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1Enzimas para la conversión de biomasa en etanol

BÚSQUEDA DE NUEVAS ENZIMAS PARA LACONVERSIÓN DE BIOMASA EN ETANOL

Proyecto FPTA-256 Viabilización de la producción deetanol en base a biomasa a través de la identificación

de enzimas hidrolíticas en diversas microbiotas

Responsable del Proyecto: Francisco Noya*

Equipo de trabajo: Inés Loaces, Cecilia Rodríguez, Vanesa Amarelle, Elena Fabiano, Francisco Noya(Departamento de Bioquímica y Genómica Microbianas, Instituto de InvestigacionesBiológicas «Clemente Estable», Montevideo, Uruguay)

* Investigador Asociado III, Departamento de Bioquímica y Genómica Microbianas, Instituto de Investigaciones Biológicas «Clemente Estable».

2 Enzimas para la conversión de biomasa en etanol

Título: BÚSQUEDA DE NUEVAS ENZIMAS PARA LA CONVERSIÓN DE BIOMASA EN ETANOL

Responsable del Proyecto: Francisco Noya

Equipo de trabajo: Inés Loaces, Cecilia Rodríguez, Vanesa Amarelle, Elena Fabiano,Francisco Noya

Serie: FPTA N° 47

© 2013, INIA

Editado por la Unidad de Comunicación y Transferencia de Tecnología del INIA

Andes 1365, Piso 12. Montevideo - Uruguayhttp://www.inia.org.uy

Quedan reservados todos los derechos de la presente edición. Esta publicación no se podráreproducir total o parcialmente sin expreso consentimiento del INIA.


Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria

Integración de la Junta Directiva

Ing. Agr., MSc., PhD. Álvaro Roel - Presidente

D.M.T. V., PhD. José Luis Repetto - Vicepresidente

Ing. Agr. Joaquín Mangado

Ing. Agr. Pablo Gorriti

D.M.V. Álvaro Bentancur

D.M.V., MSc. Pablo Zerbino


FONDO DE PROMOCIÓN DE TECNOLOGÍA AGROPECUARIA

El Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria (FPTA) fue instituido por elartículo 18º de la ley 16.065 (ley de creación del INIA), con el destino de financiarproyectos especiales de investigación tecnológica relativos al sector agropecuario delUruguay, no previstos en los planes del Instituto.

El FPTA se integra con la afectación preceptiva del 10% de los recursos del INIAprovenientes del financiamiento básico (adicional del 4o/oo del Impuesto a la Enaje-nación de Bienes Agropecuarios y contrapartida del Estado), con aportes voluntariosque efectúen los productores u otras instituciones, y con los fondos provenientes definanciamiento externo con tal fin.

EL FPTA es un instrumento para financiar la ejecución de proyectos de investiga-ción en forma conjunta entre INIA y otras organizaciones nacionales o internacionales,y una herramienta para coordinar las políticas tecnológicas nacionales para el agro.

Los proyectos a ser financiados por el FPTA pueden surgir de propuestaspresentadas por:

a) los productores agropecuarios, beneficiarios finales de la investigación, o por susinstituciones.

b) por instituciones nacionales o internacionales ejecutoras de la investigación, deacuerdo a temas definidos por sí o en acuerdo con INIA.

c) por consultoras privadas, organizaciones no gubernamentales o cualquier otroorganismo con capacidad para ejecutar la investigación propuesta.

En todos los casos, la Junta Directiva del INIA decide la aplicación de recursos delFPTA para financiar proyectos, de acuerdo a su potencial contribución al desarrollo delsector agropecuario nacional y del acervo científico y tecnológico relativo a lainvestigación agropecuaria.

El INIA a través de su Junta Directiva y de sus técnicos especializados en lasdiferentes áreas de investigación, asesora y facilita la presentación de proyectos a lospotenciales interesados. Las políticas y procedimientos para la presentación deproyectos son fijados periódicamente y hechos públicos a través de una amplia gamade medios de comunicación.

El FPTA es un instrumento para profundizar las vinculaciones tecnológicas coninstituciones públicas y privadas, a los efectos de llevar a cabo proyectos conjuntos.De esta manera, se busca potenciar el uso de capacidades técnicas y de infraestruc-tura instalada, lo que resulta en un mejor aprovechamiento de los recursos nacionalespara resolver problemas tecnológicos del sector agropecuario.

El Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria contribuye de esta manera ala consolidación de un sistema integrado de investigación agropecuaria para elUruguay.

A través del Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria (FPTA), INIA hafinanciado numerosos proyectos de investigación agropecuaria a distintas institucio-nes nacionales e internacionales. Muchos de estos proyectos han producido resulta-dos que se integran a las recomendaciones tecnológicas que realiza la institución porsus medios habituales.

En esta serie de publicaciones, se han seleccionado los proyectos cuyos resulta-dos se considera contribuyen al desarrollo del sector agropecuario nacional. Surelevancia, el potencial impacto de sus conclusiones y recomendaciones, y su aporteal conocimiento científico y tecnológico nacional e internacional, hacen necesaria laamplia difusión de estos resultados, objetivo al cual se pretende contribuir con estapublicación.


Pág.

CONTENIDO

RESUMEN ................................................................................................................... 9

INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 9

MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................... 10Obtención de muestras ........................................................................................ 10Obtención de ADN metagenómico...................................................................... 11Construcción de las metagenotecas y selección de actividadesenzimáticas de interés ......................................................................................... 11Pretratamiento de bagazo de caña ..................................................................... 11Secuenciación y análisis bioinformático ............................................................ 11Producción y detección de etanol ...................................................................... 11Determinación de glucosa y celobiosa .............................................................. 12

RESULTADOS ........................................................................................................... 12

Construcción de metagenotecas ........................................................................ 12Selección de las actividades de interés ............................................................ 12Capacidad de crecimiento en papel de filtro como única fuente decarbono .................................................................................................................. 12Producción de etanol utilizando papel de filtro ................................................. 14Utilización del bagacillo de caña de azúcar ...................................................... 14Secuenciación y análisis bioinformático del clon M9F1 .................................. 15

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .......................................................... 18

AGRADECIMIENTOS ............................................................................................... 20

BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 20


Búsqueda de nuevasenzimas para la

conversión de biomasaen etanol

Proyecto FPTA 256Período de Ejecución: May. 2009-Jul. 2012

Inés Loaces*

Cecilia Rodríguez*

Vanesa Amarelle*

Elena Fabiano*

Francisco Noya*

*Departamento de Bioquímica yGenómica Microbianas

INTRODUCCIÓNLa búsqueda de nuevas fuentes de ener-

gía renovables se presenta como uno delos desafíos cruciales con los que se en-frenta actualmente la Humanidad. La alar-mante acumulación atmosférica de gasesde efecto invernadero producida principal-mente por la quema de combustibles fósi-les amenaza con producir un cambio cli-mático global capaz de desencadenar unnuevo suceso de extinción masiva (Tansy Keeling, 2012).

En este contexto, las energías renova-bles son una alternativa viable, confiable yfactible tanto para los países desarrolladoscomo para aquellos en vías de desarrollo.

La Agencia Internacional de la Energía(IEA) estima que para lograr mantener elcalentamiento global en no más de 2 °C porencima de las temperaturas medias pre-vias a la Revolución Industrial, será nece-sario aumentar cuatro veces la producciónde biocombustibles avanzados para el año2020 (IEA, 2020).

Uno de los principales biocombustibleses el bioetanol. Su producción consisteesencialmente en la degradación de poli-sacáridos complejos en azúcares simplesy en su posterior fermentación alcohólica.Por lo tanto, las materias primas de esteproceso pueden ser sumamente diversas.En la actualidad, las más utilizadas indus-trialmente son el almidón del maíz y lasacarosa de la caña de azúcar.

RESUMENEl uso de combustibles fósiles constituye actualmente una de las mayores fuentes de emisiónde gases con efecto invernadero. La búsqueda de fuentes de energía renovables se presentacomo uno de los desafíos cruciales con los que se enfrenta actualmente la Humanidad. Unanueva matriz energética basada en fuentes de energía renovables debe contemplar entre susprincipales elementos a los biocombustibles líquidos. El Uruguay ya ha iniciado este camino yhoy se encuentra produciendo los dos principales biocombustibles líquidos: bioetanol ybiodiesel. La diversificación de las materias primas utilizadas para obtener estos combustibleses indispensable para asegurar la independencia energética. La biomasa vegetal lignoceluló-sica es una alternativa abundante, ubicua y conveniente ya que se obtiene como un sub-producto de distintas cadenas agroindustriales. En la actualidad, el paso limitante en laconversión de lignocelulosa en etanol es la sacarificación enzimática de la biomasa para obtenerazúcares fermentables a partir de los cuales se produce el etanol. Este trabajo planteódesarrollar un microorganismo capaz de facilitar la producción de etanol lignocelulósico sinnecesidad de enzimas exógenas. Para ello se utilizaron técnicas de metagenómica funcionalutilizando como material de partida las comunidades microbianas aisladas de hábitats naturalescomo ser el rumen bovino o los lodos de reactores anaerobios de tratamiento de efluentes. Elmaterial genético de estas comunidades fue seleccionado por su capacidad para favorecer elcrecimiento de Escherichia coli en material lignocelulósico como única fuente de carbono. Unode los fragmentos obtenidos, denominado M9F1, fue capaz de permitir el crecimiento de E.colitanto en papel de filtro como en bagazo de caña de azúcar. Además, cuando se lo introdujoen una cepa etanologénica, se pudo constatar la fermentación de etanol a partir de papel. Lasecuencia de M9F1 reveló genes relacionados con el metabolismo de los polisacáridos peroninguno de ellos presenta homologías significativas con celulasas, β-glucosidasas, xilanasasu otras glicosilhidrolasas conocidas.


Sin embargo, es la lignocelulosa el poli-sacárido de glucosa más abundante, másbarato y mejor distribuido del mundo. Lalignocelulosa es el principal componentede las paredes vegetales, en general, y dela madera, en particular. Es el polímeroorgánico más abundante y el principalconstituyente de la biomasa terrestre. Estácompuesta esencialmente por celulosa,hemicelulosa y lignina en una estructurasupramolecular altamente resistente a ladegradación y oxidación. Debido a estanaturaleza recalcitrante solamente algu-nos microorganismos con sistemas enzi-máticos especializados pueden digerirla(Kumar et al., 2008).

Lignocelulosa apta para ser utilizada enla producción de bioetanol puede obtener-se de las partes no comestibles de cultivostradicionales como el maíz, el trigo y elarroz, desechos forestales como aserrín ycortezas, desechos domésticos e indus-triales como papel y cartón, o de cultivosdestinados a su producción como eucalip-tus, álamos y mijo. Cualquiera sea suorigen, esta materia prima no constituyeun alimento para el hombre lo que repre-senta una ventaja sobre el almidón delmaíz o la sacarosa de la caña de azúcar(Hahn-Hagerdal et al., 2006; Metageno-mics, 2007; Tuck et al., 2012).

El Uruguay cuenta con una buena capa-cidad de producción de lignocelulosa yasea que ésta provenga de productos se-cundarios de la actividad agropecuaria (cás-cara de arroz, rastrojo de trigo o maíz,bagazo de caña de azúcar, corteza deárboles) o constituya el producto principalde cultivos especializados.

Mediante el tratamiento hidrolítico ade-cuado, la lignocelulosa puede ser utilizadaen la producción de bioetanol. El principalobstáculo para producir bioetanol a partirde lignocelulosa es el alto costo que ac-tualmente tienen las enzimas lignocelulo-líticas comerciales (Geddes et al.,2011).

Además, a escala industrial, estas en-zimas son producidas y comercializadaspor un pequeño número de proveedores,todos ellos extranjeros, lo que crearía unanueva dependencia de la matriz energéticadel país.

En este estudio nos hemos propuestoutilizar la metagenómica funcional comoherramienta para aislar nuevas funcionesmetabólicas que puedan ser aplicadas a

mejorar la producción de bioetanol lignoce-lulósico. Esencialmente, la metagenómi-ca funcional consiste en la búsqueda deactividades de interés en el conjunto de losgenomas integrantes de una comunidadmicrobiana natural como puede ser, porejemplo, la que habita una muestra desuelo fértil. El primer paso para lograr esteobjetivo consiste en aislar el ADN total dela comunidad, fragmentarlo y clonarlo envectores apropiados para obtener una co-lección de clones de Escherichia coli cadauno de los cuales ha incorporado un frag-mento del ADN de la comunidad. Esteconjunto de clones se llama bibliotecametagenómica o «metagenoteca» (Aakviket al., 2011).

En esta metagenoteca estarán repre-sentados fragmentos de material genéticode especies bacterianas conocidas pero,sobretodo, de especies desconocidas queno pueden ser cultivadas en el laboratorio.Se estima que sólo el 1% de la diversidadbacteriana del planeta es cultivable en ellaboratorio (Rappe y Giovannoni, 2003;Handelsman, 2004).

Esta metagenoteca se crece en me-dios de selección apropiados para detectarlas actividades biológicas de interés. Porejemplo, para buscar celulasas se crece labiblioteca en un medio conteniendo celulo-sa cristalina (avicel) como única fuente decarbono y se seleccionan aquellos clonescapaces de crecer y degradarla.

Utilizando este enfoque desarrollamosmetagenotecas a partir de comunidadesmicrobianas especializadas en la degrada-ción de biomasa vegetal. Estas bibliote-cas fueron principalmente utilizadas parabuscar actividades lignocelulolíticas. Losclones identificados fueron evaluados encepas de E.coli llamadas «etanologéni-cas» porque son capaces de realizar lafermentación alcohólica de los azúcaresliberados. Por último, para identificar losgenes responsables de estas actividades,los fragmentos candidatos fueron secuen-ciados parcial o totalmente y analizadoscon herramientas bioinformáticas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención de muestras

La muestra de contenido ruminal fueobtenida de un novillo Holando de 480 kg


alimentado en praderas y sacrificado en elFrigorífico Pando (Canelones, Uruguay).La muestra de lodos anaerobios fue obte-nida de un digestor alimentado con conte-nido ruminal [sólidos totales (ST) 19,3%(w/w) y sólidos volátiles (SV) 17,3% (w/w)],grasa de trinchado de curtiembre (ST 25,1%y SV 17,6%) y lodos de purga de lagunasanaerobias de una aceitera (ST 25,6% ySV 21,7%) el cual opera en el Departamen-to de Reactores de Facultad de Ingeniería(Universidad de la República, Montevideo,Uruguay). Todas las muestras fueron man-tenidas a 4 °C hasta su procesamiento.

Obtención de ADNmetagenómico

Para separar los microorganismos pre-sentes en las muestras 500 μl de líquidoruminal o del lodo del digestor se diluyeronen 3 ml de PBS. Se agregaron 3 ml dePercoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.)y se centrifugaron durante 20 minutos a10.000 x g. Se separó la capa opalescentey se realizó la tinción de Gram para verificarla presencia de células bacterianas. Lafracción celular se resuspendió en 1 ml debúfer de lisis (NaCl 700 mM, Tris-HCl50 mM pH = 8,0, EDTA 100 mM, SDS 4%).Se agregaron bolitas de zirconia (aproxi-madamente 100 μl) y se agitó horizontal-mente durante 30 segundos. Se incubó a70 °C durante 15 minutos mezclando cada5 minutos y se centrifugó a 4 °C durante 5minutos a 16000 x g. El sobrenadante fuetratado con 15 μl de proteinasa K (20 mg/ml) durante 1 hora a 37 °C. Posteriormentese agregaron 160 μl de CTAB 10% en NaCl0,7 M y se incubó 10 minutos a 65 °C. ElADN se extrajo con fenol y cloroformo, seprecipitó con isopropanol y se resuspendióen 200 μl de agua ultrapura.

Construcción de lasmetagenotecas y selección de

actividades enzimáticas deinterés

El ADN fue fraccionado por tamañoen geles de agarosa. Se seleccionaronaquellos fragmentos entre 35 y 45 kpb.Los fragmentos fueron clonados en elvector fosmídico pCC1FOS utilizando elkit CopyControl Fosmid Library Produc-

tion (Epicentre Biotechnologies, Madi-son, EE.UU). y siguiendo las instruccio-nes del fabricante. Se infectaron célulasde EPI300 y las transfectantes resisten-tes al cloranfenicol (12,5 µg/ml) se orde-naron en grupos de 10 o más clones enplacas de 96 pocillos. Estos clonesfueron evaluados en medio LB con elagregado de 0.2% carboximetil celulosasal disódica (CMC) (Sigma-Aldrich) paradetectar actividad celulasa y en LB con0,5% de xilano de avena (Sigma-Aldrich)para detectar actividad xilanasa. Se in-cubaron las placas a 30 ºC durante 7 díasy se revelaron con Rojo Congo durante 20minutos. La presencia de un halo amari-llo alrededor de la colonia se tomó comoevidencia de la presencia de actividadglicolítica. A su vez se evaluó la capaci-dad de los clones de crecer en mediomínimo M9 (MgSO4 2 mM, CaCl2 0,1mM, Na2HPO4.7H2O 12,8 g/l, KH2PO43 g/l, NaCl 0,5g/l, NH4Cl 1g/l, timina50 µg/ml, leucina 200 µM) con 0,5% deavicel como única fuente de carbono.

Pretratamiento de bagazo decaña

Bagazo de caña molido con un conte-niendo de humedad del 54% fue obtenidode la empresa productora de alcoholesALUR. Este sustrato fue sometido a dostipos de pretratamiento: incubación conagitación durante 2 horas con ácido fos-fórico 1% o con ácido sulfúrico 1%, se-guido de 1 hora de autoclave a 121 °C.Luego de este tratamiento, la fracciónlíquida fue neutralizada con NaOH hastalograr pH= 6,5 y la fracción sólida fuelavada 3 veces con abundante agua des-tilada. La biomasa obtenida se mantuvoa 4 ºC hasta su incorporación en placasde M9 en una concentración final de 1%.

Secuenciación y análisisbioinformático

La secuenciación de los fósmidosseleccionados se realizó mediante latécnica de shotgun por Macrogen Inc.(Seúl, República de Corea). El análisisbioinformático de la secuencia obtenidase real izó ut i l izando la plataformaCAMERA 2.0 (Sun et al.,2011).


Producción y detección deetanol

Fue evaluada la capacidad de utilizarpapel de filtro y producir etanol a partir delmismo en condiciones aerobias (matra-ces) y anaerobias (Fleaker, Corning,EE.UU.). Se sembraron cultivos semilla enM9-glucosa 1% con los antibióticos co-rrespondientes. Estos fueron utilizados parainocular medio M9 con papel de filtro 1%(w/v). La producción de etanol fue seguidamediante cromatografía gaseosa durante48 horas (Agilent GC 6890N, inyector7683B; columna megabore HP-PLOT de15 m x 0,53 mm y 40 µm film).

Determinación de glucosa ycelobiosa

La concentración de glucosa y celobio-sa en el medio de cultivo fue determinada porHPLC utilizando un HPLC Waters (Milford,EE.UU.) detectados por índice de refracción.La separación se realizó en una columnaBio-Rad (Hercules, EEUU) Aminex HPPX-87P (300 mm x 7,8 mm d.i.) a 85 °C usandoagua ultrapura como fase móvil (0,5 mL/min).

RESULTADOS

Construcción de metagenotecas

Para lograr los objetivos propuestos secomenzó con la construcción de bibliote-cas metagenómicas a partir de muestrasde comunidades microbianas obtenidasde distintos hábitats en donde tiene lugar ladegradación de biomasa vegetal. Concre-tamente, se seleccionaron muestras derumen bovino y de lodo de digestoresanaerobios alimentados con contenido ru-minal. En ambos casos se logró separar lafracción bacteriana y purificar su ADN.Este ADN fue fragmentado y clonado enfósmidos que fueron transfectados en célu-las de E.coli EPI300.

Se obtuvieron 30.000 clones para labiblioteca construida a partir de contenidoruminal bovino y 100.000 para la bibliotecaobtenida a partir de lodos de digestor anae-robio. Cada uno de estos clones albergaun fragmento de ADN metagenómico de42 kpb en promedio.

Selección de las actividades deinterés

Las metagenotecas fueron sembradasen medios conteniendo CMC o xilano deavena, con el fin de seleccionar actividadesenzimáticas para celulasas o xilanasas.También se las colocó en medio mínimocon avicel como única fuente de carbono.El avicel es una forma de celulosa micro-cristalina. Se presume que los clones ca-paces de crecer en avicel tendrán, ademásde hidrolasas, los sistemas de transportenecesarios para secretar a estas enzimasy para internalizar a los glúcidos liberados.Los clones positivos primariamente fueronconfirmados y sus fósmidos, reaislados,fueron utilizados para transformar célulasfrescas. Cuando el fenotipo observado serepetía en estas células, se tomó comoevidencia que las funciones de interésefectivamente provienen del fragmento me-tagenómico introducido y no de causasespúreas. Para descartar los posibles clo-nes duplicados que hayan surgido de se-leccionar dos o más veces el mismo fósmi-do, se realizaron perfiles de restricción delos fósmidos con la enzima EcoRV. En casode constatarse idénticos perfiles de restric-ción en dos o más clones, se eligió un clonrepresentante de la clase para continuar elestudio descartándose los duplicados.

De 58 clones positivos que presentaronuna o más actividades de interés, se selec-cionaron 13 para continuar el estudio envirtud de la reproducibilidad de sus fenoti-pos en medios de selección (Cuadro 1).

Capacidad de crecimiento enpapel de filtro como única

fuente de carbono

El papel de filtro está compuesto esen-cialmente por celulosa y su conversión enazúcares reductores es un ensayo común-mente utilizado para determinar las activi-dades celulolíticas de enzimas purifica-das. Se razonó que si los clones seleccio-nados producen enzimas celulolíticas, eraposible que algunos de ellos fueran capa-ces de crecer en papel de filtro como únicafuente de carbono.

Para evaluar esta alternativa se utilizómedio mínimo M9 al que se le agregó unatira de papel de filtro (Whatman No.2) comoúnica fuente de carbono. Como controles


Clon Origen Características en medios de selección

Csd1 Rumen Halo en CMC





Xil3 Rumen Halo en xilano de avena



Lq5B10 Rumen Crece en medio mínimo con avicel

BH8 Fermentador Halo en CMC

EF9 Fermentador Halo en CMC y xilano

M9F1 Fermentador Crece en medio mínimo con avicel

M9F2 Fermentador Crece en medio mínimo con avicel

Cuadro 1. Colección inicial de clones con actividades de interésconfirmadas seleccionados a partir de las metagenotecascrecidas en distintos medios

Figura 1. Medio mínimo M9 conteniendopapel de filtro como única fuentede carbono a los 7 días post-inoculación. El tubo de la izquierdafue inoculado con la cepa EPI300conteniendo un fósmido elegidoal azar, como control negativo. Eltubo de la derecha fue inoculadocon la cepa EPI300 conteniendoel fósmido M9F1.

negativos, se utilizaron el mismo mediopero sin el papel de filtro y la cepa parentalsin los fósmidos seleccionados. La Figura1 muestra un experimento tipo donde seaprecia crecimiento a partir de papel defiltro en presencia del fósmido M9F1. LaFigura 2 muestra los recuentos obtenidosen estas condiciones.

Estos datos sugieren que el crecimien-to de EPI300 (M9F1) en papel de filtro eslento y requiere de una fase lag relativa-mente extensa. Recién a partir de los 7días post-inoculación comienza a obser-varse un aumento de la densidad celular.Por otra parte, si estos cultivos estabancreciendo a partir de la celulosa del papel,la integridad estructural de éste deberíaverse afectada con el tiempo. Para intentarobservar esta transformación, se aumentóel volumen de los cultivos y se extendió eltiempo de incubación hasta 19 días. Luegode este período el papel de filtro incubadocon EPI300 (M9F1) perdió casi totalmentesu estructura macroscópica. Un efecto


sido genéticamente modificada buscandomaximizar la fermentación de hexosas ypentosas en etanol.

El fósmido M9F1 fue transformado enLY180 y la cepa resultante fue crecida encondiciones anaerobias en medio mínimoM9 conteniendo papel de filtro como únicafuente de carbono. La producción de eta-nol a las 48 horas post-inoculación sedeterminó mediante cromatografía de ga-ses. Paralelamente, se utilizó el plásmidopLOI297 (Ohta et al., 1991) que porta losgenes de piruvato decarboxilasa (pdc) yalcohol deshidrogenasa (adhB) de Zymo-monas mobilis y que potencia la produc-ción de etanol en cepas de E.coli. Esteplásmido se utilizó para transformar a lacepa EPI300 conteniendo el fósmido M9F1(Figura 4).

A continuación se estudió la cinética deproducción de etanol conjuntamente con laliberación de glucosa y celobiosa, los pro-ductos principales de la degradación enzi-mática de la celulosa. Para ello los sobre-nadantes de cultivos anaerobios conte-niendo papel de filtro como única fuente decarbono fueron analizados por GC y HPLC.Como se observa en la Figura 5, se liberatanto glucosa como celobiosa al medio.Tal como se espera, la glucosa es rápida-mente consumida lo que coincide con laaparición del etanol. La celobiosa es man-tenida en niveles relativamente constantesa lo largo de todo el experimento.

Para comprobar si la presencia de M9F1favorece el crecimiento en celobiosa, serealizaron curvas de crecimiento en mediomínimo M9 conteniendo celobiosa comoúnica fuente de carbono. En la Figura 6 sepuede observar que M9F1 favorece el cre-cimiento en celobiosa con respecto a lacepa control sin M9F1.

Utilización del bagacillo de cañade azúcar

Estos experimentos demuestran queM9F1 es necesario y suficiente para viabi-lizar el crecimiento de las cepas de E.coliestudiadas en papel de filtro como únicafuente de carbono. Sin embargo, el papelde filtro no contiene lignina por lo que noconstituye un sustrato lignocelulósico.Además, no representa una materia primarelevante desde el punto de vista del proce-so industrial de una bio-refinería. Por estas

Figura 3. Cultivos de 19 días en medio mínimo M9conteniendo 1% (w/v) de papel de filtro. Deizquierda a derecha: LY180, LY180 (M9F1) yEPI300 (M9F1).

Figura 2. Recuento de unidades formadoras de colonias(UFC), en presencia (c/PF) y ausencia (s/PF) depapel de filtro para EPI300 conteniendo M9F1 o unfósmido control (Bc1).

similar pero de menor intensidad se obser-vó con la cepa etanologénica LY180 (M9F1)y no se observaron cambios en el papel enpresencia de LY180 sin fósmido alguno(Figura 3).

Producción de etanol utilizandopapel de filtro

Para determinar la capacidad de M9F1para participar en la conversión de celulosaen etanol se utilizó la cepa etanologénicaLY180 (Miller et al., 2009). Esta cepa ha


Figura 4. Producción de etanol a partir depapel de filtro (0,07% y 1%) a las48h post- inoculación en doscondiciones anaerobias: frascoscerrados y Fleakers. Se muestranlos promedios con la desviaciónestándar de tres determinacionespara la cepa LY180, la cepaEPI300 conteniendo el fósmidoM9F1, la cepa LY180 conteniendoel fósmido M9F1 y la cepa Epi300conteniendo el fósmido M9F1 y elplásmido etanologénico pLOI297.

Figura 5. Concentración de etanol (barras), glucosa (línea continua) y celobiosa (línea punteada) a lo largodel tiempo para EPI300 conteniendo el fósmido M9F1 y el plásmido etanologénico pLOI297 (M9F1-pLOI297, panel izquierdo) y para LY180 conteniendo el fósmido M9F1 (LY180-fM9F1, panel derecho).Ambos experimentos fueron llevados a cabo en anaerobiosis, en medio mínimo con papel de filtrocomo única fuente de carbono.

Figura 6. Curva de crecimiento de EPI300transformada con M9F1 o con nfósmido control (C-) en mediomínimo M9 conteniendocelobiosa como única fuente decarbono. Las barras de errorcorresponden a la desviaciónestándar de tres replicados.


razones, se realizaron también ensayosen un sustrato de mayor valor agroindus-trial como es el bagazo de caña de azúcar.

Bagazo de caña molido («bagacillo»)conteniendo 54% de humedad fue provistopor la empresa productora de alcoholesALUR (Artigas, Uruguay). Este sustratofue sometido a pretratamiento con ácidofosfórico 1% o con ácido sulfúrico 1%,seguido de 1 hora de autoclave a 121 °C.La fracción sólida lavada con abundanteagua destilada se incorporó en placas demedio mínimo M9 y agar a una concentra-ción del 1%.

Como se muestra en la Figura 7, M9F1es suficiente para permitir el crecimientode EPI300 en bagacillo de caña de azúcarpretratado como única fuente de carbono.

Secuenciación y análisisbioinformático del clon M9F1

Con el propósito de obtener informaciónacerca de los genes involucrados en estosfenotipos así como también determinar elmicroorganismo del que provienen, se se-cuenció el fósmido M9F1 en su totalidadmediante la técnica de «shotgun».

Se realizaron 962 reacciones de se-cuenciación por el método de Sanger.Luego de eliminar las secuencias prove-nientes de los vectores utilizados para lasecuenciación así como las lecturas de

baja calidad, quedaron 862 lecturas quefueron ensambladas en tres contigs conuna cobertura promedio de 8.62X. Uno delos contigs estaba totalmente contenidoen el pCC1FOS. Para completar la se-cuencia del inserto de M9F1 fue necesariosecuenciar 435 bases adicionales a partirde los extremos de los otros dos contigspara lograr ensamblarlos y obtener unaúnica secuencia de 33996 nucleótidos.

Mediante el algoritmo Metagene se iden-tificaron un total de 28 marcos de lecturaabiertos (ORFs). Las posibles funcionesde estos ORFs fueron predichas basándo-se en su homología con clústers de gruposde ortólogos (COGs) y con las familias deproteínas Pfam (Cuadro 2).

A partir de estas predicciones se puedeidentificar en M9F1 un posible operón inte-grado por genes relacionados con el meta-bolismo de polisacáridos en el que seidentifican varias glicosiltransferasas. Esasenzimas normalmente participan de la sín-tesis de polisacáridos de la pared celularaunque es posible que este operón partici-pe también en el transporte de monosacá-ridos hacia el interior celular. De hecho, seidentifican genes que podrían codificar paraproteínas de membrana y permeasas.

Otro de los ORFs que llaman la aten-ción es el #28 que codifica para una proteí-na no caracterizada que presenta un domi-nio YceI. Estos dominios son característi-cos tanto en proteínas del periplasma como

Figura 7. Placas conteniendo 1% de bagacillo de caña de azúcar pretratado con 1% de ácido sulfúrico(izquierda) o 1% de ácido fosfórico (derecha). Cada placa fue sembrada con dos gotas de 40µLde cada uno de los siguientes cultivos: (A) EPI300, (B) Epi300 (M9F1) y (C) LY180.


Tamaño (AA)

COG e-value COG

Descripción COG Pfam e-value Pfam

Descripción Pfam

1 49

2 80

3 224 PF09560 1.20E-44 Spore_YunB

4 459 COG0008 1.00E-109 Glutamyl- and glutaminyl-tRNA synthetases

PF00749 6.60E-132 tRNA-synt_1c

5 231 COG1215 5.00E-06 Glycosyltransferases, probably involved in cell wall biogenesis

6 698 COG1216 9.00E-05 Predicted glycosyltransferases

PF00535 6.30E-08 Glycos_transf_2

7 361 COG0381 3.00E-85 UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase

PF02350 1.30E-108 Epimerase_2

8 354 COG1086 6.00E-84 Predicted nucleoside-diphosphate sugar epimerases

PF02719 6.30E-113 Polysacc_synt_2

9 323 COG1091 5.00E-41 dTDP-4-dehydrorhamnose reductase

PF04321 1.00E-12 RmlD_sub_bind

10 92

11 265

12 151

13 661 COG0463 2.00E-12 Glycosyltransferases involved in cell wall biogenesis

PF00535 1.20E-29 Glycos_transf_2

14 107 COG0564 5.00E-13 Pseudouridylate synthases, 23S RNA-specific

PF00849 1.30E-07 PseudoU_synth_2

15 111 COG3077 3.00E-08 DNA-damage-inducible protein J

PF04221 3.60E-11 RelB

16 147 COG0456 2.00E-08 Acetyltransferases PF00583 9.50E-21 Acetyltransf_1

17 236 COG1187 2.00E-54 16S rRNA uridine-516 pseudouridylate synthase and related pseudouridylate synthases

PF01479 4.90E-06 S4

Cuadro 2. Asignaciones de los ORFs detectados en M9F1 en función de sus homologías con clústers degrupos de ortólogos (COGs) y con familias de proteínas Pfam. Los ORFs que no presentanhomologías con ninguna secuencia conocida se presentan únicamente con su número y tamañoen aminoácidos


en proteínas secretadas. También se losencuentra asociados a módulos de unión acarbohidratos (CBMs) en celulasas (Stan-cik et al.,2002; Handa et al., 2005). Sieste gen efectivamente codificara una ce-lulasa funcional, la misma tendría muy bajahomología con las familias de celulasasconocidas. Su caracterización minuciosaserá objeto de futuros estudios.

Entre las posiciones 2543 y 3557 delinserto se detectó un posible gen quecodifica para un ARNr 16S. Este gen per-mite trazar un árbol filogenético para M9F1utilizando la base de datos Green Genes(DeSantis et al., 2006). Este análisissugiere que el origen de M9F1 es unabacteria del filo Firmicutes. Posiblementese trata de un Clostridiales relacionado conSyntrophomonas (Sieber et al., 2010). Sinembargo, a excepción de esta región, elresto de M9F1 no presenta homología conninguno de los genomas secuenciados deSyntrophomonas. Por lo tanto, es posible

que el microorganismo no pertenezca auna especie caracterizada.

CONCLUSIONES YRECOMENDACIONES

Este Proyecto planteó como objetivo eldesarrollo de un microorganismo capaz deproducir etanol a partir de biomasa vegetal.Además de ser capaz de degradar lignoce-lulosa y de fermentar etanol, el organismoideal debe tener bajos requerimientos nu-tricionales y adaptarse bien tanto al labo-ratorio como al entorno industrial.

Una estrategia consiste en recurrir agenes y operones conocidos especializa-dos en alguno de estos aspectos e introdu-cirlos en un organismo que se destaque enlas demás capacidades. Por ejemplo,mediante la introducción de genes de celu-lasas (β-glucosidasas, endo- y exo-gluca-nasas) de Aspergillus aculeatus y Tricho-

18 150 COG2707 7.00E-33 Predicted membrane protein

PF04284 8.90E-73 DUF441

19 393 COG2807 3.00E-15 Cyanate permease PF07690 5.60E-33 MFS_1

20 306 COG0583 1.00E-33 Transcriptional regulator PF03466 1.70E-34 LysR_substrate

21 571 COG0507 2.00E-18 ATP-dependent exoDNAse (exonuclease V), alpha subunit - helicase superfamily I member

22 672

23 390 COG1454 1.00E-124 Alcohol dehydrogenase, class IV

PF00465 9.70E-199 Fe-ADH

24 343 COG2267 2.00E-26 Lysophospholipase PF00561 8.90E-06 Abhydrolase_1

25 393 COG3284 3.00E-16 Transcriptional activator of acetoin/glycerol metabolism

PF01590 3.00E-05 GAF

26 503 COG1012 1.00E-145 NAD-dependent aldehyde dehydrogenases

PF00171 7.40E-237 Aldedh

27 236 COG0518 5.00E-37 GMP synthase - Glutamine amidotransferase domain

PF00117 1.00E-12 GATase

28 194 COG2353 2.00E-42 Uncharacterized conserved protein

PF04264 6.90E-60 YceI

Continuación


derma reesei en una cepa de Saccharomy-ces cerevisiae especializada en la produc-ción de vinos se logró que esta últimacreciera en celulosa y produjera hasta2,6% de etanol (Khramtsov et al., 2011).La desventaja con este enfoque es quetoma como punto de partida genes yadescriptos, con sus virtudes y limitacio-nes. La mayor parte de estos genes provie-nen de organismos «cultivables» o quepueden ser crecidos en condiciones delaboratorio. Sin embargo, más del 99% delos microorganismos, que a su vez consti-tuyen el mayor reservorio genético delplaneta, no pueden ser cultivados en ellaboratorio (Rappe y Giovannoni, 2003).

En este trabajo se prefirió una estrate-gia alternativa basada en la metagenómicafuncional para la búsqueda de nuevas enzi-mas lignocelulolíticas. Una de las fortale-zas de este enfoque consiste en identificargenes novedosos que guardan poca o nin-guna similitud con otros ya conocidos(Simon y Daniel, 2009). Se eligieron hábi-tats en los cuales es esperable encontrarcomunidades microbianas especializadasen la degradación de lignocelulosa.

La estrategia de selección permitió iden-tificar al menos 13 clones que demostraronalgún fenotipo relevante frente a glucanos yxilanos. De aquí en adelante el estudio secentró en uno de ellos, el fósmido M9F1,que también tiene la capacidad de soste-ner el crecimiento de la cepa parental deE.coli en un medio mínimo conteniendopapel de filtro como única fuente de carbo-no. La presencia de M9F1 parece promo-ver la liberación de glucosa y celobiosa almedio de cultivo que son los productosesperados de la acción de las exo- y endo-glucanasas, así como de las β-glucosida-sas. De hecho, también se confirmó queM9F1 tiene la capacidad de crecer mejoren celobiosa que la cepa parental.

Para identificar a los genes responsa-bles de estos fenotipos se procedió asecuenciar completamente el inserto me-tagenómico del fósmido M9F1. Tal comose espera del ADN aislado de comunida-des microbianas naturales, la secuenciade M9F1 guarda muy poca homología concualquier secuencia conocida. Si bien elorganismo de origen parece estar empa-rentado con el género Syntrophomonas,ninguno de los genes identificados presen-ta homología con genes de las especies deeste género. En función de su similitud con

Syntrophomonas, es posible que el frag-mento M9F1 provenga de un microorganis-mo anaerobio, Gram-negativo, posiblemen-te con capacidad de esporular (ver tambiénel ORF #3 del Cuadro 2) y con altasdemandas nutricionales. Es posible queestablezca estrechas relaciones sintrófi-cas con otras especies presentes en suambiente lo que podría hacer muy dificulto-so su aislamiento o crecimiento en mediosestériles.

Con respecto a los genes identificadosen M9F1 ninguno de ellos muestra homo-logía con ninguna de las familias de glico-silhidrolasas descritas en la base de datosCAZy (Cantarel et al., 2009) lo que podríasubrayar el carácter novedoso de los ge-nes contenidos en este fragmento. Llamala atención la presencia de un clúster deglicosiltransferasas entre los ORFs 5 y 13(Cuadro 2) que podría jugar algún papel enla degradación de las paredes celulares.Sin embargo, demostrar fehacientementesi son éstos los genes responsables de losfenotipos observados dependerá de estu-dios que están actualmente en curso.

La introducción del fósmido M9F1 enE.coli confirió a esta bacteria la capacidadde utilizar celulosa como única fuente decarbono. Sin embargo, para producir eta-nol en estas condiciones hicieron faltaelementos genéticos adicionales. E.colies capaz de fermentar etanol pero tambiénpuede producir ácido láctico reduciendo elrendimiento del cultivo. Además, E.colitiene un fuerte sistema de represión porcatabolito mediante el cual la presencia deglucosa bloquea tanto el transporte comola utilización de otros azúcares. La cepaLY180 contiene mutaciones en las vías deproducción de lactato y en la represión porcatabolito(Miller et al., 2009). Si bien estacepa es incapaz de producir etanol encondiciones anaerobias utilizando papelde filtro como única fuente de carbono, sípuede hacerlo cuando se le introduce M9F1.Un resultado similar se observó cuando a lacepa parental EPI300 con el fósmido M9F1se le agregó también el plásmido pLOI297que porta genes de Z.mobilis capaces dederivar el flujo de carbono desde el lactatohacia el etanol (Alterthum e Ingram, 1989).

Desde un punto de vista práctico, M9F1confiere a E.coli la capacidad de crecer enuna materia prima abundante y de bajocosto como lo es el bagazo de caña deazúcar. El bagazo y la vinaza son los


principales productos secundarios de laproducción de bioetanol a partir caña deazúcar. El bagazo es el residuo fibroso queconstituye el 12-14% del peso de la cañay es normalmente quemado para la pro-ducción de vapor y energía eléctrica(Nichols et al., 2008). Sin embargo, laconversión de bagazo en etanol permitiríaaumentar su valor entre 2 y 6 veces mejo-rando la ecuación económica de la biorefi-nería (Tuck et al., 2012). El crecimientode E.coli en bagazo como única fuente decarbono es el primer paso para alcanzareste objetivo. Aún queda por determinarcuánto etanol es posible producir a partirde esta materia prima cuando se introduceM9F1 en cepas etanologénicas comoLY180.

Una estrategia alternativa en la que elpotencial de M9F1 debe ser evaluado esformando parte de «consorcios simbióti-cos». En esta estrategia dos o más micro-organismos cooperan para degradar y fer-mentar la materia prima. En estos consor-cios existen microorganismos especiali-zados en la sacarificación de la materiaprima lignocelulósica y también microor-ganismos especializados en la fermenta-ción de los azúcares liberados (Zuroff yCurtis, 2012). La capacidad de M9F1 paraconferir el crecimiento en bagazo abre laspuertas a esta alternativa.

Para que M9F1 pueda utilizarse en elmarco de un proceso industrial es necesa-rio aumentar significativamente los rendi-mientos de etanol obtenidos en este traba-jo. Se debe tener en cuenta que M9F1 esun fragmento de ADN natural. Como tal, noestá optimizado para expresar los genesrelevantes para la degradación de lignoce-lulosa. De hecho, existen otros genes enM9F1 que seguramente no participan deeste proceso. Por lo tanto, un primer pasopara mejorar el rendimiento de la conver-sión de lignocelulosa en etanol es colocarlos genes relevantes en un contexto gené-tico adecuado para maximizar las funcio-nes buscadas. De esta manera, se podrámejorar su expresión y eliminar el materialgenético irrelevante.

En conclusión, además de generar unorganismo capaz de convertir biomasa ve-getal en etanol, el principal beneficio deeste Proyecto ha sido el desarrollo y lavalidación de un proceso basado en lametagenómica funcional que permite obte-ner elementos genéticos novedosos de

potencial aplicación agroindustrial. Esteproceso puede emplearse para mejorar elorganismo obtenido pero también parabuscar funciones metabólicas que viabili-cen otras bio-conversiones relevantes comoser grasas en biodiesel, glicerol en etanol,o vinazas ricas en proteínas en monóme-ros industriales como el estireno.

AGRADECIMIENTOSQueremos agradecer muy especialmen-

te al Dr. Lonnie Ingram y al Dr. IsmaelNieves de la Universidad de Florida enGainesville (EE.UU.) por facilitarnos gentil-mente la cepa LY180 y el plásmido pLOI297así como también permitirnos utilizar suslaboratorios e instalaciones para llevar ade-lante algunos de los estudios que aquí sepresentan. También queremos agradecera la Lic. Daniella Senatore por su apoyotécnico en la construcción de las metage-notecas, a la Dra. Liliana Borzacconi y alM.Sc. Mauricio Passeggi por facilitarnoslas muestras de lodos de los reactoresanaerobios, a la Ing. Betiana Bouzas deFrigorífico Pando por la provisión de mues-tras de rumen y al Ing. Nikolai Guchin deANCAP por proveernos bagacillo de cañade azúcar obtenido del ingenio azucarerode ALUR en Bella Unión (Artigas, Uru-guay). Este trabajo fue financiado por elProyecto INIA FPTA 2007-256. Tambiéncontó con financiación de la Agencia Na-cional de Investigación e Innovación (Pro-yecto FSE 2009-23) y de PEDECIBA-Bio-logía.

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