CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYT-

SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -SENACYT- FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -FONACYT-

UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA-UVG-

INFORME FINAL

“Implementación de pruebas para el Diagnóstico

Diferencial de Dengue:

RT-PCR en tiempo Real y ELISA IgG”

PROYECTO FODECYT No.012-2007

Dra. Alejandra Estévez

Investigador Principal

GUATEMALA, Mayo 2011

AGRADECIMIENTOS

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -CONCYT-.

RESUMEN

Introducción: Los métodos convencionales para evaluar una infección por Virus de Dengue

se basan en la detección de anticuerpos IgM e IgG en suero, mediante un ELISA. Sin

embargo, una exposición a otro flavivirus es suficiente para que se detecten anticuerpos con

reacción cruzada.

Antecedentes y objetivo: El proyecto de Vigilancia de Enfermedades Neurológicas Agudas

estudió la incidencia de casos causados por flavivirus, en un esfuerzo coordinado con la

Universidad del Valle de Guatemala, el Ministerio de Salud, el Centro para Control y

Prevención de Enfermedades de Estados Unidos y la Universidad Johns Hopkins. El

presente estudio complementa dicho proyecto con la implementación de ELISA IgG y una

técnica molecular -el RT-PCR en tiempo real- que discrimina por serotipos, con el fin de

analizar si los cuadros febriles de pacientes con síndrome neurológico estaban relacionados

con infecciones por VD.

Resultados: Se trabajaron muestras de suero provenientes de pacientes sospechosos de

infecciones arbovirales (n=497) encontrándose 12 casos positivos: 9 casos IgM positivos y

3 casos PCR positivos (serotipos DEN-1 y DEN-2). El análisis de ELISA IgG en muestras

pareadas reveló un 28% (60/ 213 pares) de infección previa, al presentar IgG anti-VD

positiva, sin cambio en título en la fase convaleciente, con viremia (RTqPCR) e IgM

negativas.

Conclusiones: Si bien la implementación del RT-PCR en tiempo real ha surgido como una

fuerte alternativa al aislamiento viral, ofreciendo una ventaja importante que es la

posibilidad de diferenciar serotipos del VD, el ELISA constituye una fuerte herramienta

aplicable a las instituciones de salud y evaluaciones de rutina.

SUMMARY

Introduction: Traditional methods used to evaluate dengue viral infection rely on the

detection of IgM and IgG antibodies by ELISA. However, a previous exposure to a

different flavivirus will promote the production of antibodies leading to cross reaction.

Background and objectives: In the hallmark of the Acute Infectious Neurologic Diseases

Surveillance project the incidence of neurologic diseases caused by flavivirus was studied,

in an effort coordinated by the Universidad del Valle de Guatemala, the Guatemalan

Ministry of Health, the Centers for Disease Control and Prevention and John Hopkins

University. Thus, the present work aims to complement the latter study by implementing

ELISA technique for the detection of IgG and IgM antibodies and a molecular technique

such as real time reverse transcriptase PCR (real time RT-PCR) that discriminates dengue

serotypes, in order to evaluate whether febrile cases with neurologic syndrome are related

with dengue viral infections.

Results: Serum samples collected from patients with suspected arboviral infection (n=497)

were analyzed by ELISA and real time RT-PCR. We found 12 positive cases: 9 IgM

positive and 3 PCR positive (dengue serotypes 1 and 2). Further IgG testing in paired

serum samples revealed previous dengue infection in 28% of the patients (60/213),

presenting IgG anti-dengue antibodies, no change in title in the convalescent phase and IgM

and PCR negative results.

Conclusions: Although real time RT-PCR implementation has emerged as a powerful

alternative to viral isolation, offering the possibility of identifying dengue serotypes,

ELISA is still a good choice for diagnostic testing in health care facilities and routine

evaluation.

ÍNDICE

PARTE I I.1 INTRODUCCIÓN I.1.1. Historia 1 I.1.2. Qué es el dengue? 1 I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 4 I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS

I.3.1 Objetivos I.3.1.1 General 8 I.3.1.2 Específicos 8 I.3.1.3 Hipótesis 8

I.4 MATERIALES Y METODOS I.4.1. Localización 9 I.4.2. Descripción general del proyecto 10 I.4.3. Pacientes y obtención de muestras 11 I.4.4. Aspectos Éticos 12 I.4.5. Manejo y procesamiento de muestras 12 I.4.6. ELISA IgM / IgG 13 I.4.7. RT-PCR tiempo real 14 I.4.8.Análisis estadístico 15 I.4.9. Variable 15 PARTE II MARCO TEORICO II.1. Características generales del Virus del Dengue 16 II.2. Vector 17 II.3. Transmisión del virus del dengue por el mosquito Aedes aegypti 18 II.4. Antecedentes del Dengue en Guatemala 19 II.5. Manifestaciones clínicas de la enfermedad causada por VD 21 II.5.1. Consideraciones generales 21 II.5.2. Síndromes clínicos 21 II.6. Detección del VD en el laboratorio 25

PARTE III III. RESULTADOS III.1. Implementación 30 III.2. Resultados de la investigación 33 III.3. DISCUSION 37 PARTE IV. IV. CONCLUSIONES

IV. 1. Conclusiones Objetivos específicos y recomendaciones asociadas IV. 1. 1. Conclusiones Objetivos a) y b) 40 IV. 1. 2. Conclusiones Objetivos c) y d) 40 IV. 1. 3. Conclusiones Objetivo e) 41 IV. 1. 4. Conclusión General 42

IV.2 RECOMENDACIONES 43 IV. 3. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 44 PARTE V V. INFORME FINANCIERO 49

1

PARTE I I.1. INTRODUCCION I.1.1. Historia La descripción más temprana de una enfermedad parecida al dengue aparece en

una enciclopedia china del año 992. En América, el dengue fue descrito clínicamente en

1780 luego de una gran epidemia en la ciudad de Filadelfia en los Estados Unidos. Se le

llamaba “fiebre quebranta huesos”, Sin embargo, el uso del término “quebranta huesos”

para describir una enfermedad febril antecede esta epidemia, pues ya figura en un

informe médico en Puerto Rico para el año 1771.

El origen de la palabra “dengue” usualmente se atribuye a una adaptación de la

palabra “dinga”, en Swahili, que pasó de África al Caribe durante una epidemia en el

1827. Sin embargo, el término ya era usado en España en 1801 para describir una

enfermedad febril aguda con dolor en los huesos, dolor en las articulaciones y

hemorragia.

I.1.2. Qué es el dengue?

Los Flavivirus son virus transmitidos por artrópodos que pertenecen a la familia

Flaviviridae. El genero Flavivirus incluye a más de 70 virus de RNA monocatenario, que

presentan determinantes antigénicos comunes. Los flavivirus son responsables de un alto

índice de mortalidad y morbilidad, y causan enfermedades severas en los vertebrados -

incluido el ser humano- tales como encefalitis y fiebre hemorrágica. Entre los virus

patogénicos del género figuran el Virus del Dengue (VD), Virus de la Fiebre Amarilla

(VFA), Virus de Encefalitis Japonesa (VEJ), Virus de Encefalitis de San Luis (VESL) y

el Virus del Oeste del Nilo (VON).

El Dengue es una enfermedad viral que puede ser causada por cuatro diferentes

serotipos (DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4) y es transmitida por la picadura de mosquitos

del género Aedes. Actualmente es considerada la arbovirosis con mayor prevalencia en

2

regiones tropicales y subtropicales de Asia, África, Centro y Sur América (Gubler 1997,

Huang JH., et al 2007).

Se ha estimado que 2.5 billones de personas viven en áreas de riesgo de infección

por dengue y se espera que este número vaya en aumento debido a la expansión del

hábitat de vectores competentes, al incremento de hospederos susceptibles humanos y al

aumento de la distribución del virus del dengue por la magnitud de los viajes alrededor

del mundo (Domingo C, et al 2004; Huang JH, et al 2007)

Globalmente, 1 de cada 100 personas son infectadas cada año por uno o más de

los cuatro serotipos del virus del dengue (DEN1-4). Se estima que cada año ocurren 10

millones de casos de fiebre de dengue, incluyendo más de 500,000 casos de dengue

hemorrágico y síndrome del choque de dengue (DH/SCD) (Kyle J.L., and E. Harris,

2008).

Los únicos modos de prevención hasta el momento son la adopción de medidas

vinculadas con la higiene, fundamentalmente la eliminación de los posibles lugares de

depósito de los huevos del insecto. En tal sentido, se recomienda mantener tapados todos

los recipientes en donde se almacene agua. Asimismo, es preciso quitar el agua de los

huecos de árboles, rocas, paredes y tapias, objetos, pozos, letrinas abandonadas,

depresiones de terreno, blocks de construcción, u objetos o instrumentos.

De la misma manera, es necesario llenar con tierra o arena los floreros, macetas y limpiar

canoas y techos.

Todas las medidas que se puedan adoptar es un paso adelante en la lucha contra

esta enfermedad. Evitar la acumulación de agua y eliminar todo tipo de basura sobre

todo aquella que puede almacenar líquidos: botellas, cáscaras, llantas y demás

recipientes.

Los enormes aumentos de la población en los centros urbanos, una deficiente

recolección de la basura y falta de abastecimiento de agua por tuberías, así como el

incremento de recipientes desechables que sirven como hábitats larvarios, se combinan

para convertir al problema hoy en día en un problema de todos. Pocos países disponen de

los recursos para llevar a cabo una campaña vertical basada en insecticidas, similar a las

utilizadas en el pasado, cuando el dengue se había dado a conocer. Así, intentar hoy

3

realizar una campaña de erradicación del Aedes aegypti sería muy difícil. Más aún,

teniendo en cuenta la extensa propagación del mismo.

El desafío que deberán enfrentar aquellos que deseen diseñar programas

comunitarios eficaces es lograr la participación activa, con sugerencias y participación de

la comunidad en el programa.

4

I.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El primer brote en América Latina y el Caribe de una enfermedad compatible con

dengue clásico, ocurrió en las Guyanas Francesas en 1635 y en Panamá en 1699

(Bhamarapravati y Yoksan, 1997). Desde entonces, la enfermedad ha sido descrita en

diferentes lugares de América Latina y el mundo. Entre las décadas de los 40s y 60s, los

programas de erradicación para prevenir epidemias urbanas de FA, también fueron

exitosas para reducir el riesgo de dengue. La erradicación del Aëdes aegypti fue posible

en Argentina, Belice, Bermuda, Bolivia, Brasil, Islas Caimán, Chile, Colombia, Costa

Rica, Ecuador, El Salvador, Guatemala, Honduras, México, Nicaragua, Panamá,

Paraguay, Perú, y Uruguay.

Sin embargo, el programa fue interrumpido a inicios de los 70s y la iniciativa de

erradicación del Ae. Aegypti fracasó (OPS, 2000) y como consecuencia de la persistencia

del mosquito en algunos lugares la enfermedad reapareció, debutando con grandes

epidemias de dengue hemorrágico en Cuba en 1981 y Venezuela en 1990. Se ha

evidenciado una amplia distribución del vector, seguida de un aumento en la transmisión

de los múltiples serotipos del virus (Hayes et al, 1992; Gubler et al, 1994; Balmaceda et

al, 1999; OPS, 2000) por lo que actualmente se han encontrado en todos los países de

América Latina, registrándose un aumento en el número de casos y epidemias de fiebre

por VD.

Según la Organización Panamericana de la Salud, en Guatemala el panorama es

preocupante. Desde el año 1991, cuando Guatemala reportaba 10,968 casos de dengue

anuales, múltiples serotipos del virus han circulado en la región, hecho que se corroboró

con el aislamiento de los cuatro serotipos en los últimos años (Usuku et al, 2001). A

pesar de que el Aedes Aegipti fue erradicado de Guatemala en 1959 (OPS, 2001) el vector

fue capaz de re-infestar el país luego de que los programas de erradicación fueran

interrumpidos. Desde el año 1995 los casos han ido en aumento llegando a 6,341 casos en

el 2005 (www.paho.org/english/ad/dpc/cd/Dengue.html). Sin embargo, se especula que

estas cifras representan una subestimación de la incidencia del VD siendo la situación

más grave de lo que parece. Entre los factores que influyen en el sub-registro de casos se

encuentran: la falta de búsqueda de servicios de salud en los casos leves de la

5

enfermedad, las limitaciones en los servicios de salud para brindar un diagnóstico

diferenciado basado en pruebas de laboratorio y en el mejor de los casos, cuando se logra

realizar la toma de muestras, la falta de un diagnóstico de laboratorio oportuno o la

incapacidad de realizar las pruebas debido a limitaciones financieras. Incluso, algunos

casos de infecciones por VD presentan un diagnóstico confuso y no son tomados en

cuenta, por ejemplo, cuando el título de IgM no es lo suficientemente alto como para

arrojar resultados positivos en un ELISA.

De acuerdo a un reporte muy reciente de la Cruz Roja Española (Octubre 2005),

el paso del Huracán Stan por Guatemala ha aumentado el riesgo latente de epidemias,

debido al daño en las infraestructuras en gran parte del país y a las inundaciones que se

traducen en la aparición de más ambientes propicios para el desarrollo del vector (Plan de

Acción, Inundaciones Centroamérica Huracán Stan, El Salvador y Guatemala, 10

Octubre 2005;

http://www.cruzroja.es/pls/portal30/docs/PAGE/SITE_CRE/ARBOL_CARPETAS/DD_

ACCION_INTERNACIONAL/D20OPERACIONES_ESPECIALES/INUNCENTROA

MTIFVIET/PLANHURACANSTAN101005P.PDF)

Este contexto revela cuan determinante constituye el desarrollo de programas

serios de vigilancia y control, y asociado a ello, la implementación de métodos rápidos y

eficaces de detección del VD en el laboratorio.

Hoy en día no existe una vacuna o cura para la enfermedad causada por el VD y

el tratamiento paliativo consiste en reposo, acompañado de administración de analgésicos

y antipiréticos. La detección temprana del VD en un paciente, es la que permite montar

una respuesta rápida en las zonas afectadas, frecuentemente orientada al control del

vector. Por lo tanto, el desarrollo de programas de vigilancia, basados en la detección del

VD por técnicas serológicas y moleculares en el laboratorio, emerge como un asunto de

prioridad en materia de salud pública, no solamente a nivel clínico sino también a nivel

nacional para lograr proveer señales tempranas de una posible epidemia. Además, el

desarrollo de ensayos rápidos de detección viral aporta datos sumamente útiles para los

estudios epidemiológicos y ecológicos enfocados en estudiar la dinámica del vector.

En Guatemala, ya se han realizado investigaciones sobre enfermedades

arbovirales, relacionados con la transmisión de flavivirus en aves, mosquitos y caballos

6

(CES / UVG; Morales et al, 2006; datos no publicados). Además, se están desarrollando

programas de vigilancia de enfermedades arbovirales en humanos en hospitales, con el

fin de estudiar la prevalencia de las infecciones por flavivirus en pacientes con

enfermedades neurológicas y que presentan cuadros febriles. Actualmente en nuestro

laboratorio se ha desarrollado la capacidad de detectar infecciones por flavivirus como el

VON, por medio de RT-PCR en tiempo real (Lanciotti et al, 2000) y mediante ELISA

(Martin et al, 2000) evaluando los niveles de IgM e IgG en suero de aves y equinos. Sin

embargo, no se han desarrollado aun todas las herramientas para apoyar un diagnóstico

de infección por flavivirus, en particular para VD, en los seres humanos. Para hacerlo,

sería necesario estudiar:

a) el perfil de anticuerpos IgG,

b) la presencia del ARN viral del VD

c) el serotipo de VD involucrado

Es por ello que uno de los objetivos del presente estudio es montar el ELISA de

captura para IgG, el cual daría un panorama más amplio de la respuesta inmunológica del

paciente ante una infección por VD y permitiría diferenciar una infección primaria de una

secundaria. Por otro lado, de acuerdo a lo expuesto anteriormente respecto a la naturaleza

antigénica de los flavivirus, para diagnosticar una infección por VD en el laboratorio

sería recomendable complementar el ensayo serológico con un test molecular que permita

detectar el ARN viral. Todos los serotipos de VD desencadenan respuestas

inmunológicas similares y el ensayo serológico no ofrece información respecto al

serotipo de VD involucrado en la infección. Considerando este aspecto, para llegar a

establecer un diagnóstico completo en los pacientes con síntomas febriles (posibles

candidatos a infección por VD), el siguiente objetivo del estudio es la optimización del

RT-PCR en tiempo real para los cuatro serotipos de VD, basado en la técnica descripta

por Johnson y equipo en CDC (2005). Este protocolo ha sido ampliamente utilizado para

detectar infecciones por VD incluso en aquellos casos en los cuales el diagnóstico se

torna confuso, por ejemplo, cuando el título de IgM no es lo suficientemente alto como

para arrojar resultados positivos en un ELISA o cuando el paciente presenta viremias

7

muy bajas como para realizar aislados virales. Cabe señalar que nuestra unidad mantiene

una relación de colaboración con el grupo del CDC mencionado (Johnson y equipo) a

través de la transferencia de tecnología y en lo que se refiere a control de calidad de las

pruebas con las que trabajamos.

8

I.3. OBJETIVOS e HIPOTESIS

I.3.1. OBJETIVOS

I.3.1.1. Objetivo general

Aumentar la capacidad para el diagnóstico diferencial del VD, implementando pruebas

para discriminar por serotipo y las infecciones primarias de secundarias.

I.3.1.2. Objetivos específicos

a) Estandarizar el protocolo de ELISA de captura para IgG con el fin de determinar el

título de anticuerpos para VD en muestras de sueros agudos y convalecientes de pacientes

con síntomas febriles y enfermedades infecciosas neurológicas agudas.

b) Evaluar los niveles de IgM e IgG, mediante un ELISA de captura, en muestras de

suero de pacientes con síntomas febriles, colectados en los departamentos de Zacapa,

Esquintla, Santa Rosa y Guatemala.

c) Estandarizar el protocolo de RT-PCR en tiempo real para los serotipos 1, 2, 3 y 4 de

VD en muestras de pacientes con síntomas febriles.

d) Estudiar, mediante la técnica de RT-PCR en tiempo real para los cuatro serotipos de

VD, la presencia del ARN viral en muestras de liquido cefalorraquídeo (LCR) y suero de

pacientes febriles, colectados en los departamentos de Zacapa, Esquintla, Santa Rosa y

Guatemala.

e) Establecer el tipo de asociación que existe entre la detección de una infección por VD

en muestras de pacientes y las técnicas utilizadas -ELISA y RT-PCR en tiempo real-

como herramientas de diagnóstico.

I.3.1.3. HIPOTESIS

La implementación conjunta de técnicas moleculares y serológicas permite aumentar la

capacidad de detección de infecciones causadas por VD en muestras clínicas de pacientes

con cuadros febriles o neurológicos.

9

I.4. MATERIALES Y METODOS

I.4.1. Localización

Este estudio se realizó con muestras de sueros de pacientes recolectadas en el

marco del Proyecto de Vigilancia de Enfermedades Infecciosas Neurológicas Agudas

(colaboración entre la Universidad del Valle de Guatemala, el Ministerio de Salud y

Acción Social, el Centro para Control y Prevención de Enfermedades de Estados Unidos

y la Universidad John Hopkins) en los departamentos de Guatemala (14°37′22″N,

90°31′53″W, 1592msnm), Zacapa (14°58’21N, 89°31’42W, 220 msnm), Escuintla

(14°17′52″N, 90°47′13″W; 347 msnm) y Santa Rosa (14°16'42"N, 90°18'00"W, 893

msnm).

Fuente google maps 50mi 100km

10

I.4.2. Descripción general del proyecto

En Guatemala se está llevando a cabo un proyecto de Vigilancia de Enfermedades

Infecciosas Neurológicas Agudas (EINA) que tiene como meta estudiar la incidencia de

casos de enfermedades neurológicas causadas por flavivirus, incluyendo infecciones por

VD y VON. Este proyecto se inició en Julio del 2005, sobre la base de una plataforma de

vigilancia en cuatro hospitales situados en distintos departamentos de Guatemala en un

esfuerzo coordinado con la Universidad del Valle de Guatemala (UVG), el Ministerio de

Salud (MS), el Centro para Control y Prevención de Enfermedades de Estados Unidos

(CDC, Fort Collins) y la Universidad John Hopkins. Se han estudiado 321 casos a la

fecha de de los cuales 14 son posibles infecciones por flavivirus. Esto se pudo determinar

estudiando el perfil de IgM en muestras de suero y líquido cefalorraquídeo (LCR)

mediante un ELISA de captura (Martin et al, 2000a). Sin embargo, ante la falta de

métodos adicionales para la confirmación de los casos, se han enviado las muestras al

CDC para un análisis mas exhaustivo (PRNT, RT-PCR en tiempo real) con el fin de

llegar a un diagnóstico definitivo. Dado el alto costo de enviar muestras al CDC para

análisis adicionales, la idea de la presente propuesta es desarrollar algunas herramientas

aquí en Guatemala.

Por otra parte, en marzo del presente año se iniciará en Santa Rosa el proyecto de

Vigilancia Comunitaria (ViCo) que cuenta al MS y al CDC como colaboradores.

Consiste en un sistema integrado de vigilancia para enfermedades febriles, diarreicas y

respiratorias que tiene como fin establecer la línea basal de incidencia de cada

enfermedad en el área e identificar las etiologías de dichos síndromes.

En el marco de ambos proyectos, el presente estudio tiene como meta analizar si los

cuadros febriles en los pacientes están relacionados con infecciones de VD primarias o

secundarias evaluando la respuesta inmunológica del paciente (ELISAs IgM e IgG) y si

están vinculadas a algún serotipo particular de VD (RT-PCR en tiempo real).

11

I.4.3. Pacientes y obtención de muestras

Se utilizarán las muestras ya colectadas para un estudio de Enfermedades

Infecciosas Neurológicas Agudas (EINA) que se realiza actualmente en los laboratorios

del CES/CDC-CAP, cuyo principal objetivo es estudiar la incidencia de flavivirus en

pacientes con encefalitis. Los criterios de elegibilidad para los pacientes figuran a

continuación. Los pacientes se incorporan al estudio en dos hospitales de referencia del

MS de la Ciudad de Guatemala (Hospital San Juan de Dios y Hospital Roosevelt) y en

tres hospitales rurales (Esquintla, Zacapa y Santa Rosa).

Los hospitales de referencia captan alrededor del 70% de los pacientes, referidos

de otros hospitales del interior y de puestos sanitarios, lo que hace que más de la mitad de

los casos provengan de áreas fuera de la Ciudad de Guatemala. Los pacientes son

elegibles para el estudio siempre y cuando hayan presentado síntomas febriles reciente y

en cuando aplica, una indicación clínica de punción lumbar.

En todos los casos se registran los datos clínicos y demográficos del paciente, y se

obtienen muestras de suero y LCR (cuando corresponda) en la visita inicial, al momento

de dar el alta y en el control de rutina subsiguiente, 5 a 15 semanas después. La muestra

de LCR se encuentra dentro del conjunto de pruebas de rutina que ya ha sido pactada el

Ubicación de los Hospitales Guatemala

12

médico, por lo que se solicita una cantidad extra (0.5-1 mL) para fines del estudio en un

consentimiento informado.

Dado que las muestras provienen de otros estudios, la recolección ya está en curso

por lo cual no se han solicitado fondos para ello.

I.4.4. Aspectos Éticos

Para mantener la confidencialidad de la información proporcionada, se asignarán

códigos a cada paciente, los cuales no tendrán vínculo alguno con su identidad. El

análisis de muestras e información que se propone sigue los lineamientos establecidos por

la Declaración de Helsinki y sus enmiendas, y no conlleva ningún riesgo para la

integridad física y mental de los participantes, como tampoco para el medio ambiente. El

proyecto cuenta con la aprobación de los comités de ética de los hospitales participantes,

John Hopkins, CDC y Universidad del Valle. Además contó con la aprobación del

Ministerio de Salud y Acción Social de Guatemala.

I.4.5. Manejo y procesamiento de muestras

Las muestras del estudio permanecerán a -20ºC en cada hospital hasta que sean

debidamente transportadas (4ºC) al laboratorio de la UVG. Se minimizarán los ciclos de

descongelamiento /congelamiento con el fin de conservar la integridad de los

especimenes. Se prepararán alícuotas de LCR y suero en el laboratorio y se guardarán -

20ºC hasta la realización de los distintos ensayos. Además de los cultivos de LCR que se

realizan de rutina en el hospital, se realizarán ensayos de aglutinación latex para

Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae tipo b y PCR para herpes simplex y

enterovirus.

13

I.4.6. ELISA IgM / IgG

Se evaluaron las muestras de suero para la detección de anticuerpos IgM

(muestras agudas n=497) e IgG (muestras pareadas de un mismo paciente obtenidas en

las fases aguda y convaleciente; n=213 pares) mediante un ELISA basado en aquel

descrito previamente, con algunas modificaciones menores (Martin y col 2000a b;

Johnson y col, 2000). Los antígenos fueron gentilmente provistos por la Dra Johnson y

colaboradores (CDC, Fort Collins).

Brevemente, se sensibilizaron las placas con anticuerpo de cabra anti -IgM ó -IgG

humanas (Kirkegaard and Perry Laboratories, USA) a 4°C toda la noche. Se bloqueó con

200 µl de solución salina (PBS pH 7.4, Sigma) + 5% Leche descremada (Dos Pinos) +

0.5% Tween20 (Sigma). Después de 5 lavados con PBS 0.05% Tween20, se agregó 50 µl

de las muestras control y desconocidas (en duplicados); los controles negativos y

muestras a evaluar se diluyeron a 1:400, los controles positivos para Dengue a 1:1,800, y

los positivos para VON a 1:800. Se incubó a 37°C por una hora y luego de lavar se

agregó 50 µl de los antígenos (antígenos DEN: DEN 1, 2 y 4 a 1:120 y DEN 3 a 1:80;

antígenos VON: 1:320, control negativo -sin antígeno- células COS-1 se utilizó en

1:160). Se incubó a 4°C por toda la noche. Al día siguiente se lavó 5 veces y se agregó

50 µl de anticuerpo monoclonal 6B6C-1 conjugado con peroxidasa de rábano (dilución

1:3,000; Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, Pa.). Luego de una

hora a 37°C se lavó 10 veces y se agregó 75 µl de sustrato de peroxidasa TMB (3,3’,5,5`

tetrametilbenzidina, Kirkegaard and Perry Laboratories, USA) . Se incubaron las placas

en oscuridad por 10 minutos y se detuvo la reacción con 50 µl de ácido sulfúrico 1N (EM

Science) y se leyó a 450nm en un lector de ELISA.

Las muestras se corrieron en pares: con antígeno (DEN 1-4) y sin antígeno (Células COS-

1), de manera que cada muestra lleve su respectivo control negativo. Para la

interpretación de los resultados, se calculó un valor de P/N- razón entre la densidad

óptica (DO) de una muestra con antígeno (P) y la DO de su control negativo (COS-1)

(N). Para que una prueba sea válida se deben dar dos condiciones: 1- el P/N de los

controles positivos debe ser mayor que 2, de lo contrario la prueba se considera inválida y

se debe repetir; y 2- el valor promedio de las DO de las muestras y controles positivos

14

debe ser 3 veces mayor que el promedio de las DO de su par sin antígeno (células COS-

1). La interpretación de los valores de P/N de pacientes mayor o igual que 3 debe

notificarse como IgM/IgG positivo y los que presenten valores comprendidos entre 2 y 3

se consideran indeterminados. Los negativos serán aquellos cuyos P/N sean menores a 2.

I.4.7. RT-PCR tiempo real

Para la extracción del ARN se trabajó con el kit comercial QIAamp Viral RNA

Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA) siguiendo las indicaciones recomendadas por el

fabricante. El ARN se guardó a -70ºC hasta la realización de los ensayos.

El protocolo de RT-PCR tiempo real está basado en aquel descripto por Johnson y

colaboradores (2005). La prueba utiliza oligonucleótidos cebadores (primers) y sondas

fluorescentes de hidrólisis doblemente marcadas o sondas TaqMan, específicos para cada

serotipo del VD reportado previamente (Johnson et al, 2005). Las secuencias pueden

apreciarse en la Tabla I. Se realizó una reacción multiplex para detección de serotipos de

VD -2, 3 y 4, en la cual se combinaron 50 pmol de cada primer y 9pmol de sonda en una

reacción de 25ul. Se utilizó el kit iScript One-Step RT-PCR (Bio-Rad, CA). Se realizó

transcripción inversa por 10 minutos a 50°C, seguido de 45 ciclos de amplificación, en un

termociclador Applied Biosystems 7500 Real -Time PCR System. Se utilizó una

temperatura de “annealing” de 60°C. Para la detección de DEN-1 se realizó una reacción

simple con las mismas condiciones antes mencionadas.

Los controles positivos utilizados en este estudio (fluido de cultivo positivo a VD

preparado a partir de sueros de pacientes con diagnóstico confirmado) fueron

amablemente proporcionados por la Lic Leticia Castillo del Laboratorio Nacional de

Salud de Guatemala.

15

Tabla I: secuencias de cebadores y sondas de hidrólisis TaqMan utilizados en el protocolo de RT-PCR tiempo real (Johnson et al, 2005)

Serotipo Secuencia Posición genoma

Fluoróforo/Quencher

DEN-1 F DEN-1 C DEN-1 probe

5’-CAAAAGGAAGTCGTGCAATA-3’ 5’-CTGAGTGAATTCTCTCTACTGAACC-3’

CATGTGGTTGGGAGCACGC

8973 9084 8998

FAM/BQH-1

DEN-2 F DEN-2 C DEN-2 probe

5’-CAGGTTATGGCACTGTCACGAT-3’ 5’-CCATCTGCAGCAACACCATCTC-3’

CTCTCCGAGAACAGGCCTCGACTTCAA

1605 1583 1008

FAM/BQH-1

DEN-3 F DEN-3 C DEN-3 probe

5’-GGACTGGACACACGCACTCA-3’ 5’-CATGTCTCTACCTTCTCGACTTGTCT-3’

ACCTGGATGTCGGCTGAAGGAGCTTG

740 813 762

TR/BHQ-2

DEN-4 F DEN-4 C DEN-4 probe

5’-TTGTCCTAATGATGCTGGTCG-3’ 5’-TCCACCTGAGACTCCTTCCA-3’

TTCCTACTCCTACGCATCGCATTCCG

904 992 960

Cy5/BHQ-3

I.4.8.Análisis estadístico

El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el software SAS. Las

proporciones se compararon utilizando la prueba Fisher Exact de dos colas. Se calcularon

coeficientes de probabilidad (odds ratio) para cada técnica con el fin de analizar la

probabilidad de encontrar un resultado positivo por uno u otro procedimiento. Se utilizó

la prueba U de Mann-Whitney para evaluar diferencias entre medias. En todos los casos,

el nivel de significancia p<0.05 se utilizó para rechazar la hipótesis nula.

I.4.9. Variable

Presencia de VD en muestras de suero de pacientes con síndrome neurológico.

16

PARTE II

MARCO TEORICO

II.1. Características generales del Virus del Dengue

El VD presenta forma esférica de 37-50 mm de diámetro y cuenta en su interior

con una nucleocápside icosaédrica que contiene al genoma constituido por ARN (ácido

ribonucleico) de polaridad positiva. En su genoma existen siete genes que codifican para

proteínas no estructurales y que son expresados por la célula infectada. Estas provocan en

el huésped la respuesta de anticuerpos y los mecanismos de defensa celular, pudiendo

desencadenar en la inmunopatogenia del dengue hemorrágico.

Existen cuatro serotipos conocidos del VD. Sabin y Schlesinger aislaron las cepas

de Hawai y Nueva Guinea en l944, denominadas posteriormente Dengue 1 (Den-1) y

Dengue 2 (Den-2). En 1954, un síndrome “nuevo” denominado fiebre hemorrágica del

dengue fue estudiado en Filipinas procediéndose al aislamiento de los serotipos Dengue 3

(Den-3) y Dengue 4 (Den-4). Aunque generan cuadros clínicos idénticos, la infección por

alguno de los diferentes serotipos estimula la inmunidad homotípica que es completa y

permanente, siendo la protección cruzada muy incompleta y transitoria. Puede existir la

posibilidad de infecciones heterotípicas.

Para la preservación de la patología se requiere la presencia de un vector, siendo

el mosquito del género Aedes su transmisor. Varias son las especies de Aedes conocidas

como vectores de estos virus, pero el A. aegypti es el vector principal. Otro vector, el

Aedes albopictus, ha demostrado capacidad de transmisión transovárica del virus, no

descartándose la misma en el A. aegypti. Comparten áreas urbanas y rurales o selváticas

por lo que pueden resultar de nexo entre una y otra zona, pudiendo inclusive fecundar una

a otra especie. El A. albopictus, implicado en Asia y Oceanía, se ha establecido en

algunas partes del continente americano, como ser, Estados Unidos, México,

Centroamérica (incluyendo Guatemala) y Brasil y se supone que tiene gran capacidad

vectorial, aunque su papel en la transmisión natural aún debe ser evaluado. Otros vectores

que han sido implicados son el A. scutellaris, A. polynesiensis, A. cooki y A. mediovitatus

17

(Henchal and Putnak, 1990). En particular, en Guatemala se ha demostrado la presencia

de A. aegypti y A. albopictus en zonas rurales y urbanas (Ogata et al, 1996; García-

Franco et al. 2002).

La dinámica de transmisión del VD depende de interacciones entre el ambiente, el

virus, la población y el vector, los que coexisten en un hábitat específico. La magnitud e

intensidad de tales interacciones determinará la transmisión del dengue en una

comunidad, región o país. Al conocer que factores están involucrados en esta dinámica,

se puede romper el ciclo y evitar la aparición de epidemias y el incremento de la

incidencia del dengue.

II.2. Vector

El mosquito Aedes aegypti, principal vector del virus del dengue en Puerto Rico,

probablemente fue transportado desde África hasta el Nuevo Mundo durante la trata de

esclavos. Se puede encontrar este mosquito entre las latitudes 35 grados norte y 35 grados

sur y se le identifica por los patrones de escamas en bandas blancas en sus patas y tórax.

El ciclo de vida del mosquito Aedes aegypti se compone de cuatro etapas: huevo,

larva, pupa y mosquito adulto. La hembra deposita sus huevos en los bordes verticales de

lugares donde se acumula agua, usualmente recipientes artificiales. Mientras los huevos

no entren en contacto con agua, pueden durar semanas y meses. Los huevos se abren

cuando los cubre el agua. Entonces surge la larva que luego se convierte en pupa. La

etapa de larva puede durar de siete a nueve días a 77 grados Fahrenheit o 25 grados

Celsius y la pupa puede durar de dos a tres días a esta misma temperatura. De la pupa

sale el mosquito adulto.

El macho Aedes aegypti se alimenta del azúcar de flores y frutas y la hembra se

alimenta de azúcar y sangre, la cual utiliza para desarrollar sus huevos. El Aedes aegypti

suele picar más en las primeras horas de la mañana y durante varias horas antes del

anochecer. Sin embargo, puede picar durante cualquier hora del día en áreas bajo techo o

en áreas protegidas de la luz directa del sol. No es común que el mosquito pique en la

playa durante un día soleado. Por lo general, tampoco se encuentra en bosques tropicales

ni mangles donde no habitan seres humanos.

18

La hembra Aedes aegypti coloca sus huevos en envases caseros artificiales que

puedan retener agua y que se encuentran frecuentemente en ambientes urbanos

domésticos. Esto incluye latas, barriles, cubos, drones, llantas descartadas y floreros. Por

lo general, la hembra no coloca sus huevos en ambientes naturales como quebradas o

ríos.

El mosquito Aedes aegypti es un vector eficiente de dengue porque es altamente

susceptible al virus del dengue, se alimenta de sangre humana y se cría cerca de los seres

humanos.

Otros mosquitos Aedes, incluyendo Aedes albopictus y Aedes polynesiensis

también pueden estar asociados con la transmisión de dengue aunque se consideran

vectores menos eficientes que el Aedes aegypti. El Aedes albopictus ha estado presente en

los Estados Unidos desde por lo menos el 1985. Esta especie nativa de Asia se puede

encontrar ahora en la mayoría de los estados de la mitad oriental de Estados Unidos y en

algunas áreas de Brasil, México, Guatemala, El Salvador y la República Dominicana.

También se han observado ciclos de transmisión de dengue en Malasia con el vector

Aedes niveus y en el oeste de África con el vector Aedes furcifertaylori.

II.3. Transmisión del virus del dengue por el mosquito Aedes aegypti

El ciclo de transmisión de dengue comienza con una persona infectada con el

virus del dengue. El virus circulará en la sangre de esa persona durante aproximadamente

cinco días. Durante ese tiempo, una hembra Aedes aegypti pica a la persona e ingiere

sangre que contiene el virus. El virus se replica dentro de este mosquito durante un

período de ocho a doce días que se conoce como el período de incubación extrínseco, ya

que ocurre fuera del ser humano.

Durante este período el virus se replica en la zona embrionaria del tubo digestivo

del mosquito, en los ovarios, el tejido nervioso y el cuerpo graso. Luego se difunde por la

cavidad corporal, se replica e infecta las glándulas salivares. Cuando este mosquito pica a

una persona susceptible le transmite el virus a través de la saliva a esta segunda persona.

19

El mosquito infectado puede picar varias veces durante el resto de su vida y transmitir el

virus a cualquier otra persona susceptible.

El virus se replica en la segunda persona y produce síntomas que comienzan a

aparecer cerca de cuatro a siete días después de la picada del mosquito, con un máximo

de tres a catorce días. Este período entre la picada y el comienzo de los síntomas se

conoce como período de incubación intrínseco, pues ocurre dentro del ser humano.

Durante este período el virus se aloja y replica en órganos como los nódulos linfáticos y

el hígado.

Luego, sale de estos tejidos y se difunde por la sangre e infecta leucocitos y otros

tejidos linfáticos. Finalmente, millones de virus salen de estos otros tejidos para circular

en la sangre. Los síntomas causados por la infección de dengue pueden durar de tres a

diez días, con un promedio de cinco días después de la aparición de los síntomas

iniciales.

Otro modo de transmisión es la transovárica, donde el mosquito infectado pasa el

virus a sus huevos. Existe evidencia de este modo de transmisión del virus del dengue en

Aedes aegypti. Sin embargo, se entiende que este tipo de transmisión es poco frecuente y

que, en términos generales, los mosquitos sólo son infectados cuando pican a una persona

infectada con el virus del dengue.

II.4. Antecedentes del Dengue en Guatemala

El Dengue es una enfermedad prioritaria en Guatemala con una tasa de 12.26 por

100,000 habitantes para el año 2008, 93.4 por 100,000 habitantes para el 2009 y una tasa

de 52 por 100,000 habitantes para el año 2010. El dengue es endémico en nuestro país,

geográficamente se distribuye en 28 áreas de salud del total de 29, quienes reportan casos

en el transcurso de todo el año, a excepción de Totonicapán que aún no reporta casos. Los

departamentos con mayor número de casos de dengue reportados para el 2008 son: Ixcán,

Peten, Zacapa, Escuintla e Izabal y para el año 20101 Escuintla, Santa Rosa, Zacapa y

Guatemala. Actualmente, continúa el incremento de casos de dengue con un 400% de

1 Los datos del año 2010 son hasta el mes de Julio.

20

aumento en comparación al año 2009, siendo el grupo de edad mas afectado el de 25- 39

años, es decir, la población económicamente activa. (Ministerio de Salud Publica y

Asistencia Social, Centro Nacional de Epidemiología, Semana 20 año 2008, Semana 52

año 2009 y Semana 27 año 2010).

El Dengue es asociado con grandes epidemias urbanas y se ha convertido en uno

de los mayores problemas de salud pública, con un impacto económico, político y social

significativo. Hoy en día no existe una vacuna o cura para la enfermedad causada por el

virus del dengue, por lo que la detección temprana en un paciente es la que permite

establecer una respuesta rápida en las zonas afectadas. Actualmente se están

desarrollando sistemas de alerta temprana que ayuden a predecir una epidemia de dengue,

siendo a vigilancia virológica el sistema de alerta temprana más importante.

Además de la detección temprana del virus, también es importante conocer los

factores de riesgo asociados a la transmisión del dengue. Los determinantes sociales de la

emergencia del virus del dengue incluyen el crecimiento poblacional, la rápida

urbanización, la escasez de servicios públicos, como el agua potable y el descarte de

desechos sólidos, y la migración a áreas endémicas. (Narro-Roble J et al , 1995; Guzmán

MG et al, 2002; Navarrete-Espinoza J et al, 2005) Los factores biológicos asociados con

la transmisión del VD son: la edad, género, raza, estatus nutricional, salud del hospedero,

la competencia y densidad del vector y el origen geográfico de la cepa viral (Gubler

1998; Navarrete-Espinoza J, 2005). Los factores asociados al resurgimiento del VD en su

forma hemorrágica (DH) están asociados a los diferentes serotipos circulantes en una

región. El mecanismo exacto responsable del DH aun no esta completamente

comprendido pero es ampliamente aceptado que las infecciones secundarias son el

principal factor de riesgo (Gubler DJ, 2002; Huang JH, et al 2007). Por lo tanto, la co-

circulación de los diferentes serotipos del VD en un área geográfica, favorece la aparición

de DH y es imprescindible conocer qué serotipos están circulando para tomar las medidas

de prevención mas apropiadas.

21

II.5. Manifestaciones clínicas de la enfermedad causada por VD

II.5.1. Consideraciones generales

Luego de la picadura del mosquito y de un período de incubación de 3 a 14 días

aparecen los síntomas: aparición abrupta de fiebre alta -sobre 39ºC- que coincide con el

periodo de viremia, acompañada de dolor de cabeza, dolores musculares y articulares

obligando en algunos casos al reposo absoluto, dolor retro-orbitario, nauseas, vómitos y

leucopenia.

En países donde circula en forma habitual el VD, la enfermedad puede

complicarse con la forma más grave, el dengue hemorrágico hasta llegar al shock, en el

cual el pulso y la presión sanguínea son muy bajos. Sin embargo, es importante

mencionar que el cuadro clínico difiere entre regiones geográficas debido a las

diferencias culturales y posiblemente al estatus inmunológico de la población afectada

(Henchal y Putnak, 1990).

La Organización Panamericana de la Salud (OPS) ha considerado al dengue como

el mayor problema de salud pública de América luego del SIDA, encontrándose casi dos

tercios de la población mundial en zonas propicias (OPS, 2000). Es posible que cada año

80.000.000 de personas contraigan la enfermedad. Estas cifras son alarmantes, lo que

evidencian la importancia del desarrollo de programas y métodos de control.

II.5.2. Síndromes clínicos

La infección sintomática por virus del dengue puede presentarse como cualquiera

de los siguientes cinco síndromes clínicos: fiebre indiferenciada, fiebre de dengue,

dengue hemorrágico, síndrome de choque por dengue y las manifestaciones inusuales.

Fiebre indiferenciada

La fiebre indiferenciada es la manifestación más común del dengue. Un estudio en

Tailandia, encontró que entre estudiantes de cuatro a dieciséis años de edad infectados

por el virus del dengue, el 87% fueron asintomáticos o levemente sintomáticos. Otros

22

estudios que han incluido participantes de todos los grupos de edad también demuestran

una transmisión silenciosa.

Fiebre de dengue

La fiebre de dengue, conocida también como dengue clásico o fiebre quebranta

huesos, es una enfermedad viral caracterizada por un comienzo súbito en sus síntomas.

Estos incluyen: fiebre, dolor en los músculos y articulaciones, erupciones en la piel, dolor

de cabeza intenso, dolor detrás de los ojos, náuseas, vómitos y manifestaciones

hemorrágicas. Los síntomas asociados con esta fase aguda de la enfermedad usualmente

duran entre cinco a siete días.

Esta fase aguda es seguida por un período de convalecencia de una a dos semanas,

caracterizado por debilidad, malestar y anorexia. Otros síntomas que pueden estar

asociados al período de convalecencia de dengue incluyen picor en la piel y

manifestaciones neurológicas. Más tarde, y con carácter temporero, puede surgir;

depresión, pérdida de visión y pérdida de cabello.

Un diagnóstico definitivo de fiebre de dengue requiere de pruebas específicas de

laboratorio debido a que la presentación clínica del dengue puede parecerse a la de otras

enfermedades como la influenza, el sarampión y la leptospirosis. Las manifestaciones

hemorrágicas de la fiebre de dengue incluyen hemorragias cutáneas como petequias,

púrpura y equimosis, sangrado gingival, sangrado nasal, sangrado gastrointestinal, sangre

en la orina y aumento del flujo menstrual. Hasta una tercera parte de los pacientes pueden

tener manifestaciones hemorrágicas. Estas manifestaciones generalmente son leves, pero

en algunos casos la hemorragia puede ser severa y hasta causar choque por la pérdida de

sangre.

Dengue hemorrágico

De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, un caso de dengue hemorrágico

debe cumplir con cuatro criterios. Éstos son:

- Fiebre o historial reciente de fiebre aguda.

- Alguna manifestación hemorrágica. Ésta puede ser espontánea, como por

ejemplo petequias, sangrado gastrointestinal, sangrado en las encías, sangrado vaginal,

23

sangrado en la orina, o cualquier otro tipo de sangrado, o puede ser provocada por una

prueba de torniquete.

- Trombocitopenia, es decir, un conteo de plaquetas de 100.000/mm3 o menos.

- Evidencia objetiva del problema patofisiológico subyacente en dengue

hemorrágico, es decir, un aumento de la permeabilidad capilar, documentada por un

hematocrito elevado o efusiones, hipoalbuminemia o hipoproteinemia.

A base de estudios clínicos reconocidos por la Organización Mundial de la Salud el

dengue hemorrágico se puede clasificar en cuatro grados de severidad. Éstos son:

--Grado I: La persona experimenta fiebre y síntomas no específicos. La única

manifestación hemorrágica es la provocada por una prueba de torniquete positiva.

--Grado II: Se presentan las manifestaciones del grado I, pero con hemorragia

espontánea en lugar de provocada.

--Grado III: Ocurre un choque incipiente, con señales de insuficiencia

circulatoria, es decir, aceleración y debilitamiento del pulso, hipotensión, estrechamiento

de la tensión arterial y piel húmeda y fría.

--Grado IV: Las manifestaciones más comunes son: choque profundo y presión

arterial y pulso no detectables.

Para cada uno de estos grados de severidad se deben cumplir los cuatro criterios de la

definición de dengue hemorrágico, aunque en estado de choque la prueba de torniquete

no es confiable. Los grados III y IV se consideran síndrome de choque por dengue.

Síndrome de choque por dengue

Un caso clínico de síndrome de choque por dengue debe cumplir con los cuatro criterios

de un caso de dengue hemorrágico y además manifestar insuficiencia circulatoria

evidenciada por la aceleración y debilitamiento del pulso, hipotensión, estado mental

alterado y piel húmeda y fría. El choque franco o la carencia de oxigenación suficiente en

los órganos vitales debido a una presión arterial muy baja es, por supuesto, evidencia de

insuficiencia circulatoria.

24

Existen determinadas señales de alarma en los casos de dengue hemorrágico que

se deben observar para prevenir que evolucionen a síndrome de choque por dengue. La

mayor parte de las personas con dengue hemorrágico no entran en choque. Aquellos

casos que llegan a choque presentan ciertas señales de peligro antes de manifestar

insuficiencia circulatoria. La mayoría de los pacientes que desarrollan el síndrome de

choque por dengue lo hacen de tres a seis días después del comienzo de los síntomas.

Una fiebre que continúa entre tres y seis días después del comienzo de los síntomas es

una señal de alerta y el paciente debe ser observado cuidadosamente. El choque ocurre

con frecuencia en el momento en que la fiebre desaparece. Una disminución en el número

de plaquetas o un aumento de hematocrito también son señales de alerta.

Si se documenta trombocitopenia y hemoconcentración, es decir, un aumento en

el número y producción de células sanguíneas debido a una disminución del volumen de

plasma, y además, el paciente muestra otras señales de dengue hemorrágico y cumple con

los cuatros criterios de la Organización Mundial de la Salud para dengue hemorrágico, se

puede determinar que su riesgo de muerte ha aumentado.

La fiebre de dengue no tiene una mortandad alta. En cambio, el riesgo de muerte

es mayor en pacientes con dengue hemorrágico. En ese caso se debe estar alerta a cuatro

señales de peligro. Éstas son:

-dolor abdominal intenso y mantenido

-vómitos persistentes

-cambio abrupto de fiebre a hipotermia, con sudoración y postración

-cambio en el estado mental del paciente que incluya agitación o letargo.

Cualquiera de estas señales indica una situación de choque inminente. Estos pacientes

necesitan observación cuidadosa y fluidos intravenosos. La meta del tratamiento es evitar

el choque. Si se administran suficientes fluidos como para evitar el choque, la

enfermedad deberá resolverse por sí misma.

25

Manifestaciones inusuales

En los últimos años han aumentado los informes publicados sobre manifestaciones poco

usuales del dengue. Las manifestaciones inusuales que se mencionan con más frecuencia

son: fallo hepático, fiebre de dengue con sangrado y desórdenes neurológicos. Menos

comunes, pero bien documentados, son los casos con síntomas encefalíticos como

convulsiones, alucinaciones, letargo, confusión y coma, y los casos con alteración del

ritmo cardiaco. Aunque no es usual, la fiebre de dengue puede en ocasiones ser grave y el

paciente puede morir, pero sin progresar a través del dengue hemorrágico. Estos

pacientes pueden presentar encefalopatía, insuficiencia hepática o hepatitis fulminante.

II.6. Detección del VD en el laboratorio La detección de anticuerpos por medio de un ELISA (por sus siglas en inglés,

Enzyme -Linked Immunosorbent Assay) y el aislamiento del virus de muestras de

pacientes, son dos procedimientos frecuentemente utilizados en el laboratorio para

evaluar una infección por VD.

El aislamiento viral y las pruebas de neutralización en placa (PRNT) a partir de

Figura 1: Viremia en suero de pacientes con VD en función a días post-síntomas febriles. Fuente: TDR / WHO and PDVI Workshop 4-6 Oct 2004.

Día de desaparición de fiebre

26

muestras de suero utilizando líneas celulares (Komar et al, 2001) o mosquitos vivos

(Kuberski y Rosen, 1977) es considerado el método de referencia ó “gold standard”. En

la enfermedad causada por el VD, la viremia aumenta típicamente antes del comienzo del

cuadro febril, de 4 a 5 días previos a la presencia de síntomas, luego presenta un pico a

los 2 ó 3 días de haberse iniciado la fiebre y finalmente disminuye, coincidiendo con la

desaparición de los síntomas febriles (figura 1, página 17). Cuando el diagnóstico de una

infección primaria por VD se realiza mediante aislado viral, se debe tener en cuenta la

fecha de la toma de la muestra, ya que fuera del período de viremia mencionado la

probabilidad de aislar VD cultivable es mucho menor. Esto suele limitar mucho la

aplicación de este método en el diagnóstico. Sumado a ello, dicho método al igual que el

PRNT, requiere de amplia experiencia por parte del profesional, suele ser muy costoso y

toman mucho tiempo hasta llegar a un resultado. Es por ello que se suele recurrir a las

pruebas serológicas, menos costosas y más rápidas, para elaborar un diagnóstico en el

laboratorio.

Los tests serológicos consisten en ELISAs de captura que evalúan los niveles de

IgM e IgG en muestras de suero (Martin et al, 2000ª; 2000b). En una infección primaria

por VD, los niveles de IgM son detectables al tercer día de iniciado el cuadro febril. El

título de IgM va en aumento en las siguientes 3 semanas y permanece detectable hasta 2

meses post-infección. Los anticuerpos IgG, por el contrario, son producidos

aproximadamente 2 semanas después de una infección y se mantienen circulantes de por

vida. En una infección secundaria por VD, el perfil de anticuerpos IgM e IgG es distinto.

Mientras que el título de IgG aumenta repentinamente a los 3-5 días de presentarse la

fiebre, la IgM registra un aumento más modesto. De acuerdo a ello, la evaluación por

ELISA de los niveles de IgM e IgG en suero a los 5-7 días de iniciado el cuadro febril,

permite diferenciar una infección primaria de una secundaria. Siguiendo este

razonamiento, la presencia de anticuerpos IgM en ausencia de IgG revelará una infección

primaria, mientras que la presencia de IgG acompañada de una modesta cantidad de IgM

desenmascarará una infección secundaria por VD (figuras 2A y 2B, página 18).

Una diferencia relevante entre las ecologías de Guatemala y otras regiones de

Norteamérica como Estados Unidos, es la circulación amplia de otros flavivirus,

incluyendo el patógeno humano VD y otros como VFA y VON. En este escenario, los

27

ensayos serológicos suelen responder a limitaciones relacionadas con la naturaleza

antigénica de los flavivirus. Además de compartir morfología y estructura genómica, los

flavivirus comparten determinantes antigénicos que pueden complicar el diagnóstico de

infecciones por VD mediante los ensayos serológicos clásicos. De hecho, una exposición

a un flavivirus relacionado es suficiente para que en el suero convaleciente del paciente

se detecten anticuerpos con reacción cruzada a VD.

Esta relación serológica entre el VD y otros flavivirus fue demostrada en 1950 por

Sabin, quien reportó reacciones cruzadas de sueros humanos convalecientes anti-dengue

con antígenos de VFA, VEJ y VON (Sabin, 1950).

También se ha demostrado una respuesta inmune anamnésica en pacientes

inmunizados al VFA y posteriormente expuestos al VD o inmunizados con antígenos de

VD (Sabin, 1950). En resumen, los cuatro serotipos de VD pertenecen a la familia

Flaviviridae, junto el VFA y el VON, entre otros.

Durante una infección por VD si bien los anticuerpos IgM producidos tendrán una

alta actividad contra el serotipo de VD involucrado, también tendrán reactividad cruzada

apreciable con otros flavivirus.

Esto sugiere que el ensayo serológico es insuficiente para elaborar un diagnóstico

etiológico concluyente en pacientes previamente expuestos a otros flavivirus o en co-

infecciones.

Teniendo en cuenta que en toda la región Centroamericana, incluyendo

Guatemala, co-circulan distintos miembros de la familia Flaviviridae, esta información

sugiere que los ensayos serológicos deberían complementarse con algún otro ensayo que

permita determinar qué flavivirus es responsable de la infección.

Más aun, la identificación del tipo específico de flavivirus, en este caso VD,

también debería ser parte del diagnóstico ya que conocer qué virus están circulando

podría ayudar a predecir la aparición de la manifestación más severa de la enfermedad, la

cual comienza con síntomas febriles que no se distinguen de una simple fiebre por VD.

De hecho, estudios recientes han demostrado que la presencia de los serotipos

Den-1 y Den-2 pueden influenciar el grado de severidad de la enfermedad (Sangkawibha

et al, 1984). Asociado a ello, esta información permitiría identificar los factores de riesgo

particulares, que siguen siendo controversiales y no congruentes entre regiones

28

posiblemente debido a las diferencias culturales y al estado inmunológico de la población

afectada.

Varios autores han identificado esta dificultad, por lo que se han descrito un

número importante de enfoques moleculares, basados en la detección de una región

específica del ARN viral a través del RT-PCR (por sus siglas en ingles Reverse

Transcription Polymerase Chain Reaction; Lanciotti et al, 1992, Harris et al, 1998, Laue

et al, 1999, Johnson et al, 2005). La implementación de estas pruebas ha surgido como

una fuerte alternativa al aislamiento viral ya que son menos costosas, mas rápidas y muy

Figura 2A: Niveles séricos de IgM e IgG durante una infección primaria por VD en función a días pre- y post-síntomas febriles. Fuente: TDR / WHO and PDVI Workshop 4-6 Oct 2004.

Día de desaparición de fiebre

Figura 2B: Niveles séricos de IgM e IgG durante una infección secundaria por VD en función a días pre- y post-síntomas febriles. Fuente: TDR / WHO and PDVI Workshop 4-6 Oct 2004.

Día de desaparición de fiebre

IgM

IgM

IgG

IgG

29

sensibles y, de acuerdo al protocolo seleccionado, ofrecen ventajas muy importantes

como la posibilidad de diferenciar los cuatro serotipos del VD y la detección del ARN

viral hasta el décimo día de iniciados los síntomas (De Paula et al, 2004).

La utilidad del RT-PCR en tiempo real en sus distintos formatos ya ha sido

demostrada en laboratorios de Centroamérica como Nicaragua, Bolivia y Ecuador

(Balmaceda et al, 1999, Harris et al 1998; Peredo et al, 1999), países donde el VD es

endémico. En Guatemala, el grupo de investigación de enfermedades arbovirales del

Centro de Estudios en Salud de la UVG está llevando a cabo un estudio de transmisión de

VON en animales (aves, caballos y mosquitos) y ha demostrado la gran utilidad de esta

tecnología para identificar infecciones por flavivirus (Morales et al, 2006, en prensa).

En el marco de las limitaciones anteriormente expuestas, nuestro objetivo es

extender dicha tecnología a la detección y tipificación del VD, para aumentar la

capacidad de detección del VD en el laboratorio, con fines inmediatos en salud pública y

a largo plazo para estudios epidemiológicos, como ya se esta haciendo en diversos países.

30

PARTE III

RESULTADOS

III.1. Implementación

Durante la primera fase del proyecto se llevó a cabo la implementación de los

protocolos necesarios para el presente estudio. En primer lugar se trabajó el protocolo de

RT-PCR en tiempo real basado en aquel descripto por Johnson y colaboradores, de CDC

Fort Collins para luego abordar el procedimiento de ELISA IgM/IgG según Martin y

colaboradores. En la sección de Materiales y Métodos se detallan los protocolos

implementados.

Se inició el proceso de estandarización utilizando ARN viral de dengue 2,

obtenido de mosquitos Aedes aegypti infectados. Estos mosquitos infectados fueron

donados por el Dr. Alvaro Molina del Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos

(NIH). Como primer paso se extrajo el ARN viral, utilizando el kit QIAamp viral RNA

mini Kit (Qiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Luego, se utilizó el kit de

Qiagen denominado “QuantiTect Probe RT-PCR kit” para hacer las primeras pruebas de

PCR porque era el único kit con el que se contaba en ese momento, pero no se logró

obtener resultados reproducibles y confiables. Por esta razón fue necesario adquirir el kit

“iScript One-Step RT-PCR” (BIO RAD). Con este kit se logró estandarizar el PCR en

tiempo real para la detección del serotipo 2 de dengue, y posteriormente para los demás

serotipos, con resultados óptimos. Esto se puede observar en las gráficas representativas

que se adjuntan al documento, donde las curvas obtenidas con el kit mencionado de la

casa comercial BioRad son las esperadas (Figuras 1-3).

Con estas pruebas de estandarización también se determinó que la mejor dilución

para el control positivo es de 1/500, porque se obtuvieron resultados con alta

reproducibilidad y no se ve afectada la sensibilidad de la prueba.

31

Debido a los altos costos tanto de la sonda como del kit para PCR, se hicieron

pruebas para tratar de disminuir los volúmenes de reacción, por lo que se logró una

detección óptima del virus utilizando un volumen de 25ul de reacción en lugar de 50ul,

que es el volumen de una reacción de PCR estándar.

Cabe señalar que no se encontraron limitaciones mayores durante el proceso de

implementación de la técnica.

Figura 1: Protocolo Kit QuantiTect Probe RT-PCR casa comercial Qiagen;

concentraciones finales ensayadas- de sonda 0.2uM y cebadores 1uM.

Fuente FODECYT 012-2007

32

Figura 2: Protocolo Kit QuantiTect Probe RT-PCR casa comercial Qiagen.

Concentraciones finales ensayadas- de sonda 0.1uM y cebadores 0.5uM.

Fuente FODECYT 012-2007

Figura 3: Protocolo Kit iScript One-Step RT-PCR casa comercial BIO RAD.

Fuente FODECYT 012-2007

33

III.2. Resultados de la investigación

El diagnóstico de una infección por VD se basó en las técnicas de RT-PCR

tiempo real y ELISA para IgM/IgG. La positividad de alguna de estas pruebas, y no

necesariamente ambas, confirmó el diagnóstico de dengue en un paciente.

En total, se obtuvieron 533 muestras de suero agudo de pacientes sospechosos de

EINAs que participaron del estudio. Como se descartaron aquellos casos presentando

etiología bacteriana, se analizaron un total de 497 muestras por ELISA y RT-PCR tiempo

real, encontrándose 12 positivos para VD (12/497; 2.4%). La edad media del grupo de

pacientes con infección viral fue de 23.3 años (rango 0.1 a 53 años), con 18.2 % mujeres

y 81.8% hombres. El 80% de los casos de VD ocurrió durante la época lluviosa,

abarcando Mayo a Octubre inclusive. Las manifestaciones clínicas de dichos pacientes se

detallan en la Tabla II.

El 25% (3/12) de las infecciones fueron detectadas por medio del RT-PCR tiempo

real, mientras que el restante 75% (9/12) mediante el ensayo serológico. En ningún caso

una muestra de suero fue positiva por ELISA y RT-PCR tiempo real simultáneamente

(Tabla III). Cabe destacar, que si bien no era parte de este estudio, también se analizaron

(por ambas técnicas) las muestras de LCR de los 12 pacientes positivos, obteniéndose

resultados similares. En los LCR de los 3 casos positivos por RT-PCR tiempo real en

suero, también se detectó ARN viral de VD. Además, en las otras 9 muestras de LCR se

detectaron anticuerpos IgM, resultados que concuerdan con los sueros de esos mismos

pacientes (Erica Dueger, resultados no publicados).

Respecto a la distribución de serotipos de VD detectados por RT-PCR tiempo

real, no se registraron infecciones con los serotipos 3 y 4, mientras que se encontraron 2

casos de DEN-1 y 1 caso de DEN-2.

En la Figura 4 se presentan los resultados obtenidos por RT-PCR tiempo real y

ELISA, teniendo en cuenta el tiempo transcurrido entre el inicio de los síntomas y la

34

fecha de toma de la muestra. De acuerdo a ello, se observa que todas las muestras

positivas por RT-PCR tiempo real fueron tomadas hasta 2 días después del inicio de

síntomas (promedio 1.33, rango 1-2) mientras que la ventana de detección del diagnóstico

serológico fue más amplia (promedio 10.77, rango 3-18) siendo significativa la diferencia

entre medias (p=0.01, Mann-Whitney U-Test).

En el estudio, la obtención de muestra convaleciente fue exitosa en un 43% de los

casos. Al examinar los anticuerpos IgG anti-VD en muestras pareadas por ELISA, se

encontró que un 28% (60/ 213 pares) eran positivas. Sin embargo, ninguno de estos

sueros evaluados fue IgM positivo ni presentó viremia activa (PCR negativo) y además,

en ningún caso se registró un aumento en el título de anticuerpos IgG en la muestra

convaleciente.

35

FIGURAS Y TABLAS

Tabla II: Manifestaciones clínicas de los 12 pacientes con infección por VD y síndrome neurológico

Tabla II: Manifestaciones clínicas de los pacientes con VD y síndrome neurológico

n (%) Fiebre 12 (100) Diarrea 8 (66.6) Dolor muscular 8 (66.6) Dificultas para caminar 8 (66.6) Vómitos 7 (58.3) Alteración de la conciencia 7 (58.3) Náusea 6 (50.0) Dolor de articulaciones 6 (50.0) Dolor generalizado 6 (50.0) Cambios en la personalidad 6 (50.0) Dolor de cabeza 6 (50.0) Vértigo 6 (50.0) Dificultad para hablar 5 (41.6) Dolor de garganta 5 (41.6) Convulsiones 4 (33.3)

Fuente: FODECYT 012-2007 Tabla III: Comparación de los resultados obtenidos por RT-PCR tiempo real y ELISA IgM; las casillas reflejan el número de casos; Pos= positivo; Neg=negativo. RT-PCR tiempo real ELISA IgM

Pos Neg Total Pos 0 9 9 Neg 3 485 488 Total 3 494 497

Fisher Exact Test; Odds ratio PCR versus ELISA 0.44; p=0.16 Fuente: FODECYT 012-2007

36

Figura 4: Resultados obtenidos por las técnicas de RT-PCR tiempo real y ELISA IgM, en muestras de suero agudo de pacientes febriles con EINA, de acuerdo a los días de inicio los síntomas.

1 2 3 4 5 6 7 o más

0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0

%

Días

Días Post- Síntomas 1 2 3 4 5 6 7 ó más

No. Muestras 52 106 68 44 47 34 144 RT-PCR tiempo real (3.80) (0.90) (0) (0) (0) (0) (0) ELISA IgM (0) (0) (1.5) (2.3) (0) (2.9) (4.2)

Fuente: FODECYT 012-2007

RT-PCR tiempo real

ELISA IgM

37

III.3. DISCUSION DE RESULTADOS

La detección temprana del VD en un paciente es lo que permite establecer una

respuesta rápida en las zonas afectadas, respuesta frecuentemente orientada al control del

vector. Hoy en día no existe una vacuna o cura para la enfermedad causada por el VD,

por lo que el desarrollo de programas de vigilancia, basados en la detección del VD por

técnicas de laboratorio adecuadas, emerge como un asunto de prioridad en materia de

salud pública, no solamente a nivel clínico sino también a nivel nacional, para lograr

proveer señales tempranas de una posible epidemia.

Con el fin de aumentar la capacidad de laboratorio para la detección del VD, en el

presente estudio retrospectivo se implementó un abordaje molecular, en combinación con

un ensayo serológico, para apoyar el diagnóstico de pacientes febriles con afección

neurológica. El estudio reveló un 2.4% de infección con VD, en concordancia con

resultados de otros autores, quienes han reconocido manifestaciones anormales del

sistema nervioso central asociadas a un cuadro clínico de dengue (Hendarto y

Hadinegoro, 1992; Patey et al, 1993; Ramos et al, 1998).

En los resultados del presente trabajo, se encontró que sólo una cuarta parte del

total de casos positivos para VD, fueron RT-PCR tiempo real positivos. Es importante

destacar que el tiempo de recolección de las muestras es crucial en la interpretación de

los resultados del RT-PCR tiempo real por la duración de la viremia. En la enfermedad

causada por el VD, la viremia aumenta típicamente antes del comienzo del cuadro febril,

de 4 a 5 días previos a la presencia de síntomas, luego presenta un pico a los 2 ó 3 días de

haberse iniciado la fiebre y finalmente disminuye, coincidiendo con la desaparición de

los síntomas febriles. Por otro lado, los niveles de IgM son detectables a partir del tercer

día de iniciado el cuadro febril y hasta 2 meses post-infección. En consecuencia, es de

esperar que el test serológico sea mas efectivo en muestras tardías, siendo el RT-PCR

tiempo real aplicable a muestras agudas tempranas, tomadas cuando el paciente aun

presenta un cuadro febril y no al acudir al servicio de salud en un estadío más avanzado

de la enfermedad. Nuestros resultados concuerdan con lo anteriormente expuesto, ya que

38

las muestras de los 3 casos detectados por medio del RT-PCR tiempo real habían sido

recolectadas hasta 2 días posteriores de iniciados los síntomas, al tiempo que la prueba de

ELISA IgM evidenció mas de la mitad de las infecciones (75%; 9/12) en muestras

tomadas a partir de los 3 días de iniciados los síntomas.

La utilidad del RT-PCR tiempo real para la detección de VD en muestras clínicas

ya ha sido demostrada en laboratorios de Latinoamérica como Nicaragua, Bolivia y

Ecuador (Balmaceda et al, 1999, Harris et al 1998; Peredo et al, 1999), países donde el

VD es endémico. La ventaja que ofrece esta técnica por sobre otras como la serología,

reside en la identificación del serotipo de VD circulante, información que es de suma

importancia considerando que la infección con un serotipo constituye un factor de riesgo

para el desarrollo del DH (Leong et al, 2007). En nuestro estudio, en los tres casos

analizados se identificó serotipo 1 (2/3) y serotipo 2 (1/3), coincidiendo con los reportes

del Laboratorio Nacional de Salud, laboratorio de referencia en Guatemala, sobre los

serotipos circulantes en los años 2006 y 2007 (WHO). Asimismo, es importante destacar

que en el marco de un Proyecto de Vigilancia de Enfermedades Febriles bajo el Acuerdo

Cooperativo entre el Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC,

Atlanta) y la Universidad del Valle de Guatemala, nuestro grupo de investigación

actualmente está aplicando el protocolo implementado en el presente proyecto para

apoyar el diagnóstico de cuadros febriles de origen desconocido y para identificar el

serotipo de dengue circulante. Esta información es compartida con las autoridades del

Laboratorio Nacional de Salud, contribuyendo así con las autoridades sanitarias en cuanto

a la epidemiología molecular del VD.

El presente estudio reveló un 28% de muestras negativas a IgM pero positivas a

IgG sin cambios en el título de IgG en la muestra convaleciente. Debido a la persistencia

de anticuerpos IgG y su prevalencia en áreas endémicas como la nuestra, una simple

muestra de suero demostrando la presencia de estos anticuerpos tiene significado clínico

limitado. Así, la detección de IgG como método diagnóstico depende de la toma de

muestras pareadas que demuestren un cambio de título de por lo menos cuatro veces,

entre la fase aguda y convaleciente, a menos que la muestra única posea un título

39

sugestivo de infección secundaria (Vordam et al, 1997). Esto sugiere, que la probabilidad

de encontrar pacientes que fueran negativos para IgM pero positivos para IgG son altas y

por tanto, las pruebas serológicas con ambos tipos de anticuerpos es de vital importancia

en zonas endémicas.

Una diferencia relevante entre las ecologías de Guatemala y otras regiones de

Norteamérica como Estados Unidos, es la circulación amplia de otros flavivirus,

incluyendo el patógeno humano VD y otros como el Virus del Oeste del Nilo (Morales-

Betoulle ME et al, 2006). En este escenario, los ensayos serológicos suelen responder a

limitaciones relacionadas con la naturaleza antigénica de los flavivirus ya que, además de

compartir morfología y estructura genómica, los flavivirus comparten determinantes

antigénicos que pueden complicar el diagnóstico de infecciones mediante los ensayos

serológicos clásicos. Esto sugiere que el ensayo serológico es insuficiente para elaborar

un diagnóstico etiológico concluyente en pacientes previamente expuestos a otros

flavivirus o en co-infecciones. Teniendo en cuenta dichos antecedentes, las muestras de

los pacientes con diagnóstico sospechoso de VD del presente estudio, fueron evaluadas

en CDC Fort Collins por otras técnicas serológicas y por la prueba de neutralización por

reducción en placa (PRNT por sus siglas en inglés Plaque Reduction Neutralization Test),

para descartar reactividad cruzada a otros flavivirus y alfavirus. Los resultados negativos

para SLE, WNV y VEE junto con los resultados positivos para VD, respaldaron el

diagnóstico de VD en los 12 casos de nuestra investigación (Erica Dueger, resultados no

publicados).

En resumen, en nuestro estudio se comprueba la hipótesis planteada, demostrando

el valor agregado de la aplicación conjunta de una técnica serológica como el ELISA para

la detección de anticuerpos, y el RT PCR tiempo real para detección del RNA viral. Debe

tenerse en cuenta sin embargo, que la ventana de aplicación de cada una de estas

poderosas herramientas depende en gran medida del momento en que se ha tomado la

muestra, respecto al inicio de síntomas. Esta información tan útil puede guiar al personal

de salud en la lectura de resultados de laboratorio, para poder así brindar un diagnóstico

acertado y oportuno.

40

PARTE IV

IV. CONCLUSIONES

IV. 1. Conclusiones Objetivos específicos y recomendaciones asociadas

IV. 1. 1. Conclusiones Objetivos a) y b)

a) Estandarizar el protocolo de ELISA de captura para IgG con el fin de determinar el

título de anticuerpos para VD en muestras de sueros agudos y convalecientes de pacientes

con síntomas febriles y enfermedades infecciosas neurológicas agudas.

b) Evaluar los niveles de IgM e IgG, mediante un ELISA de captura, en muestras de

suero de pacientes con síntomas febriles, colectados en los departamentos de Zacapa,

Esquintla, Santa Rosa y Guatemala.

La técnica de ELISA para la detección de anticuerpos IgM/IgG ha sido

implementada en el laboratorio del Centro de Estudios en Salud de la Universidad

del Valle de Guatemala.

El ELISA para la detección de anticuerpos IgM/IgG es una herramienta muy

valiosa para el diagnóstico diferencial de enfermedad por VD. La misma se aplicó

exitosamente en pacientes con EINAs, revelando infecciones que no habían sido

detectadas por una técnica sofisticada como el RT PCR tiempo real.

----Recomendación: los reactivos pueden adquirirse en casas comerciales de

Guatemala y el protocolo no presenta mayores dificultades a la hora de ejecutarse.

Se recomienda la incorporación de esta técnica a laboratorios de hospitales y

centros de salud.

IV. 1. 2. Conclusiones Objetivos c) y d)

c) Estandarizar el protocolo de RT-PCR en tiempo real para los serotipos 1, 2, 3 y 4 de

VD en muestras de pacientes con síntomas febriles.

41

d) Estudiar, mediante la técnica de RT-PCR en tiempo real para los cuatro serotipos de

VD, la presencia del ARN viral en muestras de suero de pacientes febriles, colectados en

los departamentos de Zacapa, Esquintla, Santa Rosa y Guatemala.

La técnica de RT PCR tiempo real ofrece la ventaja de ser más rápida y muy

sensible. Además, puede discriminar por serotipo. La misma ha sido

implementada en el laboratorio.

La reactividad cruzada entre Flavivirus representa un gran problema para la

vigilancia epidemiológica, control y prevención del dengue, por lo que nuevas

estrategias de diagnóstico de laboratorio son necesarias para suministrar un

diagnóstico específico así como también para describir el posible patrón de

dispersión de los serotipos circulantes. Es por ello, que la herramienta

implementada apoya fuertemente el estudio de la epidemiología molecular del

virus, en una región endémica donde la enfermedad por V constituye un problema

de gran importancia a nivel de salud pública.

----Recomendación: los reactivos y materiales necesarios para llevar a cabo este

protocolo pueden adquirirse en casas comerciales de Guatemala y luego de una

capacitación breve, la misma puede implementarse en otros laboratorios

dedicados a la salud pública. De hecho, este protocolo fue transferido al

Laboratorio nacional de Salud quienes actualmente están aplicándolo.

----Recomendación: aunque no son comunes las manifestaciones neurológicas en

el marco de una enfermedad por VD, el presente estudio sugiere que en

Guatemala el personal de salud debe tener en mente esta evidencia en el

diagnóstico diferencial de encefalitis y su manejo clínico.

IV. 1. 3. Conclusiones Objetivo e)

e) Establecer el tipo de asociación que existe entre la detección de una infección por VD

en muestras de pacientes y las técnicas utilizadas -ELISA y RT-PCR en tiempo real-

como herramientas de diagnóstico.

42

El análisis estadístico reveló que la ventana de detección del diagnóstico

serológico fue significativamente más amplia respecto de la ventana de detección

del diagnóstico molecular.

----Recomendación: concientizar al personal de salud y al personal de laboratorio

sobre la importancia de obtener datos fieles sobre la fecha de toma de muestra y el

inicio de síntomas para poder establecer conclusiones adecuadas sobre los

resultados obtenidos por diferentes técnicas.

IV. 1. 4. Conclusión General

Muchos casos de enfermedad febril causada por VD no pueden ser diagnosticados

mediante criterios clínicos. Por lo tanto, el diagnóstico diferencial por laboratorio es de

vital importancia, para distinguir un DC y/o DH de otras enfermedades tropicales,

sobretodo en países como Guatemala donde el dengue es endémico. Recurrir a las

pruebas serológicas para elaborar un diagnóstico de infección por VD, sigue siendo la

opción mas acertada, en un contexto donde los escasos recursos financieros y la búsqueda

de servicios de salud en estadios avanzados de la enfermedad, suelen limitar la aplicación

del RT-PCR tiempo real, aun cuando éste ofrezca notables ventajas como la

discriminación por serotipo.

43

IV.2 RECOMENDACIONES

De acuerdo a lo expuesto anteriormente se sugiere implementar las técnicas

serológicas en las instituciones de salud, así como también fortalecer el envío de muestras

al Laboratorio Nacional de Salud, laboratorio de referencia de Guatemala, para que

mediante el protocolo de RT-PCR tiempo real se logre la caracterización de serotipos de

VD circulantes. Asimismo, debe haber coordinación entre el Centro Nacional de

Epidemiología y el Laboratorio Nacional de Salud en cuanto a publicación de resultados

y elaboración de reportes pertinentes.

Es importante señalar que se debe mantener una capacitación continua para los

médicos que toman las muestras y los técnicos de laboratorio, para que aprecien las

limitaciones de cada técnica, en cuanto a la ventana de detección de los virus y

anticuerpos a través de la evolución de la enfermedad. Así, una muestra que se desea

evaluar a través de una técnica de biología molecular como el PCR debe ser tomada

durante el período febril, mientras que para serología se debe esperar unos días para dar

tiempo a que se manifieste la respuesta inmune.

Es muy importante el trabajo en colaboración con otros países de la región para

monitorear la circulación de serotipos ante un eventual situación de brote o re-aparición

de un serotipo particular, sobretodo teniendo en cuenta que la infección con un serotipo

constituye un factor de riesgo para el desarrollo de dengue hemorrágico.

Finalmente, los protocolos implementados en este estudio serán impartidos en un

taller a colegas del Laboratorio Nacional de Salud, cuyo principal contacto ha sido la Lic

Leticia Castillo, quien ha colaborado ampliamente con el proyecto.

44

IV. 3. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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49

PARTE V V. INFORME FINANCIERO

UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA OFICINA ADMINISTRATIVA DEL INSTITUTO DE INVESTIGACIONES

Registros correspondientes al 12 de Febrero del 2009

Nombre del Proyecto: Implementación de Pruebas para el Diagnóstico Diferencial de Dengue: RT-PCR en Tiempo Real y Elisa IgG

Código del Proyecto: FODECYT 012-2007

Investigador Principal : Dra. Alejandra Estevez Fecha: 01 de Septiembre del 2007 al 31 de Agosto del 2008 Prorroga del 01 de Septiembre de 2008 al 28 de Febrero del 2009 Duración 12 Meses Prorroga 6 meses

18 meses

FICHA DE EJECUCIÓN PRESUPUESTARIA DEL PROYECTO

RENGLÓN DESCRIPCIÓN AUTORIZADO TRANSFERENCIAS AUTORIZADAS

AJUSTADO EJECUTADO SALDO

GRUPO 1

181 Estudios, investigaciones y proyectos de factibilidad

78,000.00

-

- 78,000.00 39,000.00 39,000.00

181 Estudios, investigaciones y proyectos de factibilidad: Evaluación externa de Impacto

8,000.00

-

- 8,000.00 8,000.00 -

GRUPO 2

241 Papel de escritorio

5,350.00

(5,350.00)

- - - -

261 Elementos y compuestos químicos

62,061.26

-

- 62,061.26 60,540.54 1,520.72

295 Útiles menores médico-quirúrgicos y de laboratorio

69,989.90

-

- 69,989.90 47,437.21 22,552.69

GRUPO 3

323 Equipo médico-sanitario y de laboratorio

7,550.50

(6,618.00)

5,350.00 6,282.50 5,818.44 464.06

329 Otras maquinarias y equipos

-

6,618.00 6,618.00 6,618.00 -

Gastos Administrativos

23,095.17

-

- 23,095.17 23,095.17 -

TOTALES Q 254,046.83 Q (11,968.00) Q 11,968.00 Q 254,046.83 Q 190,509.36 Q 63,537.47

(-) (+)