“AÑO DE Y LA INDUSTRIA RESPONSABLE Y DEL FORTALECIMIENTO DE LA EDUCACION”

Universidad Nacional De PiuraFacultad de ciencias

Escuela profesional de ciencias biológicas

FUNDAMENTOS DE LAS PRUEBAS GENETICAS DE

FILIACION

CURSO: Genética de Poblaciones

DOCENTE: Blgo. Jaime Fernández Ponce

CICLO: VIII

INTEGRANTES:

Alvarado Moscol Alessandra Beatriz.

Piura, 20 de Octubre del 2015

Fundamentos técnicos de las pruebas de ADN

La información genética de cualquier persona es idéntica en todas las células nucleadas de su cuerpo y es distinta a la de cualquier otro individuo (exceptuando el caso de hermanos gemelos). Todos los seres humanos reciben la mitad de la información genética de su padre y la otra mitad de su madre. Esta información genética se localiza en una molécula situada en el núcleo de las células del organismo llamada ácido desoxirribonucleico o ADN.

En nuestro laboratorio extraemos y aislamos el ADN de las muestras biológicas que recibimos y, a partir de él, realizamos una selección de determinadas regiones empleando una técnica muy sofisticada conocida como la amplificación en cadena de la polimerasa o PCR. Estas regiones son los llamados marcadores genéticos, microsatélites o STRs.

Estos marcadores genéticos son regiones conocidas del ADN, muy variables de un individuo a otro (son muy "polimórficos") y que se heredan sin cambios de una generación a la siguiente. A las distintas formas heredables de estos marcadores genéticos las denominamos "alelos". Por lo tanto constituyen una herramienta muy valiosa en los estudios de identificación genética y filiación ya que:

Cada individuo tendrá unos marcadores genéticos distintos a los del resto, tendrá sus propios alelos.

Necesariamente, la mitad de estos marcadores serán idénticos a los de su padre y la otra mitad idénticos a los de su madre. Para un determinado marcador genético el hijo tiene dos alelos, uno cedido por el padre y otro cedido por la madre (y éstos a su vez los heredaron de sus padres, los abuelos, del mismo modo).

La información sobre los alelos de cada individuo la obtenemos del análisis mediante un secuenciador automático de ADN del producto de la amplificación por PCR.

De la comparación de los alelos encontrados en el hijo se deducen aquellos que obligadamente han debido ser aportados por el padre biológico. De la comparación se puede desprender que:

El presunto padre biológico estudiado no ha podido aportar al hijo los marcadores correspondientes al padre biológico, es decir, existen determinados alelos en el hijo que no están presentes en el padre en cuestión, en cuyo caso la paternidad quedará excluida.

El presunto padre biológico sí ha podido aportar esos marcadores, es decir, los alelos encontrados en el hijo están presentes en el padre en

cuestión, en cuyo caso procedemos a realizar un complejo análisis estadístico que contrasta la probabilidad de que esa persona sea el padre con la probabilidad de que lo sea cualquier otra persona tomada al azar de la población, dada la evidencia genética que se desprende del análisis.

La Información Genética como herramienta: El ADN

El Ácido Desoxirribonucleico o ADN es una molécula grande, de estructura compleja, que porta la información genética del organismo. Esta información genética es importantísima ya que es la que nos hace lo que somos y cómo somos y está basada en un código derivado de la combinación de cuatro elementos que son las bases nitrogenadas: Adenina, Timina, Citosina y Guanina.

Dentro de los seres humanos podemos encontrar ADN dentro del núcleo de cada célula (ADN nuclear) y fuera del núcleo, en el citoplasma de la célula, dentro de unos orgánulos pequeños denominados mitocondrias (ADN mitocondrial).

El ADN nuclear se estructura en grandes "paquetes" denominados cromosomas. Los seres humanos tenemos 46. Exactamente, 23 pares.

¿Por qué decimos mejor 23 pares? Porque, en realidad, la información genética de un ser humano está integrada en un "juego" de 23 cromosomas, 22 autosómicos (cromosomas 1 al 22) y 1 sexual (cromosoma X o Y), lo que sucede es que los seres humanos somos organismos diploides, esto es, todas nuestras células (salvo las germinales) tienen dos de estos "juegos" completos: uno que recibimos un de nuestra madre (22 + 1X) y otro que recibimos de nuestro padre (22 + 1X ó 1Y).

En total pues, 46 cromosomas. De los cuales, los cromosomas sexuales determinan el sexo de la persona. Dos cromosomas X (XX): sexo femenino; Un cromosoma X y un cromosoma Y (XY): sexo masculino.

Curiosamente, de todo el ADN nuclear, sólo aproximadamente el 10 % es el que porta el código genético con la información que configuran los genes (ADN codificante), el restante 90% es, simplemente, ADN no codificante.

Precisamente, en el ADN no codificante, es donde la genética forense ha encontrado una herramienta valiosísima para la identificación de las personas: los polimorfismos de ADN.

Los Polimorfismos de ADN

Ya hemos visto que tan sólo el 10% del ADN nuclear codifica lo que somos y como somos. Pues, por si fuera poco, de ese 10% los seres humanos compartimos casi todo... (Si no, no seríamos seres humanos). Así que, si lo que queremos es algo que nos sirva para discriminar a unas personas de otras, el ADN codificante, en términos generales y aunque también tenga sus polimorfismos, nos va a servir de poco.

En cambio, dentro del ADN no codificante nos encontramos con zonas de una extraordinaria variabilidad de unas personas a otras, de ahí que las denominemos "polimorfismos". También, por el uso que le damos, los llamamos "marcadores" de ADN.

Hay distintos tipos de polimorfismos pero para entender lo que son, su utilidad y no extendernos demasiado, nos basta con referirnos sólo a los denominados STR (del inglés Short Tandem Repeats, o "repeticiones cortas en tandem").

Un STR está formado por una secuencia corta de bases (por ejemplo, de cuatro, "AATG", como en el sistema TPOX) que se repite un número determinado de veces (...AATGAATGAATGAATGAATGAATGAATGAATGAATG...). La secuencia "AATG" forma lo que denominamos la unidad de repetición. Esta unidad de repetición "AATG" es igual para todas las personas; lo que varía de unas personas a otras, y esto es muy importante, es el número de veces que se repite.

Cada STR tiene su "unidad de repetición" característica. Y el número de repeticiones será variable desde un número mínimo a uno máximo.

Cada número de repeticiones concreto constituirá un "alelo", que es como denominamos a cada forma que puede tomar este sistema en función del número de repeticiones.

Si seguimos con nuestro STR ejemplo, en la secuencia anterior, la unidad "AATG" se repite 9 veces. Estamos, pues, ante el alelo 9 de muestro ejemplo.

Cada persona tendrá, para cada sistema o marcador genético analizado, sus propios dos alelos, uno procedente del padre y otro procedente de la madre.

Los polimorfismos de ADN que utilizamos en genética forense han sido previamente validados para tal uso, es decir, cumplen una serie de requisitos cuyo fin último es que su poder de discriminación entre personas sea lo suficientemente alto.

Polimorfismos de ADN y las Pruebas de Paternidad

En el apartado anterior, hemos descrito como todos los seres humanos recibimos la mitad de la información genética de nuestro padre y la otra mitad de nuestra madre. Es decir, heredamos un "juego" completo de 23 cromosomas (22 autosómicos + 1 sexual) de nuestro y otro "juego" completo de nuestra madre.

Así que tenemos dos cromosomas 1, dos cromosomas 2, dos cromosomas 3, y así hasta el 22 y dos cromosomas sexuales.

Entonces, de nuestros dos cromosomas 1, uno de ellos contendrá información genética procedente exclusivamente de los cromosomas 1 de nuestro padre y el otro contendrá exclusivamente información genética de los cromosomas 1 de nuestra madre.

Llegados a este punto podemos deducir que, si queremos saber si alguien es el padre biológico de una persona, y basándonos en el principio anterior, deberíamos comprobar que ambas comparten la mitad de su información genética. ¿Cómo?, mediante el estudio de polimorfismos de ADN. Veamos un ejemplo:

Investigamos una paternidad biológica y contamos con la madre, el hijo y un presunto padre biológico. Decidimos analizar el polimorfismo denominado TPOX y obtenemos los siguientes resultados:

El hijo porta los alelos 9 y 10 (se informa como [9,10]); la madre, [9,11] y el presunto padre biológico, [7,8].

Nos encontramos con una EXCLUSIÓN de paternidad, ya que los posibles hijos de esa pareja sólo pueden ser, para ese marcador analizado: [7,9], [7,11], [8,9] y [8,11], como combinación de sus alelos correspondientes, y el genotipo del hijo [9,10] no se encuentra entre ellos. El resultado no es compatible con la hipótesis de que sean padre e hijo biológicos.

Imaginemos que analizamos a un segundo presunto padre biológico y resulta ser [7,10] para el sistema TPOX.

Nos encontramos con una compatibilidad genética que implica NO EXCLUSIÓN de paternidad ya que los posibles hijos de esta nueva pareja pueden ser: [7,9], [7,11], [9,10] y [10,11]. El hijo analizado es portador de la tercera combinación posible. El resultado es compatible con la hipótesis de que sean padre e hijo biológicos. Un solo sistema no es suficiente para alcanzar una respuesta concluyente, debemos analizar el mayor número posible (en principio, cuantos más, mejor) para encontrar el mayor número de exclusiones de paternidad o una compatibilidad genética completa que no permita excluir la relación y permita alcanzar unos valores elevados para el Índice y la Probabilidad de Paternidad.

La Exclusión de Paternidad

Cuando se afronta un estudio de paternidad se deben estudiar el mayor número de marcadores posibles para poder encontrar el mayor número de exclusiones o la mayor compatibilidad genética entre el presunto padre biológico y el hijo.

De forma clásica y general se puede considerar que una paternidad queda excluida si se encuentran más de 2 exclusiones entre los marcadores analizados, en cuyo caso, podremos considerar que la persona estudiada no puede ser la padre biológico del hijo.

En nuestras pruebas de paternidad, en los que analizamos un gran número de marcadores, solemos obtener entre seis y diez exclusiones cuando la madre ha participado en el estudio y entre cuatro y seis exclusiones cuando sólo hemos estudiado al presunto padre biológico.

La Probabilidad de Paternidad

Ahora bien, si la compatibilidad genética entre el presunto padre biológico analizado y el hijo es completa ¿podríamos ya afirmar que es su padre biológico?

Nuestro sentido común nos dice que sí: primero sospechamos que una persona es el padre biológico de otra, para comprobarlo, decidimos analizar sus perfiles genéticos y, al final, ¡resultan ser perfectamente compatibles!. Parece muy poco probable que se produzca esa compatibilidad y después de todo el padre biológico sea otro.

Pues bien, podemos y debemos cuantificar esa incertidumbre. Tenemos herramientas para calcular, una vez comprobada esa compatibilidad genética, cuánto es de probable un hecho (SÍ es el padre) y cuanto es de probable el otro (NO es el padre). En 1938, Eric Essen-Möller, basándose en el Teorema de Bayes, describió su fórmula para calcular la probabilidad de paternidad (W):

W = X / ( X + Y ), donde X es la probabilidad de que la evidencia biológica observada en el hijo proceda del presunto padre biológico analizado e Y la probabilidad de que la evidencia biológica observada en el hijo proceda de cualquier otro varón tomado al azar de entre la población. Esto significa asumir que, antes de hacer la prueba de ADN, el presunto padre biológico analizado tiene tantas posibilidades de ser el padre como de no serlo y que, de no serlo, cualquier otro varón de la población tiene la misma probabilidad "a priori" de ser el padre.

En 1981, K. Hummel describió sus predicados verbales, que conjugaban distintos intervalos de valores de Probabilidad de Paternidad (W) con sus respectivas interpretaciones, con el objetivo de hacer comprensibles los valores y armonizar las interpretaciones. Consideró que un valor de W igual o superior a 99,73% era suficiente para considerar probada una paternidad desde un punto de vista práctico (W mayor o igual al 99,73% igual a "paternidad prácticamente probada").

Los predicados verbales de Hummel fueron aceptados internacionalmente. También la Jurisprudencia Española los ha descrito y admitidos como válidos (ver Sentencia del Tribunal Supremo del 24 de noviembre de 1992).

El Índice de Paternidad

Cuando afrontamos una prueba de investigación biológica de la paternidad tratamos de averiguar, mediante evidencias biológicas, si una persona es el padre biológico de otra, por lo tanto, nos planteamos dos hipótesis mutuamente excluyentes:

H1 = "El presunto padre biológico analizado SÍ es el padre biológico"

H2 = "El presunto padre biológico analizado NO es el padre biológico, lo es cualquier otro varón de la población no relacionado familiarmente con él".

No existen más hipótesis posibles, por lo tanto las probabilidades de las dos hipótesis tienen que sumar 100%. SI queremos calcular la probabilidad de paternidad utilizando la ecuación de Essen-Möller debemos asumir que la probabilidad "a priori" de ambas hipótesis es del 50% (esto es, que tan probable es una como otra). Esto teóricamente es válido pero, en general, es bastante conservador. (Baste un ejemplo: Para poder ser padre biológico hay que cumplir, respecto a la madre, ciertos requisitos – sobran las explicaciones - y este requisito no parece lógico que lo pueda cumplir cualquier otro varón escogido al azar de entre la población, y al revés, si el presunto padre nunca hubiese cumplido tal requisito, la probabilidad "a priori" debería ser 0%).

Para evitar tener que comunicar una probabilidad de paternidad "a priori", que siempre distorsiona la realidad por ser subjetiva, podemos informar mediante el uso de un ratio denominado Índice de Paternidad o IP:

Índice de Paternidad = Probabilidad de la hipótesis 1 / Probabilidad de la hipótesis 2 [IP = P(H1) / P(H2) ]

Si en un determinado estudio la probabilidad de H1 resulta ser del 99,99% entonces la probabilidad de H2 será del 0,01%, el Índice de Paternidad será del 9.999 (IP = 99,99 / 0,01 = 9.999)

Esto significa que el perfil genético observado en el hijo es nueve mil novecientas veces más probable si procede del presunto padre biológico analizado que si procede de cualquier otro varón tomado al azar de entre la población.

Los predicados verbales de Hummel consideran que un valor de IP igual o superior a 400 se corresponde con "una paternidad prácticamente probada".

La "fiabilidad" de la prueba

Es habitual encontrar en Internet, incluso en sitios web de laboratorios que se dedican a realizar pruebas de paternidad, a quienes identifican el valor obtenido de Probabilidad de Paternidad con la fiabilidad de la prueba y esto es FALSO.

Y es fácil de entender y deducir si sabe, se asume y se tiene en cuenta que el valor que se obtiene de probabilidad de paternidad depende directamente de la información genética que poseen los participantes y sólo indirectamente de la forma que el laboratorio aborda la investigación.

Si el presunto padre biológico y el hijo son totalmente compatibles genéticamente, pero comparten una información genética relativamente frecuente en la población, el valor que obtendremos de probabilidad de paternidad será menor que si la información genética que comparten es relativamente rara.

Si afrontamos las pruebas exactamente de la misma manera en ambos casos, utilizando los mismos recursos técnicos y humanos, y aplicando exactamente los mismos criterios de calidad y control, y en el primer caso obtenemos una probabilidad de paternidad del 99,995% y en el segundo del 99,9995%, ¿significa que es más fiable el segundo resultado que el primero? La respuesta es NO. Ambos son igual de fiables.

Como la información genética de los participantes no se conoce "a priori", es por lo que se establecen criterios homogéneos a la hora de abordar una investigación genética de paternidad y umbrales de decisión que se deben alcanzar para considerar concluyentes los resultados.

En condiciones normales, cualquier prueba de paternidad normal puede considerarse probada si la probabilidad de paternidad alcanza o supera el 99,9%.

Ahora bien ¿Cuáles son los recursos técnicos y humanos y los criterios de calidad y control, que utilizará y aplicará el laboratorio que va a hacer la prueba? Llegados a este punto, quizás la cuestión más importante que debamos plantearnos sea, ¿qué laboratorio me inspira más confianza a la hora de afrontar mi investigación genética?

Limitaciones de las pruebas de ADN

Todo lo descrito en los apartados anteriores es válido para aquellas pruebas de ADN que investigan la paternidad o maternidad biológicas y en las que son analizables, como mínimo, el hijo y el progenitor cuya relación biológica se investiga.

El ADN se hereda de padres a hijos. Si tratamos de investigar cualquier otra relación biológica la eficacia de la prueba desciende notablemente, lo que hace delicada su valoración.

El que una prueba de investigación biológica de parentesco (distintas de la paternidad y/o la maternidad) se pueda afrontar con unas mínimas garantías de éxito dependerá, fundamentalmente, del número de personas necesarias para la investigación que puedan o se presten a participar.

En cualquier caso es necesario plantear una hipótesis concreta. En los estudios de ADN no se pueden plantear cuestiones abiertas, del tipo: "Creo que una persona es familiar mío pero no se qué podemos ser, ¿puedo hacer una prueba de ADN que me diga qué somos?, planteada así la investigación la respuesta es NO.

Hay que plantear preguntas concretas basadas en indicios previos no biológicas, que permitan establecer hipótesis claras y mutuamente excluyentes. Por ejemplo: "Creo haber encontrado una persona que puede ser mi hermano biológico por parte de padre". Este caso sí es abordable ya que nos permite plantear dos hipótesis mutuamente excluyentes:

Hipótesis A: "los individuos analizados son hijos del mismo padre biológico"

Hipótesis B: "los individuos analizados no son hijos del mismo padre biológico".

La prueba de ADN nos permitirá calcular las probabilidades de ambas hipótesis. Es decir, nos permitirá saber cuántas veces es más probable una hipótesis que otra una vez obtenidos los respectivos perfiles de ADN. Pero esta prueba necesitaría de la participación de las madres biológicas de los dos participantes, ya que su estudio pondría en evidencia qué información genética procede de sus madres y así poder comparar sólo aquella que necesariamente debieron recibir de sus respectivos padres biológicos.

Existe además el problema añadido de desconocer "a priori" el poder de discriminación intrínseco que tendrán los perfiles genéticos de las personas analizadas. Si dos personas comparten en un determinado marcador genético un alelo rarísimo de la población la hipótesis del parentesco biológico estudiada podría verse muy favorecida, pero si la información genética encontrada en ambos individuos analizados

es bastante común, el estudio podría no alcanzar resultados concluyentes.

Con todo lo explicado queremos señalar que cualquier prueba de parentesco biológico debe ser consultada con el laboratorio para que éste aconseje respecto a cómo afrontarla con unas garantías mínimas de éxito. Existen infinidad de detalles a tener en cuenta antes de decidir si merece la pena realizar el estudio.

Como norma general, desconfíe de aquel laboratorio que le diga que cualquier estudio se puede afrontar con una prueba de ADN.

El ADN Mitocondrial

Las mitocondrias son orgánulos citoplasmáticos con carga genética propia: el ADN mitocondrial. Su función es proporcionar energía a la célula y su número varía entre 100 y 1000 por célula. Hasta lo que conocemos hoy, todas las mitocondrias que tienen nuestras células proceden de las que portaba el óvulo de nuestra madre en la fecundación, lo que hace que el ADN mitocondrial sea de herencia exclusivamente materna.

Así pues, una madre y todos sus hijos (independientemente de su sexo) tendrán el mismo ADN mitocondrial. Es por esto que el estudio del ADN mitocondrial es especialmente útil en el estudio de linajes maternos y en pruebas complejas de maternidad.

La interpretación de los resultados del análisis del ADN mitocondrial es compleja, y su poder de discriminación relativamente bajo. Si el ADN mitocondrial encontrado en dos individuos no coincide, se puede concluir que no tienen un mismo origen materno, pero si sí coinciden, no es evidencia suficiente para considerar probada una madre común.

El ADN mitocondrial tiene tres características fundamentales que lo hacen especialmente resistente a la degradación frente al ADN nuclear a la hora de estudiar muestras biológicas críticas: su reducido tamaño (16.569 pares de bases frente a los 6.000 millones del ADN nuclear), su estructura es circular y su gran cantidad de copias (dentro de cada célula, por cada copia de ADN nuclear puede haber entre 100 y 1.000 copias de ADN mitocondrial).

El Cromosoma Y

De los 23 pares de cromosomas presentes en los seres humanos sólo uno determina el sexo.

El par de cromosomas sexuales puede estar formado por 2 cromosomas X, en cuyo caso el individuo será mujer o 1 cromosoma X y 1 cromosoma Y, en cuyo caso el individuo será varón.

Así pues, el cromosoma Y sólo está presente en los varones y sólo los varones lo dan en herencia a sus hijos que, por recibirlo, serán varones.

El cromosoma Y apenas recombina con el X, así que se puede considerar, a efectos prácticos, que todos los hijos varones de un mismo padre comparten idéntico cromosoma Y.

El análisis de polimorfismos propios del cromosoma Y nos permite abordar investigaciones de linaje paterno, siempre y cuando en todas las generaciones involucradas se analicen varones.