del tamaño adecuado de los ápices
Se establecerán tres rangos o categorías de tamaños
Se correlacionarán los tamaños con el número de hojas y
primordios foliares recubriendo el meristemo
Determinación del explanto embriogénico adecuado
Se seleccionarán células en distinta fase de crecimiento y/o callos
de diferentes tamaños
Se seleccionarán embrioides en diferentes estados de desarrollo
Indicador de éxito: Se dispone de un número adecuado de explantos de
cada tipo (al menos 20), con crecimiento adecuado, para la realización de
los ensayos posteriores. Esto será un proceso secuencial que se realizará,
a partir del material mantenido in vitro tras la etapa 3, tantas veces como
sea necesario para la realización de los ensayos.
Etapa 5.- Tratamientos crioprotectores y congelación
Se aplicarán los métodos descritos en el capítulo anterior. Para la
selección del protocolo se seguirá, en principio lo indicado en la tabla.
31
Indicador de éxito: en esta etapa no se pueden establecerse los indicadores
de éxito (supervivencia y desarrollo de los explantos crioconservados)
hasta que no se complete la etapa 6)
Etapa 6.- Descongelación y recuperación de los explantos
Descongelación
Descongelación rápida en agua a 40ºC
Descongelación lenta en CFL a 25 ºC
Descarga
Lavado con medio de cultivo
Lavado con solución de sacarosa
Cultivo in vitro en medio de recuperación
Período de oscuridad (días)
Paso a condiciones de fotoperíodo 12-12
Composición del medio
MS distintas diluciones
Reguladores de crecimiento BAP, NAA Distintas
combinaciones)
Evaluación cada dos días de parámetros de supervivencia y desarrollo
de los explantos.
Indicador de éxito: Al menos con uno de los tratamientos secuenciales de
las etapas 5 y 6 se consigue la supervivencia de más de un 30% de los
explantos de todos los genotipos ensayados. Si esto no se consigue, habrá
que pasar a la etapa 7
Etapa 7.- Mejora de los protocolos establecidos.
Ensayo del tratamiento con agentes reductores del estrés oxidativo
32
En la fase de precultivo
Prolina
Melatonina
Triptófano
Ácido ascórbico
Desferroxiamina
En la fase de recuperación post descongelación
Prolina
Melatonina
Triptófano
Ácido ascórbico
Desferroxiamina
Indicador de éxito: Se consiguen mejorar (al menos en un 10%) con alguno
de estos tratamientos los resultados del mejor de los protocolos
establecidos en las etapas anteriores.
Etapa 8.- Estudio de la estabilidad genética de las plantas procedentes de
crioconservación.
Estudio con marcadores de ADN en los explantos previa
crioconservación
SSR
ISSR
Genes funcionales
Estudio con marcadores de ADN en las plántulas obtenidas a partir de
los explantos crioconservados
SSR
ISSR
33
Genes funcionales
Indicador de éxito: No se detectan diferencias entre los patrones de los
marcadores del material vegetal antes y después de la crioconservación
Etapa 9.- Establecimiento de un banco permanente crioconservado para una
especie concreta
Se ensayará con, al menos 10 genotipos distintos, el protocolo que dio
mejores resultados en las etapas anteriores.
Se evaluarán los % de supervivencia y recuperación delos
explantos crioconservados de todos los genotipos.
Se evaluará, como en la etapa 8, la estabilidad genética de todos
los genotipos tras la crioconservación-descongelación.
Indicador de éxito: El método establecido, permite la supervivencia y
desarrollo de, al menos, un 30 % de los explantos de todos los genotipos.
No se detecta variación somaclonal, en ninguno de los genotipos, como
consecuencia de la crioconservación.
INDICADOR DE ÉXITO GENERAL: Se consigue aplicar una metodología
que permite establecer un banco de material crioconservado de las
especies seleccionadas, lo que simplifica y abarata sensiblemente el
proceso de conservación del germoplasma.
34
CONTROL DE SEGURIDAD Y CALIDAD
Este apartado describe las directrices de seguridad a seguir cuando se utiliza
nitrógeno líquido, así como información sobre la instalación y las operaciones
que ayudan a asegurar un equipo adecuado, su instalación y pruebas.
SEGURIDAD DEL NITRÓGENO LÍQUIDO
El almacenamiento a baja temperatura de materiales biológicos presenta
peligros de seguridad significativos. Es necesario un poco de sentido común para
manejar nitrógeno líquido, que desplaza al oxígeno durante la evaporación. El
gas nitrógeno es incoloro, inodoro e insípido, por lo que no puede ser detectado
por los sentidos humanos y es respirado como si fuera aire. Respirar una
atmósfera que contenga menos del 18% de oxígeno puede causar mareos y
conducir rápidamente a la inconsciencia y la muerte.
EXPLOSIÓN
El nitrógeno líquido es un criógeno con un punto de ebullición de -196ºC. Cuando
se extraen de una atmósfera de nitrógeno líquido, los recipientes
incorrectamente sellados pueden explotar. La colocación de los recipientes en
fase de vapor de nitrógeno durante varias horas antes de sumergirlos en
nitrógeno líquido minimiza el riesgo de explosión.
CONTAMINACIÓN
Si el recipiente que está sumergido en nitrógeno líquido contiene materiales
biológicos peligrosos, el recipiente debe descongelarse y abrirse en una cabina
de seguridad biológica. Los contenedores rotos dentro de los congeladores de
almacenamiento pueden ser un riesgo debido a la supervivencia de los
contaminantes. Los protocolos para la descontaminación deben ser aplicados
para una acción correctiva inmediata si se produce contaminación.
ROPA PROTECTORA
Una máscara protectora de la cara, guantes aislados y ropa de manga larga
ayudan a prevenir la exposición innecesaria al nitrógeno líquido.
RECOMENDACIONES DE SEGURIDAD
Siempre considerar lo siguiente cuando se trabaje con nitrógeno líquido:
• Utilizar sólo recipientes diseñados para líquidos a baja temperatura.
• No sellar ni evitar que el nitrógeno líquido salga.
• Utilizar barras sólidas (nunca huecas) como barras de medición.
• Usar solamente nitrógeno líquido en áreas bien ventiladas.
• No llenar demasiado los envases.
35
CALIFICACIÓN DE LA INSTALACIÓN
Se trata de cerciorarse que el equipo está instalado correctamente.
Consideraciones importantes para determinar esta calificación son las
siguientes:
• Características de diseño del equipo (construcción, limpieza, etc.)
• Condiciones de instalación (cableado, utilidades, funcionalidad, etc.)
• Calibración, mantenimiento preventivo y limpiezas
• Características de seguridad
• Documentación del proveedor, impresiones, dibujos y manuales
• Documentación de software
• Lista de piezas de repuesto
• Condiciones ambientales (temperatura ambiente, requisitos de
escape/suministro de oxígeno)
A veces las actividades de control de calidad se llevan a cabo en las
instalaciones del fabricante antes de que el equipo sea enviado. Por ejemplo, los
fabricantes de equipos pueden realizar ensayos en sus instalaciones y analizar
los resultados para determinar si el equipo está listo para ser entregado. Estos
estudios pueden utilizarse como guías para obtener datos básicos y
complementar la calificación de la instalación.
CALIFICACION OPERATIVA
Los parámetros del proceso se ponen a prueba para asegurar un resultado
correcto.
Deben considerarse:
• Límites de control del proceso (tiempo, temperatura, presión, velocidad de
línea, condiciones de configuración, etc.)
• Software
• Especificaciones de las materias primas
• Procedimientos de operación
• Procedimientos de control
• Mantenimiento preventivo
• Entrenamiento
• Limpieza
• Calibración
• Evaluaciones para los modos de falla potencial y las condiciones del peor caso
posible.
36
Una calificación de la instalación ayuda a asegurar que el equipo se instala de
manera segura y apropiada.
Una calificación operativa garantiza el correcto uso y mantenimiento del equipo.
37
BIBLOGRAFÍA RECOMENDADA
• Ashmore SE (1997) Status report on the development and application of
in vitro techniques for the conservation and use of plant genetic resources.
IPGRI, Rome
• Bajaj YPS (1987) Cryopreservation of pollen and pollen embryos, and the
establishment of pollen banks. Int Rev Cytol 107:397–420
• Bajaj YPS (1995) Cryopreservation of germplasm of medicinal and
aromatic plants. In: Bajaj YPS (ed) Biotechnology in agriculture and
forestry, vol 32, Cryopreservation of plant germplasm I. Springer, Berlin,
pp 419–434
• Benson EE (1990) Free radical damage in stored plant germplasm. Int Board Plant Genet Res, Rome
• Benson EE (2004) Cryoconserving algal and plant diversity: historical perspectives and future challenges. In: Fuller BJ, Lane N, Benson E (eds) Life in the frozen state. CRC Press, Boca Raton, pp 299–328
• Benson EE (2008) Cryopreservation of phytodiversity: a critical appraisal of theory & practice. Crit Rev Plant Sci 27:141–219
• Benson EE, Bremner D (2004) Oxidative stress in the frozen plant: a free radical point of view. In: Fuller BJ, Lane N, Benson EE (eds) Life in the frozen state. CRC Press, Boca Raton, pp 205–241
• Benson EE, Johnston J, Muthusamy J, Harding K (2006) Physical and engineering perspectives of in vitro plant cryopreservation. In: Gupta S, Ibaraki Y (eds) Plant tissue culture engineering, vol 6. Springer, Berlin, pp 441–476
• Berjak P, Walker M, Mycock DJ, Wesley-Smith J, Watt P, Pammenter NW (2000) Cryopreservation of recalcitrant zygotic embryos. In: Engelmann F, Takagi H (eds) Cryopreservation of tropical plant germplasm: current research progress and application. Proceedings of an international workshop, Tsukuba, Japan, October 1998, International Plant Genetic Resources Institute, Rome, pp 140–155
• Chaudhury R (2000) Cryopreservation of seeds, embryos, embryonic axes and pollen at National Cryobank of NBPGR. In: Engelmann F, Takagi H (eds) Cryopreservation of tropical plant germplasm: current research progress and application. Proceedings of an international workshop,
38
Tsukuba, Japan, October 1998, International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI), Rome, pp 457–459
• Cruz-Cruz CA, González-Arnao MT, Engelmann F (2013) Biotechnology and conservation of plant biodiversity. Resources 2:73–95
• Dixit S, Ahuja S, Narula A, Srivastava PS (2004) Cryopreservation: a potential tool for long-term conservation of medicinal plants. In: Srivastava PS, Narula A, Srivastava S (eds) Plant biotechnology and molecular markers. Anamaya Publ, New Delhi, pp 278–288
• Engelmann F (1991) In vitro conservation of tropical plant germplasm-a review. Euphytica 57:227–243
• Engelmann F (1992) Cryopreservation of embryos. In: Dattée Y, Dumas C, Gallais A (eds) Reproductive biology and plant breeding. Springer, Berlin, pp 281–290
• Engelmann F (1997) In vitro conservation methods. In: Callow JA, Ford-Lloyd BV, Newbury HJ (eds) Biotechnology and Plant Genetic Resources, CAB International, Oxford, UK, p 119–161
• Engelmann F (2000) Importance of cryopreservation for the conservation of plant genetic resources. In: Engelmann F, Takagi H (eds) Cryopreservation of tropical plant germplasm—current research progress and applications. JIRCAS, Tsukuba, pp 8–20
• Engelmann F (2004) Plant cryopreservation: progress and prospects. In Vitro Cell Dev Biol Plant 40:427–433.
• Engelmann, F.,2009. Encapsulation-dehydration: past, present and future. Acta Hortic.908,165–171.
• Engelmann F (2011) Use of biotechnologies for the conservation of plant Biodiversity. In Vitro Cell Dev Biol Plant 47:5–16
• Engelmann F (2014) Cryopreservation of clonal crops: a review of key parameters. Acta Hort 1039:31–39
• Engelmann F, Dussert S (2013) Cryopreservation. In: Normah MN, Chin HF, Reed BM (eds) Conservation of tropical plant species. Springer, New York, pp 107–119
• Engelmann F, Engels JMM (2002) Technologies and strategies for ex situ conservation. In: Engels JMM, Rao VR, Brown AHD, Jackson MT (eds) Managing plant genetic diversity. CAB International, Wallingford, pp 89–104
39
• Engelmann F, Gonzalez-Arnao MT, Wu Y, Escobar R (2008) Development of encapsulation dehydration. In: Reed BM (ed) Plant cryopreservation: a practical guide. Springer, New York, pp 59–75
• Engelmann F, Takagi H (eds) (2000) Cryopreservation of tropical plant germplasm: current research progress and applications. JIRCAS/IPGRI, Rome
• FAO (2014) Genebank standards for plant genetic resources for food
and agriculture. Rev. ed. Rome.
http://www.fao.org/docrep/019/i3704e/i3704e.pdf
• Gonzalez-Arnao MT, Engelmann F (2006) Cryopreservation of plant
germplasm using the encapsulation- dehydration technique: review and
case study on sugarcane. Cryo Letters 27:155–168
• González-Arnao MT, & Engelmann, F. (2013). Crioconservación de
plantas en América Latina y el Caribe (No. IICA F30 52). IICA, San José
(Costa Rica).
• Gonzalez-Arnao MT, Panta A, Roca WM, Escobar RH, Engelmann F
(2008) Development and large scale application of cryopreservation
techniques for shoot and somatic embryo cultures of tropical crops. Plant
Cell Tissue Organ Cult 92:1–13
• Gonzalez-Arnao, M. T., Martinez-Montero, M. E., Cruz-Cruz, C. A., &
Engelmann, F. (2014). Advances in cryogenic techniques for the long-term
preservation of plant biodiversity. In Biotechnology and biodiversity (pp.
129-170). Springer International Publishing.
• Gupta S (2014) Cryopreservation of germplasm through encapsulation-
dehydration technique. Acta Hort 1039:147–153
• Harding K (2004) Genetic integrity of cryopreserved plant cells: a review.
Cryo Lett 25:3–22.
• Kaczmarczyk, A., Menon, A., Al-Hanbali, A., Funnekotter, B., Bunn, E.,
Phang, P. Y., & Mancera, R. L. (2012). Current issues in plant
cryopreservation. INTECH Open Access Publisher.
40
• Kami, D. (2012). Cryopreservation of plant genetic resources. INTECH
Open Access Publisher.
• Kim HH, Lee YG, Ko HC, Park SU, Gwag JG, Cho EG, Engelmann F
(2009a) Development of alternative loading solutions in droplet-vitrification
procedures. Cryo Letters 30:291–299
• Kim HH, Lee YG, Shin DJ, Kim T, Cho EG, Engelmann F (2009b)
Development of alternative plant vitrification solutions in droplet-
vitrification procedures. Cryo Letters 30:320–334
• Matsumoto T, Niino T (2014) The development of plant vitrifi cation
solution 2 and recent PVS2- based vitrifi cation protocols. Acta Hort
1039:21–28
• Matsumoto T, Sakai A (1995) An approach to enhance dehydration
tolerance of alginate-coated dried meristems cooled to −196°C. Cryo Lett
16:299–306
• Matsumoto T, Sakai A, Yamada K (1995) Cryopreservation of in vitro -
grown apical meristems of lily by vitrifi cation. Plant Cell Tiss Org Cult
41:237–241
• Mazur P (2004) Principles of cryobiology. In: Fuller B, Lane N, Benson EE
(eds) Life in the frozen state. CRC Press, London, pp 4–65
• Panis B, Lambardi M (2006) Status of cryopreservation technologies in
plants (crops and forest trees). In: Ruane J, Sonnino A (eds) The role of
biotechnology in exploring and protecting agricultural genetic resources.
Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, pp 61–78
• Pammenter, N. W., & Berjak, P. (2013). Physiology of desiccation-
sensitive (recalcitrant) seeds and the implications for cryopreservation.
International Journal of Plant Sciences, 175(1), 21-28.
• Pence VC (1995) Cryopreservation of recalcitrant seeds. In: Bajaj YPS
(ed) Biotechnology in agriculture and forestry, vol 32, Cryopreservation of
plant germplasm I. Springer Verlag, Berlin, pp 29–52
• Pence VC (2011) Evaluating costs for the in vitro propagation and
preservation of endangered plants. In Vitro Cell Dev Biol Plant 47:176–
187
41
• Popova, E., Shukla, M., Kim, H. H., & Saxena, P. K. (2015). Plant
Cryopreservation for Biotechnology and Breeding. In Advances in Plant
Breeding Strategies: Breeding, Biotechnology and Molecular Tools (pp.
63-93). Springer International Publishing.
• Pritchard HW (1995) Cryopreservation of seeds. In: Day JG, McLellan MR
(eds) Methods in molecular biology, vol 38, Cryopreservation and freeze-
drying protocols. Humana, Totowa, pp 133–144
• Pritchard HW (2007) Cryopreservation of desiccation-tolerant seeds. In:
Day JG, Stacey GN (eds) Methods in molecular biology, vol 368, 2nd edn,
Cryopreservation and freeze-drying protocols. Humana Press Inc, Totowa,
pp 185–201
• Pritchard HW, Nadarajan J (2008) Cryopreservation of orthodox
(desiccation tolerant) seeds. In:Reed BM (ed) Plant cryopreservation: a
practical guide. Springer, Berlin, pp 485–501
• Reed BM (2001) Implementing cryogenic storage of clonally propagated
plants. Cryo Lett 22:97–104
• Reed BM (ed) (2008) Plant cryopreservation: a practical guide. Springer,
New York.
• Sakai A, Engelmann F (2007) Vitrification, encapsulation-vitrification and
droplet-vitrification: a review. Cryo Lett 28:151–172
• Sakai A, Matsumoto T, Hirai D, Niino T (2000) Newly developed
encapsulation-dehydration protocol for plant cryopreservation. Cryo Lett
21:53–62
• Sakai A, Hirai D, Niino T (2008) Development of PVS-based vitrification
and encapsulation vitrification protocols. In: Reed BM (ed) Plant
cryopreservation: a practical guide. Springer,Berlin, pp 33–58
• Towill LE, Bajaj YPS (2002) Cryopreservation of plant germplasm II.
Biotechnology in agriculture and forestry, vol 50. Springer, Berlin
• Towill LE, Bonnart R (2003) Cracking in a vitrifi cation solution during
cooling or warming does not affect growth of cryopreserved mint shoot
tips. Cryo Lett 24:341–346
42
• Volk GM, Walters C (2006) Plant vitrifi cation solution 2 lowers water
content and alters freezing behavior in shoot tips during cryoprotection.
Cryobiology 52:48–61
• Volk GM, Henk AD, Bonnart RM et al (2014a) Plant shoot tip response to
treatment with plant vitrification solution #2. Acta Hort 1039:81–84
• Volk GM, Shepherd A, Borrart RM (2014b) Strategies for improved effi
ciency when implementing plant vitrifi cation techniques. Acta Hort
1039:85–89
• Walters C, Wheeler L, Stanwood PC (2004) Longevity of cryogenically
stored seeds. Cryobiology 48:229–244
• Walters, C., Wheeler, L. M., & Grotenhuis, J. M. (2005). Longevity of seeds
stored in a genebank: species characteristics. Seed Science Research,
15(01), 1-20.
• Wang ZC, Deng XX (2004) Cryopreservation of shoot-tips of citrus using
vitrification: effect of reduced form of glutathione. Cryo Letters 25:43–50
• Wang QC, Valkonen JPT (2009) Cryotherapy of shoot tips: novel
pathogen eradication method. Trends Plant Sci 14:199–122
• Wang QC, Panis B, Engelmann F et al (2009) Cryotherapy of shoot tips:
a technique for pathogen eradication to produce healthy planting materials
and prepare healthy plant genetic resources for cryopreservation. Ann
Appl Biol 154:351–363
• Wang QC, Wang RR, Li BQ, Cui ZH (2012) Cryopreservation: a strategy
technique for safe preservation of genetically transformed plant materials.
Adv Genet Eng Biotechnol 1:1–2
• Wang B, Wang RR, Cui ZH et al (2014) Potential applications of cryogenic
technologies to plant genetic improvement and pathogen eradication.
Biotech Adv 32:583–595
43
DISTRIBUCIÓN DE LOS EQUIPOS DE CRIOCONSERVACIÓN Y
CONSERVACIÓN IN VITRO
1.- SALA PREPARACIÓN DE MEDIOS:
• Sistema de purificación de agua. Resistividad de, al menos, 200,000 ohms/cm y conductividad de 5.0 micromhos/cm.
• Balanza analítica (0.01 g de resolución; 200 g capacidad mínima).
• Balanza de precisión desde 5 Kg/0,001 g.
• pH metro (rango 0-14 +/- 0.01; compensación automática de temperatura 0-60º C; dos puntos de calibración).
• Agitador magnético con placa calefactada. Temperatura regulable hasta 350ºC. (velocidad variable 50-150 rpm; resistente a reactivos).
• Refrigerador capaz de mantener una temperatura de 2-6º C y con una temperatura en el congelador de –20º C.
• Autoclave; control de procesos por microprocesador. Sistema de secado y purgado. Para temperaturas regulables desde 105 °C hasta 134 °C (0,21 a 2 bar). Modelo vertical de, al menos, 80 litros
• Lavavajillas industrial. Capacidad de carga: 120 frascos de laboratorio. Acero inoxidable (AE). Panel de control táctil en acero inoxidable con
display incorporado. Programas. Trazabilidad de procesos. Sistema de
filtrado de 4 niveles. AutoClose- cierre automático de la puerta.Indicación
óptica y acústica de fin de programa. Bomba propulsora de alto
rendimiento. Descalcificador de agua. Condensador de vapor. Sistema
antifugas.
2. LABORATORIO POLIVALENTE
• Una fuente de luz fría regulable sin etapas, que no modifique los colores
y que disponga de una lámpara reflectora halógena de larga duración.
Potencia de la lámpara reflectora halógena: 150W (15V). Flujo de Luz:
600 lm. Intensidad regulable por ajuste eléctrico estabilizado (continuo 0-
100%) y mecánico, Diámetro guía de luz: Máximo Ø9mm. Alimentación:
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220-240V aprox.50/60Hz.
• Lupa Binocular (Estereomicroscopio) 20/40x. Cabeza binocular inclinado
45º. Con distancia interpupilar variable de 55 - 75 mm. Portaocular con
ajuste de dioptrías ± 5 D. Par oculares gWF10x20 mm. Objetivos de 2x y
4x en torreta giratoria. Distancia de trabajo de 80 mm. Aumentos totales
40x. Iluminación incidente y transmitida 12v/10w.
• Baño termostatizado. Medidas internas útiles: 300 x 170 x 120 mm de prof. o
300 x 170 x 170 mm de profundidad. Termostato: Hidráulico. Precisión:
Más/menos 0.5ºC. Rango de temperatura: ambiente + 5ºC hasta 100º C.
Uniformidad de la temperatura: Más/menos 0,25ºC. Resistencia Blindada de
inmersión: 1000 W. Aislación de lana de vidrio: 25 mm de espesor. Gradillas
para: 39 tubos de 12 mm de diámetro. 33 tubos de 16 mm de diámetro. 24 tubos
de 18 / 20 mm de diám. 16 tubos de 25 mm de diámetro. Presentación: Dos, tres,
cuatro, cinco y seis, ocho, diez y doce gradillas. Interruptor principal y luz piloto.
• Horno Microondas Industrial con 2 magnetrones de alta calidad que cumple
normas sanitarias. Bandeja intermedia de cerámica extraíble. Programable.
Interior y exterior en acero inoxidable. Temporizador: 99 min. Volumen interior:
30 l.
• Refrigerador capaz de mantener una temperatura de 2-6º C y con una temperatura en el congelador de –20º C.
3. SALA CÁMARA DE FLUJO LAMINAR
• Cabina de flujo laminar horizontal con filtro HEPA que retenga partículas mayores de 0.3μm; zona de trabajo Clase 10 definida según las normas U.S. Fed Std 209 y B.S. 5295.; que mantenga un flujo de 90 fpm +/- 20% a una presión estática de 0.6-1.2.
.
• Esterilizador para instrumental en cabina de flujo laminar, por calor seco con bolas de cristal o cerámica.
5. SALA CRIOCONSERVACIÓN
• Congelador –40ºC. Temperatura de trabajo de -40 °C a -20°C.
Controlador de temperatura con pantalla digital. Controlador protegido por
llave. Sonda de temperatura, resolución 0,1 °C. Alarmas: acústica y visual
45
para temperatura máxima y mínima, así como fallo de tensión;
alimentadas por batería.Indicador para puerta abierta, con alarma. Puerta
con dispositivo de cierre de fácil apertura, incorpora cerradura con llave.
Control digital de la temperatura con panel táctil integrado. Interruptor
principal protegido por llave. Aislamiento de 110 mm, fabricado en
poliuretano inyectado de alta densidad. Gas refrigerante, libre de CFC y
HCFC, biodegradables. Sistema de evaporador envolvente. Compresor
hermético muy silencioso montado sobre amortiguadores para disminuir
el ruido <48 dB. Sello magnético perimetral doble, marco de la puerta
calefactado, evita la formación de hielo en las juntas; asegurando la
estanqueidad. Cámara interior construida en acero inoxidable. Estantes
en varilla de acero plastificado. Estructura exterior en acero con
recubrimiento epoxi. Sistema soporte con 4 ruedas, facilita el movimiento.
Tratamiento tropicalizado que permite trabajar con temperatura ambiente
hasta 32 °C y un 85-90% de H.R.
• Crioconservador Crioplus. Capacidad para 22.100 a 24.000 viales.
Cierre bajo llave y ruedecillas en estándar. Impresora térmica en opción
sobre Crioplus. Presión de llegada máxima de nitrógeno: 1,5 bar. Relleno
automático. Testigos de relleno. Control automático de las funciones.
Control de nivel por termistancias. Indicación del nivel de nitrógeno líquido
o vapor. Indicación de la temperatura sobre pantalla. Salvaguarda de los
programas. Llave de acceso al programa. Puerto RS 232. Alarma visual
y sonora.
6. SALA BANCO BASE
• Tanques de NL de 120 l con capacidad para 4000 crioviales de 2 ml.
Base con ruedas para el tanque. Sistema de almacenamiento de cajas
criogénicas de fácil recuperación. Métodos manuales de manejo de
registro de inventarios. Aislamiento de vacío avanzado que minimice las
pérdidas de nitrógeno por evaporación que asegure una temperatura de
–190°C, aun cuando solo quede unos 5 cm de nitrógeno líquido
remanente en el tanque. Sistema de bloqueo para prevenir manipulación
no autorizada de muestras.
• Tanque de reserva de nitrógeno líquido de 35 litros. Aislamiento de vacío
avanzado que minimice las pérdidas de nitrógeno por evaporación que
asegure una temperatura de –190°C
• Estanterías y equipos del banco de base de semillas del DENAREF
46
7.- CÁMARA DE CONSERVACIÓN IN VITRO
• Cámara de crecimiento: Rango de temperatura de 7º a 35ºC. Estabilidad
±1.0°C. Uniformidad ±1.0°C. Lectura digital resolución 0.1ºC. Regulación
electrónica de temperatura. Flujo de aire: del techo a las paredes y retorno
al pasillo central a través de las estanterías. Max. velocidad entre
estanterías 0.5 m s-1. Intercambio de aire fresco por hora: 4 volúmenes.
Iluminación con fluorescentes o leds hasta un mínimo de 12000 lux;
Máxima radiación fotosintética activa (500 mol m-2 s-1). Distancia a las
lámparas: Min 30 cm. Tipo de lámparas fluorescentes T8/HF/58W/840
Potencia 58W. Suplementarias dos lámparas de 60W tungsteno.
Programador horario de fotoperiodo y termoperiodo. Termostato de
seguridad contra fallos de temperatura. Alarma óptica y acústica.
8.- LABORATORIO PARA ENSAYOS DE GERMINACIÓN
• Germinadores existentes en el DENAREF
9. SALA DE PROCESAMIENTO DE SEMILLAS
• Equipos existentes en el DENAREF
11. CUARTO DE SECADO
• Equipos existentes en el DENAREF
13.- BANCO ACTIVO
• Estanterías y equipos del banco activo de semillas del DENAREF
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DISTRIBUCIÓN DEL MATERIAL FUNGIBLE PARA
CRIOCONSERVACIÓN Y CONSERVACIÓN IN VITRO
1. SALA PREPARACIÓN DE MEDIOS
• Pinzas 23 cm para cultivo in vitro (4 unidades en stock)
• Soporte acero inoxidable (2 unidades en stock)
• Mango bisturí 12,5 cm nº3 (4 unidades en stock)
• Mango bisturí 14cm nº3 (4 unidades en stock)
• Hojas de bisturí nº 11 no estériles 100 u (2 unidades en stock)
• Hojas de bisturí nº 22 100 u (2 unidades en stock)
• Agujas enmangadas para disección (2 unidades en stock)
• Papel Parafilm 10cmx75m (2 unidades en stock)
• Resma papel filtro 42x52cm (5 unidades en stock)
• Guantes látex t/mediana 100u (2 unidades en stock)
• Frascos lavadores de 500 ml (2 unidades en stock)
• Bidón de plástico con grifo de 10 l (1 unidad en stock)
• Guantes protectores de quemado (2 pares en stock)
• Tarro de vidrio de 38 cl para cultivo in vitro (al menos 400 unidades en
stock)
• Tapa de polipropileno 82mm p/tarros (al menos 400 unidades en stock)
• Placas Petri de 90 mm (al menos 400 unidades en stock)
• Matraces Erlenmeyer:
o 100 ml (4 unidades en stock)
o 250 ml (4 unidades en stock)
o 500 ml (4 unidades en stock)
48
o 1000 ml (4 unidades en stock)
• Pipetas pasteur 50 mm con chupete (20 unidades en stock)
• Pipetas graduadas:
o 0,1 ml
o 0,2 ml
o 0,5 ml
o 1,0 ml
o 2,0 ml
o 5,0 ml
o 10,0 ml
o 20,0 ml
• Probetas graduadas (pueden ser de plástico)
o 5 ml
o 10 ml
o 25 ml
o 50 ml
o 100 ml
o 250 ml
o 500 ml
o 1000 ml
o 2000 ml
• Vasos de precipitados forma baja (pueden ser de plástico)
o 25 ml
o 50 ml
o 100 ml
49
o 250 ml
o 500 ml
o 1000 ml
o 2000 ml
• Murashige & Skoog Medium Macro, Micro y Vitaminas (5 unidades en
stock)
• Sucrose double-crystallized (Sacarosa) 5Kg (2 unidades en stock)
• Phyto Agar 1Kg (4 unidades en stock)
• Sodio hipoclorito sol 10% P/V 1000ml (2 unidades en stock)
• Ácido alfa-naftalenacético ANA 25g (1 unidad en stock)
• indole-3-butyric acid IBA 25 g (1 unidad en stock)
• 6-benzilaminopurina BAP 5g (1 unidad en stock)
• Thidiazuron 250 mg (1 unidad en stock)
• Solución antibiótica-antimicótica estabilizada para PTC (mínimo 100 ml
en stock)
• Ácido Ascórbico (500 g en stock)
• Prolina (100g en stock)
• Melatonina (2 g en stock)
• Desferroxiamina (5 ml en stock)
• Tampones de calibración de pHmetro
2.- LABORATORIO POLIVALENTE
• Placas Petri de 90 mm (al menos 400 unidades en stock)
• Matraces Erlenmeyer:
o 100 ml (4 unidades en stock)
50
o 250 ml (4 unidades en stock)
o 500 ml (4 unidades en stock)
o 1000 ml (4 unidades en stock)
• Pipetas pasteur 50 mm con chupete (20 unidades en stock)
• Pipetas graduadas:
o 0,1 ml
o 0,2 ml
o 0,5 ml
o 1,0 ml
o 2,0 ml
o 5,0 ml
o 10,0 ml
o 20,0 ml
• Probetas graduadas (pueden ser de plástico)
o 5 ml
o 10 ml
o 25 ml
o 50 ml
o 100 ml
o 250 ml
o 500 ml
o 1000 ml
o 2000 ml
• Vasos de precipitados forma baja (pueden ser de plástico)
o 25 ml
51
o 50 ml
o 100 ml
o 250 ml
o 500 ml
o 1000 ml
o 2000 ml
• Micropipetas graduables 100- 1000 l (mínimo 4 en stock)
• Puntas de pipeta bolsa de 500 puntas (2 unidades en stock)
• Glicerol (mínimo 2Kg en stock)
• Etilenglicol (mínimo 1 Kg en stock)
• Dimetilulfóxido (mínimo 1l en stock)
• Sacarosa (mínimo 1 Kg en stock)
• Alginato de sodio (400g en stock)
• Cloruro de calcio (500 g en stock)
• Papel de aluminio 50m (2 unidades en stock)
• Gel de sílice naranja (2,5 Kg en stock)
• Crioviales 2 ml (500 unidades en stock)
• Termo para nitrógeno líquido 500 ml
• Cuatro bastidores para 10 cajas de 100 crioviales de 2 ml
• Cajas para 100 crioviales de 2 ml (10 unidades en stock)
• Guantes crioprotectores (2 pares en stock)
• Gafas crioprotectoras (2 unidades en stock)
3. SALA CÁMARA FLUJO LAMINAR
• Alcohol etílico 96 10 l (1 unidad en stock)
• Lejía
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• Detergente
• Pinzas 23 cm para cultivo in vitro (4 unidades en stock)
• Soporte acero inoxidable (2 unidades en stock)
• Mango bisturí 12,5 cm nº3 (4 unidades en stock)
• Mango bisturí 14cm nº3 (4 unidades en stock)
• Hojas de bisturí nº 11 no estériles 100 u (2 unidades en stock)
• Hojas de bisturí nº 22 100 u (2 unidades en stock)
• Agujas enmangadas para disección (2 unidades en stock)
5. SALA CRIOCONSERVACIÓN
• Suministro permanente de NL. Calcular para una tasa de evaporación de
0,6 l/día