Genética Molecular 2010 Profesores: Dr. Víctor Romanowski Dr. Daniel Grasso Instructoras: Dra....

Genética Molecular 2010

Profesores: Dr. Víctor Romanowski

Dr. Daniel Grasso

Instructoras: Dra. Silvina Richard

Dra. Patricia Agostino

e-mail: [email protected]

clave: cromatina

“Dogma central de la biología molecular”

DNA

RNA

transcripción inversa

transcripción y replicación de RNA

replicación de DNA virus a DNA

retrovirus y retroelementos

virus a RNA

transcripción

traducción

proteínaplegamiento (folding), procesamiento, direccionamiento (targeting)

procesamiento de RNAsplicing, edición, modificación de nucleótidos y de extremos 5´y 3´

Víctor Romanowski

reparación recombinación

ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO

Rugosas (R): inofensivas

Lisas (S): virulentas

1928: Frederick GriffithInfección con dos cepas

de Streptococcus pneumoniae

(S)

(R)

(S) inactivada

(R) + (S) inactivada

Griffith showed that adding heat-killed virulent bacteria (harmless to mice) to a live nonvirulent strain permanently transformed the latter into lethal, virulent, encapsulated bacteria.

Las primeras evidencias

El principio de transformación observado por Griffith era el DNA de la bacteria de la cepa S (virulenta).

Si bien la bacteria había muerto, su DNA sobrevivió al proceso de alta temperatura y fue tomado por la bacteria R (inofensiva).

EL DNA de la cepa S contiene los genes que forman la cápsula de protección de polisacárido. Equipado con este gen, la cepa de bacteria R estaba ahora provista de protección frente al sistema inmune del animal y por lo tanto podía matar al animal.

La naturaleza exacta del principio de transformación de DNA fue verificada en los experimentos realizados por Avery, McLeod y McCarty, y por Hershey y Chase.

¿Como se demostró que el DNA es el responsable de la herencia?

El experimento de Avery O., McLeod C. y McCarty M. (1944) fue la primer evidencia

directa de que el DNA es la base de la información genética

Extract from heated smooth (S) bacteria

treatment with protease (digests proteins)

mix with rough (R) bacteria and injected into mice

mice died

Extract from heated smooth (S) bacteria

treatment with DNase (digests DNA)

mix with rough (R) bacteria and injected into mice

mice lived

DNA carries genetic information



Determinaron que el DNA es el material

genético en el bacteriófago T2

Alfred Hershey y Martha Chase (1952)

32P experiment 35S experiment

Cuando se realiza la hidrólisis completa de los ácidos

nucleicos, se obtienen tres tipos de componentes

principales:

•Azúcar: una pentosa.

•Ácido fosfórico

•Bases nitrogenadas:

purinas y pirimidinas

La naturaleza química de los ácidos nucleicos


A, G, T, C están presentes en el ADNA, G, U, C están presentes en el ARN

Bases nitrogenadas: púricas y pirimidínicas.

Cómposición química de los Ácidos nucleicos

Cómposición química de los Ácidos nucleicos

Terminología: bases/ nucleósidos/ nucleótidos

Los nucleótidos se unen entre sí para formar largas cadenas de polinucleótidos,

esta unión entre monómeros nucleótidos se realiza mediante enlaces fosfodiéster

entre los carbonos de las posiciones 3’ de un nucleótido con la 5’ del siguiente

ADN = DNA

ARN = RNA

Conformación de un nucleótido: ángulos de torsión

Grados de libertad

Restricciones estéricas

Conformaciones adoptadas por los nucleósidos de purina y pirimidina

La proporción de Adenina (A) es igual a la de Timina (T). %A = %T

La proporción de Guanina (G) es igual a la de Citosina (C). %G = %C

La composición de bases es la misma en distintos tejidos de una misma especie.

La proporción de bases púricas (A+G) es igual a la de las bases pirimidínicas (T+C).

(A+G) = (T + C) La proporción entre (A+T) y (G+C) es característica de cada organismo, pudiendo tomar por tanto, diferentes valores según la especie estudiada.

La composición de bases varía de una especie a otra.

REGLAS DE CHARGAFF (1940)


La estructura del DNA


% de bases en distintos organismos


La estructura del DNA

Patrón helicoidal del DNA. (1953)

Dos periodicidades a lo largo del eje, una primaria de 3,4 Å y una secundaria de 34 Å.

Patrón de difracción de rayos X

"The instant I saw the picture my mouth fell open and my pulse began to race." -- James D. Watson (1968), The Double Helix, page 167. New York: Atheneum, Library of Congress card number 68-16217.

Avances científicosMolecular Structure of Nucleic Acids:A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid

James Watson & Francis CrickNature, vol 171 (4356), 737-738

25 de abril de 1953


Estructura del DNA: la doble hélice

• El esqueleto hidrofìlico de grupos fosfato y deoxiribosa alternantes está expuesto al agua del ambiente

• Las bases están apiladas en el interior de la doble hélice, con sus planos perpendiculares al eje de la doble hélice

• El apareamiento de las dos cadenas genera un surco mayor y un surco menor en la superficie de la doble hélice

G C A T

• El anillo de furanosa está en la conformación C-2´endo

• En el equilibrio ceto-enol, las formas tautoméricas predominates de las bases son las ceto •(ceto : enol = 10.000 : 1)

Reglas de Chargraff: DNA doble cadena (dsDNA)


La estructura del dsDNA


interacciones que estabilizan la doble hélice

• Enlaces de hidrógeno (pequeña contribución)

• Apilamiento de bases e interacción hidrofóbica

• Interacciones iónicas:

- Repulsión entre las cargas negativas de los

fosfatos

- Los cationes actúan como contraiones estabilizando el dsDNA

(cationes divalentes más eficientes que monovalentes;

el Mg+2 estabiliza la estructura del RNA)

ver estructuras secundarias en rRNA, por ejemplo...

DNA A: 75% agua(esporos), Na+

DNA B: 92% aguaWatson & Crick

DNA Z: poli-pur-pyr, -GCGC… alta [Na+]

La forma B es la más estable en condiciones fisiológicas

Comparación de las formas A, B y Z del DNA



Estructuras inusuales

Palíndromos (palindromes)

Repeticiones en espejo (mirror repeats)

Horquilla (hairpin-loop)

Cruciforme


Estructuras inusuales: triplex DNAs

Apareamiento tipo Hoogsteen

Estables a pH bajos (citosina protonada, C+)

H-DNA: "In vitro" es posible obtener tramos de triple hélice intercalando oligonucleótidos cortos constituidos solamente por pirimidinas (timinas y citosinas) en el surco mayor de una doble hélice. No se sabe la función biológica del ADN-H aunque se ha detectado en cromosomas eucarióticos.

H-DNA

Apareamiento tipo Hoogsteen: Bajo ciertas condiciones, los nucleótidos pueden formar puentes de hidrógeno adicionales dando lugar a tramos de DNA de triple hélice.


Estructuras inusuales: cuadruplex DNADNA cuadruplexo: "In vitro" se han obtenido cuartetos de guanina (DNA cuadruplexo) unidas mediante enlaces tipo Hoogsteen, empleando polinucleótidos que solamente contienen Guanina (G). Los extremos de los cromosomas eucariotas (telómeros) tienen una estructura especial con un extremo 3' OH de cadena sencilla (monocatenario) en el que se repite muchas veces en tandem una secuencia rica en guaninas. Se piensa que el DNA cuadruplexo telomérico serviría para proteger los extremos cromosómicos de la degradación enzimática.

Ejemplo de secuencia telomérica rica en guaninas (G): 5´P TTGGGTTGGGGTTGGGG...............TTGGGG 3'OH

Las moléculas de ssRNA pueden exhibir conformaciones variadas

Estructuras secundarias en RNA

tRNA

Propiedades fisicoquímicas

de los ácidos nucleicos

• H+ y HO-

• Espectro UV

• Temperatura de desnaturalización• (estabilidad de la doble hélice a medida que se incrementa la temperatura)

• Densidad de flotación • (ultracentrifugación en gradientes de densidad)

Hidrólisis en medio ácido

Ácidos fuertes : escinden tanto los enlaces

fosfodiéster como los enlaces N-glicosídicos.

Ácidos débiles : escinden los enlaces N-glicosídicos.

Los enlaces de las purinas son más lábiles que de

las pirimidinas

dsDNA en medio alcalino fuerte

desprotonación de los >N-H de los heterociclos

¿...?

Hidrólisis en medio alcalino

RNA

Desnaturalización del ADN

Desnaturalización térmicaTEMPERATURA DE FUSIÓN = Tm (melting temperature)

Propiedades ópticas de los nucleótidos

ssDNA (desnaturalizado a 90 oC))

dsDNA (nativo a 28 oC)

Efecto hipercrómico

The purine and pyrimidine bases in DNA absorb UV light maximally at a wavelength of approximately 260 nm. In double-stranded DNA, however, the absorption is decreased due to base-stacking interactions. When DNA is denatured, these interactions are disrupted and an increase in absorbance is seen. This change is called the hyperchromic effect. The extent of the effect can be monitored as a function of temperature

Desnaturalización térmicaTEMPERATURA DE FUSIÓN = Tm (melting temperature)

medida de

A260nm


Desnaturalización del DNA

Condiciones que favorecen la desnaturalización•Alta temperatura

•Baja fuerza iónica (repulsión de fosfatos)

•Alto pH (desprotonación de bases)

Monitoreo de la desnaturalización

•Los enlaces conjugados de las bases generan absorción en el UV a 260nm

Nucleótidos libres> ssADN> dsADN

•La Tm depende de la concentración salina, pH, composición, longitud

•La temperatura a la cual la A260 alcanza la mitad de su valor máximo es denominada Tm (temperatura de melting)

DESNATURALIZACION POR CALOR

Cálculo de Tm

•Oligonucleótidos cortos: Tm (oC) = (A+T)x2 + (C+G)x4

•Oligonucleótidos largos:Tm = 81.5 +16.6Log [Na+] + 0.41 (%CG) – (625/N) (N=longitud del oligo)

Parámetro Efecto sobre Tm Efecto sobre la velocidad de renaturalización

Composición de bases

Incremento de Tm con el aumento del %G-C

No ejerce efecto

Longitud<150 bp; incremento de Tm con el incremento de longitud; >500 bp no hay efecto

Se incrementa la velocidad con la longitud

Fuerza iónica Incremento de Tm con el aumento de [Na+]

Optimo a 1.5 M Na+

%bp mismatch

Disminuye Tm con el aumento de % mismatch

Disminuye la velocidad con el aumento de % mismatch

Concentración No ejerce efecto Aumenta la velocidad con el aumento de [DNA]

Agentes denaturalizant

es

disminuye Tm con el aumento de [formamide], [urea]

Optimo a 50% formamide

Temperatura - Optima a 20°C por debajo de Tm

Parámetros que intervienen en la desnaturalización del DNA



Densidad de flotación de los ácidos nucleicos

Basándose en múltiples estudios de la densidad de los DNAs de diferentes organismos y de su composición en bases nitrogenadas, se ha establecido una fórmula empírica que relaciona la densidad de flotación () con el contenido en G+C expresado en %:

= 1,660 + 0,00098(G+C)

DNA Densidad (g/ cm3) % (G+C)

Polímero A-T 1.675 0

Diplococcus pneumoniae 1.700 42

Escherichia coli 1.710 51

Serratia marcescens 1.716 55

Mycobacterium phlei 1.732 73

Existe una relación lineal entre el contenido en G+C y la densidad del DNA determinada por ultracentrifugación a equilibrio en un gradiente de densidad.

A mayor contenido en G+C, mayor densidad.

Avances científicos• Disociación y reasociación de las hebras

complementarias del DNA (hibridación de sondas o cómo encontrar una aguja en un pajar)

• Replicación del DNA in vitro (síntesis de genes usando cada una de las hebras de la doble hélice como molde para la copia)

• PCR: amplificación de un segmento de DNA en un tubo de ensayo (cómo leer información a partir de una sola célula, cómo detectar un virus en una muestra de sangre, etc.)

• Síntesis de DNA a partir de RNA (transcriptasa reversa de retrovirus)

Avances científicos

• Enzimas de restricción (tijeras mágicas para cortar DNA en forma precisa)

• Ligasa (pegamento especial para unir trozos de DNA: permite la construcción de moléculas recombinantes)

• Enzimas de restricción + ligasa = DNA recombinante (ingeniería genética)

Agentes intercalantes

• Moléculas aromáticas que se intercalan en el ADN entre bases apiladas• Fluorescentes• Detección de DNA y RNA• Agentes mutagénicos

Naranja de acridina

Bromuro de etidio

colorantes de ácidos nucleicos, agentes intercalantes

Bromuro de etidio

Naranja de acridina

Hibridación

reasociación de secuencias complementarias

secuencia blanco + sonda

DNA reassociation (renaturation)Double-stranded DNA

Denatured,single-strandedDNA

Slower, rate-limiting,second-order process offinding complementarysequences to nucleatebase-pairing

k2

Faster,zipperingreaction toform longmoleculesof double-strandedDNA

Sondas de ácidos nucleicos

Sonda marcada

Acido nucleico inmovilizado

Sondas fluorescentes

Sondas con grupos detectables por afinidad con anticuerpos (DIG) y otras

proteínas (avidina o estreptavidina)

High stringency: condiciones estrictas de hibridación y lavado de la sonda, tales que solamente se mantienen unidas las secuencias blanco y sonda que son 100% complementarias

Low stringency: condiciones de hibridación y lavado de la sonda, tales que se mantienen unidas las secuencias blanco y sonda entre las que no hay complementariedad perfecta (con “mismatches”)

PCR: the polymerase chain reaction

Figure 7-38

“Clonado” de un gen in vivo e in vitro .How to amplify an interesting gene. Two methods are (a) in vivo, by tricking the replication machinery of a bacterium into amplifying recombinant DNA containing the gene, and (b) in vitro, in the test tube.

Both methods employ the basic principles of molecular biology: the ability of specific proteins to bind to DNA (the proteins shown in yellow) and the ability of complementary single-stranded nucleic acid segments to hybridize together (the primer used in the test-tube method).

Tamaños de genomas

Tamaños de genomas

Virus a DNA

1 Cell length 2 μm or 2x10-6 m

2 Cell diameter 0.8 μm or 0.8x10-6 m

3 Cell total volume 1x10-15 L

Escherichia coli genome: 4,639,221 bp

4,377 genes

4,290 of these genes encode proteins; the rest RNAs

Tamaños de genomas

• Escherichia coli 1,5 µm

1 par de bases (pb) 0,34 nm = 0.34 x 10-9 m

1 molécula de DNA genómico: 4,6 106 pb / célula

DNA: 1,5 mm !!!

• Cromosoma y plásmidos

Longitud del DNA de una célula humana

1 par de bases (bp) 0,34 nm = 0,34 x 10-9 m

2 juegos of 3,0 109 pb / célula

2 metros !!!Contenido de DNA (longitud total)

en un humano adulto 2 m/célula x 1014 células 2 x 1011 kilómetros

200.000 millones de km

perímetro: 4 x 104 km

distancia de la Tierra al Sol: 1,5 x 108 km

Longitud del DNA de una célula humana

1 par de bases 0,34 nm = 0,34 x 10-9 m

2 juegos de 3,0 109 pares de bases / célula

2 metros !!!

Tamaño del DNA de un adulto 2 metros/célula x 1014 células

2 x 1011 kilómetros

200 mil millones de kilómetros

circunferencia de la Tierra: 4 x 104 km

distancia de la Tierra al Sol: 1,5 x 108 km

Empaquetamiento del DNA eucariota

En el genoma humano tenemos 3 x 109 bp distribuidos en 23 cromosomas

La forma B-DNA ocupa 0,34 nm/bp

Debemos empaquetarlo en un núcleo con un diámetro de 5-6 m (> 10.000 veces)

El DNA durante la interfase se encuentra condensado formando un complejo nucleoproteico denominado cromatina

La longitud total del DNA celular humano es de 2 metros!!!

Próxima clase: superenrollamiento y

empaquetamiento del DNA

Cinética de reasociación de cadenas complementarias.

Relación con el tamaño del DNA

Bibliografía recomendada

•Biología Molecular de la Célula. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. (2002). 4º edición, Garland Publishing, Inc.

•Gene VIII. Lewin, B. (2004). Ed. Prentice Hall. (y ediciones anteriores)

•Biología Celular y Molecular. Lodish H, Baltimore D., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., Darnel, J. (2002). 4º edición, editorial Médica Panamericana SA, España (5º edición en inglés).

•Lehninger. Biochemistry, Lehninger A.L., Nelson D.L., Cox M.M. (2005), 4º edición.(en castellano: 3º edición, 2001, editorial Omega, España)

•Molecular Biology. Weaver, R. (2004). 4º edición, Editorial McGraw-Hill.

Información actualizada y sitios de interés

www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Books

Genética Molecular 2010 Profesores: Dr. Víctor Romanowski Dr. Daniel Grasso Instructoras: Dra....

Documents

Transcript of Genética Molecular 2010 Profesores: Dr. Víctor Romanowski Dr. Daniel Grasso Instructoras: Dra....