fcd542e

Profesor Patrocinante

Dra. Marcia Costa L.

Instituto de Ciencia y Tecnología de los

Alimentos

Facultad de Ciencias Agrarias.

Extracción, caracterización parcial y determinación de propiedades

fisiológicas in vitro de fucoidina y laminarina a partir de Macrocystis

pyrifera y Durvillaea antarctica.

Tesis de Grado presentada como parte de

los requisitos para optar al grado de

Licenciado en Bioquímica y Título

Profesional de Bioquímico.

OSCAR OLIVER DÍAZ ROLDÁN

VALDIVIA – CHILE

2014

“Solo en las condiciones de mi vida diaria,

puedo estudiar donde yacen mi fuerza y mi debilidad.” Gurdjieff

AGRADECIMIENTOS

A mis padres y abuelos, que con su esfuerzo, crianza, valores, paciencia, amor y cariño, han

concebido en mi, parte de sus anhelos, pero por sobre todo, me han regalado unas grandes alas e

imaginación, para llegar lo más lejos que Dios y el destino me permitan en esta vida (humanamente

hablando).

A mis hermosos cachorros, Johny, Tomás y Gaspar, que más que simples animales, son

unos incondicionales y fieles amigos, que fecundan mi casa con alegría y son considerados como

miembros de mi familia.

A mis machos alfa (algunos no tanto) por los vacilones vividos, historias indignas e

irreproducibles, pero por sobre todo, hermandad incondicional; Pablosky, Jano, Gonzalo Iván,

“MatuSaint”, Adolfo, “abuelin” y Andrés.

No puedo dejar de mencionar además a, Lisette Yañez, Paulina Figueroa, Daniela Ampuero,

Leo Castro, Seba González, Javito Aguinaga, Pamela Burdiles, Polin Lobos, Andrea Foitzich,

Silvia Sánchez, Claudia Fuentealba, Eduardo Maureira, Claudia Roa y los “cabros del baby”.

Gracias a todos ustedes, por los agradables momentos vividos y las buenas vibras de siempre.

A mis compañeros de laboratorio, Alexandra González, Toña Sepúlveda, Yoli García y

Francisco Palma. A tesistas como, Vicky López, Karin Milling, Marta Muñoz, Gabriela, Fernando

Quezada y Olga García. A personal del Instituto, como Don Otto, Don Tito, Paula Pozo, Susana

Agüero y Erwin Ojeda. Gracias a todos, por su disposición, risas, sugerencias o facilitando material

de trabajo (…) gracias de corazón.

A mis compañeros de la carrera de Bioquímica, Jorge Torres, Cristián Marchant, Rodrigo

Sandoval, Agustín Barría, Rodrigo Carrasco, Paulina Ferrada, Magdalena Esparza, Javiera

Campos, Consuelo Geoffroy, y Vanesa Muñoz. Gracias por todo el transcurso y por esas horas de

estudio en los primeros años. Donde quiera que estén, mucha suerte a todos en sus futuros

proyectos.

A Andrea, por su apoyo y consejos incondicionales, sin duda, un pilar fundamental en los

últimos años de mi vida. Con cariño y agradecido eternamente por todo lo vivido junto a ti.

Al Profesor Dr. Patricio Godoy e Instituto de Microbiología Clínica, por su ayuda en el

desarrollo de la sección antifúngica de esta tesis, la paciencia y disposición a enseñar; muchas

gracias. No puedo dejar de lado a mis compañeras en este pasaje, Vanesa y Yoli.

A la Sra. Gloria Muñoz, QF del Hospital Base Valdivia, por su ayuda en la sección

antimicrobiana de esta tesis.

A la Profesora QF Claudia Oróstegui, por su apoyo y disposición a formar parte de este

trabajo de tesis, muchas gracias.

A mis profesoras de internado hospitalario, QF Ximena Lagos, QF Ingrid Navarrete, y QF

Eliana Sánchez, por facilitarme tiempo para dedicar al proceso terminal de titulación. A su vez, a

mis compañeros de internado perteneciente a la carrera de Química y Farmacia, Mackarena A,

Francisco A y Andy A, muchas gracias.

A los profesores, Dra. Marcia Costa, Dr. Ociel Muñoz y Prof. Mariela Horzella, por su

disposición a ayudar y corregir mis errores. Atentamente muchas gracias.

Finalmente a Francisca, por toda la ayuda brindada en la última parte de este trabajo de

tesis, por ser la mujer que eres, y por ser sinónimo de una nueva etapa en mi vida. Miles de gracias.

Este trabajo fue realizado en la Universidad Austral de Chile y fue financiado por el

proyecto FONDEF DOi 1095.

i

INDICE GENERAL

1. RESUMEN 1

1.1SUMMARY 2

2. INTRODUCCIÓN. 3

2.1 Algas marinas. 3

2.2 Algas pardas. (Reino Protista, Filum Heterokontophyta, Clase Phaeophyceae) 8

2.3 Estructura celular en algas pardas. 13

2.4 Algas Kelp 17

2.5 Macrocystis pyrifera. 17

2.6 Durvillaea antarctica. 30

2.7 Polisacáridos de reserva en algas pardas: Laminarina. 32

2.8 Polisacáridos extracelulares y de la pared celular en algas marinas. 34

2.9 Polisacárido extracelular en algas pardas: Fucoidina. 36

2.10 Importancia médica y Propiedades fisiológicas en algas marinas. 36

2.10.1 Protothecosis. 36

2.10.2 Silicosis. 43

2.10.3 Bocio. 43

2.10.4 Arseniosis. 43

2.10.5 Alergias. 43

2.10.6 Actividad Anticancerígena. 43

ii

2.10.7 Actividad Antihelmíntica. 44

2.10.8 Actividad anticoagulante. 44

2.10.9 Actividad Laxante. 44

2.10.10 Actividad antifúngica. 44

2.10.11 Actividad antiviral. 45

2.10.12 Actividad inmunológica e inflamación. 46

2.10.13 Actividad Hipolipemiante e Hipotensora. 47

2.10.14 Actividad antibacteriana. 48

2.10.15 Actividad Antioxidante 52

2.11 Digestión enzimática y método de detección de productos de hidrólisis. 57

2.11.1 Enzimas. 57

2.11.2 β – glucanos y distribución en levaduras, hongos y algas según el tipo de

enlace glucosídico que presentan. 58

2.11.3 Técnicas de detección, Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). 58

2.12 Hipótesis 61

2.13 Objetivo General 61

2.14 Objetivos Específicos 61

3. MATERIALES Y MÉTODOS. 62

3.1 Extracción de polisacáridos. 62

3.2 Detección de polisacáridos. 65

iii

3.3 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). 65

3.4 Recolección de fracciones de polisacáridos (pick cromatográficos) desde HPLC. 66

3.5 Hidrólisis enzimática de polisacáridos. 66

3.6 Test de glucosa. 67

3.7 Ensayo del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS). 67

3.8 Determinación cualitativa de Sulfatos. 68

3.9 Determinación de la Actividad Antioxidante. 69

3.9.1 Estándares y Reactivos. 69

3.9.2 Método DPPH. 69

3.9.3 Método de Fenoles Totales. 71

3.10 Determinación de la Actividad Antibacteriana. 72

3.10.1 Cepas bacterianas. 72

3.10.1.1 Bacillus subtilis ATCC 33608. 72

3.10.1.2 Escherichia coli ATCC 25922. 72

3.10.1.3 Klebsiella pneumoniae ATCC 23357. 73

3.10.1.4 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. 73

3.10.1.5 Shigella sonnei OSP 2047 – 01. 73

3.10.1.6 Staphylococcus aureus ATCC 25923. 74

3.10.1.7 Staphylocccus epidermidis ATCC 12228. 74

3.10.1.8 Streptococcus pyogenes OSP 344 – 10. 74

iv

3.10.2 Conservación de cepas de referencia. 74

3.10.3 Activación de las cepas. 75

3.10.4 Recuento de colonias bacterianas. 75

3.10.5 Estándar de medicamentos Unasyn®, Inem® y Sulperazon®. 76

3.10.5.1 Unasyn® 76

3.10.5.2 Inem® 76

3.10.5.3 Sulperazon® 76

3.10.6 Ensayo de Sensibilidad de las cepas de referencia frente a los extractos de

Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica. 77

3.10.7 Diseño experimental para la inhibición bacteriana por medio de pocillos o

discos filtro. 81

3.10.8 Análisis estadísticos. 82

3.11 Determinación de la actividad antifúngica. 82

3.11.1 Cepas fúngicas. 82

3.11.2 Cultivo de cepas fúngicas. 83

3.11.3 Ensayo de Sensibilidad de las cepas fúngicas frente a los extractos de


3.11.4 Diseño experimental para la inhibición bacteriana por medio de pocillos

o discos filtro. 85

4. RESULTADOS. 85

v

4.1 Extracción y detección mediante HPLC, de los polisacáridos Laminarina y

Fucoidina desde las algas Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica. 85

4.2 Detección mediante HPLC, de los polisacáridos Laminarina y Fucoidina,

obtenidos por la metodología de extracción según Nakamura – Black. 90

4.3 Contenido de Laminarina y Fucoidina en los extractos algales. 92

4.4. Hidrólisis enzimática de polisacáridos. 95

4.4.1 Estandarización del método DNS (ANEXO 3.1). 95

4.5 Detección de los productos de hidrólisis de Laminarina y Fucoidina

mediante HPLC 101

4.6 Determinación cualitativa de sulfatos. 105

4.7 Determinación de la actividad antioxidante. 105

4.7.1 Estudio de Estabilidad del método DPPH Brand – Williams. 105

4.7.2 Estabilidad del ensayo DPPH en condiciones de Luz – Oscuridad. 107

4.7.3 Estabilidad del ensayo DPPH a distintas temperaturas. 107

4.7.4 Estado estacionario del ensayo DPPH a 517 nm. 111

4.7.5 Determinación de la concentración óptima a utilizar para extractos

liofilizados de Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica. 111

4.7.6 % de Inhibición del radical libre DPPH (%IRL). 114

4.7.7 % DPPH remanente, EC50, TEC50 y AE. 114

4.7.8 Actividad antioxidante equivalente al Ácido ascórbico (VCEAC) y Actividad

antioxidante equivalente a TROLOX (TEAC). 119

vi

4.7.9 Método de Fenoles Totales (FT) o Método de Folin – Ciocalteu. 121

4.8 Determinación de la Actividad Antibacteriana. 123

4.9 Determinación de la actividad antifúngica. 132

5. DISCUSIÓN. 135

6. CONCLUSIONES. 142

7. BIBLIOGRAFÍA. 144

ANEXOS. 160

ANEXO 1 161

ANEXO 1.1. PROTOCOLO BLACK DE EXTRACCIÓN DE LAMINARINA

Y FUCOIDINA. 161

ANEXO 1.2. PROTOCOLO BLACK VARIANTE DE EXTRACCIÓN DE

LAMINARINA Y FUCOIDINA. 162

ANEXO 1.3. PROTOCOLO IVIN DE EXTRACCIÓN DE LAMINARINA Y

FUCOIDINA. 163

ANEXO 1.4. PROTOCOLO NUEVO DE EXTRACCIÓN DE LAMINARINA

Y FUCOIDINA. 164

ANEXO 1.5. PROTOCOLO NAKAMURA DE EXTRACCIÓN DE


ANEXO 1.6 PROTOCOLO NAKAMURA –BLACK DE EXTRACCIÓN DE


ANEXO 2 167

ANEXO 2.1 ESQUEMA DE RECUENTO DE COLONIAS BACTERIANAS. 167

vii

ANEXO 2.2 ENSAYO DE SENSIBILDIAD DE LAS CEPAS DE REFERENCIA

FRENTE A LOS EXTRACTOS DE MACROCYSTIS PYRIFERA Y

DURVILLAEA ANTARCTICA. 168

ANEXO 2.3 PREPARACIÓN DE DILUCIONES DE MUESTRAS DE

ESTÁNDARES DE FUCOIDINA - LAMINARINA Y MUESTRAS DE

ENSAYO DE ACTIVIDAD ANTIBIÓTICA. 169

ANEXO 3 170

ANEXO 3.1 PROTOCOLO SELECCIONADO DE LA ESTANDARIZACIÓN

DEL MÉTODO DE DNS. 170

ANEXO 4 171

ANEXO 4.1. CURVA DE CALIBRACIÓN DE FUCOIDINA. 171

ANEXO 4.2. CURVA DE CALIBRACIÓN DE LAMINARINA. 172

ANEXO 5 173

ANEXO 5.1 EC50 PARA EXTRACTO DE MACROCYSTIS PYRIFERA 173

ANEXO 5.2 TEC50 PARA EXTRACTO DE MACROCYSTIS PYRIFERA. 174

ANEXO 6 175

ANEXO 6.1 CURVA DE CALIBRACIÓN TROLOX (TEAC) 175

ANEXO 6.2 CURVA DE CALIBRACIÓN ÁCIDO ASCÓRBICO (VCEAC) 176

ANEXO 7 178

ANEXO 7.1 CURVA DE CALIBRACIÓN DE ÁCIDO GÁLICO A 765 nm

(MÉTODO DE FENOLES TOTALES). 177

viii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Esquema de clasificación del filum Phaeophyta y sus órdenes Laminariales y

Fucales. 9

Figura 2. Estructura de la pared celular en Algas pardas. 14

Figura 3. Diagrama esquemático de una célula de alga parda.. 15

Figura 4. Ciclo de vida de Macrocystis pyrifera. 21

Figura 5. Conformación anatómica general de Macrocystis pyrifera 22

Figura 6. Conformación anatómica general de Durvillaea antarctica. 31

Figura 7. Estructura del polisacárido de reserva Laminarina. 33

Figura 8. Moléculas fibrilares de la pared celular algal. 34

Figura 9. Estructura de fucoidina . 39

Figura 10: Espectro de absorción del DPPH. 70

Figura 11. Esquema representativo de las placas de antibiograma . 80

Figura 12. Cromatograma de moléculas estándar de Maltosa, Fucosa, Glucosa y

Ácido algínico. 87

Figura 13. Cromatograma de estándares. 88

Figura 14. Cromatograma de extractos algales de Macrocystis pyrifera, obtenidos

por las distintas metodologías de extracción según Deville et al. 89

Figura 15. Cromatograma de extractos algales de Durvillaea antarctica, obtenidos

por las distintas metodologías de extracción según Deville et al. 91

ix

Figura 16. Cromatograma de extractos algales de Durvillaea antarctica, obtenidos

por la metodología de extracción según Nakamura – Black. 93

Figura 17. Cromatograma extractos de protocolos Nakamura – Black del alga

Durvillaea antarctica. 94

Figura 18. Hidrólisis enzimática de estándares. 96

Figura 19. Hidrólisis enzimática de extractos algales. 97

Figura 20. Test de DNS de muestras estándar de laminarina y fucoidina. 98

Figura 21. Test de DNS de extractos algales. 99

Figura 22. Cromatograma de estándares de polisacáridos y estándares de productos

de hidrólisis. 102

Figura 23. Cromatograma de productos de hidrólisis de ensayo enzimático con la

enzima β-glucanasa. 103

Figura 24. Cromatograma de productos de hidrólisis de ensayo enzimático con la

enzima laminarinasa. 104

Figura 25. Determinación cualitativa de sulfatos. 106

Figura 26. Estabilidad ante la exposición de luz – oscuridad en el ensayo DPPH. 108

Figura 27. Estabilidad del ensayo DPPH, frente a la variación de temperatura. 109

Figura 28. Estabilidad del ensayo DPPH, frente a la variación de temperatura. 110

Figura 29. Estado estacionario del ensayo DPPH a 37°C y 517 nm. 112

Figura 30. Concentración óptima a utilizar para extractos liofilizados de


x

Figura 31. Antibiogramas de Extractos de protocolo nuevo de Macrocystis

pyrifera. 126

Figura 32. Antibiogramas de estándares antibióticos Inem®, Unasyn®, Sulperazon®. 127

Figura 33. Inhibción de Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus y

Staphylococcus epidermidis por efecto de las distintas diluciones de extracto de

Macrocystis pyrifera. 130

Figura 34. Actividad antifúngica de Estándar comercial de Laminarina 25 mg/ml y

Fucoidina 25 mg/ml 133

Figura 35. Actividad antifúngica para el género Aspergillus. 134

xi

INDICE DE TABLAS

Tabla I. Tres filum algales y sus características principales. 11-12

Tabla II. Principales especies de algas pardas, distribución geográfica y

principales usos. 14

Tabla III. Composición proximal en algas Phaeophyta, porcentaje expresado en

base seca. 24

Tabla IV. Composición aminoacídica en algas Phaeophyta. 25

Tabla V. Contenido de Ácidos grasos en algas Phaeophyta. (%). 26

Tabla VI. Contenido de tocoferoles (mg/kg de lípido). 27

Tabla VII. Contenido de compuestos carotenoides en algas Phaeophyta

expresado en µg/g en peso seco. 28

Tabla VIII. Concentración de polifenoles totales presentes en las algas Phaeophyta. 29

Tabla IX. Composición química de algunos fucoidanos según la especie algal. 37

Tabla X. Variación del Peso Molecular de la Fucoidina según la especie algal. 38

Tabla XI. Propiedades fisiológicas de polisacáridos de algas o de extractos algales,

reportados en humanos y otros organismos. 40

Tabla XII. Moléculas con actividad biológica en algas marinas. 41 - 42

Tabla XIII. Lista de algunas algas marinas reportadas con actividad

antibacteriana. 51- 52

Tabla XIV. Categorización de grupos antioxidantes, ejemplos de ellos y fuente

algal de la cual proceden. 54

Tabla XV. Compuesto antioxidante algal con actividad fisiológica o efecto

beneficioso para la salud. 56

Tabla XVI. Distribución de β – 1,3 glucanos en levaduras, hongos y algas. 59

xii

Tabla XVII. Modificaciones realizadas a protocolos Nakamura – Black (NB) 64

Tabla XVIII. Muestras estudiadas en ensayo de antibiograma. 79

Tabla XIX. % Inhibición del radical libre DPPH 115

Tabla XX. % DPPH remanente según concentración de extracto algal utilizada. 117

Tabla XXI. % DPPH remanente según tiempo de ensayo DPPH. 118

Tabla XXII. EC50, TEC50 y AE de extractos de alga Macrocytis pyrifera. 120

Tabla XXIII. VCEAC y TEAC para extractos de Macrocystis pyrifera y

Durvillaea antarctica. 122

Tabla XXIV. Fenoles Totales en extractos de Macrocytis pyrifera y Durvillaea

antarctica. 124

xiii

LISTADO DE ABREVIATURAS.

AE Eficiencia antiradical

CST Caldo Soya Tripticasa

D Dictiosoma

DA Durvillaea antarctica

DNS Ácido 3,5 – Dinitrosalícilico.

DPPH 2,2 – Difenil – 1 – picrilhidrazilo

EPOC Enfermedad pulmonar obstructiva crónica

EROS/ROS Especies reactivas de oxígeno

F Plasmodesmo

Fib Microfibrillas de DNA

GLUT4 Transportador de glucosa tipo 4

GSH Glutatión reducido

HDL Lipoproteína de alta densidad

IR Índice de refracción

% IRL % Inhibición del radical libre

ITU Infección tracto urinaria

LCAT Lecitina colesterol acil transferasa

LDL Lipoproteína de baja densidad

LH Lipasa Hepática

LPL Lipoproteína lipasa

xiv

M Mitocondrias

MP Macrocystis pyrifera

N Núcleo

Nu Nucléolo

P Prenoide

Ps Saco prenoideal

PVDF Membrana de transferencia fluoruro de polivinilideno

TCA Ácido tricloroacético

TEAC Actividad equivalente al TROLOX

TROLOX Ácido 6 – hidroxi – 2, 5, 7, 8 – tetrametilcromano – 2 – carboxílico

V Vacuolas

VCEAC Actividad equivalente al ácido ascórbico

VIH Virus de la inmunodeficiencia adquirida

VMT Virus del mosaico del tabaco

1

1. RESUMEN

Los polisacáridos son moléculas biológicas que cumplen diversas funciones en los organismos

vivos. Algunas de estas moléculas poseen actividad antiglicémica, antioxidante, anticoagulante,

antibacteriana y antifúngica, entre otras.

El objetivo de este trabajo de tesis fue extraer y detectar polisacáridos con capacidad

antibacteriana, antifúngica y antioxidante desde las algas pardas Macrocystis pyrifera y Durvillaea

antarctica. La extracción de los polisacáridos laminarina y fucoidina, fue realizada a base de los

protocolos propuestos por Deville et al., la detección de estos fue llevada a cabo por la técnica de

HPLC – IR.

Para determinar la capacidad antibacteriana de ambos polisacáridos, se aplicó la técnica de

antibiograma en ciertas cepas bacterianas, tales como Bacillus subtilis ATCC 33608, Escherichia

coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 23357, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,

Shigella sonnei OSP 2047-01, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis

ATCC 12228 y Streptococcus pyogenes OSP 344-10, siendo ésta positiva utilizando extractos de

Macrocystis pyrifera, en cuanto a la aparición de halos de inhibición, para Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Bacillus subtilis.

Para la determinación de la capacidad antifúngica, se trabajó con cepas clínicas del género

Candida y Aspergillus, resultando esta prueba negativa en cuanto a la aparición de halos de

inhibición, en todos sus casos.

La determinación de la capacidad antioxidante fue positiva para los extractos de laminarina

y fucoidina, efectuándose ésta por medio de la técnica de DPPH (Método de Brand-Williams) y

Fenoles totales (Método Folin-Ciocalteu).

2

1.1 SUMMARY

Polysaccharides are biological molecules that fulfill different functions in living

organisms. Some of these molecules have antiglycemic, antioxidant, anticoagulant, antibacterial

and antifungical activities.

The objective of this thesis, was to extract and detect polysaccharides with antimicrobial

and antioxidant capacity from brown algae Macrocystis pyrifera and Durvillaea antarctica. The

extraction of this polysaccharides was done from the basis of the extraction method proposed by

Deville et al., the detection of this molecules was realized by HPLC – IR technique and the

application of molecular exclusion columns.

To determine the antibacterial capacity from both polysaccharides, it was applied the

antibiogram technique on certain bacterial strains, such as Bacillus subtilis ATCC 33608,

Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 23357, Pseudomonas aeruginosa

ATCC 27853, Shigella sonnei OSP 2047-01, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus

epidermidis ATCC 12228 and Streptococcus pyogenes OSP 344-10, being positive (in matters of

inhibition halos) to Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Saphylococcus epidermidis and

Bacillus subtilis.

For the determination of antifungic activity, clinical strains of the gender Candida and

Aspergillus were used, being this negative (in matters of inhibition halos) in all the cases.

The determination of the antioxidante capacity, was positive for the laminarin and fucoidan

extracts, being this realized by the DPPH technique (Brand-Williams method) and Total phenols

(Folin-Ciocalteu method).

3

2. INTRODUCCIÓN.

2.1 Algas marinas.

Las algas marinas son un grupo grande y heterogéneo de organismos vegetales, unas 50000

especies, entre los que se cuentan desde especies unicelulares hasta plantas enormes que pueden

medir sobre 50 metros (Ortiz, 2011). Además, estos organismos se clasifican como protistas

fotótrofos, donde se incluyen todos los eucariontes sin verdaderos tejidos ni órganos. 1

Desde el punto de vista morfológico, las algas marinas son organismos estructuralmente

simples, sin embargo, para compensar tal limitación han desarrollado eficientes mecanismos

fisiológicos de respuesta, cuyas modificaciones a menudo presentan valor adaptativo. En este

sentido, los valores calóricos y constituyentes energéticos presentan variaciones ligadas con las

estrategias de desarrollo y consiguiente adecuación biológica de las especies (Lewin, 1981).

Adicionalmente, se considera a las algas marinas, como vegetales acuáticos y productores

primarios, responsables de alrededor del 80% de la producción del oxígeno atmosférico. Su

organización biológica es sencilla, pudiendo ser protofitos o talófitos; pueden presentar una

diversidad pigmentaria que ha sido aprovechada como parámetro para su clasificación. De acuerdo

a su hábitat, se las puede encontrar tanto en el plancton, neuston, como en el bentos (Wratten y

Faulkner, 1977).

Las algas marinas viven en dos tipos de condiciones muy distintas: unas lo hacen flotando en

las capas más superficiales del agua, son unicelulares y se las conoce con el nombre de algas

plantónicas; las otras viven adheridas a rocas u otros sustratos, y se las conoce con el nombre de

1 Brown Algae 3G. Coastal and Marine Life.

4

Algas bentónicas (Santelices, 1991). La distribución, el asentamiento, el crecimiento y la

propagación de las algas dependen directamente de las corrientes oceanográficas, al igual que su

estructura fisiológica.

Las algas bentónicas por su parte, crecen fijas a un sustrato. Hoy día, ese sustrato puede ser

artificial, permitiendo el desarrollo de una tecnología con vistas al máximo aprovechamiento de

los recursos algológicos. En la naturaleza, en tanto, el sustrato se localiza preferentemente en la

región litoral (Neushul y Luning, 1978).

Las algas del bentos (bentónicas) son macroscópicas y presentan una gran variedad de formas

y colores. En consideración a la mayoritaria síntesis de un determinado pigmento, se pueden

distinguir a grandes rasgos en tres grandes filum, a saber: algas verdes (Chlorophyta), algas pardas

(Phaeophyta) y algas rojas (Rhodophyta) (Hay et al., 1986).

Es relevante mencionar que, no todas las especies de algas presentan el color típico del grupo

al cual pertenecen, así por ejemplo, Gymnogongrus furcellatus es un alga roja de color pardo.

Hay diversos factores que pueden enmascarar o alterar el color de una misma especie, como

por ejemplo, la presencia simultánea de otros pigmentos, la intensidad de la radiación solar, el

momento del ciclo de vida del alga, la presencia de órganos reproductores, etc. (Wheeler, 1980).

En el litoral, las algas marinas bentónicas pueden ubicarse en diferentes zonas, tales como:

supramareal, inframareal e intermareal, que es la zona más afectada por los cambios de

temperatura, humedad y salinidad, debido al efecto de las mareas.

En Chile central, se han descrito para la zona intermareal tres cinturones permanentes de algas

y varios cinturones estacionales (Santelices, 1981). Los tres cinturones permanentes incluyen una

franja de algas calcáreas crustosas (Lithophyllum lithothamnion), un cinturón de algas pardas

5

formado por poblaciones de Lessonia nigrescens y Durvillaea antarctica y un cinturón de algas

crustosas (Codium dimorphum, Gelidium spp), con talos rastreros y coalescentes que forman una

cubierta vegetal continua.

El análisis de los factores causales de la organización de estos cinturones, indica que su límite

superior está regulado por factores abióticos, su límite inferior por presión de pastoreo, mientras

que su estructura interna (importancia relativa de las especies con morfología semejante), está

regulada por la competencia inter e intraespecífica (Wylie y Paul, 1988).

Las algas marinas bentónicas, sólo usan el sustrato como lugar de fijación. Tanto los nutrientes,

como el oxígeno se encuentran disueltos o en suspensión en el agua, la cual con su constante

agitación, ayudada por el flujo y reflujo, los pone a disposición de la planta. Este intercambio entre

el alga y el agua que la circunda, se ve facilitado si la planta está adherida a un sustrato y si su talo

opone resistencia, en caso contrario, este proceso se interrumpe y el alga muere.

En lo que respecta a su actividad fotosintética, las algas bentónicas producen una variada gama

de compuestos orgánicos, los cuales se acumulan principalmente en sus paredes celulares. Se ha

demostrado que la composición química de las algas sufre variaciones, las que pueden estar

relacionadas con los cambios estacionales, estado de desarrollo, ubicación geográfica, etc. (Ramus,

1990, Reed et al., 1985, Steinberg, 1989).

Por otra parte y respecto a la importancia industrial de las algas, podemos mencionar que; la

industria mundial se abastece de cantidades considerables de algas de distintos tipos, con miras a

la confección de una variedad de productos que ayudan al hombre a vivir mejor. Entre las algas de

mayor utilización se debe nombrar a especies de los géneros Gracilaria y Gelidium, ocupadas en

la obtención de agar – agar; Iridae, para la obtención de carragenanos y Macrocystis, Lessonia y

6

Gymnogongrum para la producción de alginatos (Abbott, 1979). En el caso específico de

Macrocystis pyrifera, el producto extraído más importante, tanto por su volumen como por su uso

es el ácido algínico, un polímero coloidal de ácido manurónico y gulurónico. Las aplicaciones del

ácido algínico son múltiples, como por ejemplo, como espesante, emulsionante, estabilizante de

alimentos, fármacos, bebidas, textiles y muchos otros productos (Iturriaga y Hope, 1977, Kajiwara

et al., 1990).

En el plano ecológico, las poblaciones de algas bentónicas en general y de Macrocytis pyrifera

en particular, forman un ambiente de gran analogía con el bosque y con ello proveen de alimento,

protección y sustrato de asentamiento a numerosas otras plantas y animales marinos; a su vez,

muchos de los peces y moluscos asociados a este “bosque”, son comestibles por los humanos. Aún

más, la producción orgánica de Macrocystis, fuera de la consumida por erizos y peces herbívoros,

eventualmente se transforma en material arrastrado, que a su vez sirve de alimento a los otros

organismos que viven fuera de la pradera de Macrocystis. Después que un alga adulta de este tipo

desaparece como consecuencia del pastoreo, desgarro u otro accidente, la iluminación del fondo

generalmente aumenta, lo que facilita el poblamiento de la zona del disco con otros ejemplares

juveniles de la misma especie preferentemente, antes que por otras especies (Parker, 1966. Gerard

et al., 1976. Kobayashi, 1989).

En Chile existen aproximadamente 550 especies de algas bentónicas, aunque las conocidas

ampliamente por la población representan menos del 1 % de ellas. Las especies más comunes son

exportadas como materia prima , usadas internamente en las industrias de alginatos y agar, y en

menor grado consumidas como alimentos (Chapman y Chapman, 1980); pero durante los últimos

años ha aumentado significativamente la importancia económica y social de este recurso natural

renovable.

7

Las algas en general constituyen un alimento sano y completo, perfecto para nuestra época;

en la cual, el pésimo hábito alimenticio, el consumo de alimentos altamente procesados, y el exceso

en la utilización de sustancias químicas en la agricultura, se desvirtúan el sentido de la nutrición,

además de debilitar el organismo.

Investigaciones realizadas en el extranjero señalan que la ingesta de algas de manera habitual,

provocan efectos favorables en la salud, relacionando los componentes químicos derivados de la

biosíntesis de las células vegetales marinas con dichos efectos; por lo tanto, moléculas como

polifenoles, ácidos grasos esenciales, pigmentos, fitoestrógenos, proteínas, vitaminas y minerales;

son objeto de acuciosos estudios y son buscados incesantemente para ser utilizados como base de

alimentos funcionales y saludables (Chan , 1997). Es decir, la gran variedad de componentes

nutricionales que conforman las algas propician la formulación y desarrollo de nuevos alimentos,

los cuales por sus propiedades físicas, químicas y biológicas pueden ayudar a una nutrición

adaptada a cada caso o situación fisiológica individual, contribuyendo a mejorar la salud y

bienestar, junto con prevenir o hacer más tolerable muchas enfermedades como cáncer de colon,

arteriosclerosis, obesidad y problemas cardiovasculares entre otras (Sanz, 2000).

No obstante, la explotación de las algas a nivel nacional ha sido mínima perdiendo con esto la

optimización de procesos, productos industriales y agrícolas (Chapman y Chapman, 1980). En

menor grado se les ha considerado como una importante fuente de nutrientes esenciales para una

alimentación sana; atendiendo a su aporte energético, fibra dietaría (Lahaye, 1991) y los bajos

contenidos de lípidos, principalmente ricos en ácidos grasos poliinsaturados ω3 (Khotimchenko,

2002), lo que permite incluirlas en dietas especiales. Son muy pocos los productos en nuestro

mercado que cumplen con las características de ser beneficiosos para los consumidores con

carencias fisiológicas y nutricionales especiales, y los existentes lo son gracias a que se le ha

8

añadido una sustancia específica, cuyos efectos favorables han sido científicamente probados. Pero

en el caso particular de las algas, éstas podrían llegar a constituir un alimento funcional por sí

mismo; es decir, no sería necesario enriquecerlas.

2.2 Algas pardas. (Reino Protista, Filum Heterokontophyta, Clase Phaeophyceae)

Las algas pardas son un importante grupo de plantas que están clasificadas en

aproximadamente 265 géneros, con más de 1500 especies (Bold et al., 1985). Ellas derivan su

coloración característica de una gran cantidad de carotenoides de fucoxantina (que otorga la

coloración parda), contenidos en cloroplastos y de la presencia de varios taninos propios de la

especie. Las algas pardas se desarrollan en regiones temperadas a subpolares, donde exhiben la

mayor diversidad en especies y expresión morfológica (Lee, 1989).

La clase Phaeophyceae está dividida en ordenes, que subsecuentemente está dividida en

familias y luego éstas en géneros (13 en esta división) y especies (Bold et al., 1985). Desde el punto

de vista de la bioabsorción, sólo los órdenes Laminariales y Fucales son de importancia (Figura 1)

(Davis et al., 2003).

Ambos órdenes son abundantes en la naturaleza e incluyen las algas estructuralmente más

complejas. Laminariales son colectivamente y comúnmente denominadas como “kelp” y son

cultivadas a gran escala para fines comerciales (propiedades gelificantes, emulsificantes para

polvos, propiedades estabilizantes en cerámica, entre otros.) (Chapman, 1980). El orden Fucales,

es un amplio y diverso orden, con una gran variación morfológica. Por ejemplo, la familia

Sargassaceae contenida en él, es bien conocida por el género algal Sargassum, que se encuentra

en aguas tropicales del Mar de Sargasso.

9

Figura 1. Esquema de clasificación del filum Phaeophyta y sus órdenes Laminariales y

Fucales. De estos últimos se desprenden las familias respectivas que lo componen. Extraído de

Bold et al., 1985.

10

La Figura 1 contiene alguno de los géneros y especies objeto de mayor estudio científico y por su

especial capacidad de absorber metales pesados. (Davis et al., 2003).

Es importante señalar que las algas, son distintas del filum Cyanophyta, clase

Cyanophyceae, o algas verde – azuladas, que también son organismos oxígenicos fotótrofos, pero

corresponden a eubacterias y evolutivamente se diferencian de las algas (Davis et al., 2003).

Si comparamos las algas pardas, con otras clases de algas, nos encontramos con que muchas

de ellas son microscópicas en tamaño y son por lo tanto, consideradas como microorganismos,

muchas formas de algas son macroscópicas en términos de morfología. Estas formas coloniales de

algas funcionan como “agregados celulares”, donde ellas comparten funciones y propiedades

comunes, incluyendo los productos de almacenamiento que ellas utilizan, así como las propiedades

estructurales de sus paredes celulares. (Stumm et al., 1996).

Existen variadas características para clasificar un alga, incluyendo la naturaleza de la

clorofila, la composición química de la pared celular y flagelación. Una característica común es

que todos los tipos de alga contienen clorofila; sin embargo, la presencia de fitopigmentos distintos

a la clorofila, es particular de cada filum/división algal. La naturaleza del polímero de reserva

sintetizado por fotosíntesis, es también clave a la hora de clasificar un alga. Según lo anterior, es

factible clasificar a los organismos algales, en los filum; Cyanophyta, Prochlorophyta,

Phaeophyta, Chlorophyta, Charophyta, Euglenophyta, Chrysophyta, Pyrrhophyta, Cryptophyta y

Rhodophyta, los cuales se contienen en la Tabla I, según presenten o no pared celular, resaltando

sus características más particulares. (Bouck, 1965).

11

Tabla I. Tres filum algales y sus características principales.

Filum Nombre

común

Pigmentos Producto de

almacenamiento

Pared

Celular

Flagelos

Chlorophyta Algas

verdes

Clorofila

a,b,α, β y γ –

carotenos y

xantofilas.

Almidón Celulosa,

Glucosidos de

hidroxiprolina,

xilanos y

manosa; o

pared celular

ausente,

calcificada en

algunos casos.

Presente

Phaeophyta Algas

pardas

Clorofila a,

c, β –

caroteno y

fucoxatina,

más otras

xantofilas.

Laminarina,

manitol.

Celulosa,

ácido algínico

y muco –

polisacáridos

sulfatados

(fucoidina)

Presente

Extraído y adaptado de Bold et al., 1985.

12

Tabla I. (Cont.) Tres filum algales y sus características principales.

Rhodophyta

Algas rojas

Clorofila a;

R y C –

ficocianinas;

R y B –

ficoeritrina,

xantofilas y

α β

carotenos.

Almidón

floridiano.

Celulosa,

xilanos,

polisacáridos

sulfatados

(galactanos).

Ausente.

Extraído y adaptado de Bold et al, 1985.

13

En el filum Phaeophyta (algas pardas), el polisacárido laminarina es el principal producto

biosintético de almacenamiento, mientras que en Rhodophyta (algas rojas) el almidón floridiano es

el principal producto. Los flagelos están ausentes en Rhodophyta, pero si se encuentran presentes

en Chlorophyta y Phaeophyta. (Kylin, 1915).

Una pared celular algal típica de Phaeophyta, Rhodophyta y muchas Chlorophyta, está

compuesta de un esqueleto fibrilar y una matriz amorfa. El esqueleto fibrilar de mayor

preponderancia dentro de estos filum, es el de celulosa. Ésta puede ser reemplazada por xilano en

Chlorophyta y Rhodophyta, en adición de manosa en Chlorophyta.

El filum Phaeophyta se caracteriza por una matriz predominante en ácido algínico o alginato,

con una menor proporción de polisacáridos sulfatados (fucoidina) (Figura 2), mientras que

Rhodophyta contiene una cierta cantidad de galactanos sulfatados (carrageninas). Ambas

Phaeophyta y Rhodophyta contienen las matrices de polisacáridos amorfas más grandes dentro de

los filum mencionados (Haug et al., 1967).

2.3 Estructura celular en algas pardas.

Una célula de alga parda típica, corresponde a lo comprendido en la Figura 3. La envoltura

del cloroplasto (Ce) contiene los cloroplastos que poseen tres tilacoides por banda. Esta estructura

(conocida como plastidio) almacena material de reserva y contiene clorofila a, c1, y c2.

Adicionalmente a la envoltura del cloroplasto, los cloroplastos se encuentran rodeados por las dos

membranas de retículo endoplasmático (Cer). La membrana externa, que contiene a su vez una

membrana interna, es descontinuada o interrumpida por la envoltura nuclear (Ne) en los órdenes

Fucales y Laminaria; sin embargo ésta es continua (Figura 3) en el caso de las algas pardas, orden

Ectocarples (Brook y Madigan, 1991).

14

Figura 2. Estructura de la pared celular en Algas pardas. Extraído de Shiewer et al., 2000.

15

Figura 3. Diagrama esquemático de una célula de alga parda. Envoltura del cloroplasto (Ce),

retículo endoplasmático cloroplástico (Cer), retículo endoplasmático (Er), envoltura nuclear (Ne),

DNA fibrilar (Fib), Nucléolo (Un), Núcleo (N), prenoide (P), saco del prenoide (Ps), dictiosoma

(D) (también conocido como aparato de Golgi o dictiosoma de golgi), mitocondria (M), vacuola

(V), plasmodesmo (F), pared celular (Cw), centriolos (Cen). Extraído de Bouck, 1965.

16

Aunque gran parte de las funciones celulares algales, son codificadas por el DNA, algunas

proteínas organelares son codificadas dentro del cloroplasto. Dentro del cloroplasto, encontramos

microfibrillas de DNA (Fib) relacionadas directamente con los plastidios. La organización del

DNA en este caso, puede ser lineal o circular y se encuentra unido a las membranas del tilacoide.

Como en todos los eucariontes, el DNA es almacenado en el nucléolo, (Nu) y éste a su vez en el

núcleo (N) celular. El prenoide (P) es responsable de la fijación de O2 y de la formación de

productos de almacenamiento. Éste es contenido por el saco prenoideal (Ps) y se extiende hacia

afuera del retículo endoplasmático del cloroplasto (Dodge, 1973).

La producción y secreción de polisacáridos acontece en el dictiosoma (D), también llamado

aparato de Golgi o dictiosoma de Golgi. Las mitocondrias (M) es el lugar donde ocurre la

respiración celular, con subsecuente síntesis de ATP. (Dodge, 1973)

La principal función de las vacuolas (V) es el almacenamiento y transporte de variadas

macromoléculas dentro o hacia el espacio extracelular.

Una proporción significativa de estos organelos, contienen ácido algínico, que adicionalmente

posee una función protectora (de la luz solar), al resituarse en la pared celular, mientras se

reabastece la síntesis de este ácido. (Figueira et al., 2000).

Finalmente, las células se encuentran interconectadas por plasmodesmo (F), los cuales se

encuentran presentes en gran cantidad de células (Figueira et al., 2000).

17

2.4 Algas Kelp

El kelp es un nombre genérico utilizado para denominar a las algas pardas de los órdenes

Fucales (e.i Ascophyllum nodosum, Sargassum spp. y Pelvetia spp.) y Laminariales (e.i. Laminaria

hyperborea, Macrocytis pyrifera y Nereocystis luetkaena) (Vásquez, 1999), aunque existen

algunos autores que solamente consideran dentro de este término, específicamente a las

Laminariales (Vozzhinskaya y Kuzin, 1994, Kloareg et al., 1999). Estas algas generalmente se

localizan en zonas de sustratos rocosos cercanas a las costas a profundidades no mayores de 40

metros, en aguas templadas o frías, claras y ricas en nutrientes. Las principales áreas en donde se

localiza Macrocystis pyrifera es en las costas de América del Norte y del Sur, sur de África, Nueva

Zelanda, Noruega, Escocia, Japón y Corea (Tabla II).

2.5 Macrocystis pyrifera.

Ubicación taxonómica según Silva et al., 1996.

División: Phaeophyta

Clase: Phaeophyceae

Orden: Laminariales

Familia: Lessoniaceae

Género: Macrocystis

Especie: pyrifera

18

Tabla II. Principales especies de algas pardas, distribución geográfica y principales usos

Especie Distribución Principal uso

Macrocystis Costa oeste de Norteamérica, de

la península de Monterrey a la

mitad de la Baja California, costa

oeste. Perú, Chile y Argentina.

En california: Industria del

alginato, poca producción en

forma de harina o alga

deshidratada para consumo

animal o humano farmacéutico.

Laminaria Escocia, Irlanda, Noruega,

Francia, China y Japón.

En Asia: Consumo humano.

Laminaria

hyperborea

Francia, Irlanda y Escocia. Noruega produce alginatos.

Laminaria digitata Francia, Noruega y Escocia. Alginatos

Ascophyllum

nodosum

Escocia e Irlanda, Noruega, Sur

de Nueva Escocia y Cánada.

Producción de alginatos y de

harina de kelp como forraje o

aditivo alimenticio.

Durvillaea

antarctica

Chile Exportada para alginatos a

Inglaterra y Estados Unidos

Lessonia Chile Exportada a Japón, Estados

Unidos y Cánada

Undaria Corea Consumo humano, desechos

para alginato.

Extraído de Hernández - Carmona, 1996

19

Macrocystis pyrifera es una alga de gran tamaño, comúnmente conocida como huiro, que en

ocasiones alcanza una longitud de 50 m o más, en su base se encuentra sujeta a una sustrato rocoso

por medio de un rizoide, del cual se originan el estirpe primario de la planta, que tiene apariencia

de tallo y de éste a su vez, emanan los cauloides que tienen apariencia de ramas, y a lo largo de

estos, se encuentran las estructuras flotadoras llamadas neumatocistos o aerocistos de donde se

despliegan las láminas, constituyendo cada cauloide, sus aerocistos y láminas, una fronda (Guzmán

del Próo et al., 1986). Los aerocistos sostienen las frondas y permiten que crezcan hacia la

superficie, una vez que la fronda alcanza la superficie continua creciendo y expandiéndose,

formando un denso dosel flotante. Cada planta consta de un gran número de frondas, contando

siempre con una mezcla de frondas juveniles, adultas y senescentes.

El ciclo de vida de Macrocystis pyrifera, consiste de una alternancia de generaciones

heteromórfico y difásico entre un esporofito diploide y un gametofito microscópico haploide. Las

zoosporas biflageladas se liberan de láminas reproductivas especializadas o esporofilos, situados

cerca del sujetador del esporofito maduro. La producción de esporas inicia cuando el esporofito

tiene de seis a doce meses de edad; las zoosporas germinan produciendo gametofitos dioicos. Los

gametofitos masculinos y femeninos se pueden diferenciar después de aproximadamente una

semana (en cultivos de laboratorio); los masculinos producen células biflageladas móviles

(anterozoides), mientras que los femeninos producen el óvulo, el cual se desarrolla en un embrión

después de fertilización (Guzmán del Próo et al., 1986; North, 1987). En unas cuatro semanas, el

crecimiento produce láminas diminutas apenas visibles a simple vista (1 – 2 mm de largo), 30 días

después el esporofito mide 5 a 10 cm. Las divisiones posteriores y la aparición de frondas iniciales

conducen al desarrollo de la morfología de una planta joven, con más de ocho frondas y 20 cm de

20

longitud a los 12 meses y a los 18 meses aproximadamente la planta puede cosecharse (Figura 4)

(Neushul y Haxo, 1963).

Aunque la producción de esporas es grande, sólo una pequeña fracción se fija en un sustrato

adecuado y un número aún menor sobrevive de la fase microscópica del ciclo de vida para producir

esporofitos (Dodge, 1973).

El período máximo de vida de las frondas es de aproximadamente seis meses, pero en muchas

ocasiones puede ser menor por el deterioro ocasionado por tormentas, ramoneo o condiciones

anómalas de temperatura. Una planta completa puede tener un período de vida de dos meses a

varios años, dependiendo de los factores antes mencionados, que son las principales causas de la

mortalidad de las algas (North, 1987).

Macrocystis pyrifera, es una especie característica de fondos rocosos, que forma mantos

densos en grandes extensiones (bosques), cuyo dosel (Figura 5), facilita el no tener competencia

con otras algas por la luz, pero incrementa su susceptibilidad al daño por tormentas, ya que al

entrelazarse las frondas en la superficie oponen una gran resistencia a las marejadas y entonces son

desprendidas las plantas completas. Se puede encontrar desde profundidades someras como es la

zona de mareas hasta profundidades de 40 m, cuando existe la suficiente penetración de luz. Su

distribución horizontal local frecuentemente está controlada por la disponibilidad de sustrato

rocoso (Guzmán del Bróo et al., 1986).

21

Figura 4. Ciclo de vida de Macrocystis pyrifera. Extraído de North, 1971.

22

Figura 5. Conformación anatómica general de Macrocystis pyrifera. A. Aspecto general de un

talo de Macrocystis pyrifera y partes principales que lo integran; B. Aspecto de una lámina.

Extraído de Guzmán del Bróo et al., 1986.

23

Desde el punto de vista nutricional, las algas Macrocytis pyrifera son productos bajos en

calorías, con un alta concentración de minerales (Mg, Ca, P, K y I), vitaminas, proteínas,

carbohidratos poco digestibles, fibra y bajo contenido en lípidos (Mayer, et al, 1987). La calidad

de la proteína y de los lípidos es aceptable en comparación con otras fuentes vegetales

principalmente debido al alto contenido de aminoácidos esenciales y altos valores relativos de

ácidos grasos insaturados. El perfil de aminoácidos destaca por contener elementos esenciales para

diversas especies, como alanina, leucina y lisina y no esenciales como ácido glutámico, ácido

aspártico, considerándose como una fuente de proteínas complementaria, interesante por este

aspecto. Los carbohidratos se encuentran en esta alga en forma de carbohidratos complejos o

ficocoloides (40%), estos se presentan en forma de gomas, alginatos (18 – 26%), fucoidinas (0.5 –

2%), manitol (6 – 22%). Estos tienen la capacidad de retener agua (con sus minerales) en el alga

para evitar la deshidratación (Ortiz, 2011).

En general la composición proximal (Tabla III), aminoacídica (Tabla IV), lipídica (Tabla V),

de tocoferoles (Tabla VI), de compuestos carotenoides (Tabla VII) y concentración de polifenoles

totales (Tabla VIII) en las algas M. pyrifera y D. antarctica, varía considerablemente de especie a

especie y en función de su localización geográfica, estaciones del año, exposición al oleaje y a las

corrientes, concentración de nutrientes presentes en el medio, profundidad a la que se localizan, la

temperatura, y estado de desarrollo de las algas.

24

Tabla III. Composición proximal en algas Phaeophyta, porcentaje expresado en base seca.

Algas pardas Proteínas

(% ± D.E)

Lípidos

(% ± D.E)

Cenizas

(% ± D.E)

Calorías

(kcal/100g)

Macrocystis

pyrifera

13,2 ± 0.0 0,7 ± 0,1 10,8 ± 0,2 360,3

Durvillaea

antarctica

(cochayuyo)

10,4 ± 0,6 0,8 ± 0,0 17,9 ± 0,1 332,4

Durvillaea

antarctica

(Hulte)

11,6 ± 0,1 4,3 ± 0,1 25,7 ± 0,1 318,7

Extraído de Ortiz, 2011.

25

Tabla IV. Composición aminoacídica en algas Phaeophyta.

Aminoácidos

(mg/100g base seca)

Macrocystis pyrifera Durvillaea antarctica

(cochayuyo)

Durvillaea antarctica

(Hulte)

Ácido aspártico 1338,8 ± 22,8 936,4 ± 10,2 2953,6 ± 14,1

Ácido glutámico 1827,3 ± 15,4 1642,7 ± 29,9 1485,9 ± 8,3

Serina 830,9 ± 9,6 552,7 ± 12,4 385,6 ± 4,8

Histidina 161,9 ± 6,1 867,1 ± 9,9 1743,0 ± 10,7

Glicina 664,9 ± 8,7 715,3 ± 14,1 441,7 ± 6,3

Treonina 735,4 ± 6,9 626,9 ± 15,6 421,4 ± 9,4

Arginina 944,7 ± 10,1 225,6 ± 8,1 229,8 ± 7,5

Alanina 643,8 ± 13,7 780,0 ± 10,3 1252,9 ± 9,0

Prolina 0,8 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,3 ± 0,0

Tirosina 425,9 ± 9,4 264,0 ± 5,8 123,1 ± 3,6

Valina 1140,2 ± 12,5 274,4 ± 11,2 281,4 ± 5,1

Metionina 1111,6 ± 10,8 170,4 ± 9,7 631,7 ± 7,7

Cistina 228,1 ± 8,3 13,9 ± 4,8 148,7 ± 4,3


26

Tabla V. Contenido de Ácidos grasos en algas Phaeophyta. (%).

Ácidos grasos Macrocytis pyrifera Durvillaea antarctica

(cochayuyo)


(Hulte)

Porcentaje Materia

grasa

0,7 0,8 4,3

Total saturados 22,8 ± 0,6 26,6 ± 1,5 39,8 ± 1,4

Total

Monoinsaturados

25,2 ± 0,2 38,9 ± 2,2 33,9 ± 2,8

Total

poliinsaturados

51,4 ± 0,6 35,5 ± 3,4 28,3 ± 1,3

Total

poliinsaturados ω6

43,9 ± 0,4 22,5 ± 1,9 15,7 ± 1,1

Total

poliinsaturados ω3

5,9 ± 0,01 11,0 ± 1,4 3,8 ± 0,05

Razón ω6/ ω3 7,42 2,05 4,13

Índice de

poliinsaturación

2.3 1,3 0,7


27

Tabla VI. Contenido de tocoferoles (mg/kg de lípido)

Algas pardas α –

tocoferol

β -

tocoferol

γ -

tocoferol

γ -

tocotrienol

δ - tocoferol Tocoferoles

totales

M. pyrifera 1327 ± 4,4 91,3 ± 4,7 88,9 ± 4,0 25,2 ± 1,4 7,7 ± 1,1 1457,2 ± 11,4

D. antarctica

(cochayuyo)

179,4 ± 7,3 7,7 ± 0,5 19,4 ± 1,0 615,7 ± 8,1 245,9 ± 3,7 1112,4 ± 22,1

D. antarctica

(Hulte)

24,0 ± 1,8 16,0 ± 2,0 35,6 ± 0,7 15,3 ± 2,1 10,6 ± 1,4 167,3 ± 8,3


28

Tabla VII. Contenido de compuestos carotenoides en algas Phaeophyta expresado en µg/g

en peso seco.

Algas pardas Luteína β-Caroteno trans β-Caroteno cis

Macrocystis pyrifera 0,3 ± 0,0 10,8 ± 0,3 6,6 ± 0,1


cochayuyo

1,0 ± 0,0 35,0 ± 1,6 -----


Hulte

4,2 ± 0,4 58,0 ± 3,4 43,0 ± 1,0


29

Tabla VIII. Concentración de polifenoles totales presentes en las algas Phaeophyta.

(Representado en equivaletes a ppm de Acido Gálico)

Algas pardas Obtenido desde

extracto etanólico

Obtenido desde alga

fresca

Obtenido desde alga

seca.

M. pyrifera 125 83,5 96,5

D.antarctica

cochayuyo

130 55,0 198,6

D. antárctica

Hulte

127 48.7 273,7


30

2.6 Durvillaea antarctica.

Ubicación taxonómica según Silva et al., 1996.

División: Phaeophyta

Clase: Phaeophyceae

Orden: Durvillaeales

Familia: Durvillaeaceae

Género: Durvillaea

Especie: antarctica

D. antarctica, más conocida como cochayuyo, corresponde al alga de mayor consumo en

nuestro país, encontrándose en toda la costa chilena.

Las plantas pueden medir hasta 15 m de largo, son de color pardo verdoso oscuro o pardo

amarillento. Esta alga se divide en cochayuyo, que corresponde a las frondas de la planta, que

suelen medir entre 3 y 12 cm de ancho y Hulte, que representa al tallo; el cuál, generalmente se

consume sin previa hidratación. (Figura 6).

Crece adherida a rocas, mediante el rizoide, que es como una raíz que se aferra al terreno;

especialmente, en lugares de oleaje intenso y cierta profundidad. Para que toda la planta pueda

recibir la energía del sol, las frondas están formadas por cavidades llenas de aire, separadas por

tabiques, envueltas en una elástica y firme membrana; lo que les permite flotar (Buschmann et al.,

1984).

El cochayuyo como tal, destaca nutricionalmente por su equilibrada cantidad de yodo,

aproximadamente, 150 µg/100g.

31

Figura 6. Conformación anatómica general de Durvillaea antarctica, considerando frondas

laminares, estipe, disco adhesivo y frondas cilíndricas. En el extremo superior derecho se

esquematiza un corta transversal de fronda y en el extremo inferior derecho, la apariencia de un

ejemplar juvenil de la especie. Extraído de Guzmán del Bróo et al., 1986.

32

Es rico en minerales, fibra y proteínas, además, posee todos los aminoácidos esenciales. Todo esto

convierte al cochayuyo en una fuente valiosa de nutrientes; por lo cual, es ideal que se le incorpore

en la dieta habitual.

Esta alga kelp, la cual produce esporas de corta vida (1 – 2 h) (Buschmann et al., 1984), habita

expuesta a las rocas intermareales y submareales superficiales subantárticas y en el hemisferio sur

en zonas temperadas de costas rocosas (Hay, 1977). En Chile, las especies se encuentran presente

desde la región de Magallanes, extendiéndose hasta el sur. Las estipes y frondas secas de

Durvillaea antarctica han sido explotadas para el consumo humano en Chile, inicialmente por los

mapuches, anterior al establecimiento español (Masuda, 1986).

2.7 Polisacáridos de reserva en algas pardas: Laminarina.

En algas marinas (como en algas Kelp), el carbono es almacenado en unidades monoméricas

(como manitol) o en unidades poliméricas. Almacenamientos en formas poliméricas son mucho

más ventajosas que formas monoméricas, puesto que éstas últimas producen una mayor alteración

osmótica en relación a las poliméricas. (Lobban, 1985). Generalmente el manitol no se encuentra

en algas pardas, aun cuando se puede llegar a presentar hasta en un 30% en relación al peso seco

de ésta.

La laminarina, el segundo mayor polisacárido de reserva en algas pardas (Figura 7), fue

inicialmente caracterizado por Schmiedeberg (1885), desde una mezcla de polisacáridos. La

glucosa en esta moléculas se encuentra en la forma β (que significa que el grupo hidroxilo presente

en el C1, el carbono quiral, se encuentra presente por sobre el plano en una proyección de Haworth).

Los enlaces presentes en este polisacárido, corresponden a uniones β (1 – 3) y β (1 – 6) en menor

proporción.

33

Figura 7. Estructura del polisacárido de reserva Laminarina (principalmente con uniones β (1

– 3)), consistente en dos tipos de cadenas. En (a), el manitol se encuentra unido al extremo terminal

(cadenas – M), mientras que en (b), la glucosa está unida al extremo terminal (cadenas – G).

Extraído de Percival y McDowell, 1967.

34

Dos clases de cadenas de Laminarina puede existir, la cadena – M, con manitol en el extremo

terminal y la cadena – G, con presencia de glucosa en su extremo terminal (Percival y Mc dowell,

1967). La cantidad que puede llegar a almacenarse de este polisacárido depende de múltiples

factores en el alga, entre los cuales se consideran la etapa de crecimiento, tejido algal, condiciones

de reproducción, condición de luminosidad, período del año y condiciones medioambientales en

general.

2.8 Polisacáridos extracelulares y de la pared celular en algas marinas.

La pared celular algal está formada por al menos dos membranas diferentes. La más interna

consiste de un esqueleto microfibrilar que otorga rigidez a la pared (Figura 2). La membrana

externa es una matriz amorfa (Kreger y Levin, 1962). Existe cierta evidencia que la matriz no

penetra las microfibrillas, pero sí se encuentra unida a la membrana más interna por uniones de

hidrogeno (Mackie y Preston, 1974). La membrana interna microfibrilar, se encuentra comprimida

con un polímero de celulosa (homopolímero de glucosa, con uniones β (1 – 4)) (Figura 8a). Dos

otras moléculas fibrilares, xilano (polisacárido constituido por uniones β (1 – 3) de D – xilosa y

diversas ramificaciones y sustituciones y manano (oligosacárido de D – manosa con uniones β (1

– 4)) son constituyentes principales en algas rojas y verdes (Figura 8b y 8c). Finalmente, el alginato

contribuye a la fuerza de la pared celular de algas pardas, en adición a otorgarle flexibilidad

(Smidsrod y Draget, 1996). Incluso si el alginato está presente dentro de la membrana más interna,

la celulosa se mantiene como el principal componente estructural. La fucoidina no sólo se

encuentra presente en la matriz, sino que también en la pared celular interna. (Chapman, 1980).

35

Figura 8. Moléculas fibrilares de la pared celular algal. (a) Celulosa, homopolisacárido de glucosa

con uniones β (1 – 4), (b) uniones estructurales β (1 – 3) y β (1 – 4) presentes en xilano de algas

rojas, y (c) manano, oligosacárido de manosa con uniones β (1 – 4) de algas verdes. Extraído de

Percival y McDowell et al., 1967.

36

2.9 Polisacárido extracelular en algas pardas: Fucoidina.

La molécula de laminarina fue inicialmente aislada por Kylin (1915), y de ahí en adelante ha

sido encontrada en numerosas especies de la familia Laminariaceae (Figura 1), con porcentajes de

masa seca de entre 5 – 20 % (Black, 1953).

La fucoidina es un heteropolisacárido ramificado, con una composición química (Tabla IX) y

peso molecular variable (Tabla X) según la especie algal que se trate y al cual se le atribuyen

múltiples actividades fisiológicas. Está constituido principalmente por L – fucosa (Figura 9); una

hidrólisis ácida de la fucoidina, puede liberar concentraciones considerables de D – xilosa, D –

galactosa y ácido úrico, entre otros (Mackie y Preston, 1974).

2.10 Importancia médica y Propiedades fisiológicas en algas marinas.

Las distintas especies de algas marinas poseen una serie de propiedades o cualidades,

atribuibles polisacáridos (Tabla XI) u otras moléculas con actividad biológica (Tabla XII), que

resultan fisiológicamente favorables para el hombre, sin embargo, no se debe olvidar que hay

algunas de ellas que le son patógenas. De las enfermedades y propiedades fisiológicas producidas

por la acción de algas marinas, se pueden mencionar las siguientes:

2.10.1 Protothecosis. Enfermedad causada por un alga unicelular del Género Prototheca

(Chlorophyceae: Chlorococcales), que carece de clorofila, parecida a una levadura pero que se

reproduce por la formación de endospora (Nosanchuk y Geenberg, 1973). Diferentes especies de

Prototheca han sido aisladas de lesiones humanas como bursitis, infecciones secundarias a

bacterias, infecciones de la piel, lesiones nodulares en la nariz y en inflamaciones del tracto

digestivo con diarrea crónica (Kaplan, 1978, Venezio et al., 1982).

37

Tabla IX. Composición química de algunos fucoidanos según la especie algal.

Alga parda Composición química (proporciones)

F. vesiculosus Fucosa, sulfato

F. evanescens C. Ag. Fucosa/sulfato/acetato (1/1.23/0.36)

F. distichus Fucosa/sulfato/acetato (1/1.21/0.08)

F. serratus L. Fucosa/sulfato/acetato (1/1/0.1)

Lessonia vadosa Fucosa/sulfato (1/1.12)

Macrocystis pyrifera Fucosa/galactosa (18/1), sulfato

Pelvetia wrightii Fucosa/galactosa (10/1), sulfato

Undara pinnatifida (Mekabu) Fucosa/galactosa (1/11), sulfato

Laminaria angustata Fucosa/galactosa/sulfato (9/1/9)

Adenocystis utricularis Fucosa/galactosa/manosa, sulfato

Spatoglossum schroederi Fucosa/xilosa/galactosa/sulfato (1/0.5/2/2)

Hizikia fusiforme Fucosa, galactosa, manosa, xilosa, sulfato

Sargassum stenophyllum Fucosa, galactosa, manosa, glucosa, xilosa,

sulfato.

Extraído de Kaplan, 1978.

38

Tabla X. Variación del Peso Molecular de la Fucoidina según la especie algal.

Peso Molecular Fucoidina Especie algal

13 KDa Ascophyllum nodosum

16 KDa Ascophyllum nodosum

25 KDa Hizikia fusiforme

100 – 180 KDa Fucus vesiculosus (Laboratorio Sigma)

160 KDa Fucus vesiculosus (nativa)

189 KDa Laminarina japonica

200 KDa Cladosiphon okamuranus

950 KDa Hizikia fusiforme.

Extraído de Kaplan, 1978.

39

Figura 9. Estructura de fucoidina, heteropolisacárido ramificado de L – fucosa, éste último como

el constituyente principal y con predominantes uniones α (1 – 2). Extraído de Percival y McDowell

et al., 1967.

40

Tabla XI. Propiedades fisiológicas de polisacáridos de algas o de extractos algales,

reportados en humanos y otros organismos.

Actividad Sustancia Activa

Anticoagulante, Antitrombótica Polisacáridos sulfatados, Fucoidanos de Ascophyllum y

otras algas pardas.

Anticoagulante Derivados de dextranos, y fracciones de fucoidanos de

algas pardas.

Antitumoral y antiproliferativa en casos

de cáncer.

Fucoidanos, polisacáridos sulfatados de Ascophyllum.

Antioxidante Pigmento fucoxantina de algas pardas asiáticas: Undaria

saragassum, Hijikia.

Antioxidante Función compartida con otros polisacáridos solubles en

agua, como diversas sales de alginato sulfatado y

manuronato.

Disminución de la absorción intestinal

de glucosa e insulina en cerdos.

Polisacáridos extraídos o alginatos de algas Euchema

cottonni, Laminaria digitata, Palmaria palmata.

Actividades inmunomodulatorias Polisacáridos extraídos con aguas calientes, de algas

pardas en Japón; Hijikia y Laminaria japonica.

Extraído de Cruz – Suárez et al., 2010.

41

Tabla XII. Moléculas con actividad biológica en algas marinas.

Moléculas con actividad biológica Actividad específica.

Proteínas Fuente de aminoácidos esenciales.

Elementos de comunicación intercelular.

Actividad antiviral

Actividad antimicrobiana

Actividad antiinflamatoria

Actividad antioxidante

Ácidos grasos poliinsaturados Actividad antibiótica

Actividad antifúngica

Pigmentos Actividad antiviral

Actividad Neuroprotectora

Actividad antiobesidad

Actividad antiangiogénica

Actividad anticáncer

Extraído desde Chojnacka et al., 2012.

42

Tabla XII (Cont.).

Polifenoles Potente antioxidantes.

Actividad antimicrobiana.

Actividad antiviral.

Actividad antialérgica

Minerales Promotor del crecimiento

Hormonas de crecimiento vegetal Control sobre la división celular

Extraído desde Chojnacka et al., 2012.

43

2.10.2 Silicosis. Cuando es producida por algas, consiste en una irritación pulmonar que causa la

descompensación de las fibras del tejido conectivo; frecuentemente se presenta cuando el personal

que trabaja con tierra de diatomeas lo hace sin usar mascarilla, con lo cual se produce la aspiración

de polvo de silicio (Beskow, 1978).

2.10.3 Bocio. Se han reportado algunos casos de bocio atribuibles a dieta por algas; en Japón se

produjeron casos de bocio por la ingestión de exceso de yodo contenido en tabletas de algas, casos

que fueron remediados simplemente disminuyendo la ingesta (Liewendahl y Torula, 1972).

2.10.4 Arseniosis. El alga Hizika (Phaeophyceae: Fucales), posee una alta concentración de

arsénico y se ha observado que en ratas causa envenenamiento cuando se las consume en gran

cantidad; sin embargo, no se han observado casos clínicos en humanos (Watanabe et al., 1980).

2.10.5 Alergias. El alga verde – azulada Lyngbya majuscula, causa una dermatitis en nadadores

cuando se produce un contacto severo, especialmente en climas templados. De esta especie se han

aislado dos toxinas que causan dermatitis; la debromoaplysiatoxina y la lyngbyatoxina A. Esta

causan inflamación de las membranas mucosas de los ojos y nariz y reacciones en la piel, con

producción de ampollas (Moore, 1977). La diatoma Fragilaria striatula (Fragilariales), también ha

sido implicada como productora de dermatitis alérgica (Hashimoto, 1979).

2.10.6 Actividad Anticancerígena. Hay informes que muestran evidencias de actividad antitumoral

en especies de los Géneros Sargassum y Laminaria (Phaeophyceae). Se logró aislar algunos

compuestos que al ser probados contra el sarcoma de rata 180 y contra tumores leucémicos,

demostraron una moderada inhibición del crecimiento (Yamamoto et al., 1982, Bhakuni et al.,

1976, Chenieux et al., 1980, Mayer y Panick, 1984, Chong y Parish 1985, Zea et al., 1986).

44

2.10.7 Actividad Antihelmíntica. El alga roja del Género Digenea (Ceramiales), es conocida como

un vermífugo eficaz en contra de Ascaris lumbricoides. El principio activo es el ácido Kainico que

a la dosis de 5 a 10 mg, fuerza al parásito a salir del huésped sin producir efectos colaterales. La

actividad se produce porque el principio activo causa parálisis neuromuscular y el gusano pierde

la habilidad de mantenerse en posición contra la acción del intestino delgado, siendo arrastrado

junto con las deposiciones del paciente (Hoope, 1979).

2.10.8 Actividad anticoagulante. Del alga marina Laminaria digitata, Macrocytis pyrifera y

Durvillaea antarctica, se aisló el polisacárido laminarina, que posee acción anticoagulante, tanto

in vivo como in vitro, y cuya potencia se estima equivalente a un tercio del de la heparina, que es

uno de los de mayor acción anticoagulante. (Nigrelli et al., 1967, Stein y Borden, 1984).

2.10.9 Actividad Laxante. Se sabe que los ficoloides tienen efectiva acción como laxantes y no

producen hábito (Gopal, 1979).

2.10.10 Actividad antifúngica. Las investigaciones acerca de la actividad antifúngica de extractos

de algas marinas, se inician con los trabajos de Pratt et al., (1951), quienes ensayaron sus

compuestos sobre Trichophyton metagrophytes y Trichophyton rubrum. En un acabado estudio,

Welch (1962) analizó las propiedades fugistáticas de 35 especies de algas marinas, contra seis

especies de hongos patógenos y encontró que once de estos extractos presentaban amplias zonas

de inhibición contra una o más de los organismos de prueba. En forma análoga y algo más tarde,

Pesando y Caramb (1984), muestrearon algas del Mar Mediterráneo y en los extractos obtenidos,

encontraron actividad contra dermatofitos, levaduras y mohos. Ma Jing – Wen y Tan Wei – Ci

(1984), por su parte, estudiaron la actividad antibiótica de 60 especies de algas de tres Divisiones

45

de macroalgas de la costa de China, contra Sccharomyces cerevisiae y sólo Laurencia spp y

Plocamium telefairiae presentaron baja acción contra esta levadura.

Reichelt y Borowitzka (1984), realizaron un intensivo estudio de la flora y fauna marina en

Australia y nueva Zelanda con el objetivo de encontrar nuevos compuestos de eventual uso en la

terapia humana y veterinaria; los extractos de algas fueron probados contra Candida albicans,

Cryptococcus neoformans, Trichophyton mentagrophytes y Microsporum audouini y obtuvieron

actividad significativa para los tres primeros con el extracto de Delisea elegans, en tanto

Microsporum audouni fue sensible a extractos de Gracilaria spp.

2.10.11 Actividad antiviral. En este ámbito, destaca el trabajo pionero Kathan (1965), quien ensayó

la protección de embriones de pollo contra el ataque del virus de la Influenza A, usando extractos

de Macrocytis pyrifera. También fue este autor, quién reportó la acción inhibitoria de los extractos

de esta misma alga sobre la neuraminidasa viral.

En Sudamérica, recién en 1986, Mayer et al., (1987), estudiaron la actividad antiviral de

extractos de Macrocytis pyrifera, observando la protección de una capa de células de amnios

humanos, del efecto citopático del virus de la estomatitis vesicular. Los mismos autores, también

estudiaron la actividad antiviral de la fucoidina, alginato de sodio y laminarina, contra el virus de

la estomatitis vesicular. Observaron que la fucoidina, presentaba una gran actividad antiviral.

Supusieron que la fucoidina se uniría a receptores específicos (lectinas), que se encuentran

presentes en diferentes tipos celulares (Mayer et al., 1984). Otras hipótesis, respecto del mecanismo

de acción antiviral de la fucoidina, indican que éstos podrían interferir la adsorción de los virus a

la célula susceptible o interactuar directamente con la partícula viral, formando un complejo

inhibidor – virus, que disminuía la tasa de partículas virales adheridas a la membrana celular y con

46

ello, la capacidad infecciosa del virión, o bien, gracias a la capacidad de las fucoidinas de unirse a

metales, podrían funcionar como bloqueadores antivirales (Allen y Dawson 1960, Paskins –

Hurjburt et al., 1978; Richard et al., 1978; Blunden et al., 1981; Bauer 1985; Hutchinson 1985;

Abrams et al., 1988).

El agar – agar y las carrageninas, ambos extraídos de Rhodophyta, han sido informados como

inhibidores de los virus de la Influenza A, Herpes simplex, polio y dengue, además de la actividad

contra virus de plantas, tales como el virus del mosaico del tabaco. En Chlorophyta se ha

encontrado actividad antiviral contra Togaviridae, Influenza A y VMT (Takemoto y Spicer, 1965).

Los extractos acuosos de muchas algas rojas son activos contra ciertos retrovirus, y se supone

que la acción pueda deberse a las carrageninas, que son polisacáridos comunes de las paredes

celulares de estas algas y son comunes de las paredes celulares de estas algas y son co –

internalizados al interior de la célula con el virus infectante inhibiéndolo (Baba et al., 1988).

Neushul (1990) informa que los carragenanos interfieren en la fusión de células infectadas con el

virus del VIH e inhiben específicamente la transcriptasa reversa. Estudios clínicos en pacientes con

SIDA, internados en el Hospital General de San Francisco, fueron tratados con sulfato de dextrano,

vía intravenosa y entérica, con resultados muy satisfactorios (Starr et al., 1962).

La literatura científica actual informa de actividad antiviral en las tres divisiones de macroalgas

y ésta se manifiesta contra virus de células animales y células vegetales. Sin embargo, no se informa

aún acerca de la actividad en contra de virus bacterianos o de cianófagos.

2.10.12 Actividad inmunológica e inflamación. La experiencias con estimulación de la

multiplicación de células T in vitro por extractos algales, procede de observaciones in vivo de otros

investigadores. (Cooper et al, 2002. Subramian et al, 2001).

47

Los desórdenes inflamatorios, como psoriasis y algunos tipos de colitis, son caracterizados

por una presencia excesiva de linfocitos que pueden ser aminorados por la ingestión de algas

marinas. Fucoidanos derivados de las algas, inhiben el pasaje de linfocitos hacia el tejido por el

bloqueo de receptores. Estos fucoidanos están siendo investigados clínicamente por su potencial

de prevenir la destrucción postisquémica de tejido cardíaco muscular, por una acción sobre

linfocitos. (Ritter, 1998).

2.10.13 Actividad Hipolipemiante e Hipotensora. Muchas comidas son conocidas por su

capacidad de reducir los niveles de colesterol y las algas pardas caen en esta categoría. La ingestión

de Undaria, produce una disminución del colesterol sanguíneo en ratas (Iritani y Nogi, 1972). Este

efecto sobre el procesamiento lipídico, parece ser el resultado de la estimulación de enzimas

hepáticas (Murata et al., 1999).

Un extracto de F. vesiculosus, de forma dosis – dependiente, redujo en forma efectiva la

elevación de triglicéridos sanguíneos y los niveles totales de colesterol. En ratas, con una dieta alta

en colesterol por 21 días, la aplicación de la suplementación en la dieta de U. pertusa, produce una

disminución en el colesterol y LDL, no así en los triglicéridos séricos. (Pengzhan et al., 2003). Los

efectos de U. pertusa, fueron modificados una vez que ésta fue sometida a degradación a pequeñas

fracciones moleculares. Estos derivados de bajo peso molecular y viscosidad intrínseca, no

redujeron el colesterol sérico, pero sí normalizaron la Hipertrigliceridemia de estos animales, así

como también el HDL. El mecanismo por el cual se consiguen estos efectos, es incierto, pero

aparentemente no involucra la acción sobre ácidos biliares, puesto que U.pertusa y sus derivados

de bajo peso molecular, incrementan la excreción biliar.

48

Recientemente, ha sido reportado que la fucoidina de L. japonica, reduce el contenido sérico

de LDL y triglicéridos y aumenta el HDL en modelos de ratas hiperlípidemicas (Huang et al.,

2010). El tratamiento también incremento la actividad de lipoproteína lipasa (LPL), lipasa hepática

(LH), y Lecitina colesterol acil transferasa (LCAT) en suero. Estos cambios en la actividad

enzimática, pueden ser el resultado directo del tratamiento fucoidano o un efecto indirecto asociado

con la mejora del perfil lipídico. (Chopin et al., 1999).

Los polisacáridos sulfatados algales, han demostrado efectos prometedores en el manejo de

la hiperlipidemia asociada con la toxicidad de ciertas drogas (efectos adversos). Fucanos, de S.

polycystum, demostraron tener un efecto preventivo en la elevación de colesterol y triglicéridos en

suero y tejido hepáticos, derivado de la toxicidad hepática por acetaminofeno. (Raghavendran et

al., 2005). De forma similar, un polisacárido sulfatado de S. wightii, redujo hiperlipidemia y

normalizo la LPL y LCAT en plasma un caso de Nefrotoxicidad inducida por el uso de Ciclosporina

A. (Josephine et al., 2007).

Undaria contiene cantidades suficientes de laminina y tetrapéptidos similares, que han

demostrado poseer una actividad inhibitoria sobre la enzima convertidora de angiotensina, en

ensayos in vivo e in vitro (Suetsana y Nakano, 2000). Una ingestión de 3.6 g/día de Undaria

(wakame) por cuatro semanas, resulta en una caída de 14 mmHg en la presión sistólica, en pacientes

asiáticos que tenían hipertensión (Krothiewski, 1991).

2.10.14 Actividad antibacteriana. Fue estudiada por primera vez por Pratt et al., (1951), al observar

que diversas especies de algas tropicales presentaban una importante actividad antibacteriana. Los

avances significativos que se han continuado hasta el día de hoy, han sido numerosos y se

49

incorporan sólo alguno de ellos en la Tabla XIII (Chester y Stott 1956, Fassina 1962, Olesse et al.,

1964; Blunden et al., 1981; Rossel y Srivastava 1987, Steinberg et al., 1991).

Rossel y Srivastava (1987), estudiaron la actividad antibacteriana de nueva algas pardas y las

probaron contra nueve especies bacterianas, encontrando que la actividad antimicrobiana está dada

principalmente por ácidos grasos insaturados, los cuales pueden estar en el alga como ácidos grasos

libres o formando parte de mono, di y triglicéridos. Reichelt y Borowitzka (1984), en cambio,

atribuyeron la actividad antimicrobiana de algas pardas australianas, a la acción de fenoles, como

resorcinol y floroglucinol.

Entre los principios activos aislados de alga marinas, que tienen actividad antibiótica, se

mencionan los siguientes; ácido acrílico, ácidos grasos insaturados, fenoles, sesquiterpenos

halogenados, carbonilos, hidroquinonas bromadas, etc. (Howard y Fenical 1978, Steinberg et al.,

1991)

Diversos autores, estiman que algunas de las sustancias con actividad antibiótica y antiviral

producidas por algas marinas, tendrían una función ecológica de protección del organismo que la

produce, provocando la eliminación de microorganismos epi o endofiticos y provocando respuestas

de repelencia en sus predadores (Krasilnikova 1961, Steinberg 1986, Santelices 1989).

Se ha observado que la actividad antibiótica de las algas marinas presenta marcadas

variaciones estacionales en términos cualitativos y cuantitativos, hasta el punto que Chester y Stott

(1956), señalan que cada especie de alga posee su propia periodicidad en la producción del

antibiótico. En cambio, otros autores encuentran cuatro patrones de producción del antibiótico, que

van desde uniforme todo el año, hasta máxima producción en Invierno, en Primavera o en Verano

(Hornsey y Hide 1985, Valdebenito 1981, Mora 1981).

50

Tabla XIII. Lista de algunas algas marinas reportadas con actividad antibacteriana.

Nombre del alga Microorganismo

Ceramium indica, Enteromorpha intestinalis,

Ulva lactuca, Gelidiella acerosa, Corallina

officinalis, Gracilaria coticata, Sargassum

sp., Galaxaura oblongata, Grateloupia sp.,

Ceramium indica, Laurentia pedicullata,

Sargassum sp., Padina gymnospora,

Stoechospermum marginatum, Cystoseira sp.,

Caulerpa racemosa, Caulerpa

scalpelliforrmis, Spathoglossum variabile,

Halimda tuna, Gelidiopsis gracilis, Iyengaria

stellata, Gelidium sp., Udotea indica,

B. cereus ATCC 11778, M. flavus ATCC

10249, K. pneumonia NCIM 2719, P.

testosterone NCIM 5098, C. freundii ATCC

10787.

Corallina officinalis, Cystoseria barbata,

Dictyota dichotoma, Halopteris filicina,

Cladostephus spongiosus, Ulva rigida.

S.aureus, M. luteus, E. faecalis, E. coli, E.

aerogenes, E. coli O157:H7

Gracilaria tikvahiae, Ulva lactuca, Ulva

fasciata, Sargassum fluitans.

E. coli, S. aureus, S. enteritidis, S.

epidermidis, P. aeruginosa, S. faecalis, C.

albicans.

Ulva lactuca, Padina gymnospora, Sargassum

wightii, Gracilaria edulis.

S. aureus, V. cholerae, S. dysentriae, S. bodi,

S. paratyphi, P. aeruginosa, K. pneumoniae.

Extraído de Chanda et al., 2010.

51

Tabla XIII. (cont.)

Caulerpa prolifera, Gracilaria domingensis,

Gracilaria sp., Amansia smultifida.

E. coli, E. aerogenes, K. pneumoniae, M.

morganii, P. aeruginosa, S. typhi, S.

typhimurium, S. enteritidis, S. cholerae.

S. marginatum, St. marginatum, P.

tetrastromatica, P. gymnospora, C. implexa,

D. australis, D. bartayresiana, S. aspermum,

Asparagopsis taxiformis, Amphiroa

fragilissima, Jania reubens, Caulerpa

racemosa, Caulerpa peltaa, Caulerpa

taxifolia, Codium fragile, Chlorodesmis

fastigiata.

B. subtilis, E.coli, Pseudomonas sp., S.

pyogenes, S. aureus, P. vulgaris, K.

pneumoniae, S. morgani, C. albicans.

Gacilaria corticata, Ulva fasciata,

Enteromorpha compressa.

V. alginolyticus, P. aeruginosa, A. hydrophilia

E, tarde, P. fluorescens, A. hydrophila.

Valonia aegrophila, Ulva pertusa, Halimeda

opuntia, Halimeda tuna, Caulerpa racemosa,

Caulerpa mexicana.

S. aureus, B, subtilis, E. coli, C. albicans.

Enteromorpha linza S. aureus, S. epidermidis, S. faecalis, B,

subtilis, S. typhimorium, P. aeruginosa, E.

cloacae, E. coli, C. albicans.

52

Por otra parte, Hornsey y Hide (1985) analizaron la distribución de la sustancia antibiótica

dentro del talo de seis especies de algas y observaron que sólo Ulva lactuca, presentaba un

contenido uniforme en toda su economía, en tanto que tres especies, Chondrus crispus, Dilsea

carnosa, Codium fragile, exhibían actividad antibiótica aumentada en las regiones más jóvenes de

la planta.

En Laminaria sacharina, la menor actividad se presentó alrededor de las zonas

meristemáticas, en tanto que en Laminaria digitata, la actividad antibiótica se distribuyó

irregularmente dentro del talo.

2.10.15 Actividad Antioxidante. Los procesos metabólicos normales de todos los organismos que

utilizan oxígeno pueden producir especies reactivas del oxígeno (EROS o ROS), se estima que

cerca del 2 – 5% del oxígeno total consumido se convierte en EROS (O2- , OH-, H2O2,

-O2, entre

otros). Probablemente, la fuente endógena más importante generadora de EROS es la cadena

respiratoria mitocondrial, aunque también pueden incluirse algunas reacciones del metabolismo de

los prostanoides, la autoxidación de las catecolaminas, la actividad de la Xantina oxidasa y la

activación de fagocitos y células endoteliales (Ríos de Molina 2003. Ferrari, 1994).

En situación patológica se incrementan sustancialmente estas especies químicas, provocando

una alteración orgánica conocida como estrés oxidativo caracterizado por el daño a biomolecular,

viéndose implicadas en la génesis o exacerbación de numerosos procesos en el aparato

cardiovascular (arteriosclerosis, cardiopatía alcohólica), sistema neurológico (enfermedad de

Parkinson, Alzhemier traumatismo craneales), aparato ocular (Cataratas, fibroplasia), aparato

respiratorio (cáncer de pulmón), riñón (Nefrotoxicidad por metales) y artritis reumatoidea, entre

otros (Rodríguez et al., 2001. Elejalde, 2001).

53

Entre los desórdenes metabólicos crónicos de mayor morbilidad y mortalidad esta la diabetes,

del 5 al 10% de la población mundial la padece, y se estima que para el año 2010 cerca de 239

millones de personas pueden ser afectadas (Hamdan y Afifi, 2004). La diabetes y el estrés oxidativo

parecen relacionarse (Sabu y Kuttan, 2002. Ugochukwu y Babady, 2002), existe evidencia que

demuestra que los niveles elevados de glucosa en la sangre conducen a la autooxidación de esta

misma, también la glicosilación no enzimática de proteínas y el aumento del metabolismo de la

glucosa por la ruta del poliol – sorbitol son contribuyentes del proceso; en cualquier caso la

producción de EROS se incrementa, y más aún en presencia de metales como el hierro (Failla y

kiser, 1981). Las EROS contribuyen a la resistencia a la insulina debido a que, interfieren con las

vías de señalización inducida por esta hormona, evitando así la traslocación del transportador de

glucosa GLUT 4 a la membrana plasmática, por otra parte una descarga de EROS es liberada por

los neutrófilos, exacerbando los procesos inflamatorios y elevando la concentración de las EROS

ajo condiciones patológicas persistentes (Micelii, 2005. Fernández et al., 2004).

Si bien los organismos vivos soportan multitudinarios factores endógenos y exógenos de estrés

oxidativo, también poseen numerosos sistemas de defensa antioxidantes regulables, enzimáticos

(superóxido dismutasa, catalasa, GSH – peroxidasa, quinonas reductasas y hemoxigenasa) y no

enzimáticos (Se, Zn, vitaminas Cy E y carotenoides) que conforman la defensa antioxidante frente

a las EROS (Kim et al., 2003), pero que no siempre resultan ser una barrera efectiva.

Muchos estudios in vitro han demostrado que la fucoidina presenta una actividad antioxidante

muy significativa, así como también existen otros antioxidantes algales (Tabla XIV) con distintas

actividades fisiológicas o efectos beneficiosos para la salud (Tabla XV). La fucoidina es un

excelente antioxidante natural, con gran potencial para prevenir la liberación o síntesis de ROS,

producto de múltiples patologías.

54

Tabla XIV. Categorización de grupos antioxidantes, ejemplos de ellos y fuente algal de la

cual proceden.

Categoría General Molécula Fuente algal

Carotenoides β – Caroteno Chondrus crispus,

Mastocarpus stellatus.

Fucoxantina Algas pardas

Anteraxantina, luteína,

Violaxantina, zeaxantina.

Algas rojas

Compuestos fenólicos. Estipodiol, Isoepitaondiol,

Taondiol.

Taonia atomaria

Terpenoides Cystoseria sp.

Pigmentos ficobilinas Ficoeritrina Algas pardas

Ficocianina

Polifenoles Catequinas, Epicatequina,

Galato

Halimeda sp.

Flavonoides Palmaria palmata

Florotaninos Sargassum pallidum

Fucus vesiculosus

Extraído desde Cornish et al., 2010.

55

Tabla. XIV (Cont.).

Polisacáridos Sulfatados Fucoidina, ácido algínico,

laminarina.

Turbinaria conoides

Laminarina, Fucoidina. Laminaria japonica,

Durvillaea antarctica,

Macrocystis pyrifera.

Galactanos sulfatados Algunas algas rojas

Vitaminas Ascorbato Chondrus crispus

Mastrocarpus stellatus

Sargassum sp.

Vitamina A Kappaphycus alvarezii


56

Tabla XV. Compuesto antioxidante algal con actividad fisiológica o efecto beneficioso para

la salud.

Compuesto antioxidante Actividad fisiológica/Efecto beneficioso.

β - Caroteno, Luteína Antimutagénico

Protector ante el cáncer de mama

Carragenanos, oligosacáridos del Carragenano Antitumoral, Anti – HIV

Fucoxantinas Antiangiogénico

Efecto protector ante la

deficiencia de retinol

Galactanos sulfatados Antiviral

Florotaninos Antiinflamatorio

Bactericida

Inhibición peróxido de hidrogeno

Hipertensión

Polifenoles Antimicrobiano

Protección vascular


57

La fucoidina de Laminaria japonica puede prevenir el incremento del peróxido lipídico (LPO,

implicado en la liperoxidación lipídica), en suero, hígado y bazo de ratones diabéticos. Este

fucoidano tiene un potente efecto contra el radical superóxido, pero uno menor en el radical

hidroxilo y en DPPH. (Micheline et al., 2007).

2.11 Digestión enzimática y método de detección de productos de hidrólisis.

2.11.1 Enzimas.

Las capacidades de los polisacáridos algales señaladas anteriormente (fucoidina y

laminarina), se ven mejoradas cuando se trata de sus oligómeros con ramificaciones β-1,6 que son

los que tendrían un mayor efecto inmunoestimulador (Elyakova et al., 2006).

Laminarina puede ser hidrolizada por β-glucanasas microbianas resultando fragmentos de

4 – 6 residuos de monosacáridos (β – glucanos, que según su extensión de monómeros pueden

recibir nombres como laminaribiosa, laminaritreosa o laminariteraosa, en la caso de la hidrólisis

de la laminarina) que preservan la actividad biológica del polisacárido, estas enzimas son

encontradas en las bacteria y hongos marinos que colonizan las algas y son capaces de degradar la

laminarina y otros carbohidratos presentes. Estas enzimas son clasificadas como exo-β-1,3-

glucanasa y endo-β-1,3-glucanasa.

Las glucanasas cumplen distintos roles fisiológicos: en plantas terrestres, están involucradas

en diferenciación celular y defensa contra hongos patógenos. En hongos tienen diferentes funciones

en procesos morfogenéticos, movilización de β-glucanos e interacción hongo-patógeno-planta. En

bacterias, cumplen funciones metabólicas (Gueguen et al., 1997).

La enzima específica que degrada laminarina es laminarinasa, una endo-β-1,3-glucanasa.

Se han identificado dos tipos de laminarinasas, endo-β-1,3(4)-glucanasa y endo-β-1,3-glucanasa;

58

endo-β-1,3(4)-glucanasa es capaz de hidrolizar ambos enlaces β-1,3 y β-1,4-glicosídicos, mientras

que endo-β-1,3-glucanasa hidroliza principalmente enlaces β-1,3-glicosídicos (Allardyce et al.,

2008).

2.11.2 β – glucanos y distribución en levaduras, hongos y algas según el tipo de enlace

glucosídico que presentan.

Los β – glucanos, corresponden a oligómeros cortos resultantes de la hidrólisis de ciertos

polisacáridos, pero también pueden ser encontrados de forma natural, en microorganismos y

plantas mayores, como estructuras conformantes de la pared celular, como material de reserva en

el espacio citoplasmático o vacuolar o como substancias extracelulares de significancia o

importancia incierta. (Allardyce et al, 2008). La distribución natural de algunos β – 1,3, β – 1,6

glucanos, se muestra en la Tabla XVI.

2.11.3 Técnicas de detección, Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

La cromatografía líquida de alta eficiencia es la técnica analítica de separación más usada

en la actualidad, por su alta sensibilidad, exactitud, una gran capacidad para la separación de

sustancias no volátiles y termolábiles y principalmente por la aplicabilidad a sustancias de interés

como lo son aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos, fármacos, hidrocarburos y

variadas sustancias inorgánicas. La diferencia de esta técnica cromatográfica con la cromatografía

liquida convencional, en la que la fase móvil es un líquido, es que en la cromatografía liquida de

alta eficiencia el diámetro de las partículas de relleno de la columna es del orden de 3 a 10 µm.

además de que se utilizan altas presiones para forzar a los componentes disueltos en la fase móvil

a pasar por la columna (Skoog et al., 2001).

59

Tabla XVI. Distribución de β – 1,3 glucanos en levaduras, hongos y algas.

Fuente Enlace glucosídico 1,3 (%) Otro enlace

glucosídico/componente

Levaduras

Saccharomyces cerevisiae 80 – 90 β – 1,6

Candida albicans 28 β – 1,6

Cryptococcus laurentii --- β – 1,6, β – 1,4, β – 1,2.

Hongos

Penicilium luteum --- β – 1,6, β – 1,4

Microsporum quinckeanum --- β – 1,6

Plectania occidentalis 60 – 70 β – 1,6, fructosa, manosa.

Algas

Laminaria digitata

(laminarina soluble)

90 β – 1,6, manitol 2,7%.

Laminaria cloustoni

(laminarina insoluble)

95 β – 1,6, manitol 1,7%.

Euglena gracilis 100 ----

Extraído de Allardyce et al, 2008.

60

Básicamente las partes de un equipo de HPLC son: depósito de solventes, bomba, inyector

y detector. El detector de Índice de Refracción (IR), el cual mide la diferencia de índice de

refracción entre el solvente puro y el solvente que contiene la muestra, es el recomendado para usar

en la detección de carbohidratos en general (Quattrocchi et al., 1975).

Entre los métodos clásicos de cromatografía liquida, la cromatografía de exclusión

molecular fue el último en ser desarrollado, esta cromatografía se utiliza para el análisis de

compuestos de elevado peso molecular, los rellenos están constituidos por pequeñas partículas

(aprox. 10 µm.) poliméricas o de sílice que contienen una red de poros uniforme en los que puede

difundir las moléculas del soluto y del disolvente. Las moléculas son atrapadas por los poros y

eliminadas del flujo de la fase móvil. Las moléculas de mayor tamaño que el tamaño medio de los

poros del relleno son excluidas, siendo las primeras en eluir, las moléculas que tienen un tamaño

inferior que el tamaño del poro penetran al interior del laberinto de poros resultando atrapadas por

más tiempo, siendo las ultimas en eluir. Las moléculas de un tamaño medio cuya penetración en

los poros depende de su diámetro eluyen de forma intermedia (Skoog et al., 2001).

El resultado del ensayo cromatográfico es, por un lado, la obtención de fracciones separadas

de los componentes de la muestra, y por el otro, la de un gráfico o cromatograma, de cuya

interpretación puede extraerse conclusiones cualitativas y cuantitativas (Quattrocchi et al., 1975).

61

2.12 Hipótesis

H1. Usando diversos protocolos es posible obtener extractos de fucoidina y laminarina con

propiedades fisiológicas (antioxidante, antibacteriana y antifúngica) a partir del alga

Macrocytis pyrifera y Durvillaea antarctica.

H2. La hidrólisis enzimática refuerza las propiedades fisiológicas de los extractos de laminarina y

fucoidina obtenidos del alga Macrocytis pyrifera y Durvillaea antarctica.

2.13 Objetivo General

Efectuar la extracción, detección y caracterización parcial de laminarina y fucoidina a partir

del alga parda Macrocytis pyrifera y obtener oligosacáridos (β – glucanos) con propiedades

fisiológicas.

2.14 Objetivos Específicos

1.- Extraer laminarina y fucoidina desde Macrocystis pyrifera usando diversos protocolos de

extracción (técnicas, instrumentación y reactivos).

2.- Determinar la actividad antioxidante, antibacteriana y antifúngica, de los dos mejores extractos

de laminarina y fucoidina obtenidos.

3.- Determinar de actividad antioxidante, antibacteriana y antifúngica de oligosacáridos de

fucoidina y laminarina obtenidos mediante hidrólisis enzimática con enzimas estándar (SIGMA).

62

3. MATERIALES Y MÉTODOS.

3.1 Extracción de polisacáridos.

Las algas utilizadas para la extracción de polisacáridos fueron colectadas en dos zonas y

fechas distintas del año (estaciones del año), a saber, M. pyrifera desde Calbuco en junio de 2009

y D. antarctica desde la localidad de Pucatrihue, costa de Osorno, en abril de 2010.

Para la extracción de los polisacáridos se procedió a aplicar las metodologías propuestas

por Deville y colaboradores (Deville et al., 2004), efectuando los ajustes necesarios que no estaban

especificados en el documento antes señalado1

Es así como se determinó que para el protocolo Black et al., (Anexo 1.1) se realizaría

posterior a la adición del HCl 0,09 M una filtración con muselina para separar la fracción de mayor

tamaño, además se estableció que la primera centrifugación se realizaría a 5000 rpm durante 30

min. , se estipulo también que la coagulación con etanol se efectuaría en una proporción 1:5 (v/v)

y que la segunda centrifugación se realizaría a 8000 rpm durante 30 min. Para el protocolo Black

et al., modificado (Anexo 1.2) se establecieron las mismas condiciones mencionadas en el

protocolo anterior.

En el protocolo Yvin’s (Anexo 1.3) la incubación del alga con H2SO4 se realiza durante 150

min. a 70 °C, para una posterior filtración con muselina; la primera centrifugación y la coagulación

1Los ajustes a la metodología fueron desarrollados en el Lab. de Biotecnología del ICYTAL por Oscar Díaz R. (el

suscrito), Andrea Díaz C., y Javier Aguinaga G, estudiantes tesistas de Bioquímica de la UACh, adscritos al proyecto

FONDEF D07I 1095

63

con etanol se realizan en las mismas condiciones que en los protocolos mencionados anteriormente,

mientras que la segunda filtración se realizó a 5000 rpm por 30 min.

Para el protocolo Nuevo (Anexo 1.4) al igual que en los protocolos anteriores se realiza una

filtración con muselina, una primera centrifugación a 5000 rpm durante 30 min. , subsecuentemente

una coagulación con etanol en una proporción 1:5 (v/v) y una última centrifugación a 5000 rpm

durante 30 min.

Los extractos obtenidos fueron secados por medio del uso de Centrivap refrigerated

concentrator Labconco (speed back), este instrumento utiliza la fuerza centrífuga y vacío para

condensar rápidamente solventes a partir de muestras biológicas y analíticas. Concentra el soluto

en la parte inferior del vial, permitiendo la recuperación de éstos en muestras de volúmenes

pequeños, de esta forma, se obtienen muestras secas sin remanentes de alcohol.

La línea central de protocolo de extracción, se realizó a base de los protocolos elaborado

por Deville et al., (2004), y aunque finalmente estos fueron la base sobre la cual se efectuó la

detección de polisacáridos por HPLC, se confeccionaron protocolos alternativos, combinando los

protocolos de Deville y Nakamura (1985) (Anexo 1.5), o protocolos NB (NB01 a NB09, según la

modificación realizada, Tabla XVII) (Anexo 1.6). Nakamura, confeccionó su protocolo de

extracción en orden de conseguir la extracción de manitol, ácidos orgánicos, aminoácidos libres y

ácido algínico entre otros, desde el alga marina japonesa Laminaria religias. El protocolo de

Nakamura se diferencia del de Deville, básicamente en las proporciones y concentraciones de ácido

que se utilizan para la extracción, así como también en los ajustes de pH y los volúmenes de etanol

85% que se utilizaban. A su vez, la extracción de Laminarina y Fucoidina por el protocolo de

Nakamura, implica que ambos polisacáridos sean extraídos de forma conjunta en el precipitado de

uno de los pasos finales del protocolo.

64

Tabla XVII. Modificaciones realizadas a protocolos Nakamura – Black (NB)

** Los puntos 1, 2, 3 y 4, corresponden a las modificaciones realizadas al protocolo NB, que en

definitiva resulta en la numeración correspondiente a cada protocolo. En Anexos 1,6 se específica

a que proceso del protocolo corresponde cada punto.

Proto-

colo

Modifi-

cacion

1 **

Modificicación 2** Modificación

3**

( recirculaciones)

Modificación

4**

(recirculaciones)

NB01 1:8 Shaker 24h + proceso

congelamiento y descongelamiento.

1

0

NB02 1:6 Shaker 24h + proceso


4

0

NB03 1:7 Shaker 24h + proceso de


2

2

NB04 1:9 Shaker 24h + proceso de


4

4

NB05 1:5 Ultrasonido por 1-2 h 4 0



NB08 1:8 Ultrasonido 1-2 h + shaker 4 0

NB09 1:8 Ultrasonido 1-2 h + shaker 4 2

65

Por lo tanto, y en vista de las variaciones que presenta Nakamura en sus protocolos, se

realizó la combinación antes mencionada, con el propósito de elaborar un nuevo protocolo que

resulte en un método de extracción alternativo de los polisacáridos en estudio.

3.2 Detección de polisacáridos.

Los extractos obtenidos de cada uno de los protocolos ensayados, se disuelven en agua

desionizada y se procesan por HPLC ConstaMetric 3200 solvent delivery system con columnas de

exclusión molecular Ultrahidrogel Waters 500 y 250 de 7,8*300 mm y detector IR Merck detector

diferential refractometer RI-71. La utilización de equipos de cromatografía, orienta a la utilización

de los mejores protocolos, en cuánto a contenido de laminarina y fucoidina, descartando aquellos

con baja concentración de polisacáridos o simplemente en ausencia de estos.

3.3 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

Previo a este análisis y para una mayor purificación y facilitación en la detección de los

polisacáridos se realiza una filtración de la muestra con filtros Millex con membrana de PVDF,

con tamaño de poro de 0,22 µm. Una vez realizada la filtración de los extractos obtenidos por la

aplicación de los distintos protocolos, éstos se analizan por HPLC/IR, utilizando como fase móvil

agua desionizada y una columna cromatográfica de exclusión molecular a 1000 psi a un flujo de

1,0 mL/min. A temperatura ambiente y con un tiempo de corrida de 25 min. Los componentes de

la mezcla eluyen de la columna en función de sus pesos moleculares, lo que constituye el

cromatograma. Por medio de éste último, se puede realizar la identificación cualitativa y

cuantitativa de los polisacáridos.

66

La recolección de pick cromatográficos, se refiere a la captura y acumulación del eluído que

proviene del HPLC y que corresponde al inicio y fin de un pico en el cromatograma, perteneciente

a Fucoidina, o bien a Laminarina.

3.5 Hidrólisis enzimática de polisacáridos.

Una vez elegido el protocolo de mayor rendimiento y pureza basado en los resultados

mostrados en el HPLC, se procede a la degradación enzimática de los polisacáridos utilizando dos

enzimas comerciales, para luego utilizar estos productos enzimáticos en pruebas de actividad

fisiológica.

La primera enzima que se utiliza es la β-glucanasa GrainGain®, con esta enzima se realizan

ensayos enzimáticos de 6, 12, 24 y 48 h para conocer el tiempo que necesita esta β-glucanasa para

la degradación de los polisacáridos. Cada ensayo enzimático se realizó como se describe a

continuación: Se incuba a 60°C 500 µL del polisacárido con 500 µL de la enzima β-glucanasa

(cada muestra en triplicado), incubándose la mezcla a distintos tiempos (0, 30, 60 min, etc.),

cumplido el tiempo determinado las muestras se trasladan rápidamente al congelador (para

inactivar la acción hidrolítica de la enzima). Una vez terminado el ensayo las muestras son retiradas

del congelador y descongeladas en agua fría para análisis.

Por otra parte, se utilizó también la enzima comercial Laminarinasa Sigma®, la cual es

específica para el polisacárido de laminarina. Se realizaron ensayos enzimáticos de 6, 12, 24 y 48

h a 37 °C para conocer el tiempo que requería la enzima para la degradación completa de los

polisacáridos en estudio, estos ensayos se realizan de la misma forma que con la enzima GrainGain.

Los productos de hidrólisis obtenidos de la degradación enzimática con ambas enzimas

fueron detectados por medio del test de glucosa, DNS y HPLC.

3.4 Recolección de fracciones de polisacáridos (pick cromatográficos) desde HPLC.

67

3.6 Test de glucosa.

Para este ensayo se utilizó el GOD – PAP comercial (Spin React®). Este método se basa

en el principio que se específica; la enzima glucosa-oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de glucosa

de acuerdo a la siguiente ecuación:

C6H12O6 + O2 + H2O GOD C6H12O7 + H2O2

El H2O2 formado en esta reacción, reacciona con 4-aminoantipireno y 4-ácido

hidroxibenzoico en presencia de peroxidasa para formar N-(4-antipiril)-p-benzoquinona imino. La

cantidad de color formado es proporcional a la concentración de glucosa.

El procedimiento consiste en mezclar 50 µL de muestra (digerida enzimáticamente) con 2

mL del reactivo que contiene las enzimas hidrolizantes de glucosa, luego se incuba a 37 °C durante

10 min, para así medir la absorbancia contra el blanco a 505 nm en un espectrofotómetro Spectronic

Genesys 5 ®.

3.7 Ensayo del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS).

Este método detecta la presencia de un grupo carbonilo (C=O) libre presente en azúcares

reductores, involucrando la oxidación de grupos aldehídos funcionales presentes en los azúcares,

reduciéndose simultáneamente el ácido 3,5-dinitrosalicílico a ácido 3-amino, 5-nitrosalicílico bajo

condiciones alcalinas (Miller, 1959). Según la siguiente ecuación:

Grupo aldehído oxidación Grupo carboxilo

3,5-dinitrosalicílico reducción Ácido 3-amino, 5-nitrosalicílico

Este método fue estandarizado 2, de manera tal de optimizar el ensayo según las variaciones

en la metodología que se encontraron en las bases bibliográficas.

68

Los primeros ensayos en estudio, coinciden en utilizar 1,5 mL de muestra con 2 mL de

Ácido tricloroacético (TCA) y 3,5 mL de DNS, luego la mezcla obtenida se lleva a hervor por baño

maría durante 5 min. , para posteriormente dejar enfriar a temperatura ambiente. La absorbancia

fue medida a 510 nm ó 540 nm. Por contraparte, otros protocolos coinciden en mezclar 3 mL de

muestra con 3 mL de DNS e incubar a 90°C durante 15 min. , para luego dejar enfriar a temperatura

ambiente y así agregar 1 mL de tartrato de sodio y potasio al 40%; finalmente se mide la

absorbancia contra el blanco a 575 nm ó 610 nm. La estandarización se realiza utilizando las 4

mezclas propuestas y midiendo cada una de estas a las cuatro longitudes de ondas expresadas, así,

la muestra utilizada corresponde a glucosa a distintas concentraciones y el blanco a reactivo DNS.

3.8 Determinación cualitativa de Sulfatos.

La presencia de sulfatación en los polisacáridos en estudio, es relevante por el hecho de que

en variadas investigaciones del campo algal, se atribuye a estos grupo sulfatos, gran parte de la

actividad fisiológica que se intenta demostrar en este trabajo de investigación, o en su defecto

explicaría parte de la actividad biológica que presentarían Fucoidina y Laminarina. Es por ello, que

ensayos tan sólo cualitativos, son de gran ayuda para dilucidar la presencia de estos grupos. Para

esto, la muestra que posiblemente contiene grupos sulfatos es levemente acidificada agregando

gotas de HCl 2 M, para así adicionar BaCl2 0,2 M, produciéndose un precipitado blanco

correspondiente a sulfato de bario.

2 La Estandarización de la Metodología, fue desarrollada en el Laboratorio de Biotecnología del ICYTAL por Andrea

Díaz C., estudiante tesista de Bioquímica UACh, adscrito al proyecto FONDEF D07I 1095.

Finalmente se agregan gotas de ácido clorhídrico 2 M, el cual disuelve los sulfatos que no

correspondan a sulfato bario 3. Este ensayo se resume en la siguiente ecuación:

69

SO42- + Ba2+ BaSO4

3.9 Determinación de la Actividad Antioxidante.

3.9.1 Estándares y Reactivos.

Los siguientes estándares fueron utilizados; ácido gálico, ácido ascórbico y TROLOX (ácido

6-hidroxi – 2, 5, 7,8 – tetrametilcromo – 2 – ácido carboxílico 97 %), todos ellos de Sigma -

Aldrich®. El primero de ellos para la determinación de Fenoles Totales y los dos últimos, para la

metodología por DPPH. Los reactivos utilizados fueron, reactivo de Folin – Ciocalteu de Sigma -

Aldrich® y la preparación de Na2CO3 20 % p/v, para el caso del método de Fenoles Totales.

3.9.2 Método DPPH.

Este método, desarrollado por Brand – Williams, (Brand – Williams et al., 1995), se basa en

la reducción de la absorbancia medida del radical DPPH* (2,2 – difenil – 1 – picrilhidrazilo), por

antioxidantes. Ya que una notoria banda de absorción, se encuentra aproximadamente a los 520

nm, el DPPH posee una fuerte coloración violeta (en su estado reducido, con un electrón

deslocalizado), éste al ser expuesto a una sustancia antioxidante, es llevado a su forma oxidada,

donde la característica coloración violeta, cambia a un amarillo pálido, signo del que el radical

DPPH ha sido estabilizado o ha perdido su capacidad oxidante (Figura 10).

3 La Determinación cualitativa de Sulfatos, fue desarrollada en el Laboratorio de Biotecnología del ICYTAL por

Andrea Díaz C., estudiante tesista de Bioquímica UACh, adscrito al proyecto FONDEF D07I 1095. En esta

oportunidad, será utilizado como fundamentación y soporte de la Actividad Antioxidante de las algas antes

mencionadas.

70

Figura 10. Espectro de absorción del DPPH. Línea morada indica el espectro, con pico de

absorción a 520 nm, del estado reducido del radical DPPH. Línea amarilla indica el espectro, del

estado oxidado del radical DPPH, así como también el descenso en la absorción a los 520 nm.

Además se incluye el cambio en la conformación molecular, del DPPH en su estado radical

reducido (molécula izquierda) a su estado estable oxidado (molécula a la derecha), con la respectiva

acción del agente antioxidante (R*). Figura extraída de Sánchez – Moreno et al., 1997.

71

Con modificaciones el método descrito por Kim (Kim et al., 2002), se basa en la medida de

la absorbancia del radical DPPH* 5,10 ×10 -5 M (1,5 mL), disuelto en Metanol 100 %, a la longitud

de onda de 517 nm. Se añade 0.75 mL de la muestra o patrón, ésta se homogeniza cuidadosamente,

y se mantiene en la oscuridad durante 1 hora y a una temperatura de 37°C (parámetros obtenidos

por estandarización del método Brand – Williams, a raíz del bajo consenso que existía en las fuentes

bibliográficas, en cuanto a parámetros utilizados). La inhibición del radical libre (DPPH) o % IRLa,

fue efectuada midiendo el descenso de la absorbancia a 517 nm, para ello se realizaron mediciones

antes de añadir la muestra con supuesta actividad antioxidante (A0) y pasada 1 h de haber agregado

ésta (Af). La concentración de DPPH* en el medio de reacción se calcula a partir de una curva de

calibración obtenida por regresión lineal. Los resultados son expresados en TEAC y VCEAC, o en

otras palabras, actividad antioxidante equivalente a Trolox y actividad antioxidante equivalente al

ácido ascórbico respectivamente. Los resultados de actividad antioxidante, también fueron

expresados como la cantidad de antioxidante que era necesaria para disminuir la concentración

inicial de DPPH* a la mitad (EC50). El tiempo necesario para alcanzar EC50 (TEC50, determinado

gráficamente), fue un parámetro necesario de determinar, ya que junto a EC50 (ambos afectan la

capacidad antiradical), se obtiene un nuevo parámetro para la medición antioxidante, AEb o

eficiencia antiradical, que se complementa al TEAC y VCEAC.

a %IRL = A (t = 0min) – A (t = tiempo en estado estacionario) / A (t = 0 min) × 100

b AE = 1/EC50 TEC50

3.9.3 Método de Fenoles Totales.

El método espectrofotométrico desarrollado por Folin y Ciocalteu (Folin y Ciocalteu, 1924),

para la determinación de fenoles totales, se fundamente en su carácter reductor y es el más

72

empleado. Se utiliza como reactivo una mezcla de ácido fosfowolfrámico y fosfomolibdíco en

medio básico, que se reducen al oxidar los compuestos fenólicos, originando óxidos azules de

wolframio (W8023) y molibdeno (Mo8023). La metodología empleada en el laboratorio, consistió en

mezclar 3,16 mL de H20 destilada, 400 µL de estándar (ácido gálico) o de extracto, 200 µL de

reactivo Folin – Ciocalteu, esperar 5 min. , agregar 600 µL de Na2CO3 al 20 % p/v, esperar 2 h y

finalmente medir la absorbancia a 765 nm. Los resultados se expresan en unidad de concentración

para ácido gálico.

3.10 Determinación de la Actividad Antibacteriana.

3.10.1 Cepas bacterianas.

La elección de las cepas utilizadas en este trabajo de investigación, fue en base a los

antecedentes bibliográficos encontrados y según su incidencia en salud pública, ya que todas las

bacterias en cuestión, causan alguna patología en el ser humano. A continuación, se detalla cada

cepa utilizada y las patologías o afecciones de salud que éstas pueden causar.

3.10.1.1 Bacillus subtilis ATCC 33608. No es considerado un patógeno humano; sin embargo

puede contaminar alimentos, pero raramente causa intoxicación alimenticia. Sus esporas pueden

sobrevivir las temperaturas extremas, que a menudo es usada en la preparación de alimentos.

(Madigan et al., 2005).

3.10.1.2 Escherichia coli ATCC 25922. Esta bacteria puede causar infecciones intestinales y extra

intestinales generalmente graves, tales como infecciones del aparato excretor, vías urinarias,

cistitis, meningitis, peritonitis, mastitis, septicemias y neumonía. La ITU por E coli son más

comunes en mujeres por la corta longitud de la uretra en comparación con el hombre, y por la

73

proximidad a la zona anal. Entre los ancianos, las infecciones urinarias tienden a ser de la misma

proporción entre hombres y mujeres. (Bae et al., 2006).

3.10.1.3 Klebsiella pneumoniae ATCC 23357. Dentro de este género están involucradas

principalmente infecciones nosocomiales. Es el agente causal de infecciones del tracto urinario,

neumonías, sepsis, infecciones de tejidos blandos, e infecciones de herida quirúrgica. Son

especialmente susceptibles los pacientes ingresados en unidades de cuidados intensivos, neonatos

y pacientes con EPOC, diabetes mellitus o alcohólicos. (Biering et al., 2001).

3.10.1.4 Pseudomnas aeruginosa ATCC 27853. Este patógeno oportunista de individuos

inmunocomprometidos, infecta el tracto pulmonar, el urinario, tejidos, heridas, y también causa

otras infecciones de sangre. La fibrosis quística está también predispuesta a la infección con P

aeruginosa de los pulmones, esta bacteria es la causante de dermatitis, causada por la disminución

del control de la calidad del agua de bebida. El más común causante de altas fiebres en infecciones

es P aeruginosa. (King et al., 1954).

3.10.1.5 Shigella sonnei OSP 2047 – 01. La mayoría de las personas infectadas con Shigella

contraen diarrea, fiebre y calambres estomacales a partir de un día o dos después de su exposición

a la bacteria. La diarrea es a menudo sanguinolenta. La Shigelosis se resuelve de ordinario en 5 a

7 días. En algunas personas, especialmente en los niños de corta edad y los ancianos, la diarrea

puede ser tan grave que el paciente necesite ser hospitalizado.

Además, Shigella alcanza la submucosa del colon y es capaz de ulcerar esos tejidos, pero

sólo produce bacterieremia en casos absolutamente excepcionales. Sin embargo, al causar

afectación colónica provoca una reacción inflamatoria intensa con moco y pus, pudiendo formarse

úlceras sangrantes, por lo que las deposiciones son de pequeño volumen y pueden ir acompañadas

74

de moco y sangre dando lugar, en conjunto, al cuadro denominado disentería bacilar. (Delpiano et

al., 2001).

3.10.1.6 Staphylococcus aureus ATCC 25923. Es el causante de diversos procesos infecciosos

que van desde infecciones cutáneas hasta enfermedades sistémicas mortales. Entre ellas podemos

mencionar, Síndrome de la piel escaldada, intoxicación alimentaria, Síndrome del shock tóxico,

abscesos cutáneos, impétigo, foliculitis, ántrax, celulitis de cara y cuello, Mastitis, Endocarditis,

Neumonía, Osteomielitis, Artritis séptica, peritonitis, pericarditis, entre otras. (Cheung et al.,

1994).

3.10.1.7 Staphylocccus epidermidis ATCC 12228. Este microorganismo es por lejos, el

recuperado con mayor frecuencia, ya que explica entre el 50% y más del 80 % de los aislamientos.

Se ha aislado en válvulas cardiacas protésicas, prótesis ortopédicas y catéteres intravenosos.

(Cheung et al., 1994).

3.10.1.8 Streptococcus pyogenes OSP 344 – 10. Esta bacteria se asocia a muchas enfermedades,

algunas muy importantes; faringitis estreptocócica, infecciones de la piel por estreptococo

(celulitis, erisipelas, impétigos, fascitis necrotizante). La faringitis se puede complicar con la

aparición de un exantema difuso (escarlatina), lo que ocurre con algunas cepas de estreptococo.

Otras enfermedades que puede causar son las bartolinitis, síndrome de shock tóxico, fiebre

reumática y glomerulonefritis postestreptocócica. (Bisno et al., 2003).

3.10.2 Conservación de cepas de referencia.

Para conservar las cepas de referencia se deben congelar usando criopreservantes como; leche

descremada al 20% o caldo glicerol al 20%, éste último fue el utilizado normalmente en los

75

procedimientos y desde el cual se realizaban los repiques. El proceso de conservación consistió

básicamente en los siguientes pasos;

Sembrar la cepa en el agar adecuado e incubar por 18 – 24 h a 35°C.

Cosechar con tórula y hacer una suspensión espesa en leche o caldo glicerol.

Agitar en vortex y congelar a -70°C (duración indefinida) o -20°C (dura alrededor de 1

año).

Mientras más baja sea la temperatura de congelación, mayor es la viabilidad de la cepa. Para

recuperar la cepa del congelado, se raspó la superficie del hielo con un asa y se siembra en el medio

adecuado. Luego incubar 24 – 48h a 35°C, siempre teniendo la precaución de que el criopreservante

no se descongele, pues la cepa puede perder viabilidad.

3.10.3 Activación de las cepas.

Cada una de las cepas de bacterias conservadas, fue sometida a un proceso de repique, que

consistió en tomar una alícuota de 100 µL desde el agar de conservación, para ser ésta inoculada

en 10 mL de Caldo Soya Tripticasa (Triptic Soy Agar, Merck AG) a 30 ± 1°C por 24 h, para

posteriormente obtener una concentración de trabajo de entre 105 – 106 ufc/mL.

3.10.4 Recuento de colonias bacterianas.

El recuento de bacterias fue realizado con el objeto de determinar una concentración en

unidades formadoras de colonias/mL, cercana a la concentración de la cual se debe disponer para

desencadenar un proceso infeccioso. Es por ello que, contar con concentraciones de entre 105 – 106

ufc/mL, fue preponderante para las posteriores pruebas antibióticas. Este proceso se detalla en

ANEXO 2.1.

76

3.10.5 Estándar de medicamentos Unasyn®, Inem® y Sulperazon®.

3.10.5.1 Unasyn®, antibiótico inyectable, consistente de ampicilina sódica y sulbactam sódico. El

primero consistente en un antibiótico semisintético de la familia de las penicilinas y el segundo, un

inhibidor de las β – lactamasas. Su espectro de acción, se detalla a continuación;

a. Bacterias Gram positivas: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,

Stapyloccus saprophyticus, Streptococcus faecalis (Enterococcus), Streptococcus

pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans.

b. Bacterias Gram negativas: Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis,

Escherichia coli, Klebsiella spp, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia

rettgeri, Providencia stuartii, Morganella morganii y Neisseria gonorrhoeae.

c. Anaerobios: Clostridium spp, Peptococcus spp, Peptostreptococcus spp, Bacteroides

spp.

3.10.5.2 Inem®, antibiótico β – lactámico del grupo de los carbapenems. Amplio espectro que

incluye bacterias Gram positivas y Gram negativas aerobias y anaerobias. Todos los estafilococos

resistentes a meticilina son resistentes a imipenem. Los microorganismos intrínsecamente

resistentes a Imipenem incluyen Enterococcus faecium, Legionella spp, Stenotrophomonas

maltophilia, Corynebacterium y algunas cepas de Burkholderia cepacia, Clostridium difficile

puede ser moderadamente sensible. No es activo contra Chlamydia spp, Chlamydophila spp y

Mycoplasma spp.

3.10.5.3 Sulperazon®, consistente en Cefoperazona sódica, cefalosporina de tercera generación,

antibiótico semisintético de amplio espectro, más Sulbactam sódico.

77

3.10.6 Ensayo de Sensibilidad de las cepas de referencia frente a los extractos de Macrocystis

pyrifera y Durvillaea antarctica.

El proceso de activación de cepas referenciales y posterior recuento de ellas, son los

procedimientos que preceden al ensayo de sensibilidad o antibiograma de las bacterias en cuestión

(este proceso se específica de mejor manera en ANEXO 2.2).

Para la realización de las diluciones que fueron utilizadas para conseguir concentraciones

de entre 105 – 106 ufc/mL, y posterior inoculo en agar semisólido Soya Tripticasa (Contenedor de

menor cantidad de agar en relación al agar sólido Soya Tripticasa), se requirió de buffer fosfato

salino (PBS) 0.01 M pH 7.20, el cual se elaboró de la siguiente forma;

Preparar una solución sales en 500 mL de H2O destilada, ajustando a pH 7.20.

Las sales consisten de; NaCl 4 g, KCl 0.1 g, Na2HPO4 anhidro 0.72 g, KH2PO4 0.12 g.

La placa Petri de ensayo de antibiograma, fue elaborada con un inóculo de cada bacteria de

referencia, incluida en el agar semisólido Soya Tripticasa, de manera tal, de evitar la siembra en

césped sobre agar sólido y así conseguir un sembrado más homogéneo. Se tuvo especial cuidado

al momento de someter a temperatura al agar semisólido (para fundir el agar y aplicar inóculo),

dejando un tiempo pertinente para que ésta descienda y así agregar el inóculo bacteriano con

seguridad. Alícuotas (5 – 7 mL) de este agar semisólido con inóculo incluido a él, fueron vertidas

sobre una agar sólido Soya Tripticasa previamente preparado. (Mayor detalle en ANEXO 2.2).

Posteriormente las placas fueron incubadas en un tiempo pertinente y a T° óptima para el

crecimiento de cada bacteria, para luego determinar halos de inhibición formados alrededor de los

discos. El tamaño del halo de inhibición, se midió mediante un pie de metro digital, midiendo en

78

milímetros la distancia correspondiente entre el borde del disco y el inicio del cultivo. Todas las

mediciones se realizaron en triplicado.

La manera en que se confeccionó cada placa de ensayo de antibiograma y el contenido de

éstas en cuanto a muestras ensayadas fue la siguiente;

A. Las placas que contenían extractos crudos (concentrado de 25 mg/mL en H2O estéril, desde

el cual se realizaban las diluciones), extractos digeridos enzimáticamente, estándares

comerciales de los polisacáridos en estudio, estándar de antibióticos y pick cromatográficos

recolectados por HPLC de fracciones de fucoidina y laminarina (Tabla XVIII), consistieron

de 6 perforaciones o 6 discos filtros. Cada perforación o pocillo, previo a un proceso de

filtrado por filtros Millipore de 0,45 µm, almacenaba (25 µL) distintas diluciones de las

muestras mencionadas. Es así como, cada placa estaba constituida por: (Figura 11)

a. Pocillo 1, correspondiente a la muestra concentrada.

b. Pocillo 2, correspondiente a la muestra con una dilución 1:1

c. Pocillo 3, correspondiente a la muestra con una dilución 1:2

d. Pocillo 4, correspondiente a la muestra con una dilución 1:4

e. Pocillo 5, correspondiente a la muestra con una dilución 1:8

f. Pocillo 6, correspondiente a una muestra de H2O destilada estéril, como blanco.

B. En el caso del trabajo por discos filtros, los discos Whatman estériles de 9 mm de diámetro,

eran impregnados en la respectiva muestra. Los discos, posteriormente fueron depositados

sobre la superficie de la placa que contiene el césped de cultivo bacteriano, para así ser

incubadas por 24 h a 30°C indistintamente para cada bacteria de referencia.

79

Tabla XVIII. Muestras estudiadas en ensayo de antibiograma.

Estándar con

Actividad

Antibiótica

Estándar

comercial

polisacáridos en

estudio

Extracto crudo Extracto digerido

enzimáticamente

Pick

cromatográficos

recolectados

desde HPLC

Unasyn® Fucoidina 25

mg/mL

Macrocystis

pyrifera 25 mg/

mL

Durvillaea

antárctica +

laminarinasa

Laminarina

Inem® Laminarina 25

mg/ mL

Durvillaea

antarctica 25

mg/mL

Durvillaea

antárctica + β

glucanasa

Fucoidina

Sulperazon® Macrocystis

pyrifera + β

glucanasa

Laminarina +

laminarinasa

Fucoidina + β

glucanasa

Laminarina + β

glucanasa

Fucoidina + β

glucanasa

Fucoidina + β

glucanasa

Laminarina +

laminarinasa

80

Figura 11. Esquema representativo de las placas de antibiograma realizadas en este trabajo de

investigación. En azul el Agar sólido Soya Tripticasa, sobre el cual se dispersa una alícuota de 25

µL de agar semisólido Soya Tripticasa, contenedor de inóculos de las bacterias de referencia. De

mayor a menor, 1, indica un concentrado de la muestra estudiada, 2, dilución 1:1 de la muestra, 3,

dilución 1:2 de la muestra, 4, dilución 1:4 de la muestra, 5, dilución 1:8 de la muestra y 6, H2O

destilada estéril.

2

3

4

5

6

1

81

A. Las muestras estándar de los medicamentos Unasyn®, Inem® y Sulperazon®, de las cuales

sólo se trabajó un preparado sin diluciones, fueron preparadas de la siguiente forma:

a. Inem®: Solución de 100 mL, dónde Inem® era resuspendido en NaCl 0.9 % y 5 –

10 % de Dextrosa H2O. Si se mantiene refrigerado, la estabilidad se conserva por

24 h.

b. Unasyn®: Resuspensión en NaCl0.9 % y 5 – 10 % Dextrosa en H2O. Si se mantiene

refrigerado, la estabilidad se conserva por 24 h.

c. Sulperazon®: Resuspensión en solución de 20 mL, constituida por; 5 % dextrosa y

NaCl 0.9 %. Si se mantiene refrigerado, la estabilidad se conserva por 24 h.

B. Las muestras concentradas de estándares comerciales de Fucoidina y Laminarina, de las

cuales se realizaron diluciones en la misma placa (pocillo 2, 3, 4 y 5), fueron de 25 mg/mL.

En lo que compete a las muestras ensayadas para actividad antibiótica, también fueron

sometidas a las mismas diluciones que en el caso de los estándares. El modo por el cual se

realizaron las diluciones fue el esquematizado en ANEXO 2.3.

3.10.7 Diseño experimental para la inhibición bacteriana por medio de pocillos o discos filtro.

El diseño experimental utilizado consistió en un diseño multifactorial 8 × 5 × 3 de dos

factores representantes o responsables de cada bacteria, cuyos parámetros corresponden a los

ocho microorganismos afectados por la inhibición. El factor cinco corresponde a los

tratamientos efectuados con las concentraciones de extracto algal y el factor tres indica el

número de repeticiones.

82

3.10.8 Análisis estadísticos.

La inhibición bacteriana por efecto de los extractos crudos fue evaluada mediante

estadística descriptiva y análisis de varianza de una vía (ANDEVA) utilizando el software

estadístico Statgraphics 5.1. En caso de reportarse evidencia significativa (p ≤ 0.05) entre

resultados se realizó una prueba de rango múltiple con el fin de determinar la magnitud de

diferencia.

3.11 Determinación de la actividad antifúngica.

3.11.1 Cepas fúngicas.

La elección de las cepas utilizadas en este trabajo de investigación, fue en base a los

antecedentes bibliográficos que indican que los hongos testeados en esta oportunidad, son los

primeros que deben probarse para un ensayo de actividad antifúngica, puesto presentan un grado

de sensibilidad mayor a ser inhibidos en crecimiento, en comparación a otras especies de hongos.

Los hongos estudiados en esta oportunidad, fueron obtenidos y estudiados desde el

cepario fúngico de las dependencias del Instituto de Microbiología Clínica. Las especies de hongos

estudiadas fueron;

Candida albicans

Candida krusei

Candida glabrans

Candida Guillermondii

Aspergillus niger

83

Aspergillus terreus

Aspergillus flavus

Aspergillus fumigatus.

3.11.2 Cultivo de cepas fúngicas.

El cultivo fue realizado a base de un cepario o banco fúngico del Instituto de

Microbiología Clínica, desde él se realizó un repique por medio de asa de micrón a un Agar

Sabouraud inclinado, incubando las cepas por 48 h a 32°C. Desde éste último cultivo, y por medio

del asa de micrón se realizó un inoculo en H2O estéril, para finalmente y por medio de una tórula,

realizar un siembra en placa con Agar Sabouraud, para incubar por 48 h a 32°C.

3.11.3 Ensayo de Sensibilidad de las cepas fúngicas frente a los extractos de Macrocystis pyrifera

y Durvillaea antarctica.

Las muestras estudiadas en esta oportunidad fueron las siguientes:

A. Extracto de Macrocystis pyrifera concentrado 25 mg/mL en H2O estéril.

B. Extracto de Durvillaea antarctica concentrado 25 mg/mL en H2O estéril.

C. Preparado de Laminarina y Fucoidina estándar 25 mg/mL en H2O estéril, a raíz del cual se

realizaron las mismas diluciones descritas en la Figura 11.

D. Muestras de pick recolectados desde HPLC, correspondiente a las fracciones de Laminarina

y Fucoidina. Extractos digeridos enzimáticamente con β - glucanasa y laminarinasa.

La manera en que se confeccionó cada placa de ensayo de antibiograma y el contenido de

éstas en cuanto a muestras ensayadas fue la siguiente;

84

A. Los cultivos en placas consistieron de 6 perforaciones o 6 discos filtros. Cada perforación

o pocillo, previo a un proceso de filtrado por filtros Millipore de 0,45µm, almacenaba (25

µL) distintas diluciones de las muestras mencionadas. Es así como, cada placa estaba

constituida por: (Figura 11)

a. Pocillo 1, correspondiente a la muestra concentrada.

b. Pocillo 2, correspondiente a la muestra con una dilución 1:1

c. Pocillo 3, correspondiente a la muestra con una dilución 1:2

d. Pocillo 4, correspondiente a la muestra con una dilución 1:4

e. Pocillo 5, correspondiente a la muestra con una dilución 1:8

f. Pocillo 6, correspondiente a una muestra de H2O destilada estéril, como blanco.

B. En el caso del trabajo por discos filtros, los discos Whatman estériles de 9 mm de diámetro,

eran impregnados en una solución de 25 mg/mL por aproximadamente 30 segundos. Los

discos, posteriormente fueron depositados sobre la superficie de la placa que contiene el

césped de cultivo fúngico, para así ser incubadas por 48h a 32°C indistintamente para cada

cepa fúngica.

C. Las muestras concentradas de estándares comerciales de Fucoidina y Laminarina, de las

cuales se realizaron diluciones en la misma placa (pocillo 2, 3, 4 y 5), fueron de 25 mg/mL

para ambos casos. En lo que compete a las muestras ensayadas para actividad antibiótica,

también fueron sometidas a las mismas diluciones que en el caso de los estándares. El modo

por el cual se realizaron las diluciones fue el esquematizado en ANEXO 2.3.

85

3.11.4 Diseño experimental para la inhibición bacteriana por medio de pocillos o discos filtro.

El diseño experimental utilizado consistió en un diseño multifactorial 8 × 5 × 3 de dos

factores representantes o responsables de cada cepa fúngica, cuyos parámetros corresponden a los

ocho microorganismos afectados por la inhibición. El factor cinco corresponde a los tratamientos

efectuados con las concentraciones de extracto algal y el factor tres indica el número de

repeticiones.

4. RESULTADOS.

4.1 Extracción y detección mediante HPLC, de los polisacáridos Laminarina y Fucoidina desde

las algas Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica.

El proceso de secado, de los extractos húmedos obtenidos por las distintas metodologías de

extracción, fue realizado por la metodología Speed back mencionada en la sección de Materiales y

Métodos. Los extractos secos derivados de este procedimiento, fueron disueltos y resuspendidos

en agua desionizada para su posterior detección por HPLC. Se obviaron los resultados por el

protocolo Black modificado del método elaborado por Deville et al., ya que la disolución de éste

en agua desionizada, resultó muy dificultosa, sin mencionar que la presencia de los polisacáridos

en estudio, fue mínima.

Es importante a la hora de la lectura o análisis de un cromatograma, considerar todos los

elementos que han sido detectados por el HPLC, tanto los conocidos o esperados, como los no

conocidos; sobre todo estos últimos, ya que pueden ser sinónimo de errores o interferentes a la hora

de detectar moléculas en estudio.

86

Para disminuir este factor de error, es trascendental conocer en parte, las posibles moléculas

o componentes químicos que pueden poseer la muestras (y que pueden ser detectados por el

detector acoplado al HPLC), por ello realizar inyecciones y posteriores cromatogramas de

estándares que se pueden encontrar en la muestra problema que se analizará a futuro, puede

convertirse en una buena opción, para optimizar el trabajo y disminuir errores. Para esto, se realizó

la detección de moléculas estándar (Figura 12) como; manitol, glucosa, fucosa y ácido algínico,

que en definitiva se convierten en picko típicos distintos a los de Laminarina y Fucoidina, que

pudiesen encontrarse en posteriores cromatogramas.

De la Figura 12 se desprende además que, de las moléculas que pudiesen significar un

problema para el análisis de extractos y posterior detección de laminarina y fucoidina, manitol,

fucosa y glucosa, no involucran un problema o posible fuente de error, puesto su tiempo de elución,

es mucho después que los polisacáridos en estudio, es decir, mayor que 17 min. (alrededor de los

20 min.). Es de cuidado, no caer en confusiones con el pico correspondiente a fucoidina y ácido

algínico, puesto ambos se encuentran muy cercanos a los 10 min, pero siempre, fucoidina eluye

más rápido (según las condiciones de flujo, detector y columna utilizados) y por ende es detectado

antes que ácido algínico.

El cromatograma contenido en la Figura 13, comprende a los polisacáridos en estudio, es

decir, los estándares de laminarina y fucoidina. La Figura 14 por tanto, corresponde al

cromatograma de los extractos logrados con los protocolos Black, Nuevo e Yvin’s a partir del alga

Macrocystis pyrifera.

Del análisis de los cromatogramas mencionados, se observa que laminarina y fucoidina

estándar, presentan un picocercano a los 15 y 10 min. respectivamente.

87

Figura 12. Cromatograma de moléculas estándar de Maltosa, Fucosa, Glucosa y Ácido

algínico. Se inyectaron 20 µL en todas las muestras analizadas en este cromatograma,

adicionalmente se realizó la inyección de; laminarina estándar, fucoidina estándar, laminaritriosa

y laminaritetraosa. El procedimiento cromatográfico se efectuó con un tiempo de retención de 25

min. , a un flujo de 1 mL/min a temperatura ambiente.

88

Figura 13. Cromatograma de estándares. Se inyectaron 20 µL de las siguientes muestras:

laminarina estándar y fucoidina estándar. El procedimiento cromatográfico, se efectuó con un

tiempo de retención de 25 min. a un flujo de 1 mL/min y temperatura ambiente.

89

Figura 14. Cromatograma de extractos algales de Macrocystis pyrifera, obtenidos por las

distintas metodologías de extracción según Deville et al. Se inyectaron 20 µL de las siguientes

muestras; extracto protocolo Black, extracto protocolo Nuevo y extracto protocolo Yvin’s. Con un

tiempo de retención de 25 min. a un flujo de 1 mL/min a temperatura ambiente.

90

En lo que respecta a la detección de Laminarina, no es menor considerar que ésta puede

variar su tiempo de elución de entre 15 a 17 min. (observando la Figura 12 y Figura 13). Referente

de los extractos por la metodología de Deville et al., los protocolos Black, Nuevo e Yvin’s

presentan un patrón común en cuanto a que, todos presentan los pico de los 10 y 15 min, en mayor

o menor proporción, pero que en definitiva apuntan a la presencia de los polisacáridos en cuestión.

La Figura 15 representa el cromatograma de los extractos de Durvillaea antarctica, de los

protocolos Black, Nuevo e Yvin’s. Se observan picos cercanos a los 15 min. , sugerentes de la

presencia de Laminarina.

4.2 Detección mediante HPLC, de los polisacáridos Laminarina y Fucoidina, obtenidos por la

metodología de extracción según Nakamura – Black.

La detección de fucoidina, fue relativamente simple y en cantidad aceptable en el caso del

protocolo Nuevo de Deville et al., a partir de Macrocytis pyrifera. No así para el caso del

polisacárido Laminarina, cuya detección fue compleja por múltiples factores, además de que

cuando ésta era detectada a partir del protocolo Black y del alga Durvillaea antarctica, se

encontraba en baja cantidad en el extracto o debido a factores ambientales, el alga analizada no

contenía el polisacárido de Laminarina, por lo que desarrollar métodos alternativos, más eficientes

o con mayor rendimiento, fue una alternativa en este trabajo de investigación. En vista de aquello,

se intentó elaborar protocolos viables, en base al método Black y el método desarrollado por

Nakamura (protocolos NB); siendo los resultados positivos en cuánto a presencia de Laminarina,

pero negativos en cantidad del polisacárido extraído.

91

Figura 15. Cromatograma de extractos algales de Durvillaea antarctica, obtenidos por las

distintas metodologías de extracción según Deville et al. Se inyectaron 100 µL de extracto del

protocolo Black, Nuevo e Yvin’s. El procedimiento cromatográfico se efectuó con un tiempo de

retención de 25 min. a un flujo de 1 mL/min y temperatura ambiente.

92

En vista de ello, se optó por mantener la metodología de Deville et al., (protocolo Black),

como método base para realizar la extracción de este polisacárido. Aun así, los resultados obtenidos

por medio del protocolo NB, figuran en la Figura 16 para NB 01 a NB05 y Figura 17, del protocolo

NB 06 a NB09.

Para la determinación de la concentración de fucoidina se seleccionó el extracto logrado por

medio del protocolo Nuevo según Deville et al., y a partir del alga Macrocytis pyrifera. Por otra

parte, para determinar la concentración de laminarina se seleccionó el protocolo Black según

Deville et al., a partir del alga Durvillaea antarctica.

4.3 Contenido de laminarina y fucoidina en los extractos algales.

Esta selección se basó en los cromatogramas que mostraban un peak cercano a los 10 min.

para fucoidina y otro a los 15 min. para laminarina, las áreas de estos peaks se utilizaron para la

determinación de la concentración de los polisacáridos, utilizando las curvas de calibración de los

estándares de fucoidina (ANEXO 4.1) (y = 12,477 x – 48,564) y laminarina (ANEXO 4.2) (y =

10,614 x – 11,939).

93

Figura 16. Cromatograma de extractos algales de Durvillaea antárctica, obtenidos por la

metodología de extracción según Nakamura – Black. Se inyectaron 100 µL de extracto del

protocolo NB01 a NB05, procedimiento cromatográfico realizado con un tiempo de retención de

25 min. a un flujo de 1 mL/min y a temperatura ambiente.

94

Figura 17. Cromatograma extractos de protocolos Nakamura – Black del alga Durvillaea

antarctica. Se inyectaron 100 µL de extracto del protocolo NB06 al NB09, procedimiento

cromatográfico realizado con un tiempo de retención de 25 min. a un flujo de 1 mL/min y a

temperatura ambiente.

95

4.4. Hidrólisis enzimática de polisacáridos. 4

4.4.1 Estandarización del método DNS (ANEXO 3.1). Los ensayos realizados por Díaz (2011),

apuntaron a la forma correcta y estandarizada en la que se debía realizar el método DNS, a raíz de

las diferencias que figuraban en las fuentes bibliográficas. La metodología, consistió en;

a. Mezclar 3 mL de muestra con 3 mL de reactivo de DNS.

b. Incubación a 90°C durante 15 min, y luego enfriar a temperatura ambiente.

c. Agregar 1 mL de Tartrato de Na y K al 40%.

d. Para finalizar, medición de la absorbancia a 540 nm, que corresponde a la longitud de onda,

donde se obtiene la mejor linealidad con un R2 = 0,9861.

En la Figura 18 y 19, 20 y 21 se exponen los resultados del test de glucosa y DNS

respectivamente. Estos ensayos fueron realizados a los productos de hidrólisis de los estándares de

laminarina, fucoidina y a los extractos obtenidos por la aplicación del protocolo Nuevo en el caso

del alga Macrocytis pyrifera y protocolo Black, para el alga Durvillaea. antarctica.

4 La Hidrolisis enzimática de polisácaridos, fue desarrollada en el Laboratorio de Biotecnología del ICYTAL por

Andrea Díaz C., estudiante tesista de Bioquímica UACh, adscrito al proyecto FONDEF D07I 1095. En esta

oportunidad, los resultados serán utilizados como fundamentación y soporte de las actividades fisiológicas estudiadas

en este trabajo de investigación.

96

Figura 18. Hidrólisis enzimática de estándares. Las gráficas muestran los resultados

obtenidos de los procesos de hidrólisis enzimática a las 48 h, con β-glucanasa y laminarinasa,

sobre: Laminarina (A), Fucoidina (B), siendo la respuesta la glucosa liberada detectada con test

de glucosa. La fucoidina no fue sometida a hidrolisis enzimática con laminarinasa, ya que esta

enzima no tiene actividad hidrolítica sobre este polisacárido. Figura extraída desde Díaz, 2011.

A

B

97

Figura 19. Hidrólisis enzimática de extractos algales. Las gráficas muestran los resultados

obtenidos de los procesos de hidrólisis enzimática a las 48 h, con β-glucanasa y laminarinasa,

sobre: extracto de D. antarctica (A) y extracto de M. pyrifera (B), siendo la respuesta la glucosa

liberada detectada con test de glucosa. Figura extraída desde Díaz, 2011.

A

B

98

Figura 20. Test de DNS de muestras estándar de laminarina y fucoidina. Se realizó una

hidrólisis enzimática de 48 h, para luego aplicar el test de DNS a las muestras obtenidas. Estas

se analizaron como extracto crudo, digeridas enzimáticamente con laminarinasa y β-glucanasa.

A. Laminarina; B. Fucoidina. La fucoidina no fue sometida a hidrolisis enzimática con

laminarinasa, ya que esta enzima no tiene actividad hidrolítica sobre este polisacárido. Figura

extraída desde Díaz, 2011.

A

B

99

Figura 21. Test de DNS de extractos algales. Se realizó una hidrólisis enzimática de 48 h,

luego se realizó un test de DNS a las muestras obtenidas. Estas se analizaron como extracto

crudo, degradadas con laminarinasa e hidrolizadas con β-glucanasa. A, D. antarctica; B. M.

pyrifera. Figura extraída desde Díaz, 2011.

A

B

100

Si se comparan las metodologías del test de glucosa y DNS aplicados a los extractos de

Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica, tenemos que, por el método del test de glucosa

(Figura 19A) si existe actividad sobre M. pyrifera, pero sólo por parte de la enzima β - glucanasa,

ya que esta es no específica y actúa hidrolizando enlaces β – glucosídicos indistintamente, no así

Laminarinasa que sólo actúa sobre el polisacárido de Laminarina, claramente reflejado en la Figura

19A, ya que el extracto de M.pyifera sólo contiene Fucoidina o en su defecto, Laminarina en una

muy baja cantidad. Respecto a la Figura 19B, ésta es relacionable al hecho de que el extracto de D.

antarctica contiene laminarina y por ende la acción enzimática de laminarina, debiese arrojar

resultados positivos en cuanto a presencia de glucosa detectable por la metodología del test de

glucosa. La enzima β – glucanasa, también es efectiva en este caso, pues es no específica y genera

cortes hidrolíticos de igual forma en este polisacárido, así como también en otro que estén presentes

en el extracto, lo que explica la mayor cantidad de residuos de glucosa detectables en el caso de la

β - glucanasa comparada a laminarinasa. Referente a la Figura 21A y 21B, éstas también son

concluyentes a la hora de ratificar la acción de ambas enzimas y que efectivamente hay presencia

de fucoidina y laminarina en los extractos. Si se comparan ambas metodologías en relación a su

efectividad o utilidad en cuanto a detección de productos de hidrolisis tenemos que; el método

DNS detecta azúcares reductores, que normalmente son monosacáridos, por lo tanto se deduce que

en el caso de la Figura 21, el hecho de que se haya detectado más azúcar reductor que glucosa

(como en el caso de la Figura 19), obedece a que la digestión enzimática genera productos de

hidrólisis variados, y no exclusivamente glucosa, que es la que únicamente detecta el test de

glucosa. Por lo tanto, en términos de sensibilidad la técnica DNS es superior al test de glucosa,

pero inferior en especificidad por glucosa. Para efectos de corroborar la acción enzimática sobre

los extractos estudiados, ambas técnicas son igual de útiles y entregan información relevante.

101

4.5 Detección de los productos de hidrólisis de Laminarina y Fucoidina mediante HPLC

La Figura 22 comprende los estándares de los polisacáridos y productos de hidrolizis

(laminaritriosa y laminaritetraosa). En esta última se reitera la patrón de elución de acido algínico

y fucoidina, muy cercanos ambos a los 10 min. , pero aun más impotante, se asevera que los

productos de hidrolizis de estos polisacáridos, no eluyen o no son detectados por el detector IR

antes de los 17 min. (17-22 min.) . Los productos de hidrolizis específicos de laminarina en

conjunto con laminarinasa, eluyen entre los 17-19 min.

Por otra parte, la detecion de productos de hidrolizis de laminarina y fucoidina, por la

utilización de enzimas hidroliticas β- glucanasa y laminarinasa, es presentada en las Figuras 23 y

24, respectivamente.

En la Figura 23 se exponen los cromatogramas de los productos de hidrólisis del ensayo

enzimático realizado con la enzima β-glucanasa durante 48 h a 60°C a los estándares laminarina,

fucoidina y a los extractos obtenidos del protocolo Nuevo para el alga Macrocystis pyrifera y del

protocolo Black para Durvillaea antárctica. A raíz de esta Figura, se observa que existen pick que

se condicen o relacionan directamente con aquellos de la Figura 22, aseverándose por lo tanto la

presencia efectiva de productos de hidrolisis de los polisacáridos laminarina y fucoidina, así como

también productos de hidrólisis específicos de la acción de laminarinasa sobre laminarina (Figura

23, picks entre 17 y 20 min. ). Esto último, se correlaciona además con los resultados presentados

en las Figuras 19 y 21, que ratifican que la digestión enzimática sobre extractos algales,

efectivamente resulta en la generación de monosacáridos (como fucosa, glucosa o manitol) u

oligosacáridos como laminaritriosa y laminaritetraosa.

102

Figura 22. Cromatograma de estándares de polisacáridos y estándares de productos de

hidrólisis. Los polisacáridos analizados fueron laminarina, fucoidina y ácido algínico y los

productos de hidrólisis corresponden a laminaritriosa (Laminarina3), laminaritetraosa

(Laminarina4), glucosa, fucosa y manitol. Para este procedimiento cromatográfico, se

inyectaron 20 µL de estándares con un tiempo de retención de 25 min. a un flujo de 1 mL/min

y a temperatura ambiente.

103

Figura 23. Cromatograma de productos de hidrólisis de ensayo enzimático con la enzima β-

glucanasa. Los productos de hidrolisis de los estándares de laminarina (Lam + B), fucoidina (Fuc

+ B) y de los extractos algales Macrocystis pyrifera (Mp + B) y Durvillaea antarctica (Da + B)

muestran peaks a los 17 min al igual que los estándares de productos de hidrólisis laminaritriosa

(Lam3), laminaritetraosa (Lam4) y glucosa. Se inyectaron 20 µL de muestras con un tiempo de

retención de 25 min. a un flujo de 1 mL/min a temperatura ambiente. Estos resultados confirman

la eficacia de las enzimas al efectuar cortes del polisacárido y generar Lam 3 y Lam 4.

104

Figura 24. Cromatograma de productos de hidrólisis de ensayo enzimático con la enzima

laminarinasa. Los productos de hidrólisis de los estándares de laminarina, fucoidina y de los

extractos algales de M. pyrifera y D. antárctica muestran peaks a los 17 min al igual que los

estándares de productos de hidrólisis laminaritriosa (Lam3, verde)), laminaritetraosa (Lam4,

fucsia) y glucosa. Se inyectaron 20 µL de muestras con un tiempo de retención de 25 min. a un

flujo de 1 mL/min a temperatura ambiente.

105

En la Figura 24 se exponen los cromatogramas de los productos de hidrólisis del ensayo

enzimático realizado con la enzima laminarinasa durante 48 h a 37°C a los estándares laminarina,

fucoidina y a los extractos del protocolo Nuevo para el alga M. pyrifera y extracto Black para el

caso de D. antarctica. En esta figura también es posible apreciar peaks cercanos a los 15 - 17 min

que coinciden con los peaks de los estándares de los productos de hidrólisis, sin embargo estos son

de un área menor a la que presentan los estándares de productos de hidrólisis.

4.6 Determinación cualitativa de sulfatos.

En la Figura 25 se observan los resultados del análisis cualitativo de sulfatos los cuales se

presentan como un precipitado blanco que corresponde a BaSO4, el cual precipitó luego de agregar

gotas de BaCl2 a una muestra acidificada previamente con HCl 2M. En todas las muestras

analizadas es posible observar precipitado blanco, siendo menor en el estándar de laminarina que

en el de fucoidina. Con respecto a los extractos, aquel obtenido por el protocolo Black utilizando

el alga D. antarctica presentó mayor contenido sulfatado que el extracto obtenido por el uso del

protocolo Nuevo, para el alga M.pyrifera.

4.7 Determinación de la actividad antioxidante.

4.7.1 Estudio de Estabilidad del método DPPH Brand – Williams.

Ya que la metodología presentaba muchas variaciones tras su revisión bibliográfica, y ésta

además variada en relación al tipo de antioxidante a estudiar, se optó por realizar un ensayo de

estabilidad previo al estudio final de la actividad antioxidante. Este ensayo tuvo como objeto,

determinar las condiciones óptimas a las cuales se debería realizar la prueba, es decir, en

condiciones de oscuridad – luz, temperatura, por cuanto tiempo debería extenderse el ensayo

DPPH, concentración óptima a la que se deberían trabajar los extractos, entre otros.

106

Figura 25. Determinación cualitativa de sulfatos. Los sulfatos se precipitaron como BaSO4,

desde una muestra levemente acidificada. Control positivo MgSO4 1% (A); Estándar de laminarina

1% (B); Estándar de fucoidina 1% (C); Extracto protocolo Black D. antárctica 1% (D); Extracto

protocolo Nuevo M. pyrifera 1% (F). Figura extraída desde Díaz, 2011.

A. B. C.

D. F.

107

4.7.2 Estabilidad del ensayo DPPH en condiciones de Luz – Oscuridad.

Esta prueba se realizó, utilizando una concentración de DPPH (DPPH disuelto en metanol

100%) de 5.10 × 10-5 M, longitud de onda de 517 nm, temperatura ambiente y extendiendo el

ensayo por 24h en condiciones de luz u oscuridad. Se observó por lo tanto como estas

condicionantes, afectaron la estabilidad de la absorbancia propia del DPPH en el tiempo.

Observando la Figura 26, se determinó que la condición de oscuridad es más apropiada para realizar

este tipo de ensayo, que por lo demás se correlaciona con la información bibliográfica, que describe

claramente que el DPPH es altamente inestable si es expuesto a la luz.

4.7.3 Estabilidad del ensayo DPPH a distintas temperaturas.

Se realizó un ensayo de estabilidad del ensayo DPPH a distintas temperaturas (T° ambiente,

37°C, 27°C y 20°C), con el objeto de determinar la temperatura a la cual se consigue el mayor

descenso de la absorbancia para el tipo de extracto utilizado y para los efectos de este estudio

(Figura 27 – 28). Puesto que desde la hora de ensayo en adelante, se experimentó un aumento de

la absorbancia probablemente debido a la inestabilidad de la solución de DPPH (5.10 × 10-5 M),

en todas las temperaturas probadas, se tomó como máximo de absorbancia al cumplirse una hora

de ensayo. Considerado aquello, los mejores resultados se obtuvieron con la aplicación de 37°C,

con lo cual ésta se convirtió en la temperatura de trabajo. Para este ensayo y considerando que en

esta instancia, si se debe visualizar el efecto antioxidante, se utilizaron las siguientes preparaciones:

a) Extracto de protocolo Nuevo Macrocytis pyrifera 5 mg/mL (en metanol 100%).

b) TROLOX 8,00 × 10-5 M (en metanol 100%).

c) Ácido gálico 5,80 × 10-5 M (en metanol 100%).

d) Ácido ascórbico 5,00 × 10-5 M (en metanol 100%).

108

Figura 26. Estabilidad ante la exposición de luz – oscuridad en el ensayo DPPH. A,

representación gráfica de la variación de la absorbancia ante la exposición de luz y oscuridad, en

el tiempo (hasta 6 horas). B, representación gráfica de la variación de la absorbancia ante la

exposición de luz y oscuridad, hasta 1 hora (tiempo óptimo de realización del ensayo DPPH).

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Ab

sorb

anci

a

Tiempo (minutos)

Estabilidad del ensayo DPPH a la exposición de Luz -Oscuridad

Absorbancia Luz Absorbancia Oscuridad

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 10 20 30 40 50 60 70

Ab

sorb

anci

a

Tiempo (minutos)

Estabilidad del ensayo DPPH a la exposición Luz - Oscuridad

Absorbancia Luz Absorbancia Oscuridad

B

A

109

Figura 27. Estabilidad del ensayo DPPH, frente a la variación de temperatura. Para las cuatro

soluciones probadas, se testeo el descenso de la absorbancia en el ensayo de DPPH como reflejo

de la actividad antioxidante, variando éste según el antioxidante y temperatura utilizada. A,

estabilidad del ensayo DPPH a T° ambiente, B, estabilidad del ensayo DPPH a 37°C.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Ab

sorb

anci

a

Tiempo (minutos)

Estabilidad ensayo DPPH a T° ambiente.

Extracto MP 5mg/mL TROLOX Ácido gálico Ácido ascórbico

A

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Ab

sorb

anci

a

Tiempo (minutos)

Estabilidad ensayo DPPH a 37°C

Extracto MP 5 mg/mL TROLOX Ácido gálico Ácido ascórbico

B

110

Figura 28. Estabilidad del ensayo DPPH, frente a la variación de temperatura. Para las cuatro

soluciones probadas, se testeo el descenso de la absorbancia en el ensayo de DPPH como reflejo

de la actividad antioxidante, variando éste según el antioxidante y temperatura utilizada. A,

estabilidad del ensayo DPPH a 27°C, B, estabilidad del ensayo DPPH a 20°C.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 50 100 150 200

Ab

sorb

anci

a

Tiempo (minutos)



A

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 50 100 150 200

Ab

sorb

anci

a

Tiempo (minutos)



B

111

4.7.4 Estado estacionario del ensayo DPPH a 517 nm.

La determinación del estado estacionario consistió en determinar a qué tiempo, la

disminución de la absorbancia fue máxima y si la medición era estable en cuanto a variación de la

absorbancia en torno al tiempo establecido (Figura 29). Para este caso, se utilizaron sólo extractos

de Macrocystis pyrifera (contenedores de fucoidina), ya que por referencia y los resultados de las

Figuras 27 y 28, se sabe que este extracto posee actividad antioxidante. Adicionalmente, se reiteran

los resultados obtenidos en la Figuras 27 y 28, puesto hasta una hora de ensayo, el descenso de la

absorbancia es máxima y estable para su medición. Además, este resultado fue previsualizado y

deducido de la Figura 26, puesto si se considera la condición de oscuridad, sólo hasta la hora de

ensayo, se observa estabilidad en los valores de absorbancia.

4.7.5 Determinación de la concentración óptima a utilizar para extractos liofilizados de

Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica.

La determinación de la concentración óptima a la cual se debía trabajar los extractos

liofilizados, consistió en determinar la disminución de la absorbancia en el ensayo DPPH según la

concentración utilizada. El ensayo fue realizado a 517 nm, 37°C y a una hora de la reacción

antioxidante. Los extractos probados, consistieron en los mejores liofilizados (Según resultados

cromatográficos por HPLC) de extracto según protocolo Nuevo de Macrocystis pyrifera y

protocolo Black para Durvillaea antarctica, cada uno de ellos probados por triplicado. Según la

Figura 30, todos los extractos probados, resultaron ser buenos antioxidantes (por la disminución de

la absorbancia) a 5mg/mL, ya que aparentemente a concentraciones mayores, la solución se satura

y arroja resultados de absorbancia no concordantes, así como también, concentraciones menores a

5 mg/mL, no equivalen a un máximo de actividad antioxidante.

112

Figura 29. Estado estacionario del ensayo DPPH a 37°C y 517 nm. Los extractos MP

corresponden a extractos de Macrocystis pyrifera, pero de orígenes geográficos y estacionales

distintos. Cada extracto se conformó de un triplicado.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 50 100 150 200 250 300

Ab

sorb

anci

a

Tiempo (minutos)

Estado estacionario ensayo DPPH a 37°C 517 nm.

Extracto MP 5 mg/mL (1) Extracto MP 5mg/mL (2)

113

Figura 30. Concentración óptima a utilizar para extractos liofilizados de Macrocystis pyrifera

y Durvillaea antarctica. Cada extracto utilizado (MP o Macrocystis pyrifera 1 – 10, DA o

Durvillaea antarctica 1 - 2) fue realizado en triplicado, utilizando concentraciones de 1 a 10

mg/mL, se midió la actividad antioxidante de los extractos sólo por la disminución de la

absorbancia del ensayo DPPH. La prueba se realizó midiendo la absorbancia a 517 nm, 1 h de

ensayo, 37 °C y en condiciones de oscuridad.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 2 4 6 8 10 12

Ab

sorb

anci

a

Concentración Extracto algal (mg/mL)

Concentración óptima a utilizar para extractos liofilizados de Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica.

Extracto MP (1) Extracto MP (2) Extracto MP (3) Extracto MP (5)

Extracto MP (5) Extracto MP (6) Extracto MP (7) Extracto MP (8)

Extracto MP (9) Extracto MP (10) Extracto DA(1) Extracto DA2

114

4.7.6 % de Inhibición del radical libre DPPH (%IRL).

Según Von Gadow et al., (1997), Sánchez – Moreno et al., (1997) y KushoSki et al., (2005),

una de las formas de representar la actividad antioxidante de un agente antioxidante, es determinar

el %IRL, representando cuanto radical libre, o en otras palabras, cuanto potencial oxidante ha sido

inhibido por el antioxidante. La determinación del %IRL, se lleva a cabo por el cálculo a través de

la formula indicada en la sección de materiales y métodos.

Los extractos utilizados para probar la actividad antioxidante, consistieron en extracto por

protocolo Nuevo de Macrocytis pyrifera o MP (contenedor de fucoidina) y extracto de protocolo

Black de Durvillaea antarctica o DA (contenedor de laminarina). Se trabajó en base a los

resultados conseguidos en la Figura 30, dónde el extracto MP 3 y DA2, fueron los que consiguieron

un mayor descenso de la absorbancia en el ensayo DPPH a una concentración óptima de 5mg/mL.

Estos extractos fueron probados considerando los resultados de todo el ensayo de estabilidad, es

decir, 517 nm, 37 °C, 1 h de ensayo y condición de oscuridad, además de realizar triplicados para

ambos extractos MP y DA. Se midió el %IRL a distintas concentraciones de estándares

antioxidantes tales como; TROLOX, ácido ascórbico y ácido gálico, para establecer una referencia

en cuanto a la potencia antioxidante. La absorbancia a 517 nm al minuto cero del ensayo fue de

0,383 y la absorbancia a la hora de ensayo, corresponde a cada valor de absorbancia promedio, que

figura en la Tabla XIX.

4.7.7 % DPPH remanente, EC50, TEC50 y AE.

Este parámetro fue determinado como consecuencia directa del % IRL, puesto denota el

porcentaje restante de DPPH que queda en la solución sin reducir o en otras palabras, la cantidad

de DPPH que no ha sido sometida al efecto antioxidante.

115

Tabla XIX. % Inhibición del radical libre DPPH

Agente antioxidante Concentración %IRL Abs 517 nm ± DE

TROLOX 1,60 × 10-4 M 89,56% 0,04 ± 0,002

4,00 × 10-4 M 85,90% 0,054 ± 0,002

8,00 × 10-5 M 81,20% 0,072 ± 0,003

Ácido Ascórbico 1,10 mM 93,47% 0,025 ± 0,001

2,30 × 10-4 M 72,84% 0,104 ± 0,002

2,80 × 10-4 M 69,20% 0,118 ± 0,002

5,00 × 10-5 M 26,89% 0,280 ± 0,005

Ácido gálico 1,40 mM 94,26% 0,022 ± 0,002

5,80 × 10-4 M 95,82% 0,016 ± 0,005

6,00 × 10-4 M 93,73% 0,024 ± 0,003

5,80 × 10-5 M 85,12% 0,057 ± 0,001

Extracto Macrocytis pyrifera 5,0 mg/mL 81,72% 0,070 ± 0,002

Extracto Durvillaea antarctica 5,0 mg/mL 36,30% 0,244 ± 0,020

116

El % DPPH remanente se calcula por medio de la siguiente fórmula;

% DPPH remanente = Absorbancia 517 nm muestra / Absorbancia 517 nm control × 100

Donde la absorbancia a 517 nm de la muestra, corresponde a la absorbancia conseguida por

un extracto en particular que posee actividad antioxidante y la absorbancia control, corresponde a

la absorbancia del DPPH sin ser sometido a algún agente antioxidante. Ya que él % DPPH

remanente, es útil para determinar la cantidad de agente antioxidante necesario para disminuir en

un 50 % la absorbancia de DPPH (50 % de DPPH remanente) (EC50), se trabajó en esta oportunidad

con los extractos comprendidos en la tabla XIX, pero esta vez, abarcando un mayor espectro de

concentraciones (1 – 5 mg/mL). Así mismo, se utilizó el % DPPH remanente de las distintas

concentraciones de los extractos antes mencionados, pero comparándolos con el tiempo

transcurrido (0 – 60 min), es decir, para concentraciones de extracto MP y DA de 5 mg/mL, se

determinó como varía el % DPPH remanente en el tiempo (60 min). Con aquello, es posible

conseguir el tiempo necesario para alcanzar el valor de EC50 (TEC50).

En definitiva, la determinación de las ecuaciones de la recta para calcular, tanto EC50 como

TEC50, fueron logradas en un principio por el cálculo del % DPPH remanente según la concentración

utilizada de extracto (Tabla XX) y en segunda instancia o una vez que ya se conocía la

concentración con la cual se conseguía un mejor resultado de porcentaje de DPPH remanente, se

estableció ésta (5 mg/mL) para realizar el estudio de cómo variaba el % DPPH remanente en el

tiempo (Tabla XXI). Las gráficas desde donde se obtienen las ecuaciones de la recta necesarias

para determinar, EC50 y TEC50, se adjuntan en ANEXOS 5.0.

117

Tabla XX. % DPPH remanente según concentración de extracto algal utilizada.

% DPPH remanente + DE

Concentración

extracto algal

(mg/mL)

Extracto Macrocystis

pyrifera.

Extracto Durvillaea antarctica.

1.00 97,17 ± 0,002 87,21 ± 0,007

2.00 76,33 ± 0,008 78.07 ± 0,017

3.00 55,22 ± 0,010 73,89 ± 0,020

4.00 34,22 ± 0,007 69,71 ± 0,009

5.00 19,84 ± 0,003 66,31 ± 0,008

118

Tabla XXI. % DPPH remanente según tiempo de ensayo DPPH.

% DPPH remanente

Tiempo de ensayo (min) Extracto de Macrocytis

pyrifera

Extracto de Durvillaea

antarctica

0 94,78 ± 0,023 98,96 ± 0,006

5 91,55 ± 0,017 96,87 ± 0,024

10 85,11 ± 0,012 94,52 ± 0,015

15 81,22 ± 0,010 92,17 ± 0,016

20 75,02 ± 0,019 89,30 ± 0,022

25 66,84 ± 0,020 86,42 ± 0,006

30 59,53 ± 0,008 82,11 ± 0,005

35 53,00 ± 0,019 77,35 ± 0,013

40 48,30 ± 0,027 72,06 ± 0,029

45 42,04 ± 0,011 68,93 ± 0,032

50 38,38 ± 0,006 64,22 ± 0,041

55 31,44 ± 0,009 61,11 ± 0,008

60 26,23 ± 0,003 58,77 ± 0,007

119

Observando las Tablas XX y XXI, se concluye que los extractos del alga Durvillaea

antarctica, no poseen suficiente actividad antioxidante, para lograr disminuir a la mitad la

concentración de radical libre DPPH, esto considerando que en todos los ensayos realizados en este

trabajo, la concentración óptima de trabajo para los extractos, fue de 5 mg/mL, midiendo valores

de absorbancia a la hora de ensayo. Esto último, no resta el hecho de que extractos de Durvillaea

antarctica, si presentan un %IRL considerable, aunque menor que los extractos provenientes del

alga Macrocystis pyrifera.

Finalmente, se calculó el AE o eficiencia antiradical, inversamente proporcional a EC50 y

TEC50, como parámetro extraordinario para valorar la actividad antioxidante de los extractos de

Macrocystis pyrifera, ya que estos si lograban disminuir al menos en un 50% la actividad oxidante

del DPPH. Los valores de EC50 se obtuvieron por medio de la ecuación de la recta y = -19,677 x +

115,59 (ANEXO 5.1) y los de TEC50 por medio de la ecuación de la recta y = -1,1908 x + 96,757

(ANEXO 5.2). AE por tanto fue determinado como una relación inversamente proporcional entre

EC50 y TEC50. Estos valores son expuestos en la Tabla XXII adjunto a valores bibliográficos para

acido gálico y acido ascórbico, extraídos desde el trabajo de Sánchez – Moreno et al., (1998).

4.7.8 Actividad antioxidante equivalente al Ácido ascórbico (VCEAC) y Actividad antioxidante

equivalente a TROLOX (TEAC).

Al igual que % IRL, % DPPH remanente, EC50, TEC50 y AE, VCEAC y TEAC, son parámetros

muy utilizados para valorar la actividad antioxidante de una muestra sometida a estas pruebas. La

particularidad en este caso, es que la actividad antioxidante se correlaciona con aquella que

presenta el ácido ascórbico (VCEAC) y TROLOX (TEAC), estableciendo una relación de

equivalencia para con estas moléculas antioxidantes, comúnmente utilizadas como estándares.

120

Tabla XXII. EC50, TEC50 y AE de extractos de alga Macrocytis pyrifera.

Parámetro

antioxidante

Extracto de

Macrocystis

pyrifera

5mg/mL

Ácido ascórbico

177 g/kg DPPH

Ácido gálico

171 g/Kg DPPH

EC50 3,33 mg/mL 76 ± 7

g Antioxidante/kg DPPH

26 ± 1

g Antioxidante/Kg DPPH

TEC50 (min) 39,27 1,15 ± 0,08 14,69 ± 1,10

AE (× 10-3) 7,65 11,44 2,62

Clasificación

potencia

antioxidante según

Sánchez – Moreno

et al., (1998)

Alto? Muy alto Medio

121

Para el cálculo de estos parámetros, se hizo uso de las ecuaciones de la recta obtenidas por

medio de las curvas de calibración para el ácido ascórbico y TROLOX (ANEXO 6). Para el caso

del VCEAC, se utilizó la ecuación y = - 0,0021x + 0,2565 y para TEAC, la ecuación y = - 0,0008x

+ 0,0774. Los resultados fueron expresados en µM para TEAC y en mg/L o ppm para VCEAC

(Tabla XXIII). El TEAC no fue aplicable para el caso del extracto de Durvillaea antarctica, porque

el valor de absorbancia de éste, escapaba del rango de absorbancia de TROLOX por el ensayo

DPPH. En la Tabla XXIII además, se agrega información recopilada de Kushoski et al., (2005), en

relación al TEAC y VCEAC de agente antioxidantes naturales, como la acerola y el mango, para

así contar con valores comparativos para un mejor análisis de estos parámetros.

4.7.9 Método de Fenoles Totales (FT) o Método de Folin – Ciocalteu.

Ya que la metodología por ensayo DPPH, permite determinar la capacidad antioxidante de

una muestra en particular, aplicar metodologías como la de los Fenoles Totales, permite especificar

un tanto más, a que componente de la muestra analizada se atribuye dicha capacidad. Por lo tanto,

resultados positivos para el método de fenoles totales, es decir, un resultado de absorbancia

apreciable en la medición a 765 nm o el cambio de color de la solución, de amarillo a azul, equivale

a que la muestra analizada, posee en su constitución compuesto fenólicos con actividad

antioxidante.

Por lo tanto, en esta oportunidad y al igual como se ha llevado a cabo anteriormente, se trabajó

con el mejor extracto de Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica (triplicados) y a base de la

ecuación de la recta, obtenida de la curva de calibración para el ácido gálico a 765 nm (ANEXO7),

potente antioxidante, comúnmente utilizado en esta metodología.

Las muestras analizadas en esta oportunidad (triplicados todas ellas) consistieron en;

a) Estándar de Laminarina y Fucoidina, a 5mg/mL y 1mg/mL cada uno de ellos.

122

Tabla XXIII. VCEAC y TEAC para extractos de Macrocystis pyrifera y Durvillaea

antarctica.

Parámetro de

actividad

antioxidante

Extracto de

Macrocystis

pyrifera

Extracto de

Durvillaea

antarctica

Acerola Mango

TEAC (µM) + DE 0,370 ± 0,021 ---- 68,0 ± 2,2 13,7 ± 0,4

VCEAC (ppm) +

DE

88,81 ± 0,018 5,95 ± 0,012 959,1 ± 19,0 174,0 ± 0,5

123

b) Extracto de protocolo nuevo de Macrocystis pyrifera y extracto de protocolo Black de

Durvillaea antarctica. Ambos a 5mg/mL.

El ácido gálico fue disuelto en metanol 100%, al igual que los extractos. Los estándares por su

parte, fueron disueltos en agua destilada. Además se realizó un blanco para el solvente metanol

100%, sin obtenerse absorbancia apreciable a 765 nm.

En la Tabla XXIV figuran los datos de la metodología por Fenoles Totales, calculados por

medio de la ecuación de la recta y = 0,0008x + 0,0239.

4.8 Determinación de la Actividad Antibacteriana.

Según la Tabla XVIII de la sección de Materiales y Métodos, se analizó una variedad de

muestras considerable para este estudio, contemplando estándares comerciales de Laminarina y

Fucoidina, Estándar antibióticos como Unasyn®, Sulperazon® e Inem® extractos algales a una

concentración de 5 mg/mL y extractos digeridos enzimáticamente y pick cromatográficos de

laminarina y fucoidina, recolectados desde el mismo HPLC. Para el caso, de los últimos tipos de

muestras, no se observó ninguna clase de inhibición en placa, siendo los resultados para pick

recolectados y extractos digeridos con laminarina y β - glucanasa, completamente negativos a todas

las concentraciones probadas.

Se realizaron placas control con el mismo inóculo y metodología que se realizaron los

antibiogramas, para todas las bacterias en cuestión y con el fin de corroborar el correcto crecimiento

bacteriano, libre cualquier contaminación que invalide las pruebas.

Las placas elaboradas para testear los estándares comerciales de Laminarina y Fucoidina, a

concentraciones de 25 mg/mL ambas, resultaron todas negativas en cuanto a inhibición bacteriana,

lo que se contrarresta para los extractos de Macrocytis pyrifera, que si presentaron actividad

antibacteriana para algunas bacterias.

124

Tabla XXIV. Fenoles Totales en extractos de Macrocytis pyrifera y Durvillaea antarctica.

Concentración Extracto algal o

Estándar polisacárido

Absorbancia 765 nm + DE Fenoles Totales

(representado en

concentración de fenoles

totales, equivalentes a

ppm de ácido gálico) +

DE

Laminarina 5 mg/mL 0,005 ± 0,001 -----

Fucoidina 5 mg/mL 0,037 ± 0,002 16,375 ± 0,012

Laminarina 1 mg/mL 0,019 ± 0,001 -----

Fucoidina 1 mg/mL 0,159 ± 0,003 168,88 ± 0,011

Extracto Macrocystis pyrifera

5 mg/mL

0,069 ± 0,004 56,38 ± 0,018

Extracto Durvillaea antarctica

5 mg/mL

0,041 ± 0,001 21,38 ± 0,022

M. pyrifera (referencial) ----- 125 ± 0,096

D.antarctica (referencial) ----- 130 ± 0,135

125

Las bacterias ATCC que presentaron inhibición frente al uso de extractos de Macrocystis

pyrifera, fueron Bacillus subtilis ATCC 33608, Staphylococcus aureus ATCC 25923,

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 y Escherichia coli ATCC 25922. La actividad

antibacteriana fue evaluada en relación al halo de inhibición formado en torno al pocillo que

contenía cada preparado de extracto. Además, se estudió el halo de inhibición formado para estas

bacterias, pero contra antibióticos comerciales (preparados comerciales inyectables vía

endovenosa), tales como; Inem®, Sulperazon® y Unasyn®, con el fin de establecer una

comparación en la magnitud del halo de inhibición de estos estándar y el extracto de Macrocystis

pyrifera. El extracto de Durvillaea antarctica no presento inhibición alguna, para ninguna de las

bacterias estudiadas. Ya que este ensayo obedece a un diseño experimental, 8 × 5 × 3, se realizaron

las pruebas en triplicado, donde en cada placa se testeaban cinco diluciones distintas más un control

de H2O estéril, resultando efectiva la prueba solamente para cuatro bacterias y no las ocho

originales que fueron contempladas.

Por lo tanto, en la Figura 31, se incluyen cuatro fotografías que comprenden los cuatro

antibiogramas positivos para halos de inhibición por la aplicación de extractos de Macrocystis

pyrifera. En la Figura 32 por otra parte, se contemplan las fotografías para halos de inhibición por

la aplicación de estándares antibióticos; conjuntamente se realizaron placas control para cada

bacteria, resultando todas ellas correctas en crecimiento bacteriano y libre de contaminación.

(Información no entregada)

En la Tabla XXV se muestran los halos de inhibición en milímetros (promedio de tres

repeticiones más desviación estándar), que son el resultado de la aplicación de preparados en los

pocillos o impregnación de discos filtros.

126

Figura 31. Antibiogramas de Extractos de protocolo nuevo de Macrocystis pyrifera.

En el sentido contrario de las manecillas del reloj, comenzando desde la flecha roja, los pocillos

corresponden a; concentrado, dilución 1:1, dilución 1:2, dilución 1:4, dilución 1:8 y control de H2O

estéril. La concentración de extracto utilizado fue de 25 mg/mL. A, antibiograma para Bacillus

subtilis ATCC 33608, B, Escherichia coli ATCC 25922, C, Staphylococcus aureus ATCC 25923,

D, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.

A B

C D

127

Figura 32. Antibiogramas de estándares antibióticos Inem®, Unasyn®, Sulperazon®.

En el sentido contrario de las manecillas del reloj y comenzando desde la flecha roja, para A

(Bacillus subtilis), Unasyn®, Sulperazon®, Inem®, para B (Escherichia coli), Unasyn®,

Sulperazon®, Inem®, para C (Staphylococcus epidermidis), Sulperazon®, Inem®, Unasyn®. Los

estándares antibióticos fueron preparados como se señala en la sección de materiales y métodos.

A B

C

128

Tabla XXV. Halos de inhibición bacteriana para Extracto de Macrocystis pyrifera y

estándares antibióticos.

Halos de inhibición (mm) + DE

Concentraciones Bacillus subtilis Escherichia coli Staphylococcus

aureus

Staphylococcus

epidermidis

Concentrado

25mg/mL

1,30 ± 0,064 A

a

2,26 ± 0,09 A

a

3,57 ± 0,06 A

a

5,39 ± 0,03 A

b

1:1 1,16 ± 0,04 A

a

2,11 ± 0,025 A

a

2,77 ± 0,02 B

ab

3,82 ± 0,05 B

b

1:2 0 ± 0 B

a

0 ± 0 B

a

0 ± 0 C

a

0 ± 0 C

a

1:4 0 ± 0 B

a

0 ± 0 B

a

0 ± 0 C

a

0 ± 0 C

a

1:8 0 ± 0 B

a

0 ± 0 B

a

0 ± 0 C

a

0 ± 0 C

a

H2O estéril

(control)

0 ± 0 B

a

0 ± 0 B

a

0 ± 0 C

a

0 ± 0 C

a

Halos de inhibición (nm) + DE para estándar antibiótico.

Inem® 11,74 ± 0,22 a 12,94 ± 0,39 ac 18,74 ± 0,38 b 13,16 ± 0,59 c

Unasyn® 14,29 ± 0,28 a 17,94 ± 0,10 b 22,90 ± 0,11 c 16,18 ± 0,33 b

Sulperazon® 16,59 ± 0,46 a 18,92 ± 0,78 b 20,67 ± 0,49 c 17,58 ± 0,64 ab

Letras mayúsculas diferentes en las columnas, indican diferencia significativa estadística entre

concentraciones de acuerdo a la prueba de rango múltiple de Tukey al 95%. Letras minúsculas diferentes

en las filas, indican diferencia significativa estadística entre bacterias de acuerdo a la prueba de rango

múltiple de Tukey al 95 %.

129

En la Figura 33, se contemplan los resultados comprendidos en la Tabla XXV, para el

concentrado y diluido 1:1 del extracto de Macrocystis pyrifera. Los resultados para los diluidos

1:2, 1:4, 1:8 y H2O estéril fueron todos negativos, sin ninguna formación de halo de inhibición,

siendo no incorporados en la Figura 33.

En cuanto a la Tabla XXV en particular, podemos inferir que; para extractos de protocolo nuevo

para el alga Macrocystis pyrifera, sólo resultaron efectivas para impedir el crecimiento

bacteriológico, los extractos concentrado y con una dilución 1:1, siendo inefectivas las diluciones

1:2, 1:4 y 1:8, además de no presentarse inhibición alguna en el pocillo control. De forma adicional,

la bacteria más fuertemente inhibida resultó ser S. epidermidis, con un halo de inhibición de 5,39

± 0,03 mm para el concentrado y de 3,82 ± 0,05 mm para la dilución 1:1 del extracto probado

(demostrable también por Figura 33). La segunda bacteria más fuertemente inhibida, fue S. aureus,

con un halo de inhibición de 3,57 ± 0,06 mm para el concentrado y otro de 2,77 ± 0,02 mm para la

dilución 1:1, le siguen a éste, E. coli, con un halo de inhibición para el extracto concentrado de

2,26 ± 0,09 mm y de 2,11 ± 0,025 mm para el extracto con dilución 1:1 y finalmente, con la menor

inhibición de crecimiento, la bacteria B. subtilis, con halos de inhibición de 1,30 ± 0,064 mm y

1,16 ± 0,04 mm, para el extracto concentrado y 1:1 respectivamente.

Al analizar estadísticamente la inhibición bacterial mediante análisis de varianza (ANDEVA),

fue posible comprobar para el caso del extracto concentrado sobre S. epidermidis, que éste presenta

diferencia significativa (p < 0,05) con respecto a las tres bacterias restantes, como se observa en

las letras minúsculas de la fila del concentrado. Para el caso de la dilución 1:1 sobre S. epidermidis,

no existe diferencia significativa si comparamos a ésta con S. aureus por análisis ANDEVA (p >

0,05) y por las letras minúsculas de la fila dilución 1:1 (letras minúsculas iguales entre ambas

bacterias). Además, para el caso de la fila

130

Figura 33. Inhibición de Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus y

Staphylococcus epidermidis por efecto de las distintas diluciones de extracto de Macrocystis

pyrifera. A, inhibición del crecimiento bacteriano correspondiente al extracto concentrado de

Macrocystis pyrifera (25 mg/mL), B, inhibición del crecimiento bacteriano correspondiente a una

dilución 1:1 del extracto de Macrocystis pyrifera.

1,3

2,26

3,57

5,39

0

1

2

3

4

5

6

Concentrado

Hal

o d

e in

hib

ició

n (

mm

)

Extracto concenrado de Macrocystis pyrifera

Bacillus subtilis Escherichia coli

Stahphylococcus aureus Staphylococcus epidermidisA

1,16

2,11

2,77

3,82

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

Dilucion 1

Hal

o d

e in

hib

ició

n (

mm

)

Extracto diluido 1:1 de Macrocystis pyrifera

Bacillus subtilis Escherichia coli

Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidisB

131

del extracto concentrado, podemos indicar que no existe diferencia significativa (p < 0,05) entre

Bacillus subtilis, Escherichia coli y Staphylococcus aureus; por otra parte, y observando la fila

dilución 1:1, tampoco existió diferencia significativa entre Bacillus subtilis, Escherichia coli y

Staphylococcus aureus.

Para el caso de los controles antibióticos, todos presentaron una inhibición del crecimiento

bacteriano mucho más fuerte y en todas las bacterias, que el extracto probado. Analizando la acción

de estos antibióticos sobre cada bacteria estudiada y no sobre distintas concentraciones (como el

caso del extracto), tenemos que; Inem® inhibe más fuertemente a Staphylococcus aureus, seguido

de S. epidermidis, luego E. coli y finalmente B. subtilis. Además, existe diferencia significativa (p

< 0,05) de magnitud de la inhibición entre B. subtilis, S. aureus y S. epidermidis, pero no existe

diferencia significativa (p > 0,05) entre E. coli y B. subtilis o S. epidermidis. Desde otra perspectiva,

Unasyn®, inhibe fuertemente y en primer lugar a S. aureus, luego a E. coli, S. epidermidis y

finalmente a B.subtilis. En términos de análisis ANDEVA, existe diferencia significativa (p > 0,05)

entre B. subtilis, E. coli y S. aureus, pero no entre E. coli y S. epidermidis (letras minúsculas iguales

en Tabla XXV). En última instancia, Sulperazon®, inhibe de mejor forma a S. aureus, luego a E.

coli, para seguir con S. epidermidis y finalmente B. subtilis. En cuanto a diferencia significativa, si

existe entre B. subtilis, E. coli y S. aureus, pero no entre S. epidermidis y E. coli. (p < 0,05 y letras

minúsculas iguales en la fila).

Comparando los resultados de la prueba del extracto de Macrocytus pyrifera y estándares

antibióticos, claramente observamos una superioridad notable de estos últimos y el extracto, aún

cuando se trate del concentrado o dilución 1:1 del extracto. Sólo para el caso del extracto probado,

se observó concordancia en cuanto a que, la inhibición bacteriana debe disminuir a medida que el

agente a probar, se somete a dilución. No se observa concordancia en relación a que, para el caso

132

de Staphylococcus epidermidis, se observó diferencia significativa entre esta bacteria y

Staphylococcus aureus para el extracto concentrado, pero no así cuando se trataba del extracto con

dilución 1:1, revelando que no existe diferencia en la inhibición del crecimiento bacteriano para

estas bacterias, cuando se trata de la aplicación de una dilución 1:1.

Finalmente, se concreta el hecho que, los extractos de Macrocystis pyrifera contenedores de

fucoidina, si presentaron actividad antibacteriana, lo que no ocurrió con las muestras estándar de

Fucoidina 25 mg/mL. Si corresponde que el extracto de Durvillaea antarctica no haya presentado

actividad alguna, puesto que el estándar de Laminarina 25 mg/mL tampoco fue efectivo en ningún

grado o magnitud para inhibir el crecimiento de algunas de las bacterias estudiadas.

4.9 Determinación de la actividad antifúngica.

La realización de la actividad antifúngica fue desarrollada en las dependencias del Instituto

de Microbiología Clínica de la Facultad de Medicina de la Universidad Austral de Chile. Según lo

descrito en la sección de Materiales y Métodos, de todos los tipos de muestras ensayadas sobre las

cepas fúngicas estudiadas, no se obtuvo ningún resultado positivo en cuanto a aparición de halo de

inhibición. Esto último se corroboró al aplicar estándar comercial de Laminarina y Fucoidina y no

conseguirse ninguna clase de inhibición del crecimiento fúngico. En las Figuras 34 y 35, se

exponen algunos de los resultados negativos para el género Candida y Aspergillus respectivamente,

pero sólo para algunas de las muestras ensayadas.

133

Figura 34. Actividad antifúngica de Estándar comercial de Laminarina 25 mg/mL y

Fucoidina 25 mg/mL. En el sentido contrario de las manecillas del reloj, desde la flecha roja,

concentrado, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 y control (H2O estéril). A, Candida albicans, para estándar comercial

de Laminarina 25 mg/mL, B, Candida guillermondii, para estándar comercial de Fucoidina 25

mg/mL, C, Candida Krusei, para estándar comercial de Laminarina 25 mg/mL.

A B

C

134

Figura 35. Actividad antifúngica para el género Aspergillus. A, Extracto de Durvillaea

antarctica, arriba Aspergillus terreus, abajo Aspergillus fumigatus, B, Extracto de Durvillaea

antarctica, arriba A. flavus, abajo A. niger, C, Extracto de Macrocystis pyrifera, arriba A. terreus,

abajo A. fumigatus, D, Extracto de Macrocystis pyrifera, arriba A. flavus, abajo A. niger, E,

Fucoidina estándar, arriba A. terreus, abajo A. fumigatus, F, Laminarina estándar, arriba A. flavus,

abajo A. niger.

A B C

D E F

135

5. DISCUSIÓN

En lo que respecta el proceso de extracción de las materias primas algales, tenemos que;

observando la Figura 12 (página 89), los monosacáridos glucosa, fucosa y manitol no revierten un

posible interferente en cuanto a tiempo de elución, comparado con los picos principales y objeto

central de este trabajo de tesis, es decir, los picos referentes a fucoidina y laminarina, que eluyen a

los 10 min y 15 – 17 min respectivamente. De igual forma, los productos de hidrólisis enzimática

como laminaritriosa y laminaritetraosa y su tiempo de elución de aproximado de 18 y 19 min

respectivamente, tampoco son sinónimo de conflicto a la hora de identificar los picos principales a

detectar en los cromatogramas. Según el cromatograma de los estándares comerciales (Figura 13,

página 90), se obtiene una relación directa con la Figura 12, ya que el estándar de fucoidina siempre

eluye en torno a los 10 min y antes que el picos de ácido algínico. De igual forma, el pico de

laminarina comercial, eluye en esta oportunidad cercano a los 15 min, manteniéndose el rango

aproximado de elución, de 15 – 17 min. Según Ortiz (2011), los extractos de Macrocystis pyrifera

debiesen contener mayor proporción del polisacárido estructural fucoidina, que del polisacárido de

reserva, laminarina, lo cual es consistente con que en la Figura 14, todos los procesos extractivos

elaborados por Deville et al., entregan una proporción aceptable de fucoidina, pero en menor grado

de laminarina (a excepción de protocolo Yvin’s), siendo el protocolo Nuevo, el que resulta en una

mayor cantidad (Según área de pico) de fucoidina. Por otra parte, para el caso del proceso de

extracción desde Durvillaea antarctica, el protocolo Black se convirtió en el mejor proceso

extractivo para conseguir una mayor cantidad de laminarina, lo que también se condice con las

fuentes referenciales, que se refieran a que esta alga contiene un mayor grado de laminarina que

Macrocystis pyrifera, sólo cuando, los factores ambientales así lo promueven. Esto último, se

convierte en una limitante y factor determinante a la hora de intentar extraer en primera instancia

136

estos polisacáridos y por otra parte, en efectivamente detectarlos por la metodología HPLC – IR,

ya que se encuentra perfectamente descrito que, la variación del contenido, aminoacídico, de

tocoferoles, compuestos carotenoides y concentración de polifenoles, entre otros, varía de especie

a especie según la localización geográfica, estaciones del año, exposición a oleaje y a las corrientes,

concentración de nutrientes presentes en el medio, profundidad a la que se localizan, la temperatura

y estado de desarrollo del alga. Sintetizando lo predicho, las condiciones ambientales pueden

promover o restringir totalmente, la síntesis del polisacárido laminarina, ya que la presencia de

ésta, está directamente limitada a la mayor o menor irradiación de luz solar que se utiliza para el

proceso fotosintético, directamente dependiente de la profundidad a la cual se encuentra el alga, a

las condiciones climatológicas (menor luz solar en período de invierno, lo que fomenta la síntesis

de un polisacárido de almacenamiento como laminarina), y a la juventud del alga que ha sido

extraída (algas jóvenes, según condiciones ambientales, puede contener mayor cantidad de

laminarina y fucoidina). Así también, no es de menor importancia mencionar que, la anatomía del

alga pudiese influir en encontrar mayor o menor contenido de estos polisacáridos en las algas

estudiadas, siendo una alternativa para trabajos futuros, realizar un estudio más acucioso sobre

estipes y frondas, así como también correlacionar los resultados, con la fuente de la materia prima,

es decir, la ubicación geográfica y el período estacional a la que corresponde el alga trabajada.

Aun cuando las metodologías elaboradas por Deville et al., fueron el principal foco de trabajo,

la elaboración de protocolos alternativos como Nakamura – Black se convirtieron por momentos

en opciones no menores para experimentar en torno a, cuánta cantidad de laminarina se podía

conseguir, ya que ésta revestía el principal problema de detección de este trabajo, debido a que

siempre se encuentra en mucho menor proporción, independiente de la materia prima, que el

polisacárido de fucoidina. A raíz de la Figura 16 (página 95), se tiene que para estos protocolos

137

NB, se consigue una menor de laminarina en relación al protocolo Black elaborado de Deville y

aplicada al alga Durvillaea antarctica.

A pesar de que, el trabajo en torno a los productos de hidrólisis no fue productivo en ninguna

de las actividades ensayadas, se realizó el proceso de detección de estos según si se aplicaba la

enzima β - glucanasa o laminarinasa (Figura 23 y 24 respectivamente). En ambos casos, la

detección de laminaritriosa o laminaritetraosa fue positiva, siendo algo menor en el caso de la β-

glucanasa, por ser ésta una enzima de menor especificidad para la hidrólisis exclusiva de

laminarina.

Para determinar la concentración de fucoidina entonces, se seleccionó el extracto logrado con

el protocolo Nuevo a partir de M. pyrifera. Mientras que para determinar la concentración de

laminarina se optó por el extracto del protocolo Black de D. antarctica. Esta elección se basó en

que el protocolo Nuevo de M. pyrifera extrae mayoritariamente fucoidina, mientras que el

protocolo Black de D. antarctica es más específico para conseguir buenas cantidades de

laminarina. Las áreas de los respectivos picos se utilizaron para la determinación de concentración

de los polisacáridos, utilizando las curvas de calibración de los estándares fucoidina (y = 12,477 x

– 48,564) y laminarina (y = 10,614 x – 11,939) (Anexo 4.1 y 4.2 respectivamente). Esto resultados

indican que el extracto de M. pyrifera correspondía en un 100% a fucoidina mientras que el extracto

de D. antarctica presenta un 79% de laminarina.

En otra instancia y respecto a la actividad enzimática de las enzimas β – glucanasa y

laminarinasa sobre los extractos de Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica, se realizaron

pruebas de detección de los productos de hidrólisis. Es este punto, el test de glucosa y el método

estandarizado del DNS, son relevantes para determinar si las enzimas efectivamente fueron activas

enzimáticamente frente a los extractos. Podemos decir por lo tanto, que aunque esta sección era

138

primordial para desarrollar parte de la hipótesis de este trabajo, era aún más relevantes para

determinar si existía o no presencia de los polisacáridos en estudio (sobre todo laminarina, por

especificidad hidrolítica de una de las enzimas por este polisacárido). Se obtuvo entonces que, para

ambos casos si existía una hidrólisis enzimática positiva, siendo ésta más sensible, pero más

inespecífica para el caso del test del DNS y más específica, pero menos sensible para el test de

glucosa. Esto último ya que, el test del DNS detecta azúcares reductores, que comprende

mayoritariamente monosacáridos como productos de hidrólisis probables, detectando por ende

mayor cantidad de posibles productos hidrolíticos en relación al test de glucosa, que sólo se refiere

a la detección exclusiva de glucosa.

Referente a la medición de la actividad antioxidante para extractos de Macrocystis pyrifera y

Durvillaea antarctica, podemos mencionar que, los mejores resultados se consiguieron en torno a

extractos de M. pyrifera, con un % IRL (Tabla XIX, página 117) en torno al 81,72 % siempre

cercano a los rangos de estándares antioxidantes, como TROLOX, ácido gálico y ácido ascórbico.

Extractos de D. antarctica, siempre presentaron menor actividad antioxidante (% IRL del 36,30

%). Si consideramos la concentración óptima de trabajo para extractos algales, 5 mg/mL, los

extractos de M. pyrifera vuelven a ser superiores que los de D. antarctica, esta vez en el % DPPH

remanente (Tabla XX, página 119), 19,84 % y 66,31 % respectivamente, denotando que el extracto de

M. pyrifera ejerce una actividad antioxidante más potente, al dejar menor cantidad de DPPH libre

o en estado reducido en el medio. En relación a la Tabla XXII (página 122), los parámetros EC50,

TEC50 y AE, comprenden otra herramienta para establecer la actividad antioxidante de un agente

antioxidante en particular, así tenemos que, el extracto de M. pyrifera, posee un EC50 aceptable en

comparación con el ácido ascórbico y ácido gálico, pero un TEC50 un tanto alto, lo que equivale a

que el extracto es un buen antioxidante, pero lento en su acción en relación a los estándares con los

139

que se compara en esta figura, y que según la clasificación de Sánchez – Moreno et al.,

correspondería aparentemente (por carecer de rangos de referencia) a un agente antioxidante de

alta potencia. La eficiencia antiradical para el extracto de M.pyrifera por tanto es excelente, pero

menor al ácido ascórbico, que es considerado un agente con una altísima potencia antioxidante. De

forma adicional, EC50 demuestra que, sólo se necesita de una concentración de 3,3 mg/mL para

conseguir la mitad de la inhibición del DPPH. Además, la Tabla XXIII (página 124) demuestra que

el extracto de D. antarctica sigue siendo menor en cuanto a actividad antioxidante y que la Acerola

y Mango son agentes antioxidantes muy potentes, pues consiguen valores de TEAC y VCEAC

importantes, considerando que el TROLOX y ácido ascórbico ya son fuertes antioxidantes. Ante

esto último, podemos inferir que, a pesar que según los parámetros EC50, TEC50 y AE son buenos

para el extracto de M. pyrifera, el TEAC y VCEAC son menores, ya que ésta corresponde a una

comparación directa de la capacidad antioxidante de dos conocidos antioxidantes y un agente

nuevo que se prueba. Por lo tanto, el extracto de M.pyrifera sólo equivale a 0,370 ± 0,021 µM de

Trolox y a 88,81 ± 0,018 ppm de ácido ascórbico. La Tabla XXIV por tanto (página 126), se refiere

a la medición de fenoles totales, por la metodología de Folin-Ciocalteu que mide el aumento de la

absorbancia a 765 nm y es útil para la determinación de antioxidante fenólicos y polifenólicos. La

Tabla XXIV demuestra además que, para el estándar de Laminarina si existe absorbancia a 765

nm, debido a una absorción a esa longitud de onda propia de laminarina o de algún producto de

reacción una vez sometida la muestra a los reactivos del método de fenoles totales. Para el caso de

fucoidina 5 mg/mL y 1 mg/mL, también se presentó lectura de absorbancia,pero mayor que en el

caso de laminarina, posiblemente a las mismas razones anteriores, ya que el estándar comercial de

fucoidina proviene de Fucus vesiculosus, donde se conoce que este tipo de fucoidina no contiene

compuestos fenólicos en su estructura, sino que contiene fucosa y sulfato. Adicionalmente, la

140

actividad antioxidante que reporta fucoidina, y algunos polisacáridos, se debe en gran parte a los

radicales hidroxilados de estos y no a la estructura resonante propia de los fenoles, o grupos fenil

en su defecto. A pesar de lo anterior, resulta más razonable que los extractos de M. pyrifera y D.

antarctica hayan sido positivos para el ensayo de fenoles totales, puesto que en su calidad de

extractos, además de fucoidina o laminarina, puedan contener otros compuestos, a los cuales se les

pueda atribuir la absorbancia resultante de este ensayo. Esto último, se condice con lo señalado en

la Tabla XXIV, puesto que Macrocystis pyrifera presenta una concengtracion de fenoles totales

quivalentes a 125 ppm de ácido gálico y Durvillaea antarctica, una de 130 ppm de ácido gálico,

resaltando el hecho entonces, de que ambas especies algales poseen efectivamente compuestos

fenólicos a los que se les puede atribuir parte de la actividad antioxidante ya demostrada en el

ensayo del DPPH. Dentro de los posibles compuestos fenólicos que pudiesen contener las algas en

cuestión, se encuentran los florotaninos, que según Koivikko (2008), son la única clase de taninos

que se encuentran en algas pardas, consistentes en polímeros de floroglicenoles, que pueden llegar

a constituir aproximadamente el 15 % del peso seco del alga (1 – 1,3 % del peso seco de

Macrocystis pyrifera, según Van Alystyne (1999)). Swanson y Druehl (2002), señalan además que

la síntesis y liberación al espacio marino de florotaninos, está estrechamente relacionada con el

stress UV – A y la protección a radiación UV – B. Cruces et al., (2013) por tanto señala que, la

actividad antioxidante y contenido soluble de florataninos, es positivamente correlacionada con la

exposición a radiación UV y rápidamente inducible a T° > 20 °C para el caso de D. antarctica, la

especie más sensible a la irradiación de temperatura. Esto reafirma aún más, que las condiciones

ambientales, influye fuertemente en la capacidad antioxidante de estas algas.

En relación a la determinación de la actividad antibacteriana, sólo se consiguieron positivos

para el extracto obtenido por protocolo nuevo de Macrocystis pyrifera, siendo éste efectivo en

141

cuanto a aparición de halo de inhibición para las bacterias, Escherichia coli, Staphylococcus

aureus, Staphylococcus epidermidis y Bacillus subtilis. Es altamente probable por antecedentes

bibliográficos, que la actividad antibiótica de este extracto se deba a fucoidina, aun cuando Reichelt

y Borowitzka (1984) señalan que, esta actividad podría deberse también a múltiples principios

activos presentes en este tipo de algas, entre los cuales tenemos, ácidos grasos insaturados, fenoles,

sesquiterpenos halogenados e hidroquinonas bromadas. Howard y Fenical (1978) agregan a la lista

anterior, ácidos grasos libres o formando parte de mono, di y triglicéridos. Una vez más, no se

puede menospreciar el hecho, y señalado por Valdebenito (1981), que cada especie algal posee su

propia periodicidad en la producción del antibiótico. En cambio, otros autores como Hornsey y

Hide (1985) encuentran cuatro patrones de producción de antibiótico, que van desde uniforme todo

el año, hasta máximo producción en invierno, primavera o verano.

Finalmente, en materia de medición de actividad antifúngica, ésta prueba resultó negativa

para todos los tipo de muestra ensayada, no obteniéndose ninguna clase de inhibición de las cepas

fúngicas utilizadas. Esto posiblemente debido a que escasos estudios indican que, el género

Undaria, u otras algas de costas tropicales u orientes, han presentado actividad sobre Trichophyton,

Candida y Saccharomyces, pero no sobre el género Aspergillus. La actividad antifúngica de

fucoidina o laminarina tampoco se encuentra bien especificada en antecedentes bibliográficos.

142

6. CONCLUSIONES.

Para finalizar y considerando los resultados de este trabajo de investigación, es posible concluir

lo que sigue;

a.- A partir del alga Durvillaea antarctica, es posible extraer en mayor cantidad el polisacárido de

reserva, laminarina, mientras que, desde MP se obtiene de mejor forma fucoidina.

b.- El polisacárido laminarina no se encuentra sulfatado en forma natural en cambio fucoidina

presenta un importante contenido de sulfatos.

c.- Respecto a la medición de actividad antioxidante para extractos de Durvillaea antarctica y

Macrocystis pyrifera, podemos mencionar que, los mejores resultados se consiguieron en torno a

extractos de Macrocystis pyrifera, cuyos resultados se asemejan a los obtenidos por medio de

estándares antioxidantes como, TROLOX, Acido Gálico y Acido Ascorbico.

d.- Las especies algales, Durvillaea antarctica y Macrocystis pyrifera, contienen compuestos

fenólicos a los que se les puede atribuir parte de la actividad antioxidante registrada. Entre estos,

los florotaninos serían los taninos que contemplan mayor importancia.

e.- Extractos del alga Macrocystis pyrifera, presentan actividad antibacteriana contra las cepas

bacterianas de, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylocuccus epidermidis y Bacillus

subtilis. Existe una gran probabilidad, que esta actividad pueda deberse al polisacárido fucoidina,

pero no se descarta atribuir esta actividad a otros principios activos presentes en el alga (descrito

por varios autores).

f.- Extractos de las algas Durvillaea antarctica y Macrocystis pyrifera, no presentan actividad

antifúngica alguna, ante las cepas fúngicas estudiadas.

g.- No es de menor importancia mencionar que, la anatomía del alga puede influir en encontrar

mayor o menor contenido de estos polisacáridos, siendo una alternativa para trabajos futuros.

143

Realizar un estudio acucioso sobre estipes y frondas, ubicación geográfica y período estacional,

son variantes importantes a considerar, en la variación en el contenido de polisacáridos que

contienen estas algas.

h.- Finalmente, puesto que tanto Durvillaea antarctica y Macrocystis pyrifera son recursos marinos

nacionales y aplicables a la dieta humana, sería importante considerar a éstas como terapias no

farmacológicas para aprovechar así, las actividades fisiológicas probadas en este trabajo de

investigación. Aun así, trabajos in vivo serían necesarios para avalar de mejor forma, los resultados

obtenidos en esta oportunidad.

144

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160

ANEXOS.

161

ANEXO 1

ANEXO 1.1. PROTOCOLO BLACK DE EXTRACCIÓN DE LAMINARINA Y

FUCOIDINA.

4x

La laminarina es extraída desde el alga seca de acuerdo a la técnica descrita por Black et

al., el alga fue mezclada con HCl 0,09 M (1:10 p/v) a 4°C durante 2 h. se realizan 4 sucesivas

extracciones y la laminarina contenida en el sobrenadante fue precipitada por adición de etanol.

Alga + HCl (1:10 p:v)

120 min 4°C

Centrifugación

Sobrenadante + Alga

Ajustar pH a 2,5

Centrifugación

Sobrenadante + Etanol

Centrifugación

Precipitado

162

ANEXO 1.2. PROTOCOLO BLACK VARIANTE DE EXTRACCIÓN DE LAMINARINA

Y FUCOIDINA.

4x

La laminarina es extraída desde el alga seca de acuerdo a la técnica descrita por Black et

al., hasta la precipitación con etanol. En este caso el sobrenadante no fue mezclado con etanol,

siendo que neutralizado con NaOH 1M, manteniéndose la laminarina en solución.


120 min 4°C

Centrifugación

Sobrenadante + Alga

Ajustar pH a 2,5

Centrifugación

Sobrenadante

Neutralización con NaOH

Muestra liquida

163

ANEXO 1.3. PROTOCOLO IVIN DE EXTRACCIÓN DE LAMINARINA Y FUCOIDINA.

La laminarina es extraída desde el alga seca de acuerdo a la técnica descrita por Ivin et

al., el alga fue mezclada con H2SO4 0,09 M (1:10 p/v) a 70°C durante 2,5 h. la laminarina contenida

en el sobrenadante fue precipitada por adición de etanol.

Alga + H2SO4 (1:14 p: v)

150 min 70°C

Centrifugación


Centrifugación

Precipitado

164

ANEXO 1.4. PROTOCOLO NUEVO DE EXTRACCIÓN DE LAMINARINA Y

FUCOIDINA.

La laminarina es extraída desde el alga seca de acuerdo a la técnica descrita por Ivin et

al., el alga fue mezclada con HCl 0,09 M (1:10 p/v) a 70°C durante 2,5 h. la laminarina contenida

en el sobrenadante fue precipitada por adición de etanol.


150 min 70°C

Centrifugación


Centrifugación

Precipitado

165

ANEXO 1.5. PROTOCOLO NAKAMURA DE EXTRACCIÓN DE LAMINARINA Y

FUCOIDINA.

4x

Alga marina + HCl 0.1 M (1:2 p/v)

Adición de 2L HCl 0.1 M

Homogeneizado

Agitación por shaker a T° ambiente, durante la noche.

Centrifugación 5000 rpm × 20 min.

Sobrenadante.

Ajuste a pH 7.00 con NaOH 5M

Centrifugación a 3000 rpm.

Sobrenadante.

Precipitado (Laminarina + Fucoidina)

Resuspender con EtOH 85%

Centrifugación a 3000 rpm.

166

ANEXO 1.6 PROTOCOLO NAKAMURA –BLACK DE EXTRACCIÓN DE

LAMINARINA Y FUCOIDINA.

Alga marina + HCl 0.1 N

MODIFICACIÓN 1

(Diluciones reaizadas)

MODIFICACIÓN 2

(Procesos realizados)

Filtración

Centrifugar a 5000 rpm por 20 – 30 min.

Sobrenadante

Ajustar pH 7.00 con NaOH 5N + Alga

5000 rpm por 20 min.

Sobrenadante

Coagulación con EtOH 85% (1:2)

Centrifugación 5000 rpm por 20 – 30 min.

Sobrenadante

MODIFICACIÓN 3

(Recirculaciones)

MODIFICACIÓN 4

(Recirculaciones)

Precipitado (Laminarina y Fucoidina)

167

ANEXO 2.

ANEXO 2.1 ESQUEMA DE RECUENTO DE COLONIAS BACTERIANAS.

Eppendorf + Bacteria ATCC

Caldo Soya Tripticasa (CST) (10ml)

Incubar por 24 h a 30°C

9 m

l P

BS

9 m

l P

BS

9 m

l P

BS

9 m

l P

BS

9 m

l P

BS

1 mL

de

CST

1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

-2 -3 -4 -5 -6

Agar Soya Tripticasa

( 20 – 30 mL)

Incubación 24 h a 30°C

-7 -8 -9 -10 -1

9 m

l P

BS

9 m

l P

BS

9 m

l P

BS

9 m

l P

BS

9 m

l P

BS

1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

100 µL de cada dilución con PBS a placa AST

Recuento de colonias en

Contador de colonias digital.

Ej:

Placa -6: 65 colonias = 6,5 ×10 -7

168

ANEXO 2.2 ENSAYO DE SENSIBILDIAD DE LAS CEPAS DE REFERENCIA FRENTE

A LOS EXTRACTOS DE MACROCYSTIS PYRIFERA Y DURVILLAEA ANTARCTICA.

Eppendorf + Bacteria ATCC

Caldo Soya Tripticasa (CST) (10ml)

Incubar por 24 h a 30°C

9 m

l P

BS

9 m

l P

BS

9 m

l P

BS

9 m

l P

BS

9 m

l P

BS

1 mL

de

CST

1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

5 mL

45 mL

Agar Soya

Tripticasa

semisólido

106 ufc/mL

-1 -2 -3 -4 -5

Agar Soya Tripticasa (20 – 30mL)

-6

Alicuotas de 5 – 7

mL 106 ufc/mL

25 µL cada

muestra +

reposo 1 – 3 h.

Incubación 24 h

a 30°C

169

ANEXO 2.3 PREPARACIÓN DE DILUCIONES DE MUESTRAS DE ESTÁNDARES DE

FUCOIDINA - LAMINARINA Y MUESTRAS DE ENSAYO DE ACTIVIDAD

ANTIBIÓTICA.

1.5

ml

conce

ntr

ado

0.7

5 m

l H

2O

des

t est

éril

0.7

5 m

l H

2O

des

t est

éril

0.7

5 m

l H

2O

des

t est

éril

0.7

5 m

l H

2O

des

t est

éril

Conc

.. 1:1 1:2 1:4 1:8

0.75 mL 0.75 mL

0.75 mL 0.75 mL

170

ANEXO 3

ANEXO 3.1 PROTOCOLO SELECCIONADO DE LA ESTANDARIZACIÓN DEL

MÉTODO DE DNS.

Protocolo consistente en la mezcla de 3 mL del Reactivo DNS, más 3 mL de muestra en

estudio. Incubación a 90°C durante 15 min, enfriar a temperatura ambiente, para luego agregar 1

mL de Tartrato de sodio y potasio al 40%, finalmente medir la absorbancia a 540 nm. Como

muestra se utilizó glucosa a distintas concentraciones. Figura extraída de Díaz, AP (2011).

y = 0,863x - 0,0167R² = 0,9832

Ab

sorb

anci

a (n

m)

Concetración glucosa (mg/mL)

Estandarización DNS

171

ANEXO 4.

ANEXO 4.1. CURVA DE CALIBRACIÓN DE FUCOIDINA.

Se realizó una curva de Calibración con fucoidina estándar a las concentraciones: 0, 40, 80,

120, 160, 200 µg , obteniéndose la siguiente ecuación de la recta: y= 12,477x – 48,564 y un R2=

0,9975. Figura extraída de Díaz, AP (2011).

172

ANEXO 4.2. CURVA DE CALIBRACIÓN DE LAMINARINA.

Se realizó una curva de Calibración con laminarina estándar a las concentraciones: 0, 20, 40,

60, 80, 100 µg , obteniéndose la siguiente ecuación de la recta: y= 10,614x – 11,939 y un R2=

0,9943. Figura extraída de Díaz, AP (2011).

y = 10,614x - 11,939

R2 = 0,9943

0

200

400

600

800

1000

1200

0 20 40 60 80 100 120

Contenido de Laminarina (μg)

Are

a (

mV

s)

173

ANEXO 5

ANEXO 5.1 EC50 PARA EXTRACTO DE MACROCYSTIS PYRIFERA

y = -19,677x + 115,59R² = 0,9955

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6

%D

PP

H r

eman

ente

Concentración extracto Macrocystis pyrifera (MP) mg/ml

EC50 Extracto Macrocystis pyrifera

174

ANEXO 5.2 TEC50 PARA EXTRACTO DE MACROCYSTIS PYRIFERA.

y = -1,1908x + 96,757R² = 0,9961

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50 60 70

%D

PP

H r

eman

ente

Tiempo (min)

TEC50 Extracto Macrocytis pyrifera

175

ANEXO 6

ANEXO 6.1 CURVA DE CALIBRACIÓN TROLOX (TEAC)

y = -0,0008x + 0,0774R² = 0,9902

-0,01

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

anci

a

Concentración (ppm)

Curva de calibración TROLOX

176

ANEXO 6.2 CURVA DE CALIBRACIÓN ÁCIDO ASCÓRBICO (VCEAC)

y = -0,0021x + 0,2565R² = 0,9835

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

anci

a

Concentración (ppm)

Curva de calibración Ácido ascórbico

177

ANEXO 7

ANEXO 7.1 CURVA DE CALIBRACIÓN DE ÁCIDO GÁLICO A 765 nm (MÉTODO DE

FENOLES TOTALES).

y = 0,0008x + 0,0239R² = 0,9866

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

anci

a 7

65

nm

Concentración ácido gálico (ppm)

Curva de calibración ácido gálico 765 nm

fcd542e

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