CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –CONCYT-

SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA-SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT-

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

INFORME FINAL

“Evaluación y diseño de una formulación a partir de extractos de Calahuala

(Phlebodium pseudoaureum) para un posible uso en cosmética como agente

antisolar”

PROYECTO FODECYT No. 16-2009

Licda. MSc. Sully M. Cruz

Investigador Principal

Guatemala, Enero 2012.

2

AGRADECIMIENTOS

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del

Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología -FONACYT-, otorgado por La Secretaría

Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnología –CONCYT-.

3

OTROS AGRADECIMIENTOS

A la Universidad de San Carlos de Guatemala, Facultad de Ciencias Químicas y

Farmacia por el aval institucional, la infraestructura brindada, materiales y equipo para

la ejecución del proyecto.

Al Laboratorio de Investigación de Productos Naturales (LIPRONAT), y Depto de

Farmacognosia y Fitoquímica de la Escuela de Química Farmacéutica por brindarnos la

infraestructura, materiales y apoyo del personal que colaboró para la ejecución del

proyecto.

Al Laboratorio de Bioensayos del Depto de Citohistología por brindarnos la

infraestructura y apoyo en la realización del control microbiológico.

Al Laboratorio de Productos Naturales Farmaya S.A. especialmente a Lic. Armando

Cáceres por el apoyo, asesoría y colaboración brindada en el desarrollo de la

investigación.

Al equipo de investigación por su compromiso, entrega y dedicación especialmente a

Licdas. Aylin Santizo, Cristina Menéndez, Ana Carolina Valdez y Lucrecia Pérez.

i

RESUMEN

La calahuala (Polypodium leucotomos y Phlebodium pseudoaureum) es un

especie medicinal que representa un potencial en cosmética por sus propiedades

fotoprotectoras, antioxidantes y antipsoriasis. Por lo que en este estudio se diseño una

formulación cosmética a partir de extractos de P. pseudoaureum, se establecieron los

parámetros de calidad para su posible uso como agente antisolar, se caracterizó la droga

vegetal y extractos mediante pruebas fisicoquímicas, fitoquímicas y microbiológicas

para evaluar su identidad y pureza. Se determinó y evaluó el espectro de absorción de

los extractos de P. pseudoaureum para determinar el factor de protección solar y se

identificaron los flavonoides totales mediante espectrofotometría UV/VIS.

Según las pruebas fitoquímicas se detectó la presencia de flavonoides, saponinas

y taninos en los extractos de fronda y en los extractos de rizoma se evidenciaron además

cumarinas. Los extractos de fronda y rizoma de calahuala absorbieron radiación

ultravioleta en longitudes de onda que corresponden a la región UVC y asociados con

el octilmetoxicinamato absorbieron energía en longitudes de onda cercanas a la región

de máximo efecto eritematoso, presentando un efecto sinérgico en su capacidad de

absorción de energía en el rango UVB.

Los extractos de fronda presentaron flavonoides en porcentajes superiores del

0.5% evidenciando el mayor factor de protección solar hasta 10, por lo que fueron los

de elección para la formulación fitocosmética, cumpliendo con los parámetros de

calidad organoléptica, fisicoquímica y microbiológica, demostraron efectividad en la

crema y gel formulado manteniendo sus características a lo largo del tiempo según el

estudio de estabilidad.

ii

SUMMARY

The calahuala (Polypodium leucotomos and Phlebodium pseudoaureum) is a medicinal

species represents a potential in cosmetics for its photoprotective properties,

antioxidants and antipsoriasis. As this study design a cosmetic formulation from

extracts of P. pseudoaureum were established quality parameters for possible use as a

sunscreen, the drug was characterized by testing plant extracts and physicochemical,

phytochemical and microbiological assess its identity and purity. Was determined and

evaluated the absorption spectrum of extracts of P. pseudoaureum to determine the sun

protection factor and total flavonoids were identified by spectrophotometry UV/VIS.

According to phytochemical tests detected the presence of flavonoids, saponins and

tannins in the extracts of frond and rhizome extracts also showed coumarins. The frond

and rhizome extracts of ultraviolet radiation absorbed calahuala wavelengths that

correspond to the region associated with UVC and octyl methoxycinnamate energy

absorbed wavelengths near the region of maximum effect erythematosus, showing a

synergistic effect on absorptive capacity energy in the UVB range.

The extracts showing flavonoids in higher percentages of 0.5%, showing the highest

sun protection factor of 10, so were the formulation of choice for phytocosmetics,

fulfilling the quality parameters of sensory, physicochemical and microbiological

efficacy in the cream and gel formulated to maintain their characteristics over time

according to the study of stability.

iii

TABLA DE CONTENIDOS

RESUMEN

Página

i

ABSTRACT ii

TABLA DE CONTENIDOS iii

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN 1

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 2

I.2.1 Antecedentes en Guatemala

I.2.2 Justificación del trabajo de investigación

I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS

I.3.1 Objetivos

I.3.1.1 General

I.3.1.2 Específicos

I.3.2 Hipótesis

7

I.4 METODOLOGÍA 8

I.4.1 Localización

I.4.2 Variables

I.4.2.1 Variables dependientes

I.4.2.2 Variables independientes

8

I.4.3 Indicadores

I.4.4 Estrategia metodológica

I.4.4.1 Población y muestra

I.4.5 El Método

I.4.6 La Técnica Estadística

I.4.7 Los Instrumentos a utilizar

8

PARTE II

MARCO TEÓRICO

15

PARTE III

III. RESULTADOS

III.1 DISCUSIÓN

36

58

PARTE IV

IV.1 CONCLUSIONES 66

IV.2 RECOMENDACIONES 68

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 69

IV.4 ANEXOS 75

PARTE V

V. INFORME FINANCIERO

iv

LISTA DE TABLAS

Página

Tabla 1.Caracterización fitoquímica de la fronda 36

Tabla 2. Caracterización fisicoquímica del rizoma 36

Tabla 3. Sólidos totales 37

Tabla 4. Pruebas fisicoquímicas realizadas a los extractos 37

Tabla 5. Pruebas macrométricas de precipitación y/o coloración 38

Tabla 6. Caracterización fitoquímica por CCF de extractos de rizoma 39

Tabla 7. Caracterización fitoquímica por CCF de extractos de fronda 40

Tabla 8. Pruebas microbiológicas realizadas a los extractos 41

Tabla 9. Longitud de onda de máxima absorbancia 43

Tabla 10. Factor de protección solar de los extractos 44

Tabla 11. Cuantificación del porcentaje de flavonoides totales 46

Tabla 12. Porcentaje de sapogeninas esteroidales de rizoma y fronda 47

Tabla 13. Resultados fisicoquímicos de las formulaciones 49

Tabla 14. Resultados de los parámetros organolépticos y fisicoquímicos 50

Tabla 15. Resultados microbiológicos del gel 51

Tabla 16. Resultados microbiológicos de crema 52

Tabla 17. Características organolépticas de lotes piloto 53

Tabla 18. Características microbiológicas de lotes piloto 53

Tabla 19. Comportamiento organoléptico de lotes piloto estudio estabilidad 54

Tabla 20. Comportamiento fisicoquímico de lotes piloto 54

Tabla 21. Pruebas organolépticas de gel y crema al 3% y OMC 55

Tabla 22. Pruebas microbiológicas de gel y crema al 3% y OMC 55

Tabla 23. Composición cuali-cuantitavia de gel 56

Tabla 24. Composición cuali-cuantitativa de crema 56

Tabla 25. Calidad microbiológica de las formulaciones finales 57

Tabla 26. Características organolépticas formulaciones finales 57

1

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN

En Guatemala hay una gran variedad de productos forestales no maderables

(PFNM) provenientes de las áreas boscosas, principalmente del bosque latifoliado,

debido a su extensión y diversidad de especies. En la actualidad, uno de estos productos

forestales lo representa, por su volumen comercializado y valor económico, el complejo

calahuala (Polypodium y Phlebodium), pero únicamente se exporta la droga vegetal sin

darle un valor agregado.

Con el mismo nombre se designan varias especies de helechos de la familia

Polypodiaceae, que abundan en sitios sombreados y húmedos de los bosques de la

región. En Mesoamérica se usan ampliamente por sus múltiples virtudes medicinales

atribuidas. La calahuala (Polypodium leucotomos y Phlebodium pseudoaureum) es un

helecho nativo de Centro América, en Guatemala se ha descrito en Alta Verapaz, Baja

Verapaz, Chimaltenango, Escuintla, Guatemala, Huehuetenango, Jalapa,

Quetzaltenango, Suchitepéquez y Zacapa.

Es una especie vegetal que representa un potencial en cosmética por sus propiedades

fotoprotectoras, antioxidantes y antipsoriasis. Estudios preliminares han confirmado la

presencia de flavonoides en el extracto etanólico de Phlebodium y Polypodium, por esta

razón se considera que este extracto podría ser de gran utilidad en cosmética para

elaborar y reforzar productos con actividad antisolar.

Guatemala actualmente no tiene productos medicinales ni cosméticos a base de

extractos de calahuala. Por lo que el objetivo de este estudio se centró en caracterizar la

droga vegetal, diseñar una formulación cosmética, establecer los parámetros de

identidad, pureza y potencia para garantizar la calidad de los productos que puedan ser

posteriormente fabricados y comercializados, esperando propiciar el uso sostenible de la

especie en beneficio de las comunidades y los diferentes sectores, en el marco de

investigación aplicada que permita el fomento empresarial, para permitir el mejor

aprovechamiento de la biodiversidad con que cuenta el país, para generar desarrollo de

cadenas productivas de valor biológico y económico, que puede lograrse por del diseño

de productos medicinales y/o cosméticos y la transferencia del conocimiento

científicamente validada para que sean aprovechados por los diferentes sectores

productivos.

2

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1 Antecedentes

La radiación solar es una de las principales causa de envejecimiento prematuro,

hiperpigmentacion foto-inducida, manchas en la piel, alergias y cáncer de piel (Bolan,

2005). Los filtros solares son una clase especial de productos que impiden el paso de la

luz solar absorbiendo o reflejando parte de la energía radiante responsable de la

formación de los eritemas en la piel. El alto contenido de estos agentes antisolares

sintéticos en una formulación puede ocasionar algunos efectos adversos.

Por décadas algunos autores ven atribuida la actividad fotoprotectora a algunos

productos naturales, especialmente especies vegetales, las cuales durante su proceso

evolutivo, han desarrollado sustancias protectoras solares que les permite la

supervivencia a la intensidad de la radiación UV. Numerosas plantas se han utilizado

con función de actividad antisolar como tal en una formulación con diferentes

funciones, o para reforzar el FPS a formulaciones con componentes sintéticos. En la

búsqueda de un potencial factor de protección solar utilizando extractos naturales,

Ramos et al (1996) determinó el espectro de absorción UV de los extractos de

Hamamelis virginiana, Matricaria recutita, Aesculus hippocastanum, Rhamnus

purchiana, Cinnamomum zeylanicum, luego de la incorporación de estos extractos a

una formulación de octil-metoxicinamato que es un protector solar sintético,

observando un incremento del FPS. Un estudio similar fue realizado con el aceite de

Caryodendron orinocense conocido como ―nuez de barina‖, se encontró un efecto de

sinergismo entre el aceite extraído y el octil-metoxicinamato (Pérez et al., 1999).

Hu et al. (1998), compararon el factor protector solar in vivo de los extractos

naturales de las hierbas chinas Chrysanthemum ramat y Crocus sativus, con el filtro

solar sintético 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona-5 ácido sulfónico y encontró que eran

similares debido a la relación que existe entre la foto reacción y la reacción biológica.

Los filtros solares sintéticos presentan mayor absorción UV que los filtros naturales,

pero los filtros naturales proporcionan a la piel tonicidad, disminuyen eritemas,

descamaciones, enrojecimientos, picaduras causadas por la excesiva exposición UV,

propiedades que los productos con protección solar sintéticos no poseen (Hu & Wang.,

1998).

Los principales componentes de las plantas que presentan actividad antisolar son

los polifenoles. El extracto de Camelia sinensis rico en polifenoles es un agente efectivo

contra los efectos adversos del sol. (Proserpio, 1967; Mazza et al., 2000).

Tabrizi et al (2003), realizaron una evaluación in vitro de extractos alcohólico-

acuoso, alcohólico, y etéreo, de flores de Rosa damascena como un agente antisolar

natural, encontraron que todos los extractos contenían flavonoides en diferentes

concentraciones lo cual le permitía la capacidad de absorción UV. Pese que el extracto

etéreo tenía un mayor contenido de flavonoides que los otros extractos, la mayor

absorbancia de luz ultravioleta la presentó el extracto alcohólico, porque con este

3

disolvente fueron extraídos numerosos pigmentos y agentes colorantes que existen en la

planta que absorben la radiación UV.

Algunos autores, consideran que los pigmentos derivados de las plantas pueden

constituir una alternativa como protectores solares, por lo que cada vez más el interés en

los compuestos fenólicos, presentes en los extractos etanólicos de diferentes especies,

constituye un recurso que se debe seguir explorando dentro de los productos

fitocosméticos por su acción fotoprotectora, antioxidante, antiinflamatoria, cicatrizante,

humectante, etc. (Hu & Wang, 1998).

Polypodium es un género de plantas típico de la familia de los helechos,

Polypodiaceae. En 1967, Horvath et al, señaló que un extracto o infusión de una especie

de helecho, Polypodium leucotomos, empleada tradicionalmente por los nativos del

norte de Honduras como tratamiento para tumores malignos, demostró tener efectos

antitumorales tanto in vitro como in vivo. Desde entonces, se ha demostrado que

extractos de una variedad de plantas de helechos, algunos de ellos referidos como

extractos de Polypodium y algunos referidos como calagualina, tienen numerosos

efectos dermatológicos, inmunomoduladores y de comportamiento.

Extractos de Polypodium leucotomos han resultado efectivos en el tratamiento

de psoriasis, dermatitis atópica y otros desordenes dermatológicos (Corrales Padilla, et

al, 1974; Jiménez, et al., 1987). En estas composiciones, el extracto demostró causar

descensos en hiperqueratosis, paraqueratosis, mitosis epidérmica, engrosamiento

epidérmico, prolongaciones epidérmicas y severidad y extensión de lesiones

epidérmicas.

Estudios preliminares han confirmado la presencia de flavonoides en el extracto

etanólico de Phlebodium y Polypodium, por esta razón se considera que este extracto

podría ser de gran utilidad en cosmética para elaborar y reforzar productos con actividad

antisolar. El extracto hidrofílico de P. leucotomos presentó actividad fotoprotectiva en

células humanas de la piel contra daño celular inducida por los rayos UV (Alonso et

al., 2003).

Los procesos para producir extractos polares de los helechos Dryopteris

crassirhizoma, Polypodium vulgare. Linn., Polypodium leucotomos, Phlebodium

decumanum, J. Smith, Polypodium decumamum, Cyathea taiwaniana, o rizomas de

Polypodium aureum, Linn, y Polypodium triseriale se describieron en la Patente GB

2,024,622a, Ramon, et al. (presentada el 24 de mayo, 1979). Esta patente también

reivindicó medicamentos preparados a partir de tales extractos y sugirió su uso oral en

tratamientos de psoriasis.

De modo similar, los procesos para producir extractos polares de una variedad

de helechos de la familia Polypodiaceae se describieron en Patente GB 2,075,834A a

Ramon et al (presentada el 26 de marzo, 1981). Esta patente sugirió el uso oral de tales

extractos en el tratamiento de enfermedades osteolocomotoras (p. ej., artritis).

Patente U.S Nº 4, 206,222 a Valetas (presentada el 3 de Junio, 1980) describe también

un método para producir extractos de una variedad de helechos en la familia

4

Polypodiaceae. Además, Valetas reivindica un agente activo de una particular estructura

química, a C8 delta-lactona, aislado de estos helechos. El agente activo demuestra ser

útil en el tratamiento de enfermedades del colágeno (p. ej., artritis).

Extractos de Polypodium leucotomos también han demostrado que aumentan el

número de linfocitos T8, disminuyen el radio T4/T8 en la sangre, prolongan la

supervivencia de injertos de piel de otros cuerpos en ratones, inhiben la respuesta

proliferante de células del bazo en ratones, e inhiben la respuesta proliferante de

linfocitos T a mitogenes (Vargas, et al., 1983; Jiménez, et al., 1987; Tuominen, et al.,

1991; Fernandez, et al., 1992; Rayward, et al., 1993). Álvarez, et al, (1992) comprobó

los efectos de un extracto de Polypodium en el comportamiento y en citoquinas del

cerebro de ratas. La información obtenida indicó que el extracto induce a hipoquinesia

en dosis moderadas-altas, sin efectos en la habituación psicomotora, en un test de

actividad psicomotora de campo abierto; mejora el aprendizaje en un test de

comportamiento pasivo relativo a la habilidad para evitar conductas; disminuye los

niveles de las citoquinas IL-1B e IL-2 en cortezas frontoparietales; disminuye IL-1B en

el hipocampo; y aumenta TNF-α en la corteza.

En otro estudio, extractos de Polypodium decumanum (―Calaguala‖)

demostraron que podían inhibir la retirada de la enzima elastasa proteolítica en

neutrófilos humanos inducida por el factor activador de plaqueta (PAF) y que podían

inhibir la biosíntesis de PAF (Tuominen, et al., 1992). Debido a que PAF puede estar

relacionado con la patogénesis de psoriasis, los autores de este estudio especularon que

la actividad anti-PAF del extracto puede contribuir a su eficacia clínica en el tratamiento

de psoriasis.

Se reporta que P. leucotomos es rico en polifenoles (Gombau et al., 2006), es

conocido en el mercado como Difur® para el tratamiento de psoriasis y Fernblock®

para fotoprotección sistémica y tópica, sus propiedades fotoprotectoras son utilizadas

para PUVA (psoraleno y radiación ultravioleta A) en terapia para psoriasis y vitíligo

(Middelkamp-Hup, et al., 2004). Han sido reportados compuesto polifenólicos

incluyendo ácido 4-hidroxicinámico (ácido p-coumarico), 3- metoxi-4-hidroxicinámico

(ácido ferúlico), 3-4 dihioxicinámico (ácido cafeico), acido vanillico, ácido clorogénico

(Gombau et al., 2006). También presenta propiedades antioxidantes via inhibición de la

radicación UV inducida por la formación de radicales superóxido y subsecuente daño de

la membrada y peroxidación lipídica in vitro o in vivo (Gomes et al., 2001; Alonso-

Lebrero et al., 2003).

P. leucotomos es un agente fotoprotector y anticarcinogénico. Este minimiza los

cambios histológicos asociados con fotoenvejecimiento en modelos de animales y

disminuye la fototoxicidad y fotosensibilización en piel humana y previene lso cambios

morfológicos en fibroblastos (Philips, et al., 2003; Alcaraz, et al., 1999; Middelkamp-

Hup et al., 2004), estimula la elastina otorgando firmeza a la piel, via kerainocitos y

fibroblastos, estimulando las fibras de colágeno.

5

Fig. 1 Estruturas polifenolicas reportadas en P. leucotomos

Fig. 2 Estructuras de chalconas reportadas en P. leucotomos

6

I.2.2 Justificación

Los géneros Phlebodium y Polypodium, representados por varias especies en la

región, es un recurso de la flora nativa de Mesoamérica con larga tradición de uso y de

explotación como medicamento y materia prima industrial, pero cuyo verdadero

potencial no ha sido estudiado de una manera sustentable y sostenible.

El estudio de productos naturales ha adquirido gran importancia en los últimos años

por la rapidez con la que se ha desarrollado la tecnología en esta área y que ha facilitado

el análisis de plantas y extractos, además, la tendencia cada vez más generalizada de

utilizar productos naturales que sustituyan a los sintéticos, ha propiciado la búsqueda de

fuentes alternas a la síntesis orgánica. Muchas investigaciones en productos naturales

han revelado que existe una gran variedad de compuestos naturales (flavonoides, ácidos

fenólicos, terpenoides, alcaloides etc.) que poseen importantes propiedades medicinales

(citotóxicas, antiinflamatorias, inmunomoduladoras, antimicrobianas, etc.) y/o

cosméticas (antioxidantes, fotoprotectores, cicatrizantes, etc).

Estudios anteriores han demostrado la presencia compuestos fenólicos en las

especies de Phlebodium, demostrando actividad fotoprotectora importante, y como

producto medicinal se comercializan extractos de Phlebodium en diferentes lugares de

la Unión Europea, Suiza, Australia, Nueva Zelanda, Centroamérica y El Caribe.

Dentro del marco del proyecto se aprovechó el conocimiento generado por

investigaciones etnofarmacológicas en la región para desarrollar un producto

fitocosmético y establecer los parámetros de calidad, para lo cual se seleccionó dicha

especie, ya que es una especie no maderable del bosque con utilidad económica que ha

sido sobre explotada y que presenta un gran potencial de mercado; para alcanzar dicho

objetivo se planteó la necesidad de generar información fitoquímica a través de

caracterizar y estandarizar los extractos vegetales del género Phlebodium, para el

desarrollo de formas fitofarmacéuticas y/o fitocosméticas que permitan aprovechar la

materia prima producida, realizando estudios de optimización de la extracción,

concentración, formulación y procedimientos para el control que garanticen su óptima

calidad y estabilidad.

7

I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS

I.3.1 Objetivos

I.3.1.1 General

Evaluación y diseño de una formulación a partir de extractos de calahuala (Phlebodium

pseudoaureum) para un posible uso en cosmética como agente antisolar

I.3.1.2 Específicos

I.3.1.2.1 Diseñar una formulación cosmética a partir de extractos de Phlebodium

pseudoaureum y establecer los parámetros de calidad para su posible uso como agente

antisolar.

I.3.1.2.2 Caracterizar la droga vegetal y extractos de Phlebodium pseudoaurem

mediante pruebas fisicoquímicas, fitoquímicas y microbiológicas para evaluar su

identidad y pureza.

I.3.1.2.3 Determinar y evaluar el espectro de absorción de los extractos de Phlebodium

pseudoaureum para evaluar el potencial como factor de protección solar.

I.3.1.2.4 Identificar, cuantificar y analizar los flavonoides totales mediante

espectrofotometría UV/VIS de los extractos de Phlebodium pseudoaureum.

I.3.1.2.5 Elaborar un producto fitocosmético a partir de extractos de Phlebodium

pseudoaureum y establecer los parámetros de calidad.

I.3.2 Hipótesis:

Al menos de una formulación fitocosmética propuesta a base de extractos de

Phlebodium es posible establecer sus parámetros de calidad y mantener su estabilidad

para su posible evaluación cosmética y comercialización.

8

I.4 METODOLOGÍA

I.4.1 Localización: El estudio se realizó en el Laboratorio de Investigación de Productos Naturales

(LIPRONAT) y Departamento de Farmacognosia y Fitoquímica de la Escuela de Química

Farmacéutica de la Universidad de San Carlos de Guatemala, coordenadas geográficas

14°35´17.46´´ 90°33´6.25´´, altura 1498 msnm, humedad relativa 78%, temperatura

promedio anual: 19.5 °C, temperatura máxima 31.5 °C, temperatura mínima absoluta 9.06

°C, precipitación pluvial 1,198.7 mm/año, brillo solar por hora: 205.7; radiación solar: 1.3

cal/cm2/min; presión atmosférica: 639.5 mm/Hg; velocidad del viento: 17.7 km/hora.

El material vegetal fue colectado en la Finca de la empresa de Biocultivos de Guatemala, la

cual está ubicada en San José Pinula, las coordenadas geográficas son 90°20´21´´ longitud

Oeste y 14°34´23´´ latitud Norte, altura 1850 msnm, presenta temperaturas entre 12 - 23 °C,

humedad relativa promedio 84%. El promedio de precipitación oscila alrededor de 1,639.3

mm.

I.4.2 Variables:

I.4.2.1 Variables independientes:

Los extractos de P. pseudoaureum

I.4.2.2 Variables dependientes:

Caracterización química, productos fitocosméticos.

I.4.3 Indicadores:

Metabolitos secundarios

Formulaciones fitocosméticas a base de extractos vegetales.

I.4.4 Estrategia metodológica:

I.4.4.1 Población y muestra:

Población: Especie vegetal P. pseudoaureum (calahuala) rizoma y fronda.

Muestra: Extractos vegetales de P. pseudoaureum rizoma y fronda

I.4.5 El método:

I.4.5.1 Colecta del material vegetal: El material se colectó en San José Pinula en la finca

Biocultivos de Guatemala y finca el Cacaotal en Samayac, Suchitepéquez siguiendo las

buenas prácticas de colecta aceptadas internacionalmente (WHO, 2003).

I.4.5.2 Molienda y secado del material vegetal: El secado del material se realizó en un

horno de convección de aire forzado, se disminuyó el tamaño de partícula en un molino

de discos para el rizoma, se utilizó tijeras y tamiz en fronda.

9

I.4.5.3 Caracterización fisicoquímica de la droga vegetal: Se realizó siguiendo los

parámetros establecidos de acuerdo a normas internacionales (Sharapin, 2000, WHO,

1998; Real Farmacopea Española, 2002; EMEA 2001, Council of Europe 2002- 2003;

Solis, et al. 2005).

I.4.5.4 Ensayos morfoanatómicos y organolépticos: Entre los caracteres organolépticos

se incluyeron los siguientes el color, olor y textura de la droga.

Las características macroscópicas se pudieron reconocer a simple vista, los cuales

permitieron distinguir la muestra en este caso rizoma y fronda.

Se revisaron caracteres como: Forma, dimensiones, pilosidad, nerviación, morfología de

la superficie (lisa, estriada, etc), fractura (neta, fibrosa, granulosa, etc), sección grosor y

dureza, entre otros.

I.4.5.5 Residuo seco: Permitió determinar la cantidad de sólidos extraíbles para la

selección del disolvente más apropiado para la extracción, siguiendo el procedimiento

aceptado internacionalmente:

En una cápsula de fondo plano de aproximadamente 50 mm de diámetro y

aproximadamente 30 mm de altura, se introdujo 2,00 g o 2,0 mL del extracto a

examinar.

Se evaporó hasta sequedad sobre un baño de agua y se secó en un horno a 100-105

ºC durante 3 h. Se dejó enfriar en un desecador sobre pentóxido de difósforo R o gel

de sílice anhidra R y se pesó.

Se calculó el resultado como porcentaje m/m o en g/L.

I.4.5.6 Determinación de cenizas: Las cenizas dan idea del contenido en material

mineral de una droga, el cual suele hallarse alrededor de un 5%.

La determinación de cenizas se realizó según método de la Farmacopea Europea:

Se realizó la ignición en un crisol por 30 min, se enfrió en un desecador y se pesó. Se

pesó 1 g del material vegetal sobre el crisol previamente seco y secó de 100-105°C por

1 hora y se incineró hasta peso constante en una mufla con temperatura entre 575 y

625°C. Se evaporó a sequedad y se incineró hasta peso constante. Se dejó enfriar el

crisol y se pesó para determinar el porcentaje de cenizas obtenidas.

I.4.5.7 Caracterización química: (Lock, 1994; Solis, 2005; Wagner & Bladt, 1996).

I.4.5.7.1 Investigación de flavonoides y antocianinas:

Ensayos macro y semimicro: Se realizó la extracción de 3 g de material vegetal

pulverizado con 10 ml de etanol o metanol al 80%, se filtró y se concentró. Se enfrió a

temperatura ambiente y se trituro el residuo con 15 ml de éter de petróleo hasta que la

extracción fuera incolora. Se disolvió el residuo en 30 ml de metanol al 80%, se filtró y

se dividió en 5 tubos:

Tubo 1: Se agregó 0.5 ml de ácido sulfúrico concentrado.

Tubo 2: Se agregaron de 3 a 5 gotas de cloruro férrico al 10% (p/v).

10

Tubo 3: Se agregó 0.5 ml de ácido clorhídrico concentrado y se calentó en baño de

maría por 5 min (prueba para leucoantocianinas).

Tubo 4: Se agregó magnesio metálico y 0.5 ml de ácido clorhídrico concentrado.

Tubo 5: testigo.

Se evaluaron las reacciones, cambios de color y/o formación de precipitado comparados

con el testigo. El desarrollo inmediato de color indicó la presencia de flavonas y

flavonoles (amarillo a rojo), flavanonoles (rojo a magenta), flavanonas (rojo, magenta,

violeta, azul), isoflavonas (amarillo); isoflavononas, chalconas y auronas no dan

coloración (37, 41-43).

Cromatografía en capa fina: Se realizó una extracción de 1 g de material vegetal seco

pulverizado con 10 ml de metanol por 5 min en baño de maría a 60C. Se filtró la

solución y se aplicó sobre las cromatoplacas de silicagel 60 F254. Como estándar se

empleó solución de flavonoides al 0.05% en metanol (10 μl) (quercetina, rutina, ácido

clorogénico, hiperósido).

Como Fase móvil se utilizó:

acetato de etilo-ácido fórmico-ácido acético glacial-agua (100:11:11:27),

n-butanol-ácido acético-agua (40:10:50);

acetato de etilo-ácido fórmico-ácido acético glacial-etilmetilcetona-agua

(50:7:3:30:10),

Detección: Sin tratamiento químico: UV 254 nm fluorescencia, zonas azules o

amarillas. UV 365 nm, dependiendo la estructura fluorescen amarillo, azul o verde.

Reactivo de Productos Naturales (NP/PEG). Fluorescencia intensa en UV-365 nm.

Solución 1: solución metanólica al 1% de difenilboriloxietilamina (NP).

Solución 2: solución etanólica al 5% de polietilenglicol 4000 (PEG).

Aplicar a la placa vapores de amoniaco para intensificar el color de las manchas.

I.4.5.7.3 Investigación de antraquinonas:

Prueba de Bornträger: Se realizó una extracción con 3 g de material vegetal pulverizado

y 10 mL de etanol al 80%, se filtró y concentró en baño de maría (60C). Se disolvió el

residuo con 30 mL de agua destilada y se filtró. Se realizó una extracción con 10 mL de

tolueno. A la fase orgánica se añadió 5 mL de solución de amonio y se agitó. Se

observaron cambios de color en la fase alcalina (color rojo, rosado: positivo).

Prueba de Bortränger modificado: Se calentaron 0.3 g de material vegetal pulverizado

con 10 mL de hidróxido de potasio alcohólico 0.5 N y 1 mL de peróxido de hidrógeno

al 3% y se calentó 10 min en baño de maría a 60C. Se adicionaron 10 gotas de ácido

acético glacial para acidificar. Se extrajo con 10 mL de tolueno. A la capa orgánica se

adicionó 5 mL de solución de prueba de amonio y se agitó. Se observaron cambios de

color en fase alcalina (color rojo, rosado: positivo).

11

Cromatografía en capa fina: Se extrajo 0.5 g de material vegetal seco pulverizado con 5

mL de metanol en baño maría (60C) por 5 min. Se filtró y se aplicaron 10 μL en la

cromatoplaca de silicagel 60 F254.

Estándar: solución al 0.1% en metanol de antraquinonas (10 μL). (Aloína, frangulina

A/B, glucofrangulina A/B y sus agliconas, reina, aloe-emodina, extracto de sen)

Fase móvil:

acetato de etilo-metanol-agua (100:17:13),

acetato de etilo-metanol-agua (100:13.5:10).

Detección:

Sin tratamiento químico: UV 254nm fluorescencia, UV 365 nm fluorescencia amarilla o

rojo-café.

Solución etanólica de hidróxido de potasio al 5 o 10%.

Antraquinonas: zonas rojas en visible y fluorescencia roja en UV-365 nm.

Antronas y antranolas: zona amarillas en visible y fluorescencia amarilla en UV-365

nm.

I.4.5.7.4 Investigación de cumarinas:

Ensayos macro y semimicro: Se tomaron 5 mL de extracto vegetal metanólico y se

agregó 1 mL de agua destilada hirviendo. Con un capilar se aplicaron 2 manchas en

papel filtro. A una mancha se le agregó 1 gota de hidróxido de potasio 0.5N. Se

observó bajo luz ultravioleta de 365 nm (fluorescencia azul o verde: positivo).

Cromatografía en capa fina: A 1 g de material vegetal se adicionaron 10 mL de metanol

y se calentó 30 min en baño de maría. Se filtró y evaporó hasta 1 mL. Se aplicó 20 μL

en una cromatoplaca de sílica gel 60 F254. Se utilizó como estándar canela en metanol al

1%, umbeliferona, ácido p-cumárico, cumarina.

Fase móvil:

tolueno-acetato de etilo (93:7);

Detección:

Sin tratamiento químico UV 254nm fluorescencia. UV 365 nm todas las cumarinas

muestras una intensa fluorescencia azul o verde- azul.

Solución etanólica de hidróxido de potasio al 5 o 10%. UV-365 nm fluorescencia azul o

verde.

I.4.5.7.5 Investigación de taninos:

Ensayos macro y semimicro: A 10 g de material vegetal pulverizado se adicionaron 30

mL de etanol o metanol al 80%, se filtró y evaporó a sequedad. Se añadieron 25 mL de

agua caliente al residuo y se agitó con varilla y se dejó enfriar. Se agregó 1 mL de

solución de cloruro de sodio al 10% y se filtró. Se adicionaron 3 mL del filtrado a 4

tubos de ensayo:

Tubo 1: testigo.

Tubo 2: Se agregaron de 4 a 5 gotas de solución de gelatina al 1 por ciento (p/v).

12

Tubo 3: Se agregaron de 4 a 5 gotas de gelatina-sal (1% de gelatina y cloruro de sodio

al 10%).

Tubo 4: Se agregaron de 3 a 4 gotas de solución de cloruro férrico al 10% (p/v).

Se observó la formación de precipitado y/o cambio de coloración.

Con cloruro férrico: grisáceo-negro: catecol; negro-azulado: pirogalol)

I.4.5.8 Análisis de Cuantitativo de Flavonoides por Espectrofotometría UV/VIS

(método según Real Farmacopea Española 2002).

Disolución madre. En un matraz de fondo redondo de 100 ml se colocó 0.8 g de droga

pulverizada (500), 1 ml de una disolución de 5 g/l de hexametilentetramina, 20 ml de

acetona y 7 ml de ácido clorhídrico. Se calentó a ebullición la mezcla a reflujo durante

30 min. Se filtró el líquido a través de algodón hidrófilo a un matraz de 100 ml. Se

añadió el algodón hidrófilo al residuo en el matraz de fondo redondo y se realizaron

dos extracciones con 20 ml, cada vez, de acetona, calentando a ebullición a reflujo cada

una de las veces durante 10 min. Se dejó enfriar a temperatura ambiente, se filtró el

líquido a través de algodón hidrófilo y después se filtraron las disoluciones de acetona

reunidas a través de un papel de filtro a un matraz aforado y diluir hasta 100 ml con

acetona lavando el matraz y el filtro. Se colocaron 20 ml de la disolución en una

ampolla de decantación, se añadieron 20 ml de agua y se extrajeron de la mezcla una

vez con 15 ml y luego tres veces con 10 ml, cada vez, de acetato de etilo. Se reunieron

los extractos de acetato de etilo en una ampolla de decantación, se lavaron dos veces

con 50 ml, cada vez, de agua, se filtró el extracto sobre 10 g de sulfato de sodio anhidro

a un matraz aforado de 50 ml y se diluyó hasta 50 ml con acetato de etilo.

Disolución problema. A 10 ml de la disolución madre se añadió 1 ml de reactivo de

cloruro de aluminio y diluyó hasta 25 ml con una disolución al 5 % V/V de ácido acético

glacial en metanol.

Disolución de compensación. Se diluyó 10 ml de la disolución madre hasta 25 ml con

una disolución al 5 % V/V de ácido acético glacial en metanol.

Se midió la absorbancia de la disolución problema después de 30 min, por comparación

con la disolución de compensación a 425 nm.

Se calculó el contenido en porcentaje de flavonoides, calculado como hiperósido, a

partir de la expresión:

tomando la absorbancia específica del hiperósido como 500 nm.

A = absorbancia a 425 nm,

m = masa de la sustancia a examinar en gramos (42).

A × 1,25

—————

m

I.4.5.9 Cuantificación de sapogeninas:

Se pesaron 0.125 g de materia vegetal y se añadió 25 ml de etanol al 95°. Se agitó y

calentó en baño María a 60°C durante 20 min y se filtró. Se transfirió una alícuota de 4

ml a un vaso de precipitar de 50 ml y se evaporó a sequedad, en baño María. Se enfrió a

13

temperatura ambiente y se añadió 2 ml de acetato de etilo, 1 ml de reactivo A (0.5 ml de

anisaldehído + 99.5 ml de acetato de etilo), 1 ml de reactivo B (ácido sulfúrico al 50%

en acetato de etilo). Se trasvasó a un tubo de ensayo, se agitó y calentó a 60°C en baño

María durante 20 min, se enfrió por 10 min, y se leyó a 430 nm, si la solución estaba

muy concentrada, se aforó a 10 ml con acetato de etilo.

Curva de calibración: Se preparó una solución madre de diosgenina a una concentración

de 100 g/mL de etanol al 95 (se pesó 10 mg y se agregó 100 ml de etanol). A partir de

dicha solución se prepararon diluciones a concentraciones de 20, 40, 60 y 80 g/mL. Se

evaporó a sequedad cada uno de los estándares y se agregó a 2 ml de acetato de etilo, 1

ml de reactivo A y 1 ml de reactivo B, se calentó a 60°C en baño María durante 20 min,

se enfrió por 10 min, y se aforó a 10 ml con acetato de etilo, se leyó a 430 nm. Se utilizó

como blanco 8 ml de acetato de etilo, 1 ml de reactivo A y 1 ml de reactivo B. Se

calculó el % de sapogeninas totales (Baccou et al.,1997).

I.4.5.10 Preparación de los extractos: El extracto alcohólico se realizó mediante

percolación utilizando etanol a razón 1:5 en rizoma y 1:10 en fronda luego se concentró

en rotavapor hasta obtener un extracto 1:1 y un extracto seco (Solis et al. 2005; Real

Farmacopea Española, 2002; Sharapin 2000).

I.4.5.11 Evaluación de las propiedades fisicoquímicas y organolépticas de los extractos

alcohólicos de P. pseudoareum:

Se evaluaron las propiedades fisicoquímicas y organolépticas de los extractos

alcohólicos de acuerdo a los parámetros establecidos internacionalmente (Farmacopea

Europea, Real Farmacopea Española 2002; Solis, et al, 2005).

I.4.5.12 Espectro de absorción UV de los extractos: Se realizó un barrido para

determinar la longitud de onda máxima de los extractos utilizando un espectrofotómetro

Agilent 8453. También se determinó el espectro de absorción UV, realizando un barrido

entre las longitudes de onda de 250 a 400 nm, para el Octil-metoxicinamato (Parsol), a

una concentración de 5 ppm en solvente etanólico. Se preparon mezclas de OMC a 5

ppm con extracto alcohólico de P. pseudoaureum a 100 ppm y 50 ppm.

I.4.5.13 Elaboración del producto fitocosmético (Sharapin, 2000).

Se realizaron dos formulaciones un gel (carbopol y trietanolamina) y la formulación de

una crema base compuesta por una fase oleosa: monoesterato de glicérilo

(autoemulsificante), alcohol cetílico, vaselina. Una fase acuosa: metil parabeno,

propielenglicol y trietanolamina para ajustar el pH 7±0.5.

Se evaluaron sus propiedades organolépticas, fisicoquímicas y microbiológicas

(Coliformes totales, Escherichia coli, Hongos y levaduras, Pseudomonas aeruginosa)

(WHO, 1998; 2004)

Se prepararon cinco cremas y/o geles para cada extracto a cinco concentraciones

diferentes, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, de extracto fluido y/o seco. Obteniéndose un total de

25 cremas O/W y/o 25 geles. Para la evaluación de las características organolépticas de

los productos elaborados color, olor, y la apariencia se determinaron por medio de los

sentidos (vista y olfato) los cuales se reportaron como aceptado y no aceptado.

14

Se realizó un estudio de estabilidad acelerada para determinar qué producto presentaba

las mejores características para su desarrollo (Tabrizi et al., 2003; Pérez et al., 1998;

Hu et al., 1998)

Del producto seleccionado se elaboraron cuatro productos utilizando la crema base o gel

anteriormente descrito, a los cuales se adicionaron las siguientes combinaciones:

crema base o gel + extracto alcohólico al X% seleccionado según estabilidad.

crema base o gel + OMC 4%

crema base o gel + extracto alcohólico al X% seleccionado según estabilidad +

OMC 4%

I.4.6 La Técnica estadística:

En el caso de la caracterización fitoquímica se indicó la presencia o ausencia de

los metabolitos detectados y se realizó el cálculo de Rf, se compararon con estándares

específicos, se presentaron los resultados en cuadros y se anexaron las fotos de los

análisis. Respecto a la caracterización fisicoquímica se obtuvo un promedio de tres

mediciones y se calculó la desviación estándar.

Para el estudio de estabilidad se determinó la media, la desviación estándar (DE) y el

coeficiente de variación (CV).

I.4.7 Instrumentos:

Se utilizaron cuadernos para el registro de las actividades realizadas diariamente y

resultados obtenidos, además de la documentación registrada en la bitácora del

laboratorio. Se elaboraron informes mensuales y trimestrales para indicar el avance de

la investigación. Se utilizó el equipo, materiales e infraestructura del Laboratorio de

Investigación de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Química y Farmacia,

para los análisis fitoquímicos y fisicoquímicos, el laboratorio de Bioensayos para el

control microbiológico y Depto de Farmacognosia y Fitoquímica para la elaboración del

producto fitocosmético.

15

PARTE II

MARCO TEÓRICO

La radiación solar

El sol, además de luz visible, emite una radiación "invisible‖ de longitud de

onda más corta que el azul y el violeta, que recibe el nombre de ultravioleta. Se

distinguen las tres subregiones que se indican en el Cuadro Nº 1.

Cuadro 1.

Regiones y características de la luz ultravioleta

UV-A Es la continuación de la radiación visible y es responsable del

bronceado de la piel. Su longitud varía entre 400 y 320 nm

UV-B Llega a la tierra muy atenuada por la capa de ozono. Es llamada

también UV biológica, varía entre 280 y 320 nm y es muy peligrosa

para la vida en general y en particular para la salud humana, en caso de

exposiciones prolongadas de la piel y los ojos (cáncer de piel,

melanoma, catarata, debilitamiento del sistema inmunológico).

Representa sólo el 5% de la UV y el 0.25% de toda la radiación solar

que llega a la superficie de la Tierra.

UV-C Es en teoría la más peligrosa para el hombre, pero afortunadamente es

absorbida totalmente por la atmósfera.

Fuente: Dirección de Meteorología de Chile, 2003

Índice de radiación ultravioleta (UV)

La radiación solar UV es un parámetro medioambiental altamente variable en

tiempo y espacio. La necesidad de llegar al público con información fácilmente

comprensible sobre la radiación UV y sus posibles efectos negativos, ha llevado a los

científicos a definir un parámetro que pueda ser usado como indicativo de las

exposiciones a esta radiación (SERNAC, 2003).

Este parámetro es el denominado Índice Ultravioleta o Índice UV o UVI y está

relacionado con los efectos eritematógenos de la radiación solar UV sobre la piel

humana y ha sido definido y estandarizado bajo la función de varias instituciones

internacionales como la World Meteorological Organization (WMO), la World Health

Organization (WHO) y United Nations Environment Programm (UNEP), agencias

especializadas de Estados Unidos y la International Commission on Non Ionizing

Radiation Protection - Alemania.

Este índice está concebido como un medio para formar conciencia de la

población, respecto a los negativos efectos que tiene la radiación solar UV en la salud,

como también alertar al público sobre la necesidad de adoptar medidas protectoras.

El índice 89 es definido por la Dirección de Meteorología como un pronóstico

diario (24 horas), de la cantidad de radiación ultravioleta que recibirá la superficie de la

16

tierra durante la hora de máxima radiación, esto es alrededor del mediodía solar, que no

coincide exactamente con el mediodía convencional. Es un número en una escala de 0 -

10 (aunque puede exceder a 10) e incide de distinta manera en las personas, según su

tipo de piel, el tiempo y horario de exposición al sol y las medidas de protección

adoptadas (SERNAC, 2003; Cabrera, 2005).

Los rayos ultravioleta A (UVA)

Resultan responsables de la pigmentación directa de la piel, al provocar la

fotooxidación de los precursores de la melanina y por ende de producir la aparición de

un bronceado inmediato. Poseen mayor longitud de onda y menor energía que los UVB,

pero están presentes en cantidades importantes a lo largo del día y del año. Los fotones

de los ultravioleta A (UVA) afectan poco a la epidermis, pero inciden de forma

constante sobre la dermis; es la radiación que penetra más profundamente en la piel y

tiene efectos acumulativos sobre la misma.

A corto plazo causan importantes daños sobre el colágeno y la elastina, proteínas

responsables de la textura, elasticidad y firmeza de la piel. Al igual que los UVB,

producen una alteración del sistema inmunológico a una disminución del número de

células de Langerhans y sus funciones, que conduce a esa reducción del sistema

inmunitario, que no es capaz de asegurar la defensa óptima de la piel.

Los UVA juegan un papel esencial en el desencadenamiento de las alergias tales

como la lucitis estival benigna (LEB) que se manifiesta por una erupción en el pecho,

espalda y manos, acompañada de picazón muy intensa y sensación de quemazón. Son

responsables de reacciones fototóxicas y fotosensibilizantes y generación de radicales

libres. La radiación UVA tiene efectos a largo plazo, como es el fotoenvejecimiento de

la piel, una de las causas más importantes del envejecimiento prematuro de la piel, que

se caracteriza por una elastosis, intensa sequedad cutánea, arrugas muy marcadas,

flacidez, falta de elasticidad, hiperqueratosis e hiperpigmentaciones (Cabrera, 2005,

André, Paye & Howard, 2009; Gurish et al., 1975).

La radiación ultravioleta B (UVB)

A corto plazo y en exceso es responsable del eritema o enrojecimiento de la piel,

una señal de alarma que debe inducir a que se finalice la exposición al sol. Estos rayos

desencadenan el proceso de bronceado en el que se forma la melanina a partir del

aminoácido tirosina en el interior de los melanosomas. A largo plazo los UVA y UVB

podrían tener influencia en el fenómeno de desencadenamiento de cánceres cutáneos

(Browder & Beers, 1993; Goldsmith et al., 1996).

Los rayos infrarrojos (IR)

Poseen una energía calorífica importante y son responsables de la pérdida de

agua cutánea. Asimismo, potencian los efectos adversos de los ultravioleta (SERNAC,

2003; Solovchenko, 2010).

17

Cuadro 2.

Efectos biológicos de la radiación solar

Radiación UVA Radiación UVB Radiación IR

Pigmentación inmediata Bronceado Acción calorífica

Escaso poder

eritematógeno

Síntesis de vitamina D Enrojecimiento

Alteraciones del ADN Eritema actínico Aumento de la temperatura

Fotoenvejecimiento Engrosamiento del estado

córneo

Potencia los efectos

negativos de la radiación

UV

Fotocarcinogénesis Alteraciones del sistema

inmunitario

Fototoxia y fotoalergia Fotocarcinogénesis

Alteraciones del sistema

inmunitario

Fuente: Publicación del Consejo General de Colegios oficiales de España, 2003.

Protección de la piel

En general es conocido el efecto nocivo de la fracción ultravioleta de la

radiación solar sobre la piel. Los rayos cuya longitud de onda es inferior a 290 nm

(región llamada UVC) son absorbidos por la capa de ozono de la atmósfera terrestre, en

cambio los rayos del intervalo comprendido entre 290 y 320 nm (región llamada UVB)

provoca eritemas simples o incluso quemaduras de mayor o menor intensidad.

Se indica como región de máximo efecto eritematoso de la luz solar la región

circunscrita en torno a los 308 nm (SERNAC, 2003; Cabrera, 2005).

La piel normalmente se protege de la luz UV o produce melanina y por el grosor

de estrato córneo (capa más superficial). La piel de los seres humanos se clasifica según

el color y la capacidad de producir enrojecimiento y quemaduras. Entre más melanina

(más oscura) tenga la piel y más gruesa sea, más tolera la luz UV sin quemarse. Un

individuo muy blanco cuando se expone al sol, se broncea poco y se quema fácil. Pero

un individuo de piel oscura se broncea mucho y casi no se quema (Parrish et al., 1979).

Con base en la tolerancia a la radiación UV la piel se ha clasificado en 6 tipos. El

individuo que tiene piel de tipo I, cuando se expone al sol, siempre se quema en forma

severa y no adquiere bronceado. La piel tipo II generalmente se quema en forma severa

y adquiere poco bronceado. La piel tipo III se quema y se broncea moderadamente. La

piel tipo IV se quema poco y se broncea fácilmente. La piel tipo V rara vez se quema y

siempre se broncea y la piel tipo VI nunca se quema (Fitzpatrick et al., 1979; Boyd et

al., 1995).

18

La mejor protección contra el sol es la ropa, por lo cual las partes del cuerpo que

no quedan cubiertas por la ropa deben ser objeto de protección con un filtro solar que

contenga filtros UV-A y UV-B. Durante las primeras exposiciones se recomienda un

protector con un Factor de Protección Solar de 15 para adultos y, como mínimo, de 20

para niños. Especial cuidado precisan los bebés cuya piel es especialmente sensible.

El efecto protector de las cremas solares no sólo depende de la calidad de las

mismas, sino de su correcta aplicación. Para el cuerpo de un adulto la cantidad adecuada

de protector solar está entre 30 y 40 g. Con el propósito de conseguir el efecto

especificado por el SPF. El protector solar debe ser aplicado entre 20 y 45 minutos antes

de tomar el sol y reaplicado después de cada baño. Si los protectores solares se aplican

apropiadamente son capaces de proteger de quemaduras, envejecimiento prematuro de

la piel y cáncer (Browder & Beers, 1993; Cabrera, 2005).

El SPF que aparece en los protectores solares indica cuánto tiempo puede una

persona estar al sol sin quemarse en comparación con el tiempo normal de exposición.

Es decir, si normalmente una persona puede estar al sol 30 minutos sin quemarse y usa

un protector solar con SPF 8, podrá estar 8 veces más al sol sin quemarse, es decir, unos

240 minutos (4 horas) (SERNAC, 2003; Cabrera, 2005).

Se conocen numerosos compuestos con efecto protector contra la radiación

UVB, normalmente son derivados del 3-bencilidenalcanfor, del ácido 4-aminobenzoico,

del ácido cinámico, del ácido salicílico, de la benzofenona y también del 2-

fenilbencimidazol.

También para la región comprendida entre 320 y 400 nm, llamada región UVA,

conviene disponer de sustancias in vitro ya que estas radiaciones pueden provocar

daños. Se ha comprobado que la radiación UVA provoca daños en las fibras elásticas y

colagénicas del tejido conjuntivo, que se traducen en un envejecimiento prematuro de la

piel, debiendo considerarse además como la causa de numerosas reacciones fototóxicas

y fotoalérgicas. El efecto nocivo de la radiación UVB puede resultar amplificado por la

radiación UVA (Cabrera, 2005; Taylor et al., 1990; Thompson et al., 1993).

La radiación UV puede provocar además reacciones fotoquímicas, con lo cual

los productos de reacción fotoquímica intervienen en el metabolismo cutáneo.

Tales productos de reacción fotoquímica son en su mayor parte compuestos radicales,

p.ej. radicales hidroxilo. También los fotoproductos radicales indefinidos, generados en

la misma piel, pueden dar lugar a reacciones posteriores incontroladas, puesto que son

muy reactivos. Pero incluso el oxígeno singulete, un estado excitado no radical de la

molécula de oxígeno, puede surgir después de una exposición a la radiación UV, al

igual que epóxidos de vida corta y muchos otros compuestos. Frente al oxígeno triplete

(estado radical básico) que existe normalmente, el oxígeno singulete se caracteriza por

ejemplo por una mayor reactividad. De todos modos existen también estados triplete

excitados reactivos (radicales) de la molécula de oxígeno (Cabrera, 2005; Solovchenko,

2010; Gurish et al., 1975).

La radiación UV es además una radiación ionizante. Existe, pues, el riesgo de

que, a raíz de la exposición a la radiación UV, surjan especies iónicas que a su vez son

capaces de incidir con carácter oxidante en procesos bioquímicos. Son absorbentes UV

o reflectores UV la mayoría de pigmentos inorgánicos que, como es sabido, se utilizan

19

en cosmética para proteger la piel de los rayos UV. Son óxidos de titanio, de cinc, de

hierro, de circonio, de silicio, de manganeso, de aluminio, de cerio y mezclas de los

mismos así como modificaciones.

Los pigmentos inorgánicos se caracterizan por un buen efecto protector frente a

la luz. Pero presentan el inconveniente de que resulta difícil incorporarlos de modo

satisfactorio a tales formulaciones. Solo cuando las partículas son muy pequeñas dentro

de la formulación se logra que no den lugar a un ―blanqueo‖ molesto sobre la piel

(formación de manchas blancas) que se observa después de la aplicación (SERNAC,

2003; Cabrera, 2005; Lowe, 1990; Martini & Chivot, 1997).

Por lo general, los tamaños de partícula de estos pigmentos se sitúan por debajo

de los 100 nm. En una emulsión convencional, las partículas tienden a aglomerarse con

mayor o menor intensidad, dando lugar a aglomerados apreciables ya con un

microscopio normal. Además, esta aglomeración no finaliza durante el proceso de

fabricación de la formulación en cuestión, sino que continúa durante el almacenaje. Por

consiguiente, el ―blanqueo‖ puede intensificarse todavía más a lo largo del tiempo

(Salvador & Chesvert, 2007).

Los filtros solares protectores

Los filtros físicos o pantallas solares actúan reflejando la radiación como un

espejo, se trata de sustancias inertes, impermeables a la radiación solar (habitualmente

polvos minerales). En términos generales, son sustancias que se aplican sobre la piel

para protegerla de los efectos perjudiciales de la radiación ultravioleta. En la mayoría de

las ocasiones se asocian filtros químicos a físicos, siendo capaces de absorber, defractar

y reflejar los rayos ultravioletas y activos antioxidantes, también llamados filtros

biológicos, que evitan la formación de radicales libres y completan las acciones de los

otros filtros, estableciendo sinergias, los más utilizados son vitaminas A, E, C y B, zinc,

magnesio y flavonoides (Salvador & Chesvert, 2007; Solovhenko, 2010).

Según su modo de acción se clasifican en:

Filtros físicos: Son sustancias minerales impermeables (opacos) a la radiación,

reflejándola y dispersándola. Entre los más usados están el óxido de zinc, el dióxido de

titanio y la mica.

Filtros químicos: Son sustancias capaces de absorber la energía de la radiación UV

transformándola en otro tipo de energía no dañina. Algunos absorben principalmente

radiaciones UV-A, mientras que otros absorben preferentemente radiaciones UV-B.

Filtros biológicos: Son sustancias antioxidantes que evitan la formación de radicales

libres y potencian el sistema inmunológico cutáneo. Entre ellos se encuentran las

vitamina A y E en sus formas de acetato o palmitato.

Respecto de la radiación UVA, aunque es el componente predominante, se hace

menos aparente como quemadura que el del componente UVB. En los últimos años han

20

existido intentos por desarrollar métodos sustentables para medir la amplitud con que

tales productos proveen protección contra las radiaciones UVA. No obstante, pareciera

faltar aún tiempo antes de que esté disponible un método universalmente válido y un

sistema estandarizado de clasificación (André, Paye & Howard, 2009; Salvador &

Chesvert, 2007).

Los ingredientes activos de las pantallas o filtros solares pueden ser orgánicos (p.

ej., Parsol 1789, homosalate) o inorgánicos (p.ej. óxido de Zinc y dióxido de Titanio).

Ambos tipos bloquean el sol, de diferente forma, por lo cual la mayoría de los filtros y

pantallas contienen más de un ingrediente activo.Los filtros orgánicos presentan una

estructura con un grupo ionizable tales como grupos sulfónico (SO3H) o carboxílico

(COOH) el cual permite la solubilidad en agua. Por otra parte se pueden clasificar en

filtros UVA o UVB, dependiendo la radiación que atenúen (André, Paye & Howard,

2009; Salvador & Chesvert, 2007).

Para seleccionar el filtro solar adecuado se debe tomar en cuenta el color de la

piel, el grosor, el tiempo de exposición al sol y la cantidad de radiación que existe donde

nos encontramos. Debemos saber que superficies de arena, concreto o agua reflejan

hasta un 85% la luz solar; por eso aunque nos encontremos a la sombra en la playa

recibimos una exposición alta (Taylor, 1990; Hurwitz, 1988; Lowe, 1990). La luz

ultravioleta atraviesa el agua hasta en un 50% y aunque las personas se sientan frescas

bajo el agua están recibiendo mucha radiación (Taylor, 1990). El lugar donde nos

encontremos es un factor muy importante (Rubenstein et al., 1999). A una altura de

1500 m existe un 20% a 40% más radiación UV que en la playa (Taylor, 1990; Rigel et

al., 1999).

Varias organizaciones en el mundo entre ellas, la Academia Americana de

Dermatología (AAD de sus siglas en inglés) y Centers for Disease Control and

Prevention (CDC de sus siglas en inglés) han sugerido medidas para la protección de los

rayos solares (Goldsmith et al., 1996). La forma más práctica de protegerse del sol es

usando ropa adecuada: pantalones, camisas (de material denso y seco) y sombrero. La

ropa de algodón se considera que posee un factor de protección solar de 8 (SPF de sus

siglas en inglés) (Gonzales, 1996; Browder et al., 1993; Lowe, 1990; Goldsmith et al.,

1996). A los niños menores de seis meses de edad se recomienda protegerlos con ropas

adecuados y no usar bloqueadores solares (Goldsmith et al., 1996). El uso de sombrillas

para la lluvia no protege pues son permeables a la radiación UV. Debemos evitar

exponernos al sol en horas en que hay mucha radiación. Se le debe aconsejar a las

personas evitar exponerse entre las 10 a.m. y 4 p.m. Sin embargo esto depende del tipo

de piel del individuo y la cantidad de radiación solar del lugar donde estemos. Un error

muy frecuente es no protegerse porque el día está nublado, esto no es correcto pues las

nubes no bloquean efectivamente la radiación UV (solo un 50%) y se puede sufrir

quemaduras severas, especialmente en las montañas (Cabrera, 2005).

21

Fig. 3 Clasificación de los filtros orgánicos UV

22

23

Fuente: Salvador & Chisvert, 2007

El factor de protección solar (SPF)

Las pantallas solares se tipifican por el factor de protección solar (SPF, también

denominado, FPS o IP), el que indica cuánto tarda una piel protegida, expuesta a la

radiación UVB, en acusar un cierto grado de eritema (enrojecimiento), comparado con

el tiempo que tarda la piel desprotegida en lograr el mismo efecto. Está calculado a

razón de la dosis UV que causa quemaduras en una piel protegida con pantalla solar,

con relación a la dosis que causa igual efecto en una desprotegida (Boyd et al., 1995;

Browder, 1993; Deflandre & Lang, 1988).

La tendencia creciente de estos cosméticos, es la de establecer factores de

protección cada vez más altos, pese a ello, la mayoría de los protectores tienen rangos

24

de SPF entre 15 y 25. Es posible encontrar protectores que rotulan SPF 50 y más pero,

en concreto, valores por sobre 40 brindan un escaso beneficio adicional, ya que incluso

con un SPF de 33, alrededor del 97% de los rayos que causan eritema han sido

eliminados.

Por norma general, antes que un filtro solar sea registrado, debe demostrar que es

inocuo para la salud, efectivo y seguro en el uso. Las regulaciones legales que se aplican

a los filtros UV son considerablemente más estrictas que aquellas que se aplican a otras

sustancias cosméticas. Se menciona que el costo de los tests de alergia a la piel

prescritos para el desarrollo de una sustancia nueva, pueden fácilmente superar los dos

millones de francos suizos.

El Manual UVI editado en España, en el contexto de la campaña activa en

relación a las precauciones que debe adoptar la población en su exposición al sol, señala

el factor recomendable para los distintos tipos de piel, ante los distintos grados a que

puede llegar el índice ultravioleta. Sus antecedentes se reproducen en el siguiente

cuadro (SERNAC, 2003; Diffey, 1994):

Cuadro 3.

Factor de Protección recomendado para fototipos de piel según UVI Diagnosticado

Índice UVI Factor de protección solar (SPF)

Piel tipo I Piel tipo II Piel tipo III Piel tipo IV

1-3 15 12 9 6

4-6 30 25 15 12

7-9 50 40 30 20

10 y más 60 50 40 30

Fuente: Manual UVI-España, 2002.

Un número limitado de filtros UV está disponible para ser incorporados en

protectores solares, en función de los requerimientos regulatorios de cada país. Con la

demanda de mayores FPS, la tendencia ha sido un uso más individual lo que implica

una variedad de agentes en los nuevos productos. La investigación reciente en la

eficacia de la protección solar se ha enfocado en la necesidad de que la protección cubra

un espectro completo en la región UV (Solovchenko, 2010; Cabrera, 2005).

Las agencias reguladoras son a menudo lentas para aprobar nuevos ingredientes.

La eficacia de los protectores solares sigue siendo muy dependiente de la formulación

del vehículo. Disolventes y emolientes pueden tener un efecto marcado en la

absorbancia por el ingrediente activo en la longitud de onda en la cual absorbe. Los

formadores de película y emulsificantes determinan la uniformidad y espesor de la

película formada sobre la superficie de la piel, el cual determina el nivel de FPS,

durabilidad y resistencia al agua. La estética juega un rol muy importante en la

aceptación del producto, particularmente con los bloqueadores y protectores solares

(Cabrera, 2005; André, Paye & Howard, 2009).

25

Tipos de formulaciones disponibles

Emulsiones

Suspensiones

Geles

Sticks

Sprays

Lociones

Espumas

Los efectos deletéreos de la exposición solar, han impuesto y desafiado a la

industria cosmética a desarrollar productos multifuncionales que contengan ingredientes

adicionales para aumentar el SPF y además activos con otras funciones especificas, tales

como:

formadores de film

antioxidantes

vitaminas

filtros UV: orgánicos, inorgánicos y sus mezclas

humectantes y humedecedores

control sobre las MMP (matrix metal proteinases)

reparación del DNA

otros

Algunas combinaciones y sus claims

Protección solar y DEET (repelente insectos)

Protección solar y astringente, reequilibrante

Hidratante, purificante, tonificante

Anti radicales libres, relajante

Color, glitter (niños)

Anticelulíticos

Vitaminas, pigmentos iluminadores

Alta protección solar y antiaging

Mercado de Productos solares

Autobronceantes

Bronceadores

Intensificadores de bronceado

Protectores solares

Post-solares

Emulsiones:

Una emulsión es un sistema disperso que contiene por lo menos dos fases

líquidas no miscibles. Las emulsiones, al igual que las suspensiones son

termodinámicamente inestables como resultado del exceso de energía libre asociada a la

26

superficie de las gotitas dispersas. Las gotitas dispersas, hacen lo posible por juntarse y

reducir la superficie; también tienden a coalescer y fusionarse provocando la ruptura de

la emulsión (Gennaro, 2003) Para minimizar este efecto se necesita un agente

emulsionante, que debe seleccionarse cuidadosamente para lograr la estabilidad óptima.

En los últimos años se ha reconocido que en la emulsiones pueden existir

combinaciones complejas multifásicas. Suelen formarse fases cristalinas líquidas y

geles a partir de la combinación básica de tres componentes de agua, aceite y

tensoactivo(agente emulsionante) (Gers-Barlag & Kröpke, 2001).

A medida que el agente emulsionante se hace más hidrófilo (afín al agua), su

solubilidad den agua aumenta y se favorece la formación de una emulsión O/W. A la

inversa, las emulsiones W/O se favorecen con los emulsionantes más lipófilos.

Griffin creó una escala basada en el equilibrio de estas dos tendencias opuestas. La

denominada escala HLB es una escala numérica que se extiende desde 1 hasta

aproximadamente 50. Los tensioactivos más hidrófilos tienen números HLB altos (más

de 10); mientras aquellos con números de HLB de 1-10 se consideran lipófilos.

Este sistema se usa para racionalizar la elección de los agentes emulsionantes no iónicos

para formular la emulsión (André, Paye & Howard, 2009).

Cuadro 4.

Relación entre los límites HLB y aplicación de surfactantes

Límites

HLB

Uso

0-3 Agente antiespuma

4-6 Agente emulsionante W/O

7-9 Agentes humectantes

8-18 Agentes emulsionantes O/W

13-15 Detergentes

10-18 Agentes solubilizantes

Si se necesita una emulsión O/W, el formulador debe usar emulsionantes con un

HLB dentro del rango de 8-18. El valor de HLB es el valor necesario para que un

material determinado sea emulsionado efectivamente.

Propiedades deseables en un agente emulsionante:

Ser tensioactivos para reducir la tensión superficial por debajo de 10 dinas/cm,

ser adsorbidos rápidamente, alrededor de las gotas dispersas, como una película

condensada, no adherente que prevendrá la coalescencia, impartir a las gotitas un

potencial eléctrico adecuado para asegurar la repulsión mutua, aumentar la viscosidad

de la emulsión, ser efectivos en una concentración razonablemente baja (Gennaro,

2003).

Los agentes antisolares aprobados se pueden dividir en dos categorías:

Materiales que absorben energía en el rango UV, en donde se encuentran los

antisolares orgánicos, a los que se refieren erróneamente como ―químicos‖. De

hecho todos los materiales son ―químicos‖ en la naturaleza. El OMC, utilizado

en esta oportunidad pertenece a este grupo y se denomina Octinoxato. Puede

27

utilizarse hasta en un 7.5% en USA y hasta 10% en la Comunidad de Estados

Europeos.

Materiales que bloquean, dispersan, y pueden absorber energía en el rango UV.

El dióxido de titanio y el óxido de zinc pertenecen a este grupo. El dióxido de

titanio refleja y dispersan prácticamente en todo el rango de radiación UV-VIS

(290-777 nm), por lo que previene y minimiza tanto las quemaduras solares

como el bronceado (Cabrera, 2005).

Todos los agentes antisolares tienen una propiedad en común y es su capacidad

para absorber energía en el rango ultravioleta. Como regla general, las moléculas de los

agentes antisolares poseen un grupo donador de electrones (metoxy o amino) y un grupo

receptor de electrones (predominantemente carbonilo, pero el grupo ciano también

puede desempeñar esta función, ej: Octocrileno) (André, Paye & Howard, 2009).

Cuando el grupo donador de electrones (metoxi) se encuentra en posición para

con respecto al receptor de electrones (carbonilo) se optimiza la absorción de radiación

ultravioleta. El antisolar más popular del mundo, (Octilmetoxicinamato), pertenece a

este grupo. Los mejores antisolares UVA tiene más de un anillo bencénico.

El octinoxato (OMC) es un antisolar paradisustituido con excelente absorbancia

en el rango UVB (presenta absorbancia máxima en 311nm y posee un coeficiente de

extinción de 23,300). Es por mucho el antisolar más utilizado en Estados Unidos y en

el Mundo. Tiene buena solubilidad en aceites y aumenta su efectividad cuando se

combina con otros antisolares con los que alcanza factores de protección solar más

elevados (Salvador & Chesvert, 2007).

La legislación en estados unidos establece que según su SPF los productos se clasifican

en:

Minima protección solar SPF 2 hasta debajo de 12.

Moderada protección solar SPF 12 hasta debajo de 30.

Alta protección solar SPF 30 o más (Rieger, 2003).

Geles

La mayoría de los geles se forma por agregación de partículas soles coloidales;

los sistemas sólidos o semisólidos así formados están interpenetrados por un líquido.

Las partículas se unen formando una malla entrelazada que confiere rigidez a la

estructura; las mallas mantienen en su interior la fase continua. A menudo se requiere

sólo un pequeño porcentaje de fase dispersa para conferir la rigidez; un gel rico en

líquido suele recibir el nombre de gelatina; si se elimina el líquido y sólo se conserva la

estructura del gel, se denomina xerogel (Charlet & Muñoz, 1996; André, Marc &

Howard, 2009).

Tipos de gel

Gelación de soles liófobos:

Los geles pueden ser soles liófobos floculados en lo que puede considerarse que

el gel forma un flóculo continuo. Las arcillas, como la bentonita, el silicato de aluminio,

magnesio (Veegum) y hasta cierto punto el caolín, forman geles por floculación de una

28

manera especial. Son silicatos de aluminio (aluminio/magnesio) hidratados que poseen

una estructura cristalina que les permite existir en forma de placas planas; la parte plana

o cara de la partícula posee carga negativa debido a los átomos de O y el borde de la

placa tiene carga positiva debido a los átomos de Al +3

/Mg 2+.

Debido a la atracción

electrostática entre la cara y el borde de diferentes partículas se genera una estructura de

gel que forma lo que suele conocerse como flóculo en castillo de naipes (Charlet &

Muñoz, 1996).

Las fuerzas que mantienen unidas las partículas en este tipo de gel son

relativamente débiles: fuerzas de vander Waals en la floculación mínima secundaria del

hidróxido de aluminio, atracción electrostática en el caso de las arcillas; y como estos

geles experimentan el fenómeno de la tixotropía, una transformación gel-sol-gel

isotérmica no química. Si se deshace un gel tixotrópico se rompen estos enlaces y se

forma un sol liófobo. Si se deja reposar, las partículas colisionan, se produce la

floculación y se restablece el gel. Los geles deben sus propiedades reológicas anormales

a la floculación. Este fenómeno de la tixotropía se aprovecha para preparar suspensiones

farmacéuticas, como la bentonita en la loción de calamina y en la industria de las

pinturas (Gennaro, 2003).

Gelación de soles liofílicos:

Los geles formados por soles liofílicos pueden dividirse en dos grupos,

dependiendo de la naturaleza de los enlaces entre las cadenas de la retícula. Los geles de

tipo I son sistemas irreversibles con una retícula tridimensional formada por enlaces

covalentes entre las macromoléculas.

Los geles de tipo II se mantienen unidos por enlaces intermoleculares mucho

más débiles, como los enlaces de hidrógeno. Estos geles son termorreversibles y pasan

de sol a gel al calentarlos o enfriarlos. Las soluciones de poli (alcohol vinílico), por

ejemplo se gelifican al enfriarlos por debajo de una determinada temperatura conocida

como punto de gel (Gennaro, 2003).

Hidrogel:

Los hidrogeles son sistemas en estado coloidal con apariencia sólida como la

albúmina coagulada por el calor, la gelatina gelificada por enfriamiento, etc. Una de las

propiedades de los hidrogeles es la de hincharse y aumentar de volumen por absorción

de agua y sustancias en ella disueltas, propiedad común a todos los tejidos de los

organismos formados por materias coloidales (André, Paye & Howard, 2009).

Control de Calidad

El control de la calidad de las materias primas y productos terminados

empleados en Fitoterapia y Fitocosmética es fundamental para garantizar su seguridad y

eficacia. Se trata generalmente de mezclas complejas cuyo control resulta difícil y

requiere un enfoque multidisciplinario.

El control de calidad tiene como objetivos determinar la identidad y pureza y

valorar sus principios activos o marcadores. Para ello es necesario disponer de métodos

adecuados y las especificaciones que debe cumplir cada producto (Solis et al., 2005).

29

Por otra parte las exigencias de calidad constituyen un apartado importante del

expediente de registro de un fitocosmético o un fitomedicamento, no sólo en relación

con las materias primas, sino también con el producto terminado, incluida su

estabilidad, y los productos intermediarios de fabricación.

En las últimas décadas, el control de calidad de las drogas vegetales y sus

productos derivados ha experimentado una importante evolución. Así, a lo largo de los

años la autentificación del material vegetal a partir de sus características

morfoanatómicas (macroscópicas y microscópicas) y organolépticas, se ha visto

complementada con la realización de ensayos químicos, físicos y biológicos que

permiten tanto la detección de adulteraciones como la identificación y valoración de los

principios activos o marcadores de las mismas. El conocimiento cada vez más completo

de los constituyentes químicos de las drogas y el desarrollo de técnicas analíticas cada

vez más sofisticadas permiten aplicar métodos de control de calidad más rigurosos y

proporcionar al consumidor preparados correctamente estandarizados y de mayor

confianza (Steinberg, 2003; Salvador & Chesvert, 2007).

Las técnicas empleadas en el control de calidad de las drogas vegetales y derivados

pueden comprender tres tipos de ensayos:

Ensayo morfoanatómico y organoléptico, útil en el control de la identidad y

pureza de las drogas vegetales.

Ensayo físico-químico, empleado en la identificación y pureza, tanto de drogas

vegetales como de productos extractivos, así como en la valoración de principios

activos o marcadores.

Ensayo biológico, utilizado principalmente para el control microbiológico, pero

que puede ser útil también, en algunos casos, para la valoración de principios

activos (Cañigueral, 1998; 2002; Bruneton, 2001; Solis et al., 2005).

Técnicas analíticas empleadas en la determinación de los filtros UV

Diferentes técnicas analíticas han sido empeladas para determinar los filtros UV,

dependiendo de la naturaleza orgánica o inorgánica del filtro UV y también de las

diferentes familias, propiedades fisicoquímicas. Se han utilizado técnicas

espectroscópicas, electroquímicas y cromatográficas.

Las técnicas cromatográficas más frecuentemente empleadas han sido la

cromatografía en capa fina, cromatografía de gases, cromatografía líquida, esto debido a

que la mayoría de filtros son más de naturaleza orgánica que inorgánica y son más

utilizados en las formulaciones. Usualmente se combinan en formulaciones cosméticas

diferentes activos los cuales no se pueden medir directamente sin un paso previo de

separación (Salvador & Chesvert, 2007).

30

Fig. 5 Porcentaje de publicaciones de acuerdo a las técnicas analíticas empleadas

Fuente: Salvador & Chesvert, 2007.

Situación reglamentaria del producto

Comunidad europea

Por la especial incidencia del tema en la conservación de la salud, los países

desarrollados tienen debidamente reglamentados los productos cosméticos solares. En

Europa los filtros solares están sometidos a una reglamentación que determina

expresamente las sustancias autorizadas y su concentración máxima, como también la

forma de realizar los experimentos para los productos cosméticos terminados.

El documento oficial que armoniza las reglamentaciones en materia de

cosméticos está contenido en la Directiva del Parlamento Europeo y del Consejo

76/768/CEE y sus modificaciones. Dicho documento tiene como principal objetivo

proteger lasalud humana, para cuyo fin establece que ella puede evaluarse a partir del

conocimiento de la seguridad de sus ingredientes que los componen y mediante

métodos que excluyen las pruebas en animales. Estos métodos deben cumplir como

requisito el uso de métodos alternativos, validados a nivel comunitario u homologado

como científicamente válidos por el Centro Europeo para la Validación de Métodos.

La lista positiva europea incluye normalmente alrededor de veinte filtros UV que

pueden ser utilizados en productos para el sol, aunque en la práctica sólo alrededor de la

mitad de ellos se utiliza (COLIPA, 2009; Herzog et al., 2005).

Estados Unidos

Por su parte, en Estados Unidos de Norteamérica, la FDA regula las pantallas

solares como medicamentos OTC21 (del inglés over-the-counter), es decir, de venta sin

prescripción médica. En consecuencia, los productos cosméticos que están marcados

como protectores del sol, están regulados tanto por las normas aplicables a cosméticos

como a medicamentos, lo que es atribuible a su intención o propósito de uso, al ser una

formula cosmética que declara otorgar protección solar. El método FDA para

determinar el Índice de protección, es reconocido mundialmente (SERNAC, 2003;

Herzog et al., 2005).

El rotulado o etiquetado de los protectores solares

La literatura disponible respecto de las medicinas OTC señala que, siendo éstas

próximas a una medicina propiamente tal, la comprensión de la información contenida

31

en las etiquetas del producto, es considerado el aspecto más importante del auto-cuidado

que las personas obtienen mediante su uso. Esta apreciación parece ser de extraordinaria

importancia para el consumidor final, expuesto a una oferta generalmente abundante y

variada en los términos y/o denominaciones que se utilizan para describir el producto,

como también en el grado de protección declarado, que carece de la necesaria

homologación para resultar comparativamente válida (SERNAC, 2003).

Situación del producto en Estados Unidos y Europa

Estados Unidos

En primer lugar, debe precisarse que en este país, los filtros o pantallas solares

son considerados tanto drogas como cosméticos. Al respecto, ante la discusión respecto

de que si los filtradores actúan como ―si se estuviera a la sombra‖ y, por ende, no

deberían reglamentarse como drogas, la FDA ha señalado que ―los ingredientes activos

de los filtradores solares afectan a la estructura y función del cuerpo ―absorbiendo,

reflejando o esparciendo a los dañinos rayos quemantes del sol y, por lo tanto, alterando

la respuesta inmunológica normal a la radiación solar‖.

Por tanto, la combinación droga OTC/producto cosmético debe cumplir con el

etiquetado propio de ambos productos. Por ejemplo, los componentes droga deben

listarse alfabéticamente como ―ingredientes activos‖, seguidos de los componentes

cosméticos en orden de predominancia como ―ingredientes inactivos‖ (SERNAC, 2003;

Herzog et al., 2005).

El sistema que rige la aprobación de ingreso al mercado para este tipo de productos

se encuentra contenida en una Monografía Final que estipula los aspectos a seguir para

que ello ocurra. Estos documentos oficiales son la publicación del resultado de los

estudios que se han realizado con el fin de determinar la seguridad y efectividad del

producto, así como las leyendas de sus etiquetas, incluidas las advertencias y

descripciones del producto. Para las drogas filtradoras de los rayos solares, las reglas

propuestas fueron publicadas en el Registro Federal el 25 de agosto de 1978, Vol.3 Nº

166, páginas 38206 a 38269. La Monografía Final se publicó el 21 de mayo de 1999,

Vol.64, Nº 98, páginas 27666 a 27693, y para enero del 2002 todos los productos debían

cumplir con la normativa. Entre otros importantes aspectos que establece dicha

monografía, se encuentran los siguientes:

Los productos que aseveren acelerar o estimular el proceso de bronceado son

sujetos a la reglamentación de una droga.

Se acepta la mención PABA en el rotulado forma resumida para referirse al

ácido p- amino benzoico.

Los productos pueden rotular en una de tres formas la protección que prometen:

―mínimal‖ (mínima), para productos con SPF entre 2 y 12; ―moderate‖

(moderada), para aquellos con SPF de 13 a menos de 30, y ―high‖ (alta), para

aquellos con SPF 30 o más. Los productos con factor de protección superior a

30, deben ser rotulados ―30 plus‖ o, lo que es igual, ―30 +‖).

32

Abolir el uso de términos tales como ―bloqueador solar‖, ―a prueba de agua‖, y

―protección a la luz solar visible o infrarroja‖.

En lo que respecta a las etiquetas señalen que el producto es ―resistente al agua‖,

o ―muy resistente al agua‖, la idea es que ello deba significar necesariamente

que el producto provee un estado posterior de protección SPF, debidamente

testeado para un largo de tiempo específico.

El término ―bloqueador solar‖ no puede aparecer en ninguna parte de la etiqueta

del producto.

Los productos que carecen de factor de protección solar, deben estar marcados

con la siguiente leyenda:

Peligro: este producto no contiene pantalla solar y no protege contra las

quemaduras de sol. Exposiciones de la piel al sol en forma repetida y

desprotegida pueden incrementar el riesgo del envejecimiento y cáncer de piel,

así como otros efectos dañinos incluso sin que se produzcan quemaduras

(SERNAC, 2003).

Las medidas fueron propuestas por la FDA principalmente por dos razones:

La incapacidad de las metodologías de testeo para formulaciones con niveles

superiores de SPF, y por lo concerniente a que el rotulado de altos SPF podrían inducir

a los consumidores a pasar más tiempo al sol del que es recomendable. Al respecto, la

National Coalition for Sun Safety, una organización patrocinada por la American

Academy of Dermatology promueve un piso, más que un techo en materia de SPF

entendiendo que es mejor entregar un mínimo nivel de SPF que asegure que los

productos proveen alguna protección (André, Paye & Howard, 2009).

El etiquetado es fundamental, ya que existen estudios que muestran que los

consumidores sub-utilizan el producto, al emplear, menos la mitad de la cantidad

recomendada, según concluye un artículo publicado en los Archives of Dermatology.

Los requisitos de etiquetado de los productos OTC incluyen:

El nombre del producto

Los ingredientes activos o substancias terapéuticas en medicina

Categoría o propósito del producto

Usos: Síntomas o enfermedades que el producto trata o previene.

Precauciones

Instrucciones de uso tales como: cuánto producto utilizar, cómo usarlo y por

cuánto tiempo.

Otra información: Por ejemplo, información para su almacenaje.

Ingredientes inactivos: substancias tales como colorantes y otros (COLIPA,

2009, Herzog et al., 2005; Goldsmith et al., 1996; RTCA, 2005, 2006).

33

Información de la especie vegetal:

P. pseudoaureum previamente ha sido llamada P. aureum, especie sólo conocida

hasta hace poco tiempo, de Florida, Sudamérica, las Bahamas, Puerto Rico y las

Antillas Menores. De acuerdo con Proctor y Evans P. decumanum y P. pseudoaureum,

han hibridizado dando origen a P. aureum. La evidencia morfológica que sustenta este

parentesco es que P. aureum tiene un número intermedio de series de soros (2 a 3

hileras) entre el de P. pseudoaureum (1 hilera) y P. decumanum (de 3 a 7 hileras).

También se señala que P. decumanum y P. pseudoaureum (tratada como P. aureum) se

ha entrecruzado en Honduras produciendo un híbrido (posiblemente P. dictyocallis)

(Morán, 1996).

Estas especies se usan ampliamente por sus múltiples virtudes medicinales

atribuidas; en Guatemala se usan indistintamente otras especies medicinales (P.

attenuatum y P. dissimile). En Honduras se produce comercialmente tanto P.

decumanum como P. leucotomos (Cáceres, 1996).

Dentro de los usos medicinales atribuidos se mencionan, la infusión y decocción

del rizoma se usa oralmente para tratar afecciones gastrointestinales (diarreas, dolor de

estómago, estreñimiento, gastritis), respiratorias (asma, tos, tos ferina) y cardíacas,

dolor de huesos, reumatismo, diabetes, gota, hipertensión, parásitos, enfermedades

venéreas, sífilis y afecciones renales (cálculos, hidropesía). Tópicamente se usa la

infusión en emplasto y cataplasma para el tratamiento de contusiones, reumatismo,

úlceras, quebraduras, cáncer, cierto tipo de tumores, psoriasis y eczema. La decocción

de las hojas se usa para detener las hemorragias. Se le atribuye propiedad analgésica,

antihemorrágica, depurativa, diurética, desinflamante, emenagoga, espasmolítica,

expectorante, febrífuga, laxante, pectoral, purgante, sudorífica y tranquilizante (Cáceres,

1996).

Del extracto acuoso del rizoma de P. leucotomos se obtiene una saponina llamada

anapsos, que es utilizada para el tratamiento de dermatitis atópica, psoriasis y vitíligo,

también se le atribuye propiedades para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y

artritis reumatoide. Se ha demostrado actividad biológica que favorece la regeneración

de tejidos por medio de la capacidad de incrementar el número de linfocitos CD8

(citotóxicos/supresores). Ha demostrado disminuir el estrés oxidativo en pacientes con

requerimientos altos de energía (deportistas). Simultáneamente se ha confirmado que

está relacionado con la modulación del factor de necrosis tumoral.

Estudios antimicrobianos demuestran que el extracto acuoso tiene alguna actividad

antibacteriana, aunque en otros estudios los extractos acuoso y etanólico fueron

inactivos contra E. coli y S. aureus. El extracto de hojas es activo contra bacterias

fitopatógenas (Xanthomonas campestris). Punzon et al. (2003) demostraron la actividad

antiinflamatoria in vitro del extracto acuoso de P. decumanum el cual inhibió el factor

de necrosis tumoral (TNF) por la producción de macrófagos activados con

lipopolisacáridos (LPS) o LPS interferon (IFN)-.

34

La calagualina es una saponina aislada del rizoma que tiene actividad antitumoral.

La decocción del rizoma produce moderada actividad diurética en ratas (Cáceres, 1996).

En tejido tumoral, una de sus saponinas (anapsos) reduce la incorporación de

nucleoproteínas y precursores por un mecanismo anabolizante opuesto a la acción de

citostáticos (Vargas, 1981 & Manna, 2003).

La administración oral del extracto acuoso tiene acción inmunomoduladora medida

por proliferación del bazo de ratón con Con A (Fernandez, 1992). La administración de

una fracción del extracto acuoso (anapsos) en ratas produce hipoactividad cerebral

dosis-dependiente posiblemente por variación en los niveles de IL-1β hipotalámica. Los

anapsos de P. leucotomos modulan las células linfoides y la expresión de moléculas de

adhesión (Sempere-Ortells et al., 2002). El extracto acuoso prolonga la sobrevivencia

de aloinjertos cutáneos en ratones, sugiriendo una actividad inmunosupresora

(Tuominen, 1991). El extracto de P. leucotomos mostró actividad antioxidante (Gomes

et al., 2001). Los anapsos del extracto acuoso de P. leucotomos (calagualina) han sido

utilizados clínicamente en el tratamiento de una serie de desórdenes inmunológicos tales

como: dermatitis atópica, psoriasis, vitiligo y procesos neurodegenarativos como

Alzheimer. El extracto hidrofìlico presentó actividad fotoprotectiva en células humanas

de la piel contra daño celular inducida por los rayos UV (Alonso et al., 2003).

Se han realizado algunos estudios de composición química en las especies de

calahuala, pero aún son incompletos. El rizoma de P. aureum contiene azúcar, aceite

esencial, mucílgo, almidón, nitrato de potasio y colorante rojo, además contiene

calagualina, polipodina, aceites grasos y taninos, así como esteroides (ecdisterona y dos

ecdisonas como la polipodaureina) y triterpenos (Horvath et al., 1975). Las especies

usadas medicinalmente en El Salvador contienen alcaloides, sesquiterpenlactonas y

taninos (Planter, 1989). Se reportaron la presencia de cinco flavonoides aislados de 2

especies de Polypodium (P. decumanum y P. triseriale) (Vasänge et al., 1997). Se aisló

vicianina, un glicósido cianogénico de P. leucotomos. El análisis cromatográfico de los

extractos muestra la presencia de ácido quínico, ácido fumárico, ácido láctico, ácido

málico y ácido cítrico (Patente WO 03/103695 A1, Quintanilla, 2003). Se especifica el

procedimiento de obtención de Alfa-d-gluco-octono-delta-lactona-eno-diol de P.

leucotomos (Patente ES 2 012 734, Vargas & Yesares, 1990) y un sulfolípido (Patente

WO 97/40838, Vasänge et al., 1997). En Guatemala se han realizado estudios por

cromatografía en capa fina en rizomas y frondas demostrando la presencia de saponinas

en rizomas y flavonoides en frondas (Datos no publicados).

Desde el año 2001 Martínez y colabordores han realizado estudios de

caracterización in situ y manejo de poblaciones del complejo calahuala (Polypodium

spp.) en la porción de la zona de vida Bosque húmedo Montano Bajo Subtropical,

comprendida entre los departamentos de Guatemala y Jalapa. Estos trabajos han

contado con el apoyo de la DIGI (Dirección General de Investigación) de la USAC y ha

tenido como objetivo caracterizar morfológica y fenológicamente las poblaciones

naturales de calahuala; además se ha realizando estudios preliminares de manejo y

aprovechamiento de estas especies. Además se inició el estudio en la parte

agrotecnológica y fitoquímica en el proyecto de Desarrollo de Plantas Medicinales

35

(OEA/AICD/USAC), con tres especies medicinales Phlebodium pseudoaureum

(calahuala), Smilax domingensis (Zarzaparrilla) y Lippia graveolens (Orégano). Para

estas especies, en el año 2002, se colectó material de propagación; para 2003 se

establecieron siembras y trabajos experimentales para conocer los principales aspectos

de su cultivo y manejo.

En el 2007 se concluyó un estudio donde se estableció una colección nacional de

calahuala en la Facultad de Agronomía y mediante el financiamiento de FODECYT se

pretende establecer una réplica de dicha colección en 3 diferentes localidades y evaluar

dichos materiales, por lo que es una especie que ha despertado interés en diferentes

sectores por lo que el estudio de la misma resulta importante ya que actualmente sólo

Honduras tiene un aprovechamiento de la especie en la comercialización de productos

naturales medicinales, y Guatemala cuenta con la presencia de la especie en la región

Volcánica del Altiplano Occidental y aún no se realiza un plan de manejo para

garantizar el aprovechamiento sostenible y sustentable de la especie, el cual podría

beneficiar a las diferentes comunidades y pequeños agricultores que conozcan el

potencial de la especie.

36

PARTE III

RESULTADOS

Objetivo: Caracterizar la droga vegetal y extractos de P. pseudoaureum mediante

pruebas fisicoquímicas, fitoquímicas y microbiológicas para evaluar su identidad y

pureza.

A la materia vegetal colectada previamente en San José Pinula; se le realizaron

pruebas fisicoquímicas como porcentaje de humedad, cenizas totales y cenizas

insolubles en ácido con la finalidad de establecer su calidad, según lo descrito en las

diferentes farmacopeas consultadas.

Según se observa en la Tabla 1 y 2 la fronda y el rizoma cumple con los parámetros

establecidos para cenizas totales, así como para cenizas insolubles en ácido,

observándose mayor cantidad de cenizas en la fronda.

Tabla 1.

Caracterización fisicoquímica de la Fronda

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

Tabla 2.

Caracterización fisicoquímica del Rizoma

No Promedio cenizas

totales

Descripción cenizas

totales

Porcentaje de

humedad

Mx

ideal

AHP(Farmacopea

Herbolaria Americana),

Farmacopea Europea,

BP( Farmacopea

Británica), FE

(Farmacopea Española)

no más de 12%.

Cenizas de color blanco

con ausencia de carbòn

negro o partículas negras,

según BP(Farmacopea

Británica)

No más del 10%

Mx 1 4.06 Se observa una masa color

blanco. 7.13

Mx 2 5.00 Se observa una masa color

blanco. 6.85

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

No Promedio

cenizas totales

Descripción cenizas

totales

Promedio cenizas

insolubles en

ácido

Descripción

cenizas insolubles

en ácido

Porcentaje de

humedad

Mx

ideal

AHP(Farmacopea

Herbolaria

Americana),

Farmacopea

Europea, BP(

Farmacopea

Británica), FE

(Farmacopea

Española) no

más de 12%.

Cenizas de color blanco

con ausencia de carbòn

negro o partículas

negras, según

BP(Farmacopea

Británica)

Según la BPA no

más del 2%.

No especificado en

las farmacopeas

consultadas

no más del 10%

Mx 1 8.75 Se observa una masa

color blanco. 0.22

Se observa una

masa color blanco y

partes color café.

9.86

Mx 2 7.33 Se observa una masa

color blanco. 0.345

Se observa una

masa color blanco y

partes color café.

9.20

37

En la tabla 3, se observa que la mayor cantidad de sólidos lo extrajo el etanol al 50%

tanto en fronda como en rizoma, seguido de etanol al 70% por lo que se seleccionó esté

último, por los flavonoides que extrae en mayor cantidad, que son los metabolitos de

interés por su efecto antioxidante y protector solar.

Tabla 3.

Sólidos totales o Sólidos extraíbles a partir de la droga vegetal

Muestra Solvente Sólidos Extraíbles

Fronda Etanol 50% 2.24

Etanol 70% 1.15

Etanol 95% 0.20

Rizoma Etanol 50% 1.51

Etanol 70% 0.84

Etanol 95% 0.24

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

En la tabla 4 se observan los resultados de las pruebas fisicoquímicas realizadas

en los extractos: Pruebas organolépticas, las cuales fueron determinadas por un panel de

al menos 3 personas; como color, empleando una carta de color, olor, descripción de los

extractos, indicando su consistencia y apariencia; pruebas fisicoquímicas como el pH,

determinado con potenciómetro a 20 °C, densidad determinada con picnómetro a 20 °C

y sólidos extraíbles, determinados a sequedad y luego 105 °C durante 3 horas.

En todos los extractos de rizoma predominó el color olmeca y tecojote con olor

dulce, de consistencia viscosa y acaramelada, mientras que en la fronda presentó un

color áfrica y golden, algunos extractos con un olor un tanto ácido, predominando

igualmente en la mayoría olor dulce.

Respecto a las características fisicoquímicas tanto los extractos de rizoma como

de fronda presentaron pH alrededor de 6 y densidad de 1, los extractos secos con mayor

cantidad de sólidos extraíbles respecto a los extractos fluidos.

Tabla 4.

Pruebas Fisicoquímicas realizadas a los extractos de P. pseudoaureum

Organolépticas Fisicoquímicas

No.

Proceden

cia Color Olor Descripción Homogeneidad pH Densidad Sólidos Extraíbles

Muestra

Ideal Característico.

Dulce/

Acido Característica Película homogénea.

Característ

ico

Característ

ico Fluido Seco

1 RC1 H2-12

Tecojote Dulce

liquido viscoso,

apariencia

acaramelada

pelicula homogenea,

unifase, sin particulas

extrañas

5,9 1,055 56,29% NA

2 RC2 H2-14 Olmeca Dulce viscoso, apariencia

acaramelada

pelicula homogenea,

unifase, sin particulas

extrañas

6,1 1,057 11,36% 78,69%

3 RC3 H2-14 Olmeca Dulce viscoso, apariencia

acaramelada

pelicula homogenea,

unifase, sin particulas

extrañas

5,7 1,061 11,36% 81,80%

4 RC4 H2-14 Olmeca Dulce viscoso, apariencia

acaramelada

pelicula homogenea,

unifase, con pequeños

sólidos suspendidos

6,0 1,005 20,90% 81,30%

5 FC1 G3-12 Africa Acido poco viscoso,

consistencia firme

pelicula homogenea,

unifase, sin particulas

extrañas

6,0 1,041 19,28% 60,40%

38

6 FC2 H2-13 Golden Acido viscoso, apariencia

acaramelada

pelicula homogenea,

unifase, sin particulas

extrañas

5,7 1,031 16,61% 53,46%

7 FC3 G3-12 Africa Ácido poco viscoso,

consistencia firme

pelicula homogenea,

unifase, sin particulas

extrañas

5,9 1,012 20,62% 64,74%

8 FC4 G3-12 Africa Dulce poco viscoso,

consistencia firme

pelicula homogenea,

unifase, sin particulas

extrañas

5,9 1,05 18,75% 62,50%

9 FC5 G3-12 Africa Dulce poco viscoso,

consistencia firme

pelicula homogenea,

unifase, sin particulas

extrañas

5,9 1,052 20,80% 68,81%

10 FC6 G3-12 Africa Dulce viscoso, apariencia

acaramelada

pelicula homogenea,

unifase, con pequeños

sólidos suspendidos

5,7 1,016 19,30% 62,04%

11 FC7 H2-13 Golden Dulce viscoso, apariencia

acaramelada

pelicula homogenea,

unifase, con pequeños

sólidos suspendidos

5,8 0,9711 17,74% 71,49%

12 FC8 H2-13 Golden Dulce poco viscoso,

consistencia firme

pelicula homogenea,

unifase, con pequeños

sólidos suspendidos

5,7 0,9819 18,04% 67,55%

13 FC9 H2-12

Tecojote Dulce

viscoso, apariencia

acaramelada

pelicula homogenea,

unifase, con pequeños

sólidos suspendidos

6,0 0,9375 10,38% 63.0 %

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09. R (rizoma), F (fronda)

Pruebas Fitoquímicas realizadas a los extractos de P. pseudoaureum

En la tabla 5 se observan las pruebas macrométricas para los extractos mediante ensayos

de coloración, precipitación, formación de espuma, cambios de color o presencia de

fluorescencia.

Tabla 5.

Pruebas macrométricas de precipitación y/o coloración en tubo Muestra Antraquinonas Cumarinas Flavonoides Saponinas Taninos

Control

Presencia de color

rojo- rosado en fase

alcalina

Fluorescencia

azul,verde o

amarilla en UV 365

Cambio de

coloración o

precipitado

Presencia de

espuma después

de media hora

Precipitado con

gelatina y gelatina-

sal

RC1 Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo

RC2 Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo

RC3 Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo

RC4 Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo

FC1 Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo

FC2 Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo

FC3 Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo

FC4 Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo

FC5 Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo

FC6 Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo

FC7 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo

FC8 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo

FC9 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

39

En la tabla 6 y 7 se observan los resultados obtenidos por cromatografía en capa fina

(CCF) para antraquinonas, cumarinas, flavonoides y saponinas para rizoma y fronda.

Tabla 6.

Caracterización Fitoquímica por CCF de los Extractos de Rizoma

Muestra Antraquinonas Cumarinas Flavonoides Saponinas

Condiciones

Fase Móvil: Acetato de etilo-

metanol-agua (100:17:13)

Fase Móvil: tolueno –

acetato de etilo

Fase Móvil: Acetato de

etilo – ác. fórmico – ác.

acético- agua

Fase Móvil n-butanol-

ác. acético-agua

Revelador Revelador: Revelador: Revelador

KOH 5% etanólico KOH 5% etanólico NP/PEG Vainillina-Ac.Sulfúrico

Muestra ideal

zonas rojas en visible y

fluorescencia roja en UV 365

nm. Antronas y antranolas

zonas amarilla en visible y

fluorescencia amarilla en UV a

365nm

Flourescencia azul o

verde en UV a 365nm

Flourescencia intensa en

UV 365nm.Manchas

amarillas a verdes en

visible.

Zonas azules, violetas y

amarillentas en visible

Estándares

Extracto de Sen Umbeliferona Rutina

Estándar de

Saponinas al 1%

0.15 amarillo 0.09 celeste 0.15 amarillo 0.16 amarillo

0.44 amarillo Ác. p - cumárico Ácido clorogénico 0.78 violeta

0.66 rojo 0.12 celeste 0.37 verde 0.86 violeta

0.73 rojo Cumarina Hiperósido

0.84 amarillo 0.45 verde 0.50 amarillo

0.90 verde Quercetina

0.69 amarillo

RC1

0.40 celeste

0.38 verde

0.13 amarillo

0.63 amarillo 0.34 verde 0.36 y 0.48 rojo,

0.78 rojo 0.46 amarillo

0.85 amarillo 0.57 amarillo 0.57 amarillo

0.79 amarillo 0.64 amarillo

0.87 celeste 0.78 rojo

0.93 amarillo

RC2 0.47 amarillo 0.45 verde

0.36 verde

0.58 verde 0.15 amarillo-verde

0.69 verde 0.42 amarillo

0.79 celeste 0.76 rojo

0.91 celeste

RC3

0.44 amarillo

0.38 verde

0.34 verde

0.85 morado 0.78 celeste

0.84 celeste

0.15 amarillo-verde

0.42 café

0.52 café, 0.78 rojo

RC4 0.84 morado 0.38 verde

0.34 verde 0.15 amarillo-verde

0.78 celeste 0.40 rojo

0.75 rojo

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

40

Tabla 7.

Caracterización Fitoquímica por CCF de los Extractos de Fronda

Muestra Antraquinonas Cumarinas Flavonoides Saponinas

Muestra

ideal

zonas rojas en visible y fluorescencia

roja en UV 365 nm. Antronas y

antranolas zonas amarilla en visible y

fluorescencia amarilla en UV a 365

Flourescencia azul o

verde en UV a

365nm

Flourescencia intensa en

UV 365nm.Manchas

amarillas, naranjas y verdes

en visible.

Zonas azules, violetas y

amarillentas en visible

Estándares

Extracto de Sen Umbeliferona Rutina

Estándar de

Saponinas al 1%

0.15 amarillo 0.09 celeste 0.15 amarillo 0.16 amarillo

0.44 amarillo Ác. p - cumárico Ácido clorogénico 0.78 violeta

0.66 rojo 0.12 celeste 0.37 verde 0.86 violeta

0.73 rojo Cumarina Hiperósido

0.84 amarillo 0.45 verde 0.50 amarillo

0.90 verde Quercetina

0.69 amarillo

FC1

0.38 celeste

No se detectaron

0.15 amarillo 0.50 rojo

0.70 rojo 0.34 verde 0.71 amarillo

0.78 rojo 0.46, 0.57, 0.66 amarillo 0.86 violeta

0.90 rojo 0.78, 0.87 celeste

FC2

0.40 celeste

0.41 verde

0.15 amarillo

0.71 celeste 0.36 verde 0.50 rojo

0.84 amarillo 0.46, 0.57, 0.66 amarillo 0.60, 0.73 amarillo

0.79 verde 0.89 violeta

0.88 celeste

FC3

0.41 celeste

No se detectaron

0.15 amarillo

0.76 rojo 0.36 verde 0.50 rojo

0.87 amarillo

0.46, 0.58, 0.67. 0.84

amarillo 0.73 amarillo

0.88 celeste

FC4 0.41 celeste

No se detectaron 0.15, 0.48, 0.60 amarillo

0.73 amarillo 0.79 rojo 0.78 celeste

FC5

0.41 celeste

No se detectaron

0.15 amarillo

0.78 rojo 0.37 verde 0.49 rojo

0.87 rojo

0.49, 0.60, 0.72, 0.81

amarillo 0.73 amarillo

0.88 celeste 0.87 violeta

FC6

0.41 celeste

No se detectaron

0.15 amarillo

0.66 amarillo 0.37 verde 0.50 rojo

0.78 rojo

0.87 amarillo

0.48, 0.60, 0.70, 0.81

amarillo

0.87 celeste

0.63, 0.73 amarillo

0.89 violeta

FC7

0.77 amarillo No se detectaron 0.29 amarillo 0.15 violeta

0.88 roja 0.50 naranja 0.66 violeta

0.60 azul 0.76 violeta azulado

0.76 naranja

41

FC8

0.74 amarillo No se detectaron 0.28 amarillo 0.15 violeta azulado

0.84 roja 0.49 naranja 0.47 violeta

0.59 azul 0.67 violeta

0.75 naranja 0.80 violeta azulado

FC9

0.71 amarillo 0.31 amarillo 0.28 amarillo 0.15 violeta

0.85 roja 0.5 naranaja 0.57 violeta

0.59 azul 0.63 violeta

0.75 naranja 0.76 violeta azulado

0.81 amarillo

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

En la tabla 8 se muestran los resultados de las pruebas microbiológicas en los extractos

de rizoma y fronda.

Tabla 8.

Pruebas Microbiológicas realizadas a los extractos de P. pseudoaureum

Extracto

Recuento total de

mohos y

levaduras. Agar

Saboraud

Recuento total

de mesófilos

aeróbicos.

Agar PCA

Ausencia de

S. aureus.

Agar

Manitol-Sal

Ausencia de

E. coli. Agar

MacConkey

Ausencia de

P aeruginosa.

Agar

Cetrimida

Muestra ideal

para cosmética ≤ 100 UFC/ml

≤ 1000

UFC/ml Ausente Ausente Ausente

RC1 Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

RC2 Cumple MNPC 1:10 MNPC 1:10 Cumple Cumple

RC3 Cumple MNPC 1:10 MNPC 1:10 Cumple Cumple

RC4 Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

FC1 Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

FC2 Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

FC3 Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

FC5 Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

FC6 Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

FC7 Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

FC8 Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

FC9 Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Control

ambiental O UFC/ml O UFC/ml O UFC/ml O UFC/ml O UFC/ml

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

MNPC: ―Muy Numeroso Para Contar‖ y es equivalente a un dictamen de ―No Cumple‖.

Objetivo: Determinar el espectro de absorción de los extractos de P. pseudoaureum

para evaluar el potencial como factor de protección solar.

Se realizó un barrido (150-700 nm) para determinar la longitud de onda máxima

de los extractos utilizando un espectrofotómetro Agilent 8453. También se determinó el

espectro de absorción UV de la mayoría de los extractos adicionando octil-

metoxicinamato (Parsol), como patrón de comparación de pantalla solar. Esta

determinación se realizó entre 250 y 400 nm.

Se prepararon mezclas de OMC (Parsol) a 5ppm con extracto etanólico de

rizoma y fronda de P. pseudoaureum a 5, 50 y 100 ppm.

42

El factor de protección solar de los extractos elaborados, se obtuvo aplicando la

fórmula y constantes teóricas proporcionadas por la Asociación Europea de Cosmética

–COLIPA- en 2009; en el cual se describe el método validado para la determinación del

factor de protección solar de productos elaborados para este fin.

En donde:

E: Erythema action spectrum ó acción eritematosa según el espectro. Dato

proporcionado por el apéndice I del documento antes mencionado.

I: Spectral Irradiance of the UV source ó Radiacción espectral de la

lámpara UV. Dato proporcionado por el apéndice II del documento.

Aoλ: Monocromatic absorbance measurements per plate of the test product

befote UV exposure.ó medida de la absorbancia monocromática por plato

de la muestra que no ha sido expuesta a radiación UV. Datos resumidos

en la tabla No. 2 que es lo que varía de una muestra a otra..

dλ: Wavelength step (1nm) o medida de la longitud de onda 1 nanómetro.

43

Tabla 9.

Longitud de onda de máxima absorbancia de extractos secos y con 5ppm de Octilmetoxicinamato.

5 ppm 50 ppm 100 ppm 5ppm +

Octilmetoxicinamato 50 ppm +

Octilmetoxicinamato 100 ppm +

Octilmetoxicinamato

Código Descripción λ Máxima

absorbancia λ

Máxima absorbancia

λ Máxima

absorbancia λ

Máxima absorbancia

λ Máxima

absorbancia λ

Máxima absorbancia

FC1 Extracto Fronda

Calahuala 283 0.058088 283 0.20458 283 0.45002 311 0.40381 312 0.54677 312 0.7604

FC2 Fronda Calahuala segunda colecta

281 0.01669 282 0.21665 282 0.44253 312 0.39626 312 0.96411 285 0.65266

FC3 Fronda Calahuala en

etanol en 70% 280 0.024657 280 0.27843 280 0.56179 311 0.74005 311 0.86295 311 1.2531

FC4 Fronda Calahuala en

etanol 50% 278 0.042878 279 0.369390 279 0.712730 312 0.447697 311 0.668707 282 0.939570

FC5 Fronda Calahuala

etanol al 50% 282 0.031834 282 0.2979 282 0.59572 311 0.48892 312 0.61114 284 0.86623

FC6 Fronda Calahuala

etanol al 70% 279 0.027620 278 0.279420 279 0.550293 312 0.437147 312 0.584097 283 0.784943

FC7 Fronda Calahuala

etanol al 70% 279 0.032792 278 0.306243 277 1.203467 312 0.452423 312 0.594763 285 0.794710

FC8 Fronda Calahuala

etanol al 70% 278 0.034970 278 0.271637 278 0.538330 312 0.477363 312 0.676197 285 0.786790

FC9 Fronda Calahuala

etanol al 70% 280 0.031093 280 0.285750 280 0.564433 312 0.483517 312 0.586803 285 0.805993

RC1 Extracto Fluido de Calahuala Rizoma

282 0.026941 282 0.24774 282 0.47201 312 0.52259 312 0.64666 312 0.70862

RC2 Extracto Rizoma

Calahuala segunda colecta

439 0.010582 281 0.038081 282 0.099432 311 0.48694 311 0.51749 311 0.56158

RC3 Extracto Rizoma en

etanol al 50% 399 0.010108 274 0.019365 275 0.049735 311 0.45852 311 0.46844 311 0.4807

RC4 Extracto Rizoma en

etanol al 70% 406 0.010766 276 0.033236 276 0.032526 311 0.56147 311 0.54416 311 0.34405

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

44

Espectro de Absorción Extracto Etanólico FC6

-1,00E-01

0,00E+00

1,00E-01

2,00E-01

3,00E-01

4,00E-01

5,00E-01

6,00E-01

7,00E-01

8,00E-01

290

294

298

302

306

310

314

318

322

326

330

334

338

342

346

350

354

358

362

366

370

374

378

382

386

390

394

398

longitud de onda nm

Ab

so

rban

cia

5ppm

50ppm

100ppm

5ppm/OMC

50ppm/OMC

100ppm/OMC

OMC 5ppm

Gráfica 1.

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09 en Espectrofotómetro Agilent 8453

En este gráfico se observa de mejor manera el efecto sinérgico que poseen los

extractos de fronda y rizoma de P. pseudoaureum al asociarse con el agente

antisolar octilmetoxicinamato. Muestran un espectro de absorción ultravioleta

cercano a la longitud de onda de máximo efecto eritematoso (308nm) y absorben

más energía asociados que separados.

Tabla 10.

Factor de protección solar de los extractos elaborados.

5 ppm 50 ppm 100 ppm 5ppm + Parsol 50 ppm + Parsol 100 ppm + Parsol

Código Descripción FPS FPS FPS FPS FPS FPS

FC1

Extracto

Fronda

Calahuala

No. 2 0.99 1.29 1.85 2.22 3.04 4.76

FC2

Fronda

Calahuala

segunda

colecta 1.00 1.28 1.70 2.17 6.31 3.61

FC3

Fronda

Calahuala

en etanol en

70% 1.02 1.29 1.69 4.11 5.37 10.75

45

FC4

Fronda

Calahuala

en etanol

50% 1.05 1.47 2.10 2.44 4.17 4.73

FC5

Fronda

Calahuala

etanol al

50% 1.04 1.41 1.99 2.65 3.49 4.77

FC6

Fronda

Calahuala

etanol al

70% 1.04 1.43 2.04 2.39 3.40 4.83

FC7

Fronda

Calahuala

etanol al

70% 1.05 1.47 4.88 2.46 3.40 5.00

FC8

Fronda

Calahuala

etanol al

70% 1.05 1.44 2.09 2.59 3.68 5.12

FC9

Fronda

Calahuala

etanol al

70% 1.05 1.45 2.10 2.62 3.35 4.88

RC1

Extracto

Fluido de

Calahuala

Rizoma 1.03 1.38 1.81 2.81 3.69 4.27

RC2

Extracto

Rizoma

Calahuala

segunda

colecta 0.97 0.97 0.98 0.98 0.98 0.98

RC3

Extracto

Rizoma en

etanol al

50% 0.98 0.99 0.99 1.00 1.01 0.98

RC4

Extracto

Rizoma en

etanol al

70% 0.97 0.96 0.97 0.98 0.98 0.98

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

Como puede observarse en la tabla anterior, a 5ppm el factor de protección solar es

bastante similar entre los diferentes extractos y se encuentra alrededor de uno. Al

aumentar diez veces esta concentración el factor de protección solar no aumenta

proporcionalmente; sin embargo si se observa un aumento en el caso de las frondas. En

el caso de las frondas el extracto que obtuvo el mayor factor de protección solar es el

FC7 y el extracto RC1 en el caso de los rizomas.

46

Al adicionar 5ppm de octilmetoxicinamato (OMC), el factor de protección solar

aumenta en todos los casos; lo cual afirma el efecto sinérgico en cuanto a capacidad de

absorción que ofrece la asociación de estas sustancias.

Objetivo: Identificar y cuantificar los flavonoides totales mediante espectrofotometría

UV/VIS de los extractos de P. pseudoaureum.

En las tablas que describen los resultados obtenidos en la caracterización

fotoquímica de los extractos por cromatografía de capa fina se identificó la presencia de

flavonoides en todos los extractos analizados.

En la siguiente tabla se incluyen los resultados obtenidos para la cuantificación

espectrofotométrica de flavonoides totales, según la metodología descrita por las

Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos, (2001).

Tabla 11.

Cuantificación del porcentaje de flavonoides totales como Rutina

Extractos Promedio Desviación estándar % de flavonoides

FC1 0,5295 0,0457 0,5295 ± 0,0457

FC2 0,6789 0,0646 0,6789 ± 0,0646

FC3 0,7200 0,0296 0,7200 ± 0,0296

FC4 0,6529 0,0432 0,6529 ± 0,0432

FC5 0,6815 0,0571 0,6815 ± 0,0571

FC6 1,3877 0,0322 1,3877 ± 0,0322

FC7 1,5694 0,1119 1,5694 ± 0,1119

FC8 1,4434 0,0248 1,4434 ± 0,0248

FC9 1,0244 0,0039 1,0244 ± 0,0039

RC1 0,6585 0,0885 0,6585 ± 0,0885

RC2 0,1413 ND 0,1413

RC3 0,0404 ND 0,0404

RC4 0,0605 ND 0,0605

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

La metodología empleada permite identificar la presencia de flavonoides por la

absorbancia que presenta a 394 nanómetros. Como se aprecia en la tabla anterior, todos

los extractos de fronda preparados con etanol al 70% presentan las mayores cantidades

de flavonoides. En el caso de los rizomas, no fue posible calcular la desviación estándar

de la muestra analizada pues en la mayoría de los análisis realizados la cantidad de

flavonoides fue tan pequeña que fue indetectable en el espectrofotómetro Agilent 8453.

Se realizó la cuantificación espectrofotométrica de sapogeninas utilizando el

método descrito por Baccou, J. ya que son metabolitos característicos de la especie los

cuales se pueden establecer como marcadores en los extractos para el control de calidad.

47

Tabla 12.

Porcentaje de sapogeninas esteroidales en los extractos de fronda y rizoma de P.

pseudoaureum

EX

TR

AC

TO

% D

IOS

GE

NIN

A

%C

OL

ES

TE

RO

L

%S

TIG

MA

ST

ER

OL

%β

-SIT

OS

TE

RO

L

PR

OM

ED

IO

SA

PO

NIN

AS

ES

TE

RO

IDA

LE

S

DE

SV

IAC

IÓN

SA

PO

NIN

AS

ES

TE

RO

IDA

LE

S

PR

OM

ED

IO

GE

NE

RA

L

RC1 0,16 4,49 11,38 9,35 8,41 3,54 6,35

RC2 0,06 1,7 4,69 3,77 3,39 1,53 2,56

RC3 0,07 1,83 5,02 4,04 3,63 1,63 2,74

FC1 0,18 5,02 12,69 10,43 9,38 3,94 7,08

FC2 0,16 4,54 11,53 9,47 8,51 3,59 6,43

FC3 0,19 5,35 13,48 11,09 9,97 4,18 7,53

FC4 0,10 2,89 7,55 6,16 5,53 2,39 4,18

FC6 0,03 0,77 2,49 1,93 1,73 0,88 1,31

FC7 0,09 2,55 6,74 5,48 4,92 2,15 3,72

FC8 0,06 1,52 4,33 3,46 3,10 1,44 2,34

FC9 0,07 1,72 4,72 3,8 3,41 1,54 2,58

La estandarización del método exigió la realización de varias modificaciones y

cuidados durante su realización. Los resultados de los promedios de las determinaciones

que se incluyen en la tabla anterior permiten establecer que las concentraciones de

saponinas esteroidales en los extractos elaborados no dependen de la concentración de

etanol utilizado.

También se observa que el porcentaje de saponinas esteroidales si se ve afectada

por el estándar de comparación utilizado; siendo más abundantes al utilizar stigmasterol

y β-sitosterol; probablemente porque las saponinas presentes en los extractos poseen

estructuras similares a estas moléculas.

La diosgenina no se comportó como un patrón de comparación confiable para

esta especie; pues en un estudio realizado por García en el año 2008, para la misma

especie, utilizando diosgenina para cuantificar el porcentaje de sapogeninas

esteroidales, se obtuvo porcentajes igualmente bajos, en el orden de 0.1531 ± 0.0050 en

fronda y de 0.0999 ± 0.010 en rizoma.

Objetivo : Elaborar un producto fitocosmético a partir de extractos de P. pseudoaureum

y establecer los parámetros de calidad.

Se formularon dos preparaciones cosméticas, utilizando extractos del fronda en etanol al

70%; un gel y una crema O/W.

El gel está compuesto por Carbopol 940 (2%), trietanolamina (2%), propilenglicol

(2%), polisorbato 20 (3%), metilcloroisotiazolinona/metilisotiazolinona (0.06%), aroma

frutal (0.50%) y agua.

48

CREMA DE CALAHUALA

Formulación

Filtrar el extracto de calahuala y pesar

Pesar el resto de materias primas.

PARTE A

%

PRUEBA 3

Carbopol 940 0.75 g

Trietanolamina 0.75 g

Polisorbato 20 1.13 g

Extracto de calahuala 3 g

Agua, csp 25 g

Medir la mitad del agua desmineralizada en el beaker, agregar la trietanolamina

y mezclar con una espátula de acero inoxidable, luego agregar poco a poco el

carbopol 940 y mezclar nuevamente con la espátula, cuidando de que no quede

nada de carbopol adherido a la misma. Sellar la mezcla con el agua

desmineralizada restante, dejar que se hidrate durante toda la noche.

Al día siguiente mezclar con agitación constante hasta disolver todo el carbopol

y que quede un gel transparente. Revisar que no tenga grumos.

Incorporar el polisorbato 20 y mezclar bien

Cuando el gel esté completamente traslúcido, agregar el extracto de calahuala.

Verificar que el peso final es de 25 g.

PARTE B

PRUEBA 3

Alcohol cetílico 2.5 g

Monoestearato de Glicerilo 2.5 g

Vaselina sólida 4 g

Vaselina líquida 12 g

Aceite de jojoba 11 g

Trietanolamina 2 g

Gel de calahuala 25 g

Glicerina 2g

Metilcloroisotiazolinona/ metilisotiazolinona (preservante) 0.06 g

Aroma 0.50 g

Agua desmineralizada, csp 100 g (aprox. 61 g)

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

Fase Oleosa:

Fundir y mezclar juntos: vaselina sólida, vaselina líquida, aceite de jojoba, alcohol

cetílico y ácido esteárico.

49

Fase Acuosa:

Calentar el agua hasta alcanzar aproximadamente 90ºC

Quitar de la fuente de calor y agregar trietanolamina y glicerina. Mezclar hasta

obtener una solución clara

Preparación de la Crema:

Mezclar la fase oleosa con la fase acuosa, moviendo constantemente hasta obtener

una crema.

Entonces, medir la temperatura. Si alcanzó aproximadamente 60ºC, agregar el gel de

la Parte A y mezclar vigorosamente hasta que se incorpore perfectamente.

Agregar preservante y aroma y mezclar bien.

Verificar que el peso final sea de 100 g (de lo contrario complete con agua a 80ºC).

Medir pH.

Los parámetros fisicoquímicos y organolépticos de estas pruebas de aroma se

incluyen en la siguiente tabla.

Tabla 13.

Resultados fisicoquímicos de las pruebas realizadas durante la selección y ensayo

de las formulaciones finales.

Formulación

Extracto

utilizado Aroma utilizado pH Color Comentarios

Gel formulación 4 FC6 Tropical Cocunut 5,48 Taxco G3-10 Turbio

Gel formulación 4 RC4 Tropical Cocunut 5,56 Pergamino G4-06 Turbio

Gel formulación 4

utilizando motor

unipropela en

fabricación. FC6 Tropical Cocunut 5,43 Muégano H3-10 Turbio

Gel formulación 4 FC6 Frutas Mixtas 5,46 Muégano H3-10 Claro y brillante

Gel formulación 4 FC6 Chocolate 5,45 Australia H3-11 Turbio

Gel formulación 4 RC4 Mandarina 5,49 Maritza H2-01 Turbio

Gel formulación 4 RC4 Air Fresh 5,48 Zacate H2-02 Claro y brillante

Gel formulación 4 RC4 OATS 5,55 Maritza H2-01 Claro y brillante

Crema formulación 1 FC6 Frutas Mixtas 7,82 Bejuco G3-07 Se utilizo ácido esteárico

Crema formulación 2

con monoesterato de

glicerilo. FC6 Tropical Cocunut 7,78 Palma G3-06 Turbio

Crema formulación 2

con monoesterato de

glicerilo. RC4 Cardamomo 8,23 Zacate H2-02

Se utilizó mono estearato de

glicerilo

Crema formulación 2

con monoesterato de

glicerilo. FC6 Frutas Mixtas 8,23 Palma G3-06

Se utilizó mono estearato de

glicerilo

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

A continuación se incluyen los resultados obtenidos de los muestreos realizados

en los tiempos establecidos por el reglamento técnico centroamericano para estudios de

estabilidad. En el anexo No. 2 se pueden observar las imágenes que aseguran la validez

de los resultados del control de calidad microbiológico realizado a los 30 y 90 días.

50

Tabla 14.

Resultados de los parámetros organolépticos y fisicoquímicos de los lotes piloto sometidos al estudio de estabilidad

Color pH

Lote

Piloto

Extracto

utilizado Color inicial Color 15 días Color 30 días Color 90 días

pH

inicial

pH 15

días

pH 30

días

pH 90

días Desviación

Gel 1% FC6 Bacalao H2-06 Mango H1-10 Travesura H1-14 Manzanilla I1-06 5.56 5.75 6.26 5.92 0.3

Gel 2% FC6

Chabacano H2-

09 Mango H1-10 Jarabe H1-13 Catalán I1-10 5.59 5.68 6.08 5.76 0.2

Gel 3% FC6 Olmeca H2-14

Tejocote H2-

12

Noviembre H1-

12

Costa del Sol I1-

13 5.54 5.71 6.04 5.68 0.2

Gel 4% FC6 Tejocote H2-13 Africa G3-12

Noviembre H1-

12 Ambar I2-09 5.76 5.64 6.07 5.63 0.2

Gel 5% FC6 Tejocote H2-13 Africa G3-12 Magna G2-12 Azabache I2-13 5.45 5.59 5.78 5.60 0.1

Crema

1% FC6 Escorpion G3-03

Cantona H3-

03 Limo G4-05 Flan I3-03 8.47 8.28 8.37 8.35 0.1

Crema

2% FC6 Palma G3-06

Cantona H3-

03 Canoa G4-08 Colindres I4-03 8.39 8.19 8.06 8.19 0.1

Crema

3% FC6 Palma G3-06 Canela H3-06 Alabastro H4-08 Buñuelo I3-06 8.39 8.04 7.92 8.10 0.2

Crema

4% FC6 Hermes G3-09

Incienso H3-

09 Canela H3-06 Buñuelo I3-06 8.29 8.02 7.84 7.95 0.2

Crema

5% FC6 Hermes G3-09

Incienso H3-

09 Camello H4-11 Buñuelo I3-06 8.20 7.90 7.74 7.87 0.2

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

Lo más evidente son los cambios de color, todas las preparaciones se han obscurecido levemente al ser sometidas a 40 ± 2ºC y

75±5% de humedad relativa. Sin embargo los geles han conservado sus características iniciales de transparencia en concentraciones de

1-3%. En el caso de las cremas las que poseen extracto al 4 y 5% han perdido fluidez y se muestran más pastosas. Es por ello que se

ha establecido que la concentración de extracto de Calahuala al 3% es la idónea para elaborar la preparación cosmética final.

La desviación del valor inicial del pH es pequeña en la mayoría de los lotes piloto analizados, por lo que puede concluirse que

permanecen estables después de 90 días en estudio.

51

También se incluyen a continuación los resultados del control de calidad

microbiológico de los diez lotes piloto después de 90 días en estudio. En este caso los

resultados se mantienen constantes pues se observa que cumplen con los parámetros de

calidad microbiológica establecidos para cosméticos por el reglamento técnico

centroamericano.

Según Genaro, 2003, los geles son preparaciones semisólidas que tienen

apariencia clara y brillante. Al observar los resultados de la tabla anterior se observa que

solamente tres aromas son compatibles con la formulación ensayada. Estas

formulaciones ya incluyen un nuevo sistema de preservantes (metilcloroisotiazolinona

/metilisotiazolinona); pues las pruebas preliminares con parabenos mostraron indicios de

contaminación microbiana, después de una semana.

Las preparaciones con los aromas más aceptados, según panel sensorial integrado

por diez personas no entrenadas, se sometieron a las pruebas microbiológicas

establecidas por el reglamento técnico centroamericano para productos cosméticos y los

resultados obtenidos se incluyen a continuación.

Tabla 15.

Resultados microbiológicos del gel formulación 4 con aromas seleccionados por

panel organoléptico

Formulación

Recuento total

de mohos y

levaduras. Agar

Saboraud

Recuento total

de mesófilos

aeróbicos. Agar

PCA

Ausencia de

S. aureus

Agar

Manitol-Sal

Ausencia de

E. coli

Agar

MacConkey

Ausencia de

P aeruginosa

Agar

Cetrimida

Observaciones.

Fragancia

ideal ≤ 100 UFC/ml

≤ 1000

UFC/ml Ausente Ausente Ausente

Frutas

Mixtas Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Chocolate Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Tropical

Coconut Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

OATS

Muy numeroso

para contar.

Muy numeroso

para contar.

Cumple Cumple

Muy

numeroso

para contar.

Las colonias presentes

en cetrimida no eran

características de P.

aeruginosa. No cumple No cumple No cumple

Air Fresh Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Mandarina Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Control

ambiental 0 UFC/ml 0 UFC/ml 0 UFC/ml 0 UFC/ml 0 UFC/ml

Esto valida los

resultados obtenidos

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

De las preparaciones analizadas, únicamente el aroma OATS, no cumple con los

parámetros de calidad microbiológica necesarios para someter la formulación al estudio

de estabilidad acelerada.

Se seleccionó la fragancia de Frutas Mixtas, en el caso del gel, pues la

composición química de este ingrediente no afecta la estabilidad fisicoquímica de la

52

formulación desarrollada, tuvo mayor aceptación en el panel sensorial y cumple con los

parámetros de calidad microbiológica establecidos por la reglamentación vigente.

También se determinó la calidad microbiológica de las cremas, cuya formulación

incluye el nuevo sistema de preservantes y poseen los aromas más aceptados por el panel

sensorial.

Tabla 16.

Resultados microbiológicos de crema formulación 2 con diferentes aromas

Formulación

Recuento total

de mohos y

levaduras

Agar Saboraud

Recuento total

de mesófilos

aeróbicos

Agar PCA

Ausencia de S.

aureus

Agar Manitol-

Sal

Ausencia de E.

coli.

Agar

MacConkey

Ausencia de P

aeruginosa

Agar Cetrimida

Observaciones

Fragancia ideal ≤ 100 UFC/ml ≤ 1000 UFC/ml Ausente Ausente Ausente

Frutas Mixtas Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Cardamomo Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Control

ambiental 0 UFC/ml 0 UFC/ml 0 UFC/ml 0 UFC/ml 0 UFC/ml

Esto valida los

resultados

obtenidos

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

Ambos aromas cumplen con los parámetros de calidad establecidos, pero

nuevamente el de Frutas Mixtas fue el que tuvo mayor aceptación.

Además, estas pruebas microbiológicas en las formulaciones preliminares,

permitieron establecer las condiciones de muestreo, la necesidad de utilizar campana de

flujo laminar vertical y validar la metodología a utilizar para establecer estos parámetros

durante el estudio de estabilidad.

Después de realizar todas estas pruebas en escalas pequeñas, y analizar los

resultados obtenidos de las pruebas organolépticas, fisicoquímicas y microbiológicas, se

estableció la formulación de dos productos fitocosméticos que fueron sometidos al

estudio de estabilidad acelerada.

La composición cuali-cuantitativa del gel es Carbopol 940 (2%), trietanolamina

(2%), propilenglicol (2%), polisorbato 20 (3%), metilcloroisotiazolinona/

metilisotiazolinona (0.06%), aroma frutal (0.50%) y agua. El extracto filtrado de fronda

de Calahuala se incorporó en concentraciones de 1%, 2%, 3%, 4% y 5%.

La crema se formuló como una emulsión O/W cuya composición cuali-

cuantitativa es una fase acuosa que contiene Carbopol 940 (0.75%), trietanolamina

(0.75%), polisorbato 20(1.13%), extracto de fronda filtrado de calahuala en

concentraciones al (1%, 2%, 3%, 4% y 5%); una fase oleosa compuesta por vaselina

sólida (4%), vaselina líquida (12%), aceite de jojoba (11%), alcohol cetílico (2.5%);

trietanolamina (2%) y monoestearato de glicerilo (1.25%) como agentes emulsionantes;

metilcloroisotiazolinona/metilisotiazolinona (0.06%) como preservante y aroma frutal

(0.50%).

Se elaboraron los diez lotes piloto de estas formulaciones y se sometieron a las

pruebas organolépticas, fisicoquímicas y microbiológicas para establecer sus parámetros

de calidad. A continuación se incluyen los resultados obtenidos al finalizar la fabricación

de los mismos y se espera que no exista gran variación en los parámetros organolépticos,

fisicoquímicos y microbiológicos, después de ser sometidos al estudio de estabilidad

acelerada.

53

Tabla 17.

Características organolépticas y fisicoquímicas de los lotes piloto después de la

fabricación

Extracto utilizado Aroma utilizado pH Color Apariencia

Gel 1% FC6 Frutas Mixtas 5,6 Bacalao H2-06 Traslucido

Gel 2% FC6 Frutas Mixtas 5,6 Mango H2-09 Traslucido

Gel 3% FC6 Frutas Mixtas 5,5 Olmeca H2-14 Traslucido

Gel 4% FC6 Frutas Mixtas 5,8 Tejocote H2-13 Opaco

Gel 5% FC6 Frutas Mixtas 5,5 Tejocote H2-13 Opaco

Crema 1% FC6 Frutas Mixtas 8,5 Escorpion G3-03 Homogénea

Crema 2% FC6 Frutas Mixtas 8,4 Palma G3-06 Homogénea

Crema 3% FC6 Frutas Mixtas 8,4 Palma G3-06 Homogénea

Crema 4% FC6 Frutas Mixtas 8,3 Hermes G3-09 Homogénea

Crema 5% FC6 Frutas Mixtas 8,3 Hermes G3-09 Homogénea

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

Tabla 18.

Características microbiológicas de los lotes piloto después de la fabricación

Tiempo Cero

Formulación RT Mohos RT Bacterias Ausencia de S.

aureus Ausencia de E. coli

Ausencia de P

aeruginosa

Formulación ideal ≤ 100 UFC/ml ≤ 1000 UFC/ml Ausente Ausente Ausente

Gel 1% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Gel 2% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Gel 3% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Gel 4% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Gel 5% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Crema 1% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Crema 2% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Crema 3% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Crema 4% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Crema 5% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Control ambiental 0 UFC/ml 0 UFC/ml 0 UFC/ml 0 UFC/ml 0 UFC/ml

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

54

Tabla 19.

Comportamiento organoléptico de los lotes piloto sometidos al estudio de

estabilidad

Fuente: Datos experimentales FODECYT 16-09, según taco de color Comex.

Tabla 20.

Comportamiento fisicoquímico de los lotes piloto sometidos al estudio de estabilidad Formul

ación

Tiempo

0

T 15

días

T 30

días

T 90

días

T 180

días

Anaquel

9 meses

Promed

io

Desviación

Estándar

Gel 1% 5,6 5,8 6,3 5,9 5,8 6,2 5,9 0,2

Gel 2% 5,6 5,7 6,1 5,8 5,4 6,1 5,7 0,3

Gel 3% 5,5 5,7 6,0 5,7 5,4 6,1 5,6 0,3

Gel 4% 5,8 5,6 6,1 5,6 5,2 5,7 5,5 0,3

Gel 5% 5,5 5,6 5,8 5,6 5,4 5,6 5,5 0,2

Crema

1% 8,5 8,3 8,4 8,4 8,2 8,3 8,3 0,1

Crema

2% 8,4 8,2 8,1 8,2 7,9 8,2 8,1 0,2

Crema

3% 8,4 8,0 7,9 8,1 7,9 8,0 8,0 0,2

Crema

4% 8,3 8,0 7,8 8,0 7,3 7,9 7,7 0,4

Crema

5% 8,2 7,9 7,7 7,9 7,5 7,9 7,8 0,2

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

La desviación estándar de los valores de pH es pequeña en la mayoría de los lotes

piloto analizados, por lo que puede concluirse que permanecen estables después de 180

días a condiciones extremas.

Los geles formulados presentan valores de pH afines al pH normal de la piel,

(4.5-6.5) (Rieger, 2000); a lo largo del estudio de estabilidad; por lo que se propuso esta

formulación como la más promisoria para elaborar un cosmético antisolar que incluyó

extractos etanólicos de fronda de Calahuala en concentraciones del 1-3%.

55

Se observó claramente que las formulaciones en estudio cumplieron con los

parámetros de calidad microbiológica establecidos para cosméticos por el reglamento

técnico centroamericano vigente y por tanto también con los parámetros establecidos por

la farmacopea británica para preparados a base de plantas y extractos vegetales.

También se comprobó que el sistema de preservantes utilizado fue efectivo en su

función de impedir la contaminación microbiológica y que el envase utilizado cumplió

efectivamente su función de barrera y resguardo de la preparación cosmética (Genaro,

2003).

Considerando que las formulaciones analizadas presentaron estabilidad

organoléptica, fisicoquímica y microbiológica, se realizaron las pruebas preliminares

para incorporar el octilmetoxicinamato a diferentes concentraciones (2, 4, 5, y 7.5%) y se

seleccionó la más adecuada. Según Rieger, 2000, este agente antisolar puede utilizarse

en una concentración máxima de 7.5% en Estados Unidos y hasta el 10% en la

comunidad económica europea, por ello se incorporó a la formulación de crema y gel

con extracto al 3%, en concentraciones inferiores al 7.5%. A continuación se incluyen las

tablas de resultados de éstas formulaciones de prueba.

Tabla 21.

Pruebas organolépticas y fisicoquímicas del gel y crema con extracto al 3% y OMC

Color pH Apariencia

Gel con extracto al 3% y OMC al 2% Gargola GI-07 5,6 Traslúcida

Gel con extracto al 3% y OMC al 4% Calcuta GI-03 5,6 Ligeramente opaca

Gel con extracto al 3% y OMC al 5% Calcuta GI-03 5,7 Opaca

Gel con extracto al 3% y OMC al 7.5% Calcuta GI-03 5,5 Opaca

Crema con extracto al 3% y OMC al 2% Canela H3-06 7,9 Homogénea

Crema con extracto al 3% y OMC al 4% Canela H3-06 8,4 Homogénea

Crema con extracto al 3% y OMC al 5% Canela H3-06 8,6

Se observan vetas de

separación.

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

Tabla 22. Pruebas microbiológicas del gel y crema con extracto al 3% y OMC

Formulación RT Mohos RT Bacterias S. aureus E. coli. P aeruginosa

Formulación ideal ≤ 100 UFC/ml ≤ 1000 UFC/ml Ausente Ausente Ausente

Gel con extracto 3% y parsol 2% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Gel con extracto 3% y parsol 3% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Gel con extracto 3% y parsol 4% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Gel con extracto 3% y parsol 7.5% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Crema con extracto 3% y parsol 2% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Crema con extracto 3% y parsol 3% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Crema con extracto 3% y parsol 4% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Crema con extracto 3% y parsol 7.5% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Control ambiental 0 UFC/ml 0 UFC/ml 0 UFC/ml 0 UFC/ml 0 UFC/ml

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

56

Después de analizar los resultados anteriores, se seleccionó la formulación con

octilmetoxicinamato -OMC- al 2% pues fue la más aceptada por los entrevistados por sus

características organolépticas.

La composición cuali-cuantitativa del gel y crema desarrollados se incluye en los

cuadros que se presentan a continuación para un lote de 500 g.

Tabla 23.

Composición cuali-cuantitativa del gel de Calahuala fronda, formulación final

Solo gel OMC Extracto Extracto

+ OMC

Carbopol 940 7.5 g 7.5 g 7.5 g 7.5 g

Trietanolamina 10 g 10 g 10 g 10 g

Propilenglicol 10 g 10 g 10 g 10 g

Polisorbato 20 50 g 50 g 50 g 50 g

Extracto de calahuala fronda 0 0 15 g 15 g

Octil metoxicinamato 0 10g 0 10 g

Metilcloroisotiazolinona/ metilisotiazolinona

(preservante) 0.3 g 0.3 g 0.3 g 0.3 g

Aroma frutal 2.5 g 2.5 g 2.5 g 2.5 g

Agua desmineralizada, csp 500 g 419.7 g 409.7 g 404.7 g 394.7 g

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

Tabla 24.

Composición cuali-cuantitativa de la crema con fronda de Calahuala, formulación

final

C Solo gel OMC Extracto Extracto +

OMC

Alcohol cetílico 12.5 g 12.5 g 12.5 g 12.5 g

Estearato de glicerilo 6.25 g 6.25 g 6.25 g 6.25 g

Vaselina sólida 20 g 20 g 20 g 20 g

Vaselina líquida 60 g 60 g 60 g 60 g

Aceite de jojoba 55 g 55 g 55 g 55 g

Trietanolamina 8.75 g 8.75 g 8.75 g 8.75 g

Octil metoxicinamato 0 10 g 0 10 g

Gel de calahuala 0 0 125 g 125 g

Glicerina 10 g 10 g 10 g 10 g

Metilcloroisotiazolinona/

metilisotiazolinona (preservante) 0.3 g 0.3 g 0.3 g 0.3 g

57

Aroma 2.5 g 2.5 g 2.5 g 2.5 g

Carbopol 940 3.75 g 3.75 g 3.75 g 3.75 g

Polisorbato 20 5.65 g 5.65 g 5.65 g 5.65 g

Extracto de fronda de calahuala 15 g 15 g 15 g 15 g

Agua desmineralizada, csp 500 g 500 g 500 g 500 g

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

Los lotes piloto de las ocho formulaciones finales se sometieron a pruebas de

calidad organoléptica, fisicoquímica y microbiológica aplicadas al resto de

formulaciones durante su desarrollo y se establecieron los parámetros de calidad. Estos

resultados se presentan a continuación.

Tabla 25.

Calidad microbiologica de las formulaciones finales

Formulación RT mohos y

levaduras

RT mesófilos

aeróbicos S. aureus E. coli P aeruginosa

Formulación ideal ≤ 100 UFC/ml ≤ 1000 UFC/ml Ausente Ausente Ausente

Gel sin extracto y sin

OMC Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Gel con extracto 3% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Gel con OMC 2% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Gel con extracto 3%

y OMC al 2% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Crema sin extracto y

sin OMC Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Crema con extracto

3% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Crema con OMC 2% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Crema con extracto

3% y OMCl al 2% Cumple Cumple Cumple Cumple Cumple

Control ambiental 0 UFC/ml 0 UFC/ml 0 UFC/ml 0 UFC/ml 0 UFC/ml

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

Tabla 26.

Características organolépticas y fisicoquímicas de formulaciones finales

Formulación Color pH

Gel sólo Incoloro, traslúcido 7.0 ± 0.0

Gel + xtracto Olmeca H2-14 6,1 ± 0.2

Gel + OMC Almendra J4-02 7,0 ± 0.1

Gel completo Cofradía G3-11 6,3 ± 0.2

Crema sola Sevilla J3-01 9,0± 0.0

Crema + xtracto Palma G3-06 8,6 ± 0.3

Crema + OMC Malvavisco I3-01 9,1 ± 0.2

Crema completa Canela H3-06 8,6± 0.3

Fuente: Experimental Proyecto Fodecyt 16-09

58

III.1 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Se evaluó y diseñó una formulación a partir de extractos de calahuala (Phlebodium

pseudoarueum) para un posible uso en cosmética como agente antisolar, para lo cual se

colectó la especie vegetal en San José Pinula, se realizó la caracterización fisicoquímica

a la materia vegetal rizoma y fronda, para establecer los parámetros de calidad.

Dentro de las pruebas fisicoquímicas realizadas se determinó el porcentaje de cenizas

totales tanto en rizomas y frondas, ya que es una prueba que indica el contenido de

minerales que contiene el material en estudio (Solís, P., Guerrero, N., Gattuso, S. &

Cáceres, A.; 2003). Las muestras de droga vegetal presentaron porcentajes de cenizas

totales no mayores a 5% como lo indican los parámetros farmacopeicos. Además se

observó que las muestras de fronda presentaron mayor contenido de minerales pues los

valores obtenidos en esta prueba fueron superiores a los del rizoma, tanto en cenizas

totales como cenizas ácidas.

Según Solís y colaboradores, 2003, la prueba de cenizas insolubles en ácido, indica la

cantidad de materia extraña presente en el material vegetal. Esta determinación es muy

importante para detectar adulteraciones e indicar el grado de contaminación en el suelo

En este caso todas las muestras de fronda y rizoma cumplieron con los valores de

referencia.

El material vegetal es secado con propósitos de preservación, pues la presencia de

agua ayuda al crecimiento de hongos y levaduras; así como a la actividad enzimática

propia de la planta. Los valores de humedad de la materia vegetal se presentaron por

debajo del 10%, como lo indica la mayoría de farmacopeas consultadas.

Según los resultados fisicoquímicos obtenidos, la droga vegetal cumple con los

parámetros de calidad establecidos y por tanto se determinó apta para su uso en la

elaboración de tinturas y extractos vegetales.

Con la finalidad de extraer la mayor cantidad de metabolitos de la misma, se realizó

la prueba de sólidos totales, o residuo seco; que permitió establecer el solvente capaz de

extraer la mayor cantidad de sólidos. Se obtuvo una mayor proporción de sólidos

extraíbles desde la droga vegetal, con etanol al 50%; pues al aumentar la proporción de

agua aumenta la proporción de otros metabolitos, (como azúcares) extraídos. En este

caso se seleccionó el etanol al 70% como mejor solvente para elaborar los extractos de P.

pseudoaureum, porque se cuantificó una mayor cantidad de flavonoides en los mismos y

estos metabolitos resultaban de especial interés en el estudio.

Las características organolépticas de los extractos preparados, se determinaron

utilizando los sentidos de un panel conformado por al menos tres personas. Según la

Farmacopea Británica (2009) y la Farmacopea Española (2003), estas propiedades son

características para los extractos de cada especie y no se observó gran diferencia entre los

extractos elaborados de rizoma y fronda. Todos los colores correspondieron a la gama

de naranjas y rojos, el cual fue determinado según una carta de color comercial.

59

El olor dulce detectado en los extractos pudo deberse a la presencia de azúcares

(Cáceres, 2006). Los cual también explica la apariencia viscosa y acaramelada de los

extractos secos y fluidos.

El pH de los extractos fluidos de rizoma fue de 5.9 ± 0.2; al igual que para los

extractos de fronda; por lo que los metabolitos presentes en estas dos partes de la planta

en estudio no afectaron éste parámetro. Sin embargo; varía levemente 5.8 ± 0.1 en los

extractos de fronda preparados con etanol al 70%. En todos los casos, el pH de los

extractos es ideal para preparaciones cosméticas pues es bastante cercano al pH normal

de la piel que se encuentra entre 4.5-6.5 (Rieger, 2000).

La densidad del extracto fluido de los rizomas fue de 1.045 ± 0.026 y de 1.010 ±

0.039 para las frondas. Los extractos fluidos de fronda preparados con etanol al 70%

presentaron una densidad menor 0.984 ± 0,032; por la mayor proporción de etanol que

posee una densidad menor (0.8) al agua (USP 30, 2007). Este parámetro mostró una

relación directa con la cantidad de sólidos que se han extraído desde la materia vegetal.

Los sólidos extraíbles de los extractos fluidos de rizoma se determinaron en 14.54

± 5.51% y en 17.95 ± 3.14% para las frondas. Según la Real Farmacopea Española

(2003) y la Farmacopea Británica (2009), estos valores son específicos para cada

especie; por lo que se esperaría que fueran similares en extractos fluidos de otra

población de P. pseudoaureum preparados en condiciones similares. Solís, P y

colaboradores (2003) también coinciden en que estos límites varían de una especie a otra

y deben ser establecidos para cada una de ellas.

Los sólidos extraíbles de los extractos secos de los rizomas se reportaron en 80.60

± 1.67% y en 63.87 ± 5.64% para las frondas. En los extractos de fronda preparados con

etanol al 70% el porcentaje de sólidos extraíbles se determinó en 66.46 ± 0.04%. Según

la Real Farmacopea Española (2003); este parámetro es específico para cada especie.

Sin embargo; Solís, P y colaboradores (2003), establecen que los sólidos

extraíbles o el peso del residuo obtenido no debe ser menor de 95% en el extracto

pulverizado, ni menor del 70% en el extracto semisólido. Por lo que puede afirmarse

que los extractos de rizoma obtenidos son entonces semi-sólidos. En cualquier caso la

Farmacopea Británica (2009) establece que esta información constituye un parámetro de

calidad verificable para establecer la calidad e integridad del extracto elaborado, previo a

su uso o aplicación.

Los resultados obtenidos en las pruebas macro y semi-micro de coloración y

precipitación coinciden con las obtenidas por García, E. en el año 2008 y Cruz et al.,

2010, en donde se detectó la presencia de flavonoides y cumarinas; tanto en frondas

como en rizomas. Además de evidenciarse la presencia de saponinas y taninos en la

mayoría de los extractos. Las antraquinonas, únicamente se evidenciaron en los

extractos de fronda elaborados con etanol al 70%. La presencia de taninos en los

extractos elaborados, coinciden con lo reportado por Cáceres en 1996, para otras especies

del género provenientes de San Salvador.

60

En el caso de los rizomas, la cromatografía en capa fina estableció la presencia de

antraquinonas, flavonoides y cumarinas. Las saponinas en este caso son menos

abundantes, pues casi no se observan bandas de color azul o violeta.

En los resultados de la tabla 7 se pudo observar la presencia de antraquinonas,

flavonoides y saponinas en los extractos de fronda de Calahuala elaborados.

Las antraquinonas, flavonoides, taninos y cumarinas presentes en los extractos

elaborados, poseen anillos bencénicos y grupos hidroxilo en su estructura; al igual que

los agentes antisolares químicos (Rieger,2000). El mismo autor explica que la presencia

del anillo bencénico es esencial, por la gran capacidad que tiene de absorber energía y

deslocalizar los electrones, pues sus enlaces conjugados son capaces de movilizar energía

desde una parte de la molécula a otra y provocar dispersión.

Según Mazza, C., Boccalandro, H., Giornado, C., Battista, D. Scopel, A. &

Ballaré, C. (2000); los principales componentes de las plantas que presentan actividad

antisolar son los polifenoles, por lo que la presencia de estos metabolitos permite

sospechar la capacidad de absorción UV de los extractos elaborados.

Además, Tabrizi, H., Mortazavi, S.& Kamalinejad, M. en el año 2003,

establecieron que la presencia de flavonoides en diferentes concentraciones, les

proporcionaba a los extractos capacidad de absorción UV; por lo que la presencia de

estos metabolitos en todos los extractos elaborados es un indicador de la capacidad que

tendrán de absorber luz en el espectro ultravioleta.

La Real Farmacopea Española, 2003; establece parámetros de calidad

microbiológica más amplios, para preparaciones farmacéuticas provenientes de plantas

medicinales a las que no se añade agua en ebullición antes de usar; que son los que más

se asemejan a los productos cosméticos. Recuento de microorganismos aerobios viables

totales, no más de 105 bacterias aerobias y no más de 10

4 hongos por gramo a mililitro.

No más de 103 enterobacterias y otras bacterias gram-negativas por g o ml. Ausencia de

Salmonella y Escherichia coli

Sin embargo, en este caso se aplicaron criterios de calidad microbiológica más

estrictos, establecidos por el Reglamento Técnico Centroamericano para la Verificación

de la Calidad de los Productos Cosméticos, que son los que se muestran en la tabla

anterior y era necesario cumplir para formular este tipo de productos en el país.

Todos los extractos de fronda analizados, pueden utilizarse en la fabricación de

productos cosméticos ya que demostraron un apropiado proceso de recolección, cultivo,

cosecha, secado, corte y almacenamiento de la materia vegetal y el extracto (Solís,

2003). Los resultados de los controles ambientales, y la realización de controles

positivos con cepas de patógenos en los medios de cultivo utilizados en cada prueba,

demostraron que las condiciones de ensayo fueron adecuadas, por lo que los resultados

son confiables.

En cuanto a los rizomas, el RC2 y RC3 no son aptos para fabricar productos

cosméticos, pues excedieron el límite establecido para mesófilos aeróbicos. Esto puede

deberse a que se prepararon en etanol al 50%. A esta concentración el etanol pierde sus

61

propiedades bactericidas (Rieger, 2000); por lo que puede presentarse la contaminación

microbiológica de los extractos; como se evidenció en esta oportunidad.

Los resultados permiten establecer que el extracto de rizoma con mejor perfil

como bloqueador solar fue el RC1 en todas las concentraciones estudiadas; mientras que

en el caso de las frondas fueron varios extractos que sobresalieron, entre los que se

encuentran el FC4 a concentraciones de 5 y 50 ppm. El FC7 en concentraciones de

100ppm. Al realizar la mezcla con Parsol, se observó un aumento en la capacidad de

absorción de todos los extractos; sobresaliendo los extractos de fronda preparados con

etanol al 70%.

La FDA define los agentes antisolares activos como aquellos que absorben,

reflejan o dispersan la radiación en el rango ultravioleta a longitudes de onda de 290 a

400 nanómetros. La radiación ultravioleta que afecta la salud de los humanos sobre la

tierra se divide en UVB (290-320 nm) y UVA (320-400 nm); se supone que las

radiaciones UV de longitudes de onda más pequeñas (UVC), son absorbidas por la capa

de ozono (Rieger, 2003).

La energía de la radiación decrece al aumentar la longitud de onda, pero ocurre lo

opuesto en cuanto a la penetración en la piel; UVA penetra más profundo, incluso bajo la

dermis y puede provocar alteraciones en el ADN, envejecimiento, arrugas y otros efectos

a largo plazo; mientras que la UVC no atraviesa ni el estrato córneo. La radiación UVB

se encuentra asociada al cáncer de piel y eritemas resultantes de la excesiva exposición

solar.

Como se pudo observar, los extractos de fronda y rizoma, por si solos, a las

concentraciones en estudio, absorben energía UV en longitudes de onda; que

corresponden a la radiación UVC, la cual tiene pocos efectos dermatológicos.

Gers-Barlag, H. & Kröpke, R.; en el 2001 indican la región en torno a los 308 nm

como la de máximo efecto eritematoso de la luz solar. Todos los extractos en estudio en

concentraciones de 5 y 50 ppm, asociados con el octilmetoxicinamato a 5ppm, absorben

radiación UV a longitudes de onda entre 311-312 nm, lo cual se encuentra bastante

cercano a la región del máximo efecto eritematoso y a bajas concentraciones del filtro

solar orgánico. Es decir, que los extractos de rizoma y fronda de P. pseudoaureum

asociados al filtro solar orgánico, tienen efecto sinérgico; según Velasco, M., Daud, F.,

Nunes, I., Kaneko, T & Rolim, A; 2009; esto puede deberse a que los extractos puede

estabilizar las moléculas de los filtros orgánicos elevando su capacidad de absorber

energía en la región UV e incluso ampliando el espectro de absorción. Esto fue evidente

en los resultados obtenidos, pues el agente antisolar orgánico en concentraciones de

5ppm mostró una absorbancia promedio de 0.4181con desviación de 0.0001; la

absorbancia aumentó al combinarse con los extractos en estudio a las diferentes

concentraciones.

La ampliación del espectro de absorción y el factor de protección solar del

producto cosmético final, debe realizarse a través de estudios in vitro empleando

membranas sintéticas de colágeno (Robles, M., Daud, F., Nunes, I., Kaneko, T. & Rolim,

A.; 2009) o bien con estudios in vivo sobre voluntarios sanos, siguiendo los protocolos

establecidos para la evaluación de productos antisolares (Cuadrado-Vega y col, 2008).

62

En base a los resultados obtenidos pudo establecerse que todos los extractos

analizados presentan acción como protectores solares, pues la mayoría de valores

obtenidos se encuentran por encima de uno, aún a bajas concentraciones y se

clasificarían como sustancias con mínima protección solar (SPF 2-12); según la

legislación de Estados Unidos. Según la legislación nacional vigente, se clasificarían

como sustancias con factor de protección solar bajo comprendido desde menor o igual a

dos hasta menos de seis.

Los resultados obtenidos para la cuantificación de flavonoides, coincidieron con

los reportados por García, en el año 2008, para la misma especie; pues estableció un

porcentaje de flavonoides totales como quercetina de 0.2294 ± 0.0030 para la fronda y de

0.0375±0.0323 para el rizoma. Los extractos de fronda presentaron porcentajes mayores

al 0.5 en todos los casos y los de rizoma en cantidades diez veces menores y a veces

indetectables.

Tabrizi y colaboradores en el año 2003, establecieron que la presencia de

flavonoides se relaciona directamente con la capacidad de absorción de energía

ultravioleta de los extractos vegetales y además comprobó que los extractos etanólicos

eran más eficaces, pues este solvente, es capaz de extraer numerosos pigmentos y

agentes colorantes que existen en la planta y pueden absorber o reflejar radiación a estas

longitudes de onda. Según los resultados los extractos de P. pseudoaureum elaborados

con etanol al 70%, se comportaron de la misma manera; pues fueron los que presentaron

mayor cantidad de flavonoides (por encima del 1%) y los que presentaron mayor factor

de protección solar por espectofotometría al asociarse con el octilmetoxicinamato.

La determinación de sapogeninas esteroidales permitió establecer que los

extractos de rizoma presentaron porcentajes promedio de 2-6 % mientras que los rizomas

de 1- 7%, además se observaron los mayores porcentajes expresados como stigmasterol y

los menores fueron los expresados como diosgenina, lo cual se infiere que las estructuras

de las sapogeninas presentes en calahuala son más cercanas a dicho esterol.

Se realizaron varias pruebas con una gran variedad de materias primas a fin de

establecer el sistema de preservantes más efectivo, el aroma más aceptado y la

estabilidad fisicoquímica de la formulación en el envase seleccionado. A las

formulaciones que no mostraron cambios en la integridad de la preparación (ausencia de

separación de fases, precipitados, cambios de apariencia, etc); el color y pH en el envase

seleccionado luego de una semana; se les adicionaron diferentes aromas.

Todas las formulaciones se prepararon con extracto de fronda pues se estableció

que cumplieron con los parámetros de calidad organoléptica, fisicoquímica,

microbiológica y además presentaron abundancia de flavonoides, metabolitos de

importancia como agentes antisolares (Tabrizi, et al; 2003).

El envase seleccionado para conducir el estudio de estabilidad fue un tubo

colapsable de polietileno con tapa ―flip-flop‖, que dosifica el producto de manera

efectiva y minimiza el contacto con el exterior para prevenir la contaminación

microbiológica (Genaro, 2003). Se comprobó que fue efectivo en este sentido, pues fue

63

el que se utilizó para envasar las formulaciones con los diferentes aromas, sin presentar

contaminación.

Es importante mencionar que en el análisis microbiológico previo al inicio del

estudio de estabilidad se realizó el control de la eficacia del medio, establecido por la

Real Farmacopea Española (2003); con la finalidad de asegurar que los medios de

cultivo se encontraban en condiciones de permitir el crecimiento de las bacterias, mohos

y patógenos si éstos estuvieran presentes en la formulaciones; lo cual proporcionó

credibilidad y veracidad a los análisis microbiológicos reportados.

Los resultados microbiológicos de las formulaciones en el tiempo inicial,

comprobaron la calidad microbiológica de las materias primas empleadas; así como la

eficacia de la aplicación de buenas prácticas de manufactura durante la elaboración y

envasado del producto.

La reglamentación vigente concerniente a la realización de estudios de estabilidad

acelerados, está diseñada para medicamentos para uso humano; la cual establece que las

condiciones de almacenamiento a las que se debe someter el producto a ensayar son: 40

± 2ºC y 75±5% y los análisis de calidad organoléptica, fisicoquímica y microbiológica se

realizan al inicio, 90 días y 180 días. Los productos elaborados se sometieron a estas

condiciones de almacenamiento; pero se realizaron dos intervalos de análisis más, antes

de los 90 días; uno a los quince días y otro a los treinta.

Lo más evidente fueron los cambios de color, todas las preparaciones se

oscurecieron levemente al ser sometidas a 40 ± 2ºC y 75±5% de humedad relativa. Sin

embargo los geles conservaron sus características iniciales de transparencia en

concentraciones de 1-3%. En el caso de las cremas con extracto al 4 y 5% perdieron

fluidez y se mostraron más pastosas. Es por ello que se estableció que la concentración

de extracto de Calahuala al 3% fue la idónea para elaborar la preparación cosmética

final.

Según los resultados expuestos se pudo establecer que las formulaciones fueron

estables en condiciones normales de almacenamiento, 25± 2ºC y 60 ±5% de humedad

relativa, por un período de nueve meses, después de la fabricación.

El estudio de estabilidad acelerada se desarrolló a 40º C durante seis meses,

introduciendo la humedad relativa elevada como un segundo factor de degradación;

como las preparaciones permanecieron dentro de parámetros aceptables de calidad se

puede asignar un período de validez tentativo de dos años en condiciones normales de

almacenamiento (RTCA 11.01.04:05, 2005).

La formulación que cumplió con todos los criterios de calidad organoléptica,

fisicoquímica y microbiológica establecidos por las farmacopeas y por la legislación

aplicable fue el gel; pues sus valores de pH fueron afines al pH normal de la piel (4.5-

6.5); lo cual evita que produzca irritación, picazón y otras molestias que se manifiestan

en formulaciones con pH mayores a 7.5 (Genaro, 2003).

Se desarrolló también la crema, porque según Rieger, 2000 la mayoría de

preparaciones antisolares comerciales se preparan como emulsiones O/W. Esta fue la

formulación que presentó mayores retos e incompatibilidades, debido a que los extractos

64

fueron de naturaleza polar, afines al agua y en la formulación se deben incorporar

materias primas de naturaleza apolar que favorecen la extensibilidad de los activos sobre

la piel y la formación de una película uniforme (Rieger, 2000); por lo que es como

mezclar agua y aceite. La selección del agente emulsionante es esencial para lograr la

homogeneidad de la preparación y por lo que fue necesario combinar varios para

estabilizar la formulación y responder a la demanda de la fase oleosa con HLB de 9.42,

según los cálculos realizados aplicando el método tradicional (Genaro, 2003).

Sin embargo; fue evidente que la formulación de crema desarrollada presentó

valores de pH mayores a los ideales; por lo que sería necesario ajustar estos valores

incorporando nuevas materias primas que afectan el equilibrio hidrofílico-lipofilico

(HLB) de la formulación; lo cual exigiría el cambio de los agentes emulsionantes

seleccionados y ensayar varias combinaciones de los mismos.

Es probable que la trietanolamina, contribuya grandemente al pH básico de la

formulación, pues es una base débil. Se incluyó en la fórmula porque es un neutralizante

de los polímeros ácidos con propiedades gelificantes; como el carbopol (Martini, M.,

Chivot, M & Peyrefitte, G.; 1997); necesario para fabricar el gel en donde se incorporó el

extracto etanólico de Calahuala.

La presencia del aceite de jojoba, compuesto en un 96% por ceramidas, en la fase

oleosa le proporciona a la formulación gran afinidad con la piel; pues las ceramidas se

encuentran presentes de forma natural en la piel, por lo que ejerce una función lubricante

(Rieger, 2000).

Dentro de las ventajas de la formulaciones de gel y crema desarrolladas, se puede

mencionar que poseen el agente antisolar orgánico más utilizado (Rieger, 2000) por su

habilidad para deslocalizar la energía desde una parte de la molécula a otra. La

combinación con extractos de fronda de Calahuala, que contienen flavonoides y otros

pigmentos que pueden estabilizar el agente antisolar orgánico y aumentar su capacidad

de absorción (Robles, M., Daud, F., Nunes, I., Kaneko, T. & Rolim, A.; 2009).

El cumplimiento con las pruebas microbiológicas de las preparaciones

fitocosméticas permitió asegurar que se fabricaron y envasaron en condiciones

adecuadas. El control de eficacia del medio establecido por las farmacopeas proporcionó

credibilidad y veracidad a los resultados de los análisis microbiológicos.

El envase seleccionado dosificó el producto de manera efectiva y previeno la

contaminación microbiológica. Fue necesario adaptar la regulación vigente sobre

estudios de estabilidad de fármacos para realizar el estudio de estabilidad acelerado en

las preparaciones cosméticas desarrolladas.

Además, la presencia de extractos naturales puede proporcionar tonicidad a la piel,

disminuir los eritemas, descamaciones, enrojecimientos y comezones causadas por la

excesiva exposición al sol, propiedades que los agentes antisolares sintéticos no poseen

(Cuadrado-vega, O. et al; 2008). Sobre todo si se considera que esta especie reporta

antecedentes de beneficios sobre la piel, pues Cáceres, 2006 menciona que el extracto

mejora el curso de la psoriasis en comparación con el tratamiento convencional, según un

estudio doble ciego con placebo y control; también menciona que la administración

65

tópica del extracto induce la repigmentación en pacientes con vitiligo y que está indicado

popularmente en el tratamiento de eczemas, dermatosis y estados de disfunción inmune.

Los agentes antisolares orgánicos como el octilmetoxicinamato, interaccionan

con el vehículo (los demás componentes de la formulación), lo cual puede afectar su

capacidad de absorción y el espectro de absorción ultravioleta de manera positiva; como

en la asociación con extracto de fronda de Calahuala o negativa. (Rieger, 2000; Robles,

2009)

Según los resultados del espectro de absorción de los extractos de Calahuala

expuestos con anterioridad y considerando que los mismos se incorporaron a las

formulaciones en una concentración de 3,000ppm, asociados al octilmetoxicinamato en

concentraciones de 2,000ppm; puede sospecharse que las formulaciones propuestas al

menos deberían mostrar un factor de protección solar comprendido entre los valores

reportados para el extracto (2-10); siendo entonces productos que proveen mínima

protección solar (FPS 2-12) según la legislación de Estados Unidos; o mediana

protección solar, según la legislación nacional.

Por la complejidad de estas formulaciones que incluyen moléculas capaces de

absorber energía ultravioleta, es necesario realizar pruebas in vivo o in vitro sobre

cultivos celulares; para establecer claramente el FPS que poseen y la seguridad de su

aplicación en base a su potencial de irritación en 50-200 voluntarios, aunque no sea

requerido para productos cosméticos, previo a su comercialización (Rieger, 2000).

Las técnicas in vitro por espectrofotometria presentan muchas limitaciones por no

tener en consideración el relieve de la piel, la sustantividad o absorción del crema, la

transpiración y la interacción filtro solar/piel (Trullás, C., Tribó, M., Serra-Baldrich, E &

Pelejero, C.; 2006). Es por ello que la determinación del FPS de la formulación en gel

con extracto de Calahuala al 3% y OMC al 2%, establecida como la más promisoria,

debe realizarse in vivo. Las técnicas in vitro, sirven como paso inicial en el desarrollo de

formulaciones y permiten seleccionar la combinación más promisoria.

La determinación del FPS debe realizarse en un grupo de al menos 20 personas

voluntarias, utilizando como patrón de comparación un producto que contiene 8% de

salicilato de homomentilo con FPS 4. Los productos se aplican en películas uniformes

en áreas delimitadas y se someten a la radiación solar en horas determinadas del día. Se

reportan los tiempos de formación de eritema y se calcula el FPS aplicando las formulas

y métodos establecidos por COLIPA, 1994. Para realizar este tipo de estudios en el país

debe solicitarse una autorización ante las autoridades competentes.

66

PARTE IV

IV.1 CONCLUSIONES

4.1.1 Se diseñó una crema y un gel a base de extractos de P. pseudoaureum y fue posible

establecer los parámetros de calidad para su posible uso como agente antisolar.

4.1.2 La droga vegetal y los extractos de P. pseudoaureum cumplen con los parámetros

de calidad y pureza por lo cual pueden ser utilizados en la fabricación de productos

cosméticos y/o farmacéuticos.

4.1.3 Según la prueba de sólidos totales, el etanol al 50% extrajo la mayor cantidad de

sólidos, sin embargo el etanol al 70% extrae la mayor cantidad de los metabolitos de

interés como los flavonoides.

4.1.4 La caracterización organoléptica evidenció que los extractos presentan una

coloración que corresponden a los tonos naranjas y rojos, por comparación con carta de

color pantone; mostrando además un olor dulce según panel evaluador.

4.1.5 Se caracterizaron los extractos fluidos y secos elaborados a través de pruebas

fisicoquímicas como el pH, la densidad y los sólidos totales o sólidos extraíbles.

4.1.6 El pH de los extractos de fronda y rizoma presentó valores desde 5.7-6.1, cercanos

al pH normal de la piel (4.5-6.5), ideal para preparaciones cosméticas.

4.1.7 La densidad de los extractos fluidos disminuyó al aumentar la concentración de

etanol en el vehículo extractor.

4.1.8 La cantidad de sólidos extraíbles de los extractos fluidos de rizoma y fronda se

encontró por encima del 14% y los extractos secos de rizoma y fronda, se reportaron por

debajo del 95%; por lo que corresponden a extractos semisólidos.

4.1.9 Las pruebas fitoquímicas macro y micrométricas en tubo, detectaron la presencia

de flavonoides, saponinas y taninos; pero no evidenciaron la presencia de antraquinonas,

mientras que por cromatografía en capa fina se identificaron lavonoides y saponinas en

los extractos de fronda y en los extractos de rizoma se evidenciaron además cumarinas.

4.1.10 La presencia de flavonoides, taninos y cumarinas en los extractos elaborados

asegura su capacidad de absorber en la región ultravioleta, por la presencia de grupos

hidroxilo y anillos bencénicos en sus estructuras.

4.1.11 Todos los extractos de fronda elaborados cumplen con los parámetros de calidad

microbiológica establecidos por el Reglamento Técnico Centroamericano para las

preparaciones cosméticas, así como con los límites establecidos por las farmacopeas

internacionales, mientras que los extractos de rizoma elaborados con etanol al 50% no

67

cumplen con los parámetros de calidad microbiológica establecidos por las farmacopeas

y por la reglamentación aplicable.

4.1.12 Los extractos de fronda y rizoma de calahuala absorben radiación ultravioleta en

longitudes de onda que corresponden a la región UVC.

4.1.13 Los extractos de rizoma y fronda de calahuala asociados con el

octilmetoxicinamato absorben energía en longitudes de onda cercanas a la región de

máximo efecto eritematoso y presentan un efecto sinérgico en su capacidad de absorción

de energía en el rango UVB.

4.1.14 Los extractos de calahuala presentan un factor de protección solar bajo pero por el

efecto sinérgico con octilmetoxicinamato son útiles para formular bloqueadores solares

con espectro de absorción UVB.

4.1.15 Los extractos de fronda presentan flavonoides en porcentajes superiores del 0.5%

evidenciando el mayor factor de protección solar por lo que son los de elección para

formular productos antisolares en asociación a un agente antisolar orgánico.

4.1.16 Las curvas de estigmasterol y el β-sitosterol permiten cuantificar de mejor manera

las sapogeninas esteroidales presentes en los extractos de fronda y rizoma de la especie

en estudio.

4.1.17 La formulación fitocosmética se preparó con extracto de fronda ya que presenta la

mayor cantidad de flavonoides, cumplen con los parámetros de calidad organoléptica,

fisicoquímica y microbiológica, y los preservantes demostraron efectividad en el sistema

formulado.

4.1.18 La concentración de extracto de fronda de Calahuala al 3% es idónea para

elaborar la preparación fitocosmética; pues conserva sus características organolépticas y

fisicoquímicas a lo largo del tiempo según el estudio de estabilidad.

4.1.19 La estabilidad microbiológica del gel y la crema indica la eficacia del sistema de

preservantes seleccionados y del envase empleado, permitiendo establecer un período de

validez tentativo de dos años, pues no mostraron signos de degradación.

4.1.20 La concentración del octilmetoxicinamato al 2% mostró mejores características

organolépticas en las formulaciones propuestas.

4.1.21 La formulación fitocosmética propuesta es en forma de gel, con extracto de fronda

de Calahuala al 3% y octilmetoxicinamato al 2%; con pH entre 6.3 ± 0.2 ; color en la

gama de naranjas y rojos y con calidad microbiológica establecida por el reglamento

técnico centroamericano para productos cosméticos.

4.1.22 La formulación fitocosmética sugerida puede tener un factor de protección solar

comprendido desde dos hasta diez; en base a los extractos utilizados en su fabricación.

68

IV.2 RECOMENDACIONES

4.2.1 Realizar un estudio de escalamiento y elaborar lotes piloto de las formulaciones

propuestas para su posterior comercialización y registro.

4.2.2 Someter la formulación a un estudio de estabilidad en anaquel de duración de dos

años para establecer su período de vigencia en el mercado.

4.2.3 Continuar con los estudios clínicos para establecer el factor de protección solar y

actividad antioxidante de la formulación final en gel.

4.2.4 Evaluar el potencial como agente antisolar y antioxidante de otras especies de

calahuala.

69

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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75

IV. 4 ANEXOS

Anexo No. 1. Fotografías de la caracterización de la droga vegetal y extractos de P.

pseudoaureum mediante pruebas fisicoquímicas, fotoquímicas y microbiológicas.

Anexo No. 2 Espectros de absorción de los extractos de P. pseudoaureum.

Anexo No. 3 Fotografías de la cuantificación de flavonoides totales mediante

espectrofotometría UV/VIS.

Anexo No. 4 Fotografías de la elaboración de un producto fitocosmético a partir de

extractos de P. pseudoaureum.

76

Anexo No. 1.

Fotografías de la caracterización de la droga vegetal y extractos de P.

pseudoaureum mediante pruebas fisicoquímicas, fitoquímicas y microbiológicas.

77

Fig. 1- Determinación sólidos extraíbles de la droga

vegetal.

Fig.2- Determinación de cenizas de la droga vegetal

Fig. 3-Determinación del porcentaje de humedad

Fig. 4- Preparación del percolador

78

Fig. 5-Concentración de la tintura en rotavapor

Fig. 6- Secado del extracto sobre silica gel

Fig.7 – Taco de color Comex utilizado. Fig. 8- Determinación de color, utilizando taco y

luz de día.

Fig. 9- Sólidos extraíbles o sólidos totales de los

extractos de fronda y rizoma.

Fig. 10- Pruebas macro y micrométricas en tubo,

determinación de saponinas.

79

Fig. 11- Determinación de pH de extractos fluídos. Fig. 12- Determinación de gravedad específica de

extractos fluidos.

Fig. 13-Identificación de cumarinas por

cromatografía de capa fina

Fig. 14- Identificación de flavonoides por

cromatografía de capa fina

Fig,¡. 15–Identificación de saponinas por CCF Fig. 16- Identificación de antraquinonas por CCF

80

Fig.17-Determinación de taminos, pruebas micro y

macrométricas en tubo.

Fig. 18- Disolución de extractos en caldo para

establecer calidad microbiológica

Fig 19- Preparación de cajas de petri por vertido y

dilución en el medio de cultivo.

Fig. 20- Incubación de los medios a las

temperaturas correspondientes.

Fig. 21- Observación de las cajas y del control

ambiental para tabular los resultados.

Fig. 22- Observación de una unidad formadora de

colonia de mohos en agar Saboraud del extracto

81

RC3, no sobrepasa el límite.

Fig. 23- Ajustes y modificaciones al método de

cuantificación de saponinas Fig. 24- Control estricto de la temperatura.

Fig. 25- Curva de calibración de Saponinas Fig. 26- Determinación de la absorbancia con

espectrofotómetro Agilent.

82

Anexo No. 2

Espectros de absorción de los extractos de P. pseudoaureum.

83

Espectro de absorción Extracto de Fronda FC1

-1,00E-01

0,00E+00

1,00E-01

2,00E-01

3,00E-01

4,00E-01

5,00E-01

6,00E-01

7,00E-01

8,00E-01

290

294

298

302

306

310

314

318

322

326

330

334

338

342

346

350

354

358

362

366

370

374

378

382

386

390

394

398

Longitud de onda nm

ab

so

rban

cia

5ppm

50ppm

100ppm

5ppm OMC

50ppm/OMC

100ppm/OMC

5ppm/OMC

Espectro de Absorción Extracto etanólico FC2

-2,00E-01

0,00E+00

2,00E-01

4,00E-01

6,00E-01

8,00E-01

1,00E+00

1,20E+00

290

294

298

302

306

310

314

318

322

326

330

334

338

342

346

350

354

358

362

366

370

374

378

382

386

390

394

398

longitud de onda nm

Ab

so

rba

ncia

5ppm

50ppm

100ppm

5ppm/OMC

50ppm/OMC

100ppm/OMC

OMC 5ppm

84

Espectro de absorción Extracto etanólico FC3

-2,00E-01

0,00E+00

2,00E-01

4,00E-01

6,00E-01

8,00E-01

1,00E+00

1,20E+00

1,40E+00

290

294

298

302

306

310

314

318

322

326

330

334

338

342

346

350

354

358

362

366

370

374

378

382

386

390

394

398

Longitud de onda nm

Ab

so

rban

cia

5ppm

50ppm

100ppm

5ppm/OMC

50ppm/OMC

100ppm/OMC

OMC 5ppm

Espectro de absorción Extracto etanólico FC4

-1,00E-01

0,00E+00

1,00E-01

2,00E-01

3,00E-01

4,00E-01

5,00E-01

6,00E-01

7,00E-01

8,00E-01

9,00E-01

290

294

298

302

306

310

314

318

322

326

330

334

338

342

346

350

354

358

362

366

370

374

378

382

386

390

394

398

longitud de onda nm

Ab

so

rba

nc

ia

5ppm

50ppm

100ppm

5ppm/OMC

50ppm/OMC

100ppm/OMC

OMC 5ppm

85

Espectro de absorción Extracto etanólico FC5

-1,00E-01

0,00E+00

1,00E-01

2,00E-01

3,00E-01

4,00E-01

5,00E-01

6,00E-01

7,00E-01

8,00E-01

9,00E-01

290

294

298

302

306

310

314

318

322

326

330

334

338

342

346

350

354

358

362

366

370

374

378

382

386

390

394

398

Longitud de onda nm

Ab

so

rba

nc

ia

5ppm

50ppm

100ppm

5ppm/OMC

100ppm/OMC

100ppm + parsol

OMC 5ppm

Espectro de Absorción Extracto Etanólico FC6

-1,00E-01

0,00E+00

1,00E-01

2,00E-01

3,00E-01

4,00E-01

5,00E-01

6,00E-01

7,00E-01

8,00E-01

290

294

298

302

306

310

314

318

322

326

330

334

338

342

346

350

354

358

362

366

370

374

378

382

386

390

394

398

longitud de onda nm

Ab

so

rban

cia

5ppm

50ppm

100ppm

5ppm/OMC

50ppm/OMC

100ppm/OMC

OMC 5ppm

86

Espectro de absorción Ultravioleta, Extracto FC7

-2,00E-01

0,00E+00

2,00E-01

4,00E-01

6,00E-01

8,00E-01

1,00E+00

290

294

298

302

306

310

314

318

322

326

330

334

338

342

346

350

354

358

362

366

370

374

378

382

386

390

394

398

Longitud de onda nm

Ab

so

rban

cia

5ppm

50ppm

100 ppm

5ppm/OMC5ppm

50ppm/OMC 5ppm

100ppm/OMC5ppm

OMC 5ppm

Espectro de absorción, Extracto etanólico de fronda FC8

-1,00E-01

0,00E+00

1,00E-01

2,00E-01

3,00E-01

4,00E-01

5,00E-01

6,00E-01

7,00E-01

8,00E-01

9,00E-01

290

294

298

302

306

310

314

318

322

326

330

334

338

342

346

350

354

358

362

366

370

374

378

382

386

390

394

398

Longitud de onda nm

Ab

so

rba

nc

ia

5ppm

50ppm

100ppm

5ppm/OMC

50ppm/OMC

100ppm/OMC

OMC 5ppm

87

Espectro de Absorción Extracto etanólico FC9

-1,00E-01

0,00E+00

1,00E-01

2,00E-01

3,00E-01

4,00E-01

5,00E-01

6,00E-01

7,00E-01

8,00E-01

9,00E-01

290

294

298

302

306

310

314

318

322

326

330

334

338

342

346

350

354

358

362

366

370

374

378

382

386

390

394

398

Longitud de onda nm

Ab

so

rba

nc

ia

5ppm

50ppm

100ppm

5ppm/OMC

100ppm/OMC

100ppm + parsol

OMC 5ppm

Espectro de Absorción Extracto etanólico RC1

-1,00E-01

0,00E+00

1,00E-01

2,00E-01

3,00E-01

4,00E-01

5,00E-01

6,00E-01

7,00E-01

8,00E-01

290

294

298

302

306

310

314

318

322

326

330

334

338

342

346

350

354

358

362

366

370

374

378

382

386

390

394

398

Longitud de onda nm

Ab

so

rba

nc

ia

5ppm

50ppm

100ppm

5ppm/OMC

50ppm/OMC

100ppm/OMC

OMC 5ppm

Espectro de absorción Extracto etanólico RC2

-1,00E-01

0,00E+00

1,00E-01

2,00E-01

3,00E-01

4,00E-01

5,00E-01

6,00E-01

290

294

298

302

306

310

314

318

322

326

330

334

338

342

346

350

354

358

362

366

370

374

378

382

386

390

394

398

Longitud de onda nm

Ab

so

rba

nc

ia

5ppm

50ppm

100ppm

5ppm/OMC

50ppm/OMC

100ppm/OMC

OMC 5ppm

88

Espectro de absorción Extracto etanólico RC3

-1,00E-01

0,00E+00

1,00E-01

2,00E-01

3,00E-01

4,00E-01

5,00E-01

6,00E-01

290

294

298

302

306

310

314

318

322

326

330

334

338

342

346

350

354

358

362

366

370

374

378

382

386

390

394

398

Longitud de onda nm

Ab

so

rba

nc

ia

5ppm

50ppm

100ppm

5ppm/OMC

50ppm/OMC

50ppm/OMC

OMC 5ppm

Espectro de absorción Extracto etanólico RC4

-1,00E-01

0,00E+00

1,00E-01

2,00E-01

3,00E-01

4,00E-01

5,00E-01

6,00E-01

290

294

298

302

306

310

314

318

322

326

330

334

338

342

346

350

354

358

362

366

370

374

378

382

386

390

394

398

Longitud de onda nm

Ab

so

rban

cia

5ppm

50ppm

100ppm

5ppm/OMC

50ppm/OMC

100ppm/OMC

OMC 5ppm

89

Anexo No. 3

Fotografías de la cuantificación de flavonoides totales mediante espectrofotometría

Ultravioleta/Visible.

90

Fig. 1- Preparación de los extractos para el análisis. Fig. 2- Pipeteado de alícuotas exactas desde balones

aforados.

Fig. 3- Preparación de estándar de Rutina con el

acomplejante

Fig. 4- Preparación de extractos con el

acomplejante.

Fig. 5- Determinación de la absorbancia en

espectrofotómetro UV/VIS Fig. 6- Registro y análisis de los resultados.

91

Anexo No. 4

Fotografías de la elaboración de un producto fitocosmético a partir de extractos de

P. pseudoaureum.

92

Fig. 1- Prueba extracto fronda, utilizando crema

base comercial

Fig. 2- Llenando la manga y duya con la crema

elaborada.

Fig. 3- Llenado de a crema en tubo colapsable de

polietileno transparente.

Fig. 4- Primera formulación de gel, utilizando

parabenos al 1% como preservantes.

Fig. 5- Estudio acelerado de preestabilidad de las

primeras formulaciones.

Fig. 6- Evaluación sensorial de las preparaciones

preliminares.

93

Fig. 7. Lotes fabricados utilizando motor

unipropela.

Fig. 8- Determinación del pH de las diferentes

formulaciones de gel.

Fig. 9- Formulación de la crema seleccionando

materias primas.

Fig. 10- Incorporación del gel a la fase oleosa.

Fig. 11- Homogenización de la emulsión en lote

piloto.

Fig. 12-Pruebas utilizando diferentes aromas.

94

Fig. 13- Envasado de las formulaciones con

distintos aromas en tubos colapsables de polietileno

con tapa flip-flop

Fig. 14- Fabricación de lotes piloto para estudios de

estabilidad.

Fig. 15-Determinación organoléptica del color de

las cremas y geles sometidos a estudio de

estabilidad.

Fig. 16- Determinación de pH de cremas y geles

sometidos a estudios de estabilidad.

Fig. 17- Calidad microbiológica de las

formulaciones sometidas a estudio de estabilidad.

Fig. 18- Uso de campana de flujo laminar en el

análisis microbiológico de las formulaciones

sometidas a estabilidad.

95

Fig. 19- Cepas ATCC utilizadas para realizar las

pruebas de validez de los medios y pruebas de

conteo

Fig. 20- Traslado de las cepas hacia los medios

utilizados en el control de calidad microbiológico.

Fig. 21. Observación de cambios específicos en

cada medio.

Fig. 22- Ausencia de unidades formadoras de

colonias en controles ambientales.

Fig. 23- Formulaciones finales de cremas Fig. 24- Formulaciones finales de gel.

96

Fig. 25-Envasado de formulaciones finales. Fig. 26- Determinación de pH y color en

formulaciones finales.