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LA PRODUCCION DE ENERGIA UTIL EN LA PRODUCCION DE ENERGIA UTIL EN LOS MAMIFEROS: LA FOSFORILACION LOS MAMIFEROS: LA FOSFORILACION

OXIDATIVA MITOCONDRIALOXIDATIVA MITOCONDRIAL

FISICOQUIMICAFISICOQUIMICA

Curso 2004Curso 2004

Clases Teórica 36Clases Teórica 36

Noviembre 17Noviembre 17

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Mecanismo de transducción de Mecanismo de transducción de energía en los animalesenergía en los animales

Los seres vivos son máquinas químicas que utilizan la Los seres vivos son máquinas químicas que utilizan la energía química del ATP para hacer espontáneas a las energía química del ATP para hacer espontáneas a las reacciones endergónicasreacciones endergónicas

La energía química de los sustratos que se oxidan se La energía química de los sustratos que se oxidan se utilizan para la generación de un gradiente utilizan para la generación de un gradiente electroquímico de Helectroquímico de H+ + en la membrana mitocondrial en la membrana mitocondrial

El gradiente electroquímico de HEl gradiente electroquímico de H+ + se utiliza para la se utiliza para la producción de ATP. producción de ATP.

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Las mitocondrias, esas organelas subcelulares

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REGULACIÓN DEL CONSUMO DE OXÍGENO REGULACIÓN DEL CONSUMO DE OXÍGENO MITOCONDRIAL: EFECTO DEL ADPMITOCONDRIAL: EFECTO DEL ADP

El ADP aumenta el El ADP aumenta el consumo de Oconsumo de O22

La relación:La relación: con ADP/sin ADPcon ADP/sin ADP (est. 3/est. 4) (est. 3/est. 4) es denominada es denominada Control RespiratorioControl Respiratorio

El El control respiratorio, control respiratorio, usualmente de 4 a 10,usualmente de 4 a 10, es el índice mas es el índice mas sensible para juzgar la integridad y el acoplamiento mitocondrial sensible para juzgar la integridad y el acoplamiento mitocondrial y, por lo tanto, la calidad de las mitocondrias aisladas. y, por lo tanto, la calidad de las mitocondrias aisladas.

ADP

O2

t

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Consumo de oxígeno = energía biológica

El 95 % del oxígeno consumido se consume en las El 95 % del oxígeno consumido se consume en las mitocondriasmitocondrias

El 99 % del oxígeno consumido por las mitocondrias El 99 % del oxígeno consumido por las mitocondrias es reducido por la citocromo oxidasaes reducido por la citocromo oxidasa

El 100 % del oxígeno consumido por la citocromo El 100 % del oxígeno consumido por la citocromo oxidasa se utiliza para sintetizar ATP por el oxidasa se utiliza para sintetizar ATP por el mecanismo conocido como mecanismo conocido como fosforilación oxidativafosforilación oxidativa

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REGULACIÓN DEL CONSUMO DE OXÍGENO CELULAR

CONCEPTO CONCEPTO CLÁSICOCLÁSICO

ADPADP______________OO2 2 no es limitanteno es limitante[O[O22] celular] celular = 5-30 = 5-30 MM

[O[O22]]0.50.5 para la respiración para la respiración mitocondrial = 0.02-0.3 mitocondrial = 0.02-0.3

MM

NUEVO NUEVO CONCEPTOCONCEPTO

ADPADPOO22

NONO

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REGULACIÓN DEL CONSUMO DE OXÍGENO MITOCONDRIAL

TRES PROTEINAS REGULAN LA RESPIRACION

1. La FLa F11-ATPasa (factor -ATPasa (factor limitante: ADP)limitante: ADP)

2. La mtNOS (produce NO)2. La mtNOS (produce NO)

3. La citocromo oxidasa (factor 3. La citocromo oxidasa (factor limitante:NO/Olimitante:NO/O22))

2 H+

2 H+

2 H+

2 H+

O2

NO

ADP

ATP

NADH

F1-ATPasa

mtNOSCitocromo oxidasa

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Ensayo polarográfico estándar para acoplamiento mitocondrial

ADP

t

O

O2] =0.22 mM

Est. 4b

Est. 3

Est. 4a

La respiración se mide en natg O/min/mg prot.

Respiracion en estado 4a: Respiración controlada, definida por el flujo pasivo de protones a través de la membrana interna.

Respiración en estado 3: Respiración activa, la máxima velocidad fisiológica de consumo de O2 y de síntesis de ATP.

Respiración en estado 4b. Idem 4a. Cuando es mayor que 4a implica activación de la ATPasa mitocondrial por desacoplamiento o exceso de Mg2+.

Control respiratorio (1 y 2): Las relaciones entre las respiraciones en: est. 3/ est.4a y est. 3/ est.4b. Normalmente, de 3 a 7 con succinato y de 4 a 10 con malato-glutamato.

Relación ADP/O: Mide la fosforilación oxidativa. Normalmente, 1.7 con succinato y 2.7 con malato-glutamato.

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Reacciones de los complejos mitocondrialesReacciones de los complejos mitocondriales

ComplejoComplejo Reacción Reacción E°´E°´

II NADHNADH22 => UQ => UQ 260 mV260 mV

IIII Succ => UQSucc => UQ 0 mV0 mVIIIIII UQHUQH22 => cit. c => cit. c 200 mV200 mV

IV cit c => OIV cit c => O22 620 mV620 mV

Las diferencias de potencial eléctrico de mas de 200 mV, Las diferencias de potencial eléctrico de mas de 200 mV, definen los sitios de conservación de energía. definen los sitios de conservación de energía.

Se toma un Se toma un E°´de 0.23 V como potencial operacional E°´de 0.23 V como potencial operacional para la conservación (transducción) de energía. para la conservación (transducción) de energía.

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La cadena respiratoria mitocondrial (2002)

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La cadena respiratoria mitocondrial

NADH2 => Fp(FMN) => UQ => cit bKbT=> cit c,c1=> cit aa3 =>O2

Una serie de moléculas con grupos prostéticos redox Una serie de moléculas con grupos prostéticos redox con potenciales de oxidación crecientes desde el NADHcon potenciales de oxidación crecientes desde el NADH22 (-320 mV) al O(-320 mV) al O22 (+ 820 mV) y (+ 820 mV) y = 1.14 V. = 1.14 V.

La oxidación del NADHLa oxidación del NADH22 por el O por el O22 genera 220 kJ/2 e genera 220 kJ/2 e-- ((G = -nF G = -nF x 96500 x 1.14).x 96500 x 1.14). Las reacciones de transferencia de electrones (óxido-Las reacciones de transferencia de electrones (óxido-reducciones) se realizan a alta velocidad por estar los reducciones) se realizan a alta velocidad por estar los transportadores de electrones incorporados en la transportadores de electrones incorporados en la membrana interna y restringidos en sus movimientos .membrana interna y restringidos en sus movimientos .

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Los potenciales redox (E°´) de los componentes de la cadena respiratoria

NADHNADH22 - 320 mV- 320 mVFMNHFMNH22 - 280 mV- 280 mVFe-S (Complejo I)Fe-S (Complejo I) - 270 mV- 270 mVFADHFADH22 - 10 mV- 10 mVFe-S (Complejo II)Fe-S (Complejo II) 20 mV 20 mVUbiquinol (UQHUbiquinol (UQH22)) 60 mV 60 mVCitocromo bCitocromo bkk 40 mV40 mVCitocromo bCitocromo bT T 190 mV190 mVCitocromo c (+cCitocromo c (+c11)) 230 mV 230 mVCitocromo a+aCitocromo a+a33 380 mV380 mVOxigenoOxigeno 820 mV 820 mV

Los de mas arriba en la tabla reducen a los de mas abajo

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La teoría quimiosmóticamitocondrial(Mitchell, 1965)

NADH O22e-

10 H+

3 H+

ATP ADP

La membrana interna es La membrana interna es impermeable a los Himpermeable a los H++..

La transferencia de electrones La transferencia de electrones en la cadena respiratoria en la cadena respiratoria produce la extrusión vectorial produce la extrusión vectorial de Hde H+ + al citosol. al citosol.

A ambos lados de la A ambos lados de la membrana interna mitocondrial membrana interna mitocondrial se establece un “potencial se establece un “potencial protomotriz” protomotriz” ((p = 60 p = 60 pH + pH + ..

El potencial electroquímico de El potencial electroquímico de los Hlos H+ + determina su pasaje por determina su pasaje por la Fla F11-ATPasa y la síntesis de -ATPasa y la síntesis de ATP.ATP.

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Teoría Quimiosmótica (Mitchell, 1962-1978)

~(2-1) (2-1) = RT ln (= RT ln (aaHH++(2)(2)/ / aaHH++(1)(1) + F. + F.(2-1)(2-1)

Formulación del potencial electroquímico del Formulación del potencial electroquímico del HH+ + en la matriz mitocondrial en la matriz mitocondrial (1)(1) y en el y en el espacio intermembranas (citosol) espacio intermembranas (citosol) (2)(2)

Dividiendo por F, y tomando Dividiendo por F, y tomando p = p = F; y pH = -log F; y pH = -log aaHH++

p = p = + 59 + 59 pHpHLa fuerza protomotriz (La fuerza protomotriz (p), expresa en mV p), expresa en mV

(normalmente 220 mV) el potencial electroquímico (normalmente 220 mV) el potencial electroquímico del Hdel H++ que es utilizado en la síntesis endergónica de que es utilizado en la síntesis endergónica de

ATP a partir de ADP y Pi. ATP a partir de ADP y Pi.

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H+

~

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La teoría quimiosmótica: La teoría quimiosmótica: p = p = + 59 + 59 pHpHDeterminación experimentalDeterminación experimental

Determinación de Determinación de p en mitocondrias en p en mitocondrias en estado de reposo (estado 4)estado de reposo (estado 4)

pp 60 60pHpH

220 mV 50 mV 170 mV220 mV 50 mV 170 mV

En mitocondrias respirando, el pH de la matriz En mitocondrias respirando, el pH de la matriz 8.0, 8.0, para un pH del citosol para un pH del citosol 7.27.2

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Consideraciones energéticas para cada sitio de Consideraciones energéticas para cada sitio de conservación de energía (1)conservación de energía (1)

G° = - n . F. G° = - n . F. E°E°para 2 epara 2 e- - (reacción redox) y H(reacción redox) y H++ (F (F11-ATPasa)-ATPasa)

G° = - 2 x 96500 x 0.23 = - 44.3 kJ/2 HG° = - 2 x 96500 x 0.23 = - 44.3 kJ/2 H++

ADP + Pi ==> ATP ADP + Pi ==> ATP G°´ = 32.6 kJ/molG°´ = 32.6 kJ/mol

Reacción redox (Reacción redox (E°´= 0.23 V) E°´= 0.23 V) G°´ = - 44.3 kJ G°´ = - 44.3 kJ Reacción total acoplada Reacción total acoplada G° = - 10.8 kJ/molG° = - 10.8 kJ/mol

Eficiencia (química redox /química fosforilación): Eficiencia (química redox /química fosforilación): 32.6/44.3 = 74 %32.6/44.3 = 74 %

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ADP + Pi ATP G = 32.6 kJ

El flujo de H+ por dentro de la proteína de la F1-ATPasa (un rotor molecular) produce la síntesis de

ATP a partir de ADP y Pi

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(1) La reacción redoxNADH2 + ½ O2 => NAD + ½ H2O G = - 220 kJ

E = 0.82 ( 0.32) = 1.14 VG = n . F . x 96500 x 1.14) = 220 kJ

(2) La fuerza protomotriz (el potencial electroquímico del H+)

220 mV (medido); para 10 H+) G = n . F . x 96500 x 0.22) = 212 kJ

Eficiencia (p / E) = 212 /220 = 96 %

(3) La síntesis de ATP ADP + Pi => ATP G = 32.6 kJ

para 3 H+ por vuelta del rotor de la F0 G = n . F . x 96500 x 0.22) = 63.7 kJ

Eficiencia = 32.6/ 63.7 = 51 %

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FRACCION DE LA MASA MITOCONDRIAL EN FRACCION DE LA MASA MITOCONDRIAL EN ESTADOS 4 Y 3 EN ORGANOS PERFUNDIDOSESTADOS 4 Y 3 EN ORGANOS PERFUNDIDOS

--- Consumo de oxígeno ------ Consumo de oxígeno --- Mitocondrias Organo Contenido de Fracción de Mitocondrias Organo Contenido de Fracción de

est. 4 est. 3 perfundido mitocondrias mitocondrias est. 4 est. 3 perfundido mitocondrias mitocondrias (nmol O(nmol O22/min/ (/min/ (mol Omol O22/min/ (mg prot.//min/ (mg prot./ est. 4 est. 3 est. 4 est. 3

mg prot.) g órgano) g órgano) ---- ( % ) ----mg prot.) g órgano) g órgano) ---- ( % ) ----

HígadoHígado 1010 8888 1.3 1.3 35 35 65 65 35 35

Corazón Corazón 28 13528 135 3.1 3.1 53 53 72 72 28 28

La fracción de mitocondrias en estado 3 (x), se calcula de: Consumo del La fracción de mitocondrias en estado 3 (x), se calcula de: Consumo del órgano/contenido de mitocondrias = (1-x) est. 4 + (x) est. 3órgano/contenido de mitocondrias = (1-x) est. 4 + (x) est. 3

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REGULACIÓN DEL SUMINISTRO DE OXÍGENO POR EL ÓXIDO NÍTRICO. 1. El efecto vasodilatador.

El NO generado por la eNOS del endotelio vascular activa a la GMP El NO generado por la eNOS del endotelio vascular activa a la GMP ciclasa del musculo liso, aumenta el cGMP, y produce vasodilatación. ciclasa del musculo liso, aumenta el cGMP, y produce vasodilatación. El aumento del diámetro de los vasos, permite un mayor tiempo de El aumento del diámetro de los vasos, permite un mayor tiempo de equilibración y aumenta la liberación de Oequilibración y aumenta la liberación de O22 de la HbO de la HbO2 2 a los tejidos.a los tejidos.

Premio Nobel de Fisiología y Medicina 1998 a Forschgott, Murad e Premio Nobel de Fisiología y Medicina 1998 a Forschgott, Murad e Ignarro “por su descubrimiento del papel de mensajero intercelular del Ignarro “por su descubrimiento del papel de mensajero intercelular del NO en el sistema cardiovascular”NO en el sistema cardiovascular”

NO

Mensajero intercelular

Vasodilatación endotelio-músculo liso

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REGULACIÓN DEL CONSUMO DE OXÍGENO POR EL ÓXIDO NÍTRICO. 2. Inhibición de la citocromo oxidasa por nhibición de la citocromo oxidasa por

el NOel NO

Inhibición competitiva con el OInhibición competitiva con el O22: depende de la relación O: depende de la relación O22/NO /NO 150 O150 O2 2 = 1 NO= 1 NO

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Competición en el centro activo de la citocromo oxidasa

N = O

O = O CuB+ Fe2+

Hemo a3

Proteína

CuB+ Fe2+

Hemo a3

Proteína

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OXIDO NITRICO SINTASA OXIDO NITRICO SINTASA MITOCONDRIAL (mtNOS): MITOCONDRIAL (mtNOS): el descubrimientoel descubrimiento

La actividad de mtNOS, determinada como La actividad de mtNOS, determinada como producción de NO, fue original y producción de NO, fue original y simultáneamente observada en mitocondrias de simultáneamente observada en mitocondrias de hígado de rata por Ghafourifar y Richter (1997) hígado de rata por Ghafourifar y Richter (1997) y por Giulivi, Poderoso y Boveris (1998).y por Giulivi, Poderoso y Boveris (1998).

Previamente se había informado la existencia Previamente se había informado la existencia de una proteína mitocondrial reactiva con de una proteína mitocondrial reactiva con anticuerpos anti-eNOS (Kobzik et al. (1995) y anticuerpos anti-eNOS (Kobzik et al. (1995) y Bates et al. (1995; 1996Bates et al. (1995; 1996).

mtNOS

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LA ACTIVIDAD FUNCIONAL DE LA mtNOS EN LA LA ACTIVIDAD FUNCIONAL DE LA mtNOS EN LA REGULACION DE LA RESPIRACION DE MITOCONDRIAS DE REGULACION DE LA RESPIRACION DE MITOCONDRIAS DE

HIGADO DE RATA. HIGADO DE RATA. Efectos del sustrato (arginina) y de un inhibidor (NMMA).Efectos del sustrato (arginina) y de un inhibidor (NMMA).

Respiración en estado 3 Respiración en estado 3 (ng-at (ng-at O/min.mg prot.) O/min.mg prot.) (%)(%)

+ malato-glutamato con ADP + malato-glutamato con ADP 113113 84 84 (a) id. + 0.3 mM arginina(a) id. + 0.3 mM arginina 101101 75 75 (b) id. + 1 mM NMMA(b) id. + 1 mM NMMA 135 135 100 100

Actividad functional de la mtNOS (b-a)Actividad functional de la mtNOS (b-a) 34 34 25 25

+ succinato con ADP + succinato con ADP 178178 8787id. + 0.3 mM argininaid. + 0.3 mM arginina 160160 78 78 id. + 1 mM NMMAid. + 1 mM NMMA 205 205 100100

Actividad functional de la mtNOS (b-a) 45 22Actividad functional de la mtNOS (b-a) 45 22