Foodómica, herramienta para el estudio de componentes bioactivos

de alimentosLluís Arola Ferrer

CTNS-URV

2Big science at the table, Lucas Laursen, NATURE | VOL 468 | 23/30 December 2010

Ideas

Componentes bioactivos de los alimentos como señales celulares

Biomarcadores

3

4

TranscriptomicsTranscriptomics

ProteomicsProteomics

MetabolomicsMetabolomics

Non‐hypothesis driven

High throughput

NOISY

MASSIVE DATA!

OMICS Integration???

GenomicsGenomics

5

The term nutrigenomics was coined ten years ago to describe a branch of nutrition and food research that applies new profiling techniques for transcripts, proteins and metabolites to better understand the interplay of the genome with its nutritional environment. In this respect, nutrigenomics is still in its infancy and it will need time until it really delivers what was hoped. Although all technologies are attractive to use and promise to deliver huge data sets with new insights into mechanisms for dietary adaptation, we have learned that it is not trivial to collect the data and it is even more difficult to analyze and extract meaning from them. Although the number of nutrigenomics studies is rapidly growing, most applications are still of descriptive nature. Technologies are maturing but reproducibility and robustness are still in need of improvement.

In contrast, nutrigenetics with SNP or haplotype analysis is more easily performed is highly accurate and robust from a technological perspective. Genetic variations in numerous genes can be associated with disease risks and susceptibility, although each SNP alone may have only a minor impact. However, each individual’s susceptibility can be modulated by diet and this forms one of the conceptual lay-outs for nutritional requirements on an individual level. It can be predicted that future studies will employ all combinations of the different nutrigenomics techniques in the same study and including comprehensive genotyping of the volunteers. Yet, it can also be foreseen that huge knowledge gaps remain in the understanding of human nutrition and physiology.

6

Genomics Genomics 

TranscriptomicsTranscriptomics

Proteomics Proteomics 

MetabolomicsMetabolomics UntargetedNon‐hypothesis‐driven

TargetedHypothesis‐driven

TargetedHypothesis‐driven

TargetedHypothesis‐driven

Hypothesis‐driven Omics Integration Bottom‐up Omics Integration

7

FLAVONOIDES

J Am Diet Assoc. (2010) 110:390-8

60,1%

Total oligómeros + polímeros

10,3 %

Total monómeros

Oligomers and polymers

8

ALIMENTOS RICOS EN FLAVANOLES

USDA Database for the Proanthocyanidin Content of Selected Foodshttp://www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/Data/PA/PA.html

mg/100g edible portion

mg/100g edible portion

9

EFECTOS BIOLÓGICOS DE LAS PROANTOCIANIDINAS

Estudios epidemiológicos

Reducción de la mortalidad por causas cardiovasculares

Reducción en la incidencia de determinados tipos de cáncer

Estudios de intervención, con animales o in vitro

Antioxidantes

Antiinflamatorios

Anticancerígenos

Hipolipidémicos

Antidiabéticos

Hipotensores

Antimicrobianos

etc.

10

Un numero sorprendente de fitoquímicos de la dieta interaccionan con reguladores clave de la fisiología de los mamíferos promoviendo beneficios de salud.

¿QUÉ SENTIDO BIOLÓGICO TIENE?

Xenohormesis: Sensing the Chemical Cues of Other SpeciesKonrad T. Howith and David A. Sinclair; Cell, 133, 387-391, 2008

11Xenohormesis: Sensing the Chemical Cues of Other SpeciesKonrad T. Howith and David A. Sinclair; Cell, 133, 387-391, 2008

12

¿No tan solo los fitoquímicos?

13

VÍAS DE SEÑALIZACIÓN

EXPRESIÓN GÉNICA

DIETA

CRECIMIENTO CELULAR NORMAL

FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN

Destino y actividades de los nutrientes en la célula

microRNA

INGREDIENTES

Zn

MODULACIÓN HEMOSTASIS

NUTRIENTES

14

Componentes bioactivos de los alimentos como señales celulares

Aproximación ómica

Tratamiento crónico de ratas normales con proantocianidinas de pepita de uva

Tratamiento crónico de ratas obesas con proantocianidinas de pepita de uva

Interacción proantocianidinas con ligandos

Factores de transcripción

microRNA

Zn

15Br. J. Nutr. 2010; 103: 944–952

GSPE

OHO

OH

OH

OH

OH

HO

OH

O

OH

OH

OH

HO

OH

O

OH

OH

OH

n

16

14 h ayuno

Sonda oral 2,5 ml manteca/kg

peso + 0, 5 o 

25 mg

GSPE/kg

peso

3h

SacrificioHÍGADO

Administración crónica de GSPE durante 21 días2 ml leche condensada /kg

peso + 0, 5

o 25

mg

GSPE/kg

peso

Vehiculo

+ GSPEVehiculo

Ratas Wistar

Agilent

Microarrays

RMN

TRANSCRIPTÓMICA

METABOLÓMICA

Aproximación ómica ADMINISTRACIÓN CRÓNICA GSPE

17

235

5 mg/kg

83

25 mg/kg

28

55

3547

82

138

97

Cambios significativos de expresión

Aproximación ómica TRANSCRIPTÓMICA NO DIRIGIDA

RELEVANCIA BIOQUÍMICA:

Ciclo celular

Ensamblaje proteico

Apoptosis

Metabolismo lipídico

Inflamación

Señalización celular

18

14 h ayuno

Sonda oral 25 mg

GSPE/kg

peso

3h

SacrificioHÍGADO

Administración crónica 

de GSPE durante 10 días2 ml leche condensada 

/kg

peso + 25 mg

GSPE/kg

peso

Vehiculo

+ GSPEVehiculoRatas Wistar

nLC asociada a LTQ-Orbitrap

PROTEÓMICA

15 semanasDieta de cafeteria

ad libitum

Aproximación ómica GSPE CRÓNICA EN OBESIDAD

19

Aproximación ómica PROTEÓMICA NO DIRIGIDA

A.HFD induce síndrome metabólico y activa glicogénesis, glucólisis y síntesis de AG y TAG

B.HFD y administración de 25mg/kg peso de GSPE durante 10 días, revierte la situación

Molecular & Cellular Proteomics, 2010, 9, 1499

20J. Nutr. Biochem., 2011; 22, 380

Aproximación ómica DIRIGIDA

21

CDCA

SHPFXR + SHP

SREBP1

+

Lipid synthesis

-

-

Proantocianidinas

VLDL

Interacción con ligandos: FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN

Mol Nutr Food Res. 2009; 53: 805Int. J. Obes. 2009; 33:1007Mol. Nutr. Food Res.; 2010, 54: 37

22Free Rad. Res. 2011; 45: 611

Interacción con ligandos: FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN

23

pY

pY

pY

pY

pY

pY

PI-3-quinasa

IRS 1/2

p85

p110

pY

GLUT-4

Gluc

Gluc

W t i

SB 203580

p38-MAP quinasa

GLUT-4

pReceptorde Insulina

Insulina

Proantocianidinas

Endocrinology 2004; 145:4985

J. Nutr. Biochem. 2010; 21: 476

Interacción con ligandos: FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN

24

Tratamiento células HepG2 con:

Extracto pepita de uva (100 mg/l)

Extracto de cacao (100 mg/l)

Epigalocatequina galato (50 mg/l)

Array microRNA

Interacción con ligandos: microRNA

0,1 % DMSO (Control)0,1 % DMSO + different treatments

5h treatment Total RNA extraction

HepG2 cells

miRNA-specific reverse- transcription (Applied Biosystems)

25PLoS ONE, 2011; 6 (10), e25982

Interacción con ligandos: microRNA

Explica muchos cambios inducidos por las proantocianidinas

La FAS es una de sus dianas

26

Tratamiento células HepG2 con:

Extracto pepita de uva (150 mg/l)

Array

Interacción con ligandos: Zn

Control5M Zn

12h treatment

Total RNA extraction

HepG2 cells

La expresión de los genes de la metalotioneina y de los transportadores de Zn de las familias ZnT y ZIP está fuertemente modificada por acción del extracto de proantocianidinas.

27

Núcleo

wwwwwwwwwwwwwwww

GolgiCitoplasma

Mitocondrias

´Retículo

endoplásmico

Alb ZIP1

ZnT5

ZnT1

ZIP7

ZIP7

Metalo-

tioneína

Apo-

tioneína

Metalo-

tioneína

G-SZn

G-SH

MTF1

MTF1

MTs ZnT1 ɣGCS

MTF1

Apo-

proteínas

Zn-Metalo-

proteínas

Zn-Metalo-

proteínas

Proteínas

sin Zn

Zn2+

lábilnM ZnT10

ZnT6

ZnT7

ZnT5

ZnT6

ZnT7ZIP4

ZIP6

ZIP10

ZIP13

Zn-Metalo-

proteínas

Zn2+

lábilnM

Zn2+

Zn2+

TOTALμM

Zn2+

TOTALμM

Conjunto de efectos similares a los de quelantes

extracelulares de Zn

J. Nutr. Biochem., 2011; 22, 153–163

28

Biomarcadores

BIOCLAIMS will provide BIOmarkers of Robustness of Metabolic Homeostasis for Nutrigenomics-derived Health CLAIMS Made on Food

Development of an in vivo model of dyslipidemia

Detection of early biomarkers of dyslipidemia

29

Basal Estrés

Señal amplificada

FríoAyunoInfecciónO2PresiónEjercicioXenobióticosDaño tisularDaño DNAFFsDietasD.Hiperprot.Dieta GrasaEstrés cognit.Inflamación…

30

Development of an in vivo model of dyslipidemia

GOLDEN SYRIAN HAMSTERS

Suitable model 

for 

cholesterol and 

lipoprotein 

studies: 

common 

metabolic features with humans: 

‐Low rate of hepatic cholesterol synthesis

‐Substantial 

amount 

of 

cholesterol 

are 

transported 

in 

LDL

when 

the diet contains cholesterol

‐Bile acid synthesis is not activated by dietary cholesterol

‐Receptor‐dependent and independent uptake of LDL

exist

‐The liver produces exclusively ApoB

100 isoform

31

High fat diet: BCD + lard instead of wheat starch (21% energy from fat) + 0.1% cholesterol

Bioclaims control diet (BCD):10% energy from fat (sunflower, flaxseed and coconout oils)

Sacrifice (after 5h of fasting):•Biometric parameters: body weight, adiposity and liver weight•Blood parameters: TG, CHOL, lipoprotein profile, phospholipids, glucose, insulin, leptin•Tissues collection: brown and white adipose tissue, liver, brain, kidney, muscle…•PBMC isolation: RNAm isolation for transcriptomics•Plasma collection: metabolomics

30d4d 15d

-

Dyslipidemia

degree +

Control diet

High

fat

diet

4d

Males12‐week‐old

Development of an in vivo model of dyslipidemia

32CONTROL

HIGH

FAT

050100150200250300

Triglyceride

s(m

g/dL) Plasma triglycerides

0 4 15 30Time (days)

*

Plasma cholesterol

100

150

200

250

300

Cholesterol(mg/dL)

0 4 15 30

Time (days)

** *

0 4 15 30

Plasma phospholipids

200

250

300

350

400

450

Phosph

olipids(m

g/dL)

Time (days)

* *

* vs

control animals

(Student’s

t‐test, p<0.05)

Development of an in vivo model of dyslipidemia

Chol HDL / Chol LDL

0

1

2

3

4

0 4 15 30

ratio

*

**

Time (days)

33

Light

Dyslipemia

degree

DyslipidemicControl (Healthy) Moderate

TRANSCRIPTOMIC

ANALYSIS

(microarrays)

METABOLOMICANALYSIS

(HPLC‐MS)

PBMC

PLASMA

ONLY

2800 GENOMIC

SEQUENCES

OF

HAMSTER

IN NCBI

ONLY

2800 GENOMIC

SEQUENCES

OF

HAMSTER

IN NCBI

HAMSTER

MICRROARRAY

NOT

AVAILABLE

HAMSTER

MICRROARRAY

NOT

AVAILABLE

DEVELOPMENT

OF

HAMSTER

MICROARRAY

DEVELOPMENT

OF

HAMSTER

MICROARRAY

?

Detection of early biomarkers of dyslipidemia

34

DEVELOPMENT

OF

HAMSTER

MICROARRAYDEVELOPMENT

OF

HAMSTER

MICROARRAY

Total RNA

isolation

(CTNS)

mRNA

sequentiation

(CRG)

(pool of

different

tissues: blood, liver, brain, WATs, iBAT, spleen, muscle, kidney…)

(PolyA+ selection, transcription

(cDNA) and

sequentiation

Illumina

Genome

Analyzer

IIx

Sequence

indentification

(qGenomics

and

CTNS)

De novo sequence

assembly

(qGenomics

and

CTNS)

40000

identified sequences matching 16600

different 

genes+111000 sequences not identified (yet)

1,4x106

sequences

(contigs)

Probe

design

(qGenomics

and

CTNS)

Microarray

design

and

validation

(qGenomics

and

CTNS)

Blast against Human, 

Mouse and  Rat RefSeqs

allowed the identification 

and optimization of the 

sequences

Detection of early biomarkers of dyslipidemia

35

METABOLOMICS ANALYSIS: Set up of

the

LC‐MS analysis

in plasma samplesMETABOLOMICS ANALYSIS: Set up of

the

LC‐MS analysis

in plasma samples

Extraction

of

metabolites

from

100 μL of

plasma. MS detector: time of flight (TOF)

Analysis

of

data 

by 

means

of

the

XCMS

software. 

XCMS

provides

methods

for

feature

detection, 

non‐linear retention

time alignment, visualization, relative

quantization

and

statistics

and

is

capable

of

simultaneusly

analyzing

and

visualizing

the

raw

data from

hundreds

of

samples.

Ionization: Electrospray

(ESI) in both

positive and

negative

modes

Detection of early biomarkers of dyslipidemia

36

EQUIPO INVESTIGADOR

INVESTIGADORES

A. Ardèvol

A. Arola

L. Arola

C. Bladé

M. Blay

J. Fernández

S. García

M. Mulero

B. Muguerza

M. Pinent

G. Pujades

A. Romeu

J. Salvadó

TÉCNICAS

I. Baiges

V. Grifoll

N. Llópiz

Y. Tobajas

PRE-DOC

L. Baselga

E. Casanova

A. Castell

L. Cedó

A. Ceretò

H. Dabbagh

A. Fernández

R. Gordillo

N. González

L. Guerrero

M. Margalef

N. Martínez

M. Ojeda

V. Pallarés

A. Ribas

C. Rojas

POST-DOC

M. Quiñones

M. Suárez

ESTUDIANTES

K. Acosta

Z. Pons