Dra. MARIA ROSARIO CALIXTO COSTOS

Practica 02Procedimiento

Preparar una gradilla de 9 tubos de ensayo de acuerdo a la siguiente tabla

UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN

MARCOSUniversidad del Perú,

DECANA DE ÁMERICA

FACULTAD DE QUÍMICA,

INGENIERÍA QUÍMICA E INGENIERÍA

AGROINDUSTRIAL

E.A.P DE QUÍMICA

MANUAL UNIVERSITARIO PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICAPERIODO ELECTIVO ADICIONAL 2015-O

LIMA – PERÚ2015

Elaborado por Rosario Calixto Cotos

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9mL de caseína 5% 1 1 1 1 1 1 1 1 1

mL de agua destilada

8.4 7.8 8.8 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4

mL de Ácido acético 1.0 N

1.6

mL de Ácido acético 0.1 N

0.2

0.5

1.0

2.0

4.0

8.0

mL de Ácido acético 0.01 N

0.6

1.2

pH teóricopH experimental

Observa la precipitación de la caseína a los 15 minutos (X)

Reactivos

Tubo de Ensayo 1

Tubo de Ensayo 3

Tubo de Ensayo 4

Tubo de Ensayo 5

Tubo de Ensayo 6

Se

agito suavemente los tubos con la precaución de no formar espuma, luego se procedió a tapar los tubos.

Se prosiguió a determinar los pH teóricos de cada uno de los tubos con los datos dados. Luego se determinó el pH experimental usando un pH metro. Los tubos se dejaron en reposo durante 15 minutos y observar el grado de turbidez o

precipitación. Determinamos el punto isoeléctrico de la caseína.

Tubo de Ensayo 7

Tubo de Ensayo 8

Tubo de Ensayo 9

PRACTICA 09

HIDROLISIS DE LAS GRASAS POR ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA

I. OBJETIVO

Determinar la actividad de la lipasa pancreática mediante la formación de ácidos grasos libres por titulación.

II. INTRODUCCIÓN

En el organismo de los animales casi todos los lípidos se encuentran en complejo con las proteínas, los carbohidratos y otras sustancias, en realidad los lípidos rara vez se encuentran en estado libre. Los mamíferos los acumulan en forma de grasa, los peces en forma de ceras y en las plantas se almacenan en forma de aceites que adicionalmente tienen funciones de protección y proveen aromas y sabores característicos.

Los acilgliceroles (constituido por una molécula de glicerol y ácidos grasos) pueden existir como monoacilglicéridos, diacilglicéroles y triacilglicéridos (TAG) En los alimentos los más comunes son los TAG, los otros son usados como aditivo por sus propiedades emulgentes.

La presencia de ácidos grasos en la estructura de los lípidos determina sus propiedades. Aunque se considera que no todos los lípidos tienen ácidos grasos, sí tienen por lo menos alguno de sus derivados.

Los términos grasas y lípidos no pueden ser usados indistintamente, ya que al hablar de grasas se refieren a un tipo especial de lípidos: Los triacilgliceroles, que generalmente son sólidos a temperatura ambiente y constituyen la principal reserva energética en algunos organismos.

Los ácidos grasos naturales poseen un número par de átomos de carbono, producto del mecanismo de biosíntesis, iniciada a partir AcetilCoA. Su número de átomos de C varia de 4 (ácido butírico de lípido de la leche) a 38 (ceras)

Los acilgliceroles se hidrolizan para formar glicerol libre y los ácidos grasos que los constituyen; en las células, las enzimas llamadas Lipasas realizan la hidrólisis; ésta hidrólisis catalizada por lipasas se caracteriza por cierto grado de especificidad, de modo que las distintas lipasas actúan de modo preferencial sobre diferentes enlaces éster.

La enzima principal de la hidrólisis de los TAG es la lipasa pancreática, que prefiere ácidos grasos de cadena larga de más de 10 átomos de carbono; hidroliza a los TAG en diacilgliceroles, liberando el Ácido graso de la posición 1 ó 3 del glicerol. Los diacilgliceroles son hidrolizados rápidamente hasta glicerol y ácidos grasos libres. Los productos son ácidos grasos libres (AGL) o 2-monoacilglicero (2-MAG). Este último puede ser hidrolizado por medio de la transferencia del

grupo acilo en posición 2 hacia la posición 1 o 3 por medio de las isómeras lipasa y ser finalmente hidrolizado a glicerol y AGL

La lipasa pancreática es un polipéptido de 449 aminoácidos y PM de 50,000 daltons que hidroliza los enlaces éster en posición 1 y 3 de los triacilglicéridos.

La acción conjunta de las enzimas pancreáticas y de las sales biliares lleva a la formación de micelas, que progresivamente se enriquecen en productos hidrolíticos más polares que sus precursores. La velocidad de absorción de los ácidos grasos depende de la longitud de su cadena (número de átomos de carbono) y de su grado de saturación. Así, los insaturados de cadena larga son absorbidos más eficazmente que los saturados.

Fundamento

La actividad de la enzima se evalúa midiendo los ácidos grasos libres que se liberaron en el curso de la hidrólisis de la grasa por acción de la lipasa pancreática. La concentración de los ácidos grasos libres se determina mediante la titulación con NaOH 0,05N. La acción de lipasa se ve potenciada por las sales biliares que al emulsificar las grasa las transforma en pequeñas micelas

III. MATERIALES Y REACTIVOS

Aceite, buffer fosfato 0.1 M pH 8, sales biliares, lecitina y glicerol, pancreatina 1% Bureta, probeta, tubos de ensayo, gradilla, vasos de 50 mL, pipetas, bombillas, papel parafina, Balanza analítica, baño maría.

IV. PROCEDIMIENTO

HIDROLISIS DE LAS GRASAS POR ACCION DE LA LIPASA

Tubos 1 Sales 2 blanco 3 Sin sales 4 blanco

Aceite ml 1 - 1 -

Buffer fosfato 0.1 M pH 8, ml

- - 2 2

Sales biliares en buffer, ml

- 2 - -

Lecitina/ aceite ml -

- - -

Agua destilada, ml 2 3 2 3

El color rosa del aceite no debe desaparecer en caso contrario, agregar NaOH 0,05N hasta que aparezca el color (Sólo a los tubos 1, 2 y 3).Agregar 5 ml de pancreatina 1% a cada tubo (los 5). La Pancreatina es un extracto de enzimas que contiene a la Lipasa pancreática. Incubar por 45 minutos a 370C. Agitar por 15 ser cada 10 minutos.Titular cada tubo con NaOH 0,05N hasta coloración ligeramente rosa, anotar el gasto en ml, agitar constantemente durante la titulación.

Reactivos

Lecitina / AceiteSales biliares en Buffer

5 mL de Buffer fosfato 0,1 M PH

8

5 mL de Aceite

Tubo de ensayo 1 Sales

5 mL de Aceite + 3 mL de Aceite +

Agua destilada

Sales biliares

en bufferAceite

1 mL Aceite

Reactivos

Lecitina / AceiteSales biliares en Buffer

5 mL de Buffer fosfato 0,1 M PH

5 mL de Aceite

5 mL de Aceite + 3 mL de Aceite +

Agua destilada

5 mL de Sales biliares en buffer +

agua destilada

2 mL de Sales biliares en buffer

Tubo de ensayo 2 Blanco

Sales biliares en

buffer

Agua destiladaBuffer fosfato 0,1M

PH 8

Aceite

5 mL de Aceite + Buffer fosfato 0,1M

PH 8 + Agua destilada

3 mL de Aceite + Buffer fosfato

0,1M PH 8

1 mL Aceite

Tubo de ensayo 3 Sin sales

Lecitina / AceiteSales biliares en Buffer

5 mL de Buffer fosfato 0,1 M PH

Agua destiladaBuffer fosfato 0,1M

PH 8

5 mL de Buffer fosfato 0,1M PH

8 + agua destilada

2 mL de Buffer fosfato 0,1M PH

8

Tubo de ensayo 4 Blanco

Adherencia de Pancreatina al 1%

4 Tubos de ensayo con 10 mL de mezclas + 5 mL de

Pancreatina al 1%

4 Tubos de ensayo con 5 mL de

mezclas

Pancreatina al 1% (Lipasa Pancreática)

Incubación y Agitamiento

Agitar por 15 seg cada 10 minutos

Incubar por 45 minutos a 37°C

El color rosado del aceite no debe desaparecer en caso contrario, agregar NaOH 0,05 N hasta que

aparezca el color

NaOH 0.05 N

V. RESULTADOS

Cálculos: Los gastos en ml de NaOH 0.05 N

1. Determinar la concentración de los AGL en función de la acidez:

1.1 Miliequivalentes de Acidez con sales biliares = gasto x 0.05 N

A: Miliequivalentes de acidez con sales biliares = 2.3*0.05 = 0.115*10-3 #eq-gsto

1.2 Miliequivales Acidez sin sales biliares = gasto x 0.05 N

NaOH 0,05 NNaOH 0,05 N

Mezcla titulada Coloración Rosada

10 mL de las mezclas Coloración Transparenté

Titulación de los 5 tubos

Gasto Con sales biliares

GastoSin sales

GastoMl ml ml

Tubo 1 8,3  Tubo 3  9,6 Tubo 5Tubo 2  6,0 Tubo 4  9,4 Tubo 4 gasto  2,3 gasto  0,2 gasto

B: Miliequivalentes de acidez sin sales biliares = 0.2*0.05 = 0.01 *10-3 #eq-gsto

1. ¿Cuál de los tubos presento mayor actividad enzimática?

En la actividad enzimática de cualquier enzima, el sustrato hace contacto con el centro o sitio activo de la enzima .Se forma un complejo intermedio llamado enzima-sustrato.La molécula de sustrato se transforma por reorganización de los átomos, por rotura, o por combinación de varias moléculas de sustrato. El sustrato transformado, los productos de reacción, se liberan de la molécula de enzima .La enzima, ahora libre puede reaccionar con otras moléculas de sustrato.Entonces como se tuvo a los tubos de ensayo por 45 minutos en incubación con la mano a 37°C, lo que se puede ver en este caso son los posibles factores que afecten la actividad enzimática: temperatura, pH, concentración e inhibidores.

Temperatura: la actividad enzimática se incrementa al aumentar la temperatura, hasta que la enzima se desnaturaliza.

PH: en este caso la enzima es más activa alrededor de pH= 6. Concentración de sustrato: al aumentar la concentración de sustrato, la

velocidad de reacción se incrementa, hasta que se ocupan todos los centros activos.

El tubo que presento mayor actividad enzimática es el tubo número 3, donde el gasto de volumen de NaOH fue 9.6 ml tornando a una coloración rosada; mientras mayor sea el gasto de NaOH a 0.05 N mayor será la actividad enzimática.

2. Mencione cinco propiedades de la lipasa pancreática

La lipasa pancreática es una enzima del tipo éster hidrolasas carboxílicas que se encarga de hidrolizar enlaces esteres propios de las lípidos mediante la adición de una molécula de agua dando lugar a ácidos grasos libres y glicerol.

Es una enzima que cataliza reacciones con una elevada especificidad de sustrato así como de forma regio o enantioespecífica.

Se secreta en forma activa (y no como proenzima) y funciona a un pH óptimo de 6 – 7 en presencia de colipasa.

Actúa rápidamente en interface hidrofóbica/hidrofílica de la emulsión de la grasa.

Se estabiliza en la interface agua – aceite por acción de la colipasa y ácidos grasos libres.

3. Que función cumplieron las sales biliares

La función que cumplen las sales biliares en la hidrolisis de las grasas (aceite) es la de emulsificar y solubilizar las grasas, transformándolas en pequeñas micelas con lo cual disminuye la tensión superficial produciéndose la ruptura de los enlaces esteres.

4. ¿Por qué se neutralizo el aceite utilizado en la práctica?

Como la hidrolisis del aceite por medio de la lipasa pancreática va liberando ácidos grasos en la solución y al emplear hidróxido de sodio en la valoración ácido – base para la determinación indirecta de la cantidad de ácidos libres liberado, lo que provoca una reacción acido base debido a la mezcla entre un álcali y los ácidos grasos libres dando la formación de jabones. Además, también sirve para neutralizar la acidez del aceite residual debido a los ácidos grasos libres

5. ¿Cuál fue la utilidad de la fenolftaleína?

La fenolftaleína es un indicador ácido – base que indicó el cambio de pH dada por la neutralización del aceite residual obtenida por los ácidos grasos libres.

V. CUESTIONARIO

1. Esquematice la estructura de un triestearina y tripalmitina.

Triestearina o también llamada Estearina o Glicerol triestearato de manera trivial. Su nombre IUPAC es 1,3-Di(octadecanoiloxi)propan-2-iloctadecanoato es un gliceril éster de ácido esteárico, derivado de la grasa animal creada como producto derivado del procesamiento de la carnes y es utilizado como sebo en la manufactura de velas y jabón. Su fórmula molecular es C57H110O6

Tripalmitina es un glicérido de ácido palmítico, o es Tripalmitato de glicerol. Es un aceite que se encuentra en el aceite de palma y otros aceites o grasas. A diferencia con la Triestearina es en vez de ácido palmítico (C16:0) posee, ácido esteárico (C18:0)). Su fórmula molecular es C51H98O6

2. ¿Cuáles son los productos liberados por acción de la lipasa pancreática?

Síntesis: Páncreas exocrino

Sustrato: Triacilgliceridos con ácidos grasos de cadena larga.

Acción enzimática: Hidrolisis ácidos grados C1 y C3

Productos: 2-moniacilgliceridos y dos ácidos grasos libres.

Requiere: Colipasa, fosfolípidos, fosfolipasa A2, Sales biliares y los ácidos

grasos libres provenientes de la de las lipasas: Lingual y gástrica.

La lipasa pancreática , la enzima principal de la hidrólisis de los TAG es la lipasa pancreática , que prefiere ácidos grasos de cadena larga de más de 10 átomos de carbono; hidroliza a los TAG en diacilgliceroles, liberando el ácido graso de la posición 1 o 3 del glicerol. Los diacilgliceroles son hidrolizados rápidamente hasta glicerol y ácidos grasos libres. Los productos son ácidos grasos libres (AGL) o 2-monoacilglicero (2- MAG). Este último puede

ser hidrolizado por medio de la transferencia del grupo acilo en posición 2 hacia la posición 1 o 3 por medio de las isómeras lipasa y ser finalmente hidrolizado a glicerol y AGL.

3. Cuáles son los ácidos grasos poliinsaturados, monoinsaturados y saturados presentes en los alimentos.

Ácidos grasos saturados

No poseen dobles enlaces en su cadena.

Son generalmente sólidos a temperatura ambiente.

Se encuentran en alimentos de origen animal, y las excepciones son el aceite de coco y de palma.

La grasa saturada aumenta el colesterol más que cualquier otro tipo de grasa.

El exceso de grasas saturadas puede aumentar la biosíntesis de colesterol y tiene efecto trombogénico.

Ácidos grasos monoinsaturados

Generalmente son líquidos a temperatura ambiente.

Presentan un doble enlace en su estructura.

Su principal representante es el ácido oleico (C-18), presente en el aceite de oliva.

Pueden disminuir el colesterol total y LDL, cuando reemplazan parcialmente a los ácidos grasos saturados.Enzima Fuente Glándula Sustrato Productos

Pepsina Jugo gástricoPared

estomacal ProteínasPéptidos y

Aminoácidos

AmilasasJugo

pancreático Páncreas Almidón Maltosa

ProteasasJugo

pancreático PáncreasProteínas y péptidos

Péptidos y Aminoácidos

LipasaJugo

pancreático Páncreas TriglicéridosÁcidos grasos y

glicerina

PeptidasaJugo

entéricoPared

duodeno Péptidos Aminoácidos

MaltasaJugo

entéricoPared

duodeno Maltosa GlucosaSacarasa Jugo Pared Sacarosa Glucosa y Fructuosa

entérico duodeno

LactasaJugo

entéricoPared

duodeno Lactosa Glucosa y GalactosaSales

Biliares Bilis Hígado Grasa Emulsión

Ácidos grasos poliinsaturados

Poseen uno o dos enlaces en su estructura.

Se encuentran principalmente en alimentos de origen vegetal, a excepción de los pescados y mariscos.

Son componentes imprescindibles de las membranas celulares y precursores de las prostaglandinas (moléculas mediadoras en la inflamación).

Son esenciales porque no se sintetizan en el organismo, así que debemos aportarlos a través de la alimentación.

Los   ácidos grasos   poliinsaturados se dividen en dos grupos:

Omega-6 (n-6): representado por el ácido linoleico y araquidónico. Presente fundamentalmente en aceites de semillas y cereales.

Omega-3 (n-3): representado por el ácido linolénico proveniente de semillas y cereales; y por el ácido eicosapentaenoico y docosahexaenoico presentes en las grasas de pescados y mariscos.

4. ¿Cuáles son las enzimas que digieren las grasas en el sistema digestivo de un mamífero? Indique la función de cada una.

La grasa del alimento es hidrolizada en el intestino delgado a ácidos grasos y glicerina por la acción conjunta de las sales biliares (son derivados del ácido cólico que emulsionan y saponifican las grasas) y de la lipasa pancreática. En la pared del duodeno y en las células adiposas se produce una neoformación de triglicéridos a partir de la glicerina, de los ácidos grasos y de los monoglicéridos absorbidos.  

La grasa no absorbida en el intestino delgado es excretada en las heces, produciendo heces grasientas que dificultan la limpieza de las instalaciones.   

5. Cite cuatro sales biliares y como intervienen en la emulsificación de las grasas

El ácido taurocólico procede del ácido cólico (uno de los ácidos biliares) conjugado con el aminoácido taurina en el carbono 17. Su nombre IUPAC es 2-{[(3alpha, 5beta, 7alpha, 12alpha)-3, 7,12-trihydroxy-24-oxocholan-24-yl] amino} ethanesulfonicacid.

El ácido glicocólico procede del ácido cólico (uno de los ácidos biliares) conjugado con el aminoácido glicina en el carbono 17.Este ácido con sodio y potasio da lugar a una de las sales biliares.

Las sales biliares que se segregan en la bilis al intestino para contribuir a la digestión de los lípidos se sintetizan en el hígado a partir de colesterol en una ruta en la que interviene el citocromo P450, que origina el ácido cólico, con la posterior incorporación de los aminoácidos glicina o taurina.

Las principales sales biliares son glicocolato y taurocolato, que son las sales de sodio y potasio de los ácidos taurocólico y glicocólico, respectivamente, los cuales son conjugados de los aminoácidos glicina y taurina con ácido cólico. Otros ácidos biliares son productos intermediarios de su síntesis y también pueden estar en el producto final, en menor cantidad.

Función de las sales biliares

Los ácidos biliares glicocólico y taurocólico interaccionan con iones de sodio o de potasio para dar los resultados finales: glicocolato y taurocolato, que se excretan por vía biliar al intestino. Estas sales tienen carácter heteropolar (o anfipolar), debido a sus cargas (+) y (-) y a su gran núcleo hidrofóbico de anillos de carbono, en el otro extremo de la molécula. Por ello son solubles en agua y también pueden interaccionar con las grasas. Así actúan como

detergentes, o solubilizadores, provocando y estabilizando la emulsión de las grasas para que puedan ser digeridas por las enzimas digestivas en el medio acuoso del intestino (quimo). También allí producen la emulsión de otros compuestos liposolubles como las vitaminas A, D, E y K, y también contribuyen a la absorción de colesterol.

Esquema simplificado de las rutas de síntesis de los ácidos biliares sales biliares

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Zamora Espitia. Métodos selectos de bioquímica experimental. Univ. nacional de Colombia. 1° edición. 2012

2. Campbell Bioquímica 6ta edición, Editorial Cengare Learning, 2009, México.

3. Feduchi, Blasco, Romero, Yañez. Bioquímica Conceptos esenciales. Editorial Moderno. 1° edición. 2011.