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CADENA RESPIRATORIA Y FOSFORILACIÓN OXIDATIVA

1) Indique si las afirmaciones hechas a continuación son verdaderas o falsas.a) La respiración puede ocurrir sólo en presencia de O2. b) El dispositivo molecular para la respiración se encuentra sólo en las células

eucariotas.c) Las proteínas transportadoras de electrones que tienen FAD como grupo

prostético se denominan citocromos.d) La relación P:O es igual a 2,5 para el FADH2 en la mitocondria.e) El amital bloquea la formación del ATP de la oxidación del isocitrato, pero

no de la del succinato. f) En presencia de un desacoplante la energía obtenida del transporte de

electrones se disipa como calor.

2) La inyección de dinitrofenol a una rata produce un aumento inmediato en su temperatura corporal. ¿Puede explicar por qué?

3) Un laboratorio farmacéutico le envió a usted muestras de dos nuevos compuestos metabólicos para caracterizarlos como posibles antibióticos. Utilizando una preparación aislada de mitocondrias de hígado e incubada con piruvato, O2, ADP, y Pi, usted observa que la adición del compuesto "A" bloquea tanto el transporte de electrones como la fosforilación oxidativa. Cuando agrega el compuesto "B" además del "A", observa con sorpresa que se restablece el transporte de electrones pero no la fosforilación oxidativa. a) ¿Cómo clasificaría estos compuestos teniendo en cuenta su modo de acción en el transporte de electrones y la fosforilación oxidativa? b) Nombre un par de sustancias conocidas que podrían dar el mismo resultado.

4) Se prepararon mitocondrias y se determinó el consumo de O2 en 0,2 ml de la preparación en estado 4, en estado 3 y desacoplado, en presencia y en ausencia de una sustancia M (ver tabla). Indique qué tipo de inhibidor es M y justifique su respuesta.

CONDICIÓN SUSTANCIA M (nM)

CONSUMO DE 02 (moles de át O/min)

ESTADO 4 0 11ESTADO 4 0,5 4ESTADO 3 0 80ESTADO 3 0,5 30

DESACOPLADO 0 85DESACOPLADO 0,5 33

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5) Cuatro transportadores: a, b, c y d, cuyas formas reducidas y oxidadas pueden ser distinguidas espectrofotométricamente, se requieren para la respiración en un sistema de transporte de electrones bacteriano. En presencia de sustrato y oxígeno, tres inhibidores diferentes bloquean la respiración, obteniéndose los patrones de los estados de oxidación que aparecen en la Tabla. ¿Cuál es el orden de los transportadores en la cadena desde los sustratos hasta el oxígeno?

Tabla: Efecto de los inhibidores sobre los niveles de oxidación de los transportadores en una vía hipotética de transporte de electrones (+ y - indican las formas totalmente oxidadas y reducidas, respectivamente).

INHIBIDOR a b c d1 + + - +2 - - - +3 + - - +

6) a) Se determinó (en presencia de distintas concentraciones de una sustancia "A" y "B") la velocidad de consumo de oxígeno en mitocondrias intactas en las siguientes condiciones: estado "3", estado "4" y en presencia de un desacoplante. El sustrato empleado fue malato-glutamato. Los resultados se grafican abajo. Indique si las sustancias "A" y “B” son inhibidores de la síntesis de ATP, de la cadena respiratoria o desacoplantes. Justifique brevemente.

b) Se estudió el efecto de distintas concentraciones de una sustancia "C" y "D" (inhibidores del transporte de electrones) sobre el consumo de oxígeno en partículas submitocondriales utilizando como sustrato: NADH, succinato y ascorbato + tetra metil p fenilen diamina (TMPD). Precise lo mejor posible el lugar de acción de la sustancia "C" y "D" en la cadena respiratoria. Justifique brevemente.

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7) Una suspensión de mitocondrias consume 24 µmol O2/min en presencia de malato y glutamato. Al agregar 2,8 mmoles de ADP y Pi en exceso el consumo se acelera a 211 µmol O2/min durante 3 min para luego retornar a la velocidad inicial. Explique a qué se debe la aceleración transitoria del consumo de oxígeno y calcule el control respiratorio e índice P/O. Explique cómo afectaría un inhibidor de la transferencia de energía la velocidad de consumo de oxígeno y el índice P/O.

8) Usted realizó una serie de experimentos con partículas submitocondriales en donde midió síntesis de ATP, consumo de oxígeno y diferencia de pH. El medio de reacción contenía, además de las partículas, ADP, Pi y NAD, una serie de agregados, los cuales se indican al final del enunciado. Los resultados fueron elaborados por un compañero suyo, quién para comprobar sus conocimientos sobre el tema se los entregó en forma desordenada. ¿Es usted capaz de ordenarlos? Hágalo.SINTESIS DE ATP (µmol/h.mg proteína):30; 0; 0; 30; 20; 0; 10; 0; 0; 0; 0; 20; 30; 0; 0.CONSUMO DE O2 (µmol/h.mg proteína):0; 5; 5; 0; 5; 12; 2; 5; 5; 12; 0; 0; 2; 5; 0.DIFERENCIA DE pH:0; 0; 1,5; 1; 1; 0; 0; 1; 1,5; 0; 0; 1; 0; 1; 1.AGREGADOS:A) IsocitratoB) Isocitrato + isocitrato deshidrogenasaC) B + -cetoglutarato deshidrogenasa + CoAD) B + rotenonaE) C + succinil CoA sintetasa + GDP + rotenonaF) D + 2,4-dinitrofenolG) E + oligomicinaH) E + 2,4-dinitrofenolI) NADHJ) NADH + amitalK) J + succinatoL) K + malonato

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M) L + ascorbato-TMPDN) M + oligomicinaO) N + 2,4-dinitrofenol

9) El gráfico muestra el trazado obtenido en un oxígrafo al incubar partículas submitocondriales a 30°C, en un medio a pH: 7,5. Caracterice cada uno de los compuestos agregados (A, B, C, etc.). Justifique brevemente el efecto de cada compuesto sobre la velocidad de consumo de O2.

10) Se agregaron 0,1 ml de una suspensión conteniendo partículas submitocondriales (con una concentración de proteína de 5 mg/ml) a 2,9 ml de una solución amortiguadora (pH 7,2) en una cubeta termostatizada de un oxígrafo. Las medidas de consumo de oxígeno obtenidas ante el agregado de diferentes compuestos se muestra en el gráfico adjunto. En base a estos datos: a) Calcule la velocidad de consumo de O2 en cada caso, expresándola en µmol/min.mg de proteína. b) Calcule el índice P/O. c) Caracterice lo mejor posible a los compuestos X, Y, Z y A. d) ¿Qué velocidad de consumo de O2

esperaría medir si a los 3,9 minutos (flecha en línea de puntos) se agregara nuevamente ADP y Pi (iguales cantidades que anteriormente)? ¿Durante cuánto tiempo? e) ¿Puede decir en qué estado estaban las partículas a tiempo cero?

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Tiempo (min)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

[O2]

(mM

)

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

2 µl Z

2 µl A

2 µl X

2 µl Y

5 µl ADP (65 mM)+ 3 µl Pi (75 mM)

RESPUESTAS1) a) F b) F c) F d) F e) V f) V 2) Porque se disipa el gradiente de protones como calor.3) A: inhibidor de la F1-ATPasa (oligomicina); B: desacoplante (dinitrofenol)4) inhibidor de la cadena de transporte de electrones5) c b a d6) a) A: inhibidor de ATPasa; B: inhibidor de cadena de transporte de electrones b) C: inhibidor sitio 1; D: inhibidor sitio 27) Aumenta el consumo de O2 al agregar ADP y Pi (pasa de estado 4 a 3) C.R.= 7,42 P:O= 2,58) A) 0 0 0 B) 30 5 1 C) 30 5 1 D) 0 0 0 E) 20 5 1 F) 0 0 0 G) 0 2 1,5 H) 0 12 0 I) 30 5 1 J) 0 0 0 K) 20 5 1 L) 0 0 0 M) 10 5 1 N) 0 2 1,5 O) 0 12 09) A: NADH. B: ADP. C: rotenona. D: succinato. E: oligomicina. F: DNF. G: antimicina. H: ascorbato+TMPD. I: CN,CO, F-, N3

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10) a) 0,024; 0,3; 0,024; 0,51; 0; 0,54 b) 1,5 c) X-succinato, Y-desacoplante, Z-antimicina, A-ascorbato+TMPD d) no se vería efecto. Prácticamente no hay oxígeno. e) estado 1.

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Modelo quimiosmótico

Relación entre potenciales de óxido-reducción y energía libre en la cadena respiratoria mitocondrial.

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Sitios de acción de inhibidores en la cadena respiratoria mitocondrial.

Desacoplante 2,4 dinitrofenol. Tiene un protón disociable y es muy hidrofóbico. La carga negativa está deslocalizada en toda la molécula permitiendo su solubilidad en la membrana. El DNP toma protones del espacio intermembrana, atraviesa la membrana interna mitocondrial y disipa el gradiente de protones.

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Lanzadera del glicerofosfato

Lanzadera del malato-aspartato

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Grupos prostéticos de citocromos. El Fe-protoporfirina IX se encuentra en citocromos b, hemoglobina y mioglobina. Los hemos A y C se encuentran en citocromos del mismo nombre. Obsérvese el sistema de dobles enlaces conjugados que permiten detectar a las proteínas que los poseen por su absorción en el visible.

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