Fundamentos-de-PCR

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Grupo de Investigaciones Mellitopalinologicas y Propiedades

Fisicoquímicas de Alimentos

FUNDAMENTOS DE LA REACCION EN CADENA DE POLIMERASA `PCRFUNDAMENTOS DE LA REACCION EN CADENA DE POLIMERASA `PCR´́

Y SU APLICACIÓN EN ALIMENTOSY SU APLICACIÓN EN ALIMENTOS

Mónica Patricia Osorio TangarifeMónica Patricia Osorio Tangarife30 de Abril de 200930 de Abril de 2009

Universidad del Tolima





,todas las células. Contiene la información genética usada en eldesarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos,

ADNADN

el ADN es un polinucleótido constituidos por d‐

AMP, d‐

GMP, d‐

CMP,d‐TMP. Esta formado or un nucleótido a su vez está formado orun azúcar, una base nitrogenada y un grupo fosfato que actúa comoenganche de cada nucleótido con el siguiente.






3´

FosfatoMoniDi

Tri

RibosaDesoxiribosa

5`Composición

estructuralAzucares

Bases nitrogenadasPurinas: A ‐ GPirimidinas: U ‐ T ‐ C

Adenina Guanina Timina

(ADN)

Citosina Uracilo

(RNA)

Universidad del TolimaPirimidinasPirimidinasPurinasPurinas





ADNADN Polinucleótidos constituidos por d‐AMP, d‐GMP, d‐CMP, d‐TMP.


Estructura primaria





Polinucleótidos constituidos Ribosa. A diferencia de ADN

ARNARN reemplaza la Timina por Uracilo. No forma dobles cadenas.

• Constituido por única cadena sin estructurasuperior. Masa molecular elevada.

• Contiene información genética del ADN,para utilizarla en la síntesis de proteínas.

• Determina el orden en que se unirán losaminoácidos.

• Se sintetiza en el núcleo celular y pasa alcitoplasma.


Griffiths, A.; Gelbart, W.; Miller, J.; Lewontin, R. 2000.





Técnica de biología molecular descrita en 1985 por Kary Mullis, cuyo objetivoes obtener un ran número de co ias de un fra mento de ADN articular,partiendo de un mínimo

Amplifica un fragmento de ADN; su utilidad es que, tras la amplificación,resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad


.





•

Fun amentos e PCRFun amentos e PCR

.

• Consiste en la separación por calor de las dos cadenas de ADN que se desea

fragmento de ADN artificial llamada cebador, mediante la acción de la ADNPolimerasa.

• Resultado es la duplicación del número de moléculas de una secuenciaconcreta de ADN.

• El proceso se repite un número determinado de veces (30), consiguiendo unaumento o amplificación exponencial de copias del fragmento de ADN molde.

• Si se parte de una molécula única de ADN en la muestra inicial y en cadaciclo se duplica el numero de moléculas, al final de los 30 ciclos, se obtendrá230 moléculas idénticas (1`073.741.824 moléculas).






Fundamentos de PCRFundamentos de PCR

Desarrollada por Kally Mullis en 1985, utilizando ADN polimerasadel fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli .

Amplifica únicamente el fragmentode ADN que se desea aunque esté

en bajas cantidades o en presenciaAlta especificidad

La reacción es eficaz si separte de una muestra poco

purificada, en presencia deotros com onentes

semejantes

El mayor de los dos fragmentos que se produce en la ruptura proteolítica con

’ ’’ ’

PM: 68 KDa

. .

actividad de 5´→

3´ polimerasa, posee actividad 3´→

5' exonucleasa, pero carece dela actividad 5‘ → 3' exonucleasa que se encuentra normalmente en la DNApolimerasa I de E. coli.

Fragmento Klenow

po merasapo merasa3’→ 5’ 3’→ 5’ exonucleasaexonucleasa

ADN Polimerasa IHoloenzima

Proteólisis

ADN Polimerasa5´ → 3´

Exonucleasa5´ → 3´ 5´ → 3´


3´ → 5´





Fundamentos de PCRFundamentos de PCR

Que se necesita

Mg++

ADN polimerasa

Pr mers Termociclador: Permiterealizar ciclos detemperatura necesarios

Cadena de

ADN

molde

Nucleótidos: dNTPs (A, G, C, T)

para a amp cac n e

ADN

Buffer de la reacción: TRIS‐HCl, TWEEN 20, KCl…

Existen otras tecnologías menos populares utilizando distribución de aire

caliente en tubos suspendidos, logrando el mismo objetivo de transferir calor

eficientemente a la reacción ara ue cambien los ciclos de tem eraturas






∼

Concentración de 0.1 a 0.5 µM

Tamaño recomendado de 20 a 30 b5´ 3´SI SI

No largas secuencias de una sola base

Evitar C y G en el extremo 3´

. 2. ACCAGCTATGACCATGATGA

5´ 3´NO NO

Evitar complementariedad entre cada uno y entre varios1. ACCTCGCGGGGGATCGCGAA2. TTCGCCCCATCGCCTTCGC

Extensión del primer La ADN polimerasa realiza extensión del primer usando la cadena complementaria como molde

3 5

dNTPs + Mg ++

5 3

Universidad del Tolima3 5





ADN polimerasas

• Temp. óptima de actuación a 42ºC • Temp. óptima de actuación a 72‐74ºC• p erasa e . c

• Fragmento Klenow de ADN polimerasa• T4 ADN polimerasa• Actividad exonucleásica 3´→ 5´

• p erasa• Tth polimerasa• No poseen actividad exonucleásica

Taq polimerasa

Aumenta la fidelidad:

No osee actividad exonucleásicas.No se añaden cantidades excesivas de Mg++.Se añade igual cantidad para dNTPs en la mínima concentración posible.






s

• dATP, dGTP, dCTP, dTTP. µ µ

• La concentración debe ser similar entre cada uno de ellos y se deberelacionar con la Mg++.

Buffer de la reacción

Com osición distinta de endiendo de las casas comerciales:

KCl . TRIS‐HCl. Gelatina. DMSO. Detergentes: Tritón. BSA. PEG…

Mg++

La concentración es fundamental ara la o timización de la reacción.

Contribuye a aumentar la temperatura de hibridación

[Mg++]: Disminuye la especificidad

Universidad del Tolima[Mg++]: Aumenta la especificidad




Fisicoquímicas de AlimentosPCR

El termociclador Perkin Elmer Cetus:• Permite la programación flexible de la temperatura• Rápido calentamiento y enfriamiento paso a paso para resultados consistentes.• Rango de temperatura de 0‐99°C


. .





Desnaturación





Fisicoquímicas de AlimentosPCR

10 – 20 pmol de primer

dATP, dCTP, dGTP y dTTF(cada uno 0.2 mM) 0.625 a 1.25 unidades

de Taq polimerasa

eacc n e a mezc a

1 X buffer de PCR(50 mM KCl, 10 mM TRIS‐HCl, 3 mM Cadena de ADN molde o

g , p a p ant a

Volumen final de 25 µl o 50 µl

Superpone con una gota de aceite mineral

Cada ciclo de PCR consiste

Denaturacion a 94ºC por 30´´

Hibridación a 60ºC (para H1 y H2 55ºC) por 30´´

Amplificación a 72ºC por 1´


Muestras de tamaño normal: 35 ciclos

Muestras

de

tamaño

de

biopsia:

40

ciclos





os m o os ra c ona es e on ro e ca a en as empresas a men ar as sebasan en dos únicos procesos, La inspección visual y el análisis microbiológico delProducto final. Esto lleva a una serie de DESVENTAJAS:

No detectar en que fase de la cadena de

recepción y/o producción se produce la

fisicoquímica del alimentos

Se requiere un muestreoestadísticamente significativolo que supone la recogida deun importante numero demuestras con limitaciones

económicas y temporales queello supone.

En el caso de detectarse una anomalía, debe


esec arse o o e o e, con a cons gu en e

pérdida financiera





conocimiento de los problemas cuando elproducto ya se halla en el mercado, lo que

el peligro potencial de que el consumidordesconfíe de esa casa comercial en el futuro.

Las técnicas de PCR son rápidas para ladetección de microorganismos en alimentos. Secaracterizan por su:

•Especificidad•Sensibilidad•Corto tiempo de análisis•Capacidad de inclusión en sistemas integrados


• enc ez

•Integración en sistemas HACCP




Fisicoquímicas de AlimentosREFERENCIASREFERENCIAS

• Wan, J. H.; Trainor, k. J. ; Brisco, M. J.; Morley, A. A. 1990. Monoclonality in B celllymphoma detectec in paraffin wax embedded sections using the polimerase chainreaction. Clin Pathol; 43: 888 ‐890.

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Fisicoquímicas de AlimentosReferenciasReferencias

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