HPLC

HPLCCromatografía líquida de alta

presión, de alta resolución de o de alto precio…

HPLC

• Al principio se seleccionó la presión como el criterio principal de la cromatografía líquida y de ahí su nombre: High Pressure Liquid Chromatography.

• Esto parecería indicar que se mejora el comportamiento de la columna debido principalmente a la elevada presión.

HPLC

• Esto no es cierto; la buena resolución es el resultado de la combinación de muchos factores: partículas muy pequeñas distribuidas en un intervalo de tamaños angosto, tamaño de poros uniforme, bajos volúmenes de inyección de muestra, detectores sensibles de bajo volumen y por supuesto, buen sistema de bombeo.

HPLC

• Naturalmente, la presión se necesita para permitir circular un determinado caudal de la fase móvil, pues de otra manera, resulta ser un factor negativo que no contribuye a mejorar la separación.

HPLC

• Fase móvil : es un líquido.

• Hay cuatro tipos básicos de cromatografía:

- Partición o reparto.

- Adsorción o líquido sólido.

- Intercambio iónico.

- Exclusión por tamaño o permeación por geles.

HPLC: Aplicaciones

• Productos farmacéuticos.• Productos químicos.• Alimentos.• Toxicología.• Ambiente.• Bioquímica.• Petroquímica.• Polímeros.

HPLC

• Determinación cualitativa y cuantitativa.

• Técnica no destructiva.

Limitaciones

• La identificación (cualitativa) de compuestos puede estar limitada si no se acopla con un espectrómetro de masas.

• La resolución puede ser difícil de obtener en muestras complejas.

• Solamente se puede analizar una muestra por vez.

Limitaciones

• Las bandas no solamente se separan sino que además se ensanchan.

• El ensanchamiento de las bandas se puede minimizar si se realiza una adecuada selección del tamaño de las partículas de la fase estacionaria y la forma en que se rellena la columna.

HPLC: cómo trabaja?

• En la cromatografía, los solutos se resuelvencon velocidades diferenciales de elución a medida que pasan por la columna cromatográfica.

• Separación: distribución del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria.

HPLC

• Es la técnica analítica más ampliamente usada, siendo un proceso separativo que se basa en la transferencia de masa del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria.

• Emplea una fase móvil líquida para separar los componentes de una mezcla. Estos analitos, se disuelven primero en un disolvente, y luego se los fuerza a fluir a través de una columna cromatográfica, mediante una presión elevada.

HPLC

• En la columna, la muestra se resuelve en sus componentes.

• El grado de resolución es importante, pues depende del grado de interacción entre los componentes solubles y la fase estacionaria.

• La fase estacionaria se define como el material de relleno inmóvil en la columna.

Historia

• Las primeras, incluyendo la de Tswett, se efectuaron en columnas de vidrio con diámetros de 1 a 5 cm y largos de 50 cm a

500 cm. Para asegurar caudales razonables, el diámetro de las partículas de la fase estacionaria estaba entre

150 µm y 200 µm.

Cromatografía líquida (Tswett)

• Columna: tubo de vidrio.

• Relleno: carbonato de calcio pulverizado.

• Muestra: extracto de hojas de plantas.

• Fase móvil: éter de petróleo.

• El nombre ha permanecido hasta hoy a pesar que la mayor parte de los compuestos analizados son incoloros.

Historia

• Los científicos se dieron cuenta que aumentaba la eficiencia de la columna al disminuir el tamaño de partículas del relleno.

• A partir de 1960, aparece la HPLC con diámetros de partículas del relleno entre

3 µm y 10 µm, empleando equipos más sofisticados, con mayores presiones.

HPLC

• Es la más utilizada de todas las técnicas separativas analíticas. Las razones de la popularidad del método son:

• Sensibilidad.

• Adaptabilidad a determinaciones cuantitativas exactas.

• Adecuabilidad para separar especies no volátiles o térmicamente frágiles.

Cromatografía líquida

Aplicaciones de cada tipo de cromatografía líquida

• PM > 10 000: Permeación por geles y Cromatografía de Fase Inversa.

• PM < 10 000 y especies iónicas: Cromatografía por Intercambio Iónico.

• Especies no iónicas, polares, pequeñas (separación de miembros de series homólogas): Cromatografía por partición o reparto.

. Especies no polares e isómeros estructurales, hidrocarburos alifáticos de los alcoholes alifáticos:Cromatografía por Adsorción o Líquido Sólido.

Cromatografía líquida

Cromatografía de partición

Cromatografía

• Tres componentes fundamentales:

• MUESTRA.

• FASE MÓVIL.

• COLUMNA.

HPLC

• Condiciones de la cromatografía:

• Muestra: tamaño.

• Fase móvil: caudal; composición.

• Columna: largo y diámetro; relleno; temperatura.

Porqué emplear HPLC?

• Tiempo: Una cromatografía clásica puede tardar entre 2 h y 12 h. Con HPLC, un análisis equivalente se reduce a 2 min y 12 min.

• Reproducibilidad: la clásica se debe rellenar en cada análisis, incrementando la posibilidad de errores. Una columna de HPLC se puede utilizar para cientos o miles de muestras.

Porqué emplear HPLC?

• Cuantificación: la clásica fue y es aún una técnica excelente para la preparación o purificación de muestras, pero requiere recolección adicional para ser útil en un análisis cuantitativo.

• Con HPLC, los detectores on line proveen información cuantitativa durante el curso de la separación.

Porqué HPLC?

• Sensibilidad: en la CL clásica, se empleaban columnas largas y volúmenes grandes de fase móvil, con lo que se diluía la muestra y eso limitaba la sensibilidad de la técnica.

• La HPLC minimiza las columnas (son miniaturas) y mantiene la dilución en un mínimo.

Fase móvil

• El tipo y la composición de la fase móvil (eluyente) son variables que influyen en la separación.

• Las propiedades comunes a los diversos disolventes que se emplean son:

Propiedades de los disolventes (fase móvil)

• Pureza.

• Compatibilidad con el detector.

• Solubilidad de la muestra.

• Baja viscosidad.

• Inercia química.

• Precio razonable.

Columna: eficiencia

• Efecto del tamaño de partículas del relleno.

• Ensanchamiento de banda extra columna.

• Tamaño de muestra.

Efecto del tamaño de partículas

• CM, coeficiente de transferencia de masa de la fase móvil,es función del d2

p que conforman el relleno.

• Se incrementa dramáticamente la eficiencia de la columna de HPLC, si disminuye el diámetro de partícula.

Porqué rellenas?

• Para aumentar la eficiencia de la columna, en CG se incrementa la velocidad de transferencia de masa entre la FM y la FE.

• En las columnas tubulares abiertas, se consigue al disminuir el espesor de la FE y reducir el diámetro de la columna. (las moléculas difunden rápidamente de la vena gaseosa a la FE que recubre la pared).

Porqué rellenas?

• En los líquidos, la difusión en 100 veces más lenta que en los gases, por eso en CL, por lo general, no es factible emplear columnas tubulares abiertas, pues el diámetro de la vena líquida del disolvente es muy grande para que la molécula del soluto lo recorra en poco tiempo, y de ahí el empleo de columnas rellenas.

Diámetro de las partículas del relleno

• La eficiencia de una columna rellena aumenta al disminuir el tamaño de las partículas.

• En condiciones óptimas, el número de platos teóricos de una columna de largo L es:

N = 3500 x L(cm)/dp (µm)

Diámetro de las partículas del relleno

Influencia del diámetro de las partículas

• La mejor resolución R es porque permiten un flujo más uniforme a través de la columna, reduciendo el término A.

• Otra razón es que el camino que recorre el soluto difundiendo en la FM, entre las partículas es del mismo orden que el tamaño de ellas; o sea, a menor tamaño de partículas, menor es la distancia en la que difunde el soluto. (disminuye C).

Ensanchamiento extra columna

A veces ocurre fuera del relleno de la columna, a medida que el soluto pasa por tubos abiertos, tales como: el sistema de inyección, la región del detector y la conexión de tuberías.


• Surge por la diferencia de las velocidades del flujo entre capas del líquido adyacente a las paredes y el centro del tubo.

• La difusión es más lenta en el líquido que en el gas, por eso se vuelve notable para estos casos. (100 veces más lenta).


π r2 u

Hex = ------------

24 DM

Tamaño de la muestra

• Efecto del tamaño de la muestra sobre la eficiencia: microgramos de muestra por gramo de relleno.

• Se nota el mejor comportamiento de la cromatografía en fase inversa, en rellenos ligados (enlazados) comparados con los otros.

Instrumentos

• Para obtener caudales de eluyente razonables con rellenos de 2 µm a 10 µm, es necesario emplear presiones de bombeo de varios miles de psi.

(1 atm = 14,7psi). Las presiones típicas varían entre 70 y 400 atm.

• Por eso, el equipo es más elaborado y caro, respecto de los otros tipos de cromatografía.

Instrumentación

Instrumentación

Son 8 componentes básicos:• Reservorios de la fase móvil.• Sistema de suministro de disolvente.• Elemento para introducir la muestra.• Columna.• Detector.• Reservorio del residuo.• Tuberías de conexión.• Computadora, integrador o registrador.

Reservorios de la fase móvil

* Uno o más, recipientes limpios, inertes, de vidrio o acero inoxidable.

• Contienen generalmente 200 ml a 1000 ml de un disolvente.

• Equipados con un desgasificador (generalmente para O2 y N2), para eliminarlos pues interfieren formando burbujas en la columna y en el sistema de detección.

• Filtrado si es necesario, para eliminar las partículas pequeñas, con filtros de poros de 0,22 µm a 0,45 µm.

• Con tapa que permita pasar la tubería. • Reactivos altamente purificados, grado HPLC.

Desgasificadores

• Pueden ser un sistema de bombas de vacío, un sistema de destilación, aparatos para calentar y agitar el disolvente, o sistemas de burbujeo en que los gases son barridos de la disolución por finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad (He).

• A veces contienen un sistema de filtro de polvo y material particulado de los disolventes.

• Igual que los filtros, pueden ser parte o no,del instrumento.

Fase móvil

• La que usa un solo disolvente de composición constante (o una mezcla), se denomina elución isocrática.

• Se mejora frecuentemente la eficiencia de la separación mediante la elución en gradiente.

• En ella se emplean dos o a veces más disolventes, que difieren significativamente en polaridad.

Fase móvil

• Se varía la relación de los disolventes en una manera programada, continuamente o en etapas.

• Actualmente, en los equipos hay reservorios de donde salen dos o más disolventes a una cámara de mezclado a velocidades que varían continuamente.

• La relación de los volúmenes se puede alterar linealmente o exponencialmente con el tiempo.

Fase móvil

• Las propiedades de los eluyentes que se pueden variar para producir elución en gradiente son:

• Fuerza iónica.

• pH.

• Fuerza en la serie elutrópica.

• Constante dieléctrica.

Índice de polaridad

• Este parámetro se basa en las mediciones de solubilidad para la sustancia en cuestión, en tres disolventes, dioxano (un aceptor de dipolo de protón bajo), nitrometano (un aceptor de dipolo de protón alto) y alcohol etílico (un donor de dipolo de protón).

• Es un número que mide la polaridad relativa de varios disolventes.

Poder eluyente de FM

Separaciones

• Las más sencillas, se pueden realizar usando la elución isocrática.

• Para análisis más complejos, se requiere la elución en gradiente.

• Se modifica la composición de la fase móvil a medida que ocurre la separación.

• Los compuestos altamente retenidos eluyen menos rápidamente y los que son eluidos primero quedan bien resueltos.

Ejemplos

• La segunda es una elución isocrática con una solución 50 % (v/v) de metanol – agua.

• La primera es para una elución en gradiente, que se inició con 40 % : 60 % de los dos disolventes y luego la concentración de metanol se incrementó a una velocidad de

8 %/min.

Ejemplos

• La separación se acorta significativamente por la elución en gradiente sin sacrificar la resolución de los picos iniciales.

• Los efectos de la elución en gradiente, son semejantes a los efectos producidos por la programación de temperatura en la cromatografía gaseosa.

Sistema de bombeo• Los requerimientos de presión son severos e

incluyen:

- Generación de presiones de hasta 6000 psi (400 atm).

- Salida libre de pulsos.- Caudales entre 0,1 ml/min a 10 ml/min.- Control de flujo y reproducibilidad de flujo de 0,5% o

mejor.- Componentes resistentes a la corrosión (sellos de

acero inoxidable o Teflon).

Condiciones ambientales

• Las altas presiones no constituyen un peligro explosivo pues los líquidos no son muy compresibles.

• A lo sumo, la rotura puede producir una pérdida.

Bombas

Sistema de suministro de disolvente.

Debe asegurar un suministro de caudal libre de pulsos, constante, reproducible, preciso.

Bombas

• Hay tres tipos:

• Reciprocantes, a pistón. (caudal constante).

• Tipo jeringa o de desplazamiento (mecánicas).

• Neumáticas o de presión constante.

Bombas

• Si se provocan pulsos en los flujos, estos son indeseables pues:

* causan problemas a la hora de la detección.

* impiden un buen análisis cuantitativo.

* conducen a una temprana falla de la columna.

Bomba reciprocante

Bombas reciprocantes

• Se usan en el 90 % de los equipos, consisten generalmente de una cámara pequeña (35 µL a 400 µL), en la que el disolvente se bombea hacia delante y hacia atrás mediante un pistón movido por un motor.

• Dos válvulas que se abren y cierran alternadamente, controlan el flujo del disolvente hacia adentro y fuera de un cilindro.


• En el movimiento hacia atrás, el pistón aspira el eluyente desde el reservorio y debido a las válvulas de chequeo se cierra la salida a la cámara de separación.

• Durante el avance, el eluyente es empujado dentro de la columna y la entrada del reservorio se cierra.


• El movimiento de bombeo del pistón produce un flujo de pulsos que requiere atenuación.

• Estas bombas generan una alta presión de salida con caudales constantes y la posibilidad de usar la elución por gradiente.


• Con cabeza simple, el 50 % del tiempo la fase móvil fluye hacia la columna y en el otro 50 % se llena la cámara.

• Con cabezas gemelas, operan desfasadas

180 º y la fase móvil fluye hacia la columna el 100 % del tiempo, libre de pulsos.


• Desventajas: producen flujo con pulsos, que se deben minimizar porque su presencia aparece como ruido en la línea base del cromatograma.

• Ventajas: pequeño volumen interno (35 µl a

400 µl), presiones de salida de hasta

10 000 psi, fácil adaptabilidad a elución en gradiente y caudales constantes, independientes de la presión de la columna y viscosidad del disolvente.

Bomba por desplazamiento

Bombas por desplazamiento

Consisten de cámaras tipo jeringa, grandes, equipadas con un émbolo que es activado por un mecanismo de tornillo con un motor en etapas.

• Presuriza un volumen finito de disolvente y envía un flujo constante libre de pulsos al sistema.

• Producen un flujo que tiende a ser independiente de la viscosidad y la presión.

Bombas por desplazamiento

• Desventajas:

• Capacidad de disolvente limitada (250 ml).

• Considerables inconvenientes cuando se deben cambiar los disolventes.

• Son caras.

• Elución en gradiente: necesitan dos bombas, por lo menos.

Bomba neumática

Bombas neumáticas

• Se operan vía presión de un gas. Un pistón de gran área mueve a otro de área pequeña cuando actúa la presión de una línea de gas.

• La presión del gas es amplificada en la relación de las áreas de las fuerzas de los pistones y se introduce un líquido a alta presión,a presión constante.

Bombas neumáticas

• Ventajas: Son baratas y libres de pulsos.

• Si ocurre un bloqueo parcial en el sistema ocurre una caída en el caudal pero la presión se mantiene constante.

• Desventajas: Tienen poca capacidad.

• No sirven para elución en gradiente y se utilizan con presiones inferiores a

2000 psi.

Sistemas de control

• Muchos equipos tienen elementos controlados por computadora para medir el caudal, determinando la caída de presión en una restricción colocada a la salida de la bomba.

• Cualquier diferencia con un valor prefijado se usa para incrementar o disminuir la velocidad del motor de la bomba.

Sistemas de programación

• Muchos equipos tienen un medio para variar la composición del disolvente ya sea continuamente o en forma escalonada.

Sistemas de inyección de la muestra

• A menudo la precisión de la cromatografía líquida está limitada por la reproducibilidad con que se introducen las muestras en el relleno de la columna.

• El problema es mayor cuando se produce el ensanchamiento de bandas por la sobrecarga de la columna.

• Por eso, los volúmenes deben ser minúsculos (décimas de microlitros hasta 500 µl)

• Conviene no despresurizar el sistema.


• El medio más simple e inicial para la introducción de la muestra, es la inyección con jeringa a través de un septum.

• Con este fin, se emplean las microjeringas diseñadas para soportar presiones hasta

1500 psi.


• En las inyecciones de flujo parado, se interrumpe el flujo del disolvente momentáneamente, se elimina una conexión en la cabeza de la columna y se inyecta la muestra directamente en la cabeza del relleno de la columna.

• Después del reemplazo de la conexión, se presuriza el sistema nuevamente.

Ventajas y desventajas

• Ventaja: su simplicidad.

• Desventaja: la reproducibilidad de la inyección de la jeringa es raramente superior al 2% a 3% y es aún peor.

• El método más empleado de introducción de la muestra en la CL es mediante los lazos de muestreo.

HPLC: sistema de inyección

Lazos de muestreo

• A menudo son una parte integral de los equipos de la CL y tienen lazos intercambiables que proveen una elección de los tamaños de la muestra desde 5µL hasta 500 µL.

• Los lazos de muestreo de este tipo permiten la introducción de muestras hasta 7 000 psi con precisiones de algunas décimas porcentuales relativas.

• Se disponen de válvulas de inyección de las micro muestras con lazos de muestreo, que tienen volúmenes de 0,5 µL a 5 µL.

Muestras

• Deben estar en forma líquida para la inyección en el instrumento; las muestras sólidas se deben disolver en un disolvente compatible con las fases móvil y estacionaria.

Muestras

• Cantidad:

• Se inyectan de 1 µl a 100 µl; generalmente 5 µl a

10 µl; las cantidades en masa inyectadas varían dependiendo de la sensibilidad y el rango dinámico del detector.

• Preparación:

Se puede requerir una preparación de la muestra limitada o extensa, que queda definida por su complejidad relativa.

Preparación de la muestra

• Puede incluir cualquiera de las etapas siguientes:

* Dilución.

* Preconcentración.

* Filtración.

* Extracción.

* Ultrafiltración.

Tiempo de análisis

• Está comprendido en un intervalo de

5 min a 2 h.

• Generalmente ocurre entre 10 min y

25 min.

• La preparación de la muestra difiere de una a otra. Puede ser extensa y requerir más tiempo que el análisis mismo.

Análisis

• Requiere entrenamiento de manera de optimizar las separaciones.

• Se requiere a menudo la preparación de la muestra.

Columnas

• Se construyen de acero inoxidable, plástico, aunque a veces hay de vidrio. En este caso, la presión máxima es 600 psi.

• Los precios de la columnas rellenas varían de 200 a 500 dólares.

Columnas analíticas

• La mayoría de la columnas tiene entre 10 cm y 30 cm.

• Normalmente son rectas con largos adicionales, cuando se necesita, mediante acoples de dos o más columnas juntas.

• El diámetro interior está comprendido entre4 mm y 10 mm.

• Los tamaños de partícula del relleno más comunes son:3 µm, 5 µm ó 10 µm.


• Las columnas más comunes de 25 cm de largo, 4,6 mm de diámetro interior y con relleno de partículas de 5 µm, tienen entre 40 000 platos / m y 60 000 platos / m.

• Se han producido aún más pequeñas, con largos de 3 cm a 7,5 cm. Pueden tener hasta 100 000 platos / m, con mucha velocidad y consumo mínimo de disolvente.

Columna de guardia o precolumna

• Se coloca antes de la columna analítica para incrementar su vida, eliminando el material particulado y los contaminantes del disolvente.

• Además, sirven para saturar la fase móvil con la fase estacionaria de manera de minimizar las pérdidas del disolvente de la columna analítica.

Columna de guardia o precolumna

• La composición del relleno de la columna de guardia debe ser similar a la de la columna analítica, pero el tamaño de partículas es generalmente más grande, sin embargo, para minimizar la caída de presión.

• Cuando se contamina, se rellena nuevamente o se descarta y reemplaza por una nueva del mismo tipo.

• Se la sacrifica para proteger a la columna analítica, que es mucho más cara.

Termostatos

• Para muchas aplicaciones, no es necesario el control de temperatura y las columnas operan a la temperatura ambiente.

• A menudo se obtienen mejores cromatogramas si se la mantiene constante, desde la ambiente hasta

150 ºC.

• Pueden tener también baños con agua, con temperatura constante.

Tipos de rellenos

• Se han usado dos en CL:

• Pelicular.

• Partícula porosa.

Relleno pelicular

• Consiste de bolillas esféricas, no porosas, de vidrio o polímero, con diámetros típicos de 30 a 40 µm.

• Se deposita una delgada capa porosa de sílice, alúmina, una resina sintética de poliestireno –divinil benceno o una resina de intercambio iónico, sobre la superficie de estas bolillas.

Relleno pelicular

• Para algunas aplicaciones, se aplica un recubrimiento adicional, que consiste de una fase estacionaria líquida que se mantiene adsorbida.

• Pueden también ser tratadas químicamente para dar una capa de superficie orgánica.

Relleno pelicular

• Se emplean más para las columnas de guardia y no tanto para las columnas analíticas.

Relleno poroso

• Un relleno típico para CL consiste de micropartículas porosas que tienen diámetros entre 3 µm a 10 µm.

• Las partículas son de sílice, alúmina, una resina sintética de poliestiereno – divinil benceno o una resina de intercambio iónico, con la primera como la más común.

Relleno poroso

• Se preparan las partículas de sílice aglomerando submicro partículas de sílice bajo condiciones que conducen a partículas más grandes que tiene diámetros muy uniformes.

• Las partículas resultantes se recubren a menudo con películas orgánicas delgadas, que son unidas química o físicamente a la superficie.

Detectores

• A diferencia de la cromatografía gaseosa, no existen detectores universales y confiables como los de ionización en llama y conductividad térmica.

Detectores

Tipos de Detectores

• Hay dos categorías:• De propiedades masivas, por ejemplo, el índice de

refracción, la constante dieléctrica o densidad de la fase móvil, que es modulada por la presencia de solutos.

• De propiedades del soluto, como absorbancia de radiación UV, fluorescencia o corriente de difusión, que no es poseída por la fase móvil. Estos son más sensibles que los primeros en el orden de 1000 veces o más.

Comparación de detectores

Detectores

• El rol más importante del detector de HPLC es monitorear los solutos a medida que eluyen.

• Genera una señal eléctrica, proporcional al nivel de alguna propiedad de la fase móvil o de solutos.

HPLC

• Características necesarias de un buen detector de HPLC1) Sensibilidad.2) Linealidad.3) Predecibilidad en la respuesta.4) Confiabilidad.5) Indestructible.6) Fácil de usar.7) Bajo volumen muerto.

Detector de absorbancia de radiación UV

• Más del 70 % de los detectores de HPLC.

• La señal es proporcional a la concentración del soluto.

• Se detectan alquenos, compuestos aromáticos y aquéllos que tienen uniones múltiples de C, O, N, y S.

• La fase móvil no debe interferir en la detección.

Celda del detector de absorbancia

Detectores de absorbancia

• La celda tiene forma de z.• Se mide la absorbancia de los eluyentes de

una columna y para minimizar el ensanchamiento de banda, se mantiene el volumen lo más pequeño posible, entre 1 µl y 10 µl y largos de celda entre 2 mm y 10 mm.

• Están restringidos a presiones debajo de 600 psi, por lo que se requiere un reductor de presión.

Detector de absorbancia

• Muchos son de doble haz; un rayo pasa a través de la celda del eluyente y el otro a través de un filtro para reducir la intensidad.

• Se emplean detectores fotoeléctricos para comparar las intensidades de los dos rayos.


• Igualmente, se pueden encontrar instrumentos de simple haz, en los cuales se almacenan las mediciones de la intensidad del sistema disolvente en la memoria de una computadora y se la emplea para los cálculos de la absorbancia.


• Alternativamente, se puede usar un chopper junto con un fototubo.

• En cada caso, el cromatograma consiste de un gráfico de log de la relación de las dos señales transducidas como función del tiempo.

Detectores de absorbancia en UV con monocromadores

• Algunos pueden actuar en el UV solamente y otros en el UV y el visible.

• Se pueden elegir varios modos operativos.• Por ejemplo, se puede obtener el

cromatograma entero a una λ única; alternativamente, cuando los picos del eluyente están suficientemente separados en el tiempo, se pueden elegir diferentes λ para cada pico.


• Se usa el control con computadora para seleccionar la mejor λ para cada eluyente.

• Los más poderosos son los de arreglo de diodo.

• Se permite recolectar datos de un espectro entero en un segundo.


• Una forma de presentación de los datos espectrales es en un gráfico tridimensional que es útil para identificar especies y elegir las condiciones para una determinación cuantitativa.

• Se obtuvieron los espectros en intervalos sucesivos de 5 s.

Disolventes en el UV

Detectores de índice de refracción

• El disolvente pasa a través de una mitad de la celda en su camino hacia la columna. El eluato fluye a través de la otra cámara.

• Los dos compartimentos están separados por un plato de vidrio montados de manera que el rayo incidente se desvíe si las dos disoluciones difieren en índices de refracción.

• El desplazamiento resultante del rayo con respecto a la superficie fotosensible, provoca la variación en la señal de salida, que cuando se amplifica y registra, provee el cromatograma.

Detector de Índice de refracción


• Desventajas: responden a casi todos los solutos. Esto es, son detectores generales como un detector de llama o de conductividad eléctrica en cromatografía gaseosa. Pero, son confiables y no son afectados por el caudal.

• Sin embargo, son sensibles a la temperatura y se los debe mantener a T constante

• Además, no son tan sensibles como los otros tipos de detectores.


• No sirven para la elución en gradiente, porque es imposible ajustar exactamente la muestra y la referencia mientras varía la composición del disolvente.

Otros detectores• De conductividad: se usan como detectores

universales para iones. No son útiles con elución en gradiente.

• Se mide la conductividad del efluente.

• Electroquímicos: miden la corriente eléctrica asociada con la reducción u oxidación d los solutos a la salida d la columna. Tienen alta sensibilidad y selectividad, e intervalo lineal extendido.

• No sirven para elución en gradiente.

Cromatografía por partición

• Es la más usada.

• Se puede subdividir en líquido - líquido y de fase unida.

• La diferencia surge en cómo se mantiene la fase estacionaria unida a las partículas del soporte de relleno.


• En la líquido – líquido, la fase estacionaria es mantenida sobre la superficie de las partículas del relleno por adsorción física.

• En la fase unida, se une químicamente a las partículas del soporte.


• La más antigua es la primera; ahora, la segunda se ha vuelto predominante debido a ciertas desventajas de la primera.

• Una desventaja de la líquido – líquido es la pérdida de fase estacionaria por disolución en la fase móvil, lo que requiere recubrimientos periódicos del soporte.

Columnas para cromatografía de fase unida

• Los soportes se preparan con sílice rígido o composiciones basadas en sílice.

• Se forman como partículas fuertes mecánicamente, uniformes, porosas, de

3,5 µm ó 10 µm.

• La superficie está ocupada por grupos silanos, Si - OH.

Rellenos de fase normal y de fase inversa

• Se distinguen dos tipos según las polaridades de las fases móvil y estacionaria:

• Fase estacionaria altamente polar (agua o trietilenglicol) sobre soporte de partículas de sílice o alúmina; y, disolvente relativamente no polar tal como el hexano o iso propil éter como fase móvil.

• Esta por razones históricas, se denomina cromatografía de fase normal.

Cromatografía de fase inversa

• La fase inversa es cuando la fase estacionaria es no polar, a menudo un hidrocarburo y la fase móvil es un disolvente polar, como el agua, el metanol o el acetonitrilo.

• En la cromatografía en fase normal, el componente menos polar eluye primero (es más soluble en la fase móvil) y al aumentar la polaridad de la fase móvil disminuye el tiempo de retención.

Selección de columnas en separaciones de Cromatografía de partición

• Debe haber un equilibrio entre los tres participantes activos en el proceso separativo:

• Soluto.

• Fase móvil.

• Fase estacionaria.

Selección de la columna

• Las fuerzas intermoleculares de describen cualitativamente por el índice de polaridad de cada uno de los tres reactivos.

• Las polaridades de varios grupos funcionales analitos en orden creciente son : hidrocarburos < éteres < cetonas < aldehidos < amidas < aminas < alcoholes.

• El agua es más polar que cualquier compuesto que contiene esos grupos funcionales.

Desarrollo del método

• Tienden a ser más complejos en la cromatografía líquida que en la gaseosa porque en una fase móvil líquida, los componentes de la muestra interactúan con ambas fases. En cromatografía líquida, influye si la fase móvil es acetonitrilo, hexano o dioxano.

Desarrollo

• Al elegir una columna, se compara la polaridad de la fase estacionaria con la de los analitos, por lo que se emplea una fase móvil de polaridad considerablemente diferente para la elución.

Selección de la fase móvil

• El más fácilmente manejable es el factor de capacidad (k´) porque depende mucho de la composición de la fase móvil. Debe estar entre 2 y 5, pero se puede expandir entre 0,5 y 20.

• A veces también es necesario variar los factores de selectividad(α) alterando la composición de la fase móvil.

Efecto de la fuerza del disolvente sobre k´

• Los disolventes que interactúan fuertemente con los solutos, se denominan solventes polares o fuertes.

• La forma de medir es a través del índice de polaridad.(P´) (cromatografía de partición).

• Es una medida de la polaridad relativa de varios disolventes.

Indices de polaridad

• La tabla da un listado de índices de polaridad y otras propiedades de un número de disolventes que se usan en cromatografía de partición.

• Se puede manejar el factor de capacidad

k ´, que se puede variar cambiando el índice de polaridad del disolvente.

Propiedades de algunos disolventes de HPLC

Cromatografía por adsorción

• Líquido – sólido.• Separación de compuestos pequeños solubles

en disolventes no polares.• Se adsorben sobre la fase estacionaria y se

separan por la fuerza de adsorción.• Fases estacionarias empleadas: alúmina y

sílice. • En lugar del índice de polaridad, se emplea la

fuerza del disolvente.

Cromatografía por adsorción

• Los tiempos de retención son: olefinas <hidrocarburos aromáticos < haluros, sulfuros < éteres < nitrocompuestos < ésteres = aldehidos = cetonas < alcoholes = aminas < sulfonas < sulfoxidos < ácidos carboxílicos.

Selección del disolvente para Cromatografía por Adsorción

• La única variable para optimizar k ´y α, es la composición de la fase móvil, diferente de la cromatografía de partición en la que el relleno de la columna tiene un efecto pronunciado sobre la última.

• La fuerza del disolvente: el índice de polaridad puede servir como una guía aproximada de las fuerzas de los disolventes. Una mejor es la fuerza del eluyente, un parámetro que depende del adsorbente.

Selección del sistema de disolventes

• Es semejante a la de partición, con un disolvente con una fuerza alta y el otro baja.

• Se obtiene un buen valor de k´ variando la relación de los volúmenes.

• Lo único que la fuerza del disolvente no varía linealmente como lo hace el índice de polaridad, por lo que el cálculo de las mezclas es más difícil.

Aplicaciones

• Para compuestos no polares que tienen un PM menor que 5 000.

• Aunque puede haber superposición con la de partición, tienden a ser complementarias.

• Generalmente, es más adecuada para muestras solubles en disolventes no polares y por eso tienen solubilidad limitada en disolventes acuosos,

Cromatografía de intercambio iónico

• Separación de especies iónicas o ionizables.• Columna: resina de intercambio iónico.• Detectores: de conductividad eléctrica.• Si la diferencia en conductividad es pequeña, se

emplea una segunda columna; contiene una segunda resina de intercambio iónico que convierte a los iones del disolvente en especies con poca ionización.

• Los iones de la muestra aumentan su conductividad eléctrica.

Cromatografía por intercambio iónico

• Para separar y determinar iones basado en resinas de intercambio iónico.(aniónicas y catiónicas)

• El detector es de conductividad eléctrica.

• Las resinas sintéticas datan de 1930 para ablandamiento de aguas.


• El proceso se basa en el equilibrio de intercambio entre iones en solución y otros del mismo signo en la superficie de un sólido rígido, insoluble, de alto PM.

• Resinas de intercambio catiónico: grupos sulfónicos, SO3

- H+, ácido fuerte.

• Grupo ácido carboxílico: ácido débil.


• Resinas de intercambio aniónico: gruposamino terciarios – N(CH3)3

+OH- (base fuerte) o primarios

- NH3+ OH- (base débil).

- kint representa la afinidad de la resina por B+

relativa a otro catión- (RSO3

- B+)s(H+)aq- kint = ----------------------------------------

- (RSO3- H+)s (B+)aq

Valores de kint para resinas de intercambio catiónico sulfonadas

• Orden decreciente:

Tl+> Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+> NH4+> Na+> H+> Li+

Valores de kint para resinas de base fuerte

• Orden decreciente:

SO42- > C2O4

2 - > I- > NO3- > Br - > Cl- > HCO2

- > CH3CO2

- > OH - > F-.

Intercambio iónico

Estructura

Rellenos

• Son pequeñas bolillas porosas, formadas por la copolimerización del estireno y el divinilbenceno. Este último produce el entrecruzamiento que brinda estabilidad mecánica a las bolillas.

• Para activar el polímero, se unen químicamente grupos funcionales ácidos o básicos a la estructura.

Cromatografía de exclusión por tamaño o permeación por geles

• Separación de compuestos grandes tales como polímeros y proteínas de MMR elevados.

• Las partículas del soluto difunden dentro de la red de poros de la fase estacionaria, constituida por pequeñas partículas de polímero o sílice.

• Las moléculas más grandes que el tamaño del poro son excluidas y no son retenidas, mientras que las pequeñas quedan dentro.

Cromatografía de exclusión por tamaño o permeación por geles

• Fase estacionaria: geles orgánicos y partículas basadas en sílice : polímeros de divinilbenceno – estireno o poliacrilamida.

• Tamaño de poros: de 40 A a 2500 A

• Curva de calibración: se grafica MMR vs volumen de retención.

Permeación por geles

Exclusión por tamañoEl Dalton corresponde al peso de 1/12 del

átomo de C

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