ICF-UNAM Acceso OpenWebmail - UNIVERSIDAD NACIONAL … · 2018-06-06 · 1 universidad nacional...
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1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS FÍSICAS INSTITUTO DE CIENCIAS FÍSICAS CENTRO DE CIENCIAS DE LA ATMÓSFERA HOSPITAL GENERAL DE MÉXICO INVESTIGACIÓN DE METABOLITOS ASOCIADOS A LA PRE-DIABETES POR ANÁLISIS DE TRAZAS MOLECULARES EN EL ALIENTO EXHALADO TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: MAESTRA EN CIENCIAS (FÍSICA MEDICA) PRESENTA: KATYA PATRICIA VAZQUEZ RIVERA TUTOR PRINCIPALES DR. ANTONIO MARCELO JUÁREZ REYES INSTITUTO DE CIENCIAS FÍSICAS MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR DR. JESÚS FLORES MIJANGOS – INSTITUTO DE CIENCIAS NUCLEARES DR. RUBÉN YVAN MAARTEN FOSSION – INSTITUTO DE CIENCIAS NUCLEARES DRA. ADRIANA MONROY GUZMÁN – FACULTAD DE MEDICINA MÉXICO, D. F. (MES EN QUE SE REALIZÓ EL EXAMEN) 2017
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS FÍSICAS INSTITUTO DE CIENCIAS FÍSICAS
CENTRO DE CIENCIAS DE LA ATMÓSFERA HOSPITAL GENERAL DE MÉXICO
INVESTIGACIÓN DE METABOLITOS ASOCIADOS A LA PRE-DIABETES POR ANÁLISIS DE TRAZAS MOLECULARES EN EL ALIENTO EXHALADO
TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
MAESTRA EN CIENCIAS (FÍSICA MEDICA)
PRESENTA: KATYA PATRICIA VAZQUEZ RIVERA
TUTOR PRINCIPALES DR. ANTONIO MARCELO JUÁREZ REYES
INSTITUTO DE CIENCIAS FÍSICAS
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR DR. JESÚS FLORES MIJANGOS – INSTITUTO DE CIENCIAS NUCLEARES
DR. RUBÉN YVAN MAARTEN FOSSION – INSTITUTO DE CIENCIAS NUCLEARES DRA. ADRIANA MONROY GUZMÁN – FACULTAD DE MEDICINA
MÉXICO, D. F. (MES EN QUE SE REALIZÓ EL EXAMEN) 2017
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Universidad Nacional Autónoma de México
Título
Investigación de metabolitos asociados a la pre-diabetes por análisis de trazas
moleculares en el aliento exhalado
Estudiante
Fis. Katya Patricia Vázquez Rivera
Director de Tesis
Dr. Antonio Juárez Reyes
Miembros del Comité Tutoral
Dr. Jesús Flores Mijangos
Dr. Rubén Fossión
Dra. Adriana Monroy (asesor profesional)
Colaboradores
M. en C. José Manuel Hernández Solís (CCA, UNAM)
Dra. Yolanda Mares Gutiérrez (Dpto. Neumología, HGM)
M. en C. Ana María Gallegos Sánchez
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AGRADECIMIENTOS ACADÉMICOS
5
AGRADECIMIENTOS PERSONALES
6
ÍNDICE
AGRADECIMIENTOS ACADÉMICOS ........................................................................................................... 4
AGRADECIMIENTOS PERSONALES ............................................................................................................ 5
ÍNDICE ..................................................................................................................................................... 6
RESUMEN ................................................................................................................................................ 8
ABSTRACT ............................................................................................................................................. 10
CAPITULO 1: INTRODUCCIÓN................................................................................................................. 11
CAPITULO 2: PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y OBJETIVOS ................................................................ 14
2.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................................................ 14
2.2 HIPÓTESIS .................................................................................................................................... 15
2.3 JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................................. 15
2.4 OBJETIVO GENERAL ..................................................................................................................... 16
2.5 OBJETIVOS PARTICULARES ........................................................................................................... 17
CAPITULO 3: ANTECEDENTES ................................................................................................................. 18
3.1 FUNDAMENTOS DEL METABOLISMO HUMANO ........................................................................... 18
3.2 FUNDAMENTOS DE LA RESPIRACIÓN E INTERCAMBIO GASEOSO .................................................. 20
3.3 VOLÚMENES DENTRO DEL CUERPO HUMANO Y EN CONDICIONES AMBIENTALES ........................ 22
3.4 PATOLOGÍAS DETECTABLES POR VOCs ......................................................................................... 23
3.5 PERSPECTIVAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES POR VOCS EN EL FUTURO ................. 24
3.6 DIABETES ..................................................................................................................................... 27
3.7 PREDIABETES ............................................................................................................................... 29
3.8 PROBLEMÁTICA DE LA DIABETES EN MEXICO Y EL MUNDO .......................................................... 30
3.9 VENTAJAS DE LA DETECCIÓN DE LA PREDIABETES ........................................................................ 31
3.10 CURVA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA ORAL COMO METODO DE DIAGNÓSTICO ...................... 32
3.11 ACTUALIDAD DE LAS INVESTIGACIONES EN DMT2 ...................................................................... 34
3.12 MÉTODO DE ANALISIS DE ALIENTO EXHALADO .......................................................................... 35
7
3.13 LOS MÉTODOS ACTUALES PARA DETECCION DE COVs ................................................................ 36
CAPITULO 4: METODOLOGÍA ................................................................................................................. 38
4.1 CARACTERIZACIÓN DE PACIENTES ................................................................................................ 38
4.2 MUESTREO DEL ALIENTO ALVEOLAR ............................................................................................ 39
4.3 ANÁLISIS POR CG-EM-DIF ............................................................................................................. 41
4.4 ANÁLISIS CUALITATIVO ................................................................................................................ 42
4.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................................................. 43
4.5.1 ANALISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES ............................................................................ 43
4.5.2 ANALISIS DESCRIPTIVO DE LA MUESTRA ................................................................................ 43
4.5.3 ANOVA .................................................................................................................................. 44
4.6 ANÁLISIS CUANTITATIVO .............................................................................................................. 44
4.6.1 CURVAS DE CALIBRACIÓN ..................................................................................................... 44
4.6.2 CUANTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS EN LAS MUESTRAS DE ALIENTO .............................. 46
CAPITULO 5: RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................................ 47
5.1 CARACTERIZACIÓN DE PACIENTES ................................................................................................ 47
5.2 MUESTREO DEL ALIENTO ALVEOLAR ............................................................................................ 55
5.3 ANÁLISIS POR CG-EM-DIF ............................................................................................................. 55
5.4 ANÁLISIS CUALITATIVO ................................................................................................................ 57
5.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................................................. 62
5.5.1 ANOVA .................................................................................................................................. 62
5.5.2 ANÁLISIS DESCRIPTIVO DE LA MUESTRA ................................................................................ 63
5.5.3 ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES ............................................................................ 65
5.6 ANÁLISIS CUANTITATIVO .............................................................................................................. 70
5.6.1 CURVAS DE CALIBRACIÓN ..................................................................................................... 70
5.6.2 CUANTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS EN LAS MUESTRAS DE ALIENTO .............................. 71
CAPITULO 6: CONCLUSIONES ................................................................................................................. 74
REFERENCIAS ......................................................................................................................................... 77
INDICE DE FIGURAS TABLAS Y ECUACIONES ........................................................................................... 81
8
RESUMEN
La investigación de los metabolitos asociados a la prediabetes por trazas
moleculares en el aliento exhalado, involucra el análisis, con gran sensitividad, de los
componentes moleculares de éste. Esta metodología se ha considerado recientemente
como una alternativa de diagnóstico no invasivo para enfermedades como la
prediabetes, la Diabetes Mellitus tipo 2 (DMT2) (Gallego 2016) y muchas otras
enfermedades (Pereira 2014). Además, el diagnóstico de la prediabetes es un paso
fundamental para la detección temprana y la prevención de la DMT2. La DMT2 es una
de las principales causas de muerte y una enfermedad que ataca a una gran parte de
la población mexicana.
Esta investigación involucra el análisis cualitativo, estadístico y cuantitativo de 25
compuestos definidos en el trabajo previo de Gallego (2016) como potenciales
biomarcadores de DMT2. Éste estudio previo, sirvió para mostrar que la técnica permite
distinguir entre pacientes sanos y diabéticos, y por lo tanto tiene el contraste necesario
para emprender estudios más refinados de diagnóstico. El presente trabajo, motivo de
esta tesis, va un paso más adelante y explora la posibilidad de diagnosticar a la pre-
diabetes, lo cual, es un reto importante, incluso para los métodos clínicos más
convencionales.
En el presente trabajo, se estudió el aliento exhalado de una muestra poblacional
compuesta por 38 individuos caracterizados por pruebas hematológicas en el Hospital
General de México “Dr. Eduardo Liceaga”. Los individuos fueron separados en 6 grupos,
empleando criterios clínicos estandarizados basados en la NOM-015 y NOM-037 de la
SSA y los criterios de la ADA. El primer grupo fue catalogado como “sujetos
normoglicémicos” o grupo de control (TNG). El segundo y tercer grupo incluyeron a
sujetos con prediabetes, siendo catalogados como “sujetos intolerantes a la glucosa”
(ITG) y “sujetos con glucosa alterada en ayuno e intolerantes a la glucosa” (GAA+ITG).
El cuarto grupo fue catalogado como “sujetos con DMT2 recién diagnosticados”
(RDMT2). El quinto grupo fue catalogado como “sujetos con DMT2 de larga duración”
(DMT2) y finalmente el sexto grupo fue catalogado como “sujetos con DMT2 en estado
crítico” (CDMT2).
Los compuestos en el aliento exhalado de 38 individuos fueron identificados por
la técnica cromatográfica CG-EM-DIF.
Con el estudio de los compuestos de los 6 grupos, que comprende un gran
espectro de evolución de la DMT2, especialmente los grupos con sujetos en algún
estadio de la DMT2, se fortaleció la selección de los potenciales biomarcadores para la
DMT2 estudiados por Gallego (2016).
De los compuestos estudiados se encontró que 14 metabolitos son potenciales
biomarcadores de la prediabetes. Algunos potenciales biomarcadores de la
prediabetes son la 2-butanona, el 1-hepteno y el p-xileno.
9
Algunos de los 14 metabolitos son capaces de discriminar entre ambos grupos de
prediabetes estudiados. Dentro de los potenciales biomarcadores de la prediabetes
que cumplen esta condición se encuentra la acetona y el 1-propanol para el tipo de
prediabetes GAA+ITG y el benzaldehído para el tipo de prediabetes ITG.
10
ABSTRACT
The investigation of metabolites associated with prediabetes by molecular traces in the
exhaled breath, considers the analysis, with great sensitivity, of the molecular
components of this one. This methodology has recently been considered as a non-
invasive diagnostic alternative for diseases such as prediabetes, Diabetes Mellitus type 2
(DMT2) (Gallego 2016) and many other diseases (Pereira 2014). In addition, the diagnosis
of prediabetes is a critical step in the early detection and prevention of T2DM. T2DM is
one of the main causes of death and a disease that attacks a large part of the Mexican
population.
This research involves the qualitative, statistical and quantitative analysis of 25
compounds defined in the previous work of Gallego (2016) as potential biomarkers of
T2DM. This previous study served to show, that the technique allows to distinguish
between healthy and diabetic patients, and therefore has the necessary contrast to
undertake more refined diagnostic studies. The present work, goes a step further and
explores the possibility of diagnosing pre-diabetes, which is a major challenge, even for
more conventional clinical methods.
In the present study, the exhaled breath of a population sample composed of 38
individuals characterized by hematological tests at the General Hospital of Mexico "Dr.
Eduardo Liceaga ". Individuals were separated into 6 groups, using standardized clinical
criteria based on NOM-015 and NOM-037 of SSA of México and ADA criteria. The first
group was categorized as "normoglycemic subjects" or control group (TNG). The second
and third groups included subjects with prediabetes, being classified as "subjects
intolerant to glucose" (ITG) and "subjects with altered glucose in fasting and glucose
intolerant" (GAA + ITG). The fourth group was classified as "newly diagnosed DMT2
subjects" (RDMT2). The fifth group was classified as "subjects with long-term DMT2" (DMT2)
and finally the sixth group was classified as "subjects with DMT2 in critical condition"
(CDMT2).
Compounds in the exhaled breath of 38 individuals were identified by the CG-EM-DIF
chromatographic technique.
The study of the compounds of the 6 groups, comprising a large spectrum of DMT2
evolution, especially the groups with subjects at some stage of T2DM, strengthened the
selection of the potential biomarkers for DMT2 studied by Gallego (2016 ).
Of the compounds studied, it was found that 14 metabolites are potential biomarkers of
prediabetes. Some potential biomarkers of prediabetes are 2-butanone, 1-heptene and
p-xylene.
Some of the 14 metabolites were able to discriminate between both groups of
prediabetes studied. Among the potential biomarkers of prediabetes that meet this
condition are acetone and 1-propanol for the type of prediabetes GAA + ITG and
benzaldehyde for the type of prediabetes ITG.
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CAPITULO 1: INTRODUCCIÓN
El análisis de los metabolitos presentes en el aliento exhalado, actualmente, es un
tema de investigación bastante activo especialmente en Europa, Asia y Estados Unidos.
El propósito de este tipo de estudios es producir un método de diagnóstico no invasivo
en general. En particular en años recientes, se ha mostrado su efectividad en el
diagnóstico de patologías hepáticas, metabólicas y cánceres, principalmente.
(Amman, 2013)
El análisis del aliento exhalado se basa en el hecho de que, dentro del cuerpo
humano, existe una generación continua de compuestos volátiles. Estos compuestos,
también conocidos como metabolitos, son parcialmente emitidos a través del aliento
exhalado. Sin embargo estas exhalaciones se presentan en cantidades muy pequeñas
relativas al contenido del aliento total, esto es, en partes por mil millón, en comparación
con el CO2 y el vapor de agua. Estos compuestos volátiles contienen información
concerniente a las condiciones metabólicas y fisiológicas del sujeto bajo estudio.
(Amman 2013; Cao 2006)
Se ha probado que el análisis del aliento exhalado es un procedimiento
importante para la evaluación y monitoreo del desarrollo de una enfermedad al analizar
las cantidades de trazas moleculares de una muestra gaseosa conocida y al poder ser
asociadas con una patología en particular. (Amman 2013)
El método de análisis por aliento puede proveer, adicionalmente, una
herramienta complementaria para diagnósticos médicos convencionales de una
enfermedad, ya que es posible analizar, simultáneamente, centenas de compuestos
relacionados al metabolismo humano. (Pereira 2014)
Recientemente esta metodología ha sido aplicada para el diagnóstico de
enfermedades que son difíciles de diagnosticar de manera temprana, como la Diabetes
Mellitus tipo 2, dado a que en etapas tempranas es asintomática.
En México, una de las principales causas de muertes es la Diabetes Mellitus tipo II.
Cuando esta enfermedad es detectada y atendida en una etapa temprana mediante
una dieta balanceada y ejercicio, se puede prevenir sus complicaciones.
A pesar de la gran conveniencia del procedimiento, uno de los mayores retos es
el vincular, de manera inequívoca, los compuestos detectados y cuantificados, a las
vías metabólicas que se producen como resultado de la condición de salud o patología
en la que se encuentra el paciente.
Para la implementación exitosa de este método es necesario la estandarización
y definición de líneas basales de normalidad en una población.
12
En estudios anteriores dentro del equipo de trabajo del presente proyecto, se
logró definir los parámetros de control de una población normoglicémica en la Tesis:
“Análisis de Metabolitos Presentes en el Aliento, determinación de la línea basal” por A.
Gallego. En estos parámetros de control, además de obtener una distribución basal, se
logró una identificación tentativa de metabolitos asociados a la diabetes. (Gallego
2016)
El presente trabajo de tesis, se apoya en esta distribución basal y en los
metabolitos encontrados en sujetos diabéticos. La metodología de Gallego (2016) será
aplicada para estudiar, principalmente, a sujetos con prediabetes, que es una
condición que tiene gran relevancia para el diagnóstico de la diabetes de manera
temprana. Además, se aplicará la metodología al estudio de poblaciones
normoglicémicas, diabéticas de reciente diagnóstico, diabéticas de larga duración y
diabéticos críticos.
Se consideró como muestra de población normoglicémica a aquellos sujetos que
presentaran valores normales en las pruebas hematológicas aplicadas, de acuerdo a la
NOM-015 y la NOM-037 de la secretaria de salud de México y a los valores normales
establecidos por la Asociación Americana de Diabetes (ADA 2016)
Se consideró como muestra de población prediabética a aquellos sujetos que
presentaran una glucosa alterada en ayuno, intolerancia a los carbohidratos o la
presencia de ambos, de acuerdo a los valores de referencia de la NOM-015 de la
Secretaria de Salud Pública de México.
Se consideró como la muestra de población diabética reciente a aquellos sujetos
que fueron diagnosticados con diabetes por medio de la curva de tolerancia a la
glucosa, de acuerdo a los valores umbrales de referencia de la NOM-015 de la
Secretaria de Salud Pública de México. Al presentar valores umbrales, estos sujetos
apenas empiezan a presentar los síntomas de la enfermedad.
Se consideró como la muestra de población diabética de larga duración a
aquellos sujetos que fueron diagnosticados con diabetes por medio de glucosa en
ayuno o mediante niveles de hemoglobina glucosilada, de acuerdo a los valores de
referencia de la NOM-015 de la Secretaria de Salud Pública de México. Estos sujetos,
nunca habían sido diagnosticados, pero ya presentaban la enfermedad por un tiempo
prolongado.
Para la población de diabéticos críticos, se consideró a aquellos sujetos que
presentaran diabetes en un estado muy avanzado, es decir, que presentara y/o
superara los niveles reportados de glucosa capilar en la NOM-015.
La determinación de las condiciones de las personas voluntarias que participaron
en este proyecto fue realizada por el equipo de trabajo encabezado por la Dr. Adriana
Monroy Guzmán en el Hospital General de México.
13
El análisis de las muestras de aliento fue realizado en el Centro de Ciencias de la
Atmósfera, UNAM utilizando cromatografía de gases acoplada a detectores de
espectrometría de masas e ionización de flama (CG/EM-DIF).
La identificación y cuantificación de los compuestos se realizó tanto con la
inyección de estándares gravimétricos, como con el software ChemStation de Agilent
Technologies.
El estudio de correlaciones multivariado se llevó a cabo utilizando el software R.
El estudio de las poblaciones diabética y diabética crítica tiene como objetivo
reafirmar la identificación de los compuestos alterados, estudiados anteriormente, así
como mantener los límites, entre una población normoglicémica y diabética.
El presente trabajo de tesis tiene como objetivo identificar los compuestos que
presenten una diferencia en concentraciones que sea significativa entre poblaciones
normoglicémicas y prediabéticas, con la finalidad de marcar las bases de identificación
de la alteración metabólica conocida como prediabetes. Además de realizar un análisis
estadístico que permitirá presentar las correlaciones de los compuestos en ambas
poblaciones.
El desarrollo de este trabajo pretende contribuir al desarrollo de métodos que
permitan detectar de manera oportuna la prediabetes, padecimiento que cursa
asintomático.
14
CAPITULO 2: PLANTEAMIENTO DEL
PROBLEMA Y OBJETIVOS
2.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El análisis del aliento exhalado es un método de diagnóstico no invasivo que se
ha convertido, sobre todo en Europa, en un procedimiento importante en la evaluación
del estado de salud y el desarrollo de una enfermedad a través del análisis de trazas
moleculares presentes en muestras en fase gaseosa. (Amman 2013; Ramírez 2015)
Lo beneficioso de este método es que no hace falta punzar o extraer fluidos del
paciente para realizar un diagnóstico clínico. Además de lo anterior, simultáneamente,
proporciona de manera complementaria el análisis de decenas de metabolitos
relacionados al metabolismo humano. (Amman 2013; Ramírez 2015)
La diabetes es una alteración del metabolismo caracterizada por el aumento de
los niveles de glucosa en sangre (hiperglucemia), causada por un defecto de la
secreción de la hormona insulina por el páncreas. (Frenk 2011)
La diabetes es actualmente una de las primeras causas de muerte de los
mexicanos. Prevenirla y diagnosticarla a tiempo es de alta relevancia.
En México la mortalidad por diabetes ha mostrado un incremento sostenido
durante las últimas décadas, a una tasa de 15.5 defunciones por 100,000 habitantes.
Esto ha implicado que esta patología ha llegado a ocupar, desde 1997 el tercer lugar
de la mortalidad general y en ese lugar se mantuvo hasta 1999. En ese año ocurrieron
443,950 defunciones y de estas, 45,632 se debieron a diabetes. Esto representó un 10.3%
de las defunciones, con variaciones por entidad federativa que van de 6.2% en el
estado de Chiapas a 13.6% en el estado de Coahuila. (Frenk 2011)
Se ha estimado que la esperanza de vida de individuos con diabetes se reduce
entre 5 y 10 años con respecto a la media nacional que es de 72.6 años para hombres
y de 77.8 años para mujeres. En México, la edad promedio de las personas que murieron
por diabetes en 2010 fue de 66.7 años, lo que sugiere una reducción en la esperanza de
vida. (Hernández 2013)
El panorama resulta difícil de abordar, por lo que es necesario contar con
Programas de Acción Estatales, congruentes con los nacionales e internacionales. (Frenk
2011)
Dentro de la historia natural de la enfermedad se ha señalado un estado
metabólico previo que no corresponde a la diabetes pero que tampoco se ubica
dentro de la normalidad, es decir, se trata de un estado intermedio que se ha redefinido
15
como prediabetes. (ALAD 2009) A partir de este estadío, de no mediar acciones
preventivas, se evoluciona a la diabetes de manera explícita. Es por esto que es
fundamental identificar este estadío de la patología e implementar acciones
preventivas.
En decenas de estudios se ha demostrado que al identificar e intervenir en el estilo
de vida de las personas con prediabetes, es posible evitar la progresión a la diabetes
hasta en un 58% de los casos. Esto pone de manifiesto que el intervenir a los pacientes
en estado de pre-diabetes es posible evitar un deterioro progresivo o desaceleración
de la enfermedad. Es razonable anticipar que la detección y tratamiento de la
prediabetes sea una estrategia eficiente para lidiar con la epidemia de diabetes mellitus
y toda consecuencia médica, social y económica que esta conlleva. (ALAD 2009)
En estudios anteriores, en el mismo grupo de trabajo de esta tesis, se han
identificado compuestos que han logrado diferenciar a una población de sujetos sanos
con una población de sujetos diabéticos. Lo anterior apoya la idea de que es posible
identificar la diabetes en un estadío previo, es decir en la etapa prediabética,
otorgando la gran posibilidad de detener la progresión y/o emergencia de la
enfermedad. (Gallego 2016)
La motivación central de este proyecto de tesis consiste en contribuir con el
desarrollo de técnicas no invasivas y potencialmente socializables en su
implementación, para diagnosticar la prediabetes.
2.2 HIPÓTESIS
Es posible identificar potenciales biomarcadores de sujetos que presentan
prediabetes, por medio del análisis de su aliento alveolar. Para realizar esta
identificación es necesario contrastar los compuestos presentes en sujetos de control
con sujetos con prediabetes. El análisis del aliento de los sujetos muestreados tomará
como punto de partida a los compuestos identificados como potenciales
biomarcadores de la diabetes mellitus tipo 2 en el trabajo previo de Gallego (2016).
Además, es posible identificar y cuantificar las correlaciones que existan entre la
concentración de compuestos orgánicos volátiles de los 3 principales grupos de estudio
de este trabajo: sujetos de control, sujetos prediabéticos y sujetos diabéticos, otorgando
un gran espectro de información de la evolución de la enfermedad.
2.3 JUSTIFICACIÓN
La diabetes es una enfermedad crónica provocada por múltiples factores. Esta
enfermedad se coloca en la segunda causa de muerte en México. En su etapa inicial
no produce síntomas y cuando se detecta tardíamente y no se trata adecuadamente
16
ocasiona complicaciones de salud graves tales como: ceguera, falla renal, amputación
de extremidades y muerte prematura. Además, que es una enfermedad que reduce la
esperanza de vida por hasta por 10 años en la población mexicana. (Hernández 2013)
En México, los costos de atención por paciente van desde 700 hasta 3 200 dólares
anuales, alcanzando los 778 MM USD, lo que se traduce en 5 a 14% del presupuesto en
salud destinado a la atención de esta enfermedad y sus complicaciones. (Hernández
2013; Barquera 2013)
Es un hecho que la diabetes mellitus tipo 2 es una enfermedad prevenible, si se
realiza un diagnóstico en el estadio previo conocido como prediabetes. El desarrollar
métodos de diagnóstico temprano que se puedan aplicar en el sector salud pueden
aminorar el impacto que tiene la diabetes sobre la calidad de vida de la población
mexicana. (Hernández 2013)
2.4 OBJETIVO GENERAL
En base a los resultados obtenidos del trabajo de Gallego (2016), donde se
presentan compuestas como potenciales biomarcadores para la Diabetes Mellitus tipo
2, se pretende vincular estos mismos metabolitos, y probablemente nuevos, en un grupo
de personas prediabéticas. Este análisis se realiza con el propósito de especificar la
condición de prediabetes, al realizar un contraste entre los metabolitos de personas
normoglicémicas y los metabolitos presentes en personas prediabéticas. De esta forma
se logrará diagnosticar a la prediabetes de manera que se puedan realizar
intervenciones dirigidas a evitar al paciente el desarrollo de la diabetes.
Las actividades a realizar para cumplir este propósito son:
La implementación de una técnica no invasiva para detectar a la prediabetes
por medio del análisis de compuestos orgánicos volátiles presentes en el aliento
exhalado.
La aplicación de bases metodológicas, de métodos de recolección y de análisis
de muestras. Estas actividades fueron desarrolladas anteriormente en el grupo de
trabajo.
Realizar el análisis, contrastaste y correlación de datos cualitativos y cuantitativos
de los compuestos presentes en el aliento de los grupos de sujetos de estudio.
17
2.5 OBJETIVOS PARTICULARES
Implementar el protocolo de toma de muestras de aliento alveolar y evaluar la
repetibilidad de los métodos llevados a cabo anteriormente en el grupo.
Implementar y optimizar el sistema portátil de toma de muestras de aliento
alveolar del trabajo anterior.
Realizar la identificación y cuantificación directa e indirecta de compuestos
orgánicos volátiles presentes en pacientes normoglicémicos, prediabéticos y diabéticos,
mediante cromatografía de gases acoplado a detectores de ionización de flama y
espectrómetro de masas.
Realizar un análisis estadístico de los metabolitos de interés en las poblaciones de
estudio que permita establecer una correlación entre metabolitos específicos y un
estadío particular de prediabetes. Lo anterior también permitirá establecer intervalos de
confiabilidad entre las diferentes patologías de diabetes y prediabetes.
Realizar el análisis de componentes principales de los compuestos de interés de
las poblaciones de estudio, y constatar que el grupo de prediabetes se encuentra
aislado del espectro, adquirido por Gallego (2016), entre personas normoglicémicas y
diabéticas.
18
CAPITULO 3: ANTECEDENTES
3.1 FUNDAMENTOS DEL METABOLISMO HUMANO
El metabolismo consiste en todas aquellas transformaciones químicas que sufren
los nutrientes con fines de obtención de energía, manipulación de la materia por parte
de las células y obtención de elementos estructurales o reguladores de las funciones
biológicas. El metabolismo humano es una actividad química altamente coordinada
que mantiene el estado vital. (Guyton 2011)
A las sustancias que se originan como resultado del metabolismo a partir de la
digestión u otros procesos químicos corporales se les conoce como metabolitos.
Los centenares de reacciones químicas que integran el metabolismo están articulados
en largas secuencias de reacciones consecutivas ligadas entre sí por intermediarios
comunes, de manera que el producto de cada reacción resulta en el sustrato o reactivo
de la siguiente. Estas secuencias de reacciones reciben el nombre de rutas metabólicas.
La existencia de un intermediario común entre dos reacciones consecutivas hace
posible la transferencia de energía química entre ellas. (Guyton 2011)
Las rutas metabólicas a su vez están organizadas en un complejo entramado en
el que unas están conectadas con otras a través de encrucijadas metabólicas, en las
cuales hay un metabolito común a dos o más rutas. (Guyton 2011)
Figura 3.1 Rutas metabólicas. Sin entrar en detalles, el propósito de esta imagen es el de ilustrar
la complejidad tan grande de las rutas metabólicas humanas. (KEGG Encyclopedia of Genes
and Genome 2017)
19
En el metabolismo se incluyen dos fases principales de las cuales derivan las
principales vías metabólicas: el catabolismo y el anabolismo.
El catabolismo es una de las fases donde las moléculas orgánicas complejas y
relativamente grandes se degradan para dar lugar a moléculas de estructura más
simple y menor tamaño con la finalidad de obtener energía. Este proceso degradativo,
supone una oxidación y además es exergónico ya que va acompañado de la liberación
de la energía química inherente a la estructura de las moléculas orgánicas que se
degradan. (Guyton 2011)
El anabolismo es la segunda fase y es un proceso endergónico que emplea
energía química donde se realizan procesos biosintéticos para formar diversas
biomoléculas, tales como los ácidos nucleicos, proteínas, polisacáridos y lípidos a partir
de moléculas precursoras de estructura más sencilla y menor tamaño. (Guyton 2011)
El cuerpo humano es una máquina que necesita disponer de “combustible” en
forma de energía química. Esta energía es utilizada para el trabajo físico, para obtener
calor y mantener así la temperatura corporal, para la construcción de sus propias
estructuras, utilizando para ello numerosas reacciones biosintéticas, y para transportar
un elevado número de sustancias a través de las membranas celulares. (Guyton 2011)
Un combustible metabólico puede definirse como un compuesto circulante que
es tomado por los tejidos para la producción de energía. Existen dos tipos de
combustibles para el organismo: exógenos, derivados de la ingesta de alimentos, y
endógenos, derivados directamente de los almacenes tisulares (como el glucógeno y
los triglicéridos) o de la oxidación incompleta de otros combustibles (como el lactato o
los cuerpos cetónicos). (Guyton 2011)
Los principales órganos y tejidos implicados en el metabolismo son el hígado, el
músculo, el cerebro, el tejido adiposo y los eritrocitos.
El hígado tiene un papel fundamental ya que es el principal responsable del
mantenimiento del equilibrio metabólico interinsular. Entre sus tareas se encuentra el
mantenimiento de la glucemia, sintetizan los principales derivados nitrogenados de los
aminoácidos, regular el aporte de los diferentes nutrientes a los demás tejidos de
acuerdo con la composición de la dieta y las demás circunstancias fisiológicas, síntesis
utilización de las diferentes lipoproteínas sanguíneas, síntesis de los compuestos
cetónicos a partir de los ácidos grasos y además eliminar residuos producidos por el
cuerpo y sustancias toxicas que se ingieren. (Guyton 2011)
Además de aprovechar los productos metabólicos, el cuerpo necesita excretar
los productos secundarios del metabolismo y demás sustancias tóxicas. Las vías de
excreción principales son el riñón, el pulmón y el sistema hepatobiliar.
El riñón es el órgano más importante para la excreción de la mayoría de las
sustancias y el pulmón lo es para gases y compuestos volátiles. Las sustancias excretadas
eliminadas en las heces son principalmente componentes ingeridos no absorbidos o
20
metabolitos excretados en la bilis y no reabsorbidos en el tubo intestinal. Las vías de
menos cuantía en términos de excreción son las glándulas salivales, el estómago, el
intestino, el colon, las glándulas sudoríparas, la mama, las glándulas lagrimales, el pelo y
la piel. (Guyton 2011)
3.2 FUNDAMENTOS DE LA RESPIRACIÓN E INTERCAMBIO GASEOSO
La respiración es la acción de introducir aire fresco dentro de los bronquiolos,
ductos alveolares y atrios de los pulmones.
Las cuatro funciones principales de la respiración son: 1) la ventilación pulmonar,
que se refiere al flujo de entrada y salida de aire entre la atmosfera y los alveolos
pulmonares; 2) la difusión de oxígeno y de dióxido de carbono entre los alvéolos y la
sangre; 3) el transporte de oxígeno y de dióxido de carbono en la sangre y los líquidos
corporales hacia las células de los tejidos corporales y desde las mismas, y 4) la
regulación de la ventilación. (Guyton 2011)
La función de la ventilación pulmonar es renovar continuamente el aire de las
zonas de intercambio gaseoso de los pulmones, en las que el aire está próximo a la
sangre pulmonar. Estas zonas incluyen los alveolos, los sacos alveolares, los conductos
alveolares y los bronquiolos respiratorios. (Guyton 2011)
Parte del aire que respira una persona nunca llega a las zonas de intercambio
gaseoso, sino que simplemente llena las vías aéreas en las que no se produce
intercambio gaseoso, como la nariz, la faringe y la tráquea. Este aire se denomina aire
del espacio muerto, porque no es útil para el intercambio gaseoso. (Guyton 2011)
Durante la espiración se expulsa primero el aire del espacio muerto, antes de que
el aire procedente de los alveolos llegue a la atmosfera. Por tanto, el espacio muerto es
muy desventajoso para retirar los gases espiratorios de los pulmones. (Guyton 2011)
El volumen de aire normal del espacio muerto de un varón adulto joven es de
aproximadamente 150 ml. Este valor aumenta ligeramente con la edad. (Guyton 2011)
La capacidad pulmonar total es el volumen máximo al que se pueden expandir
los pulmones con el máximo esfuerzo posible (aproximadamente 5.800 ml); es igual a la
capacidad vital más el volumen residual. (Guyton 2011)
Todos los volúmenes y capacidades pulmonares son aproximadamente un 20-
25% menores en mujeres que en varones, y son mayores en personas de constitución
grande y atléticas que en personas de constitución pequeña y asténicas. (Guyton 2011)
Después de que los alveolos se ventilan con aire limpio, la siguiente fase del
proceso respiratorio es la difusión del oxígeno desde los alveolos hacia la sangre
21
pulmonar y la difusión del dióxido de carbono en la dirección opuesta, desde la sangre.
El proceso de difusión se aplica para todos los gases importantes en la fisiología
respiratoria y se define como el movimiento aleatorio de moléculas en todas las
direcciones a través de la membrana respiratoria y los líquidos adyacentes. Esto también
se aplica a los gases que están disueltos en los líquidos y en los tejidos del cuerpo.
(Guyton 2011)
Para que se produzca la difusión debe haber una fuente de energía. Esta
procede del movimiento cinético de las propias partículas.
La presión es producida por múltiples impactos de partículas en movimiento
contra una superficie. Por tanto, la presión de un gas que actúa sobre las superficies de
las vías respiratorias y de los alveolos es proporcional a la suma de las fuerzas de los
impactos de todas las moléculas de ese gas que chocan contra la superficie en
cualquier momento dado. Esto significa que la presión es directamente proporcional a
la concentración de las moléculas del gas. (Guyton 2011)
La difusión neta de un gas en una dirección es efecto de un gradiente de
concentración. Si una cámara de gas o una solución tiene una concentración elevada
de un gas particular en un extremo de la cámara y una concentración baja en el otro
extremo, se producirá difusión neta del gas desde la zona de concentración elevada
hacia la zona de concentración baja. (Guyton 2011)
En fisiología respiratoria se manejan muestras de gases en mezclas,
principalmente de oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono. La velocidad de difusión
de cada uno de estos gases es directamente proporcional a la presión que genera ese
gas solo, que se denomina presión parcial de ese gas. (Guyton 2011)
Los gases disueltos en agua o en los tejidos corporales también ejercen una
presión, porque las moléculas de gas disuelto se mueven de manera aleatoria y tienen
energía cinética. Además, cuando el gas disuelto en el líquido entra en contacto con
una superficie, como la membrana de una célula, ejerce su propia presión parcial de la
misma manera que un gas en la fase gaseosa. Las presiones parciales de diferentes
gases disueltos se denominan de la misma manera que las presiones parciales en
estado gaseoso. (Guyton 2011)
La presión parcial de cada uno de los gases en la mezcla de gas respiratorio
alveolar tiende a hacer que las moléculas de ese gas se disuelvan en la sangre de los
capilares alveolares. Por el contrario, las moléculas del mismo gas que ya están disueltas
en la sangre están rebotando de manera aleatoria en el líquido de la sangre, y algunas
de estas moléculas que rebotan escapan de nuevo hacia los alveolos. (Guyton 2011)
La velocidad a la que escapan es directamente proporcional a su presión parcial
en la sangre. La dirección de la difusión neta está determinada por la diferencia entre
las dos presiones parciales. Si la presión parcial es mayor en la fase gaseosa de los alveolos, como ocurre normalmente en el caso del oxígeno, entonces más moléculas
difundirán hacia la sangre que en la otra dirección. Por otro lado, si la presión parcial del
22
gas es mayor en el estado disuelto en la sangre, como ocurre normalmente en el caso del dióxido de carbono, la difusión neta se dirigirá hacia la fase gaseosa de los alveolos.
(Guyton 2011)
La unidad respiratoria está formada por un bronquíolo respiratorio, los conductos
alveolares, los atrios y los alvéolos. Hay aproximadamente 300 millones de alveolos en
los dos pulmones, y cada alveolo tiene un diámetro medio de aproximadamente
0,2 mm. Las paredes alveolares son muy delgadas y entre los alveolos hay una red casi
solida de capilares interconectados. De hecho, debido a lo extenso del plexo capilar,
se ha descrito que el flujo de sangre en la pared alveolar es una lámina de sangre que
fluye. Así, es evidente que los gases alveolares están muy próximos a la sangre de los
capilares pulmonares. Además, el intercambio gaseoso entre el aire alveolar y la sangre
pulmonar se produce a través de las membranas de todas las porciones terminales de
los pulmones, no solo en los propios alveolos. Todas estas membranas se conocen de
manera colectiva como la membrana respiratoria, también denominada membrana
pulmonar. (Guyton 2011)
El aire alveolar no tiene en modo alguno las mismas concentraciones de gases que el
aire atmosférico Hay varias razones para estas diferencias. Primero, el aire alveolar es
sustituido solo de manera parcial por aire atmosférico en cada respiración. Segundo, el
oxígeno se absorbe constantemente hacia la sangre pulmonar desde el aire pulmonar.
Tercero, el dióxido de carbono se está difundiendo constantemente desde la sangre
pulmonar hacia los alveolos. Y cuarto, el aire atmosférico seco que entra en las vías
respiratorias es humidificado incluso antes de que llegue a los alveolos. (Guyton 2011)
3.3 VOLÚMENES DENTRO DEL CUERPO HUMANO Y EN CONDICIONES AMBIENTALES
La medición de un volumen gaseoso se realiza a la presión y temperatura
registradas en el equipo, donde las moléculas gaseosas se encuentran a presión y
temperatura ambiente (PTA). Además, el gas expirado se encuentra saturado con vapor
de agua, que se le conoce como temperatura ambiente, presión y saturación. Las
condiciones ambientales varían a lo que los volúmenes necesitan ser convertido a
condiciones estándar, las cuales para propósitos generales se obtiene del pulmón. En el
pulmón, el gas se encuentra a temperatura, presión y saturación corporal. En el sistema
tradicional de unidades, la cantidad de gas es reportada como un volumen bajo
condiciones estándar (T=0° C, P=101.3 kPa y saturación 0 por la eliminación del vapor
de agua). Un volumen en estas unidades se encuentra a temperatura y presión en seco.
(11)
La relación del volumen de un gas con la presión es descrita por la ley de Boyle
que establece que a una temperatura constante un volumen gaseoso es inversamente
proporcinal a su presión. (Cotes 2006)
23
La relación de un volumen con la temperatura ambiente es el tema de la ley de
Charles que establece que a una presión constante, el volumen de un gas es
proporcional a su temperatura absoluta. (Cotes 2006)
Estas dos ecuaciones son combinadas en la ecuación general de gases que
representa que para una masa dada para dos condiciones fijas. (Cotes 2006)
𝑃1𝑉1
𝑇1= 𝑃2
𝑉2
𝑇2 Ec. 1
Esta ecuación es usada para convertir volumenes a condiciones corporales (Ec.
2) o condiciones estandar (Ec. 3) de una medida hecha en condiciones ambientales.
𝑉𝐵𝑇𝑃𝑆 = 𝑉𝐴𝑇𝑃 ∗273+37
273+𝑡∗
𝑃𝐵−𝑃𝐻2𝑂(𝑡)
𝑃𝐵−𝑃𝐻2𝑂(37) Ec. 2
𝑉𝑆𝑇𝑃𝐷 = 𝑉𝐴𝑇𝑃 ∗273
273+𝑡∗𝑃𝐵−𝑃𝐻2𝑂(𝑡)
𝑃𝐵,𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑 Ec. 3
Donde V es el volumen del gas bajo las condiciones especificadas, t es la
temperatura ambiental y 37 es la temperatura del cuerpo en grados celcius, PB es la
presión barométrica y PH2O es la presión del vapor acuoso a la temperatura indicada.
(Cotes 2006)
La relación entre la presión de un gas y la cantidad en una solución bajo
condiciones de equilibrio es descrita por la ley de Henry. Esta postula que la cantidad
de gas disuelto en un líquido es proporcional a la presión parcial del gas en contacto
con el líquido siempre que no haya una reacción química. La cantidad varia con la
temperatura y debe ser especificada. (Guyton 2011; Cotes 2006)
La ley de Henry es usada para describir consecuencias de la exposición a
cambios barométricos de presión. (Guyton 2011; Cotes 2006)
3.4 PATOLOGÍAS DETECTABLES POR VOCs
Muchos de los compuestos orgánicos volátiles (COV) generados por el
metabolismo se encuentran en el aliento exhalado de los humanos. La composición de
este aliento es influenciada por varios factores. El principal factor radica en que el aliento
exhalado refleja la composición volátil del torrente sanguíneo. Demás factores se
relacionan con la composición del aire inhalado, los alimentos con constituyentes
volátiles, la dieta y su influencia en el metabolismo, la influencia de los procesos
metabólicos normales y relacionados a la enfermedad, el microambiente en los
pulmones, intestinos y cavidad oral, y las diferencias genéticas y/o fenotípicas. (Amman
2013;Amann 2014; Lourenço 2014; Fenske 1999; Phillips 1999)
24
A pesar de que el aliento es una mezcla muy compleja, existen diversas maneras
de extraer información específica de una muestra de aliento exhalado.
El mayor provecho del diagnóstico basado en el análisis de aliento radica en que
puede ofrecer una metodología no invasiva, en tiempo real y que puede monitorear el
estado metabólico del individuo.
En la actualidad se estima que existen más de 3000 COVs representados en
menos de 100 partes por millón (ppm) en el volumen total de aliento exhalado de los
seres humanos. (Amman 2013;Amann 2014; Lourenço 2014; Fenske 1999; Phillips 1999)
Entre los COVs más abundantes se encuentra la acetona, el isopreno y el
propanol, medidos en cantidades de apenas una fracción de ppm mientras que las
cetonas, aldehídos y el pentano se encuentran en concentraciones de partes por billón
(ppb) o partes por trillón (ppt). (Amman 2013;Amann 2014; Lourenço 2014; Fenske 1999;
Phillips 1999)
En la actualidad existen unos pocos exámenes clínicos ratificados que emplean el
análisis del aliento exhalado, entre ellos se encuentran: (Amman 2013)
La prueba de dióxido de carbono en la respiración o capnografía
La prueba de monóxido de carbono para ictericia neonatal
La prueba de hidrógeno para detectar deficiencia de disacaridasa, el tiempo de
tránsito intestinal, sobre crecimiento bacteriano, estasis intestinal.
La prueba de óxido nítrico para la terapia del asma.
La prueba de aliento para la detección del rechazo del trasplante de corazón.
Ciertamente, la popularidad para emplear el análisis diagnóstico basado en el
análisis de aliento se ha ido incrementando, al igual que las técnicas empleadas para
su análisis.
3.5 PERSPECTIVAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES POR VOCS EN EL
FUTURO
Entre las enfermedades que se han estudiado se encuentra una extensa lista que
incluyen: Enfermedades oncológicas, enfermedades pulmonares, enfermedades
cardiovasculares, fallas digestivas, fallas renales crónicas, enfermedades hepáticas (que
incluyen a la diabetes), infecciones por helicobacter pilori y Schizophrenia. (Pereira 2014)
Dentro de las técnicas más populares para el análisis del aliento se encuentran:
La cromatografía de gases, la espectroscopía por reacción de transferencia de
protones, la selección de iones en tubo de flujo, la espectroscopía láser y sensores
químicos. (Pereira 2014)
25
Los métodos de clasificación de compuestos y aproximaciones estadísticas más
empleados en el análisis del aliento humano son: el análisis de componentes principales,
el análisis de varianza, el análisis de discriminantes lineales, el análisis de datos
multivariados y el análisis de reconocimiento de patrones entre otros. (Pereira 2014)
En la Tabla 1 se presentan las enfermedades más notorias y las técnicas aplicadas
en el análisis de aliento.
Tabla 1. Caracterización de compuestos orgánicos volátiles seleccionados del aliento
exhalado reportados en la literatura (Pereira 2014)
Enfermedad Compuestos (biomarcadores putativos) Metodologías empleadas
Cáncer de
pulmón
* 1-octano * Isopreno
* Acetona * Metanol
* Pentano * Heptano
* Estireno * 2-butanone
* 2-hidroxiacetaldehido *Formaldehido
* 3-hidroxi 2-butanona * Hexanal
* 4-hidroxihexanal * Nonanal
* Pentanal * Octanal
*Patrones de VOCs
* MEFS/CG-EM
* RTP-EM/CG-EM
* Nanoarreglos químicos
* TF-RCI-EM
* RTP-EM
* DSF-MEFS/CG-EM
* CG-DIF
* e-nose
* sensores colorimétricos
* nanopartículas de oro
* sensor de gas SAW virtual
Mesotelioma *Ciclopentano *Ciclohexano
*Patrones de VOCs
* e-nose
* DT-CG-EM
Cáncer de
mama
* Nonano * 5-metiltridecano
* 3 metilundecano * Undecano
* 2 metilpropano * Dodecano
* 2 metiloctano * Tridecano
* Tetradecano * Pentadecano
* 1-yodo nonano * Hexanal
* Heptanal * Octanal
* Nonanal * d- limoneno
* 4-metildodecano * 2,3,4-trimetildecano
* 6-metilpentadecano * 3,3-dimetil pentano
*5,2-metilpropilnonano * 3-metilnonadecano
* 2,5,8,1-isopropilmetilamino * Perfil de COVs
* Patrón de reconocimiento de COVs
* e-nose
* TD-CG-EM
* Dispositivo POC
* CG-EM
Cáncer
colonrectal
* Decanal * 1,2-pentadieno
* Ciclohexano * metilciclohexane
*4-metiloctane * 1,3-dimetilbenceno
* COVs discriminantes
* CG-EM
* MEFS/CG-EM
Cáncer gástrico * COVs discriminantes * Sensores
* CG-EM
Cáncer de
cabeza y cuello
* COVs discriminantes
* Patrón de reconocimiento de COVs * e-nose
* CG-EM
26
Continuación Tabla 1
Cáncer de
hígado
* 2,3-dihidrobenzofurano * ácido acético
* cloruro de metanosulfurilo * etanol
* 1-octen-3-ol * hexanal
* 3,2-hidroxibutanona * octano
* estireno * decano
* Sensores
* CG-EM
* MEFS/CG-EM
Inflamación de
vías aéreas
* Patrón de reconocimiento de COVs * e-nose
Asma
* Decano * 2,3,6 trimetildecano
* Tetradecano *2,1,3-metilbutadieno
* 2,2-dimetilhexano * Nonano
* Dodecano * 2,4 dimetiloctano
* 2,2,4,6,6-pentametil- * 3,6-dimetildecano
heptano * Patrones de COVs
* COVs discriminantes
* e-nose
* CG-EM
* CG-TDV-EM
Dificultad
respiratoria
aguda
* octano * acetaldehído
* 3-metilheptano * acetona
* isopreno * n-pentano
* CG-EM
* CG-DIF/CG-EM
Embolismo
pulmonar
* Patrones de reconocimiento de COVs * e-nose
Tuberculosis
pulmonar
* alcanos y derivados * ciclohexano
* Derivados del benceno
* Patrones de reconocimiento de COVs
* CG-EM
* Dispositivos POC
* TD-CG-SAW
EPCO/enfisema
* Etano * MDA
* Hexanal * Heptanal
* Espectro de masas * Perfil de COVs
* Patron de reconocimiento de COVs
* CG-DIF
* CL-EM/EM
* RTP-EM
* e-nose
* CMC/EMI
Fibrosis cística
* pentano * dimetil sulfuro
* carbonil sulfuro * carbón disulfuro
* etano
* CG-EM
* CG-DIF
Insuficiencia
cardiaca
* Acetona * Pentano
* Isopreno * Trimetil amino
* TSIF-EM
* CG-EM
* CG
Malsorción de
carbohidratos
* Etanetiol * dimetilsulfuro * RTP-EM
Cirrosis hepatica * 2-butanona * metanol
* heptadienol * monoterpenos
* RTP-TDV-EM
Higado graso
* acetona * Isopreno *
Trimetilamina * Acetaldehído
* Pentano
* TSIF-EM
Hepatitis
alcoholica
* 2-propanol * Acetaldehído
* Acetona * Etanol
* Pentano * trimetilamina
* TSIF-EM
Academia
propionica
* 3-heptanona * RTP-EM
* CG-EM
Diabetes
mellitus
* acetona * Isopropanol
* Tolueno * 2,3,4 trimetilhexano
* m-xileno * 2,6,8 trimetildecano
* Tridecano * Undecano
* Patrón de reconocimiento de COVs
* MEFS/CG-EM
* TSIF-EM
* Espectroscopía láser
* e-nose
* CG-EM
27
Continuación Tabla 1
Fallas renales
crónicas
* NO
* TMA
* Uraemia
* Patrón de reconocimiento de COVs
* ozono
* Quimioluminiscencia
* DT-CG-EM
* EMI/CG-EM
* e-nose
Infección por helicobacter
pylori
* 13CO2/12CO2 * Espectroscopía Ring
Down de cavidad (IRC)
Abreviaciones DT—Desorción térmica; EPCO—Enfermedad Pulmonar crónico obstructiva; MVC—método de validación cruzada; e-nose—Nariz electrónica; CL-EM—Cromatografía líquida-Espectrometría de masas; TF-RCI-EM—Transformada de Fourier- Resonancia ciclotrónica de iones-Espectrometría de masas; CG/EM—Cromatografía de gases/Espectrometría de masas; RTP-TDV-EM—Reacción por transferencia de protones-Tiempo de vuelo-
Espectrometría de masas; CMC-EMI—Columna multicapilar-Espectrometría de movilidad iónica; RTP-EM–
Reacción por transferencia de protones-Espectrometría de masas; TSIF-EM—Tubo de selección de iones con flujo-Espectrometría de masas; MEFS—Microextracción de fase sólida; EMI—Espectrometría de movilidad iónica; MEFS-DSF—Microextracción de fase sólida con Derivación sobre fibras; IRC—Infrarrojo cercano; COVs—compuestos orgánicos volátiles.
3.6 DIABETES
La diabetes es una alteración del metabolismo caracterizada por el aumento de
los niveles de glucosa en sangre (hiperglucemia), causada por un defecto de la
secreción de la hormona la insulina que es producida en el páncreas.
En una persona no diabética los niveles de glucosa en la sangre se mantienen
dentro de unos límites normales muy estrechos, sobrepasando muy rara vez los 100
mg/dl. Cuando una persona no diabética ingiere alimentos, los azúcares que éstos
contienen se absorben desde el intestino y pasan a la sangre, tendiendo a elevar los
niveles de glucosa en ésta. Tal tendencia a la elevación es inmediatamente detectada
por las células productoras de insulina que responden con una secreción rápida de esta
hormona. La insulina, permitirá la entrada de glucosa a las células y disminuirá su nivel
en la sangre. Una vez que la glucosa ha entrado en los tejidos, es metabolizada y
produce energía que es utilizada para mantener las funciones de los órganos y su
estructura. (Frenk 2011)
En una persona con diabetes, la producción de la insulina está tan disminuida
que se altera todo el mecanismo regulador: las elevaciones de la glucosa sanguínea no
son seguidas por un aumento suficiente de la insulina, la glucosa no puede penetrar en
las células y su cantidad continúa elevándose. Los síntomas característicos por al
aumento de la glucosa en la sangre, debido a la falta de insulina son: poliuria, polidipsia,
polifagia, adelgazamiento y astenia. (Frenk 2011)
Las complicaciones de la diabetes pueden llegar a ser problemas de salud
incapacitantes y potencialmente mortales dado que los niveles de glucosa en sangre
consistentemente altos pueden llevar a enfermedades serias que afecten el corazón y
los vasos sanguíneos, los ojos, riñones y los nervios. Las personas con diabetes tienen un
28
mayor riesgo de desarrollar infecciones y son objeto de amputaciones de las
extremidades inferiores, principalmente. (FID 2015)
Los tipos de diabetes se describen brevemente a continuación:
• Diabetes gestacional: Es la hiperglucemia que se detecta por primera vez en
cualquier momento durante el embarazo puede ser clasificada como
gestacional o en el embarazo. Las mujeres con niveles de glucosa ligeramente
elevados son clasificadas como que tienen diabetes gestacional, mientras que
las mujeres con niveles de glucosa en la sangre sustancialmente elevados son
clasificadas como que tienen diabetes mellitus en el embarazo. La diabetes
gestacional normalmente desaparece tras el parto. Sin embargo, las mujeres que
han sido diagnosticadas con ella corren un mayor riesgo de desarrollar diabetes
gestacional en otros embarazos, así como diabetes tipo 2 más tarde en la vida.
Los bebés que nacen de madres con diabetes gestacional también corren un
mayor riesgo de desarrollar diabetes tipo 2 en su adolescencia y juventud. (FID
2015)
• Diabetes monogénica, Es el resultado de una mutación genética.
Ejemplos de diabetes monogénica incluyen diabetes de aparición en la madurez
de los jóvenes y diabetes mellitus neonatal. (FID 2015)
• La diabetes secundaria, que surge como una complicación de otras
enfermedades, como trastornos hormonales o enfermedades del páncreas. (FID
2015)
• Diabetes tipo 1: Es causada por una reacción autoinmune, en la que el sistema
de defensa del cuerpo ataca las células-beta productoras de insulina en el
páncreas. Como resultado, el cuerpo ya no puede producir la insulina que
necesita. La enfermedad puede afectar a personas de cualquier edad, pero la
aparición normalmente ocurre en niños y jóvenes adultos. Las personas con esta
forma de diabetes necesitan de insulina todos los días para controlar los niveles
de glucosa en la sangre y poder vivir. (FID 2015)
• Diabetes tipo 2: en ésta, el cuerpo es capaz de producir insulina, pero se vuelve
resistente a ella, de modo que la insulina es ineficaz. Con el tiempo, los niveles de
insulina pueden llegar a ser insuficientes Tanto la resistencia, como la deficiencia
de insulina pueden llevar a niveles de glucosa en sangre altos. (FID 2015)
Muchas personas con diabetes tipo 2 no son conscientes de su condición durante
mucho tiempo porque los síntomas suelen ser menos marcados que en la diabetes tipo
1 y pueden tardar años en ser reconocidos. Sin embargo, durante este tiempo el cuerpo
ya está siendo dañado por el exceso de glucosa en sangre. Como resultado, muchas
personas ya presentan complicaciones cuando se les diagnostica con diabetes tipo 2.
Existen varios factores de riesgo importantes, los más importantes son el
sobrepeso, la inactividad física y la nutrición pobre. Otros factores que juegan un papel
importante son la etnicidad, historial familiar de diabetes, historial pasado de diabetes
gestacional y edad avanzada. (FID 2015)
29
En contraste con las personas con diabetes tipo 1, muchas personas con diabetes
tipo 2 no requieren tratamiento diario de insulina para sobrevivir. El pilar del tratamiento
de la diabetes tipo 2 es la adopción de una dieta sana, aumentar la actividad física y
mantener un peso corporal normal. (FID 2015)
El número de personas con diabetes tipo 2 está aumentando rápidamente en el mundo.
Este aumento está asociado con el envejecimiento de la población, el desarrollo
económico, el aumento de la urbanización, las dietas menos saludables y la disminución
de la actividad física. (FID 2015)
3.7 PREDIABETES
La asociación americana de diabetes define a la prediabetes como un estado que
precede al diagnóstico de diabetes tipo 2. Esta condición en común, está en aumento
epidemiológico y se caracteriza por elevación en la concentración de glucosa en
sangre más allá de los niveles normales sin alcanzar los valores diagnósticos de diabetes.
Tabla 2.
La prediabetes se puede identificar a través de una prueba oral de tolerancia a la
glucosa (Intolerancia a la Glucosa, ITG) o a través de la glucemia en ayunas (Glucosa
Alterada en Ayuno, GAA). (ALAD 2009; FID 2015; NSW 2012)
La mayoría de las personas con cualquiera de las dos condiciones desarrollará
diabetes manifiesta dentro de un período de 10 años. (ALAD 2009; FID 2015; NSW 2012)
Tanto la GAA como la ITG están íntimamente relacionadas con el Síndrome
Metabólico y no tan solo indican alto riesgo para el desarrollo de diabetes manifiesta.
También, y en forma similar al Síndrome Metabólico, estas alteraciones indican riesgo de
enfermedad vascular ateroesclerótica. (ALAD 2009; FID 2015; NSW 2012)
La Glucosa Alterada en Ayuno (GAA) es una condición en que los niveles de
glucosa en la sangre en ayuno son mayores a los normales, pero no lo suficiente para
diagnosticar diabetes mellitus tipo 2. (ALAD 2009; FID 2015; NSW 2012)
Esta ocurre cuando se libera demasiada glucosa en el torrente sanguíneo del
hígado durante la noche. El hígado es el principal responsable del suministro adecuado
de glucosa en la sangre cuando se presenta un ayuno. Cuando se presenta la glucosa
alterada en ayuno, el hígado no responde normalmente a la insulina, llamando a esta
condición resistencia a la insulina hepática. Esto da por resultado demasiada glucosa
en la sangre al despertar. (ALAD 2009; FID 2015; NSW 2012)
La Intolerancia a la Glucosa (ITG) es una condición donde los niveles de glucosa
en la sangre dos horas después de una carga con 75 g de glucosa son elevados a lo
normal, pero no lo suficiente para diagnosticar diabetes mellitus tipo 2. (ALAD 2009; FID
2015; NSW 2012)
30
Esta ocurre cuando la insulina producida no trabaja apropiadamente o no hay
la insulina suficiente para satisfacer la demanda o una combinación de ambos. Esto
resulta en demasiada glucosa en la sangre durante el día y después de la ingesta de
alimentos o al despertar o una combinación de los tres. (ALAD 2009; FID 2015; NSW 2012)
Tabla 2. Recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud para los criterios para la
diabetes e hiperglucemia intermedia (2006) (FID 2015)
La diabetes debe ser diagnosticada cuando
se cumplen uno o más de los siguientes
criterios:
Glucosa plasmática tras dos horas de
una carga oral de 75 g de glucosa
7,8-11,1 mmol/l (140-200 mg/dl)
Glucosa plasmática en ayunas ≥
7,0 mmol/l (126 mg/dl)
La Glucosa en Ayuno Alterada debe ser
diagnosticada si se cumple el siguiente
criterio
Glucosa plasmática tras dos horas ≥
11,1 mmol/l (200 mg/dl) tras una
carga oral de 75g de glucosa
Glucosa plasmática en ayunas de
6,1-6,9 mmol/l (110-125mg/dl
La tolerancia a la Glucosa Alterada (TGA)
debe ser diagnosticada si se cumplen el
siguiente criterio
3.8 PROBLEMÁTICA DE LA DIABETES EN MEXICO Y EL MUNDO
La diabetes es una de las mayores emergencias de salud del siglo XXI. La
Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que, en el mundo, la glucosa en sangre
alta es el tercer factor de riesgo principal para la mortalidad prematura, después de la
presión arterial alta y el consumo de tabaco. Muchos gobiernos y profesionales de la
salud pública, continúan no siendo conscientes del impacto actual de la diabetes y sus
complicaciones. (FID 2015)
En muchos estudios, una proporción sustancial de aquellos con diabetes no han
sido diagnosticados previamente. Muchas personas continúan sin ser diagnosticadas,
porque con frecuencia hay pocos síntomas en los primeros años de la diabetes tipo 2 o
síntomas que ocurren, pero no son reconocidos como ligados a la diabetes. (FID 2015)
En todos los países hay personas que viven con diabetes. Sin una prevención
efectiva y programas de control, el impacto continuará aumentando en el mundo. (FID
2015)
Unos 415 millones de personas en el mundo, o el 8,8% de adultos entre las edades
de 20-79 años se estima que tienen diabetes. Si estas tendencias continúan, en 2040
unos 642 millones de personas, o uno entre diez adultos, tendrá diabetes. (FID 2015)
De acuerdo con la Federación Internacional de Diabetes (FID,2015), China, India,
Estados Unidos, Brasil, Rusia y México, son los países con mayor número de diabéticos.
31
Se ha estimado que la esperanza de vida de individuos con diabetes se reduce
entre 5 y 10 años. En México, la edad promedio de las personas que murieron por
diabetes en 2010 fue de 66.7 años, lo que sugiere una reducción de 10 años. (Hernández
2013)
El desafío para la sociedad y los sistemas de salud es enorme, debido al costo
económico y la pérdida de calidad de vida para quienes padecen diabetes y sus
familias, así como por los importantes recursos que requieren en el sistema público de
salud para su atención. (Hernández 2013)
En México, las estimaciones existentes son muy variables con cálculos de costos
de atención por paciente que van desde 700 hasta 3 200 dólares anuales. Estas cifras
representan un gasto nacional de 779 MM USD anuales. (Hernández 2013; Barquera
2013)
La prevalencia de Diabetes Mellitus tipo 2 tiende a seguir aumentando. En
información de la Secretaría de Salud de México se reporta que la prevalencia de
diabetes pasó de 8.2% en el año 2000 a 10.7% en 2006. En datos del año 2005 la
mortalidad en mujeres mexicanas fue de 66.6 y en hombres de 56.7 por 100,000
habitantes ubicándose como causa número uno de muerte en México. (FID 2015)
3.9 VENTAJAS DE LA DETECCIÓN DE LA PREDIABETES
Para lograr reducir la carga social de la diabetes, además de la detección y
tratamiento de los individuos enfermos, se requiere de una profunda intervención de
carácter preventivo. Actualmente se dispone de las evidencias científicas sobre los
factores de riesgo responsables del desarrollo de la diabetes. Las experiencias
internacionales sobre los beneficios para la salud pública son prueba de la importancia
de la prevención primaria. (FID 2015)
En los últimos diez años, varios ensayos clínicos han sido publicados con respecto
al tratamiento de la prediabetes con la finalidad de investigar la efectividad de estos
tratamientos en retardar o abrogar la progresión de la prediabetes a diabetes
manifiesta. En forma general, los estudios arrojan datos optimistas y permiten establecer
que:
1) Los cambios en el estilo de vida son altamente efectivos en retardar la
progresión de la prediabetes a diabetes
2) Los agentes farmacológicos que aumentan la sensibilidad a la insulina
(metformina, glitazonas) o que impiden la absorción de carbohidratos
(Acarbosa) también confieren un efecto de retardo en la progresión de
prediabetes a diabetes. (FID 2015)
De acuerdo a las evidencias se establece que la modificación en el estilo de vida
de los individuos representa la primera alternativa de selección para la prevención de
la Diabetes Mellitus, resultando la piedra angular tanto para el tratamiento como para
32
la prevención de la DMT2. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha establecido
los factores del estilo de vida que tienen evidencia comprobada para prevenir la
progresión hacia diabetes tipo 2, los cuales se presentan en la Tabla 3. (FID 2015)
Tabla 3. Evidencia sobre prevención del progreso hacia la diabetes (FID
2015)
Evidencia Disminuyen el riesgo
Convincente
Pérdida de peso en personas con
sobrepeso
Aumento de actividad física
Probable Fibra dietética
Posible Ácidos grasos n-3
Alimentos con bajo índice glucémico
Insuficiente
Vitamina E
Cromo
Magnesio
Consumo moderado de alcohol
3.10 CURVA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA ORAL COMO MÉTODO DE DIAGNÓSTICO
En la actualidad existen métodos para detector tanto a la prediabetes como a
la diabetes La prueba más conocida del tipo estímulo-respuesta es la Curva de
Tolerancia a la Glucosa Oral (CTGO). Esta es una prueba que mide la capacidad que
tiene el organismo para metabolizar la glucosa, de manera que, en los sujetos con
alteraciones en el metabolismo de los carbohidratos, esta capacidad se encuentra
alterada, y en el caso particular de los sujetos con (DMT2), esta capacidad se encuentra
disminuida. (Trujillo 2007)
En la CTGO se obtiene una muestra de sangre en ayunas para determinar la
glucemia tras un ayuno de 8 a 10 hr. Si el valor de glucemia en ayunas es igual o mayor
a 126 mg/dl, se diagnostica Diabetes Mellitus y no se realiza la prueba pues este valor
es suficiente para el diagnóstico. Si la glucemia en ayunas es menor de 126 mg/dl,
entonces se le administrar al paciente una carga de glucosa, (75 gramos de glucosa
disuelta en 250 miligramos de agua. Posteriormente, se toman muestras de sangre a
intervalos regulares de tiempo, de acuerdo con alguno de los muestreos
convencionales: una muestra cada 15, 30 o 60 minutos hasta las 2 horas. Si la glucemia
en la muestra de las dos horas es igual o superior a los 200 mg/dl, se diagnostica DMT2.
Finalmente, con los valores de concentración de glucosa y tiempo obtenidos, se dibuja
una gráfica que generalmente se representa como una curva. Ver Figura 3.1. (Trujillo
2007)
33
Figura 3.1 Valores nominales en la Curva de Tolerancia a la Glucosa Oral. TNG: Tolerante Normal
a la Glucosa, GAA: Glucosa Alterada en Ayuno, ITC: Intolerante a los carbohidratos, GAA+ITG:
Glucosa Alterada en Ayuno +Intolerante a la glucosa, DMT2: con Diabetes Mellitus tipo 2.
Monroy (Datos sin publicar)
Otros criterios para el diagnóstico de la prediabetes y diabetes, es por medio de
la concentración de la glucosa en sangre después de 8 a 10 h de ayuno, y mediante la
determinación de hemoglobina glucosilada, los valores de estas medidas, de acuerdo
a la ADA, OMS y la NOM-015 de la SSA de México, se presentan en la Tabla 4.
Tabla 4. Criterios diagnósticos de Diabetes Mellitus (Inzucchi 2012;NOM-015 2010; ADA 2016)
Organismo Asociación Americana de
Diabetes
Organización
Mundial de la Salud
NOM 015
SSA
Medición
Plasmática
en sangre
venosa
TNG ITG GAA Diabetes Pre-
diabetes Diabetes ITG GAA Diabetes
Glucosa en
ayuno
(mg/dl)
<100 100-
125 ≥ 126 110-125 ≥ 126
100 –
125 ≥ 126
Glucosa a las
2 h de CTOG
(mg/dl)
<140 140-
199 ≥ 200 140-199 ≥ 200
140
-
199 ≥ 200
Glucosa
casual
(mg/dl)
<140 ≥ 200 ≥ 200 ≥ 200
Hemoglobina
glucosilada
(%)
<5.7 5.7-
6.4 ≥ 6.5 ≥ 6.5
34
3.11 ACTUALIDAD DE LAS INVESTIGACIONES EN DMT2
Aplicar el análisis diagnóstico basado en el análisis de aliento es un objetivo
actual. Entre las diversas bondades de este diagnóstico sobresale su metodología no
invasiva, presentando grandes ventajas por sobre los métodos de diagnósticos
tradicionales.
Múltiples estudios se han dedicado a encontrar relaciones significativas de COVs
propios de la diabetes. Existen numerosas investigaciones donde el metabolito más
estudiado resulta ser la acetona. La razón fisiológica es que la acetona es parte de los
tres cuerpos cetónicos producidos en el hígado como una fuente de energía alternativa
cuando la glucosa no se encuentra disponible. Personas que presentan ayuno o realizan
ejercicio prolongado tenderán a tener bajos niveles de glucosa sanguínea y por tanto
tendrán niveles de cetona elevados en la sangre con un olor afrutado característico en
el aliento. (Wang 2013)
Las personas que son diagnosticadas con diabetes no son capaces de usar la
glucosa, ya sea por la carencia de insulina o resistencia a ésta, por lo que se acumula
en el torrente sanguíneo presentando hiperglicemia. Por tanto, los cuerpos cetónicos se
incrementan en respuesta al decremento energético y el hígado empieza a romper
grasas produciendo los cuerpos cetónicos. (Wang 2013)
Se presume que la mejor técnica para un análisis preciso de la acetona en el
aliento es el SIFT-MS (Amman, 2013). En esta investigación se encontró una correlación
entre la glucosa sanguínea y la acetona en personas sanas, con la finalidad de aplicarlo
a personas diabéticas. (Amman 2013,Walton 2014)
Otras investigaciones han llegado a analizar la acetona en 38 pacientes con
DMT2 utilizando la selección de iones en tubo de flujo acoplado a espectrómetro de
masas, que consiste en una técnica en tiempo real que ofrece una medición rápida,
reproducible y de fácil realización de la concentración de acetona en pacientes
ambulatorios con diabetes tipo 2. (Storer 2011)
Yan (2014) y colaboradores emplearon cromatografía de gases combinada con
una aproximación metabolómica para identificar distintas marcas metabólicas de la
DMT2. En el estudio referido, se realizó un estudio a 39 sujetos sanos y 48 sujetos con DMT2.
Como potenciales biomarcadores se identificaron al Isopropanol, 2,3,4-trimetillhexano,
2,6,8-trimetildecano, tridecano, undecano, acetona, m-xileno y tolueno.
Dentro de las investigaciones más actuales, y como parte del mismo equipo de
trabajo de esta tesis, se encuentra el estudio de 27 sujetos sanos y 8 sujetos diabéticos
seleccionados de la población mexicana por Gallego (2016). En este estudio se empleó
cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM). Como
resultado se logró determinar una línea basal de compuestos formada por 20
metabolitos de acuerdo a las diferencias significativas en los errores estándar de ambas
poblaciones y dentro de un análisis de componentes principales de los metabolitos en
35
la población total, se mostró una clara correlación de 9 biomarcadores con la patología
diabética de acuerdo a la literatura.
Los metabolitos que logró identificar, sin repetición, tanto en la línea basal, como
en el análisis estadístico se muestran en la Tabla 5. Los metabolitos de esta tabla forman
una parte fundamental en el desarrollo de esta tesis.
Tabla 5. Metabolitos de la línea basal y ACP en personas con DMT2 (Gallego 2016)
Peso por átomos de
carbono
Metabolitos
Muy Ligeros (C1-C5) Etanol Butano
Acetona
Ligeros (C5-C7)
Isopreno 1-Propanol
2-Butanona Butenona
Ciclohexano 2-Pentanona
3 Metilhexano 1-Hepteno
3-Metil 2-Butenal
Pesados (C7-C12)
2-Etoxiethanol 1-Pentanol
2-Hexanona 2,3,5- Trimetilhexano
p Xileno 2,4,6-Trimetilheptano
m Xileno (1,3
Dimetilbenzeno)
2,2,6- Trimetiloctano
Benzaldehido 2,2,3,4-Tetrametilpentane
2,3,3 Trimetiloctane 2,6- Dimetildecane
Limoneno Undecano
3.12 MÉTODO DE ANALISIS DE ALIENTO EXHALADO
La cromatografía de gases es la técnica más común para el análisis de
biomarcadores en el aliento exhalado. Esta técnica consiste en la inyección de una
muestra de aire dentro de una columna cromatografía donde se lleva a cabo un
proceso de separación fisico-química. La elución se produce por el flujo de una fase
móvil de gas inerte a lo largo de la columna. Los compuestos químicos con diversas
afinidades a la fase estacionaria se moverán a diferentes velocidades. Las velocidades
producirán la separación de los compuestos. (Guiochon 1988)
De forma general las etapas del análisis cromatográfico se puede ver con el
siguiente esquema (Guiochon 1988):
Elección de la columna y fase estacionaria
Ajuste de temperaturas
Ajuste del caudal del gas portador
Inyección de la muestra
36
Vaporización de la muestra y arrastre hasta la columna
Fijación de los componentes al inicio de la columna
Desplazamiento de los componentes de la muestra a velocidades diferentes
Los solutos salen de la columna, pasan al detector y se obtiene el cromatograma
Los parámetros que se eligen en el equipo de cromatografía de gases son:
1.- Tipo de gas portador
2.- Columna y dimensiones
2.1.- Fase estacionaria
3.- Tipo de detector
4.- temperaturas en:
4.1 Inyector
4.2 Columna
4.3 Detector
Los detectores que pueden ser empleados en el sistema son:
1.- El detector de ionización de flama (FID). Este es un detector de tipo destructivo
el cual forma una llama que quema e ioniza los compuestos separados en la columna,
es un detector insensible a los grupos funcionales como C=O, OH, NH que originan en la
llama pocos iones, tiene una gran sensibilidad de 10-3 g soluto/mL. (Guiochon 1988)
2.- El principio de un detector por espectrometría de masa (EM) consiste en que
la muestra es fragmentada a través de bombardeos de electrones o iones, los iones
formados se fragmentan, y estos fragmentos son separados magnéticamente por su
relación carga-masa y finalmente son cuantificados por un proceso de adquisición de
datos. (Guiochon 1988)
3.13 LOS MÉTODOS ACTUALES PARA DETECCION DE COVs
La cromatografía de gases, sigue siendo hasta ahora el método favorito para el
análisis del aliento exhalado debido a su gran resolución y sensibilidad. Existen diversos
acoplamientos de detectores en CG, entre ellos el acoplamiento con detectores de
espectrometría de masas (GC-EM), con detección de ionización de flama (CG-DIF) y
con espectrometría de movilidad iónica (GC-EMI). (Pereira 2014)
A pesar de la gran calidad de los resultados de la CG, resulta ser un método
costoso, poco transportable y no puede ser ocupado en tiempo real.
Actualmente ya están disponibles opciones de análisis en tiempo real como la
reacción de transferencia de protones (RTP) y sus variantes que incluyen la
espectrometría de masas (RTP-EM), la reacción de transferencia de protones-tiempo de
vuelo y la espectrometría de masa (RTP-TV-EM), la espectrometría de movilidad iónica
37
acoplada a columnas multicapilares (EMI/CM), la selección de iones en tubo de flujo
con espectrometría de masas (SITF-EM). (Pereira 2014)
De manera reciente se han desarrollado una amplia gama de acercamientos y
sensores de espectroscopia láser, comúnmente conocidos como narices electrónicas
(e-nose), que se aplican al análisis del aliento exhalado con resultados prometedores.
Estas opciones en tiempo real reducen varios pasos experimentales innecesarios
relacionados con el muestreo, el almacenamiento y la preconcentración de las
muestras. (Pereira 2014)
Como parte de estos desarrollos existen dispositivos denominados como punto
de atención (POC por sus siglas en inglés de “point of care”), potencialmente baratos y
de aplicación en tiempo real. Estos dispositivos son capaces de ofrecer alta sensibilidad
y selectividad como la EM. Una de las ventajas más notables de estos dispositivos POC
es que pueden ser utilizados en grandes estudios epidemiológicos. Sin embargo, se
limitan a la caracterización de un número muy limitado de COV y su capacidad para
identificar simultáneamente la amplia variación química de COVs en el aliento
exhalado debe ser mejorada. (Pereira 2014)
Alternativamente, muchas narices electrónicas (e-nose en inglés) dependen del
reconocimiento de patrones y caracterizan cualitativamente diferentes clases de COVs
en comparación con los dispositivos que dan una cuantificación absoluta. (3)
Tanto para una caracterización cuantitativa como cualitativa, los COV deben ser
identificados por metodologías integrales como la CG-EM. Desafortunadamente, estas
metodologías integrales son muy costosas, requiriendo operadores altamente
especializados y expertos. (Pereira 2014)
La búsqueda de una tecnología fiable para el análisis del aliento todavía está en
progreso, ya que no existe una metodología única disponible para alcanzar la resolución
de la CG-EM y en un enfoque en tiempo real usando un dispositivo de punto de atención
asequible (POC) (Pereira 2014)
38
CAPITULO 4: METODOLOGÍA
4.1 CARACTERIZACIÓN DE PACIENTES
Para este trabajo se contempló una población de 42 pacientes con dos
repeticiones, cada uno, para el estudio de compuestos orgánicos presentes en el
aliento.
Para lograr la caracterización fisiológica de estos sujetos se seleccionó a los
participantes de una base de datos, del Hospital General de México “Dr. Eduardo
Liceaga”, que cuenta con alrededor de 1400 participantes.
Actualmente esta base de datos sigue creciendo y su implementación se lleva a
cabo bajo el protocolo “identificación de factores que predisponen a la diabetes
mellitus tipo 2 en sujetos normoglicémicos con historia familiar de diabetes y su relación
con obesidad” con número de oficio CE/011/417 ante el comité de ética del mismo
hospital.
En este protocolo, a cargo de la Dra. Adriana Monroy Guzmán, se realiza una
serie de pruebas hematológicas, revisión de antecedentes familiares y mediciones de
parámetros fisiológicos. Los resultados de este protocolo recaen en una base de datos
que contiene información del estado de salud de diversos sujetos. Dentro de las pruebas
hematológicas se incluyen: la hemoglobina glucosilada, la curva de tolerancia a la
glucosa, los factores inmunológicos, la biometría hemática, la urea, la creatinina, el
ácido úrico, el colesterol, los triglicéridos, las lipoproteínas, la bilirrubina, la albúmina y
múltiples proteínas. Los valores de referencia se presentan en la Tabla 6.
Tabla 6. Valores de referencia para la clasificación de dislipidemias
Parámetro Sano Por encima de lo
normal Anormal
COLESTEROL (mg/dL) 50-199 200-239
Hipercolesterolemia
≥240
Hipercolesterolemia
crónica
TRIGLICÉRIDOS
(mg/dL) 50-149
150-199
Hipertriglicemia
≥200
Hipertriglicemia
crónica
IMC (kg/m2) 18-24.9
Recomendado
25-29.9
Sobrepeso
≥30
Obesidad
Para catalogar a los sujetos de los grupos de interés para este proyecto, de la
base de datos, se consideró lo siguiente:
Un grupo de control o sujetos sanos compuesto por 6 sujetos. donde se
buscó que los sujetos sometidos al protocolo de la Dra. Monroy tuvieran
39
tanto ausencia de diabetes como de otras enfermedades. Además, que
cada sujeto presentara valores nominales de las siguientes pruebas
hematológicas: Curva de tolerancia a la glucosa oral, prueba de
hemoglobina glucosilada y prueba de glucosa en ayuno.
Adicionalmente se consideró: el índice de masa corporal, los niveles de
colesterol y de triglicéridos con valores normales. Estos valores se
encuentran reportados por la Asociación Americana de Diabetes (ADA
2016), la NOM-037 y la NOM-015 de la SSA. Tabla 4, Tabla 6.
Un grupo de prediabéticos compuesto por 18 participantes donde se
buscó que los sujetos sometidos al protocolo de la Dra. Monroy
presentaran los valores establecidos por la NOM-015 de la Secretaria de
Salud Pública y los valores reportados por la Asociación Americana de
Diabetes (ADA 2016) para aquellas personas con glucosa alterada en
ayunas y con intolerancia a los carbohidratos. Esto se cuantifica llevando
a cabo pruebas hematológicas que incluyen la obtención de la curva de
tolerancia a la glucosa, prueba de hemoglobina glucosilada y prueba de
glucosa en ayuno. Tabla 4.
Un grupo de diabéticos compuesto por 12 participantes, donde se buscó
que 6 de los sujetos sometidos al protocolo de la Dra. Monroy presenten los
valores umbrales establecidos por la NOM-015 de la Secretaria de Salud
Pública para sujetos con diabetes reciente. Para los otros 6 pacientes con
diabetes de larga duración se buscó que rebasaran los valores umbrales
de esta misma norma. La cuantificación de esos valores se llevó a cabo
por medio de pruebas hematológicas: obtención de la curva de
tolerancia a la glucosa, prueba de hemoglobina glucosilada y prueba de
glucosa en ayuno. Tabla 4.
Un grupo de diabéticos en estado crítico compuesto por 6 participantes
que presentaron glicemia descontrolada y en estado de urgencia
médica. A estos pacientes se les midió la glicemia capilar en
Departamento de Urgencias del HGM.
4.2 MUESTREO DEL ALIENTO ALVEOLAR
Las muestras de aliento fueron tomadas en el Hospital General de México “Dr.
Eduardo Liceaga” en el departamento de neumología, bajo parámetros controlados
de temperatura, presión barométrica y humedad relativa. Estos parámetros se
obtuvieron del Pletismógrafo del consultorio VmaxE, 2009, Vyasis HealthCare, Yorba
Linda, CA.
40
A los sujetos muestreados se les pidió un ayuno de 8 horas, no haber realizado
ejercicio físico previo, presentarse sin lavado bucal con algún químico, sin perfumes,
lociones, cremas faciales ni maquillaje.
Dado que el aliento humano consiste de una mezcla de aire de los alveolos y aire
del espacio muerto, para que el análisis de aliento sea efectivo es deseable maximizar
la cantidad de aire alveolar dado a la riqueza de metabolitos en él.
Para el presente trabajo, se colectó, con una bolsa Tedlar (SKC Inc., Eighty Four,
PA, USA) una primera muestra de 300 ml compuesta de la mezcla de aire del espacio
muerto y aire de los alveolos. Esta primera muestra fue descartada con motivo de
desalojar el aire del espacio muerto. El resto de la exhalación, la cual consistió en aliento
alveolar, fue colectado en una segunda bolsa y la cual se utilizó para el análisis de
metabolitos en el análisis cromatográfico.
Para remover la humedad de la muestra de aliento, se acopló, a las bolsas Tedlar,
un tubo de Nafión que elimina el agua por medio de permeación. (Perma Pure 2017)
Después del procedimiento de muestreo del aliento, se midió el volumen del
aliento alveolar en las bolsas Tedlar con el método de Arquímedes. Posteriormente se
preconcentraron las muestras en cartuchos de adsorbentes. Para este fin, se conectó
una bomba de vacío a los cartuchos adsorbentes, donde el contenido de la bolsa
Tedlar fue adsorbido por el cartucho. Para ello, se utilizó un flujo de 120 ml / min.
Los cartuchos empleados consistieron en tubos de acero de 14.5 cm de longitud
y diámetro de 0.5 cm, empacados con materiales adsorbentes de carbón grafitizado
con el siguiente orden: 0.18g de Carbopack C, 0.125g de Carbopack B y 0.12g de
Carbosieve SIII.
Los cartuchos, cargados con las muestras, fueron transferidos al Centro de
Ciencias Atmosféricas, UNAM, MX. Los cartuchos fueron refrigerados a 4 °C y
almacenados en un bote de acero lleno de carbón activado para su futuro análisis en
CG- EM-DIF. El periodo de almacenaje fue de hasta 3 semanas.
Posterior a la colección de las muestras de aliento y desalojo de las muestras en
los cartuchos, todas las bolsas fueron sanitizadas para remover contaminantes residuales
y marcadas para la identificación de cada muestra
La limpieza de las bolsas se realizó enjuagando dos veces con aire zero y una vez
con nitrógeno gaseoso 5.0 (Praxair Technology Inc., MX). En cada enjuague las bolsas
fueron calentadas por 20 minutos a 80° C y vaciadas con una bomba de vacío. Este
método fue desarrollado por Gallego (2016)
Para verificar la limpieza de las bolsas de muestreo, después del lavado, se vertió
nitrógeno seco a una de estas bolsas y se analizó esta muestra en el cromatógrafo de
gases antes de su uso para el proceso de segunda recolección de muestras.
41
Se tomó a los pacientes una segunda muestra de aliento a la semana de la
primera. Los pacientes a quienes no se repitió esta prueba fue a los catalogados como
diabéticos críticos, debido a su estado de emergencia médica. El periodo de toma de
muestras de aliento fue de 3 meses.
4.3 ANÁLISIS POR CG-EM-DIF
El análisis CG-EM-FID se realizó en un cromatógrafo de la marca Agilent
Technologies mod. 7890A GC System. Este cromatógrafo de gases se acopló con
espectrometría de masas (MS) Agilent 5975C y un detector por ionización de flama (DIF).
En la Tabla 7 se muestran las condiciones para la adquisición de los
cromatogramas del CG-EM-DIF.
Se utilizó el sistema de procesamiento de datos, ChemStation, Agilent, revisión
E.02.00,2008, propio del equipo, el cual contaba con la librería NIST, revisión D.05.02,
2005, para la identificación de analitos.
En este sistema se analizaron las señales del espectrómetro de masas (EM) y del
detector de ionización de flama para todos los compuestos de la Tabla 5.
De manera cualitativa, para la identificación de los analitos en el equipo, se
consideraron los tiempos de retención, encontrados por Gallego (2016) y el espectro de
masas de los compuestos de interés. Se considera como tiempo de retención al tiempo
que tarda en ser detectado un compuesto de interés después de la inyección de una
muestra en el CG, donde el tiempo de retención es característico de cada compuesto.
Para la identificación absoluta de los compuestos, se inyectaron los estándares
de la tabla 8, con la finalidad de obtener los tiempos de retención del equipo.
Posterior a la inyección de los cartuchos con muestras de aliento en el CG-EM-
DIF, cada cartucho fue nuevamente termodesorbido a 350° C, con un flujo de nitrógeno
gaseoso por 3 horas, con la finalidad de limpiarlo y reutilizarlo para futuros muestreos.
42
Tabla 7. Parámetros cromatográficos del análisis
TERMODESORCIÓN DEL CARTUCHO COLUMNAS CROMATOGRÁFICA
Temperatura 330 °C Columna capilar EM
100% DIMETIL
POLISILOXANO (60m,
0.25mm, 1 um), no polar
Tiempo 8 min Columna capilar FID
HP-PLOT/Q
(30 m, 0.32 mm, 20 um)
Gas portador y flujo He 1 ml/min
CRIOENFOQUE EN EL PTV Programa de
temperatura
-20 oC (1.6 min)/5 oCmin-1
/260 oC (5 min)
Trampa de
crioenfoque
Inyector PTV
empacado con
Carbotrap C
ESPECTRO DE MASAS
Temperatura
inicial -20 °C Modo de adquisición SCAN/SIM
Temperatura
final 350 ° C Modo de ionización Impacto Electrónico
Tiempo 1.6 min Energía de ionización 70 eV
Flujo 1 ml/min Barrido de masas y
velocidad del escaneo
Escaneo completo de
35-200 uma, 4.3
escaneados/seg
DETECTOR POR IONIZACIÓN DE
FLAMA (DIF)
Temperatura fuente
iónica / Temperatura
línea de transferencia
230 ° C / 270 °C
Flujos aire: 450 ml/min
hidrógeno: 40 ml/min
nitrógeno: 20 ml/min Temperatura cuadrupolo 150 °C
4.4 ANÁLISIS CUALITATIVO
Para el análisis cualitativo, se tomó el área bajo la curva (ABC) de cada
compuesto de cada muestra y se realizó una gráfica de barras de los 6 grupos de
estudio para observar las diferencias entre ellos. Para las muestras con segunda
repetición, se realizó un promedio de la señal para cada compuesto.
Se tomó el error estándar para cada compuesto por grupo de estudio para
demostrar que el contraste entre compuestos por grupo era significativo. Ec. 4
𝑆�̇� =𝑆
√𝑁 Ec. 4
Donde S es la desviación estándar del compuesto y N es el número de sujetos del
grupo muestreado.
43
4.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
4.5.1 ANALISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES
El objetivo de un análisis de componentes principales (ACP) es reducir un gran
número de variables dependientes, a un conjunto menor e independiente para explicar
el fenómeno de interés. Además, el aplicar ACP se logra clasificar y/o agrupar a los
sujetos estudiados, basándose en características medidas.
Este tipo de análisis aumenta el poder de interpretación otorgando un sentido de
orden a los datos y al mismo tiempo minimiza la pérdida de información.
Para lograr la reducción de variables, el ACP crea nuevas variables no
correlacionadas que sucesivamente maximizan la varianza.
Al encontrar estas nuevas variables, las componentes principales se reducen a
resolver un problema de eigenvalores o eigenvectores, y donde las nuevas variables
están definidas por el conjunto de datos utilizado. (Jolliffe 2002)
Se aplicó ACP a la serie de datos cromatográficos obtenidos en el capítulo 4.4
para los grupos de interés: sanos y prediabéticos, sanos y diabéticos, y el conjunto de los
6 grupos de estudio.
Asimismo, para realizar el estudio de ACP, se utilizó el software R versión 3.2.4 2016,
de The R foundation for statistical computing y la librería FactoMineR. (Le 2008)
4.5.2 ANALISIS DESCRIPTIVO DE LA MUESTRA
Para realizar el análisis descriptivo e identificar si existían casos atípicos y/o
extremos en cada uno de los 6 grupos estudiados, se realizaron diagramas de cajas y
bigotes para cada uno de los compuestos estudiados.
Este tipo de diagramas son una herramienta gráfica conveniente en el análisis
descriptivo para mostrar un grupo de datos numéricos a través de sus medianas,
promedios, cuartiles y observaciones mínimas y máximas. Se puede mostrar la
distribución de datos, examinar la simetría e indicar posibles valores atípicos. (College of
Saint Benedict and Saint John´s University 2017; Li 2012)
44
Figura 4.1 Composición de una gráfica de cajas y bigotes.
4.5.3 ANOVA
El análisis de varianza (ANOVA) es un procedimiento estadístico utilizado para
probar el grado en el que dos o más grupos varían o difieren en un experimento. Una
gran varianza (o diferencia) por lo general indica que hubo un hallazgo significativo de
la investigación. (Universidad de Barcelona 2017)
El análisis de la varianza permite contrastar la hipótesis nula de que las medias de
N poblaciones (N >2) son iguales, frente a la hipótesis alternativa de que por lo menos
una de las poblaciones difiere de las demás en cuanto a su valor esperado. Este
contraste es fundamental en el análisis de resultados experimentales, en los que interesa
comparar los resultados de n factores con respecto a la variable dependiente o de
interés. (Universidad de Barcelona 2017)
Al aplicar ANOVA de una vía se calcula un estadístico denominado F. Si las
medias entre los grupos varían mucho y la media dentro de un grupo varía poco, es
decir, si los grupos son heterogéneos entre ellos y similares internamente, el valor de F
será más alto, y, por tanto, las variables estarán relacionadas. Por tanto, en cuanto más
difieren las medias de la variable dependiente entre los grupos de la variable
independiente, más alto será el valor de F.
El análisis ANOVA de una vía fue aplicado a los 6 diferentes grupos de estudio
con la finalidad de probar si el contraste entre estos grupos era significativo para algún
compuesto de interés.
4.6 ANÁLISIS CUANTITATIVO
4.6.1 CURVAS DE CALIBRACIÓN
La composición cuantitativa de una mezcla puede ser obtenida a partir de una
relación lineal o cuadrática de una concentración conocida del compuesto de interés
y el área del pico del compuesto de interés. (TO-01 1984)
45
Para este procedimiento se requiere obtener curvas de calibración que relacione
concentraciones conocidas del compuesto y el área de la señal del CG-EM-FID. Para
este fin se emplearon mezclas gaseosas de estándares gravimétricos, a partir de los
compuestos en forma gaseosa o líquida.
Se realizó el procedimiento de dilución estática descrito en los métodos TO-01
(1984) y TO-17 (1999) de la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos de
América (EPA) para los compuestos en estado líquido con la finalidad de obtener una
mezcla gaseosa. En este método se considera la corrección por temperatura y presión
para que los resultados se presente en condiciones estándar. (TO-15 1999)
Los estándares utilizados se presentan en la Tabla 8.
Tabla 8. Estándares gravimétricos empleados para realizar las curvas de calibración
Compuesto Estado Marca y no. de serie
Etanol Líquido J.T. Baker 9014-03, 4L
Butano Gaseoso Spectra Voc Standards U.S. EPA PAMS, Linde, a 1 ppm
Acetona Líquido J.T. Baker, 9006-03, 4L
Isopreno Gaseoso Spectra Voc Standards U.S. EPA PAMS, Linde a 1 ppm
Fluka, BCBN7519V, 1 mL
2-Butanona Líquido Sigma Aldrich 02469 5ml, BCBP9263V
Ciclohexano Gaseoso Spectra Voc Standards U.S. EPA PAMS, Linde a 1 ppm
2-Pentanone Líquido Sigma Aldrich 46211-5ml, SZBF079XV
2-Ethoxietanol Líquido Sigma Aldrich 79109-1ml, BCBQ4793V
1-Pentanol Líquido Sigma Aldrich 77597-1ml, BCBP3806V
2-Hexanona Líquido Sigma Aldrich 02473-5ml, BCBR3966V
p Xileno Gaseoso Spectra Voc Standards U.S. EPA PAMS, Linde a 1 ppm
m Xileno Gaseoso Spectra Voc Standards U.S. EPA PAMS, Linde a 1 ppm
Benzaldehido Líquido CHEM, 0-239, 232-105ª
Limoneno Líquido Sigma Aldrich, L-2129-100 mL, 128H3405
Undecano Gaseoso Spectra Voc Standards U.S. EPA PAMS, Linde a 1 ppm
Tanto la mezcla gaseosa en el bulbo de dilución estática y los gases en la bala
gaseosa (Spectra Voc Standards) fueron inyectadas en el CG-EM-DIF con 3 a 4
diferentes concentraciones siguiendo el método TO-01 de la EPA. En este método, se
realiza un ajuste lineal siguiendo la Ec. 5 ,donde YN es la señal del compuesto de interés,
x es la cantidad del compuesto de interés en nanogramos por el volumen muestreado,
A y B son los coeficientes de la ecuación o factores de respuesta. (TO-17 1999)
𝑌𝑁 = 𝐴+ 𝐵𝑥 Ec. 5
46
4.6.2 CUANTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS EN LAS MUESTRAS DE ALIENTO
Para cuantificar los compuestos de la Tabla 8, se aplicó la Ec. 6 para cuantificar
al compuesto de interés.
𝑋𝑐 =𝑌𝑐−𝐴
𝐵 Ec. 6
Donde Xc es la cantidad del compuesto de interés en nanogramos por volumen
muestreado, Yc es la señal del compuesto de interés, A y B son los coeficientes
calculados en la Ec. 6 . (TO-01 1984; TO-17 1999)
La concentración de un compuesto en CG generalmente se expresa en partes
por billón volumétricas. La conversión se realiza utilizando la Ec. 7, bajo las condiciones
de presión, P, y temperatura, T, deseadas. (Raña 2017)
𝑁[𝑝𝑝𝑏𝑣] = 𝐶 [𝜇𝑔
𝑚3] ∗
𝑅𝑇
𝑃
𝑀 Ec. 7
Donde C es la concentración del compuesto de interés, M es la masa molecular
del compuesto de interés y R es la constante de los gases ideales.
47
CAPITULO 5: RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 CARACTERIZACIÓN DE PACIENTES
Para este estudio se obtuvieron 38 muestras de aliento de diferentes sujetos, los
cuales describieron a 6 grupos de estudio:
A) Normoglicémicos o con Tolerancia Normal a la Glucosa (TNG)
B) Intolerantes a la Glucosa (ITG)
C) Glucosa Alterada en Ayuno + Intolerantes a la Glucosa (GAA+ITG)
D) Recién diagnosticados con Diabetes Mellitus tipo 2 (RDMT2)
E) Diabetes Mellitus de larga duración (DMT2)
F) Diabetes Mellitus en estado crítico (CDMT2)
Se lograron obtener 23 repeticiones a la semana de la primera toma de muestra de
aliento.
Para los sujetos con diabetes en estado crítico no se tomó ninguna repetición por
su estado de emergencia médica.
En total se obtuvieron 61 muestras de aliento para los 6 grupos de estudio.
Inicialmente se había considerado estudiar 7 grupos, el cual incluía a sujetos
prediabéticos con Glucosa Alterada en Ayuno (GAA), pero durante el periodo de
muestreo no se presentó ningún paciente que reuniera los valores establecidos para ser
considerado.
En la Tabla 9 se muestra un resumen de los parámetros de interés de los 6 grupos
muestreados.
Tabla 9. PARÁMETROS DE INTERÉS DE LA POBLACIÓN MUESTREADA
GRUPO TNG ITG GAA+ITG RDMT2 DMT2 CDMT2
SEXO 3H 5M 1H 8M 2H 4M 0H 4M 2H 3M 3H 3M
EDAD 36 ± 11 48 ± 7 48 ± 7 55 ± 9 54 ± 13 54 ± 12
IMC 25±4 28±3 36±4 32±8 30±7 NA
GLUCOSA
PROMEDIO 108±14 156±16 168±30 197±12 336±69 288±88
TRIGLICERIDOS 95±31 147±67 237±80 143±36 201±124 NA
COLESTEROL 179±27 210±32 194±44 201±63 233±83 NA
CODIGO DE
IDENTIFICACIÓN
DE PACIENTES
P4,P8,P10,
P20,P21,
P27,P30,
P31
P1,P2,P5,P6,
P12,P14,P16,
P24,P28
P3,P22,P23
,P25, P26,
P32
P7,P9,P
17,P29
P11,P13,P
15,P18,P1
9
P33,P34,P35,
P36,P37,P38
En las figuras 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6 y 5.7 se muestran visualmente los resultados
de las pruebas fisiológicas y hematológicas de los pacientes muestreados.
48
En la Figura 5.1 se muestra la glucosa promedio en sangre y la glucosa casual de
todos los sujetos muestreados. De fondo a la gráfica se pueden observar los valores de
referencia para la glucosa casual. El primer nivel, es el valor normal de la glucosa casual,
el segundo nivel son los valores por encima de lo normal y el tercer nivel son los valores
anormales donde se presenta hiperglicemia crónica. La prueba de glucosa casual fue
la única que se pudo tomar a los pacientes en estado de diabetes crítico, debido a su
condición de emergencia médica.
Los valores de glucosa promedio fueron obtenidos para los sujetos en los grupos:
TNG, ITG, GAA+ITG, RDMT2 y DMT2. Cabe destacar que, en la actualidad, no hay un
valor de referencia para determinar la normalidad en la glucosa promedio.
En esta misma figura se ve una clara tendencia al aumento del valor de la
glucosa promedio y glucosa casual del grupo en un estado normoglicémico a los grupos
donde ya se presenta una diabetes diagnosticada.
Para un caso confirmado de diabetes, se emplea un valor de glucosa casual en
sangre mayor que 200 mg/dL.
Figura 5.1 Glucosa promedio y glucosa casual en sangre. En la gráfica se presentan los valores
promedio y el error estándar para cada grupo muestreado en este trabajo (TNG, ITG, ITG+GAA,
RDMT2, DMT2, CDMT2).
En la Figura 5.25.2 se muestra la Curva de Tolerancia a la Glucosa Oral de 5 grupos
de estudio. En esta figura es posible distinguir por colores a los grupos. En verde el grupo
GLUCOSA PROMEDIO Y GLUCOSA CASUAL EN SANGRE
49
TNG, en amarillo el grupo ITG, en gris el grupo GAA+ITG, en naranja el grupo RDMT2, en
azul el grupo DMT2.
Se puede observar como es la respuesta de cada grupo a la ingesta de glucosa
cada 30 min por un lapso de 2 h. Además, representa un resumen visual para las pruebas
de glucosa en ayuno y glucosa postprandial en conjunto.
Los valores nominales para un sujeto TNG es que, en ayunas, el individuo presente
un valor menor que 100 mg/dL de glucosa en sangre, posteriormente suben los niveles
de glucosa en sangre, pero a las 2 h de la ingesta, los valores de glucosa deben ser
menores a 140 mg/dL. Los valores que se encuentran por encima de los valores la curva
de un sujeto con TNG, y dependiendo el valor puede diagnosticar prediabetes o
diabetes según los valores de referencia de la Tabla 4.
Figura 5.2 Curva de Tolerancia a la Glucosa Oral. En la gráfica se presenta el promedio de los
valores de la CTGO y el error estándar para 5 de los grupos muestreado. En verde el grupo TNG,
en amarillo el grupo ITG, en gris el grupo GAA+ITG, en naranja el grupo RDMT2, en azul el grupo
DMT2.
La Figura 5.3 muestra la glucosa en ayuno de 5 de los grupos muestreados. De
fondo a la gráfica se pueden observar los valores de referencia para la glucosa en
ayuno. El primer nivel, es el valor normal de la glucosa en ayuno, el segundo nivel son los
valores por encima de lo normal y el tercer nivel son los valores anormales donde se
presenta hiperglicemia crónica.
Se puede observar que el grupo NGT muestran valores normales para esta
prueba, al igual que el grupo ITG (condición que se diagnostica con glucosa
50
postprandial). El grupo GAA+ITG muestra un valor por encima de lo normal,
característico de su tipo de condición prediabética. El grupo con un diagnóstico
reciente de diabetes (RDMT2), presenta valores ligeramente por encima de los normales
de esta prueba. Todos los pacientes con DMT2 presentaron los valores establecidos para
ser considerados como tal de acuerdo a la NOM-015 de la SSA y la Tabla 4.
Figura 5.3 Glucosa en ayuno. En el gráfico se presenta el valor promedio y el error estándar de
la glucosa en ayuno para cada uno de los 5 grupos de estudio (TNG, ITG, ITG+GAA, RDMT2,
DMT2).
La Figura 5.4 muestra los valores de la Hemoglobina Glucosilada de 5 de los
grupos de estudio. De fondo a la gráfica se pueden observar los valores de referencia
para la hemoglobina glucosilada. El primer nivel, es el valor normal de la hemoglobina
glucosilada, el segundo nivel son los valores por encima de lo normal y el tercer nivel son
los valores anormales donde se presenta hiperglicemia crónica.
Se puede observar que el grupo TNG muestra valores normales, los grupos
prediabéticos y diabéticos recientes muestran valores por encima de lo normal. El grupo
con diabetes de larga duración muestra valores anormales que entran en el criterio de
la Asociación Americana de Diabetes (ADA) para el diagnóstico de diabetes. Tabla 4
51
Figura 5.4 Hemoglobina glucosilada. En el gráfico se presenta el valor promedio y el error
estándar de la hemoglobina glucosilada para cada uno de los 5 grupos de estudio (TNG, ITG,
ITG+GAA, RDMT2, DMT2).
Las Figuras 5.5, 5.6 y 5.7 muestran los valores de otros parámetros fisiológicos para
tomar criterios de como discriminar entre sujetos sanos y/o normoglicémicos. También
se muestran los valores, para los otros grupos de estudio. Esto muestra que, para los
sujetos identificados con prediabetes y diabetes, éstos presentan otras condiciones de
enfermedad, principalmente dislipidemias, además de la condición metabólica
estudiada en este trabajo.
La Figura 5.5 muestra los valores del índice de masa corporal de 5 de los grupos
de estudio. De fondo a la gráfica se pueden observar los valores de referencia para este
índice. El primer nivel, es el valor recomendado del IMC, el segundo nivel son los valores
que establecen sobrepeso y el tercer nivel son los valores que establecen obesidad.
En la Figura 5.5 se observó que la población muestreada padecía mayormente
de sobrepeso y obesidad. Incluso en el grupo de control (TNG), una fracción de ellos
presentaba sobrepeso.
52
Figura 5.5. Índice de masa corporal (IMC). En el gráfico se presenta el valor promedio y el error
estándar del índice de masa corporal para cada uno de los 5 grupos de estudio (TNG, ITG,
ITG+GAA, RDMT2, DMT2).
La Figura 5.6 muestra los valores de triglicéridos de 5 de los grupos de estudio. De
fondo a la gráfica se pueden observar los valores de referencia para esta dislipidemia.
El primer nivel, es el valor normal, el segundo nivel son los valores por encima de lo normal
y el tercer nivel establece hipertrigliceridemia crónica.
Se observa que el grupo TNG tiene valores normales, mientras que los grupos ITG
y RDMT2 se encuentran muy cercanos al límite superior de la normalidad. Los grupos
GAA+ITG y DMT2 presentan valores de hipertrigliceridemia crónica.
53
Figura 5.6 Triglicéridos. En el gráfico se presenta el valor promedio y el error estándar de los
triglicéridos para cada uno de los 5 grupos de este estudio (TNG, ITG, ITG+GAA, RDMT2, DMT2).
La Figura 5.7 muestra los valores de colesterol en sangre de 5 de los grupos de
estudio. De fondo a la gráfica se pueden observar los valores de referencia para esta
dislipidemia. El primer nivel, es el valor normal, el segundo nivel son los valores por encima
de lo normal y el tercer nivel establece hipercolesterolemia crónica.
En esta figura es posible observar que el grupo TNG tiene valores normales,
mientras que los grupos ITG, GAA+ITG, RDMT2 y DMT2 presentan valores por encima de
lo normal ara esta dislipidemia.
54
Figura 5.7 Colesterol. En el gráfico se presenta el valor promedio y el error estándar del
colesterol para cada uno de los 5 grupos de este estudio (TNG, ITG, ITG+GAA, RDMT2, DMT2).
El realizar la mayoría de pruebas que involucra niveles de glucosa en sangre
permitió la correcta diferenciación y diagnóstico de pacientes normoglicémicos,
prediabéticos y diabéticos. Este fue considerado el paso principal para poder hacer
correctamente la toma de muestras de aliento.
La identificación de otros parámetros en los sujetos de estudio, como el IMC,
colesterol y triglicéridos, permitió saber si los sujetos muestreados, en el caso del grupo
TNG, eran sujetos completamente sanos (sin ninguna otra enfermedad como obesidad
o alguna dislipidemia) o si el grupo de estudio era normoglicémico. Se observó que no
todos los sujetos en el grupo TNG eran sanos. Más adelante en el análisis de ACP se
observa que los pacientes P10 y P20, que son pacientes normoglicémicos y no sanos,
son ubicados en un cuadrante diferente respecto a la ubicación promedio de los sujetos
de control.
Para los otros grupos de estudio, se observó que algunos pacientes muestreados
además de prediabetes o diabetes, presentaban alguna condición relacionada con
dislipidemias y/o obesidad. Pero la presencia de las dislipidemias no afectó el análisis de
este trabajo.
55
5.2 MUESTREO DEL ALIENTO ALVEOLAR
En el proceso de toma de muestras de aliento alveolar, se logró aplicar
correctamente el protocolo hecho en el estudio previo de Gallego (2016).
Se logró muestrear a 38 pacientes. En el consultorio de neumología del Hospital
General de México se tomaron las muestras de 32 pacientes, a quienes se les realizaron
todas las pruebas hematológicas. En el departamento de Urgencias se tomó una única
muestra a 6 pacientes en estado crítico.
De los 32 pacientes, solamente a 23, se les realizo una repetición de toma de
muestra una semana después de tomar la primera muestra, debido a la dificultad de
lograr que los pacientes regresaran a dar muestras.
El volumen medido de las muestras en las bolsas Tedlar siempre fue de 1.000 ±
0.005L, por el método de Arquímedes.
Las condiciones ambientales promedio medidas en el consultorio donde se
tomaron las muestras de aliento fueron 584 ± 2 mmHg para la presión y 21 ± 1 °C para la
temperatura.
5.3 ANÁLISIS POR CG-EM-DIF
Con el análisis por CG-EM-DIF de las muestras de aliento, se obtuvieron los
cromatogramas de cada uno de los pacientes.
Para cada paciente se obtuvo un cromatograma en DIF, que mostraba la señal
de los compuestos muy ligeros de su aliento, y un cromatograma en EM, que mostraba
la señal de los compuestos ligeros a pesados de su aliento. Figura 5.8.
Con estos cromatogramas se realizó una correlación visual, entre sujetos con
distintas condiciones. Estas correlaciones se observan en las Figura 5.9 y Figura 5.10.
56
Figura 5.8 Cromatogramas obtenidos para las muestras de aliento A) en Espectrometría de
Masas, B) con Detector de ionización de flama.
La Figura 5.9 muestra las diferencias entre un sujeto normoglicémico (negro) y dos
sujetos prediabéticos (azul y rojo). Se puede observar como difieren en escala los picos
de los pacientes prediabéticos de los normoglicémicos.
Figura 5.9 Correlación visual de cromatogramas de sujetos con TNG, ITG, GAA+ITG. A) señal del
EM, B) señal del DIF.
La Figura 5.10 muestra las diferencias entre sujetos normoglicémicos y diabéticos.
Se observaron mayores diferencias en abundancia comparadas a las abundancias de
la Figura 5.9. Con esta visualización se apoya al marco teórico basado en los resultados
de Gallego (2016), ya que al inspeccionar los picos con el Software ChemStation se
A
B
A
B
— TNG
— GAA+ITG
— ITG
— TNG
— GAA+ITG — ITG
57
comprobó que los compuestos que presentan mayor diferencia corresponden a los de
la Tabla 5.
Figura 5.10 Correlación visual subjetiva de cromatogramas de sujetos con TNG, DMT2, CDMT2.
A) señal del EM, B) señal del DIF.
5.4 ANÁLISIS CUALITATIVO
Para realizar el análisis cualitativo, se consideró seguir los 25 compuestos (salvo la
butenona) mostrados en la Tabla 5.
De la correlación visual de cromatogramas se pudo observar dos compuestos en
la señal DIF, los cuales se presumió podrían ser indicadores de diabetes y prediabetes. A
estos compuestos se les nombró “X” e “Y” debido a que no pueden ser identificados si
no se cuenta con un estándar gaseoso en el DIF.
Los coeficientes de variación de presencia de metabolitos intraindividual e
interindividual de los grupos muestreados se presentan en la Tabla 10. . Este coeficiente
nos permite observar la variación biológica de los compuestos de los grupos
muestreados.
— TNG
— DMT2
— CDMT2
— TNG
— DMT2 — CDMT2
A
B
58
Tabla 10. COEFICIENTES DE VARIACION DE PRESENCIA DE METABOLITOS
DE LOS GRUPOS MUESTREADOS
Grupo CV Intraindividual (%) CV Interindividual (%)
TNG 58±9 64 ±23
ITG 48±9 74±31
GAA+ITG 45±3 71±29
RDMT2 41±5 51±16
DMT2 59±16 46±26
CDMT2 NA 68±36
El análisis diferencial de los compuestos respecto a la población normoglicémica
y las poblaciones prediabéticas se muestra en la Figura 5.11donde los compuestos se
distribuyen ordenadamente de acuerdo al número de moléculas de carbono de muy
ligeros (izquierda) a pesados (derecha). Se puede observar que existe una diferencia
significativa para algunos compuestos en los diferentes grupos de estudio. Teniendo
compuestos que se distinguen en la condición de ITG y/o GAA+ITG.
Figura 5.11 Contraste de compuestos entre pacientes con TNG y prediabéticos
59
En la Figura 5.12 se muestra el análisis diferencial de las poblaciones diabéticas,
respecto a la población normoglicémica. Se observó que las poblaciones donde existen
más compuestos con una diferencia significativa son los DMT2 y CDMT2.
Figura 5.12 Contraste de compuestos entre pacientes con TNG y diabéticos.
A partir de este análisis diferencial mostrado en la Figura 5.12, se determinó que
los compuestos con una diferencia significativa para el estudio de la prediabetes son los
mostrados en la Tabla 11. De igual modo se muestran los compuestos contrastados entre
la población normoglicémica y diabética.
Se encontraron 14 metabolitos significativos para la condición de prediabetes.
De éstos, 7 metabolitos tienen potencial para describir la condición ITG, y 10 metabolitos
tienen el potencial de describir la condición GAA+ITG. Los metabolitos que coinciden
para las dos condiciones son: 1-Hepteno, 2-Butanona y p-Xileno.
60
Tabla 11. Compuestos con una diferencia significativa por grupo estudiado. COMPUESTO ITG GAA+ITG RDMT2 DMT2 CDMT2
1 Y
2 Etanol 3 Butano
4 X
5 Acetona
6 Isopreno
7 1-Propanol
8 2-Butanona
9 3-Metil 2-Butenal
10 Cilohexano
11 2-Pentanona
12 3 Metil Hexano
13 1-Hepteno
14 2-Etoxietanol
15 1-Pentanol
16 2-Hexanona
17 2,3,5- Trimetilhexano
18 p-Xileno
19 2,4,6-Trimetilheptano
20 m-Xileno
21 2,2,6- Trimetiloctano
22 Benzaldehido
23 2,2,3,4-Tetrametilpentano
24 2,3,3 Trimetiloctano
25 2,6- Dimetildecano
26 Limoneno
27 Undecano
61
La Tabla 11 además muestra que los 27 metabolitos estudiados como
biomarcadores de diabetes mellitus tipo 2, están asociados al menos a uno de los tres
grupos de sujetos diabéticos estudiados. Son 5 los metabolitos con una diferencia
significativa que pueden describir potencialmente al grupo RDMT2, para el grupo de
DMT2 son 15 metabolitos y para los CDMT2 son 15 metabolitos. Los metabolitos en común
para los tres grupos estudiados son el p-Xileno y el Limoneno.
Tras este análisis cualitativo, se expone que el metabolito que está presente en
todos los grupos de estudio y que presenta una diferencia significativa para ser un
biomarcador potencial tanto para la prediabetes como la diabetes tipo 2 es el p-Xileno.
Los siguientes metabolitos que presentaron mayor frecuencia en los grupos estudiados
son el 1-Hepteno y el Limoneno.
Respecto a la acetona, la cual es un metabolito muy estudiado como potencial
biomarcador para diagnosticar la DMT2, se observó un comportamiento no lineal, de tal
forma que la concentración de este compuesto disminuye para la condición de
prediabetes GAA+ITG, respecto al grupo de control. Sin embargo, para estados donde
la enfermedad ya está presente se notó un incremento acelerado en que en etapas
temprana de la enfermedad la acetona, en nuestro estudio, aparecía en rangos
similares a los normales y un poco más elevados también. Lo cual nos permite determinar
que este compuesto se comporta de una manera particular en las etapas tempranas
de prediabetes y de una manera diferentes a principios de la enfermedad.
Sobre los biomarcadores potenciales descritos anteriormente, existe una serie de
investigaciones que los vinculan con alteraciones metabólicas o enfermedades
hepáticas.
Friedman (1994) y colaboradores compararon el aire alveolar de sujetos de
control contra pacientes con enfermedades hepáticas. En este estudió se encontró al
limoneno con concentraciones inusualmente altos, especialmente para personas con
enfermedad hepática no colestática.
De igual manera Fernández del Rio (2015) y colaboradores estudiaron el aliento
de personas con cirrosis hepática, y posterior a un trasplante de hígado. En este estudio
se observó que los sujetos con la enfermedad tenían niveles elevados de Limoneno, y
posterior al trasplante de hígado, estos niveles disminuyeron considerablemente, siendo
el limoneno el metabolito con mejor capacidad diagnóstica.
Respecto al 1-hepteno, existen investigaciones donde se vincula con
enfermedades metabólicas. (Günther1996)
Eng (2015) y colaboradores estudio el aliento de una población de niños con
enfermedades hepáticas crónicas, respecto a un grupo de control. En este estudio se
encontró que los niveles de 1-deceno, 1-hepteno, 1-octano y 3-metilhexano eran
significativamente mayores a los niveles del grupo de control.
62
Existen compuestos, que, como fuente primaria, es la inhalación de estos mismos
en el ambiente. Algunos de estos COVs, como los xilenos y toluenos, son absorbidos en
el sistema circulatorio y han sido reportados en muestras sanguíneas de personas no
ocupacionalmente expuestas. Al ser absorbidos dentro del cuerpo humano, un gran
porcentaje de estos compuestos son metabolizados por enzimas. El p-Xileno, por
ejemplo, es sintetizado por enzimas hepáticas. Los cambios metabólicos pueden
modificar esta síntesis y elevar o disminuir las concentraciones de estos compuestos
externos. (Chau 2012) (KEGG 2008) (Wishart 2013)
En el trabajo de Gallego (2016), quien tiene la investigación consultada más
amplia en metabolitos encontrados en sujetos con DMT2, se encuentran todos los
metabolitos descritos anteriormente. Esta investigación está fundamentada por
investigaciones previas que se encontraron en la literatura, donde se analizan algunos
metabolitos por separado para esta misma patología, sin embargo, en la investigación
de Gallego(2016) y en esta investigación hemos detectado otros metabolitos no
mencionados en la literatura que podrían ser potenciales biomarcadores de la
prediabetes y diabetes.
5.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
5.5.1 ANOVA
Los análisis de varianza de los compuestos entre los 6 grupos estudiados más
representativos se muestran en la Tabla 12.
En esta tabla se observan 10 compuestos con un valor significativo de F. Esto
significa que, si existe alguna relación entre los grupos estudiados por cierto compuesto
de interés, y este compuesto tiene un valor F significativo, es decir, mayor al valor crítico
de F, esta relación tiene significancia.
En esta tabla se observa que tanto el 2-butanona y el 1-hepteno tienen un valor
F significativo. Estos dos compuestos anteriormente en el 5.4 y en el 5.5.3 , mostraron
tener una posible relación con los sujetos prediabéticos
De igual forma todos los compuestos presentados en la Tabla 12, han mostrado
ser potentes biomarcadores principalmente para la DMT2.
63
Tabla 12. ANOVA
Compuesto F Valor crítico para F
X 3.46 2.52
1-propanol 3.43 2.52
2-butanona 3.43 2.52
1-heptano 2.74 2.52
2-hexanona 2.87 2.52
2,4,6-trimetil heptano 2.80 2.52
2,2,6-trimetil octano 3.27 2.52
2,2,3,4-tetrametil
pentano 3.73 2.52
2,3,3 trimetil octano 3.48 2.52
2,6- dimetil decano 3.19 2.52
5.5.2 ANÁLISIS DESCRIPTIVO DE LA MUESTRA
En la Figura 5.13 se muestran gráficos de cajas y bigotes de algunos compuestos
de especial interés descriptivo para la población prediabética.
Algunos valores atípicos fueron expresados para el p-xileno, el limoneno, el 2,4,6
trimetilheptano y la 2-hexanona. Se presentan traslapes en la mayoría de las gráficas
entre los valores máximos y mínimos.
Se observa que para la 2 butanona, la mediana del grupo ITG y el promedio está
por encima tanto de la mediana como del promedio del grupo TNG. La mediana y el
promedio del grupo GAA+ITG se encuentra muy por debajo de la mediana del grupo
TNG. Se infiere que la diferencia estadística es relevante.
Para el 1-hepteno se observa que para el grupo ITG, el promedio y la media son
muy cercanos y son valores alejados del promedio y la media del grupo TNG. Para el
grupo GAA+ITG la media y promedio coinciden y sus valores están por debajo del
promedio y media del grupo TNG. Se infiere que la diferencia estadística es relevante.
Para el p-xileno, las medianas y promedios de los dos grupos prediabéticos se
encuentran por debajo significativamente del promedio y media del grupo TNG.
Para el limoneno y la 2-hexanona se observa una mayor diferencia de los
promedio y medianas para los grupos diabéticos contrastados con el grupo TNG.
Marcando mayor relevancia para esta enfermedad que para la prediabetes.
El 2,4,6 trimetilheptano, muestra diferencia entre los promedios y medianas de los
grupos prediabéticos respecto al grupo TNG y de igual forma para los grupos diabéticos.
64
Cabe destacar que este compuesto no muestra diferencias significativas en el análisis
cualitativo del capítulo 5.4 .
Figura 5.13 Gráficos de cajas y bigotes de algunos compuestos de interés
65
5.5.3 ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES
Se aplicó el análisis de componentes principales a los siguientes datos:
A) Sujetos TNG, GAA+ITG e ITG
B) Sujetos TNG, DMT2 y CDMT2
C) Los 6 grupos de estudio
En la Tabla 13 se muestran los componentes principales para cada ACP, así como la
fracción descrita y contribuciones de varianza. Es posible observar que las primeras dos
componentes, CP1 y CP2, describen en A) el 50%, en B) el 55% y en C) el 50% de la
varianza.
Tabla 13. Componentes Principales
DATOS A B C
CP1 CP2 CP3 CP1 CP2 CP3 CP1 CP2 CP3
Compuesto Undecan
o
2,4,6
trimetil
heptan
o
Limonen
o
2-
Hexanon
a
1
hepten
o
2,6
dimetil
decan
o
Undecan
o
2,2,3,4
tetrame
ti
lpentan
o
2,3,3
trimetil
octan
o
Varianza 8.889 4.580 2.558 11.546 3.315 2.494 9.734 3.681 2.265
Fracción de
varianza
(%)
32.921 16.961 9.476 42.762 12.280 9.238 36.054 13.633 8.390
Varianza
acumulada
(%)
32.921 49.883 59.358 42.762 55.042 64.280 36.054 49.685 58.07
5
En las Figura 5.14Figura 5.15 Figura 5.16 , se muestran los planos de las
correlaciones de los casos A, B y C analizados.
66
Figura 5.14 Plano de factor variable, Caso A: TNG, GAA+ITG, ITG. Con nombre los 10
componentes principales con mayor peso.
Figura 5.15 Plano de factor variable, Caso B: TNG, DMT2, CDMT2. Con nombre los 10
componentes principales con mayor peso.
67
Figura 5.16 Plano de factor variable, Caso C: TNG, GAA+ITG, ITG, RDMT2, DMT2, CDMT2. Con
nombre los 10 componentes principales con mayor peso.
Los vectores de las Figura 5.14, Figura 5.15 y Figura 5.16 representan la dirección
de mejor ajuste para cada uno de los compuestos.
La correlación del vector se mide aproximadamente con el coseno del ángulo
formado por el vector de interés y el eje. Existirá una gran correlación con ángulos
agudos, una correlación inversa con ángulos colineales y no se presentará correlación
con ángulos rectos.
Los compuestos que simplifican el espacio muestral definidos como
componentes principales entre sujetos sanos y prediabéticos son el undecano y el 2,4,6
trimetilheptano. Ambos compuestos muestran no ser significativos como potenciales
biomarcadores en la prediabetes en la Tabla 11.
El undecano ha sido anteriormente estudiado como potencial biomarcador para
la diabetes mellitus. (Pereira 2014) El 2,4,6 trimetilheptano es parte de la línea basal de
personas diabéticas definida en el trabajo de Gallego (2016)
Los compuestos que simplifican el espacio muestral definidos como
componentes principales entre sujetos sanos y diabéticos son la 2-hexanona y el 1-
hepeno.
La 2-hexanona es parte de la línea basal de personas diabéticas definida en el
trabajo de Gallego (2016). El 1-hepteno, como se menciona en el capítulo 5.4 ha sido
68
estudiado como biomarcador potencial de enfermedades metabólicas, hepáticas y en
la diabetes. (Eng 2015)
Los compuestos que simplifican el espacio muestral definidos como
componentes principales entre los 6 grupos de estudio son el undecano y el 2,2,3,4
tetrametil pentano. Ambos compuestos muestran no tener diferencias significativas en
la Tabla 11, para ser considerados como potenciales biomarcadores de todo el
espectro entre sujetos normoglicémicos hasta llegar a un estado crítico de diabetes.
En las Figura 5.17 Figura 5.18, y Figura 5.19 se muestran los planos de factores de
individuos.
En la Figura 5.17 se observa que los sujetos con ITG son colocados en el cuadrante
superior derecho en su mayoría. Los sujetos con GAA+ITG se localizan en el cuadrante
inferior izquierdo, al igual que los sujetos con TNG. Se puede observar como este último
grupo se encuentra muy cercano al eje x = 0, colocándolo en su mayoría muy cercano
al origen. En este plano es posible observar el espectro que crea el estudio de pacientes
normoglicémicos y prediabéticos y que en general separa a estos 3 grupos de estudio.
Además, que con este análisis se demuestra fácilmente que las dos condiciones de
prediabetes están vinculadas a diferentes metabolitos encontrados en el aliento por su
localización en diferentes cuadrantes.
En la Figura 5.18 se observa al 100% de los sujetos con CDMT2 en el cuadrante
inferior izquierdo. El 80% de los sujetos con DMT2 se localizan en el cuadrante inferior
derecho. Los sujetos con TNG en su mayoría los localiza en el cuadrante superior
izquierdo. En este plano se observa claramente la diferenciación por grupos de
pacientes normoglicémicos y diabéticos.
En la Figura 5.19 se observa el espectro creado por los 6 grupos de estudio. Se observa
a los sujetos con CDMT2 en su mayoría en el cuadrante inferior izquierdo, los sujetos con
DMT2 en el cuadrante inferior derecho, los sujetos con RDMT2 sobre el eje x = 0, los sujetos
con ITG en el eje superior derecho, los pacientes con GAA+ITG en el cuadrante inferior
izquierdo y los sujetos con TNG prácticamente en el origen del plano, como era de
esperarse.
69
Figura 5.17 Plano de factores de individuos, Caso A: TNG, GAA+ITG, ITG.
Figura 5.18 Plano de factores de individuos, Caso B: TNG, DMT2, CDMT2.
70
Figura 5.19 Plano de factores de individuos, Caso C: TNG, GAA+ITG, ITG, RDMT2, DMT2, CDMT2.
5.6 ANÁLISIS CUANTITATIVO
5.6.1 CURVAS DE CALIBRACIÓN
Como resultado de realizar la dilución estática descrita en los métodos TO-01 y
TO-17 de la EPA se obtuvo un bulbo gaseoso.
Las concentraciones en el bulbo de dilución estática y en la bala gaseosa de los
compuestos en estándares gravimétricos gaseosos se presentan en la Tabla 14. Estas
concentraciones se ocuparon para hacer las curvas de calibración, al inyectar ciertos
volúmenes del compuesto, en forma gaseosa, en el CG-EM-DIF del CCA, UNAM.
En la Figura 5.20 se muestra una de las curvas de calibración obtenidas.
71
Tabla 14. Concentraciones de los compuestos
Compuesto Concentración
gaseosa (ug/ml)
Etanol 3.7 ± 0.2
Butano 0.00203±0.00001
Acetona 7.4 ± 0.2
Isopreno 6.3 ± 0.2
2-butanona 7.5 ± 0.2
2-pentanona 7.5 ± 0.2
2-etoxietanol 38.9 ± 0.2
1-pentanol 7.6 ± 0.2
2-hexanona 7.5 ± 0.2
Benzaldehido 9.7 ± 0.2
Limoneno 11.7 ± 0.2
Ciclohexano 0.00289 ± 0.00001
m/p-xileno 0.001769 ± 0.000009
m-xileno 0.00347 ± 0.00002
Undecano 0.00480 ± 0.00002
Figura 5.20. Curva de calibración del butano.
5.6.2 CUANTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS EN LAS MUESTRAS DE ALIENTO
Con el ajuste de las curvas de calibración, se pudieron obtener las
concentraciones de los compuestos en el aliento en los diferentes grupos de estudio.
72
La Tabla 15 muestra el promedio de la concentración en partes por billón volumétricas
(PPBv) de estos compuestos en los diferentes grupos estudiados en este trabajo.
Tabla 15. Concentración de metabolitos en el aliento (PPBv)
Metabolito/Grupo NGT ITG GAA+ITG RDMT2 DMT2 CDMT2
Etanol 54.2 ± 0.5 54.0 ± 0.3 53.0 ± 0.8 55 ± 1 53.9 ± 0.4 52.0±0.4
Butano 90 ± 19 114 ± 30 128 ± 52 85 ± 27 54 ± 12 20 ± 6
Acetona 265 ± 41 256 ± 16 158 ± 19 188 ± 23 391 ± 136 2215 ±
1523
Isopreno 122 ± 17 139 ± 19 95 ± 9 125 ± 41 243 ± 72 118± 25
2-Butanona 71 ± 2 78 ± 4 65.8 ± 0.5 71 ± 2 81 ± 4 68 ± 3
Ciclohexano 20 ± 7 16 ± 5 6 ± 3 14 ± 5 22 ± 5 5 ± 1
2-Pentanona 27.8 ± 0.4 30 ± 1 27.7 ± 0.4 28.2 ± 0.8 32 ± 1 27.1± 0.8
2-Etoxi Etanol 183 ± 2 188 ± 4 189 ± 8 184 ± 1 184 ± 2 179 ± 0.2
1-Pentanol 39 ± 1 38.2 ± 0.5 38.6 ± 0.9 38.9 ± 0.8 40.0 ± 0.8 37.1 ± 0.3
2-Hexanona 27.4 ± 0.5 27.9 ± 0.7 27.2 ± 0.7 28.1 ± 0.8 30.4 ± 0.7 26.1± 0.2
p Xileno 9 ± 3 4.0 ± 0.6 3.9 ± 0.9 2.8 ± 0.5 4.6 ± 0.5 2.2 ± 0.7
m Xileno 11 ± 4 4.0 ± 0.6 4 ± 1 2.8 ± 0.5 4.6 ± 0.6 2.3± 0.8
Benzaldehido 76 ± 4 87 ± 4 72 ± 1 80 ± 6 83 ± 3 74± 3
Limoneno 31 ± 3 48 ± 14 30 ± 3 24.6 ± 0.5 53 ± 13 25 ± 2
Undecano 4.1 ± 0.6 3.5 ± 0.6 3.4 ± 0.9 3.1 ± 0.4 6.4 ± 0.7 3.3 ± 0.5
En la Tabla 15 se muestran las concentraciones de 15 compuestos que se
presentan en el aliento.
Esencialmente todos son biomarcadores potenciales de la DMT2. Aunque
también se observan las concentraciones de los compuestos de los pacientes con
prediabetes, siendo algunos los que cuentan con alguna diferencia significativa para
apuntar a esta condición metabólica. También se observan las concentraciones para
el grupo con tolerancia normal a la glucosa (NGT), los cuales han sido estudiados como
línea basal entre sujetos sanos y diabéticos por Gallego (2016).
Con la identificación y cuantificación de los compuestos orgánicos volátiles en el
aliento, es posible acercarnos a la investigación de métodos más prácticos, para el
diagnóstico de la enfermedad, como la utilización de sensores de detección específica
de estado sólido, narices electrónicas y dispositivos POC.
Actualmente existen diversas investigaciones en las cuales se han creado
sensores de alta sensibilidad de compuestos.
Li (2016) y colaboradores han desarrollado un sensor de gran sensibilidad (11.06
ug/ml) de 2-butano gaseoso, elaborado con hojas de g-C3N4 y nanopartículas de óxido
de cobre añadidas.
Wei (2012) y colaboradores han desarrollado un sensor a base de nitruro de indio
con resolución por debajo de partes por billón (ppm) para la detección de acetona en
el aliento en sujetos diabéticos.
73
Lee (2015) desarrolló un sensor sensible a terpenos como el limoneno con
resistencias tipo puente y tecnología CMOS. Este sensor es capaz de detectar
concentraciones de pocas ppbv de limoneno.
Chatterjee (2013) y colaboradores desarrollaron una nariz electrónica (e-nose) a
partir de sensores de resistencia cuántica y nanocompuestos de polímeros conductores.
Ellos se basaron en un conjunto de metabolitos identificados como biomarcadores del
cáncer de pulmón. Este dispositivo es capaz de detectar una serie de compuestos, entre
ellos etanol, acetona, propanol, 2-butanona, ciclohexano, isopreno y xileno en
concentraciones hasta por debajo de concentraciones del orden de ppm.
74
CAPITULO 6: CONCLUSIONES
Respecto a la caracterización y clasificación de pacientes, se concluye que toda
investigación clínica, que involucra a seres humanos, conlleva una gran complejidad.
Un ejemplo que se observó claramente en este trabajo, fue que, dado que se investigó
a fondo la condición médica de los pacientes; no todos los pacientes clasificados en el
grupo de control podrían definirse con un cuadro sano, se clasificaron como
normoglicémicos dado que sus condiciones diagnosticadas fueron consideradas
irrelevantes para nuestro estudio. De igual manera los sujetos que presentaban cuadros
de prediabetes y diabetes también presentaban condiciones diversas no asociadas con
la diabetes directamente, pero si asociadas a factores genéticos, ambientales,
socioculturales, nutricionales, geográficos, entre otros, que originan ambas condiciones
de manera independiente.
Respecto al análisis de correlación visual de los cromatogramas se concluye que
fue posible observar diferencias significativas, tanto en cromatogramas con señal DIF y
con señal EM entre los 6 grupos de estudio. Además, que es posible el análisis cualitativo
por forma de pico de los compuestos de interés en el equipo de CG-EM-DIF empleado.
Esto es que, para un cierto compuesto su pico, en los diferentes grupos de estudio con
una condición prediabética o diabética, se puede apreciar como un pico con curvas
suaves y amplias si tiene niveles bajos de abundancia y picos en forma de impulso para
niveles altos de abundancia del compuesto en el aliento comparados con el pico del
compuesto para sujetos del grupo TNG.
Referente al análisis cualitativo de las muestras de aliento, se observó que al
hacer el contraste entre el grupo TNG y los grupos prediabéticos, algunos de los
metabolitos estudiados en este trabajo representan potenciales biomarcadores para la
prediabetes.
Estos potenciales biomarcadores se puede clasificar en tres casos. El primer caso
es que el metabolito estudiado en ambos grupos de prediabetes contrastado con el
grupo TNG cuente con una diferencia significativa y que el error estándar no se traslape
entre los tres grupos. Este caso se consideraría un biomarcador potencial primario, ya
que para los dos tipos de prediabetes se estaría detectando la condición metabólica
de prediabetes. Los potenciales biomarcadores primarios encontrados en este trabajo
son la 2-butanona, el 1-hepteno y el p-xileno.
El segundo caso es que el metabolito estudiado solo tenga una diferencia
significativa para uno solo de los grupos prediabéticos respecto al contraste con el
grupo TNG y que el error estándar de este grupo prediabético no se traslape con el del
grupo TNG. Y más importante, que tenga una diferencia apreciable entre medias y error
estándar del otro grupo prediabético. En este caso el metabolito se consideraría como
biomarcador secundario, con el cual se podría diferenciar entre nuestros dos grupos que
caracterizan a la condición prediabética. Algunos compuestos encontrados como
potenciales biomarcadores secundarios son la acetona, el 1-propanol, el benzaldehído
75
y el compuesto Y. El limoneno, a pesar de cubrir con los requisitos de este caso, tiene un
historial extenso en la literatura de ser correlacionado con enfermedades hepáticas, lo
cual, de ser considerado como único biomarcador, dificultaría un diagnóstico acertado
de ambas enfermedades. Esto expone que un biomarcador puede tener un amplio
espectro para detectar enfermedades, por lo que sería conveniente considerar para un
diagnóstico de enfermedad un conjunto de metabolitos alterados.
El tercer caso se define por dos condiciones, una es que las medias entre los tres
grupos tengan valores muy similares sin importar el error estándar, la segunda condición
es que el error estándar de alguno de los 3 grupos sea tan grande que englobe la media
y el error estándar de los otros dos grupos. Ninguno de los compuestos que caen bajo
estas condiciones serán considerados como potenciales biomarcadores de diagnóstico
para la prediabetes.
Una vez ya analizados los compuestos, para clasificarlos en alguno de los casos
anteriormente mencionados, si se ordenan los compuestos en base al número de
moléculas de carbono, de menor a mayor, se observa que los compuestos muy ligeros
y ligeros se asocian mayormente a una diferencia entre el grupo TNG y el grupo
prediabético GAA+ ITG, y los compuestos pesados se asocian mayormente a una
diferencia entre el grupo TNG y el grupo ITG.
Se concluye que algunos biomarcadores tienen comportamiento lineal, fácil de
analizar con diferencias apreciables entre cada etapa entre un paciente sano y un
paciente con diabetes diagnosticada, sin embargo, otros compuestos parecen no tener
este comportamiento lineal, lo cual hace que su uso como un biomarcador primario sea
difícil, ya que, al no seguir una tendencia lineal de crecimiento o decrecimiento, dos
estados diferentes de salud pueden darnos una misma medida en este biomarcador.
Como ejemplo de esto, en caso de elegir a la acetona como un biomarcador
de seguimiento desde etapas sanas, hasta la etapa crítica de la enfermedad, se
observaría al principio una caída en los valores de concentración, y de aquí al
presentarse la enfermedad, los niveles empezarían a aumentar. Sería necesario
considerar otros biomarcadores potenciales, para determinar el estado del paciente, si
no hay un registro completo de su evolución.
El análisis de los resultados de Figura 5.12 y Tabla 11, concernientes al análisis de
pacientes en diferentes estadios de DMT2 comprueban y respaldan los resultados
obtenidos en el trabajo previo de Gallego (2016).
Los componentes principales, del análisis de componente principales, de los tres
grupos estudiados en el 5.5.3 mostraron una buena descripción de la varianza.
Aunque todos los compuestos han presentado ser potenciales biomarcadores
para la diabetes, los componentes principales, para los grupos TNG y prediabéticos,
coincidieron con compuestos poco significativos en el estudio cualitativo de los
compuestos. Este mismo resultado se repitió para el ACP de los 6 grupos estudiados. Se
concluye que para estos dos casos estos componentes mostraron la mayor estabilidad
76
y similitud en el ACP, a diferencia del ACP para los grupos TNG y diabéticos, donde los
componentes principales coinciden con compuestos con variaciones significativas del
grupo TNG. Por tanto, los componentes principales de mayor relevancia para sujetos
prediabticos resultan no ser una gran opción como potenciales biomarcadores de la
prediabetes.
Además, el ACP nos presentó una buena diferenciación entre grupos con el
análisis visual de los mapas de factores individuales de los grupos estudiados,
especialmente para sujetos con CDMT2 y DMT2.
El análisis estadístico descriptivo respalda la postulación de los biomarcadores
primarios para la prediabetes. En este análisis se observó que tentativamente el 2,4,6
trimetilheptano puede ser considerado como un compuesto de interés para la
prediabetes, pero el análisis cualitativo y el error estándar considerado en la medición
no lo respaldan.
Con el análisis de varianza del 1-heptano y la 2-butanona se respalda la
propuesta de que estos compuestos sean considerados como potenciales
biomarcadores primarios y el 1-propanol como potencial biomarcador secundario.
Con el análisis cuantitativo de algunos de los potenciales biomarcadores para la
diabetes encontrados por Gallego (2016), se obtuvo la concentración de 2 de los
potenciales biomarcadores primarios para la prediabetes, la 2-butanona y p-xileno. Las
concentraciones que fueron calculadas para potenciales biomarcadores secundario
de la prediabetes fueron para la acetona, el isopreno, el Ciclohexano, el benzaldehído
y el limoneno.
Se recomienda como método más confiable de diagnóstico de la prediabetes
por medio del aliento exhalado, la utilización de grupos de compuestos, como una
combinación de los potenciales biomarcadores en este trabajo definidos como
primarios y secundarios. Con la finalidad de asegurar la identificación de la condición
de salud específica en la que se encuentra el paciente.
Al concluir esta fase de la investigación, la cual abordó la problemática del
diagnóstico temprano de la diabetes en la población mexicana de una manera no
invasiva, al enfocarnos en identificar potenciales biomarcadores para la prediabetes y
diabetes en el aliento humano, el siguiente paso natural de este proyecto es la
investigación de detectores o sensores que puedan identificar los compuestos gaseosos
de hasta algunas centenas de ppbv, y posteriormente la construcción de dispositivos
más eficientes y asequibles que puedan incluir los detectores del grupo de compuestos
elegidos para el diagnóstico de la enfermedad.
77
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INDICE DE FIGURAS TABLAS Y ECUACIONES
