Guia Trabajo Practico 1 BIO253 2010-2

Universidad Andrés Bello Facultad de Ciencias Biológicas

Departamento de Ciencias Biológicas

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS

MICROBIOLOGIA

BIO253

PROFESORES: MARIO CASTILLO RUIZ (PROFESOR E�CARGADO) ALEJA�DRO GO�ZÁLEZ CA�DÍA

CARRERA: BIOTEC�OLOGÍA

[email protected] [email protected]

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ÍNDICE

CONTENIDO FECHA (SECCIÓN) PÁGINAS

INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA

03 – 09

Nº1 TÉCNICAS BÁSICAS DE

MICROBIOLOGÍA Y MORFOLOGÍA

BACTERIANA

25-27 DE AGOSTO (1)

1-3 DE SEPTIEMBRE (2)

10 – 32

Nº2 FLORA NORMAL Y

FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS GRAM

POSITIVO. ANTIMICROBIANOS



33 – 51

Nº3 FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS

GRAM NEGATIVO. ANTIMICROBIANOS

29 SEPTIEMBRE-1 DE

OCTUBRE (1)

13-15 DE OCTUBRE (2)

52 – 67

Nº4 BACTERIAS ANAEROBIAS Y

FASTIDIOSAS. FLORA NORMAL



68 – 74

Nº5 HONGOS UNICELULARES Y

FILAMENTOSOS

3 DE NOVIEMBRE (1)

5 DE NOVIEMBRE (2)

75 – 84

3

INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

1.1 BIOSEGURIDAD Un laboratorio de microbiología debe contar con la infraestructura necesaria para

manipular un microorganismo de acuerdo a su riesgo biológico cumpliendo con los

procedimientos del nivel de bioseguridad correspondiente (niveles del 1 al 4).

Nuestro trabajo en el laboratorio involucra microorganismos no patógenos, siendo nuestro

nivel de Bioseguridad de tipo 2. Es decir, se requiere de un espacio diseñado especialmente

para la manipulación del microorganismo y otros espacios para la preparación del material

estéril y la eliminación o esterilización del material contaminado. Además se deben seguir

normas que permitan una manipulación libre de contaminación para el microorganismo, el

experimentador y para el medio ambiente.

1.2 MATERIALES PRESE�TES E� U� LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA Es esencial que posea: estereomicroscopios (lupas), microscopios, refrigeradores, cámaras

de cultivo, balanzas, centrífugas y destiladores de agua. En muchas ocasiones las cámaras

de cultivo y refrigeradores se ubican en una sala especial, o bien algunos de estos equipos

son de uso común para varios laboratorios.

MICROSCOPIO OPTICO COMPUESTO:

• Sistema óptico

o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del

objetivo.

o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de

ésta.

o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la

preparación.

o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.

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o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

• Sistema mecánico

o SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el

brazo.

o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.

o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o

binocular.

o REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar,

cambiar los objetivos.

o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y

micrométrico que consigue el enfoque correcto.

1.2 OTROS MATERIALES UTILIZADOS SO�:

a) De vidrio: placas de Petri, matraces Erlenmeyer, tubos de ensayo, pipetas Pasteur,

embudos, matraces aforados, pipetas graduadas, buretas, probetas, cristalizadores,

portaobjetos, cubreobjetos, desecadores, frascos (diferentes capacidades, transparentes o

color ámbar), vasos de precipitado, frascos cuenta gotas, etc.

b) Otros: algodón, papel filtro, papel indicador de pH, papel de envolver, pinzas, bisturíes,

asas con hilos de platino, colorantes, reactivos diversos, etc.

Para realizar siembras y/o repiques, se utilizan asas con hilos de platino o de tungsteno. La

utilización de estos metales se debe a que son resistentes a la oxidación y porque una vez

esterilizados a la llama, se enfrían rápidamente sin riesgo de provocar la muerte de los

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microorganismos con que se está trabajando. Además, estos hilos son muy maleables

pudiendo ser transformados en un asa o en espátula, permitiendo repicar o resembrar desde

un medio líquido o sólido.

Asa níquel-cromo

Placa de Petri Placa petri con medio sólido

Matraz Erlenmeyer. Pipeta Pasteur INCUBADORA

(Rango temperatura 5-100ºC,

microprocesador regula la Tº

+/- 0.5ºC.)

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AUTOCLAVE

En términos de Física experimental se define el punto de ebullición de un líquido como la

temperatura a la cual se iguala el valor de la presión de vapor del fluido con el que

corresponde a la presión atmosférica. El autoclave está formado por una vasija cilíndrica de

hierro forjado, de paredes gruesas y con una tapadera resistente que se cierra

herméticamente mediante la acción o giro de un potente tornillo conectado a una

abrazadera. En un comienzo antes de que se alcance la temperatura de 100ºC, se elimina la

presión del vapor de agua (Flowing steam), de modo que suba la temperatura junto con la

presión, sin alcanzar el punto de ebullición del agua. Este procedimiento aplicado sobre

material resistente a la temperatura elimina las bacterias, virus y esporas, es decir, queda

totalmente estéril.

7

1.4 Precauciones en el laboratorio y durante el trabajo práctico

- Para evitar posibles contaminaciones, es esencial la limpieza y el orden dentro del

laboratorio.

- Antes de comenzar a trabajar se debe limpiar el mesón con un algodón embebido en

alcohol etílico 70-96°, o con una solución de hipoclorito de sodio (1-5%).

- Se recomienda trabajar en forma cómoda en un mesón material sintético duro y no

inflamable. Este mesón debe estar ubicado en un sitio con menor corriente de aire (las

ventanas deben estar cerradas), alejado de las zonas de circulación de otras personas y debe

contar con un mechero.

- Los tubos de ensayo o matraces que contengan medios de cultivos o cultivos de mo,

nunca deben abrirse en posición vertical, sino lo más horizontalmente posible (inclinados) y

para quitar el tapón de algodón se mantendrán inclinados con una mano y se abrirán con la

otra, la que sostendrá a su vez el asa (con el dedo meñique, se retira el tapón de algodón

que obtura el tubo). Una vez abierto de la forma señalada, se flamea por algunos segundos

el orificio, repitiendo dicha operación una vez realizada la siembra (el tapón nunca debe

dejarse sobre el mesón).

- Antes de utilizar las asas con hilos de platino, que sirven para las siembras y/o repiques,

éstas deben flamearse al rojo en posición vertical bajo la acción de la llama. Antes de

efectuar la siembra y/o repique debe esperarse algunos segundos a que se enfríen, pudiendo

enfriarse también en el borde de la placa de Petri que contiene el medio de cultivo.

Inmediatamente después de haberlas utilizado, deben flamearse nuevamente, evitando

diseminar el microorganismo en el medio ambiente.

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Partes de la llama

1.- Cono frío: no llega oxígeno

2.- Cono de reducción: poco oxígeno

3.- Cono de oxidación: abundancia de oxígeno

4.- Zona de fusión: alcanza los 1500 ºC (Zona

que esteriliza por calor)

El asa se flamea en la zona 4, hasta lograr la

Incandescencia.

- Las placas de Petri deben abrirse manteniéndolas en lo posible en posición vertical.

- El material de vidrio destinado a esterilización debe prepararse previamente (placas de

Petri envueltas en papel, etc.), estar bien lavado y seco. El lavado se realiza con detergentes

y/o soluciones especiales, luego debe enjuagarse con H2O corriente y posteriormente con

H2O destilada.

- Las observaciones microscópicas, tinciones y las diferentes pruebas bioquímicas deben

realizarse en el momento oportuno.

1.5 �ORMAS DE SEGURIDAD E� EL LABORATORIO

a) Dejar la ropa innecesaria en las perchas del laboratorio y usar un delantal (blanco).

b) Nunca deben llevarse a la boca lápices, etiquetas o cualquier otro material.

c) Los mesones del laboratorio deben limpiarse antes y al final de cada laboratorio con un

desinfectante apropiado.

d) Las asas con los hilos de platino deben esterilizarse a la llama del mechero en toda su

extensión antes y después de su uso. El salpicado se evita sosteniendo el hilo alrededor de

la llama antes de flamearlo.

e) No se distraiga conversando mientras trabaja, así evitará quemarse con el mechero o

sufrir otros accidentes.

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f) Si se derrama un cultivo en el mesón o piso, cubrir el área con un desinfectante y

notificar al Instructor.

g) Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos del laboratorio.

h) Los medios inoculados deben colocarse en las cámaras de cultivo con su identificación

respectiva, ej.: nombre, naturaleza del espécimen, sustrato del cual se aísla, fecha,

identificación del manipulador.

i) Cuando no se utilizan los mecheros, éstos deben guardarse y se debe estar seguro que se

les ha apagado al final de cada laboratorio.

j) Oculares, objetivos, como también otras partes del microscopio, deberán limpiarse antes

después de su uso. Los lentes deben limpiarse con papel especial para lentes o un paño de

batista.

k) Todos los reactivos y equipos deben dejarse en su lugar de origen al término de cada

laboratorio.

l) Todos los tubos, placas de Petri, pipetas, portaobjetos, etc., deben dejarse en los

recipientes adecuados una vez terminado el laboratorio.

m) Todos los materiales de desecho como trozos de papel, algodón, etc., deben colocarse en

los basureros adecuados y no en los mesones o suelo.

n) Accidentes personales, tales como derrame de reactivos, cortes y quemaduras, deben

comunicarse inmediatamente al Instructor.

ñ) Todos los estudiantes deberían lavarse las manos con jabón o con un desinfectante si es

necesario, antes de dejar el laboratorio.

EVITE ACCIDENTES TRABAJANDO ORDENADAMENTE Y CON PRECAUCION.

Si en forma accidental entra en contacto con este material, avise inmediatamente a su

Instructor indicándole el origen de la contaminación

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TRABAJO PRÁCTICO Nº1

TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGÍA

OBJETIVOS

1. Identificar material básico empleado durante la práctica bacteriológica. 2. Adquirir la destreza para manipular materiales y cultivos bacterianos. 3. Adquirir la destreza y el cuidado para trabajar en esterilidad. 4. Conocer los diferentes medios de cultivo. 5. Conocer la utilidad de los medios de cultivo más usados. 6. Conocer el concepto de siembra y aislamiento de bacterias. 7. Practicar diferentes tipos de siembra. 8. Practicar diferentes tipos de aislamiento bacteriano. 9. Conocer distintos tipos de tinciones y la utilidad de éstas.

El Trabajo Práctico Nº1 tiene como objetivo principal que el alumno adquiera los

conocimientos básicos en lo que respecta a la manipulación de cultivos bacterianos

poniendo énfasis en los conceptos de esterilidad, siembra en medios líquidos y sólidos

(diferenciales, selectivos y enriquecidos) y manejo de microorganismos aeróbicos.

El Laboratorio de Microbiología muchas veces está encargado de identificar el

agente etiológico de una determinada patología. Para lograr esto es fundamental la obtención

de un CULTIVO PURO, ya que por lo general la muestra que contiene al patógeno ha

evaluar viene contaminada con bacterias de la flora normal. Por otra parte, luego de la

identificación del microorganismo, el Laboratorio de Microbiología puede orientar respecto

al tratamiento antibiótico a seguir, si este corresponde, ya que se puede evaluar la

susceptibilidad del patógeno a diferentes agentes antimicrobianos.

Como primera actividad práctica el alumno debe concentrarse en realizar los

procedimientos microbiológicos básicos de manera adecuada, manteniendo siempre las

condiciones de esterilidad necesarias para un buen análisis. Por lo tanto, como primeras

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actividades el alumno deberá familiarizarse con el material ESTÉRIL con el que trabajará

(Tabla Nº1) y los procedimiento de siembra y aislamiento de microorganismos desde

diferentes muestras.

La siembra implica colocar los microorganismos en un ambiente que contenga todos

los nutrientes necesarios para su desarrollo y multiplicación. En el laboratorio este medio

ambiente lo constituyen los medios de cultivo, cuyas características van a variar de acuerdo

a los requerimientos de los microorganismos o a los procedimientos experimentales que sea

necesario realizar a lo largo de su proceso de identificación.

Debido a que el cuerpo humano (que incluye a la cavidad oral) es un lugar donde

cohabitan un sin número de microorganismos distintos, generalmente las muestras

contienen una flora mixta, la que se manifiesta por el desarrollo de distintas especies

bacterianas. Por este motivo es de suma importancia obtener una cepa bacteriana aislada

para poder estudiar sus características morfológicas y bioquímicas y así lograr una

identificación correcta (Figura Nº1). Por lo tanto, en una primera instancia, para obtener un

cultivo puro se debe lograr primero el AISLAMIE�TO de U�A COLO�IA en medio

sólido, puesto que por definición una colonia proviene de una sola bacteria y por ende

correspondería a un cultivo puro. En el caso de los medios líquidos, una vez obtenido el

crecimiento bacteriano (enturbiamiento), se debe realizar el aislamiento de U�A gota a un

medio sólido para obtener colonias aisladas y puras.

.

Colonia A

Colonia B Colonias A y B se

encuentran mezcladas

Figura Nº 1: Aislamiento por estrías o en cuadrantes en placa de agar MacConkey.

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Tabla Nº 1 : Material de uso común en el Laboratorio de Microbiología

Material Tipo esterilización Esterilización

Tipo de material Antes de ser utilizada Después de ser utilizada

Asa de platino Directo a la llama del mechero Sí Sí Re-utilizable

Pipetas aforadas de vidrio* Directo a la llama del mechero Sí Sí Re-utilizable

Pipetas aforadas de plástico Química No No Desechable

Pipetas Pasteur de vidrio* Autoclave No Si Desechable

Tubos estériles** Autoclave

Llama Mechero Si Si Re-utilizable

Placas Petri de vidrio Autoclave Si Si Re-utilizable

Puntas de Papel Absorbente Autoclave No No Desechable

Placas Petri de plástico Química No Si Desechable

* Este material se pueden encontrar en cilindros metálicos o envueltas en papel, ya estériles. En el primer caso, se debe poner el cilindro en forma horizontal, destaparlo y sacar una pipeta sin tocar con los dedos las otras, en el segundo caso se debe desenvolver la pipeta, de manera de no tocar su extremo inferior.

** Cada vez que se destape un tubo estéril, se debe flamear su boca y repetir la operación inmediatamente antes de volver a cerrarlo. Este procedimiento pretende evitar la entrada de microorganismos del aire al interior del tubo.

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Una vez que se obtienen colonias aisladas se puede realizar la identificación de esta

especie bacteriana. Debemos recordar que cada colonia corresponde en su origen a UNA sola

bacteria que se ha desarrollado en un medio de cultivo sólido, hasta formar una población que

se observa como una colonia visible. Por lo tanto, la morfología de esta colonia estará

determinada por millones de bacterias idénticas y será propia de cada tipo de bacteria. Es

importante tener en cuenta que la morfología de colonia también dependerá del medio de

cultivo en el cual se propague la bacteria, ya que su metabolismo depende de la disponibilidad

de nutrientes y tanto la calidad como cantidad de éstos varía en los diferentes medios de

cultivo. La morfología macroscópica de las colonias (análisis macroscópico) permite evaluar

características como forma, elevación, margen, superficie, brillo, color y hemólisis (en agar

sangre) (Figura 2).

Es importante destacar que el crecimiento de las bacterias en medios líquidos no da

origen a la formación de colonias, sino que se evidencia mediante la turbidez del caldo,

sedimento y otras características.

Debido a que muchas especies bacterianas presentan colonias que son muy parecidas se

hace imposible diferenciarlas sólo con la observación MACROCÓPICA de éstas. Por esta

razón además se hace necesario realizar una observación MICROSCÓPICA de las células que

conforman cada colonias.

La suma de los datos obtenidos de la descripción macroscópica y microscópica

proporcionan una orientación sobre las pruebas bioquímicas a realizar para la identificación

definitiva de las bacterias que conforman la colonia.

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Figura Nº 2: Criterios macroscópicos para la descripción de una colonia bacteriana.

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Por otra parte, la observación al microscopio de las bacterias permite conocer una serie

de características complementarias a la morfología de la colonia entre las que encontramos:

forma, disposición o agrupación, presencia o ausencia de estructuras (cápsulas, esporas,

flagelos), movilidad, etc.

Existen numerosas técnicas para la observación microscópica de los microorganismos

(Tabla Nº 2), dentro de las cuales encontramos:

1. Observación de bacterias vivas: Para observar las bacterias vivas, sin teñir, se utiliza el

microscopio de fase contrastada. Este tipo de microscopio se desarrolló para hacer posible

observar células pequeñas sin teñir. Se basa en utilizar y aumentar la pequeña diferencia de

índice de refracción que existe entre las células y el medio que las circunda. Esta diferencia

puede ser usada para crear una imagen con mucho mayor contraste que la que se obtiene en

el microscopio de campo claro. Este microscopio usa un lente objetivo especial y en el

condensador se inserta un diafragma especial; además para aumentar el contraste se

insertan filtros verdes o azules.

a. Al fresco: Este método de examen permite observar el microorganismo vivo y evita las

deformaciones artificiales de su morfología que producen las técnicas de coloración. Su

aplicación más importante se refiere al estudio de la movilidad de los microorganismos.

b. Con fondo oscuro: Se basa en el fenómeno de Tyndall, de reflexión luminosa. Para la

observación se sustituye el condensador de Abbé por el condensador de fondo oscuro, o

de ultra. Se ilumina la preparación en forma oblicua, incidiendo los rayos luminosos

directamente sobre los microorganismos sin penetrar en el objetivo del microscopio. Se

le emplea para la observación de bacterias muy pequeñas o de aquellas que difícilmente

se observan al microscopio de campo claro por su falta de contraste con el medio.

c. Gota colgante: Consiste en suspender el microorganismo a observar en un líquido y

depositar una gota de la suspensión sobre un cubreobjeto, luego se procede a la

observación microscópica.

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2. Observación de bacterias muertas:

a. Tinciones simples: Se utiliza un sólo colorante para revelar la presencia de

microorganismos y su forma en general. Son de poco uso en bacteriología.

b. Tinción negativa: Se tiñe el fondo mientras que las células permanecen sin teñir

(transparentes), observándose como entidades claras sobre un fondo oscuro. Ejemplo de

este tipo de tinción es la tinción de cápsula en la que se usa tinta china.

c. Tinciones especiales: Se utilizan para observar alguna estructura en particular como

nucleoide, flagelo, esporas, etc.

d. Tinciones diferenciales: Las bacterias son diferentes entre sí, tanto en su estructura

física como en su composición química, de modo que reaccionan en forma diferente

frente a los colorantes. Estas tinciones se utilizan para diferenciar los distintos grupos de

bacterias. La Tinción de Gram es la tinción diferencial más importante usada en

bacteriología. Otra muy utilizada es la Tinción ácido resistente o tinción de Ziehl

Neelsen.

Otras estructuras bacterianas que también pueden ser diferenciadas por métodos de

tinción son las esporas y la cápsula:

a. Observación de esporas: Esta tinción es un ejemplo de una tinción especial. Algunos

géneros bacterianos como Bacillus y Clostridium, producen endosporas como una forma

de resistencia a condiciones ambientales adversas, por ejemplo sequedad o falta de

nutrientes. Las endosporas o esporas se caracterizan por ser altamente resistentes al

calor, a las radiaciones y a la desecación. La resistencia de la espora se debe a la

estructura proteica (rica en aminoácidos azufrados) de sus capas externas, lo que

también las hace resistentes a tinción. Por este motivo las esporas se tiñen en caliente.

b. Observación cápsula: se trata de una tinción negativa, usando tinta china, que permite

determinar la presencia de cápsulas polisacarídicas.

Por lo tanto el estudio macro y microscópico de una muestra bacteriana permite

obtener una orientación preliminar de su identidad y dirige el desarrollo de pruebas

bioquímicas especificas que permitan una buena identificación.

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TI�CIÓ� DE GRAM

La técnica de mayor importancia en el área de la microbiología, es la tinción de Gram

(Figura Nº 3), pues divide a la mayoría de las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivo

y Gram negativo. Además permite diferenciar forma (cocos, bacilos) y la disposición

bacteriana (diplos, cadenas, racimos).

La tinción Gram consiste en teñir un frotis de bacterias con Cristal Violeta, y luego

tratarlas con una solución mordiente (fijadora) de Iodo/Ioduro (Lugol). Todas las bacterias se

tiñen en estas condiciones, sin embargo, sólo algunas son capaces de retener el colorante al

tratarlas con un agente decolorante como etanol o una solución decolorante de Etanol –

Acetona. Las bacterias que retienen el colorante son Gram positivo y las que se decoloran

son las Gram negativo que para observarse deberán teñirse con un colorante de contraste

(Safranina). Por lo tanto, las Gram positivo se verán de color azul/violeta y las Gram

negativo de color rojo o rosado.

La diferencia en la reacción frente a la tinción de Gram se debe a la composición

química de las estructuras externas de las bacterias. Las bacterias Gram positivo tienen una

capa gruesa de peptidoglicán o mureína, mientras que las Gram negativo tienen menor

cantidad de peptidoglicán y tienen una membrana externa (además de la membrana

citoplasmática). La explicación más aceptada es que, luego de la acción de la solución

decolorante, las bacterias Gram positivo son capaces de retener el colorante gracias al

peptidoglicán que se deshidrata. En cambio las Gram negativo, pierden parte de los lípidos de

su membrana externa por acción del decolorante (un solvente orgánico como por ejemplo

alcohol), lo que sumado a la menor cantidad de peptidoglicán, hace que se decoloren. Es

importante destacar que la etapa crítica en la tinción es la decoloración, por lo que se debe

tener especial cuidado en realizarla en forma adecuada.

18

Figura Nº 3: Técnica Tinción Gram.

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TABLA Nº 2: Cuadro Resumen Tipo de Tinciones

TI�CIÓ� REACTIVOS PRI�CIPIO UTILIDAD

Gram Cristal Violeta, Lugol,

Alcohol – Acetona, Safranina

Gram positivo retienen cristal violeta (azul)

Gram negativo se tiñen con contraste (rojo)

Clasificación bacteriana clásica:

Gram Positivo y Negativo

Tinción de esporas Verde de malaquita, Safranina Tiñe la espora (verde) Esporas de bacilos Gram Positivo

Kinyoun Fucsina, Acido Sulfúrico, Azul de

Metileno

Unión ácido resistente de fucsina a escasos

ácidos micólicos de la pared (fucsia)

�ocardia

(BAA lábiles)

Anaranjado de acridina Naranja de Acridina

(fluorescencia)

Tiñe el DNA bacteriano (fluorescencia

naranja) Bacterias Gram lábiles

Giménez Fucsina, Verde de Malaquita Tiñe la pared de Bartonella (fucsia) Bartonella spp, corpúsculo

elemental de Chlamydia

Ziehl-�eelsen Fucsina, Alcohol – Acido, Azul de

Metileno

Unión ácido-alcohol resistente de fucsina a

ácidos micólicos de pared (fucsia) Micobacterias (BAAR*)

Auramina / rodamina Auramina – Rodamina

Permanganato de Potasio

Unión de auramina-rodamina al ácido

micólico de la pared (fluorescencia

amarilla)

Micobacterias

(mayor sensibilidad que Ziehl

Neelsen)

20

También es importante señalar que las bacterias Gram positivo pueden

observarse como Gram negativo en algunas condiciones: en cultivos viejos (de más de

24 ó 48 horas), a pH ácido y en condiciones de decoloración muy prolongada.

Un género bacteriano que representa una excepción a la tinción de Gram (no

posee una pared gruesa de peptidoglicán ni una membrana externa) es Mycobacterium

(bacilos ácido – alcohol resistentes), cuyas especies como M. tuberculosis (Bacilo de

Koch) y M. leprae (Bacilo de Hansen) deben ser teñidos con la tinción de Ziehl

Neelsen. Son bacterias que se tiñen con dificultad, pero que una vez teñidas, el

colorante no se libera, aún por acción de decolorantes enérgicos como una solución de

alcohol y ácido clorhídrico. Esta resistencia se debe a la gran cantidad de lípidos que

tienen en su cubierta, incluyendo ácidos grasos de alto peso molecular que constituyen

entre el 20 y el 40% del peso seco de la bacteria. Este contenido inusualmente alto en

lípidos le confieren a este grupo propiedades como: hidrofobicidad (las bacterias

tienden a formar grumos en medio líquido), resistencia a la acción de anticuerpos y el

complemento y, crecimiento lento debido a la dificultad de absorción de nutrientes a

través de esta pared celular lipídica.

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A B

C D

ACTIVIDADES PRÁCTICAS SIEMBRAS 1. De medios Sólidos a medios Sólidos. 1.1. Desde placa Petri a placa de Petri:

a. Flamear el asa para su esterilización. b. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias.

c. Tomar una muestra con el asa desde el medio sólido con la bacteria en estudio (Con sólo tocar la colonia estará tomando la cantidad de bacterias suficiente para poder sembrar).

d. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estrías, para ello: i. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig – zag en un pequeño sector de la placa. Flamear el asa, para eliminar las bacterias.

ii. Con el asa estéril, deslizarla desde el sector ya sembrado hacia el sector contrario de la placa nuevamente en forma de zig – zag. �uevamente flamear el asa, para eliminar las bacterias.

iii. Con el asa estéril, a partir de las últimas líneas realizadas deslizarla hacia el sector contrario de la placa en forma de zig-zag. �uevamente flamear el asa.

e. Con el asa estéril, repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar la placa. Tener cuidado de que la última estría no tome contacto con el lugar donde se realizó el primer sembrado. Tapar la placa y flamear el asa para su esterilización.

f. Incubar la placa recién sembrada a la temperatura adecuada.

Figura Nº 4: Siembra desde agar en placa petri a agar en placa de petri.

22

2. De medios Sólidos a medios Líquidos. 2.1. Desde placa Petri a tubo con medio de cultivo líquido:

a. Rotular el tubo de caldo con los datos correspondientes (Nombre Microorganismo, Grupo, Fecha).

b. Flamear el asa para su esterilización. c. Enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias. d. Tomar una muestra con el asa desde el medio sólido con la bacteria en estudio (Con sólo tocar la colonia estará tomando la cantidad de bacteria suficiente para poder sembrar).

e. Flamear la boca del tubo con medio líquido estéril. f. Introducir el asa dentro del tubo con caldo y agitar vigorosamente. g. Flamear la boca del tubo y el asa para su esterilización. h. Tapar el tubo e incubar a la temperatura adecuada.

Figura Nº 5: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con caldo de cultivo.

A B

C D

18 – 24 Hrs.

23

3. De medios Líquidos a medios Sólidos 3.1. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a placas de Petri:

a. Rotular la placa en el reverso (donde se encuentra el agar) con los datos correspondientes.

b. Homogenizar el tubo con la muestra por agitación. c. Flamear el asa para su esterilización. d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y enfriar el asa en las paredes de este. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego retirarla.

e. Flamear y tapar la boca del tubo. f. Seleccionar el medio adecuado y poner la placa boca abajo cerca del mechero. (Recuerde que no debe alejarse del mechero con la placa abierta para no perder la esterilidad del medio)

g. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estrías, para ello: iv. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig – zag en un pequeño

sector de la placa. Flamear el asa, para eliminar las bacterias. v. Con el asa estéril, deslizarla desde el sector ya sembrado hacia el

sector contrario de la placa nuevamente en forma de zig – zag. �uevamente flamear el asa, para eliminar las bacterias.

vi. Con el asa estéril, a partir de las últimas líneas realizadas deslizarla hacia el sector contrario de la placa en forma de zig-zag. �uevamente flamear el asa.

vii. Con el asa estéril, repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar la placa. Tener cuidado de que la última estría no tome contacto con el lugar donde se realizó el primer sembrado.

h. Tapar la placa y flamear el asa para su esterilización. i. Incubar la placa a la temperatura adecuada.

Figura Nº 6: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a agar en placa Petri.

18 – 24 hrs.

A B C

D

24

3.2. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a tubo con agar (Por picadura). a. Rotular el tubo con los datos correspondientes. b. Homogenizar el tubo con la muestra por agitación. c. Flamear el asa en punta para su esterilización. d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y enfriar el asa en las paredes de éste. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego retirarla.

e. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano. f. Efectuar la siembra del tubo con el cultivo bacteriano al tubo con el medio estéril; para ello: i.- Destapar el tubo estéril e introducir el asa cargada sin tocar las paredes,

picando el medio de cultivo al centro sin llegar al fondo del mismo. ii.- Retirar el asa con precaución para producir el menor desgarro posible.

g. Flamear la boca del tubo y taparlo. h. Flamear el asa para su esterilización. i. Incubar el tubo sembrado a la temperatura adecuada.

Figura Nº 7: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a Tubo con agar

A B

C D

25

3.3. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a tubo con agar (Zig – Zag superficie). a. Rotular el tubo con los datos correspondientes. b. Homogenizar el tubo con la muestra por agitación. c. Flamear el asa para su esterilización. d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y enfriar el asa en las paredes de éste. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego retirarla. e. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano. f. Destapar el tubo con agar tendido y flamear la boca del tubo. g. Introduzca el asa hasta el fondo. Posteriormente, en un sólo movimiento, deslizar el asa con movimientos en zig – zag ascendentes por la superficie del medio de cultivo. h. Flamear y tapar la boca del tubo. i. Flamear el asa para su esterilización. j. Incubar el tubo recién sembrado a la temperatura adecuada.

Figura Nº 8: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a tubo con agar tendido.

A B

C D

26

4. Desde medios Líquidos a medios Líquidos. 4.1. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a tubo con medio de

cultivo líquido.

a. Rotular el tubo con los datos correspondientes. b. Homogenizar el tubo problema por agitación. c. Flamear el asa para su esterilización. d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo

y enfriar el asa en las paredes de éste. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego retirarla.

e. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano. f. Destapar el tubo con medio de cultivo estéril e introducir el asa cargada sin

tocar las paredes, agitar en el medio de cultivo y retirar con cuidado. g. Flamear la boca del tubo y taparlo. h. Flamear el asa para su esterilización. i. Incubar el tubo sembrado a la temperatura adecuada.

Figura Nº 9: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a tubo con medio de cultivo.

18 - 24 hrs.

A B

C

27

Tabla Nº3: Cuadro Resumen Actividad Técnicas de Siembra.

Desde Medio Tipo A Medio Tipo Toma de muestra desde Siembra en Tipo Siembra

Sólido

Sólido Placa Petri Placa Petri Aislamiento en cuadrantes

Líquido Placa Petri Tubo con Medio de cultivo Agitación con asa

Líquido

Sólido Tubo con cultivo líquido

Placa Petri Aislamiento en cuadrantes

Tubo con Agar Pinchadura

Tubo con Agar Tendido Zig-Zag superficie

Líquido Tubo con cultivo líquido Tubo con Medio de cultivo Agitación con asa

28

5. Técnicas de Esterilización 5.2. Flameado

a. Dividir una placa de agar nutritivo por la mitad y rotularla con los datos correspondientes.

b. Homogenizar el tubo con el cultivo bacteriano por agitación. c. Flamear el asa para su esterilización. d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y enfriar el asa en las paredes de éste. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego retirarla.

e. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano. f. Deslizar el asa suavemente por una mitad del agar. Cerrar la placa. g. Luego, flamear el asa para su esterilización, enfríela en la tapa y deslícela suavemente por la otra mitad del agar.

h. Cerrar la placa. i. Incubar la placa a 37ºC.

6. Desinfección y Asepsia 6.2. Cloro a. Dividir una placa de agar nutritivo por la mitad y rotularla con los datos correspondientes.

b. Tomar una tórula estéril y humedecerla en suero fisiológico c. Luego con esta misma deslizarla por alguna superficie fuera del laboratorio de amplia exposición (baranda de la escalera, manillas de las puertas, etc.).

d. Una vez tomada la muestra, pasar la tórula suavemente sobre una mitad de la placa de agar nutritivo.

e. A continuación, para comprobar la capacidad de desinfección del cloro, limpiar varias veces la superficie analizada anteriormente con un algodón con cloro y deslizar una tórula estéril.

f. Pasar la tórula por la otra mitad del agar. g. Incubar la placa a 37ºC.

6.2. Yodo a. Dividir una placa de agar nutritivo por la mitad y rotularla con los datos correspondientes.

b. Por una mitad del agar, deslizar suavemente uno de sus dedos. c. Tome un trozo de algodón con yodo y limpie la yema del dedo que utilizó, espere unos segundos.

d. Pasar el dedo suavemente por la otra mitad de la placa. e. Incubar la placa a 37ºC.

6.2. Alcohol a. Dividir una placa de agar nutritivo por la mitad y rotularla con los datos correspondientes.

29

b. Tomar una tórula estéril y humedecerla en suero fisiológico c. Luego con esta misma deslizarla por otra superficie fuera del laboratorio de amplia exposición (baranda de la escalera, manillas de las puertas, etc.).

d. Una vez tomada la muestra, pasar la tórula suavemente sobre una mitad de la placa de agar nutritivo.

e. A continuación, para comprobar la capacidad de desinfección del alcohol, limpiar varias veces la superficie analizada anteriormente con un algodón con alcohol y deslizar una tórula estéril.

f. Pasar la tórula por la otra mitad del agar. g. Incubar la placa a 37ºC.

CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS Y MICROSCÓPICAS 1. Análisis Macroscópico.

Realice la observación de sus aislamientos en las placas de petri sembradas

previamente, según los parámetros presentes en la tabla, recuerde que debe analizar una sola colonia aislada del cultivo (la más representativa del cultivo).

2. Análisis Microscópicos. Realice tinción Gram a las colonias que tiene disponibles y observe al microscopio,

caracterizando afinidad tintorial, forma y agrupación bacteriana.

Tinción Gram:

Preparación frotis bacteriano a partir de colonia. a. Colocar una gota de agua en el centro de la lámina (aprox. 0,5 cm de

diámetro). b. Flamear el asa para su esterilización. c. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias. d. Obtener una pequeña muestra desde la placa. e. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del

portaobjeto. f. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque (sin

hervir).

Preparación frotis bacteriano a partir de caldo de cultivo. a. Flamear el asa para su esterilización. b. Enfríe el asa en las paredes internas del tubo. c. Tome un inóculo del tubo problema procurando que quede una película en

el asa. d. Esparcir la gota por la superficie del portaobjeto. e. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque (sin

hervir).

30

Tinción frotis

a. Verificar, con el dorso de la mano, que el vidrio no esté demasiado caliente. b. Cubrir el frotis completamente con cristal violeta e incubar por 3 min. c. Dejar escurrir el cristal violeta y agregar sobre la muestra una solución de

Lugol. Dejar con Lugol por 2 min. d. Lavar el lugol alternando alcohol-acetona y agua dejando escurrir, hasta que

se decolore completamente. Nota : Debe primero lavar con el decolorante alcohol – acetona y luego con agua. De otra manera retirara el colorante de la muestra y no podrá observar las bacterias.

e. Cubrir con colorante de contraste, Safranina al 1%, por 1 min. f. Lavar con agua, dejar escurrir y secar suavemente con papel absorbente. g. Observar en el microscopio óptico con inmersión (objetivo 100X).

Utilizar el microscopio, anotar y fotografiar lo que observe.

3. Tinción de Esporas. Procedimiento : a. Limpiar una lámina portaobjeto con alcohol. b. Con el asa colocar una gota de agua en el centro de la lámina (aprox. 0,5 cm de

diámetro). c. Flamear el asa para su esterilización. d. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias. e. Obtener una pequeña muestra desde la placa de Bacillus spp. f. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del

portaobjeto. g. Fijar en el mechero hasta que se seque completamente (sin hervir). h. No olvidar esterilizar el asa después de usarla. i. Cortar papel absorbente en forma rectangular, de manera que cubra el frotis con

bacteria, pero que no sobresalga a los bordes de la lamina del portaobjeto. j. Poner 4 capas de papel sobre el frotis y a continuación agregar solución

colorante Verde de Malaquita. Debe fijarse que el colorante tiene que atravesar las 4 capas de papel y ponerse en contacto con el frotis bacteriano.

k. Como esta tinción se realiza en caliente: para ello con una pinza de madera debe colocar la muestra encima de la llama del mechero hasta observar emisión de vapor durante 5 min. No sobrecaliente para evitar que se queme su muestra o se rompa el portaobjeto.

l. Una vez que se observa emisión de vapor desde la muestra, se debe reponer el colorante nuevamente. Debe repetir 3 veces este proceso.

m. Lavar con agua de tal manera que escurra suavemente todo el colorante Verde de Malaquita.

31

n. Posteriormente cubra el frotis con el colorante de contraste Safranina, durante 2 min.

o. Lavar con agua y secar cuidadosamente con papel absorbente y observar con lente de inmersión.

NOTA:

− Las bacterias se observan rosadas mientras que las esporas (de menor tamaño que las bacterias) son pequeñas esferas verdes.

− Es posible observar esporas libres y esporas intracelulares. En estas últimas es posible determinar si se encuentran al centro o hacia un extremo de la célula y, si la espora deforma o no al bacilo.

− Una vez observada la muestra desechar la lámina en los frascos con DESINFECTANTE ubicados en cada mesón.

Localización y morfología de las esporas en Bacillus

Figura Nº 10: Procedimiento Tinción de Esporas.

A B

E F G

C D

Verde Malaquita Safranina

Papel Absorbente

32

4. Tinción de Cápsula. Procedimiento: a. Limpiar una lámina portaobjeto con alcohol. b. En una esquina de la lámina portaobjeto colocar una gota de Tinta China del

tamaño de una arveja. c. Flamear el asa para su esterilización. d. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias. e. Obtener una pequeña muestra desde la placa de Klebsiella spp. f. Mezclar la muestra con la gota de tinta, esterilizar el asa y repetir 3 o 4 veces

(sólo agregar la bacteria). La Tinta China impide ver si la solución tiene o no suficiente bacteria, por lo mismo es necesario mezclar con suficiente cultivo.

g. Tenga cuidado de no ensuciar su cultivo bacteriano con tinta china, asegurarse de esterilizar el asa previamente y de enfriar ésta.

h. Realizar un frotis de la suspensión de manera que quede una capa delgada. Esto se realiza tomando un cubreobjeto y esparciendo la mezcla a lo largo del portaobjeto que contiene la mezcla Tinta China–Bacteria (Figura 12).

i. Fijar suavemente en el mechero. j. Durante 2 min cubra completamente con colorante de contraste, Fucsina. k. Lave con agua, seque con papel absorbente y observe con lente inmersión.

Figura Nº 12: Procedimiento Tinción de Cápsula.

A B

C D

E

Fucsina

F

Bacterias

Cápsula

33

TRABAJO PRÁCTICO �º 2: FLORA �ORMAL Y FISIOTAXO�OMÍA DE BACTERIAS

GRAM POSITIVO

OBJETIVOS 1. Realizar pruebas bioquímicas para la identificación de cocáceas Gram positivo.

2. Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de

productos intermediarios, debido a la acción bacteriana.

3. Identificar cepas bacterianas Gram positivo, provenientes de muestras de mucosa

bucal y nasofaríngea.

Como en la mayoría de los animales, en el organismo humano existen lugares

que deben mantenerse estériles y otros donde de forma natural cohabitan una gran

diversidad de microorganismos, aún en las personas más sanas.

La sangre, el líquido cefalorraquídeo, la médula ósea y las vías aéreas inferiores

(bronquios y alvéolos), entre muchos otros, carecen de microorganismos debido a los

mecanismos de defensa que presentan. Pero en la boca, faringe, intestinos, vagina,

oídos, piel, nariz o conjuntivas residen diversos microorganismos que conforman la

FLORA �ORMAL del ser humano. Algunos de los microorganismos aislados con

mayor frecuencia desde las diferentes regiones del cuerpo y que se consideran

integrantes de la flora normal son: Staphylococcus epidermidis, S. aureus (portadores),

Streptococcus mitis, S. salivarius, S. mutans, bacterias coliformes como Escherichia

coli, lactobacilos, entre otros.

Innumerables bacterias son filtradas a medida que el aire que los transporta pasa

a través de la nasofaringe, la tráquea y los bronquios; la mayoría de estos

microorganismos son atrapados en la secreciones mucosas y deglutidos. Así, los senos

nasales, la tráquea, los bronquios y los pulmones son habitualmente estériles. La

nasofaringe es el hábitat natural de bacterias y virus patógenos comunes que causan

infecciones en la nariz, garganta, bronquios y pulmones. Algunas personas se

convierten en portadores nasales de estreptococos y estafilococos y descargan estos

microorganismos en grandes cantidades desde la nariz hacia el aire.

34

Las bacterias con las que convivimos diariamente pueden representar un riesgo

para nuestra salud cuando el ecosistema cuerpo humano-bacteria se ve afectado, ya sea

por alteración del ecosistema bacteriano o por factores del hospedero, como una

disminución en las defensas, que permitan que las bacterias normales invadan o ataquen

al ser humano. Es en estos casos que el diagnóstico de los organismos responsables es

de suma importancia para poder elaborar tratamientos adecuados. Por este motivo, el

Laboratorio de Microbiología cumple un rol fundamental en la identificación de

bacterias en una muestra determinada.

En el laboratorio de Microbiología el análisis de una muestra sigue por lo

general, la siguiente secuencia:

a. Siembra y obtención del microorganismo aislado (cultivo puro)

b. Observación de morfología macroscópica

c. Tinciones y observación de morfología y agrupación microscópica.

d. Identificación fisiotaxonómica (reacciones metabólicas específicas)

e. Estudios de sensibilidad a agentes antimicrobianos.

La fisiología bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas a través

de las alteraciones que producen en el medio de cultivo. Estas alteraciones están

determinadas por el metabolismo de cada bacteria, por lo tanto ha sido posible

establecer diferencias entre ellas, las que han sido utilizadas en su clasificación en

diferentes géneros y especies.

Las técnicas de identificación bioquímica de las bacterias diferencian géneros y

especies bacterianas en base a la detección de:

a. Utilización de fuentes de carbono: Glucosa, Lactosa, Sacarosa, Manitol,

Sorbitol, Citrato.

b. Formación de productos finales o intermediarios del metabolismo microbiano:

Indol, CO2 Acido sulfhídrico (H2S), Acetilmetilcarbinol, etc.

c. Presencia de enzimas: Catalasa, Ureasa, Oxidasa, Coagulasa, etc.

d. Sensibilidad a algunas compuestos químicos o antibióticos: Bacitracina,

Optoquina, Novobiocina, etc.

35

En general, para cocáceas Gram positivo se utilizan fundamentalmente los dos

últimos métodos, en cambio para bacilos Gram negativo se emplean los tres primeros.

Estos test se pueden realizar mediante baterías en tubos convencionales o mediante

sistemas comerciales más fáciles de manipular (API).

En este trabajo se analizaran dos de las Familias de Bacterias Gram positivo más

importantes, como son la Micrococcaceae y Streptococcaceae.

Familia Micrococcaceae

La Familia Micrococcaceae comprende los géneros Micrococcus, Staphylococcus y

Planococcus. Son bacterias Gram positivo, esféricas (cocos) agrupadas en racimo. Son

catalasa positivo, reacción característica de la Familia Micrococcaceae y que permite

diferenciara la de otros cocos Gram positivos como por ejemplo Streptococcus.

Las especies del género Micrococcus son saprófitas, se encuentran

habitualmente en la piel de mamíferos, en el suelo y el agua. Tienen metabolismo

estrictamente aerobio, a diferencia de las especies del género Staphylococcus que son

anaerobios facultativos.

Otra característica que diferencia ambos géneros, es la propiedad de

Staphylococcus de fermentar glucosa en anaerobiosis, no así Micrococcus.

Figura Nº 13: Agrupación de algunas cocáceas Gram Positivo

36

Las principales especies del género Staphylococcus son:

� Staphylococcus aureus.

� Staphylococcus epidermidis.

Staphylococcus aureus es patógeno para el hombre. Produce una variedad de

factores responsables de su patogenicidad, algunos de estos se describen en las Tablas

Nº 1 y 2.

Tabla Nº 1: Algunas enzimas producidos por Staphylococcus aureus. Enzimas Acción en la célula blanco

Hialuronidasa Rompe el cemento celular facilitando la invasión de los tejidos por las bacterias.

Fibrinolisina Disgrega coágulos de fibrina.

Coagulasa Coagulan el plasma y, se pueden encontrar secretadas al medio extracelular y otras que están unidas a membranas.

Nucleasas Hidrolizan DNA.

Tabla Nº 2: Algunas toxinas producidos por Staphylococcus aureus.

Toxinas Acción en la célula blanco

Alfa toxina Es una hemolisina que produce lisis total de los glóbulos rojos. Es una proteína antigénica de peso molecular 30.000 D.

Leucocidina* Causa degranulación de los leucocitos y macrófagos.

Exfoliatina Algunas cepas producen esta toxina, la que causa el síndrome de piel quemada.

Enterotoxinas Algunas cepas producen estas toxinas que causan intoxicaciones alimentarías.

* También es conocida como toxina de Panton - Valentine.

Las toxinas producidas por Staphylococcus aureus son causantes de los síntomas de las enfermedades estafilocócicas.

37

AISLAMIE�TO Y CARACTERIZACIÓ�

El medio de cultivo utilizado para el aislamiento de S. aureus dependerá del

origen de la muestra. Para el aislamiento de S. aureus de muestras CLÍ�ICAS como

pus, heridas, secreciones, etc. se utiliza:

A. AGAR SA�GRE: Éste es un medio enriquecido que contiene sangre desfibrinada

de cordero o de conejo. Permite el desarrollo abundante de las especies de

Staphylococcus y además permite visualizar la producción de hemólisis por lisis de

los glóbulos rojos alrededor de las colonias.

S. aureus : produce halos de hemólisis completa alrededor de las colonias,

producida por la alfa toxina.

S. epidermidis : no produce hemólisis o lo hace débilmente.

Micrococcus : no produce hemólisis.

B. AGAR MA�ITOL SALADO O MEDIO DE CHAPMA�: Es un medio

selectivo que contiene Manitol, NaCl al 7,5% y el indicador de pH Rojo de

Fenol. Micrococcus y Staphylococcus son halotolerantes, es decir, son capaces

de crecer en esta concentración de NaCl. En este medio además se evidencia la

fermentación de Manitol, la que se observa por el viraje del indicador a amarillo.

S. aureus: Genera colonias amarillas cremosas rodeadas de una zona amarilla

(producto de la fermentación)

S. epidermidis : generalmente no fermenta el manitol

Micrococcus: No fermenta el manitol.

Figura Nº 14: Tipos de hemólisis

38

TABLA DE IDE�TIFICACIÓ� DE BACTERIAS GRAM POSITIVO

Cocaceas

Catalasa

Positivo

Test de Bacitracina

Test de Coagulasa Micrococcus

Staphylococcus aureus Staphylococcus

Coagulasa negativo

Test de Novobiocina

S. Coagulasa negativoNo saprophyticus

Staphylococcus

saprophyticus

HemólisisGamma

Bilis EsculinaNaCl 6,5 %

Enterococcus

Negativo

Streptococcus

Observar Hemólisis

HemólisisBeta

Test de Latex

Streptococcus

Grupo A, B, C,D, F, G

HemólisisAlfa

Optoquinaresistente

Streptococcus

grupo viridans

Optoquinasensible

Streptococcus

pneumoniae

Bilis positivoNaCl positivo

Enterococcus

Bacilos

Catalasa positivo

Aspecto Tinción Gram

Bacilos GrandesEsporuladosBordes netos

Bacilo en empalizada

Bacilos finos

Bacillus sp

Corynebacterium sp

Listeria

S R

(+) (-)

R S

Cocaceas

Catalasa

Cocaceas

Catalasa

Positivo

Test de Bacitracina



Coagulasa negativo

Test de Novobiocina


Staphylococcus

saprophyticus

Positivo

Test de Bacitracina



Coagulasa negativo

Test de Novobiocina


Staphylococcus

saprophyticus

HemólisisGamma


Enterococcus

HemólisisGamma


Enterococcus

Negativo

Streptococcus

Observar Hemólisis

HemólisisBeta

Test de Latex

Streptococcus


HemólisisAlfa

Optoquinaresistente

Streptococcus

grupo viridans

Optoquinasensible

Streptococcus

pneumoniae


Enterococcus

Negativo

Streptococcus

Observar Hemólisis

HemólisisBeta

Test de Latex

Streptococcus


HemólisisBeta

Test de Latex

Streptococcus


HemólisisAlfa

Optoquinaresistente

Streptococcus

grupo viridans

Optoquinasensible

Streptococcus

pneumoniae


Enterococcus

HemólisisAlfa

Optoquinaresistente

Streptococcus

grupo viridans

Optoquinasensible

Streptococcus

pneumoniae


Enterococcus

Bacilos

Catalasa positivo




Bacilos finos

Bacillus sp

Corynebacterium sp

Listeria

Bacilos

Catalasa positivo




Bacilos finos

Bacillus sp

Corynebacterium sp

Listeria

S R

(+) (-)

R S

39

En los dos medios (Agar Sangre y Agar Manitol Salado) se debe confirmar

mediante tinción de Gram la presencia de cocos Gram positivo en racimo, ya que otras

especies pueden dar colonias semejantes. Una vez confirmada la presencia de cocos

Gram positivo en racimo se realizan pruebas bioquímicas para confirmar el diagnóstico.

Una vez aisladas las colonias y habiendo observado su aspecto y características

en medios selectivos se realizan las pruebas bioquímicas.

Prueba de la Catalasa: Busca la presencia de la enzima catalasa, que

descompone el H2O2.

La enzima se encuentra en la mayoría de las bacterias que contienen citocromo.

La excepción es Streptococcus que no puede descomponer el H2O2. El test permite

diferenciar Staphylococcus, Micrococcus y Listeria (catalasa positivo) de Streptococcus

(catalasa negativo).

Para realizar esta prueba se debe colocar una gota de peróxido de hidrógeno en

un portaobjetos, sobre la cual se agrega la colonia en estudio. La aparición rápida y

sostenida de burbujas (antes de 5 segundos) indica test positivo.

Precauciones: no tocar el agar sangre al tomar la colonia ni usar asas de platino

ya que estas sustancias dan falsos positivos.

Si se sospecha que la colonia corresponde a Staphylococcus aureus, se realiza la

prueba de la COAGULASA.

Coagulasa: Es una prueba de PATOGE�ICIDAD que busca la presencia de la

enzima coagulasa producida por Staphylococcus aureus.

H2O2 H2O + O2 Enzima Catalasa

40

La enzima es un activador del fibrinógeno a fibrina, además, la pared de

Staphylococcus aureus posee receptor de fibrinógeno lo que permite la formación de

puentes entre bacteria y bacteria, formándose un coágulo.

Diferencia Staphylococcus aureus de otros Staphylococcus coagulasa negativo.

Esta prueba se puede realizar de dos formas:

a) Técnica en tubo: consiste en incubar plasma de conejo con gotas de cultivo

líquido de Staphylococcus. La reacción positiva se observa como la aparición de

un coágulo a las 4 horas. Esta técnica detecta la coagulasa libre.

b) Técnica en portaobjeto: a partir de un cultivo de Staphylococcus en medio

sólido, se hace una suspensión abundante sobre una gota de agua. Esta

suspensión debe ser lo más homogénea posible. Sobre ésta se coloca una o dos

gotas de plasma de conejo y se homogeniza. La reacción positiva se observa

como aglutinación de las bacterias a los 20 segundos. Esta técnica detecta la

coagulasa unida a membrana.

c) Otra prueba que sirve para diferenciar Staphylococcus aureus de otros

Staphylococcus es un test comercial de aglutinación a través de partículas de

latex. La metodología consiste en poner una gota del reactivo latex sobre un

círculo de la tarjeta, a continuación se emulsiona sobre la gota la colonia

sospechosa, se agita durante unos segundos y si hay formación de grumos

visibles se considera positiva. Siempre se debe realizar un control negativo que

está incluido en el kit. El fundamento de la técnica de aglutinación con

partículas de latex se muestra en la siguiente figura.

Partículas de

latex con

anticuerpos

Bacterias Aglutinación de las partículas

Anticuerpo (Antígeno específico) = reconocen el antígeno bacteriano.

41

Familia Streptococcaceae

El Género Streptococcus corresponde a cocos Gram positivos, anaerobios

facultativos que se disponen en pares o en cadenas y son catalasa negativo. Bajo

ciertas condiciones de cultivo las células son ovoides o alargadas. Se encuentran en

diferentes superficies y mucosas del hombre y de algunos animales como cavidad oral,

faringe, piel, tracto intestinal. Algunas especies son utilizadas en la industria lechera

para la elaboración de quesos, leches fermentadas y yoghurt (Streptococcus lactis).

Los miembros del género Streptococcus se clasifican de acuerdo a:

1.- ACTIVIDAD HEMOLÍTICA: según el tipo de hemólisis que presenten al ser

cultivadas en placas de agar sangre de conejo o de cordero.

a) Beta hemolíticos: producen halos limpios de hemólisis alrededor de las

colonias.

b) Alfa hemolíticos: producen halos de hemólisis incompleta de color verdoso

(viridans) alrededor de las colonias.

c) Gama hemolíticos: no producen hemólisis

2.- SEGÚ� CO�STITUCIÓ� A�TIGÉ�ICA DE LA PARED CELULAR O

CLASIFICACIÓ� DE LA�CEFIELD: Se basa en la composición química y

antigénica de un hidrato de carbono presente en la pared celular y permite clasificar

a los estreptococos en grupos serológicos que van desde la A hasta la U.

Ambas clasificaciones se asocian entre sí, así tenemos por ejemplo estreptococos

beta hemolíticos del grupo A como Streptococcus pyogenes, que corresponde al más

patógeno del género.

Streptococcus pyogenes produce varias toxinas y enzimas responsables de su poder

patógeno. Es el agente causal de infecciones locales purulentas como amigdalitis,

faringitis, otitis, etc. Además provoca enfermedades sistémicas como fiebre puerperal y

escarlatina.

Streptococcus pneumoniae o pneumococo es otra especie importante de este

género, agente causante de neumonía lobar en el hombre. Es un diplococo no

perfectamente esférico, tiene forma de cabeza de lanza (lanceolado). Su forma virulenta

se encuentra rodeada por una cápsula. Es habitante normal de la faringe del hombre.

Para su aislamiento las placas deben incubarse en un ambiente con 10% de CO2. En

42

agar sangre S. pneumoniae presenta alfa hemólisis y las colonias son planas con formas

de fichas de damas.

Estreptococos fecales o enterococos (por ejemplo Enterococcus faecalis). Existen

otras especies de Streptococcus que habitan el intestino del hombre y animales y se les

conoce con el nombre de estreptococos fecales o enterococos. Se caracterizan porque

generalmente son no hemolíticos y pueden crecer en condiciones de alta salinidad (NaCl

6,5%), pH básico (pH 9,6) y en presencia sales biliares en que otros estreptococos no

pueden hacerlo. Su presencia en alimentos o agua indica contaminación fecal.

AISLAMIE�TO Y CARACTERIZACIÓ� El aislamiento de Streptococcus pyogenes se efectúa sembrando la muestra sobre

una placa de agar sangre. Streptococcus pyogenes presenta las siguientes características:

1. Hemólisis en placa de agar sangre. Se observa hemólisis limpia alrededor de las

colonias, las cuales son muy pequeñas.

Se debe confirmar mediante tinción de Gram la presencia de cocos Gram positivo

en cadena, ya que otras especies pueden dar colonias semejantes, por ejemplo

Staphylococcus. Una vez confirmada su presencia se realizan pruebas adicionales para

confirmar el diagnóstico.

a) Prueba de sensibilidad a Bacitracina. Los estreptococos beta hemolíticos del

grupo A (Streptococcus pyogenes) son sensibles a Bacitracina (se realiza en forma

similar a un antibiograma). Otros estreptococos también son sensibles, sin embargo

no son beta hemolítico.

b) Pruebas serológicas. El diagnóstico de Streptococcus pyogenes se debe confirmar

mediante reacciones serológicas con antisueros específicos para el antígeno

superficial.

c) Bilis/Esculina, �aCl 6,5%. Los Enterococos crecen en presencia de NaCl 6,5%,

toleran las sales biliares y pueden hidrolizar la esculina. Estas propiedades se

pueden usar para distinguir los Enterococos de otros cocos Gram Positivo catalasa-

negativos. En la prueba positiva, el tubo donde está el medio se torna de color

chocolate oscuro, característico al desdoblar la bilis esculina.

43

�OTA: Lea el procedimiento por completo antes de comenzar a trabajar.

RECUERDE EN TODO MOMENTO TRABAJAR CON TÉCNICA ASÉPTICA

PARA EVITAR LA CONTAMINACIÓN QUE CONDUCIRÁ A RESULTADOS

ERRÓNEOS.

RECUERDE QUE ESTÁ TRABAJANDO CON MUESTRAS BIOLÓGICAS Y

MICROORGANISMOS POTENCIALMENTE PATÓGENOS, POR LO QUE

DEBE APLICAR LAS MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD APRENDIDAS CON

44

ACTIVIDADES PRÁCTICAS

1. Observe las placas sembradas y describa las colonias bacterianas. Describa si

se trata de cultivos puros.

2. Realizar una tinción de Gram a su muestra problema. Observe al

microscopio.

3. Realizar un aislamiento de colonia en los siguientes tipos de agar.

a. Agar Corriente.

b. Agar Sangre.

4. Realizar las pruebas bioquímicas correspondientes según la tabla

Para el estudio de bacterias Gram positivo, se utilizan básicamente la detección

de enzimas y la sensibilidad a compuestos químicos o antibióticos.

Ante esto, se estudiara la presencia de enzimas como catalasa y coagulasa. La

sensibilidad a antibióticos se verá más adelante.

Procedimiento Prueba de Catalasa:

a. Tome una colonia desde el agar con un mondadientes o varilla de plástico estéril (sin sacar agar).

b. Poner la bacteria sobre un portaobjeto. c. Poner sobre el portaobjeto con la bacteria una gota de H2O2 y observe. Anote

lo observado y compare con su resultado del Gram.

Procedimiento Prueba de Coagulasa:

a. Tomar una tira reactiva y agregue una gota de cada reactivo en las zonas marcadas.

b. Con una varilla de plástico o un mondadientes tome varias colonias desde el agar.

c. Mezclar con la solución de anticuerpos del Test de aglutinación (plasma de conejo).

d. Esperar unos minutos agitando constantemente. e. Si existe la presencia de coágulos (como “leche cortada”), la reacción es

positiva. Si se ve siempre homogéneo, la reacción es negativa. Anote lo observado y compare con su resultado del Gram.

Procedimiento Prueba Bilis / Esculina:

45

a. Rotular el tubo con agar Bilis / Esculina con los datos correspondientes. b. Flamear el asa para su esterilización. c. Tomar un inóculo del tubo con cultivo bacteriano. d. Efectuar la siembra de la siguiente manera:

i. Destapar el tubo con agar Bilis / Esculina e introducir el asa cargada sin tocar las paredes, picando el medio de cultivo al centro sin llegar al fondo del mismo.

ii. Retirar el asa con precaución para producir el menor desgarro posible. e. Flamear la boca del tubo y taparlo. f. Flamear el asa para su esterilización g. Incubar el tubo sembrado a la temperatura adecuada.

Test de CAMP para Streptococcus

La sigla CAMP proviene de Christie, Atkins, Munch y Petersen, los descubridores del

fenómeno. Este procedimiento se utiliza para confirmar la presencia de Streptococcus

tipo B por la producción de una zona de hemólisis característica cuando crece en la

proximidad de Staphylococcus aureus, lo que se denomina “punta de lanza” (Ver figura

adjunta)

Procedimiento:

a.- Sobre una placa de agar Sangre realice con el asa una única estría en el centro a partir de un cultivo de Staphylococcus aureus.

b.- Perpendicular a la estría original, realice con el asa una o más estrías con el cultivo de Streptococcus.

c.- Incubar a la temperatura adecuada.

46

5. Procedimiento toma de muestra desde mucosas.

a. Tomar una placa de Agar Sangre, una placa de Agar Corriente y dividirla en 5 partes iguales. No olvidar rotular la placa en el reverso (por donde se encuentra el agar) con los datos correspondientes.

b. A continuación tomar una tórula estéril y humedecerla en suero fisiólogico. c. Deslizar la tórula por una de las siguientes mucosas: i. Mucosa yugal derecha o mejilla derecha. ii. Mucosa yugal izquierda o mejilla izquierda. iii. Mucosa vestibular iv. Paladar Duro v. Paladar Blando

d. Tomar la placa por su base y realizar la siembra en una de las zonas demarcadas.

e. Repetir el procedimiento hasta haber sembrado una muestra de cada una de las mucosas.

6. Siembre una muestra de la zona buconasofaringea y una nasal de su

compañero, de la misma forma que en la actividad anterior, en:

a. Agar Corriente b. Agar Sangre

47

TEST DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS AGE�TES

A�TIMICROBIA�OS MÉTODO DE DIFUSIÓ� E� AGAR O KIRBY-BAUER

Una metodología común para el estudio de la sensibilidad a antimicrobianos es

la difusión en agar. Este método cualitativo se basa en la inoculación del

microorganismo sobre una placa de agar donde se colocan discos de papel filtro

estériles impregnados con una concentración conocida de antibiótico. El antibiótico en

los discos difunde radialmente durante el tiempo de incubación de tal manera que a

medida que se aleja del disco, la concentración disminuye. En un punto determinado, la

concentración del antibiótico no podrá inhibir el crecimiento del microorganismo,

produciéndose entonces una zona circular de inhibición (o halo de inhibición) alrededor

del disco. El diámetro del área de inhibición puede ser convertido a las categorías de

“susceptible”, “intermedio” o “resistente” de acuerdo a las tablas publicadas por el

“National Committee for Clinical Laboratories Standars (NCCLS)”.

Interpretación de los halos de Inhibición para Staphylococcus spp (Agar Mueller –Hinton)

DROGA CONTENIDO DEL DISCO

SENSIBLE (Halo en mm)

INTERMEDIA (Halo en mm)

RESISTENTE (Halo en mm)

Oxacilina 1 µg ≥ 13 11 – 12 ≤ 10 Eritromicina 15 µg ≥ 23 14 – 22 ≤ 13 Clindamicina 2 µg ≥ 21 15 – 20 ≤ 14 Vancomicina 30 µg ≥ 15 - - Novobiocina 5 µg ≥ 16 - ≤ 16 Amoxicilina / A. Clavulánico 20 / 10 µg ≥ 20 - ≤ 19

Antibiograma mediante la técnica de difusión con discos

48

Interpretación de los halos de Inhibición para Streptococcus ββββ-hemolíticos (Mueller-Hinton con sangre de cordero)





Penicilina 10 unidades ≥ 24 - - Eritromicina 15 µg ≥ 21 16 – 20 ≤ 15 Clindamicina 2 µg ≥ 19 16 – 18 ≤ 15 Vancomicina 30 µg ≥ 17 - -

Interpretación de los halos de Inhibición para Streptococcus pneumoniae (Mueller-Hinton con sangre de cordero)





Penicilina 1 µg de oxacilina ≥ 20 Eritromicina 15 µg ≥ 21 16 – 20 ≤ 15 Trimet/sulfame 1.25 / 25.75 µg ≥ 21 16 – 20 ≤ 15 Vancomicina 30 µg ≥ 17 - -

Bacitracina: Detecta si el desarrollo bacteriano es inhibido por este antibiótico. Se

debe diseminar en una placa de agar sangre una colonia con la precaución de una

siembra homogénea y total de la placa. Luego se coloca un disco de bacitracina, se

incuba 16-24 horas y después se mide el tamaño del halo.

Se considera sensible cuando existe un halo de inhibición ≥ a 10 mm de diámetro.

Se considera resistente cuando el halo de resistencia es de < 10 mm de diámetro.

Micrococcus son sensibles a bacitracina.

Staphylococcus, son resistentes a bacitracina.

Optoquina: es un compuesto químico que pone a prueba la fragilidad de la

membrana celular de la bacteria y que a bajas concentraciones (5µg/ml) permite

diferenciar Streptococcus pneumoniae que es sensible de otros Streptococcus α

hemolíticos. Se utiliza un disco de optoquina que se deposita en una placa de agar

sangre cordero luego de haber diseminado la colonia sospechosa. Se incuba la placa a

37°C por 24 horas y después se mide el halo de inhibición. Si el halo es ≥ de 14 mm,

corresponde a Streptococcus pneumoniae.

�ovobiocina: es un antibiótico activo por vía oral. Se utiliza para el tratamiento de

infecciones por S. aureus y para el tratamiento de infecciones urinarias resistentes a

49

otros fármacos. La novobiocina es bacteriostática e interfiere con la síntesis de la pared

bacteriana. Este fármaco se utiliza muy poco debido a que su uso está asociado a una

alta incidencia de reacciones adversas y a que frecuentemente emergen cepas resistentes

Amoxicilina / Ácido Clavulánico: La asociación amoxicilina/ácido clavulánico está

indicado para el tratamiento a corto plazo de las infecciones bacterianas y cuando se

sospecha que estén causadas por cepas resistentes a amoxicilina productoras de beta-

lactamasas. En otras situaciones, debería considerarse la amoxicilina sola. Este

tratamiento se recomienda parea las siguientes infecciones

• Infecciones del tracto respiratorio superior, en particular sinusitis, otitis media,

amigdalitis recurrente: Estas infecciones son a menudo producidas por

Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis y

Streptococcus pyogenes.

• Infecciones del tracto respiratorio inferior, en particular exacerbaciones agudas

de bronquitis crónicas (especialmente si se consideran graves), bronconeumonía.

Estas infecciones son a menudo producidas por Streptococcus pneumoniae,

Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis.

• Infecciones del tracto genitourinarío e infecciones abdominales, en particular

cistitis (especialmente cuando sea recurrente o complicada excluyendo

prostatitis), aborto séptico, sepsis pélvica o puerperal y sepsis intraabdominal,

las cuales son a menudo producidas por Enterobacterias (principalmente

Escherichia coli, Staphylococcus saprophyticus spp. y Enterococcus spp.)

• Infecciones de la piel y tejidos blandos, en particular celulitis, mordeduras de

animales y abscesos dentales con celulitis diseminada que son a menudo

producidas por Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y Bacteroides

spp. Algunas cepas bacterianas producen beta-lactamasas, lo cual hace que no

sean sensibles a amoxicilina sola.

50


7. Realice el Test de difusión por disco (Sensidisco) a) Ud. cuenta con una placa de agar Müller-Hinton donde se encuentra la bacteria

en estudio. b) Con el asa, tomar una colonia desde la placa y sembrarla en el tubo de agua

estéril hasta que quede turbio (McFarland 0,5). c) Tomar una tórula estéril y (SIN FLAMEARLA!!!!) sumérjala en el caldo recién

inoculado. Flamear la boca del tubo y cerrar. d) Tomar la tórula mojada y deslizarla sobre toda la superficie del agar Müller-

Hinton. Una vez terminado, eliminar la tórula. e) Tomar una pinza estéril y flamear brevemente. Tomar con cuidado cada uno de

los sensidiscos y distribuirlos homogéneamente en la placa, cuidando de que no queden demasiado cerca del borde de la placa ni demasiado cerca entre si.

Nota: Asegúrese de flamear las pinzas cada vez que tome un sensidisco y enfríe en

la tapa de la placa antes de sacar uno.

Trate de no tocar el agar al poner los discos, sólo déjelos caer desde cerca y

presiónelos suavemente contra el agar con la pinza (sin hundirlos!!!)

51

Interpretación del Test de Sensidiscos (2º sesión). • Observe los halos de inhibición y mida el diámetro de estos para determinar si la

bacteria es “susceptible”, “intermedio” o “resistente” con respecto a los antibióticos dispuestos en el agar. Compare con la Tabla adjunta.

• Tipos de zonas que pueden desarrollarse alrededor de los discos: a. Resistentes: No hay zona de inhibición o si existe es muy estrecha. b. Intermedio: Hay una estrecha zona libre de crecimiento bacteriano alrededor

del disco. c. Sensible: Hay una amplia zona libre de crecimiento bacteriano alrededor del

disco.

52

TRABAJO PRÁCTICO �º3: FISIOTAXO�OMÍA DE BACTERIAS GRAM �EGATIVO

OBJETIVOS 1. Realizar pruebas bioquímicas convencionales para la identificación de bacterias

Gram negativo.

2. Realizar Test de Detección Comerciales para la identificación de bacterias Gram

negativo (API 10E – API 20E – API 32A - API 10S).

3. Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de

productos intermediarios, debido a la acción bacteriana.

4. Realizar prueba de susceptibilidad antimicrobiana por difusión en agar.

En el laboratorio de Microbiología el análisis de una muestra sigue por lo

general, la siguiente secuencia:

a) Siembra y obtención del microorganismo aislado (cultivo puro)

b) Observación de morfología macroscópica

c) Tinciones y observación de morfología y agrupación microscópica.

d) Identificación fisiotaxonómica (reacciones metabólicas específicas)

e) Estudios de sensibilidad a agentes antimicrobianos.

Los trabajos prácticos anteriores se han centrando en los primeros tres puntos (a, b

y c), por lo que el presente se tratará la fisiotaxonomía bacteriana y sensibilidad a

antibióticos de bacterias Gram negativo.

Como se vio en el trabajo práctico sobre bacterias Gram positivo, la

fisiotaxonomía bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas frente a

distintos medios de cultivo a través de las alteraciones que producen en estos medios.

Estas alteraciones, son producidas por enzimas específicas de las diferentes bacterias, ya

que no todos los microorganismos poseen los mismos requerimientos nutricionales o

poseen las mismas rutas metabólicas. De este modo esta técnica taxonómica se basa

principalmente en la detección de:

a) Utilización de distintas fuentes de carbono.

b) Presencia de enzimas.

c) Sensibilidad a productos químicos o antibióticos.

53

La identificación de un bacteriana aislada puede realizarse utilizando diferentes

ensayos bioquímicos que generalmente determinan la actividad de una vía metabólica

(conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio

de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.

Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado

para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como la

presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o

determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en

presencia de inhibidores, etc. Estas pruebas no significan de ninguna manera un estudio

profundo del metabolismo bacteriano.

A la determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas

(manuales de identificación, comerciales, etc.). Los sistemas comerciales utilizan

modificaciones de las pruebas bioquímicas convencionales, ya sea sustratos

deshidratados, tiras de papel filtro impregnadas con reactivos o pequeños

compartimentos con medios listos para sembrar. En todos los casos se emplean códigos

numéricos para la interpretación de resultados.

La batería con la cual trabajaremos en el laboratorio consta de 6 tubos con medio

estéril:

1. Agar tendido corriente: Es un medio sólido nutritivo, que permite observar posible

pigmentación en las colonias.

2. Agar Urea: Es un medio sólido en él que se puede observar la producción de la

enzima Ureasa ya que contiene además de nutrientes básicos:

�� Triptona.

�� Urea.

�� Indicador de pH fenolftaleina.

Esta prueba se basa en la capacidad de algunas bacterias que poseen la enzima

ureasa y pueden degradar urea a amoníaco y CO2. Esta reacción es fácilmente

evidenciable por que el pH varía hacia alcalino debido al efecto del amoníaco. El

cambio de pH se observa por viraje de un indicador de pH como la fenolftaleína.

54

3. Agar Citrato: Este medio de cultivo contiene además de sales minerales:

�� Fosfato de amonio.

�� Citrato de sodio, como única fuente de carbono.

�� Indicador de pH azul de bromo timol (verde a pH neutro, azul a pH alcalino).

Este medio contiene como única fuente de carbono el citrato y solamente pueden

desarrollarse aquellas bacterias que posean la enzima Citrato Permeasa la que les

permite transportar el citrato a través de la membrana citoplasmática. Una vez en el

interior de la célula el ión citrato es metabolizado a través del ciclo de los ácidos

tricarboxílicos.

55

4. Agar TSI: Las bacterias pueden utilizar azúcares (hidratos de carbono) a través de

varias rutas metabólicas. Los productos finales de estas reacciones dependerán de la

bacteria de que se trate, del azúcar utilizado y de la ruta metabólica. En general estos

productos serán ácidos (fórmico, pirúvico, láctico, etc.) y gases (CO2, H2). Existen

muchos medios de cultivo que se han diseñado con el objeto de detectar la

producción de ácidos y de gas a partir de distintos azúcares.

El Agar TSI (Triple Sugar Iron) es un medio rico que contiene los nutrientes

necesarios para el crecimiento de las bacterias y que permite visualizar la utilización

de azúcares. Contiene además de nutrientes como extracto de carne, extracto de

levadura, peptona, etc:

�� Glucosa al 0,1%

�� Lactosa al 1,0%

�� Sacarosa al 1,0%

�� Citrato de amonio.

�� Hierro.

�� Indicador de pH rojo de fenol (Amarillo pH ácido; Rojo pH alcalino).

La bacteria primero usará glucosa, como la concentración es baja, se agota

rápidamente. Si la bacteria fermenta solamente la glucosa, en el fondo del tubo se

producirán ácidos y el indicador de pH virará a amarillo. En cambio, en la superficie

inclinada por efecto del metabolismo oxidativo de los aminoácidos presentes en el

medio de cultivo, se producirán aminas, por lo que el indicador en la superficie

virará a rojo.

Si la bacteria fermenta además de la glucosa, la lactosa (que está en mayor

concentración) todo el tubo virará a amarillo por la producción de ácidos, pues no se

alcanza a consumir toda la lactosa presente.

Si se produce gas se observará como quiebres en el agar o separación de la

columna de agar del fondo del tubo.

Si la bacteria produce H2S, este reacciona con la sal de hierro dando sulfato

ferroso, un compuesto insoluble de color negro.

Este medio permite diferenciar a los microorganismos que fermentan glucosa y/o

lactosa de los que no. Siempre hay que asegurarse que exista desarrollo bacteriano.

56

C: Control negativo

1: Desaminación de aminoácidos positiva, fermentación de glucosa negativa,

fermentación de lactosa y sacarosa negativa, producción de H2S negativo.

2: Desaminación de aminoácidos positiva, fermentación de glucosa positiva,

fermentación de lactosa y sacarosa negativa, producción de H2S negativo.


fermentación de lactosa y sacarosa negativa, producción de H2S positivo.


fermentación de lactosa y sacarosa positiva, producción de H2S negativa.


fermentación de lactosa y sacarosa positiva, producción de H2S positiva.

5. Agar LIA : Las distintas bacterias poseen enzimas inducibles que pueden actuar

sobre algunos aminoácidos, desaminándolos o decarboxilándolos. Ejemplo de estas

reacciones enzimáticas son: la decarboxilación de la lisina (Figura 1) y la

desaminación de la lisina.

Figura Nº 1: Esquema de descarboxilación de la Lisina

57

Otro efecto de las bacterias sobre aminoácidos azufrados es la remoción del

grupo -SH2, produciendo H2S (reacción que se observa también en el medio TSI).

Este medio contiene además de nutrientes como peptona y extracto de levadura:

� Aminoácido lisina

� Aminoácidos azufrados

� Glucosa

� Citrato de hierro y amonio

� Indicador de pH púrpura de bromocresol (Amarillo a pH ácido, Morado a pH

alcalino).

La bacteria primero utiliza la glucosa produciendo ácido por lo que el pH baja y

el indicador vira a amarillo. Si la bacteria NO PRODUCE lisina decarboxilasa se

mantendrá esta coloración amarilla (Reacción K/A, negativa). Si la bacteria

PRODUCE la enzima lisina decarboxilasa, la cual remueve el grupo COOH de la

lisina dando como producto CO2 y una diamina (alcalina), entonces el indicador vira

nuevamente hacia el lado alcalino y se revierte el viraje de amarillo a morado

(Reacción K/K, positiva)

Si la bacteria produce H2S éste reacciona con la sal de hierro formando sulfuro

ferroso (negro). Si la bacteria es capaz de desaminar a la lisina, la superficie se verá

roja y el fondo amarillo (Reacción R/A)

58

6. Medio MIO: Permite observar motilidad, donde la reacción será positiva cuando el

crecimiento bacteriano se observe como el enturbamiento completo del medio. Si

sólo se limita al pinchazo, es negativa. También es posible observar la presencia de

la enzima ornitina descarboxilasa, que participa en el metabolismo de varios

aminoácidos en algunas bacterias. La reacción positiva se observa por el color

morado del tubo en cambio la reacción negativa el medio se torna amarillo (puede

ponerse morado el fondo). Además, se puede observar la presencia de indol, para lo

cual hay que agregar una gota de reactivo de Kovacs. En este caso, la reacción

positiva será la aparición de un aro rojo sobre la superficie del medio.

En la figura, los pares están organizados sin y con reactivos de Kovacs,

respectivamente.

1: Motilidad negativa, ornitina descarboxilasa negativa, indol positivo (con reactivo de

Kovacs se observa anillo fucsia)

2: Motilidad positiva, ornitina descarboxilasa positiva, indol negativo (con reactivo de

Kovacs se observa anillo amarillo)

3: Motilidad positiva, ornitina descarboxilasa positiva, indol positivo.

Otra prueba que complementa la determinación de una especie bacteriana

desconocida es la susceptibilidad a antibióticos. Los antibióticos son agentes

terapéuticos producidos por organismos vivos, que inhiben o destruyen a los agentes

infecciosos. Los ensayos de susceptibilidad están indicados para apoyar la

quimioterapia antimicrobiana de tratamiento en procesos infecciosos por bacterias en las

que la identidad del microorganismo no es suficiente para predecir en forma confiable

59

su susceptibilidad. Estos ensayos son a menudo indicados cuando se piensa que el

organismo causante pertenece a una especie capaz de mostrar resistencia a los agentes

antimicrobianos más comúnmente usados.

Los métodos de susceptibilidad antimicrobiana o antibiogramas son métodos

que determinan in vitro la sensibilidad de los microorganismos a una variedad de

agentes antimicrobianos bajo condiciones específicas y estandarizadas.

�OTA PARA LA PRUEBA DE LABORATORIO: �O es necesario que Ud. se aprenda de memoria cada una de las reacciones bioquímicas que se describieron. Sólo debe ser capaz de manejar los conceptos generales, como por ejemplo: "el medio MIO sirve para ver si la bacteria es móvil o no".

ACTIVIDADES PRÁCTICAS 1. Observe las placas sembradas y describa las colonias bacterianas. Describa si se

trata de cultivos puros.

2. Realizar una tinción de Gram a su muestra problema. Observe al microscopio.

3. Siembra de Batería Bioquímica Convencional.

Cada grupo contara con una batería convencional compuesta por 6 pruebas bioquímicas dispuestas en 6 tubos. Para sembrar la batería se deben seguir las siguientes indicaciones:

a. Flamear el asa para su esterilización. b. Tomar una colonia aislada de la placa de agar Mac Conkey con la muestra a

estudiar. c. Flamear la boca del tubo con caldo estéril o suero fisiológico, sumergir el asa

con cuidado y agitar. d. Flamear el asa para su esterilización. El caldo recién sembrado será utilizado

como inóculo para sembrar toda la batería. e. Esterilizar el asa, enfriar en las paredes internas del tubo recién sembrado y

sumergirla en el caldo. f. Usar este inóculo para sembrar todos los tubos de la batería. g. Antes de empezar, anotar los colores de los distintos medios. Esto le servirá

para hacer una comparación con el resultado final. h. Para cada tubo de la batería el asa debe ser esterilizada previamente y enfriada

en las paredes del tubo antes de sumergirla en el caldo inoculado.

60

Posteriormente siembre en los medio teniendo en cuenta que: 1. Los medios semitendidos (Agar TSI, Urea y LIA) se deben sembrar en

profundidad y en superficie, es decir, atravesándolos hasta el fondo con el asa en punta, y luego en zig-zag por la superficie.

2. Los medios tendidos (Agar Citrato y Corriente) se siembran sólo en la superficie, es decir, se realiza un zig-zag con un asa convencional (en argolla).

3. Los caldos se siembran agitando el asa con el inóculo dentro del tubo con el medio.

4. Los medios semisólidos (agar MIO) se siembran sólo en profundidad con un asa en punta, pinchando el agar hasta la mitad del tubo aproximadamente.

Lectura e interpretación de la Batería. Una vez que la batería es sembrada, se incuba a 37ºC para que los

microorganismos crezcan y produzcan los cambios en los distintos medios. Posteriormente los resultados se “leen” y se comparan con la Tabla de Resultados adjunta.

4. Siembra de Tira Reactiva Comercial para la identificación de bacterias Gram

negativo (API 10S).

Procedimiento:

a. Preparar una cámara de incubación y rellenar con agua corriente lo pocillos para mantener un ambiente húmedo. Que NO quedé un exceso. b. Anotar en el exceso de la tapa, en la parte lateral, el nombre de la bacteria y el de un integrante del grupo. c. Coloque la galería de reacciones sobre la cámara de incubación. d. Tome con el asa una colonia desde el agar y siembre en el tubo de suero estéril hasta una medida de densidad igual 0.5 Mc Farland (Estándar) e. Con una pipeta Pasteur estéril, inocule cada una de las celdas de la galería hasta el menisco, tal y como se muestra en la figura adjunta (línea azul).

61

f. Llenar las pruebas CIT hasta la cúpula (ver figura)

g. En las pruebas LDC, ODC, URE y H2S coloque, después de inocular, una gota de

aceite mineral, para crea un ambiente microaerofílico.

h. Incubar a 37ºC

g. Lea la tira de acuerdo a la Tabla anexa y luego agregue los reactivos abajo

mencionados:

h. Para la producción de Indol: Coloque una gota del reactivo de James en la prueba

IND (esperar un par de minutos). Coloración rosa indica positivo.

Para la producción de Nitritos: Coloque una gota del reactivo de NIT1 y NIT2 en la

prueba GLU. Esperar unos minutos. Coloración roja indica positivo.

Para la detección de triptofano desaminasa: Coloque una gota de FeCl3 (TDA) en

la prueba TDA (Marrón es positivo)

i. Lea y compare sus resultados con la Tabla adjunta.

j. Rellene la cartilla de resultados según como detalle la profesora.

k. Compare su código numérico con los catálogos que tiene la profesora. Anote el

resultado en la cartilla y guárdelo para pegarlo en su informe.

Test Reacciones Positivo Negativo ONPG Beta galactosidasa Amarillo Incoloro GLU Fermentación

/oxidación glucosa Amarillo, Amarillo/Gris

Azul, Azul/Verdoso

ARA Fermentación /oxidación glucosa

Amarillo Azul, Azul/Verdoso

LDC Enzima lisina descarboxilasa

Naranja Amarillo

ODC Enzima ornitina descarboxilasa

Rojo/Naranja Amarillo

CIT Utilización del citrato Azul/Verde, Azul Verde pálido/ Amarillo

H2S Producción de H2S Depósito/línea negra Incoloro/Gris URE Enzima ureasa Rojo/Naranja Amarillo

62

5. Test de difusión por disco (sensidiscos)

a. Tomar una tórula estéril y (sin flamearla!!) sumergirla en el caldo con el inoculo. Flamear la boca del tubo y cierre.

b. Deslizar la tórula mojada sobre toda la superficie del agar Müller – Hinton. Una vez que termine, eliminar la tórula.

c. Dejar secar la placa con la tapa ligeramente entreabierta. d. Tomar la pinza y flamear brevemente. Tomar con cuidado cada uno de los

sensidiscos y distribuirlos homogéneamente en la placa, cuidando de que no queden demasiado cerca del borde de la placa ni demasiado cerca entre si.

e. Incubar a 37ºC durante 16 hrs. f. Observar y medir el diámetro del halo formado alrededor de los sensidiscos.

Determine sensibilidad o resistencia al antibiótico según NCCLS.

NOTA: Los diversos tamaños de los halos de inhibición producidos por antibióticos

diferentes para una misma especie bacteriana NO PUEDEN SER COMPARADOS

ENTRE SI. Por ejemplo: un halo de inhibición de 30 mm. para Penicilina no indica

mayor sensibilidad que un halo de 20 mm. para Tetraciclina.

63

LECTURA BATERÍA BIOQUÍMICA

Agar Urea Reacción positiva : El agar se torna fucsia. Reacción negativa : El agar no cambia de color.

Agar Citrato Reacción positiva : Viraje del indicador de pH a color azul (alcalino). Reacción negativa : El agar permanece de color verde (neutro). Agar TSI Utilización de glucosa : Superficie roja (pH alcalino). Se anota K

Fondo amarillo (pH ácido). Se anota A Utilización de lactosa : Fondo y superficie amarilla (pH ácido). Se anota A/A Producción de gas : Ruptura de la columna de agar Producción de H2S : Ennegrecimiento del agar. Reacción negativa : El tubo no varía de color. Se anota K/K. Agar LIA Decarboxilación de lisina positivo : todo el tubo morado (alcalino). Se anota K/K Decarboxilación de lisina negativo : superficie morada (alcalina). Se anota como K

fondo amarillo (ácido). Se anota como A Desaminación de lisina positivo : superficie roja. Se anota R

fondo amarillo. Se anota A Desaminación de lisina negativo : no hay cambio. Se anota A/A Producción de H2S : ennegrecimiento del agar Medio MIO Reacción positiva : El medio se observa de color morado. Reacción negativa : El medio se torna amarillo (puede ponerse morado el fondo). Presencia de indol Reacción positiva será la aparición de un aro rojo sobre la superficie del medio al agregar una gota de reactivo de Kovacs.

64

RESULTADOS MAS FRECUE�TES DE ALGU�AS PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA FAMILIA E�TEROBACTERIACEAE

Glucosa Lactosa Sacarosa Manitol Sorbitol Gelatina Citrato H2S Motilidad Indol V-P R-M Pigmento Urea

Escherichia coli AG + V + + - - - +/- + - + - -

Shigella flexneri A - V V - - - - - + - + - -

Shigella dispar - V - - - - - - - + - + - -

Salmonella Typha A - - + + - V + + - - + - -

Salmonella paratyphi A AG - - + + - - - + - - + - -

Salmonella paratyphi B AG - - + + - + + + - - + - -

Salmonella gallinarum A - - + + - + +/- - - - + - -

Citrobacter freundii AG + +/- + + - + +/- + - - + - -

Klebsiella pneumoniae AG + + + + - + - - - + - - -

Enterobacter aerogenes AG + + + + -/+ + - + - + - - -

Enterobacter hafniae AG V V + - - V - + - +/- -/+ - -

Serratia marcescens V - + + + + + - + - + -/+ + V

Serratia rubidae AV + + + - + + - +/- - + -/+ + V

Proteus vulgaris AV - + - - + V + + + - + - +

Proteus mirabilis AG - V - - + (+) + + - -/+ + - +

Pseudomonas aeruginosa* - - - - - + + - + - - - + -

Alcaligenes faecalis* - - - - - - V - + - - - - -

* No pertenecen a la familia Enterobacteriaceae AG = Acido – Gas (utilización del substrato y producción de gas) V = Variable (+) = Positivo después de 3 ó 4 días +/- = Generalmente positivo -/+ = Generalmente negativo

65

TABLA I

Nota : Todos producen gas de glucosa. Todos son Citrato positivo. Excepto E. coli

Todos son Ureasa negativo. Excepto Klebsiella, que puede dar positivo al 2do o 3er día

a : ciertas especies de S. Arizona Fermentan la Lactosa lentamente b : ciertas especies de E. coli son Lisina Descarboxilasa negativo.

Producción de H2S

Fermentación de Glucosa Positivo Fermentación de Lactosa Positivo Lisina Desaminasa Negativo

Positivo Negativo

Salmonella Arizonaa Citrobacter freundii

Positivo

Indol Negativo

Lisina Descarboxilasa

Positivo Negativo

Escherichia coli Enterobacter spp.

Klebsiella spp.

Negativo

Lisina Descarboxilasa Positivob

Indol

66

TABLA II

Negativo

Citrato

Negativo Positivo

Proteus rettgeri

Providencia spp.

Positiva

Indol

Positivo Negativo

Fermentación de Glucosa Positivo Fermentación de Lactosa Negativo Lisina Desaminasa Negativo

Producción de H2S

Indol Positivo

Proteus morganii

Lisina Descarboxilasa Negativo

Proteus vulgaris Proteus mirabilis

Lisina Descarboxilasa Negativo

Nota : P. vulgaris y P. mirabilis pueden o no utilizar Citrato Todos producen un poco de gas de Glucosa Todos son Ureasa positivo. Excepto Providencia

67

Edwarsiella

TABLA III

Negativa

Positivo Negativo

Positiva


Positivo Negativo

Indol

Positivo Negativo

Citrato Positivo

Citrato Negativo

Citrato

Negativo Positivo

Indol Serratia

Negativo Positivo

Salmonella Paratyphi A

Shigella spp. Shigella spp.

Yersinia enterocolitica

Citrato Negativo

Producción de H2S

Citrobactera

Salmonella Typhi Salmonella Arizona

Salmonella Paratyphi B

Indol Negativo Citrato Positivo

Fermentación de Glucosa Positivo Fermentación de Lactosa Negativo Lisina Desaminasa Negativo


Nota : Todos son Ureasa Negativo. Excepto algunas cepas de Yersinia enterocolitica. No producen gas de Glucosa Shigella, Serratia, Salmonella Typhi y Yersinia enterocolitica. El resto produce gas de

Glucosa. a: Ciertas especies de Citrobacter son Lactosa Negativo y pueden ser Indol Positivo o Negativo

68

TRABAJO PRÁCTICO �º4: BACTERIAS A�AEROBIAS Y FASTIDIOSAS. FLORA �ORMAL

OBJETIVOS

1. Conocer la importancia de una buena muestra para un cultivo anaerobio

2. Conocer y practicar el procesamiento microbiológico de bacterias anaerobias y con

requerimientos especiales de cultivo aisladas a partir de muestras de flora normal de la

boca.

3. Conocer algunos cuadros clínicos relevantes causados por microorganismos de este

tipo.

I�TRODUCCIÓ�

Las bacterias anaerobias estrictas son microorganismos incapaces de

multiplicarse en presencia de oxígeno (el metabolismo del oxigeno genera radicales

tóxicos) ya que no tienen los sistemas de citocromos para el metabolismo del oxígeno,

ni las enzimas superoxido dismutasa (SOD) y catalasa para eliminar estos radicales.

Para su desarrollo in Vitro éstas requieren medios de cultivo enriquecidos y un

ambiente anaeróbico.

En el hombre las bacterias anaeróbicas predominan normalmente en la cavidad

oral alrededor de los dientes, en el tracto gastrointestinal, en los orificios del tracto

genitourinario y en la piel. La mayoría de estos hábitats tienen una baja tensión de

oxígeno y bajo potencial de oxidorreducción.

Si enfocamos nuestra atención en la cavidad oral, es posible observar que

existen diversos ecosistemas donde se encuentran diferencias significativas dependiendo

si el área de estudio es la flora de dientes, la lengua, la mucosa yugal o el crévice

gingival. La flora oral es de tipo mixto, con asociación de microorganismos facultativos

y anaerobios que se adhieren a la superficie dental, en primera instancia gracias a la

película adquirida y luego entre si a través de diferentes polisacáridos de origen

bacteriano (biopelícula). Los dientes corresponden a la única superficie de nuestro

cuerpo que NO sufre recambio lo que facilita enormemente la formación de esta

biopelícula.

69

En esta cavidad predominan diferentes especies de Streptococcus α hemolíticos

(Grupo viridans). Streptococcus mutans y Streptococcus sanguis que se encuentran a

en la placa dental; Streptococcus mitis que se adhiere tanto a los dientes como a las

mucosas y S. salivarius que predomina en la mucosa lingual. Entre los

microorganismos anaerobios Gram positivo puede encontrase Actinomyces spp. a nivel

de la placa y en menor cantidad algunas especies de Lactobacillus. También es posible

encontrar espiroquetas del género Treponema distintas de T. pallidum. Los cocos Gram

positivo anaerobios pertenecen a los géneros Peptococcus, Peptostreptococcus,

Ruminococcus entre otros. Pueden además aislarse especies de Mycoplasma y

levaduras del género Candida. Por otro lado, la mayoría de los Gram negativos

presentes en la boca son anaerobios estrictos como Bacteroidales y especies del género

Fusobacterium.

La flora de la cavidad oral está involucrada en enfermedades como la caries y

periodontitis. Por una parte, en el desarrollo de la caries dental intervienen no sólo las

bacterias sino también factores externos como el pH ácido resultante de la

descomposición de hidratos de carbono de la dieta, etc. Por otra parte, la periodontitis

resulta de la agresión de la flora normal a los tejidos de soporte del diente (infección

endógena) en individuos susceptibles.

Los microorganismos de la boca también causan otras infecciones bucales como

abscesos periapicales y estomatitis y más importante aún, pueden causar una serie de

infecciones extraorales. Por ejemplo, pacientes con válvulas cardíacas patológicas

pueden desarrollar endocarditis bacteriana en la que están implicados Streptococcus α

hemolíticos. Las actinomicosis cérvico-facial, pulmonar, gástrica son un grupo de

infecciones que tienen como agente etiológico especies de Actinomyces, las que

provienen exclusivamente de la boca

Las infecciones de importancia médica por bacterias anaerobias son comunes.

Estas son frecuentemente polimicrobianas, es decir, las bacterias anaerobias en general

producen infecciones mezcladas con otros anaerobios, con anaerobios facultativos y

con aerobios, las infecciones se producen cuando los anaerobios y otras bacterias de la

flora normal contaminan sitios del cuerpo normalmente estériles

70

Las infecciones producidas por anaerobios pueden dividirse según su origen en:

a) Endógenas: abcesos, endocarditis, infecciones pleurales y pulmonares,

bacteremia, infecciones peridontales, peritonitis, sinusitis crónica, gingivitis

necrotizante, colitis pseudomembranosa.

b) Exógenos: intoxicaciones alimentarias, botulismo, tétanos, colitis

pseudomembranosa.

AISLAMIE�TO DE BACTERIAS A�AERÓBICAS

A fin de obtener resultados óptimos se debe actuar según los siguientes principios

generales:

- Correcta recolección y transporte de la muestra clínica

- Procesamiento de muestras con mínima exposición al oxígeno atmosférico

- Uso de medios frescos y prerreducidos

- Empleo correcto del sistema anaeróbico, con inclusión de un catalizador activo

para permitir la eliminación del oxígeno presente

Existen diferentes sistemas que son satisfactorios para el cultivo de bacterias

anaeróbicas. Uno de los más utilizados es el “Sistema GASPAK”, este consta de un

soporte para placas incluido en una cubeta transparente con tapa hermética (Figura 1).

Para crear la atmósfera anaeróbica se utiliza un sobre comercial con catalizador que

contiene una tableta de borohidrato sódico y otra de bicarbonato sódico y ácido cítrico.

Las placas y los tubos sembrados en el interior de la jarra, obtendrán un ambiente de

anaerobiosis, al reaccionar el catalizador con 10 mL de agua destilada estéril que se

adiciona al sistema, de esta manera se produce la reducción del oxígeno según la

siguiente reacción.

2H2+ O2

2H2O

71

Por otra parte la reacción del catalizador con el agua libera CO2. Este CO2 es

utilizado para confirmar el ambiente anaerobio, para ello se utiliza un papel indicador

(azul de metileno) que vira de color (de azul a blanco) en presencia de CO2.

Figura 1: Sistema GASPAK para crecimiento de bacterias anaeróbicas

BACTERIAS FASTIDIOSAS

Las bacterias fastidiosas, corresponden a aquellas que no crecen en medios de

cultivo convencionales (agar nutriente, agar sangre) y requieren medios suplementados

con vitaminas, aminoácidos, factores de crecimiento, etc. Además pueden requerir

condiciones especiales de cultivo como por ejemplo mayor tiempo de incubación,

condiciones anaeróbicas o de CO2 (bacterias capnofílicas).

Un medio utilizado para el crecimiento de bacterias anaeróbicas fastidiosa es el

agar sangre suplementado con hemina-menadiona, la menadiona es una tipo de

vitamina K y la hemina es un producto de la descomposición de la hemoglobina, la

gran cantidad de nutrientes de este medio permite el crecimiento de bacterias

metabólicamente exigentes.

72

Las bacterias capnofílicas son aquellas que requieren de una concentración de

CO2 para su proliferación. En la cavidad oral se pueden encontrar un sin número de

estas bacterias, particularmente las involucradas con el desarrollo de las caries. Un

medio propicio para el aislamiento de estas bacterias es el agar “Mitis salivarius”, este

es un medio selectivo para el aislamiento de Streptococcus oralis, Streptococcus

salivarius y Enterococcus (ver recuadro) y se utiliza para estudios microbiológicos de

la placa dental y caries producidas por bacterias presentes en la saliva.

Este medio esta compuesto por cristal violeta, telurito de potasio y azul de

tripan, que son agentes que inhiben la mayoría de los bacilos Gram Negativos y

bacterias Gram positivo a excepción de Streptococcus.

Streptococcus salivarius en agar Mitis-salivarius

Streptococcus oralis en agar Mitis salivarus

Enterococcus en agar Mitis-salivarius

73


I.- Flora anaerobia facultativa

1.- Tinción directa de muestras del diente:

Para esto el alumno con un mondadientes estéril tomará muestras de al menos

una superficie dental que le parezca más interesante. Las muestras tomadas se fijarán y

teñirán con tinción de Gram para observar los microorganismos adheridos a la

superficie celular.

Tinción Gram:

1) Preparar un frotis con la bacteria de la siguiente manera:

a.- Colocar una gota de agua en el centro del portaobjeto

b.- Obtener una pequeña muestra desde la mucosa oral a estudiar.

c.- Mezclar la muestra con la gota de agua.

d.- Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque.

2) Teñir el frotis de manera habitual, observar al microscopio, anotar y dibujar lo

que observe

2.- Siembra de saliva en agar sangre y en agar Mitis-Salivarius (Streptococcus mutans)

1) El alumno deberá obtener una muestra de saliva en un tubo de ensayo estéril

(aprox. 3 mL)

2) Se realizarán dos diluciones seriadas 1/10 de la muestra de saliva obtenida en el

punto anterior y se sembrará 0,1 mL de cada dilución en placas Mitis-salivarius.

Con la misma saliva realizar un aislamiento en placas de agar sangre.

3) Incubar las placas en un ambiente con 5% de CO2, que se logra en un tarro con

una vela

4) Realizar análisis macroscópico de colonias en agar sangre y contar colonias

azules y negras en agar Mitis-Salivarius. Las colonias azules corresponden a

Streptococcus mutans que juegan un rol en cariogénesis y son uno de los

principales agentes causales de bacteremias continuas y endocarditis. Las

colonias negras corresponden a Enterococcus, que pueden ser causantes de

infecciones urinarias, bacteremias, abscesos y endocarditis.

5) Realizar análisis microscópico mediante tinción de Gram.

74

II.- Análisis de la microflora anaerobia de la lengua. Siembra en placa de muestras

tomadas de la lengua e incubadas en presencia y ausencia de oxígeno.

1) Con un limpiador lingual (asa de plástico) el alumno tomará muestras

del dorso de la lengua. Desde la secreción remanente en el limpiador realizará 2

aislamientos en placa con asa en loop e incubará una de las placas (agar sangre

suplementado con hemina y menadiona) en anaerobiosis y otra (agar sangre) en

aerobiosis. Además, observará directamente las bacterias, para lo cual se fijarán y

teñirán con tinción de Gram para analizar la microflora adherida a la superficie de la

lengua.

Para el cultivo en anaerobiosis la placa debe ser debidamente rotulada e

incubada en una jarra de anaerobiosis (GASPAK).

2) Realizar análisis macroscópico de colonias observando principalmente la

variedad de colonias distintas. Aquellas colonias pigmentadas de negro en la

placa de agar sangre H-M se relacionan con el nivel de halitosis. Algunas de

estos géneros bacterianos también son causantes de endocarditis.

3) Realizar análisis microscópico mediante tinción de Gram.

75

TRABAJO PRÁCTICO �º5: HO�GOS U�ICELULARES Y FILAME�TOSOS

I�TRODUCCIÓ�

Los hongos son organismos eucariontes que tienen la capacidad de infectar al ser

humano. La mayoría tolera esta exposición sin secuelas, pero algunos desarrollan una

hipersensibilidad alérgica. Esto porque un individuo sano tiene una resistencia innata a

la colonización de hongos y porque la virulencia inherente en estos microorganismo es

muy baja. Sin embargo, en individuos inmunosuprimidos, la infección puede

desencadenar enfermedades que, si no son debidamente controladas, pueden conllevar a

un resultado fatal para el hospedero. A los hongos que se aprovechan de la debilidad

del hospedero se les denominan hongos oportunistas. Hongos como Candida

(Candida albicans), Aspergillus (Aspergillus fumigatus) y varios Zigomicetos (Rhizopus

arrhizus) son ejemplos de ellos.

TALO

(Cuerpo macroscópico)

Unicelular Pluricelular

Levaduras Micelio

Colonias semejantes a las bacterianas

Sifonado Septado

Colonias algodonosas, lanosas, aterciopeladas

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Hongos unicelulares (Levaduras)

Las levaduras son organismos fúngicos unicelulares que generalmente se reproducen

asexualmente por gemación. Los criterios usados para el diagnóstico son

fundamentalmente morfológicos (macroscópicos y microscópicos).

Las levaduras normalmente prosperan en hábitat con abundante azúcar, tales

como frutas, flores e incluso la corteza de los árboles. Algunas de ellas viven en

simbiosis con animales, especialmente insectos. Las levaduras más importantes desde

el punto de vista comercial son las cepas cerveceras y panaderas de la especie

Sacharomiyces cerevisiae.

Candida spp.: En ciertas condiciones C. albicans, C. tropicalis, C. kefyr, y otras,

son parte de la flora normal de los humanos. Pueden aislarse de las superficies mucosas

sanas de la cavidad oral, vagina, tracto gastrointestinal y área rectal. Sin embargo,

cuando se rompe la barrera mucosa, los microorganismos pueden llegar a la sangre e

invadir pulmones, bazo, riñones, hígado, corazón y cerebro. Este género se caracteriza

por un aspecto macroscópico de su colonia opaco, de color cremoso y consistencia

pastosa (Figura 1)

Figura 1: Observación microscópica de una muestra de esputo en que se ponen en

manifiesto las levaduras en gemación y las pseudohifas de las especies de Candida.

77

Hongos Filamentosos:

Estos pueden ser sifonados (aseptados) o septados. Los hongos sifonados son

generalmente multinucleares (ej. Mucoral) y los hongos septados presentan hifas con

tabiques que son prolongaciones de la membrana citoplasmática (ej. Aspergillus,

Dermatophytos).

1) Hongos septados

Estos hongos pueden presentarse como contaminantes ambientales (ej. Penicillium),

como patógenos oportunistas (ej. Aspergillus) y como patógenos (ej.

Dermatophytos).

Aspergillus spp.: Los microorganismos que pertenecen a éste género son

extremadamente frecuentes en el medio ambiente y de crecimiento rápido (48 h). En

contraste con la mayoría de las infecciones producidas por Candida, la aspergilosis se

adquiere de fuentes exógenas. Estos microorganismo se identifican por sus

características morfológicas presentando colonias aterciopeladas, algodonosas o

pulvurentas, coloreadas (crema, verde, café y negras). Microscópicamente

presentan hifas septadas de la que nace una prolongación no septada (conidóforo),

el cual se dilata en su extremo distal (vesículas) rodeándose allí de células

conidiogénicas (fiálides). Las fiálides producen conidios los que se disponen en

forma de cadenas. El conjunto vesícula, fiálide y conidios se conoce como “cabeza

aspergilar”. Ver Figura 2.

De las aproximadamente 900 especies de Aspergillus descritas, A. Fumigatus y

A. Flavus son las que con mayor frecuencia se asocian a enfermedad invasiva. Son

ubiquitarios en el ambiente y no forman parte de la flora normal del ser humano, aunque

pueden producirse colonizaciones transitorias. La aspergilosis está asociada con

problemas respiratorios como la dilatación crónica de la vía aérea hasta un colapso de

un segmento pulmonar.

78

Figura 2: Estructura microscópica de especies de Aspergillus.

Penicillium: Estos microorganismo son ubicuitarios en el medio ambiente y

suelen aislarse en muestras de aire y como contaminantes en los cultivos de laboratorio,

desarrollándose en 3-4 días. En 1929, Sir Alexander Fleming observó que una especie

de Penicillium había contaminado su cultivo de Staphylococcus aureus, destruyendo las

bacterias que se encontraban inmediatamente en contacto con el hongo. Esta

observación casual llevó al descubrimiento de la penicilina.

Los hongos que petenecen a este género se caracterizan por la producción

de conodióforos en el extremo de hifas septadas ramificantes. Cuando se alojan en

superficies, como una placa de agar, germinan y crecen rápidamente produciendo

colonias con aspecto polvoriento, de color verde azulado.

P. marnefeii es la única especie patógena de Penicillium y es causa de

infecciones espontáneas del sistema retículoendotelial, afectando vasos linfáticos,

pulmón, hígado, bazo y hueso. Ver figura 3.

79

Figura 3: Aspecto microscópico de Penicillium.

2) Hongos sifonados.

Zigomicetos: Especies de Rhyzopus, Mucor y Absidia han sido implicados en

cuadros de zigomicosis. Macroscópicamente presentan un micelio algodonoso.

Microscópicamente, forman hifas aceptadas y se reproducen asexualmente

produciendo esporangios en los que se desarrollan esporas (Ver figura 4). Las

enfermedades asociadas a estos microorganismos son usualmente la mucormicosis

rinocerebral. Esta infección se origina en los senos paranasales y puede afectar órbita y

el paladar, extendiéndose hacia el cerebro. En pacientes inmunodeprimidos puede

afectar el pulmón, el tracto gastrointestinal y los tejidos subcutáneos.

80

Figura 4: Aspecto microscópico de hongos sifonados.

Tanto las levaduras como los hongos filamentosos se siembran en agar Sabouraud, cuyo

contenido en glucosa es mayor que el de otros medios de cultivo y el pH es ácido (pH

5,6) para impedir la contaminación bacteriana. Generalmente se incuban a 25-30°C por

un tiempo que depende de la especie fúngica (levaduras y hongos ambientales, 48 h

aprox, hongos dermatofitos, 15-30 días).

�ota:

-Recuerde el principal criterio para la identificación de estos microorganimos es el

morfológico, por lo tanto, es importante que trabaje con cuidado.

-Recuerde que está trabajando con patógenos oportunistas: Trabaje siempre cerca del

mechero y no se acerque demasiado a los medios que contienen los hongos. Así mismo,

ante cualquier posibilidad de contaminación, lávese de inmediato.

81


1.- Observación y descripción de cultivos de levadura.

1.1.- Procedimientos.

a) Examen macroscópico: Describa, tal como lo hacía para colonias bacterianas,

forma, color, aspecto de la superficie, borde, elevación y brillo de las colonias.

Anote lo que observe.

b) Examen microscópico: Realice una tinción Gram tradicional. Es decir, realice

un frotis con la colonia de levaduras en una gota de agua y continúe con el

protocolo por usted conocido. Observe con inmersión y dibuje lo que observa.

�ota: La tinción Gram es sólo una técnica de tinción. Las levaduras no son

Gram + ni Gram -. Recuerde que la característica de ser Gram+ o Gram- está

relacionada con propiedades que pertenecen a las membranas bacterianas.

c) Tinción de cápsula en levadura Cryptococcus:

1. Coloque en un portaobjeto limpio una gota de agua y una gota de tinta china.

2. Emulsione una colonia de Cryptococcus y extienda la preparación con otro

portaobjeto.

3. Seque suavemente en la llama del mechero

4. Cubra con fucsina y deje reposar 2-3 minutos.

5. Lave con agua, seque y observe al microscopio con aceite de inmersión en

100X.

82

2.- Observación, y descripción de hongos filamentosos.

2.1.- Procedimientos.

a) Examen macroscópico: Color y aspecto (aterciopelada, algodonosa,

polvorienta, lanosa) en anverso y reverso. Anote lo que observe.

b) Examen microscópico: Para esto se realizará un examen al fresco.

Examen al Fresco:

1.- Coloque una gota de azul de lactofenol sobre un portaobjeto.

2.- Flamee un asa, enfríe cerca del mechero y obtenga un pequeño trozo del hongo

(sin sacar agar). DEBE USAR MASCARILLA.

3.- Mezcle el fragmento del hongo con el azul de lactofenol y cubra con un

cubreobjeto.

4.- Observe con aumento de 40X (sin inmersión, ni aplastando la muestra).

5.- Reconozca las estructuras microscópicas reproductivas de cada especie y dibuje.

• Recuerde: el principal criterio para la identificación de estos microorganismos

es el morfológico, por lo tanto, es importante que trabaje con cuidado.

• Recuerde que está trabajando con patógenos oportunistas: Trabaje siempre

cerca del mechero y no se acerque demasiado a los medios que contienen los

hongos. Asimismo, ante cualquier posibilidad de contaminación, lávese de

inmediato.

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“El camino al éxito, comienza con el recorrido de nuestros esfuerzos”

Guia Trabajo Practico 1 BIO253 2010-2

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