CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA –CONCYT–

SECRETARÍA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA –SENACYT–

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA –FONACYT–

INSTITUTO DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA AGRÍCOLAS –ICTA–

INFORME FINAL

Validación de una metodología de selección asistida con

marcadores moleculares en el mejoramiento genético del frijol

(Phaseolus vulgaris L.) para resistencia al virus del mosaico

dorado (BGYMV-GA; Begomovirus, Geminiviridae)

PROYECTO FODECYT No. 42-2008

HÉCTOR ALFREDO SAGASTUME MENA

Investigador principal

GUATEMALA, OCTUBRE DE 2011.

ii

AGRADECIMIENTOS:

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del

Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología -FONACYT-, otorgado por la Secretaría

Nacional de Ciencia y Tecnología –SENACYT- y el Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnología -CONCYT-.

iii

EQUIPO DE INVESTIGACIÓN:

Ing.Agr.MSc. Héctor Alfredo Sagastume Mena

Investigador Principal

Licda. Bioq. MSc. Karla Melina Ponciano Samayoa

Investigadora Asociada

Ing.Agr. Julio César Villatoro Mérida

Investigador Asociado

Ing.Agr. Edgar Edgardo Carrillo Ramos

Investigador Asociado

iv

RESUMEN

El presente informe contiene los resultados obtenidos en la validación de una

metodología de selección asistida por los marcadores moleculares codominantes, tipo

SCAR, SR2 y SR21 en la población segregante obtenida de la retrocruza entre ICTA

Ligero y la F1 de la cruza entre ICTA Ligero y SEA15, en busca de plantas de frijol

portadoras del gen bgm-1 que confiere la resistencia al virus del mosaico dorado del frijol

(BGYMV). La variedad ICTA Ligero es portadora del gen de resistencia bgm-1 y SEA15

es portadora del gen susceptible Bgm-1. La población BC1F2 fue evaluada en una parcela-

vivero de BGYMV, observándose alta variabilidad fenotípica. Estos resultados no se

pudieron relacionar con el genotipo de las plantas seleccionadas debido al

desacoplamiento de las fases de campo y laboratorio. La población se avanzó a

generación BC1F4. Se establecieron modificaciones a los protocolos básicos de rutina

para adaptarlos al formato 96, que se utilizó por primera vez en ICTA para un proceso de

selección asistida por marcadores. Se estableció que las cajas de megatítulo son

ventajosas para el muestreo en campo e invernadero y se adaptan exitosamente a la

extracción alcalina de ADN. La calidad del ADN obtenido fue suficiente para amplificar

los marcadores SR2 y SR21 en el 70% de las muestras. Con base en el diagnóstico

molecular positivo y grano negro pequeño, se redujo la población inicial a 10 individuos

portadores del gen bgm-1, que podrán ser evaluados para correlacionar el fenotipo y

genotipo en el avance generacional de autofecundación requerido para liberar una nueva

variedad con resistencia a BGYMV.

v

SUMMARY

This study shows the results of the validation of a methodology of assisted

selection using co-dominant SCAR markers SR2 and SR21 in the segregating population

developed from the backcross ICTA Ligero X (ICTA Ligero X SEA15)F1 searching for

bean plants carrier of bgm-1 bean resistance gen which reduces BGYMV symptoms. The

parental ICTA Ligero contains bgm-1 resistance gen and SEA15 contains Bgm-1

sensitive gen. The population BC1F2 was evaluated on field conditions under BGYMV

stress where high phenotypic variability was observed. Those results were not compared

with the plants genotypes because of incompatibility between field and lab phases. The

segregating population was advanced until BC1F4 generation. The basic routine protocols

were modified to 96 wells format, which was use at ICTA for the first time for a Marker

Assisted Selection process. The use of cell culture megatiter plates was advantageous in

the field and greenhouse sampling and they were use successfully for alkaline DNA

extraction. The DNA quality was enough for PCR amplification of SR2 and SR21

markers in the 70% of the samples. The initial segregating population was reduced to 10

individuals that were positive for MAS and had small black seed. This new population

may be evaluated in the generational development of recombinant inbred lines to

compare their phenotype and genotype in order to release a new variety with BGYMV

resistance.

vi

ÍNDICE

Página

RESUMEN. iv

SUMMARY. v

LISTA DE CUADROS. viii

LISTA DE FOTOGRAFÍAS. ix

LISTA DE ABREVIATURAS. x

PARTE I

I.1. INTRODUCCIÓN. 1

I.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. 3

I.2.1. Antecedentes en Guatemala. 3

I.2.2. Justificación del trabajo de investigación. 3

I.3. OBJETIVOS E HIPÓTESIS. 4

I.3.1. Objetivos.

I.3.1.1. General. 4

I.3.1.2. Específicos. 4

I.3.2. Hipótesis. 4

I.4. METODOLOGÍA. 4

I.4.1. Localización. 4

I.4.2. Variables. 5

I.4.2.1. Variables dependientes. 5

I.4.2.2. Variables independientes. 5

I.4.3. Indicadores. 5

I.4.4. Estrategia metodológica. 5

I.4.5. Método. 5

I.4.6. Técnica Estadística. 11

I.4.7. Instrumentos utilizados. 11

PARTE II

II. MARCO TEÓRICO. 14

II.1. El corredor seco en Guatemala . 14

II.2. El frijol en Guatemala. 15

II.3. Los efectos, a nivel mundial, del mosaico dorado en el

cultivo del frijol. 16

II.4. El virus del mosaico dorado del frijol. 17

II.4.1. Síntomas. 18

II.4.2. Diseminación. 18

II.5. Historia del control genético del mosaico dorado del frijol. 18

vii

Página

II.6. Variedad de frijol ICTA Ligero. 19

II.7. Variedad de frijol SEA15. 20

II.8. El frijol desde el punto de vista molecular. 20

II.9. Selección asistida por marcadores moleculares para

resistencia al BGYMV. 24

PARTE III

III. RESULTADOS. 26

III.1. Discusión de resultados . 26

III.1.1.Establecimiento de la población segregante

sujeta a selección asistida por marcadores

moleculares. 26

III.1.2.Evaluación en campo de la respuesta de la

población al mosaico dorado. 26

III.1.3.Adaptación de la metodología de selección

asistida por marcadores moleculares de plantas

portadoras del gen bgm-1. 28

PARTE IV

IV.1. CONCLUSIONES. 38

IV.2. RECOMENDACIONES. 39

IV.3. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 40

IV.4. ANEXOS. 43

IV.4.1. Reconstitución de partidores. 43

IV.4.2. Cuadro 5. Descripción de partidores SR2 y SR21. 42

IV.4.3. Cuadro 6. Resultados detallados de la evaluación de

campo, en la parcela-vivero, en la población BC1F2. 44

IV.4.4. Cuadro 7. Resultados detallados del diagnóstico

molecular de la población BC1F3 analizada con los

marcadores moleculares SR1 y SR21. 45

IV.4.5. Breve biografía académica de los investigadores. 46

PARTE V

V.1. INFORME FINANCIERO. 47

viii

LISTA DE CUADROS

Página

1. Mezcla de reacción PCR para amplificación de SR2 y SR21. 10

2. Programa de amplificación para SR2 y SR21. 10

3. Resumen del diagnóstico fenotípico visual de la población BC1F2

evaluada en la parcela-vivero (referirse a cuadro 6 en anexos para

detalle). 27

4. Resumen del diagnóstico molecular de la población BC1F3

analizada con los marcadores SR2 y SR21 (para mayor detalle ver

cuadro 7 en anexos). 32

5. Descripción de los partidores SR2 y SR21. 42

6. Detalle de los resultados del diagnóstico fenotípico visual

de la población BC1F2 evaluada en la parcela vivero. 43

7. Detalle de los resultados del diagnóstico molecular de la

población BC1F3 analizada con los marcadores SR2 y SR21. 44

ix

LISTA DE FOTOGRAFÍAS

Página

1. Amplificación de los marcadores SR2 y SR21 para los progenitores. 29

2. Amplificación del marcador SR21 en ADN de extracción clorofórmica. 30

3. Amplificación del marcador SR21 con 4U de Taq polimerasa. 31

4. Fragmento de la visualización de SR21 para muestras sometidas a

extracción alcalina. 32

5. Diagnóstico fenotípico de plantas. R= resistentes, S= susceptibles,

M= muertas. 34

6. Muestreo en campo y traslado del material vegetal al laboratorio

utilizando formato 96. 34

7. Desarrollo de variedades progenitoras en invernadero. De izquierda

a derecha: ICTA Ligero y SEA15. 34

8. Cruce entre ICTA Ligero y SEA15. A) Emasculación de flores.

B) Identificación. C) Maduración. D) Cosecha de vainas formadas. 35

9. Población BC1F2 sembrada en parcela-vivero para evaluación fenotípica

de la resistencia a BGYMV. 35

10. Plantas seleccionadas (lazos de color rojo) para el diagnóstico

fenotípico y genotípico dentro de las subpoblaciones BC1F2. 36

11. Parcela-vivero al momento de la evaluación fenotípica. 36

12. A) Selección de descendencia de semilla única. B) Siembra de la

réplica “A” en invernadero. C) Muestra de crecimiento indeterminado

en la población. 37

13. Adaptación del formato 96 desde la transferencia del ADN en

la caja de megatítulo de extracción, a la placa de PCR y

al gel de visualización. A) Caja de megatítulo de extracción. B)

Placa de PCR. C) Gel de visualización. 37

14. Muestreo en invernadero siguiendo el formato 96. A) Muestreo de

hojitas. B) Caja de megatítulo con muestras. C) Caja de muestreo

completa. 37

x

LISTA DE ABREVIATURAS

ADN = Ácido deoxirribonucléico.

ARN = Ácido ribonucléico.

BC = Back Cross = Retrocruza.

BGYMV = Bean Golden Yellow Mosaic Virus = Virus del mosaico dorado del frijol.

°C = Grados centígrados.

CIAT = Centro Internacional de Agricultura Tropical.

CTAB = Bromuro de hexadeciltrimetilamonio.

DDS = Días después de la siembra.

EDTA = Ácido etilendiaminotetraacético

ICTA = Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícolas.

MAS = Marker Assisted Selection = Selección asistida por marcadores.

msnm = Metros sobre el nivel del mar.

mg = Miligramo.

pb = Pares de bases.

PCR = Polimerase Chain Reaction = Reacción en Cadena de la Polimerasa.

RAPD = Random Amplified Polymorphic DNA = Polimorfismo de ADN Amplificado

al Azar.

SCAR = Sequence-Characterized Amplified Region = Región amplificada de una

secuencia caracterizada.

SSR = Single Sequence Repeat = Secuencia simple repetida.

TBE = Tris-borato etilenodiaminotetraacetato.

TE = Tris-etilenodiaminotetraacetato.

U = Unidad(es).

µL = Microlitro.

1

PARTE I

I.1. INTRODUCCIÓN

El frijol (Phaseolus vulgaris L.) es uno de los granos alimenticios más importantes en

Guatemala, que, junto al maíz y el arroz, constituyen la dieta básica de la mayoría de

guatemaltecos. En las zonas rurales más pobres del país, el cultivo de frijol se convierte

en la actividad económica más rentable pues es fuente de ingresos, al mismo tiempo que

cubre las necesidades básicas de sus productores. La seguridad alimentaria y económica

de la población se ve amenazada por el efecto dañino de factores bióticos y abióticos

sobre la producción de frijol. De tal forma que el objetivo primordial de la investigación

agrícola es la de mejorar las características del frijol. El primer paso es conocer su

genética y asociarla con características fenotípicas de importancia agronómica, nutritiva o

cultural, con el objetivo de hacer el mejoramiento genético adecuado.

El mosaico dorado (BGYMV) es la enfermedad viral del frijol más seria y limitante

en Guatemala. Para controlar esta enfermedad es necesario desarrollar variedades

tolerantes, piramidando genes, no sólo a BGYMV, sino también a otras enfermedades

transmitidas por la mosca blanca. Durante un largo proceso, dentro del Programa de

Mejoramiento Genético del Frijol del ICTA, se han liberado variedades con tolerancia a

mosaico dorado, tal es el caso de las variedades ICTA Ligero e ICTA Chapina. A pesar

de los logros obtenidos actualmente no se puede considerar un problema solucionado.

Tanto la planta como los patógenos evolucionan constantemente para conseguir su

perpetuación, de tal manera que siempre existe la necesidad de generar nuevas y mejores

variedades, no solo desde el punto de vista de su tolerancia al virus sino de otros factores

bióticos y abióticos que limitan la producción. La búsqueda de variedades mejoradas

promisorias, que se adapten al constante cambio climático, es un objetivo constante de la

investigación agrícola.

Las variedades ICTA Ligero y SEA15 son contrastantes en cuanto a la resistencia a

BGYMV y la sequía. ICTA Ligero es portadora del gen bgm-1, tolerante a BGYMV, y

SEA15 es portadora del gen Bgm-1, susceptible a BGYMV. Mientras que SEA15 es

altamente tolerante a sequía e ICTA Ligero es susceptible pero escapa de esta gracias a su

precocidad. Empezar un programa de cruzas con estas variedades dará lugar a la

posibilidad de desarrollar una nueva variedad con las características deseables de

tolerancia a BGYMV y sequía.

La resistencia a BGYMV depende de la acumulación de varios genes. El gen más

importante conocido que está directamente implicado en la resistencia es bgm-1. Urrea y

sus colaboradores identificaron un marcador molecular tipo RAPD, muy cercano, ligado

a bgm-1 y después este fue convertido en SCAR en el CIAT, el cual fue usado para

identificar el gen recesivo bgm-1 que confiere la resistencia a BGYMV en frijol. Este

marcador es llamado SR2 y es ampliamente utilizado en CIAT para selección asistida en

generaciones tempranas (F1) debido a la herencia recesiva de bgm-1 y porque la

enfermedad es difícil de detectar en el campo y en invernaderos. Una versión de SR2

llamada SR21 fue desarrollado a partir de un estudio de bioinformática en el que se

2

secuenció los fragmentos amplificados por SR2. Este estudio reveló que la diferencia

entre los alelo Bgm-1 y bgm-1 es una deleción/inserción de 40 pares de bases. El nuevo

marcador flanquea más cercanamente este fragmento. Aunque todavía no se conoce el

papel de esta diferencia es probable que sea importante en la interacción planta-patógeno

(Blair, Rodriguez, Pedraza, Morales y Beebe, 2007).

Tanto SR2 como SR21 han sido ampliamente utilizados para selección de plantas

resistentes a BGYMV (Kelly, Gepts, Miklas y Coyne, 2003). La adaptación y validación

de esta metodología hace posible establecer, mediante PCR, si una planta de frijol posee

el gen recesivo bgm-1 y, por lo tanto, si es o no resistente al BGYMV, al estar en

contacto con la enfermedad en el campo.

La selección asistida por marcadores permite eliminar segregantes en generaciones

tempranas y optimiza el espacio y recursos dedicados a la población en desarrollo y

permite hacer una selección en líneas avanzadas para confirmar la presencia de genes de

resistencia a BGYMV antes de incluir estás líneas como progenitoras (Blair, Quintero,

Buendía, Tohme, Teran y Beebe, 2002).

La selección de plantas con resistencia al BGYMV está limitada por factores

ambientales que determinan la presencia o ausencia del vector responsable de transmitir

el virus y la respuesta fisiológica de la planta (Beaver y Rosas, 2003). Sin embargo, los

marcadores moleculares han demostrado ser una herramienta muy útil para predecir las

características de una población muy temprano en su desarrollo. La selección asistida por

marcadores requiere someter material vegetal a los siguientes procedimientos: extracción

de ADN, cuantificación de ADN, amplificación de marcadores moleculares por PCR,

visualización de productos de PCR y diagnóstico molecular. Es importante adaptar las

condiciones reportadas en estudios previos para cada uno de los ambientes nuevos donde

se desarrollarán, especialmente cuando se tiene una población que no se ha estudiado

antes. Al hacer esta adaptación se garantiza que se optimizará la eficiencia de la técnica

general.

El formato 96 es común en el mundo de la biotecnología. La forma de

almacenamiento, transferencia de muestras, equipos y accesorios están adaptados a este

formato. De tal forma, que se cuenta con pipetas multicanales, placas de PCR y cajas que

tienen el arreglo de 12 columnas por 8 filas, que permite trabajar 96 muestras con

facilidad y ahorrando tiempo. En el muestreo en campo e invernadero, las cajas de

megatítulo con formato 96 pueden ser de gran ayuda porque tiene una identificación

implícita que evita la rotulación de tubos individuales. Su practicidad evita la

contaminación cruzada o extravío de muestras.

En un proceso de selección asistida por marcadores se requiere analizar una población

con un gran número de individuos. Con la adaptación de un protocolo con formato 96 al

laboratorio de Biotecnología de ICTA se espera hacer más eficiente el proceso de

selección de plantas que posean el gen que confiere resistencia al mosaico dorado del

frijol.

3

El proceso de adaptar y validar la metodología de selección asistida por los

marcadores SR2 y SR21 en la población de la retrocruza entre ICTA Ligero X F1 (ICTA

Ligero X SEA 15), constituye la base de un programa de mejoramiento donde el

laboratorio de Biotecnología del ICTA tiene la capacidad de determinar, con mayor

certeza, la presencia o ausencia de la resistencia al BGYMV en plantas jóvenes de frijol.

Este programa nuevo fortalece el mejoramiento genético de frijol en Guatemala y en la

región centroamericana, al promover el intercambio de germoplasma mejorado. A

mediano plazo, generará un incremento en la producción de frijol y en la seguridad

alimentaria del país.

I.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1 Antecedentes en Guatemala

A nivel mundial se están reportando pérdidas importantes en la agricultura debido

al cambio climático global. Desde el verano del 2009, una extensa región, que comprende

siete de los 22 departamentos de Guatemala, fue declarada zona crítica a causa de la

sequía. El estrés hídrico es causa de un aumento en la incidencia de enfermedades, lo que

repercute en la producción de los cultivos y, a su vez, en la seguridad alimentaria de la

población. El frijol y el maíz, por ser básicos en la alimentación del guatemalteco, son los

cultivos que reportan mayores pérdidas debido a la ausencia de lluvia. La devastación de

los campos y la falta de alimento en el corredor seco podría ser prevenida con una

política de estado que promueva la adopción de cultivares que se adapten a la situación

ambiental actual. En otras palabras, cultivares que tengan características de resistencia a

factores bióticos, como la virosis, y tolerancia a factores abióticos, como la sequía.

Para el desarrollo de estas variedades mejoradas se requiere de poner en marcha

nuevos programas de mejoramiento genético que combinen cruzas de variedades

contrastantes y selección asistida por marcadores moleculares. Esta estrategia

tecnológica, que utiliza mejoramiento convencional y Biotecnología, disminuye el tiempo

de generación de variedades de frijol que se adapten. En un futuro contribuirá al control

de las pérdidas económicas y al fortalecimiento de la seguridad alimentaria en el país.

I.2.2. Justificación del trabajo de investigación

La selección asistida por marcadores moleculares es una herramienta muy útil

para el mejoramiento genético de los cultivos, porque minimiza el tiempo que se requiere

y maximiza los recursos disponibles. Esta tecnología conlleva mucho trabajo de Biología

Molecular, Bioinformática y Genética de Poblaciones. A pesar de que en Guatemala no

se realizan estudios avanzados de Ingeniería Genética, el país tiene las capacidades para

aplicar y aprovechar los métodos de selección asistida que se desarrollan en otras

instituciones de investigación a nivel mundial. En el caso del frijol, el desarrollo de la

selección asistida se ha enfocado principalmente a la identificación de genes que

confieren resistencia a enfermedades limitantes de la producción de este cultivo.

4

Una de las enfermedades más importantes es la causada por el virus del mosaico

dorado del frijol. Según los reportes, los marcadores moleculares SR2 y SR21 están

ligados al gen bgm-1, que confiere resistencia al BGYMV y pueden ser utilizados

ampliamente para la selección de plantas portadoras dentro de poblaciones segregantes.

Para que Guatemala se beneficie de la utilización de estos marcadores, dentro de una

metodología de selección, debe adaptar los procedimientos reportados a las condiciones

propias del país y los protocolos de rutina. Para asegurar que los resultados se

reproduzcan fielmente se deben validar simultáneamente los resultados moleculares con

el desarrollo del cultivo en condiciones de campo. Actualmente se trabaja un número

limitado de muestras diarias. Durante el proceso de adaptación de procedimientos, el

laboratorio de Biotecnología puede hacer más eficiente la metodología de rutina de tal

forma que puede aumentar la capacidad ya instalada.

I.3. OBJETIVOS E HIPÓTESIS

I.3.1. Objetivos

I.3.1.1 General

Contribuir al desarrollo tecnológico del mejoramiento genético de frijol en

Guatemala.

I.3.1.2. Específicos

A. Adaptar una metodología de selección por resistencia al BGYMV utilizando

el marcador SCAR SR2.

B. Seleccionar individuos resistentes al BGYMV en una población segregante

proveniente de la retrocruza ICTA Ligero X (ICTA Ligero X SEA 15).

C. Evaluar bajo condiciones de campo la respuesta al BGYMV de las plantas

seleccionadas.

I.3.2. Hipótesis

Las plantas seleccionadas por su resistencia al BGYMV, mediante el marcador SR2,

se muestran resistentes, bajo condiciones de campo, en el departamento de El Progreso.

I.4. METODOLOGÍA

I.4.1. Localización

La fase de trabajo en laboratorio y evaluación en invernadero se llevó a cabo en el

laboratorio de Biotecnología del ICTA, en la Unidad Central de Innovación Tecnológica

(oficinas centrales), ubicados en el kilómetro 21.5 Carretera al Pacífico, Bárcena, Villa

Nueva, Guatemala (14º 31’ 04.65’’ latitud norte, 90º 36’ 58.99’’ longitud oeste), a una

5

altitud de 1457 msnm, con una temperatura promedio de 24°C. Las cruzas y retrocruzas

se efectuaron en un invernadero del ICTA en La Alameda, Chimaltenango, kilómetro 53

carretera al occidente (14º 38’ 16.05’’ latitud norte, 90º 48’ 14.46’’ longitud oeste), a una

altitud de 1766 msnm, con una temperatura promedio de 19°C. La fase de campo se

efectuó en una parcela-vivero, en la aldea El Conacaste, Sanarate, El Progreso, kilómetro

52.5 carretera al nororiente (14º 47’ 47.22’’ latitud norte, 90º 12’ 56.84’’ longitud oeste),

a una altitud de 862 msnm, con una temperatura promedio de 29°C.

I.4.2. Variables

I.4.2.1. Variables dependientes

Genotipo, dado por la amplificación y migración de bandas de ADN.

Fenotipo, dado por la presencia de síntomas de virosis causado por BGYMV.

I.4.2.2. Variables independientes

No se midieron variables independientes pues se hizo una selección de plantas con

base en las variables dependientes.

I.4.3. Indicadores

Bandas de ADN de 530/570 pb de longitud, indicación de genotipo

resistente/susceptible.

Síntomas de virosis (clorosis, enrollamiento de hojas y vainas) indicación de fenotipo

susceptible, resistente o plantas muertas.

I.4.4. Estrategia Metodológica

El material vegetal utilizado consistió en las variedades de frijol ICTA Ligero y

SEA15. Las semillas fueron suministradas por el Banco de Germoplasma del ICTA.

Para el establecimiento del experimento se efectuó una cruza entre las variedades

ICTA Ligero y SEA15. Posteriormente se efectuó la retrocruza entre ICTA Ligero y

la F1 obtenida de la cruza anterior. El período de ejecución del proyecto fue de

febrero de 2009 a febrero de 2011.

I.4.5. Método

A. Fase de campo

En este estudio se estableció una población segregante resultado de la retrocruza entre

ICTA Ligero y la F1 de la cruza entre ICTA Ligero y SEA15, la cual fue empleada para

adaptar y validar una metodología de selección asistida por marcadores moleculares que

será utilizada en el mejoramiento genético de frijol para tolerancia a mosaico dorado y

sequía.

6

Los progenitores escogidos fueron las variedades de frijol ICTA Ligero y SEA15 ya

que tienen fenotipos y genotipos contrastantes para la resistencia a mosaico dorado y

sequía. ICTA Ligero posee el gen bgm-1 y es muy utilizado en Guatemala porque escapa

al efecto de factores bióticos y abióticos debido a su precocidad. SEA15 es portador del

gen Bgm-1 por lo que es susceptible a mosaico dorado, pero es muy utilizado por su

tolerancia a la sequía. Ambas variedades provienen de programas extensos de

mejoramiento genético y siguen utilizándose con el objetivo de generar nuevas

variedades que agrupen lo mejor de ambas. Todas las generaciones iniciales del cruce de

interés se desarrollaron bajo condiciones de invernadero en la Estación Experimental de

ICTA Chimaltenango. Para obtener la primera generación (F1) de la cruza entre ICTA

Ligero y SEA15, se realizó una polinización con la metodología de cruzas con

emasculación. La progenie resultante fue constituida por las semillas provenientes de

vainas formadas en flores fecundadas exitosamente. La F1 obtenida se retrocruzó con

ICTA Ligero como progenitor femenino. Cada una de las vainas obtenidas del retrocruce

se trabajó como una subpoblación BC1. Todas las semillas BC1 resultante fueron

sembradas en la Estación Experimental de ICTA Chimaltenango, en invernadero,

generándose por autofecundación las semillas BC1F1.

Toda la semilla BC1F1 fue sembrada en la parcela del agricultor colaborador Mario

Augusto Fajardo Morales, ubicada en la Aldea El Conacaste, Sanarate, El Progreso. Se

utilizó un arreglo de subpoblación por surco de siete posturas con tres plantas por

postura. Dicha parcela fue escogida por ser conocida como zona importante de incidencia

de la mosca blanca que transmite la enfermedad del virus del mosaico dorado que, dentro

de la metodología del Programa de Frijol del ICTA, se trabaja regularmente como

parcela-vivero de BGYMV.

Durante el desarrollo de la BC1F2, se hizo una evaluación en campo de la incidencia y

severidad del virus del mosaico dorado en tres plantas de cada subpoblación escogidas al

azar. El método de marcación fue con rafia roja. Se diagnosticaron plantas con fenotipo

resistente (R), susceptible (S) o muertas (M) con base en la presencia de los síntomas

típicos de la infección por mosaico dorado (clorosis, enrollamiento de hojas, y de vainas);

obviando los efectos producidos en las plantas por otras enfermedades (fotografía 5).

Durante la cosecha, se escogió al azar una vaina por planta, por postura, en todas las

subpoblaciones (selección por descendencia de semilla única).

Las semillas BC1F3 fueron clasificadas en tres réplicas. La primera réplica fue

sembrada bajo condiciones de invernadero para obtener más semilla en generación BC1F4

(fotografía 12).

B. Fase de laboratorio

Se colectaron hojas jóvenes trifoliadas en dos etapas: a) de cada planta BC1F2

marcada en la parcela-vivero, y; b) de plantas BC1F3 seleccionadas al azar en la

regeneración en invernadero. Para el muestreo se aprovechó el formato 96 de cajas de

megatítulo (fotografía 6), introduciendo con la ayuda de pinzas aproximadamente 200 mg

de tejido vegetal fresco en cada celda, la cual se denominó muestra. Todas las cajas

7

fueron trasladadas al laboratorio de Biotecnología en una hielera con bolsas de gel de

congelación para mantener los tejidos a baja temperatura y evitando así su degradación.

Las cajas fueron almacenadas a -20°C durante varios días, obteniéndose los mejores

resultados cuando no se interrumpió la congelación por un máximo de tres días.

Todas las muestras fueron sometidas a los protocolos que se describen más adelante,

los cuales se adaptaron para esta investigación a partir de procedimientos descritos

anteriormente (Blair, Quintero, Buendía, Tohme, Terán y Beebe, 2002; Blair, Rodríguez,

Pedraza, Morales y Beebe, 2007; Ponciano 2004; Ponciano, Molina y Villatoro, 2009). El

proceso de adaptación de metodologías se discute con más detalle en la Parte III de este

informe.

a. Protocolo “A” de extracción de ADN

Para la extracción de ADN se siguió el protocolo propuesto por Ponciano et al. (2009),

que consistió en lo siguiente:

1. Se tomaron 150-200 mg de tejido y se maceraron con nitrógeno líquido hasta que el

material se convirtió en un polvo fino.

2. Se transfirió a un tubo Eppendorf de 1.5 mL y se agregó 500 µL de buffer CTAB (2%

CTAB, NaCL 1.4 M, Tris-HCl 100 mM, EDTA 20 mM, 0.2% β-mercaptoetanol),

precalentado a 65°C. Se evitó agregar el buffer a menos de 15°C.

3. Se cerró el tubo y se mezcló.

4. Se incubaron los tubos en baño de María a 65ºC, durante 30 minutos, mezclando

ocasionalmente.

5. Se removieron los tubos del baño de María y se dejaron enfriar a temperatura

ambiente. Se agregaron 500 µL de una solución 1:1 de cloroformo:isopentanol (1:1).

Se mezcló vigorosamente durante dos minutos.

6. Se centrifugó a 13,000 rpm, durante cinco minutos, a temperatura ambiente.

7. Se transfirió la fase acuosa (fase superior) a otro tubo.

8. Se repitió el lavado con cloroformo:isopentanol (1:1) desde el paso 4 al 6.

9. Se agregaron 15 µL de ARNasa a cada tubo y se incubó a 37ºC, durante 30 minutos.

10. Se agregó 2.5 volúmenes de etanol absoluto, previamente almacenado a –20ºC y se

mezcló hasta formar un precipitado.

11. Se extrajo el ADN utilizando una punta de plástico.

8

12. Se descartó la fase acuosa y se “lavó” el precipitado con 335 µL de etanol al 70%. Se

centrifugó durante cinco minutos a 13,000 rpm.

13. Se descartó la fase acuosa y se secó con vacío, en un Centri-Vap, entre 3 y 45

minutos.

14. Se disolvió el ADN en 150 µL de buffer TE y se dejó a 4ºC durante media hora. La

muestra se almacenó a 4ºC.

b. Protocolo “B” de extracción de ADN

Se hizo una prueba para el formato 96 con una extracción clorofórmica, de acuerdo

con el protocolo de Ponciano (2004).

1. Se tomaron 150-200 mg de tejido y se colocó en la celda correspondiente en la caja

de megatítulo (formato 96). Se maceró con nitrógeno líquido hasta que el material se

conviertió en un polvo fino. Se agregaron 600 µL de buffer CTAB, precalentado a

65°C, a cada celda. Se evitó agregar el buffer a menos de 15°C.

2. Se cerró la caja y se sumergió en baño de María.

3. Se incubó la caja en baño de María a 65ºC, durante 30 minutos, dándole pequeños

golpes ocasionalmente, a modo de mezclar levemente. Nunca se agitó la caja.

4. Se removió la caja del baño de María y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se

trasladó el sobrenadante a tubos, evitando el tejido vegetal en lo posible. Se agregó

500 µL de cloroformo:isopentanol (1:1) y se mezcló durante dos minutos.

5. Se centrifugó a 13,000 rpm, durante cinco minutos, a temperatura ambiente.

6. Se transfirió la fase acuosa (fase superior) a otro tubo.

7. Se agregaron 15 µL de ARNasa a cada tubo y se incubó a 37ºC, durante una hora.

8. Se agregaron 2.5 volúmenes de etanol absoluto, almacenado a –20ºC, y se mezcló

hasta formar un precipitado.

9. Se centrifugó, durante cinco minutos, a 13,000 rpm.

10. Se descartó la fase acuosa y se secó con vacío, en Centri-Vap, durante 45 minutos.

11. Se disolvió el ADN en 150 µL de buffer TE y se dejó, a 4ºC, durante media hora. La

muestra se almacenó a 4ºC.

9

c. Protocolo “C” de extracción de ADN

Se hizo una segunda prueba con formato 96 (extracción alcalina), de acuerdo con el

protocolo propuesto por Ponciano (2004).

1. Se tomaron 150-200 mg de tejido y se colocó en la celda correspondiente en la caja

de megatítulo (formato 96). Se maceró con nitrógeno líquido hasta que el material se

convirtió en un polvo fino.

2. Se agregaron 200 µL de buffer de extracción (250 mM de NaOH). Se cerró la caja y

se sumergió en baño de María. Se incubó a 95ºC, durante 30 minutos, dando

pequeños golpes ocasionalmente, a modo de mezclar levemente. Nunca se agitó la

caja.

3. Se removió la caja del baño de María y se dejó enfriar, a temperatura ambiente,

durante 10 minutos. Se agregaron 500 µL de 100 mM de Tris-HCl a pH 8.0.

4. Se agregaron 1000 µL de agua destilada. Utilizando una pipeta multicanales con

puntas se mezcló mecánicamente y se tomó una alícuota de 10 µL para hacer el PCR

inmediatamente.

5. Se almacenó brevemente a 4°C.

d. Cuantificación de ADN

La cuantificación de ADN se hizo siguiendo el protocolo propuesto por Ponciano

(2004) y consistió en lo siguiente:

1. Se hizo una dilución de ADN extraído, en una proporción 1:200, en buffer TE,

mezclando 995 µL de buffer con 5 µL del ADN resuspendido. Se homogenizó

vigorosamente.

2. En el equipo de espectrofotometría de luz ultravioleta se escogió la opción

DNA:RNA. Se indicó el factor de conversión a 260 nm 1.0=50.0 µg/mL y factor de

dilución 200. Se blanqueó con 200 µL de buffer TE.

3. Se midió la concentración de las muestras colocando 200 µL de la dilución preparada

en la celda de cuarzo. Se limpió la celda utilizando kimwipes. Se enjuagó la celda

entre muestras con agua destilada.

4. Se interpretaron los resultados de la cuantificación y se evaluó la pureza mediante la

relación de lecturas a 260 nm y 280 nm. Una razón menor que 1.7 indicaba la

presencia de proteínas y una razón mayor que 1.9 indicaba la presencia de ARN.

5. Se hicieron diluciones de las muestras, según la cantidad necesaria de ADN para

realizar la PCR (100 ng ADN/5 µL alícuota).

10

e. Amplificación de marcadores moleculares

La amplificación de marcadores moleculares se realizó siguiendo los protocolos de

Blair et al. (2002), Blair et al. (2007) y Ponciano et al. (2009). El ADN obtenido de cada

una de las muestras se sometió a amplificación por PCR con los marcadores moleculares

SCAR SR2 y SR21 para seleccionar plantas resistentes a BGYMV. La mezcla de

reacción utilizada se describe en el cuadro 1, utilizando los partidores específicos R y F

para la amplificación de cada marcador (cuadro 5). Esta mezcla de reacción se sometió al

programa de amplificación (cuadro 2) en un termociclador APOLLO ATC401.

Cuadro 1. Mezcla de reacción PCR para amplificación de SR2 y SR21.

Componente Concentración Final Cantidad (µL)

5X buffer PCR Tfi 1X 6.0

50 mM MgCl2 2.5mM 1.5

10 mM dNTP 4.0μM 1.2

12.5 mM partidor R 1.0 μM 1.2

12.5 mM partidor F 1.0 μM 1.2

Agua Ultrapura 8.5

5U/µL Taq polimerasa Tfi 2U 0.4 (2U)

ADN de frijol 100 ng 10.0

Total (Master Mix) 30.0 Fuente: Ponciano (2004).

Cuadro 2. Programa de amplificación para SR2 y SR21.

Evento Número de

Ciclos Temperatura (ºC)

Tiempo

(minutos)

Desnaturalización inicial 1 94 2

Desnaturalización 1 94 0.5

Hibridación 1 60 1

Elongación 1 72 1

Repetición de ciclo 30

Elongación final 1 72 5

Finalización 1 10 Indefinido Fuente: Ponciano (2004).

f. Electroforesis

Los productos de amplificación se visualizaron por medio de electroforesis en gel de

agarosa al 1.5% y tinción con bromuro de etidio según el protocolo descrito por Ponciano

(2004). El protocolo consistió en lo siguiente:

1. Se disolvió agarosa en 150 mL de TBE 1X, se mezcló y calentó en horno de

microondas durante 30 segundos. Se revolvió suavemente. Se calentó durante otros

30 segundos y se repitió la operación hasta que la solución se vió transparente y sin

burbujas.

11

2. Se ensambló la cámara de electroforesis horizontal y se probó el peine a utilizar.

3. Se enfrió un poco bajo chorro de agua corriente. Se virtió la solución dentro de la

cámara y se colocó el peine adecuado.

4. Se dejó enfriar hasta que la solución se solidificó completamente. Se retiró el peine.

Se llenó la cámara, hasta cubrir el gel unos milímetros, con TBE 1X.

5. Se cargó una mezcla de cuatro µL de buffer de carga (60% glicerol, 0.25% azul de

bromofenol y 0.25% de xilencianol) y 10 µL de producto de PCR. Se mezcló

pipeteando y se cargó la muestra en el pozo correspondiente. También se cargó un

pozo con dos µL de una escalera de peso molecular de 100 pares de bases.

6. Se cerró la cámara y se corrió a 100 voltios, corriente directa, durante una hora.

7. Se sacó el gel de la cámara y se sumergió en una solución de bromuro de etidio

(utilizando doble guante, lentes, bata y tomando todas las precauciones necesarias

debido a que es un reactivo cancerígeno), durante cinco minutos.

8. Se sumergió el gel en agua destilada durante varias horas para eliminar el fondo

sobreteñido. El gel se puso sobre el transiluminador y se tomaron fotografías,

tomando todas las precauciones para evitar daños por la luz ultravioleta.

9. Se sumergió el gel en un gramo de carbón activado, disuelto en 400 mL de agua

destilada, durante un mes, para eliminar el bromuro de etidio.

Se utilizó escalera de peso molecular de 100 pb para identificar cada uno de los

productos de amplificación. Los resultados se fotografiaron con cámara digital en blanco

y negro a través de filtros de luz ultravioleta del transiluminador. Los desechos fueron

tratados adecuadamente por medio de la empresa ECOTERMO, S.A. para reducir al

mínimo los daños al medio ambiente.

El diagnóstico se hizo por comparación de la migración de los productos de

amplificación correspondientes a los progenitores y las muestras que se analizaron (Blair

et al. (2002) y Blair et al. (2007).

I.4.6. Técnica Estadística

No se utilizó análisis estadístico, de ningún tipo, para analizar los resultados de este

trabajo.

I.4.7. Instrumentos utilizados

Se utilizó el siguiente equipo:

12

Termociclador

Apollo ATC401.

Fuente de poder de

250 voltios.

Micropipetas.

Transiluminador

UV.

Microcentrífuga.

Cámara de

electroforesis

horizontal.

Balanza analítica.

Centrievaporador

LABCONCO.

Refrigeradora a 4ºC.

Bomba

hidroneumática.

Refrigeradora a

menos 20ºC.

Centrífuga con vacío

y trampa fría.

Dewar.

Computadora con

escáner.

Dispensador de

nitrógeno líquido.

Software para

análisis de ADN.

Estufas con

agitación magnética.

Reguladores de

voltaje.

Horno de

microondas.

Baños de María.

Potenciómetro.

Autoclave.

Espectrofotómetro

de luz ultravioleta.

Suavizador de agua.

Destilador de agua.

Cámara digital.

Se utilizaron los reactivos y productos siguientes:

Abono químico 15-15-15.

Fungicida a base de

azoxystrobin1 +

difenoconazole2.

Herbicida a base de linuron3.

Agua Ultrapura4.

Oligonucleótidos.

Taq polimerasa.

Buffer para PCR.

dNTPs.

Cloruro de magnesio.

Urea.

Agarosa.

Bromuro de etidio.

Ácido clorhídrico.

EDTA.

Trizma base.

Ácido bórico.

Azul de bromofenol.

Xilencianol.

Glicerol.

1 Metil (E)-2-{2-[6-(2-(cianofenoxi) pirimidin-4-

iloxi]fenil}-3-metoxiacrilato. 2 3-cloro-4-[4-metil-2-(1H-1,2,4-triazol-1-

ilmetil)-1,3-dioxolan-2-il] fenil-4-clorofenil éter. 3 3-(3,4-diclorofenil)-1-metoxi-1-metilurea.

4 Destilada, filtrada y esterilizada.

CTAB.

Cloruro de sodio.

β-mercaptoetanol.

Cloroformo:Isopentanol

(24:1).

ARNasa (20 mg/mL).

Etanol.

Hidróxido de sodio (25 mM).

Tris-HCl (100 mM).

13

Se utilizaron los siguientes consumibles:

Bandejas de plástico.

Bolsas de papel.

Tarjetas de papel.

Macetas de plástico.

Lazo de plástico.

Cajas plásticas.

Megatítulo de 96 pozos.

Placas plásticas, de 96 pozos, para

PCR.

Bolsas plásticas.

Papel aluminio.

Cristalería en general.

Puntas de micropipeta.

Combitips.

Papel toalla.

Bolsas de gel de congelación.

14

PARTE II

II. MARCO TEÓRICO

II.1. El corredor seco en Guatemala

El cambio climático que afecta el comportamiento de los fenómenos

meteorológicos a nivel mundial, repercute seriamente en la agricultura. En un país

netamente agrícola, como Guatemala, los daños son más grandes y preocupantes. Durante

el año 2009, los departamentos de Santa Rosa, El Progreso, Jalapa, Jutiapa, Zacapa,

Chiquimula, Izabal y Baja Verapaz, reportaron daños serios en la productividad y

economía de la población debido a la sequía que sufrieron en ese período de tiempo. Por

esta razón se denominó a está región de Guatemala como “Corredor Seco” (Asociación

EDUCCA, 2011).

Al contabilizar las pérdidas totales, tuvo que agregarse siete departamentos más al

“Corredor Seco”: Suchitepéquez, Retalhuleu, Sacatepéquez, Guatemala, Totonicapán,

Huehuetenango y Quiché. Se reportó que la pérdida fue de 169 millones de quetzales,

72,798 hectáreas de cultivos, la muerte de 54 niños por desnutrición, 54,000 familias

sufriendo hambre y 100 mil familias afectadas (Ramírez, 2011).

La canícula prolongada se debe a la presencia del fenómeno meteorológico

conocido como “El Niño”, que se inicia cuando aumenta la temperatura de las aguas

superficiales del océano Pacífico Central. Esto desencadena patrones climáticos

anormales en muchas regiones, provocando lluvia excesiva en unas y sequía, en otras.

Como en Guatemala, la sequía dió inicio a sucesos relacionados con la falta de lluvia:

aparición de enfermedades, producción baja o nula, pérdidas importantes de plantas y,

sumando todo, escaso rendimiento agrícola, que incrementa considerablemente la

pobreza y extrema pobreza en la región y amenaza la seguridad alimentaria (Asociación

EDUCCA, 2011).

En relación al rendimiento de las cosechas, las más afectadas fueron las de maíz y

frijol, lo que deriva en una preocupante crisis de abastecimiento de los principales

alimentos de la dieta guatemalteca. Las pérdidas de maíz alcanzaron el 60% y las de frijol

el 90%, que a su vez produjeron un aumento del 4% en el precio del quintal de maíz y un

19% en el precio del quintal de frijol, en el período 2009/2010. La situación general es

preocupante pues implica una crisis ambiental, agrícola, alimentaria, social, económica,

nutricional y de salud. Para hacerle frente a dicha crisis generalizada se requiere de

políticas de gobierno que incluyan a todos los actores competentes para dar soluciones

inmediatas y viables (Asociación EDUCCA, 2011).

Es importante mencionar que el corredor seco atraviesa Guatemala y se extiende

por Honduras, El Salvador y Nicaragua, por lo que se considera un problema regional. La

ONG internacional Acción Contra el Hambre (ACF) recomendó que los gobiernos de los

países afectados actuaran ante la situación de crisis suministrando semillas resistentes a la

sequía y fertilizantes para garantizar las cosechas (Diario La Tribuna, 2010).

15

El desarrollo de estas semillas resistentes requiere que los países inicien

urgentemente programas de investigación para incorporar resistencias genéticas no sólo a

sequía, sino también a las principales enfermedades y generar tecnologías para un mejor

aprovechamiento de los fertilizantes y del recurso hídrico tan limitado en estas épocas de

crisis climática.

II.2.El frijol en Guatemala

El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es uno de los cultivos alimenticios más

importantes en Guatemala que, junto al maíz y arroz, constituyen la dieta básica de la

mayoría de guatemaltecos. El promedio de consumo en Guatemala es de alrededor de 20

kg/año/persona. El frijol suple proteínas, carbohidratos, vitaminas y minerales

(especialmente hierro, fósforo, magnesio, manganeso, zinc, cobre y calcio). Las proteínas

del frijol son ricas en el aminoácido lisina, que en el maíz (Zea mays L.) es deficiente, por

lo que los dos alimentos se complementan nutricionalmente muy bien para tener una

dieta de proteínas balanceada. Es fuente importante de proteínas en la dieta diaria del

guatemalteco por lo que se le ha dado en llamar “la carne de los pobres”, por lo que,

nutritivamente, juega un rol muy importante en la dieta de los no privilegiados. El frijol

provee de un 10 a 20% de los requerimientos nutritivos de una persona adulta. El frijol es

un cultivo típico de pequeños agricultores de subsistencia, a menudo sembrado en

pendientes de baja fertilidad (Sagastume, Molina y Ávalos, 2003).

El cultivo de frijol en Guatemala ha sido cultiva básicamente para autoconsumo,

constituyendo la principal fuente de proteínas en el área rural. Esta condición es la que

determina las características actuales del sector, en donde, de acuerdo a la Encuesta

Agropecuaria del MAGA, una alta proporción de la producción (53.42%), es realizada en

unidades productivas menores de siete hectáreas (86.59% de las unidades productivas),

que equivale al 66% del área cultivada, lo que significa una baja productividad por

unidad de área. Los niveles de consumo varían de acuerdo con el estrato económico de

los consumidores y su localización geográfica, de esta cuenta se tiene que, en el área rural

y estratos con bajo nivel de ingresos, son los que consumen mayor cantidad de frijol por

día (Masaya, Díaz y Salguero, 1984).

El período de cultivo del frijol en Guatemala consta de dos siembras al año. La

primera siembra se realiza en el segundo trimestre del año, de abril a junio. El mayor

problema que afecta el frijol de primera es que coincide con la época de verano y que a

estas alturas las familias sufren de escasez de alimentos. El frijol de primera se cosecha

entre agosto y octubre, lo que coincide con la abundancia de alimentos. Simultáneamente

a esta cosecha, durante el tercer trimestre del año, se realiza la siembra de segunda. El

último trimestre del año coincide con la cosecha del frijol de segunda (Asociación

EDUCCA, 2011).

Según estudios sobre la rentabilidad de la introducción de nuevas variedades de frijol

en Jutiapa, el 35% de los agricultores encuestados registró que obtiene mayores ingresos

por el cultivo de frijol, sin embargo de este grupo, 44% lo atribuye al uso de variedades

mejoradas y 56% al incremento en el área sembrada. Estos datos indican que, solo en

16

Jutiapa, departamento parte del corredor seco, el 37% de los agricultores utilizan semilla

mejorada (Martínez y Viana, 1997).

Los resultados de la producción de frijol, tanto en primera como en segunda,

dependen en gran medida de la presencia e interacción de los factores constantes y

factores variables que se hayan presentado durante las épocas de siembra. Los factores

constantes dependen de las especies de frijol así como de las variedades sembradas.

Mientras que los factores variables dependen de la interacción del genotipo con el

ambiente. Las condiciones climáticas y el manejo integrado que se haya dado al cultivo

influyen directamente en el rendimiento en la cosecha (CIAT, 1984).

La producción de frijol en Guatemala está sujeta a condiciones ambientales,

generalmente adversas. La zona productora de frijol del país se localiza entre 0 y 1200

msnm y las principales limitaciones para la producción son: a) el mosaico dorado –

conocido como mancha amarilla–, b) la mala distribución de lluvias –presencia de

canícula– y c) el uso de variedades criollas con bajos rendimientos que no soportan

enfermedades (Guillespie, 1999).

II.3. Los efectos, a nivel mundial, del mosaico dorado en el cultivo del frijol

El mosaico dorado del frijol fue identificado en Brasil hacia el inicio de la década de

1960, por el Dr. Alvaro Santos Costa y reportado en 1965 (Maxwell, Hanson, de Faria,

Gilberston, 1999; Morales, 2000). En esa época, a pesar del amarillamiento y de pérdidas

de producción severas que presentaban las plantas de frijol afectadas, la enfermedad no

alcanzaba una incidencia significativa que mereciera una mayor atención.

Desafortunadamente, se desconocía el alto potencial de diseminación de esta enfermedad,

la cual se convirtió, una década mas tarde, en una limitante de la producción de frijol en

los principales estados productores del Brasil. Al final de la década de 1970 y principios

de 1980, la enfermedad había provocado pérdidas mayores y campos de frijol con

incidencia del 100% eran comunes (Maxwell et al., 1999), el mosaico dorado ya dañaba

también regiones productoras de frijol en América Central (El Salvador y Guatemala), El

Caribe (República Dominicana, Haití y Puerto Rico) y el norte de México. Desde la

década de 1980, el mosaico dorado ha continuado su expansión. En América Central el

mosaico dorado ha incrementado notablemente su incidencia en Guatemala, Honduras y

Nicaragua (Morales, 2000).

En un taller internacional, realizado en Guatemala en 1992, se listó al virus del

mosaico dorado del frijol como el mayor factor limitante de la producción en muchos

países de Latinoamérica (Maxwell et al., 1999). Actualmente, la enfermedad del mosaico

dorado del frijol es de gran importancia en Centroamérica, Sudamérica, Islas del Caribe y

Nigeria (Morales, 2000) y se observa que Brasil, El Salvador, Guatemala y Jamaica, son

países especialmente afectados por las pérdidas que provoca este patógeno (Pernezny,

McMillan, Heibert y Lentini, 2004).

Los reportes indican que la enfermedad es devastadora en áreas de producción de

frijol que están por debajo de 1000 msnm (Blair et al., 2007).

17

II.4. El virus del mosaico dorado del frijol

La caracterización del agente causante del mosaico dorado de las plantas de frijol por

Gálvez y Castaño y por Goodman y colaboradores, ambos en el año 1976, mostró que la

enfermedad es provocada por el virus del mosaico dorado del frijol (BGYMV), que

pertenece al grupo de los geminivirus (Maxwell et al., 1999; Pernezny et al., 2004).

Los virus de plantas generalmente consisten en una partícula simétrica o alargada que

contiene ARN, pero los geminivirus tienen un envoltorio conformado por el

apareamiento de dos estructuras esféricas, su material genético lo constituye una

molécula de ADN de hebra simple (Pernezny et al., 2004).

Se han encontrado algunas variantes del BGYMV, nombrándoseles según la región

de donde se aislaron: el BGYMV-BR –Brasil–, BGYMV-DR –República Dominicana–,

BGYMV-GA –Guatemala– y BGYMV-H (Homestead, Florida, USA).

Experimentalmente, BGYMV-H es muy similar al BGYMV-GA. Ya se ha determinado

la secuencia de ADN entera de varios tipos de BGYMV (Pernezny et al., 2004).

Gilbertson y colaboradores –1998– y Loniello y colaboradores –1992– confirmaron

que la variación en las propiedades biológicas del virus es reflejo de las grandes

diferencias entre las secuencias de sus ADNs. Se encontró que tres geminivirus distintos

provocan los síntomas del mosaico dorado, y que cada uno se encuentra en un

agrupamiento filogenético distinto. El aislado de Brasil formó su propio cluster

filogenético, mientras que los aislados de las Islas del Caribe, Jamaica, Centroamérica y

el sur de México se agrupan juntos con el aislado de Puerto Rico (Maxwell et al., 1999).

Estos estudios filogenéticos fundamentaron el cambio de nombre de los geminivirus

que infectan al frijol. Para los distintos geminivirus que causan síntomas de mosaico

dorado, en el “Segundo Taller Internacional de Mosca Blanca y Geminivirus” –1998– se

logró el consenso de llamar BGYMV a los aislados similares a BGYMV-BR –tipo I– y

que los aislados de El Caribe y de Centroamérica –tipo II- se designaran “Virus del

Mosaico Amarillo del Frijol” o BGYMV, nombre utilizado por primera vez en 1977 por

el Doctor Julio Bird y luego adoptado por Goodman y colaboradores (Maxwell et al.,

1999).

El BGYMV es transmitido en una manera semi-persistente por diferentes biotipos de

la mosca blanca (Bemisia tabaci Genn.), que tiene preferencia por un gran rango de

hortalizas como: tomate, pepino, chile y melón, así como leguminosas como la soya y el

frijol común. Se ha reportado que el BGYMV es endémico para la región afectada pero

también se conoce que causa epidemias serias cuando las condiciones son favorables para

el insecto vector, tales como: baja precipitación pluvial, plantaciones subsecuentes o

abuso de plaguicidas. Las pérdidas pueden ser del 45 al 100% durante las epidemias y la

enfermedad tiende a expandirse a lugares nuevos, incluso a mayores altitudes y latitudes

(Blair et al., 2007).

18

II.4.1. Síntomas

El BGYMV es un begomovirus bipartito, con dos moléculas de ADN de hebra simple

encapsidado en partículas quasi-icosahédricas en parejas (geminado) (Blair et al., 2007).

El síntoma más evidente en las hojas es un brillante mosaico amarillo o dorado, red de

venas amarillas y clorosis intervenal. El enrollamiento de las hojas es también común,

junto con la distorsión de la planta. Las leguminosas pueden sufrir malformaciones y

mostrar puntos de mosaico, mientras que las semillas presentan decoloración,

malformaciones y menor tamaño. Es común observar plantas enfermas rodeadas de

plantas saludables (Pernezny et al., 2004).

II.4.2. Diseminación

La propagación del virus en el campo y, por ende, de la enfermedad, se da mediada

por un vector: Bemisia argentifolii. Esta especie recientemente descrita se conoció

previamente como la mosca blanca (Bemisia tabaci “cepa B”). La mosca adulta es un

insecto blanco parecido a las palomillas, de cerca de un mm de largo con boca picadora-

chupadora. Estas moscas se congregan, se alimentan, se aparean y ponen huevos en el

envés de las hojas de las plantas que pueden pertenecer a más de 70 familias (Pernezny et

al., 2004).

La transmisión del virus puede ser mecánica, pero esta no parece tener mucha

importancia en el campo. Aparentemente el BGYMV se transmite a través de semilla

pero no por contacto entre plantas ni por el polen (Pernezny et al., 2004).

II.5. Historia del control genético del mosaico dorado del frijol

El control genético ha sido el objetivo más perseguido en la lucha contra el mosaico

dorado del frijol, a pesar de que hasta la fecha no se ha identificado ningún genotipo de

Phaseolus vulgaris completamente inmune al BGYMV (Morales, 2000).

El mejoramiento para la resistencia al virus ha sido la estrategia más efectiva para

controlar la enfermedad. Esto es especialmente verdadero dado que otras formas de

control son caras y poco prácticas, por ejemplo, el uso desmedido de insecticida para

controlar al vector está limitado por la rápida transmisión del virus y el desarrollo de

resistencia a los plaguicidas por la mosca blanca. Por esta razón, el mejoramiento se ha

enfocado en el mejoramiento genético por medio de la identificación de genes de

resistencia a los principales factores bióticos y abióticos que afectan al frijol (Blair et al.,

2007).

Los trabajos más exitosos de mejoramiento genético han sido realizados en

Centroamérica, gracias a un proyecto iniciado en 1974 y desarrollado entre el CIAT y el

ICTA, financiado por USAID, UNDP y, más tarde, por el Gobierno suizo. En este

estudio, el primer paso fue la identificación de fuentes de tolerancia como: Porrillo

Sintético, ICA-Pijao y Turrialba 1, todas variedades de grano negro. Estas variedades

fueron cruzadas entre sí para desarrollar las primeras líneas liberadas en 1979: ICTA-

19

Quetzal, ICTA-Jutiapán e ICTA-Tamazulapa. La variedad ICTA-Quetzal (DOR41), fue

más tarde liberada en el noroeste argentino, y una línea hermana fue liberada en México,

como Negro Huasteco 81. Posteriormente, el ICTA generó variedades más precoces a

partir de las DOR originales, por ejemplo, ICTA Ostúa (Morales, 2000).

Varios genes de resistencia para BGYMV se han identificado y su modo de

funcionamiento resulta en una atenuación de los síntomas y las pérdidas de rendimiento

que se derivan de la enfermedad de la planta (Blair et al., 2007).

El frijol “Garrapato”, una línea criolla de México, fue una de las mejores fuentes de

resistencia al mosaico dorado. Las investigaciones realizadas en Puerto Rico y Florida

demostraron que la resistencia derivada de Garrapato es controlada por un gen recesivo

denominado bgm-1. Garrapato se caracteriza por la falta de desarrollo de los síntomas del

mosaico, pero muestra la deformación de las vainas y rendimiento reducido bajo

presiones de la enfermedad de moderada a severa. Para balancear las pérdidas de calidad

y de rendimiento, el bgm-1 debe ser combinado con otros genes de resistencia que

produzcan vainas no deformes, y el gen bgm-2 que atenúa los síntomas del mosaico

(Kelly, Gepts, Miklas y Coyne, 2003).

La colaboración entre investigadores de la Universidad de Puerto Rico y el Servicio

de Investigación Agrícola del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos resultó

en la identificación de un marcador molecular RAPD ligado con bgm-1 en 1996.

Posteriormente, los investigadores en CIAT convirtieron al marcador RAPD en marcador

SCAR SR2570/530 que ha permitido la selección indirecta para este gen de resistencia.

Actualmente el gen bgm-1 y su marcador molecular son utilizados ampliamente en

programas públicos y privados de mejoramiento (Beaver y Rosas, 2003).

Existen varios mecanismos de resistencia al BGYMV en frijol común, que deben ser

combinados tomando en cuenta los diferentes ancestros –razas– de los genotipos de frijol

usados como fuentes de genes de resistencia. La genética de resistencia al BGYMV

puede estudiarse, fenotípicamente, tomando en cuenta el amarillamiento foliar, enanismo

de la planta, aborto de flores y formación de vainas (Morales, 2000). También, puede

estudiarse genéticamente estableciendo cruzas nuevas de progenitores resistentes y

susceptibles, observando la segregación en la progenie y la herencia de la resistencia.

II.6. Variedad de frijol ICTA Ligero

La variedad de frijol negro ICTA Ligero fue generada por el Instituto de Ciencia y

Tecnología Agrícolas (ICTA), con el apoyo del Programa Cooperativo Regional de Frijol

para Centroamérica (PROFRIJOL) y liberada en 1999 (Guillespie, 1999).

Origen: ICTA Ligero es una variedad producto de la cruza entre las líneas DOR385

(ICTA Achuapa) del CIAT y JU-90-4 (ICTA Chapina) del ICTA, realizada por el

Programa de Frijol del ICTA en el Centro de Producción de Jutiapa (Guillespie, 1999).

20

Adaptación: ICTA Ligero se adapta bien a alturas hasta de 1200 msnm y a la siembra

en planicies y laderas; puede sembrarse en monocultivo o asociada con maíz y sorgo. Su

precocidad les permite a las siembras de primera (de mayo a junio) escapar de los efectos

de la canícula (Guillespie, 1999).

Características morfológicas: ICTA Ligero es de hábito de crecimiento

indeterminado, de 60 cm de altura. La floración (flores color lila) ocurre entre 29 y 30

DDS. La vaina madura es de color crema y tiene seis granos de color negro. La madurez

fisiológica se alcanza a los 64 DDS y puede cosecharse a los 71 DDS (Guillespie, 1999).

Características culinarias: El tiempo de cocción en ollas de barro es de una hora con

10 minutos, obteniéndose un caldo espeso de buen sabor (Guillespie, 1999).

Características agronómicas: Comparado con los materiales criollos de la región,

ICTA Ligero es resistente a mosaico dorado y tolerante a antracnosis, bacteriosis y roya.

En Jutiapa ha mostrado rendimientos experimentales hasta de 2.59 toneladas métricas por

hectárea, con un promedio de 1.66 toneladas métricas. El rendimiento varía entre 20 y 30

quintales por manzana en monocultivo y en condiciones adecuadas de humedad

(Guillespie, 1999).

En evaluaciones para identificación de parentales resistentes a sequía, ICTA Ligero

ha escapado de los peores efectos del estrés hídrico debido a que tiene precocidad

extrema. Esta característica también le hace ser altamente resistente al ataque del

BGYMV (Beebe, Rao, Terán, Cajiao, Quintero, Tohme y Rosas, 2001).

II.7. Variedad de frijol SEA15

La variedad de frijol SEA15 es una progenie del cruce SX 12293 X {(SEA 5 X Apetito)

X [(BAT 477 X G 17341) X (XAN 309 X G 17722)]}. Uno de sus parentales resistentes a

sequía es la variedad SEA 5, que a su vez fue seleccionada como primer material para

sequía en programas de cruzas dobles combinando las variedades Bat 477, San Cristóbal,

G2618 y Río Tibaji. Estos últimos fueron selecciones no sujetas a mejoramiento que

mostraban comportamiento sobresaliente en condiciones de estrés hídrico (Beebe et al.,

2001).

El color de grano de SEA 15 es violeta o “roxo”, una herencia de su progenitor Apetito,

un cultivar mexicano. La ventaja de SEA 15 es que se combina fácilmente con variedades

de color de grano más comercial, como rojo o negro. Es en el aspecto de combinación en el

que SEA 15 es superior a SEA 5, pues es un buen donador de la resistencia a sequía y de

altos contenidos de hierro y zinc. Esta aptitud combinatoria se reflejó en la evaluación del

cruce SEA 15 X ICTA Ligero realizado en CIAT durante el año 2001 (Beebe et al., 2001).

II.8. El frijol desde el punto de vista molecular

Para poder mejorar las características del frijol es necesario conocer su genética y

asociarla con características fenotípicas de importancia agronómica, nutritiva o cultural,

21

con el objetivo de poder hacer el mejoramiento genético adecuado. Una de las principales

herramientas con que debe contar un fitomejorador es la variabilidad genética y

Guatemala es parte de uno de los centros de origen o diversidad genética del frijol a nivel

mundial (Sagastume et al., 2004).

En la actualidad, la demanda por utilizar eficientemente y conservar los recursos

naturales, tales como: el agua, los suelos fértiles, la biodiversidad y al mismo tiempo

maximizar la producción agrícola, ha llevado a enfocar los esfuerzos en identificar

cultivares capaces de tolerar el estrés hídrico, ya que pueden ser una opción para

estabilizar y expandir la producción de ambientes altamente secos, pues requerirían de

menos irrigación y en consecuencia se ahorraría agua (Singh, 1995). Así como cultivares

capaces de resistir el daño de enfermedades que limitan la producción. La identificación

de dichos cultivares requiere del estudio de un sin fin de poblaciones segregantes, porque

todas las características económicas y agronómicas no pueden segregar en una única

población. De esta forma, los genes para dichas características han sido localizados sobre

mapas desarrollados a partir de diferentes poblaciones segregantes. Los mapas son

creados uniendo la información proporcionada por diferentes tipos de marcadores

moleculares en mapas consenso. Estos mapas permiten ubicar las regiones genéticas

relacionadas con las características de interés y los marcadores moleculares altamente

ligados a ellas (Kelly et al., 2003).

La introducción al uso de los marcadores moleculares requiere de una definición

inicial como la siguiente: Es “cualquier fenotipo molecular oriundo de la expresión de un

gen”, como es el caso de las isoenzimas o de segmentos específicos de ADN

(correspondiente a regiones expresadas o no del genoma), que puede ser detectado y su

herencia monitoreada. Es importante agregar a esta definición que “un marcador

molecular es una molécula amplificada producto de la expresión de un gen”, en el caso

de los segmentos de ADN, o de una proteína, en el caso de las isoenzimas. La

identificación o caracterización, en otras palabras el establecimiento de sus propiedades

bajo ciertas condiciones, permite asociar genotipos con fenotipos específicos. Un

genotipo será, entonces, la expresión visual de la molécula aislada debida a la expresión

de un gen. Un fenotipo será, entonces, la expresión visual de una característica

promovida por la expresión de dicho gen (Ferreira y Grattapaglia, 1998).

Otra definición dice que “los marcadores moleculares son biomoléculas que se

pueden relacionar con un rasgo genético”. Las biomoléculas que pueden ser marcadores

moleculares son las proteínas (antígenos e isoenzimas) y el ADN (genes conocidos o

fragmentos de secuencia y función desconocida). Un marcador molecular monomórfico

es invariable en todos los organimos estudiados, pero cuando presenta diferencias en el

peso molecular, actividad enzimática, estructura o sitios de restricción, se dice que es

polimórfico. A veces el grado de variación es tal que se denominan hipervariable (Claros,

1998).

Los resultados de toda una serie de trabajos de genética de poblaciones con diferentes

organismos arrojaron información acerca de la naturaleza de la variación a nivel

molecular y trajeron como resultado la evidencia de que existía una gran variación

22

genética contenida en las proteínas y genes, misma que no podía ser justificada del todo

por efectos de la selección natural (Castillo, 2007).

Al proceso de caracterizar las diferencias a nivel molecular en un individuo dado se

conoce como genotipado. Muchas técnicas de genotipado han sido desarrolladas en estos

últimos años y, generalmente, están basados en una de las siguientes estrategias:

a) Genotipado clásico basado en hibridación. Involucra el corte de ADN genómico con

endonucleasas de restricción, seguido por la separación electroforética de los

fragmentos de ADN. Los Polimorfismos de Fragmentos de Tamaño Restringido

(RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphisms) son detectados por

hibridación de Southern con sondas específicas correspondientes a regiones

hipervariables del ADN (Tanksley et al., 1989; Botstein et al., 1980; Nakamura et al.,

1987; Jeffreys et al., 1991).

b) Genotipado basado en PCR. Involucra la amplificación in vitro de una secuencia

particular de ADN usando partidores específicos o arbitrarios y una polimerasa

termoestable. Los productos de la amplificación son separados por electroforesis y

detectados con tinciones especiales o el uso de partidores marcados con 32

P ó 33

P. Las

técnicas en ésta categoría incluyen el RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA

= Polimorfismo del ADN Amplificado al Azar) (Williams et al., 1990), el DAF

(DNA Amplification Fingerprinting = Genotipado de ADN Amplificado) (Caetano et

al., 1994) y AP-PCR (Arbitrarily Primed-PCR = PCR con Partidores Arbitrarios)

(Welsh y McClelland, 1990).

Los marcadores moleculares han jugado un rol importante en la caracterización

genética y el mejoramiento de muchas especies de cultivos. Han contribuido

enormemente en la evaluación de la biodiversidad, la reconstrucción de relaciones

filogenéticas y el entendimiento de la evolución e interacción entre plantas y

microorganismos. Los sistemas de marcadores moleculares revelan variaciones en la

secuencia del ADN genómico (FAO/IAEA, 2002).

La primera generación de marcadores moleculares son los mencionado en el inciso a)

del párrafo anterior. Estos se basan en la hibridización ADN-ADN y son de desarrollo

lento y muy costoso. La invención de la reacción en cadena de la polimerasa PCR para

amplificar segmentos pequeños de ADN dio paso a la segunda generación de marcadores

basados en PCR que son de desarrollo mucho más rápido de un costo mucho más bajo.

Actualmente, el avance de una nueva generación de marcadores se dirige a nuevas

técnicas de detección de tal forma que los marcadores siempre basados en PCR sean más

eficientes y de costos más efectivos (FAO/IAEA, 2002).

Según Espinoza (2007) “PCR son las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction

o Reacción en Cadena de la Polimerasa. La idea básica de la técnica es sintetizar muchas

veces un pedazo o fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a

temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus que vive a

altas temperaturas (79ºC a 85ºC), de ahí su nombre comercial más conocido: Taq

23

polimerasa. Cuando hacemos una reacción de PCR simulamos lo que sucede en una

célula cuando se sintetiza el ADN”.

En un tubo se mezclan todos los ingredientes necesarios para hacerlo: la polimerasa,

el ADN del organismo que queremos estudiar –donde se encuentra el fragmento que

queremos sintetizar– , los oligonucleótidos (llamados también primers, iniciadores,

cebadores, “oligos”, etc.) necesarios para que se inicie la transcripción, dinucleótidos

(dNTPs), y las condiciones para que la enzima trabaje adecuadamente (cierto pH,

determinadas cantidades de magnesio en forma de MgCl2, KCl, y pueden necesitarse

otras sales o reactivos, dependiendo de cada polimerasa). Esta técnica tan ingeniosa tiene

muchísimas aplicaciones distintas y se ha convertido en una herramienta muy importante

en la biología molecular. Sus aplicaciones van desde la genética de poblaciones,

evolución molecular y genómica, hasta la medicina forense (Espinoza, 2007).

Ante la controversia que genera la falta de coincidencia entre la información

molecular y la información morfológica, Rentaría (2007) expresa que “el principal

argumento en favor de la utilización de caracteres moleculares es que son universales. En

muchos casos, principalmente cuando se requiere comparar linajes con divergencia

temprana, es imposible establecer hipótesis de homología morfológica; en cambio,

existen genes presentes en todos los genomas celulares −como los ribosomales−, que

pueden proveer de información para reconstrucciones filogenéticas, donde los caracteres

morfológicos son inaplicables. Además, estudios teóricos y empíricos han mostrado que

en la reconstrucción de filogenias es crucial contar con numerosos caracteres

informativos y los estudios típicos de secuencias nucleotídicas implican varios cientos o

miles de caracteres en contraste con los estudios morfológicos, en los que un análisis

incluye raramente más de cien caracteres. Los datos moleculares también tienen la

ventaja de trabajar directamente con la base genética de la variación, mientras que la base

genética de la mayoría de los caracteres morfológicos se asume. Asimismo, en el

acercamiento molecular, los caracteres se pueden seleccionar y definir de una manera

relativamente objetiva”.

Los marcadores moleculares se utilizan extensivamente para investigar la base

genética de las características agronómicas y facilitar la transferencia y acumulación de

aquellas más deseables entre líneas de mejoramiento. Estos marcadores se limitan a

aquellos que pueden ser aplicados en un amplio rango de situaciones y que pueden ser

implementados con poca inversión en países en desarrollo (FAO/IAEA, 2002). Uno de

las técnicas más utilizadas para asociar características agronómicas y secuencias

genéticas es la técnica RAPD.

La definición de RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) establece que es

cualquier segmento de ADN que es amplificado usando como iniciadores dos

oligodeoxinucleótidos de secuencia arbitraria en reacción en cadena de la polimerasa

PCR (Kahl, 2001).

Los RAPD son utilizados para la generación de mapas genéticos, identificación de F1,

identificación varietal y de líneas, mejoramiento genético, análisis de segregantes,

24

estudios de diversidad, pruebas de semillas, clonaje posicional y selección asistida por

marcadores (MAS). Su implementación requiere de baja inversión, bajo costo de corrida

de muestras, pero baja portabilidad del laboratorio a los campos. Su ventaja es que

requiere de poca cantidad y calidad de ADN, no se requiere conocer la secuencia del

ADN que se analiza y se pueden detectar en gel de agarosa (FAO/IAEA, 2002). Al

analizar los datos obtenidos con RAPD se deben tener en cuenta dos supuestos: a) cada

uno de los marcadores representa un locus mendeliano en el cual el marcador visible, el

alelo dominante, está en equilibrio de Hardy-Weinberg con un alelo recesivo y, b) los

alelos marcados para diferentes loci no migran a la misma posición en el gel (Rentaría,

2007).

Los polimorfismos RAPD resultan de los cambios en los sitios de unión de los

iniciadores en la secuencia de ADN. Los productos pueden ser separados por

electroforesis en gel de agarosa y se interpretan como marcadores dominantes

(FAO/IAEA, 2002). La dominancia indica que no pueden discernir los homocigotos

dominantes de los heterocigotos para un segmento particular, por lo que la estimación de

las frecuencias alélicas se debe hacer de manera indirecta, asumiendo equilibrio de

Hardy-Weinberg (Rentaría, 2007). Para convertirlos en marcadores codominantes se

utilizan como base para desarrollar un marcador SCAR.

La técnica SCAR (Región Amplificada de una Secuencia Caracterizada y

Secuenciada) fue descrita en 1993. Esta técnica aprovecha que los RAPD proporcionan

principalmente fragmentos de ADN altamente repetido. Estos fragmentos de RAPD se

clonan y secuencian para elaborar oligonucleótidos específicos. Aunque permite el

desarrollo rápido de marcadores moleculares, el grado de polimorfismo obtenido es

bastante bajo (Claros, 1998).

La conversión de marcadores RAPD en regiones caracterizadas por su secuencia

(SCAR), mediante el diseño de cebadores más largos y específicos basados en la

secuenciación del marcador RAPD, aumenta significativamente la reproducibilidad y

simplifica la técnica PCR, preparándola así para la automatización e incrementando, por

tanto, su utilidad en mejora genética. Un fragmento polimórfico de interés puede ser

escindido de un gel, clonado (o no) y secuenciado, para diseñar iniciadores específicos

para ese fragmento en particular, permitiendo su amplificación en condiciones de PCR

más rigurosas (Rentaría, 2007).

II.9. Selección asistida por marcadores moleculares para resistencia a BGYMV

BGYMV es la enfermedad viral del frijol más seria y limitante en Centroamérica.

Para controlar esta enfermedad, es necesario piramidar genes que confieran resistencia,

no sólo a BGYMV, sino también a otras enfermedades transmitidas por la mosca blanca.

La selección asistida por marcadores permite eliminar segregantes en generaciones

tempranas y optimiza el espacio y recursos dedicados a la población en desarrollo y

permite hacer una selección en líneas avanzadas para confirmar la presencia de genes de

resistencia a BGYMV antes de incluir estás líneas como progenitoras (Blair et al., 2002).

25

La resistencia a BGYMV depende de la acumulación de varios genes, el gen más

importante conocido e implicado en la resistencia es bgm-1. Urrea et al. (1996)

identificaron un marcador molecular RAPD muy cercano ligado a bgm-1 y después este

fue convertido en SCAR en CIAT, el cual fue usado para identificar el gen recesivo bgm-

1 que confiere la resistencia a BGYMV en frijol (Miklas, 2010).

Este marcador es llamado SR2 y es ampliamente utilizado en CIAT para selección

asistida en generaciones tempranas (F1) debido a la herencia recesiva de bgm-1 y porque

la enfermedad es difícil de detectar en el campo y en invernaderos. El cultivar Genuine es

resultado directo de este esfuerzo (Miklas, 2010).

El marcador molecular SR2 es empleado extensivamente por científicos en CIAT

para asegurar que el gen bgm-1 está presente en todo el germoplasma nuevo destinado a

producción en Centroamérica (Kelly et al., 2003). Es un marcador codominante y

polimórfico y el tamaño de los fragmentos amplificados es de 530 pb en el genotipo

resistente ó 570 pb en el genotipo susceptible (Miklas, 2004).

Recientemente, Blair et al. (2007), reportaron la secuencia de nucleótidos del

fragmento de ADN amplificado por SR2 en los cultivares SEL1309 (resistente a mosaico

dorado) y DOR476 (susceptible a mosaico dorado). Esta investigación, con una

herramienta bioinformática, reveló que la diferencia entre los fragmentos es una

inserción/deleción de 40 nucleótidos. También, desarrollaron un nuevo marcador llamado

SR21 que flanquea más cercanamente la inserción/deleción, dando como resultado un

producto de amplificación más pequeño.

El proceso de selección asistida por marcadores consiste en amplificar por PCR un

fragmento del gen bgm-1 que contiene una inserción/deleción que produce polimorfismos

en los individuos resistentes y susceptibles. El diagnóstico se hace detectando la

diferencia entre la migración de los fragmentos que son de mayor tamaño en el caso de

SR2 y más pequeños para SR21 (Blair et al., 2007).

26

PARTE III

III. RESULTADOS

III.1.Discusión de Resultados

III.1.1. Establecimiento de la población segregante sujeta a selección asistida

por marcadores moleculares

En esta investigación, un aspecto de vital importancia fue establecer si ICTA Ligero y

SEA 15 eran genéticamente compatibles, en otras palabras que daría lugar a suficiente

semilla como para conformar una población de estudio. Las primeras pruebas se

realizaron bajo condiciones controladas en invernadero, donde se sembraron un alto

número de plantas de cada variedad en diferentes épocas y se logró coordinar la floración

de ambas variedades (fotografía 7). La polinización manual de los parentales fue exitosa

en 170 cruces ICTA Ligero X SEA 15 y 160 cruces SEA 15 X ICTA Ligero.

A pesar de la buena compatibilidad observada entre las dos variedades (Beebe et al.,

2001) se observaron los mejores resultados utilizando a ICTA Ligero como progenitor

femenino. Esto fue ventajoso para mantener las características deseables de dicha

variedad. De la emasculación y la polinización exitosa de las flores de ICTA Ligero,

debidamente identificadas, se obtuvieron vainas (fotografía 8) con semilla F1. Toda esta

semilla fue sembrada y se retrocruzó con ICTA Ligero con el objetivo de recuperar el

genotipo en la población resultante. Se observó que en la retrocruza se fijaron

características como color de grano negro, precocidad y alta producción, tan apreciadas

en ICTA Ligero; en contraste con el color de grano morado y baja producción de SEA15.

Las vainas resultantes de la retrocruza exitosa fueron identificadas individualmente.

Toda la semilla cosechada constituyó la población segregante que se buscaba para

continuar con la investigación y las semillas de cada vaina lograda constituyeron una

subpoblación. Utilizando esta organización, la semilla BC1F2 fue sembrada en campo, se

adelantó una generación al mismo tiempo que se evaluó su respuesta a mosaico dorado.

III.1.2. Evaluación en campo de la respuesta de la población al mosaico dorado

Ya establecida la población segregante resultado de la retrocruza de interés pudo ser

evaluada bajo condiciones de campo reales con alta incidencia de mosaico dorado en la

región del corredor seco de Guatemala. Gracias a la comunicación con otros

investigadores, se conoció de una finca de un agricultor particular, quien perdió toda su

cosecha de frijol a causa del daño por virus. Después de llegar a un acuerdo, el agricultor

cedió su parcela para que se estableciera el experimento en la finca El Conacaste,

municipio de Sanarate, departamento de El Progreso. Esta parcela se adaptó

perfectamente a esta investigación pues se observó una alta población de mosca blanca,

transmisora efectiva de virus BGYMV, sometiendo a la población segregante a una real y

fuerte presión de mosaico dorado. Por ser una fuente in situ de inóculo se le denominó

parcela-vivero. Debido a que se encuentra en una zona del Corredor Seco, de acuerdo con

27

la Asociación EDUCCA, la parcela-vivero, además, proporcionó las condiciones

favorables para identificar plantas con cierta tolerancia a sequía.

La población segregante se sembró en la parcela en septiembre del 2010 con una

organización de subpoblación por surco de siete posturas con tres semillas por postura,

con tres surcos control con ICTA Ligero, SEA15 y Rojo de seda (fotografía 9). Después

de un mes de cultivo, se seleccionaron plantas al azar dentro de la subpoblación

(fotografía 10) y se hizo el primer muestreo de material vegetal para afinar las

condiciones adecuadas para la selección molecular de las plantas portadoras del gen de

resistencia al mosaico dorado (referirse a sección III.3).

A mediados de noviembre del 2010, se evaluó la incidencia y severidad del mosaico

dorado en las plantas seleccionadas. El diagnóstico se hizo identificando solamente la

presencia de las características propias del mosaico: clorosis, enrollamiento de hojas y de

vainas; obviando los efectos producidos en las plantas por otras enfermedades. Los

resultados resumidos en el cuadro 3 muestran la alta variabilidad fenotípica observaba en

la población como respuesta a la presión, no sólo de mosaico dorado, sino de todos los

estreses bióticos y abióticos a los que fue sometida la parcela-vivero. Más de la mitad de

las plantas mostraron un fenotipo resistente al mosaico dorado. Entre estas se observaron

algunas con muy buena arquitectura. Las plantas muertas probablemente fueron

altamente susceptibles a la sequía y a las enfermedades. Se encontró alta incidencia de

daño debido a apión, hongos e insectos. El efecto sobre los controles corroboró que hubo

una fuerte presión de mosaico dorado y sequía moderada (fotografía 11).

En esta fase de la investigación, se esperaba tener los resultados de la selección

asistida para correlacionarlos con el fenotipo mostrado por las plantas en el campo,

lamentablemente no se logró debido a las dificultades encontradas en la adaptación de las

metodologías relacionadas con la selección asistida.

Cuadro 3. Resumen del diagnóstico fenotípico visual de la población BC1F2 evaluada

en la parcela-vivero (referirse al cuadro 6 en anexos para detalle).

Fenotipo Símbolo Porcentaje

Resistente R 58%

Susceptible S 15%

Muerto M 16%

Dudoso ? 12%

Total 100% Fuente: Proyecto FODECYT 42-2008.

A finales de noviembre del 2010 las plantas en la parcela estaban listas para la

cosecha. Se cosechó una vaina por planta a lo largo del surco para conservar la

subfamilia. Los granos resultantes se clasificaron para tener tres réplicas de descendencia

de semilla única que representara la variabilidad existente en cada subpoblación

(fotografía 12). El efecto de las enfermedades durante la época de llenado y maduración

de grano dió como resultado una cosecha de granos muy pequeños cuya viabilidad fue

comprobada en la siguiente siembra en invernadero, donde germinaron sólo aquellos

granos viables.

28

En los primeros días de diciembre del 2011, la primera réplica de las subpoblaciones

fue sembrada en invernadero. Este último paso se hizo para tener material vegetal para

concluir la adaptación de la metodología de selección asistida y aprovechar para obtener

la siguiente generación. Durante esta fase se colectaron datos adicionales como color de

flor y color de grano, los cuales fueron utilizados para la selección final de las

subpoblaciones interesantes. El color de grano negro y resultado genético positivo fueron

las características más importantes en el proceso de avance generacional y liberación de

una nueva variedad en el futuro. Cómo se esperaba, la población mostró un crecimiento

indeterminado en el 95% de las plantas, una característica de los progenitores (fotografía

12).

III.1.3. Adaptación de la metodología de selección asistida por marcadores

moleculares de plantas portadoras del gen bgm-1

Se utilizó como punto de partida la metodología de selección asistida por marcadores

moleculares reportada por Blair et al. (2007) utilizando los marcadores moleculares SR2

y SR21 para identificar plantas de frijol portadoras del gen de resistencia al mosaico

dorado. En el proceso de adaptación de dicha metodología en esta investigación se buscó

establecer protocolos compatibles con el formato 96. Este está basado en un arreglo de 12

columnas con ocho filas que se ajusta a multipipetas y termocicladores adaptados a

placas de PCR de 96 muestras por corrida (fotografía 13).

La adaptación de la metodología se inició con establecer las condiciones adecuadas

para la amplificación de los marcadores en los progenitores de la población de interés. Se

sembraron en invernadero semillas de cada progenitor y se extrajo ADN siguiendo el

protocolo básico utilizado en el laboratorio de Biotecnología (Ponciano et al., 2009) que

es una extracción clorofórmica en tubo individual. Luego se amplificaron los marcadores

utilizando dos mezclas de reacción, variando la concentración de partidores y Taq

Polimerasa (Prueba 1: 1 μM y 2U; Prueba 2: 0.25 μM y 1U, respectivamente).

En la fotografía 1 se muestra la visualización de los productos de amplificación, que

efectivamente revelaron polimorfismo entre las variedades progenitoras y amplificaron

productos de aproximadamente 570/530 pb para SR2 y 269/232 pb para SR21. A pesar

de que la literatura reportaba la prueba 2 (Blair et al., 2007), las condiciones en la prueba

1 fueron las más adecuadas para la amplificación en esta investigación. Esto pudo ser

debido a la concentración inicial de los partidores, la calidad de la Taq polimerasa

utilizada o las condiciones ambientales. Todos estos aspectos tienen un efecto directo

sobre la reproducción de los resultados reportados previamente, por esta razón deben ser

adaptados a las condiciones locales de cada laboratorio.

Con los polimorfismos parentales identificados, se procedió a analizar la progenie de

la población segregante que se encontraba sembrada en la parcela-vivero preparada para

esta investigación. En el campo se seleccionaron al azar tres plantas por subpoblación,

para un total de 438 plantas, de las que se muestreó material vegetal joven.

29

El muestreo consistió en tomar hojas trifoliadas pequeñas y con ayuda de una pinza

introducirlas en la celda correspondiente en las cajas de megatítulo (fotografía 2). El

formato 96 resultó ser muy ventajoso para el muestreo en campo. Por ser una caja liviana

de celdas profundas, fue fácil llevarla por todo el terreno, sin pérdidas de tejido o

contaminación cruzada, evitándose la complicación de trabajar con miles de tubos

individuales o tapaderas. La identificación estaba implícita en el formato por lo que se

redujo considerablemente el tiempo utilizado en rotulación individual. También resultó

muy conveniente para el transporte de las muestras del campo al laboratorio, pues las

cajas fueron fácilmente colocadas en una hielera con gel de congelación para mantener la

temperatura baja y evitar la degradación del tejido.

Fotografía 1. Amplificación de los marcadores SR2 y SR21 para los progenitores (C8= SEA15,

C9=ICTA Ligero, C10 = Otro cultivo sin el gen bgm-1, M= Escalera molecular).

Fuente: Proyecto FODECYT 42-2008.

En el laboratorio, el almacenamiento fue facilitado por las mismas ventajas

mencionadas. Se observó que el material congelado correctamente puede ser almacenado

a -20ºC por un máximo de tres días, permitiendo acoplar el proceso en los fines de

semana. Esto pudo ser establecido pues durante la investigación se tuvieron problemas

con el sistema de alimentación eléctrica que sometieron las muestras a congelamiento y

descongelamiento constante cuyo efecto desfavorable fue corroborado con los resultados

de amplificación de marcadores.

En esta investigación se intentó, por primera vez, la extracción de ADN en cajas de

megatítulo y, por lo tanto, se enfrentaron varias dificultades cambiando las condiciones

para concluir con una adaptación exitosa de esta nueva tecnología. El formato 96 como se

ha mencionado, resultó ser ventajoso en la etapa de muestreo y traslado de muestras.

También se observó que permite manipular un alto número de muestras al mismo tiempo,

por lo que se buscó aprovechar lo aprendido en el muestreo para sacar beneficio en el

resto del proceso.

La extracción de ADN se intentó con el protocolo básico adaptado al laboratorio

(Ponciano et al. 2009) y que dió buenos resultados en la extracción de ADN de los

progenitores. Lamentablemente, la caja de megatítulo solo se ajustó a los primeros pasos

del protocolo. Funcionó muy bien en la pulverización con nitrógeno líquido, pues se

ahorró tiempo, al moverse rápidamente de celda a celda, y reactivo, al verterlo

P1 P2 C8 C9 C10 C8 C9 C10 M C8 C9 C10 C8 C9 C10

SR2 SR21 SR2 SR21

30

directamente en la celda congelando completamente la muestra. También, permitió

incubar 96 muestras al mismo tiempo, pues las celdas transmitieron efectivamente el

calor a la mezcla. La caja se pudo sumergir en el baño de María con un bajo nivel de

agua. Los resultados fueron buenos siempre que no se agitó la caja.

Se estableció que las extracciones clorofórmicas no pueden hacerse en la caja, pues es

imposible sellarlas herméticamente, por lo que no pueden ser agitadas vigorosamente. De

hacerlo, se corre el riesgo de que la presión generada por la interacción química y la

agitación provoque una explosión de cloroformo, poniendo en riesgo la seguridad en el

laboratorio. La solución que se encontró fue utilizar la caja para los pasos es los que no se

requiere agitación o en los que dar unos golpes suaves dan un efecto parecido y para

continuar el protocolo se necesitó trasladar la mezcla a tubos individuales. Con esto, se

regresó a la forma tradicional de extracción en la que solo se trabajan 42 muestras por

día. Para intentar mantener el desempeño de 96 muestras diarias, se redujo el protocolo a

la versión final que se muestra en la sección I.4.5. Prueba 1. En él se contempla sólo una

extracción clorofórmica en tubo. El ADN obtenido de esta forma no fue de buena calidad,

pues se precipitó en baja cantidad, con muchos pigmentos y alta oxidación. Después se

intentó la amplificación según el protocolo adaptado en los controles y se obtuvo una

visualización de productos de PCR en forma de nube, que daban una idea del

polimorfismo, muy lejana de la banda característica de los progenitores (fotografía 2).

Para evitar ambigüedades o falsos resultados se decidió repetir los procedimientos

con algunas modificaciones. En total se realizaron dos muestreos en los meses de octubre

y noviembre en la parcela-vivero. Con base en estos resultados se modificó el protocolo

de extracción diluyendo el ADN a diferentes concentraciones para evitar interferencias de

pigmentos y se aumentó la cantidad de Taq polimerasa a 3U y 4U para promover la

amplificación. Con esto se aumentó el trabajo y el costo pero no se mejoró la

visualización (fotografía 3). Se concluyó que las 4U de Taq polimerasa podrían ayudar

pero no son necesarias si se tiene ADN de mejor calidad.

Fotografía 2. Amplificación del marcador SR21 en ADN de extracción clorofórmica (C8= SEA15,

C9=ICTA Ligero, M= Escalera molecular).

Fuente: Proyecto FODECYT 42-2008.

C8 C9 M

31

Después de varias pruebas sin éxito, se alcanzó la época de cosechar la población que

se tenía en la parcela-vivero para no perder el material que se había adelantado una

generación. Lamentablemente, debido que no se obtuvieron los resultados esperados para

las plantas sujetas a selección asistida, no se pudo cumplir el objetivo de validar los

primeros haciendo una correlación entre los diagnósticos fenotípicos y genotípicos. Sin

embargo, los avances hechos en la evaluación en campo se tradujeron en subpoblaciones

con características potenciales de resistencia al mosaico dorado y tolerancia a sequía que

pueden seguir el proceso de mejoramiento genético.

Fotografía 3. Amplificación del marcador SR21 con 4U de Taq Polimerasa (M= Escalera molecular,

C8= SEA15, C9= ICTA Ligero).

Fuente: Proyecto FODECYT 42-2008.

En diciembre del 2011, la población se sembró en invernadero con el objetivo de

obtener material vegetal para concluir la adaptación de la metodología de selección

asistida y adelantarla una generación, esperando esta vez utilizar el diagnóstico molecular

para conservar únicamente las plantas portadoras del gen bgm-1. En esta ocasión, se hizo

un muestreo al azar de dos plantas por subpoblación siguiendo el formato 96 (fotografía

14).

Para aprovechar la experiencia adquirida y las ventajas encontradas en la

manipulación de un gran número de muestras en el formato 96, se buscó un protocolo de

extracción de ADN que se pudiera adaptar a las cajas de megatítulo. En investigaciones

anteriores (Ponciano 2004; Ponciano et al. 2005) se había reportado una extracción

alcalina rápida, que incluso se utilizó con buenos resultados en selección asistida del gen

opaco-2 de alto nivel de proteína en maíz. Aunque nunca se había realizado en formato

96, se consideró una buena alternativa para la amplificación de SR2.

Este protocolo provee de ADN de baja calidad pero, es suficiente para la PCR, que

debe ser amplificado de inmediato, es de muy bajo costo y se invierte muy poco tiempo

(Ponciano, 2004). En la adaptación del protocolo original, se agregó un paso de

pulverización de tejido con nitrógeno líquido, aumentando la cantidad de ADN final.

También se observó que funciona con material que ha sido almacenado en las cajas de

M

C8 C9

32

megatítulo durante tres días en congelación continua. Después de realizar varias pruebas

de tiempos de almacenamiento y diluciones de ADN, se concluyó que la amplificación

debe ser inmediata, sin diluciones adicionales y no se debe almacenar la mezcla de

extracción. No son necesarias más de 2U de Taq polimerasa. En la fotografía 4 se

observan los polimorfismos amplificados con ADN proveniente de extracción alcalina.

Como se ve son bandas bien definidas que dan un diagnóstico inequívoco del estado del

gen en la planta analizada. En todas las muestras, incluso en los controles, además de la

banda del marcador molecular se visualizó una nube que corresponde a los componentes

de la mezcla de reacción de PCR que no son utilizados, y algunos otros como ARN

(Ponciano, 2004). Donde sólo hubo nube, se anotó un resultado de no amplificación

(fotografía 4).

Fotografía 4. Fragmento de la visualización de SR21 para muestras sometidas a extracción alcalina

(M= Escalera molecular, C8= SEA15, C9=ICTA Ligero, N= Negativo, P= Positivo, H= Heterocigoto).

Fuente: Proyecto FODECYT 42-2008.

El resumen de los resultados obtenidos para la población analizada se muestra en

el cuadro 4 y los datos detallados en el cuadro 7 en la sección de anexos. Aunque el 70%

de las muestras amplificaron una banda bien definida, el resto no amplificó. Esto pudo ser

debido a que el resultado siempre es afectado por la calidad y cantidad final de ADN que

se pone en la reacción de amplificación.

Cuadro 4. Resumen del diagnóstico molecular de la población BC1F3 analizada con

los marcadores SR2 y SR21 (para mayor detalle ver cuadro 7 en anexos).

Fenotipo Símbolo Porcentaje

Positivo P 37%

Negativo N 29%

No amplificó ? 27%

No germinó 0 3%

Heterocigoto H 4%

Total 100% Fuente: Proyecto FODECYT 42-2008.

M

C8 C9 C- N P H

33

Esta información se utilizó para hacer la selección de plantas que tenían potencial

para ser nuevas variedades en el futuro. Dichas plantas cumplieron con dos requisitos

esenciales: ser portadoras (resultado positivo) del gen bgm-1 y tener grano negro

pequeño. De toda la población, sólo 10 plantas fueron seleccionadas. Esta colección

reducida, tienen un alto potencial para el mejoramiento genético en Guatemala. En

proyectos futuros podrá ser resembrada y reevaluada, tanto agronómica como

molecularmente, varias veces en el proceso de avance generacional. También permitirá,

en una investigación futura, cumplir con el objetivo de correlacionar la resistencia

fenotípica mostrada por estas subpoblaciones bajo alto estrés del virus del mosaico

dorado en campo con el resultado experimental molecular que indica que son portadoras

del gen de resistencia. Esta evaluación será importante para determinar la efectividad de

los marcadores moleculares, que puede ser afectada por mutaciones tanto en el virus

como en el frijol relacionadas con la evolución patógeno-hospedero.

La experiencia adquirida en esta investigación, será de mucha utilidad en nuevos

trabajos de selección asistida por marcadores, ya que sienta las bases para la adaptación

de cualquier nuevo marcador molecular que sea desarrollado para conferir la resistencia a

otras enfermedades que afectan al frijol y también extenderla a otros cultivos de

importancia nacional.

34

Fotografía 5. Diagnóstico fenotípico de plantas. R=resistentes, S= susceptibles y M=muertas.

Fuente: Proyecto FODECYT 42-2008.

Fotografía 6. Muestreo en campo y traslado del material vegetal al laboratorio utilizando formato 96.

Fuente: Proyecto FODECYT 42-2008.

Fotografía 7. Desarrollo de variedades progenitoras en invernadero. De izquierda a derecha: ICTA

Ligero y SEA15.

Fuente: Proyecto FODECYT 42-2008.

R M S

35

Fotografía 8. Cruce entre ICTA Ligero y SEA15. A) Emasculación de flores. B) Identificación. C)

Maduración. D) Cosecha de vainas formadas.

Fuente: Proyecto FODECYT 42-2008.

Fotografía 9. Población BC1F2 sembrada en parcela-vivero para evaluación fenotípica de la

resistencia a BGYMV.

Fuente: Proyecto FODECYT 42-2008.

A B

C D

C D

36

Fotografía 10. Plantas seleccionadas (lazos de color rojo) para el diagnóstico fenotípico y genotípico

dentro de las subpoblaciones BC1F2.

Fuente: Proyecto FODECYT 42-2008.

Fotografía 11. Parcela-vivero al momento de la evaluación fenotípica.

Fuente: Proyecto FODECYT 42-2008.

37

Fotografía 12. A) Selección de descendencia de semilla única. B) Siembra de la réplica “A” en

invernadero. C) Muestra de crecimiento indeterminado en la población.

Fuente: Proyecto FODECYT 42-2008.

Fotografía 13. Adaptación del formato 96 desde la transferencia del ADN en la caja de megatítulo de

extracción, a la placa de PCR y al gel de visualización. A) Caja de megatítulo de extracción. B) Placa

de PCR. C) Gel de visualización.

Fuente: Proyecto FODECYT 42-2008.

Figura 14. Muestreo en invernadero siguiendo el formato 96. A) Muestreo de hojitas. B) Caja de

megatítulo con muestras. C) Caja de muestreo completa.

Fuente: Proyecto FODECYT 42-2008.

A B C

B

C

A

B

C

A

A

A

A

A

38

PARTE IV

IV.1. CONCLUSIONES

Se estableció la población segregante ICTA Ligero X (ICTA Ligero X SEA 15) F1.

Las variedades ICTA Ligero y SEA15 son genéticamente compatibles, obteniendo los

mejores resultados al usar la primera como progenitor femenino con emasculación

antes de la polinización artificial.

Se obtuvo alta variabilidad fenotípica como respuesta al estrés de BGYMV en la

población BC1F2 sembrada en la parcela-vivero, pues se observaron tanto plantas con

alta resistencia como plantas con alta susceptibilidad.

No se pudo correlacionar el fenotipo evaluado en la parcela-vivero con el genotipo de

las plantas sujetas a selección asistida porque no se logró el diagnóstico molecular antes

de cosechar.

Se adaptó la metodología de selección asistida por los marcadores SR2 y SR21 para

resistencia al BGYMV conferida por el gen bgm-1.

El formato 96 en cajas de megatítulo es favorable para el muestreo en campo e

invernadero. Permite ahorrar tiempo debido a la identificación implícita y el

ordenamiento de las muestras acelera la transferencia a placas de PCR. Evita la

contaminación cruzada y se manipulan 96 muestras al mismo tiempo.

La extracción alcalina puede realizarse en caja de megatítulo. Permite obtener ADN de

calidad aceptable para amplificación por PCR con 2U de Taq polimerasa sin necesidad

de dilución posterior. Se demostró que puede utilizarse tejido almacenado a -20°C por

un máximo de tres días.

El porcentaje de amplificación fue de 70%, probablemente depende de la calidad y

cantidad de ADN final que se usa en la mezcla de amplificación.

Se alcanzó la generación BC1F4 de la población segregante y se seleccionaron 10

individuos que son portadores del gen bgm-1 por lo que se espera que sean resistentes a

BGYMV.

La metodología de selección adaptada en esta investigación puede ser adaptada a otros

marcadores y otros cultivos contribuyendo efectivamente al desarrollo de nuevas

variedades mejoradas para Guatemala.

39

IV.2. RECOMENDACIONES

Realizar consultas con investigadores con más experiencia en extracción alcalina

para Selección Asistida por Marcadores, por ejemplo, con el Doctor Mathew

Blair, para determinar la razón por la cual los marcadores SR2 y SR21 no

amplifican en un cien por ciento y encontrar soluciones para que la visualización

de los genotipos sea inequívoca y mejor aprovechada.

Intentar realizar la extracción con más material vegetal que el utilizado en esta

investigación.

En cuanto sea posible, se recomienda sembrar el material en el invernadero con el

fin de someter las muestras a los protocolos en el menor tiempo posible.

Continuar con el avance generacional por autofecundación de los individuos

seleccionados en esta investigación portadores del gen bgm-1 al nivel de

endogamia requerido para la liberación de nuevas variedades.

Realizar una evaluación fenotípica de la población obtenida a partir de los 10

individuos seleccionados en una nueva generación y comprobar que el genotipo

resistente diagnosticado para estos individuos coincide con su fenotipo en un

ambiente de presión de BGYMV.

Aplicar el proceso de adaptación detallado en esta investigación en la validación

de metodologías de selección asistida con nuevos marcadores moleculares para

otras enfermedades del frijol, y otras características de interés en diferentes

cultivos de importancia para Guatemala.

40

IV.3. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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consulta: Septiembre 2011. Fecha de última actualización: Enero 2011.

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polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.

Nucleic Acids Research 18:6531.

43

IV.4. ANEXOS

44

IV.4.1. Anexo 1. Reconstitución de partidores (Ponciano, 2004).

REACTIVOS: Tris-HCl 10mM y Agua Ultra Pura.

EQUIPO: Espectrofotómetro UV/Visibles SmartSpec 3000™ Bio-Rad.

Preparación:

1. Preparar solución de Tris-HCl 10 mM pH 8.0.

2. Centrifugar 10 segundos los tubos originales.

3. Agregar 200 μL de Tris-HCl 10 mM a cada tubo. Mezclar y centrifugar 10

segundos.

4. Hacer diluciones 1:333, agregando 3 µL de primer en 1 mL de agua ultra-pura.

5. Calentar estas diluciones a 65°C por cinco minutos, centrifugar 10 segundos.

6. Repetir la incubación a 65°C por cinco minutos y enfriar.

7. Seleccionar el modo de operación DNA/RNA del SmartSpec 3000™. Seleccionar

DNA oligo.

8. Indicar que no se conoce el coeficiente de extinción molar.

9. Ingresar el valor de factor de conversión de A260nm a concentración 30 μg/mL.

10. Ingresar el valor de la masa molecular del oligonucleótido.

11. Blanquear con agua ultra-pura.

12. Determinar la concentración del primer en el tubo original.

13. Hacer la dilución de cada partidor necesaria para la reacción de PCR

(12.5 pmol/µL en este caso).

14. Preparar una mezcla 1:1 de partidores diluidos (F+R).

IV.4.2. Anexo 2.

Cuadro 5. Descripción de partidores SR2 y SR21 (Blair et al., 2007).

Nombre

del

Marcador

Secuencias Descripción

Tamaño

producto

(R/S)

Temperatura

de

hibridización

SR2

F=

CACAGCTGCCACAGGTGGGA

R=

CACAGCTGCCCTAACAAAAT

Gen bgm-1

codominante 533/570 60°C

SR21

F=

CATGAGGGGCATGAGATGCG

R=

CACAGCTGCCCTAACAAAAT

Gen bgm-1

codominante 232/269 60°C

F=forward, R= reverse, R= resistente, S=susceptible.

45

IV.4.3. Anexo 3.

Cuadro 6. Resultados detallados de la evaluación en campo, en la parcela vivero, de la población BC1F2.

Familia/planta 1 2 3 Familia/planta 1 2 3 Familia/planta 1 2 3 Familia/planta 1 2 3

33 R M R 65 R R M 97 R R ? 129 ? R R

34 M R M 66 R R M 98 R S R 130 S S S

35 R R ? 67 R R R 99 R M R 131 S ? ?

36 S R S 68 R R M 100 R S R 132 ? M S

37 R R M 69 ? R R 101 S S R 133 R M S

38 M R S 70 R R R 102 R ? ?

39 R R M 71 M ? M 103 ? R R

40 R S M 72 R S R 104 R R M

41 R S S 73 R R M 105 S M S

42 S M R 74 ? R R 106 R M R

43 R R R 75 R S S 107 R M ?

44 R R R 76 S R ? 108 R M R

45 R M R 77 R R R 109 ? R R

46 R R R * 78 S ? R 110 R R R CLAVE

47 R * R * R * 79 R ? M 111 M R M Duda ?

48 R R R * 80 M ? M 112 R ? M Buena arquitectura

49 R R R * 81 ? S R 113 R S M Resistencia *

50 R R R 82 R R M 114 R S R Resistente R

51 M R R 83 R M R 115 ? M R Susceptible S

52 R ? R 84 R R R 116 S S R Muerta M53 R R ? 85 R R M 117 R R ?

54 ? ? S 86 R S M 118 ? R R

55 M R R 87 R R R 119 R R R

56 R M R 88 R M R 120 ? R R

57 R R S 89 R R R 121 ? ? ?

58 R S S 90 S R M 122 R S ?

59 M ? ? 91 ? R M 123 ? R ?

60 R * ? R 92 ? ? R 124 R R ?

61 R R R * 93 R ? R 125 R R M

62 R R R 94 R S R 126 R R S

63 R R R 95 S ? S 127 R ? ?

64 R ? R 96 S R ? 128 M M R

46

IV.4.4. Anexo 4.

Cuadro 7. Resultados detallados del diagnóstico molecular de la población BC1F3 analizada con los marcadores SR2 y SR21.

11 ? P 62 0 0 95 ? ? 128 P P

12 ? ? 63 P P 96 ? ? 129 P ?

13 N N 64 H H 97 ? ? 130 ? ?

14 P N 65 H H 98 ? ?

15 P P 66 P P 99 ? ?

16 ? P 67 P P 100 ? ? Clave

17 ? ? 68 H N 101 ? P Resistente P

18 ? N 69 H N 102 ? P Susceptible N

19 P P 70 P P 103 N N No amplificó ?

20 N P 71 N N 104 P P No germinó 0

21 N N 72 N P 105 P ? Hetocigoto H

22 N P 73 H P 106 ? ?

23 ? ? 74 P P 107 P N

24 ? ? 75 P N 108 N P

25 P N 76 P N 109 P ?

26 N N 77 N N 110 P P

45 N P 78 N N 111 N ?

46 P P 79 P P 112 ? P

47 N ? 80 ? N 113 N N

48 ? P 81 0 0 114 P P

49 N P 82 P P 115 N P

50 N N 83 P N 116 ? P

51 P P 84 ? P 117 P P

47

IV.4.5. Anexo 5. Breve biografía académica de los investigadores

Héctor Sagastume

Título de Ingeniero Agrónomo de la Facultad de Agronomía de la Universidad de San

Carlos de Guatemala, con especialización en Fitotecnia. Título de Máster en Ciencias

Agropecuarias y de los Recursos Naturales Renovables, con especialidad en

Fitomejoramiento, obtenido en el Centro Agronómico Tropical de Investigación y

Enseñanza (CATIE), Costa Rica. Diploma de Estudios Avanzados en Biotecnología por

la Universidad Politécnica de Cataluña, Barcelona, España. Actualmente, es coordinador

del Laboratorio de Biotecnología de ICTA. Posee 25 años de experiencia en

investigación agrícola.

Karla Ponciano

Posee el título de Licenciada en Bioquímica de la Universidad del Valle de Guatemala y

el título de Máster en Biotecnología Agroforestal de la Universidad Politécnica de

Madrid. Actualmente es Técnica de Innovación Tecnológica en Biotecnología, en el

Laboratorio de Biotecnología del ICTA. Posee 8 años de experiencia en investigación

agrícola.

Julio Villatoro

Posee el titulo de Ingeniero Agrónomo de la Universidad de San Carlos de Guatemala.

Actualmente es Investigador Principal en Innovación Tecnológica en el Programa de

Granos Básicos del ICTA, específicamente en el cultivo de frijol y es el enlace entre los

centros internacionales de investigación en frijol y el ICTA. Posee 21 años de experiencia

en investigación agrícola.

Edgardo Carrillo

Posee el titulo de Ingeniero Agrónomo de la Facultad de Ciencias Agrícolas y

Ambientales de la Universidad Rafael Landívar de Guatemala. Actualmente es

investigador en el Programa de Granos Básicos en el Centro de Investigación de Oriente

CIOR-ICTA, Jutiapa. Posee 10 años de experiencia en investigación agrícola.

48

PARTE V

V.1. INFORME FINANCIERO

AD-R-0013

Nombre del Proyecto:

Numero del Proyecto: 42-2008

Investigador Principal: ING. HÉCTOR ALFREDO SAGASTUME MENA

Monto Autorizado: Q286,196.00

Plazo en meses 24 MESES

Fecha de Inicio y Finalización: 02/02/2009 al 01/02/2011

Menos (-) Mas (+)

0 SERVICIOS PERSONALES

35 Retribuciones a destajo Q 48,000.00 Q 1,818.18 Q 49,664.00 Q 154.18

1 SERVICIOS NO PERSONALES

181

Estudios, investigaciones y proyectos de

factibilidad (Evaluación Externa de Impacto) 8,000.00Q 8,000.00Q

121 Divulgación e información 1,500.00Q 305.00Q 1,195.00Q

122 Impresión, encuadernación y reproducción 1,000.00Q 305.00Q 1,305.00Q -Q

133 Viáticos en el interior 3,200.00Q 3,150.00Q 50.00Q

141 Transporte de personas 24,000.00Q 24,000.00Q

163

Mantenimiento y reparación de equipo

médico-sanitario y de laboratorio 10,000.00Q 4,900.00Q 5,100.00Q

169

Mantenimiento y reparación de otras

maquinarias y equipos 4,900.00Q 4,900.00Q -Q

2 MATERIALES Y SUMINISTROS

214

Productos agroforestales, madera, corcho y

sus manufacturas

225 Minerales no metálicos 3,600.00Q 3,150.00Q 450.00Q

241 Papel de escritorio 350.00Q 349.20Q 0.80Q

243 Productos de papel o cartón 500.00Q 497.05Q 2.95Q

261 Elementos y compuestos químicos 37,350.00Q 37,206.02Q 143.98Q

262 Combustibles y lubricantes 8,160.00Q 444.00Q 4,043.12Q 3,672.88Q

263 Abonos y fertilizantes 2,500.00Q 444.00Q 2,944.00Q -Q

264 Insecticidas, fumigantes y similares 3,500.00Q 2,968.00Q 532.00Q

267 Tintes, pinturas y colorantes 1,000.00Q 729.00Q 271.00Q

268 Producrtos plásticos, nylon, vinil y pvc 1,000.00Q 902.47Q 97.53Q

269 Otros productos químicos y conexos 1,818.18Q 1,818.18Q -Q

295

Útiles menores, médico-quirúrgicos y de

laboratorio 10,200.00Q 1,385.58Q 11,585.58Q -Q

298 Accesorios y repuestos en general 4,500.00Q 4,500.00Q

PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E

INTANGIBLES

323 Equipo médico-quirúrgico y de laboratorio 90,000.00Q 1,385.58Q 84,300.00Q 4,314.42Q

GASTOS DE ADMÓN. (10%) 26,017.82Q 26,017.82Q -Q

286,196.00Q 8,852.76Q 8,852.76Q 233,711.26Q Q52,484.74

MONTO AUTORIZADO 286,196.00Q Disponibilidad 52,484.74Q

(-) EJECUTADO 233,711.26Q

SUBTOTAL 52,484.74Q

(-) CAJA CHICA

TOTAL POR EJECUTAR 52,484.74Q

Nombre del Gasto Asignacion

Presupuestaria

TRANSFERENCIA En Ejecuciòn

Ejecutado Pendiente de

Ejecutar

QUINCEAVA CONVOCATORIA

LINEA FODECYT

"Validación de una metodología de selección asistida con marcadores moleculares en el mejoramiento

genético del frijol (Phaseolus Vulgaris) para resistencia al virus del mosaico dorado (BGYMV-GA

Begomovirus, Geminiviridae)"

Grupo Renglon