FACULTAD DE MEDICINA

CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS

EFECTO CONCOMITANTE DEL ÓXIDO NÍTRICO Y EL CIANURO DE SODIO EN EL SENO CAROTÍDEO IN VIVO SOBRE EL REFLEJO HIPERGLUCÉMICO

EN RATAS NORMALES Y DIABÉTICAS

Tesis

Que para obtener el Grado de Doctor en Ciencias Fisiológicas

Presenta:

M. en C. Héctor Rafael Tejeda Chávez

Asesores: Biol. Elena Roces de Álvarez-Buylla

D. en C. Sergio Adrián Montero Cruz

Colima, Col., Enero 2008.

FACULTAD DE MEDICINA

CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS

EFECTO CONCOMITANTE DEL ÓXIDO NÍTRICO Y EL CIANURO DE SODIO EN EL SENO CAROTÍDEO IN VIVO SOBRE EL REFLEJO HIPERGLUCÉMICO

EN RATAS NORMALES Y DIABÉTICAS

Tesis

Que para obtener el Grado de Doctor en Ciencias Fisiológicas

Presenta:

M. C. Héctor Rafael Tejeda Chávez

Asesores: Biol. Elena Roces de Álvarez-Buylla

D. en C. Sergio Adrián Montero Cruz

Colima, Col., Enero 2008.

Este trabajo de tesis fue realizado en el laboratorio de

neuroendocrinología del Centro Universitario de Investigaciones

Biomédicas de la Universidad de Colima, con la beca del Consejo

Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT). Registro: 171469.

DEDICATORIA

Dedico este trabajo:

Especialmente:

A mis Hijos y Esposa.

A mis Padres.

A mis Hermanos y Hermanas.

A mis Sobrinos.

A mis Hermanos Fraternos.

Con cariño y respeto a toda la humanidad que le pueda ser de utilidad este Conocimiento.

“Nuestra recompensa se encuentra en el esfuerzo y no en el resultado. Un esfuerzo total es una victoria completa”.

Mahatma Gandhi

AGRADECIMIENTOS

Expreso mi sincero agradecimiento:

A la Universidad de Colima, en particular al Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas (CUIB), por aceptarme como alumno de su

reconocido programa académico en Ciencias Fisiológicas

Al Dr. Ramón Álvarez-Buylla de Aldana, a quien considero como uno de los

científicos más prominentes que ha tenido la comunidad científica en México, y a

quien debo me haya sembrado la curiosidad de explorar lo desconocido en el

campo del saber científico, cuando aún era un estudiante de medicina.

A la Biol. Elena Roces de Álvarez-Buylla y al Dr. Sergio Adrián Montero Cruz, asesores de este trabajo de Tesis, por abrirme las puertas del laboratorio

de neuroendocrinología y guiarme en el camino de la investigación científica; por

su invaluable ayuda, sus consejos, su apoyo permanente durante el proceso de

mi formación en el doctorado, y muchas otras cosas que quedan grabadas tanto

en mis pensamientos como en mis sentimientos.

Al Dr. Sergio Adrián Montero Cruz, por ser un apreciable amigo y por

compartir conmigo su vasto conocimiento con gran generosidad.

A todos mis Maestros que integran el Cuerpo Académico de este Centro Universitario, que me enseñaron a comprender los diversos mecanismos

implicados en los procesos biológicos estudiados por ellos; muy especialmente a

mis sinodales: Dra. Irene Díaz Reval, Dr. Miguel Huerta Viera, Dra. Xóchitl

Angélica Rosio Trujillo Trujillo y Dr. José Clemente Vásquez Jiménez, que con sus

aportaciones y comentarios han contribuido a enriquecer de manera importante la

estructura de esta Tesis.

Al Dr. Eliseo Portilla de Buen por sus aportaciones y a la Dra. Caridad Áurea Leal Cortés por el apoyo técnico para la cuantificación de los nitritos en la

sangre encefálica.

A todo el personal técnico y administrativo del CUIB, por su apoyo

constante y su amistad.

Al CONACyT por la beca recibida para la realización de mi doctorado, sin

este apoyo me hubiera sido imposible continuar estudiando.

ÍNDICE

Página Índice de tablas y figuras 3

Abreviaturas 6

Resumen 8

Abstract 9

Introducción 10

Antecedentes - La homeostasis de la glucosa y los quimiorreceptores.

- El óxido nítrico y los quimiorreceptores.

- El óxido nítrico y la homeostasis de la glucosa.

- El óxido nítrico en la diabetes.

14

14

26

34

36

Justificación 41

Planteamiento del problema 42

Hipótesis 42

Objetivos - General.

- Específicos.

42

43

Metodología - Animales y técnicas quirúrgicas generales.

- Estimulación de los RSCC.

- Obtención de sangre y procedimientos bioquímicos.

- Determinación de los niveles de glucosa en el plasma.

- Determinación de los niveles de nitritos en el plasma. Método de

Griess.

- Reactivos de Griess

- Fármacos utilizados.

- Ratas diabéticas.

- Protocolo experimental.

44

45

46

47

48

50

50

52

53

2

- Análisis estadístico. 54

Resultados - Control 1. Inyección de sol. sal. por dos ocasiones en el seno

carotídeo aislado circulatoriamente aislado.

- Control 2. Estimulación de los RSCC con NaCN seguida de una

inyección de sol. sal. en el seno carotídeo circulatoriamente aislado.

- Experimental 1. Estimulación de los RSCC con NaCN en el seno

carotídeo circulatoriamente aislado seguida de un inhibidor de la

NOS (L-NAME).

- Experimental 2. Estimulación de los RSCC con NaCN en el seno

carotídeo circulatoriamente aislado seguida de un donador del NO

(NPS).

- Comparación de la retención de glucosa cerebral entre los grupos

control 2 y experimentales 1 y 2.

55

58

61

65

69

Discusión 71

Conclusiones 83

Perspectivas 85

Referencias 86

3

ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS

Página Tabla 1. Protocolo para la determinación de nitritos. 51

Tabla 2. Concentración de glucosa plasmática (mg/dL) en el grupo

control 1.

55

Tabla 3. Retención de glucosa cerebral (mg/dL) en el grupo control

1.

56

Tabla 4. Concentración de nitritos (nmol/mL) en la sangre venosa

cerebral en el grupo control 1.

56

Tabla 5. Concentración de glucosa plasmática (mg/dL) en el grupo

control 2.

59

Tabla 6. Retención de glucosa cerebral (mg/dL) en el grupo control

2.

59

Tabla 7. Concentración de nitritos (nmol/mL) en la sangre venosa

cerebral en el grupo control 2.

61

Tabla 8. Concentración de glucosa plasmática (mg/dL) en el grupo

experimental 1.

63

Tabla 9. Retención de glucosa cerebral (mg/dL) en el grupo

experimental 1.

63

Tabla 10. Concentración de nitritos (nmol/mL) en la sangre venosa

cerebral en el grupo experimental 1.

65

Tabla 11. Concentración de glucosa plasmática (mg/dL) en el grupo

experimental 2.

66

Tabla 12. Retención de glucosa cerebral (mg/dL) en el grupo

experimental 2.

67

Tabla 13. Concentración de nitritos (nmol/mL) en la sangre venosa

cerebral en el grupo experimental 2.

67

Figura 1. Microfotografía de la morfología de las células glómicas en

una rebanada delgada del CC de rata.

20

4

Figura 2. Cambios en la concentración de la glucosa sanguínea y

en la retención de glucosa cerebral en las ratas

anestesiadas.

22

Figura 3. Vías nerviosas desde los receptores del CC al hipotálamo. 23

Figura 4. Velocidad de infusión de glucosa en la vena cava durante

el estado hipoglucémico producido por la insulina (1

mU/k/min) en perros controles con CC intactos (●) y en

perros con extirpación de ambos CC (ο).

24

Figura 5. Respuesta secretora de las células glómicas del CC a

diferentes concentraciones de glucosa en condiciones de

hipoxia y normoxia.

25

Figura 6. Cadena respiratoria (CR) en la mitocondria. 28

Figura 7. Esquema hipotético de un modelo de membrana de las

células del CC sensibles al oxígeno.

31

Figura 8. Síntesis, difusión y esfera de acción del NO en el sistema

nervioso.

33

Figura 9. Secuencia de mediciones del cuerpo carotídeo perfundido

de gato.

35

Figura 10. Expresión de la NOSe y NADPH-Diaforasa en el cuerpo

carotídeo de ratas control en condiciones de normoxia o

hipoxia, y en ratas diabéticas durante la normoxia.

39

Figura 11. Esquema que muestra el procedimiento quirúrgico en la

rata.

46

Figura 12. Concentración de glucosa en el plasma y retención de

glucosa cerebral en las ratas normales (A) y diabéticas (B)

del grupo control 1.

57

Figura 13. Concentración de nitritos en la sangre venosa cerebral en

ratas normales (A) y diabéticas (B) del grupo control 1.

58

Figura 14. Concentración de glucosa en los plasmas arterial y

venoso, y retención de glucosa cerebral en ratas normales

(A) y diabéticas (B) del grupo control 2.

60

5

Figura 15. Concentración de nitritos en la sangre venosa cerebral en

ratas normales (A) y diabéticas (B) del grupo control 2.

62

Figura 16. Concentración de glucosa en los plasmas arterial y

venoso, y retención de glucosa cerebral en las ratas

normales (A) y diabéticas (B) del grupo experimental 1.

64

Figura 17. Concentración de nitritos en la sangre venosa cerebral en

las ratas normales (A) y diabéticas (B) del grupo

experimental 1.

65

Figura 18. Concentración de glucosa en los plasmas arterial y

venoso, y retención de glucosa cerebral en las ratas

normales (A) y diabéticas (B) del grupo experimental 2.

68

Figura 19. Concentración de nitritos en la sangre venosa cerebral en

las ratas normales (A) y diabéticas (B) del grupo

experimental 2.

69

Figura 20. Comparación de las retenciones de glucosa cerebral en

las ratas normales y diabéticas entre los grupos: control 2,

experimental 1 y 2.

70

Figura 21 Esquema hipotético de un modelo de la membrana de las

células del CC sensibles al oxígeno.

74

6

ABREVIATURAS aa Aorta abdominal i.v. intravenosa AC Arteria carótida K+ Ión potasio acc Arteria carótida común LC Locus coeruleus ace Arteria carótida externa LCR Liquido cefalorraquídeo. Aci ACh

Arteria carótida interna Acetilcolina

L-NAME N-nitro-L-arginina metil éster

ADN Ácido desoxiribonucleíco L-NMMA N-monometil-L-arginina ADP Difosfato de adenosina m Metros af Arteria femoral. ME Membrana externa al Arteria lingual. mg Miligramos ATP Trifosfato de adenosina MI Membrana interna Ca2+ Ión calcio. min Minuto CC Cuerpo carotídeo mL Mililitro Cit-c Citocromo oxidasa c mM Milimolar CO2 Bióxido de carbono mmHg Milímetros de mercurio CP Carótida primitiva mmol Milimol CR Cadena respiratoria mU Miliunidades Cu Cobre Na+ Ión sodio dL Decilitro. NaCN Cianuro de sodio D. O. Densidad óptica NAD Nicotinamida-adenina

dinucleótido EDTA Ácido etilen diamino

tetraacético NADH Nicotinamida-adenina

dinucleótido reducido E.E. Error estándar NaOH Hidróxido de sodio EIM Espacio intermembranal

mitocondrial NED N-1-nafiletilendiamina

FAD Dinucleótido flavina adenina NH4Cl Cloruro de amonio FADH Dinucliótido flavina adenina

reducido Nm

Nmol Nanómetros Nanomol

fC Femtocoulombio NO Óxido nítrico g Gramo NO2 Nitritos GCS Ganglio cervical superior NOS Sintasa de óxido nítrico GLUT Proteína transportadora de

glucosa NOSe Sintasa de óxido nítrico

endotelial GMPc Guanosin monofasfato

cíclico. NOSi Sintasa de óxido nítrico

inducible GP Ganglio petroso NOSmt Sintasa de óxido nítrico

mitocondrial H+ Ión hidrógeno NOSn Sintasa de óxido nítrico

neuronal i.p. Intraperitoneal NPS Nitroprusiato de sodio NPV Núcleo paraventricular SCA Seno carotídeo aislado

7

NSC Nervio del seno carotídeo SH Sulfhidrilo NSO Núcleo supraóptico SNC Sistema nervioso central NTS Núcleo del tracto solitario STZ Estreptozotocina O2 Oxígeno SY Seno yugular OONO- Peroxinitrito t tiempo p Probabilidad V3 Tercer ventrículo pCO2 Presión parcial de bióxido

de carbono V4 Cuarto ventrículo

pO2 Presión parcial de oxígeno µL Microlitro RCC Receptores del cuerpo

carotídeo µmol Micromol

rpm Revoluciones por minuto µm Micrómetros RSCC Receptores del seno cuerpo

carotídeo ∆ψ Potencial de membrana

mitocondrial sec Segundos ∆pH Gradiente electroquímico SC Seno carotídeo

8

RESUMEN

Se ha postulado la existencia de glucorreceptores en diversos sitios del

organismo, particularmente en el SNC, y en los cuerpos carotídeos (CC). El óxido

nítrico (NO) modula la descarga quimiosensora en los receptores seno-cuerpo

carotídeos (RSCC) inhibiendo en forma reversible el consumo de O2 y bloqueando la

citocromo-c oxidasa (cit-c) mitocondrial. Se sabe que los desórdenes metabólicos

observados en la diabetes reducen la utilización de glucosa, afectando la actividad

neuronal y la respuesta a la hipoxia. En esta tesis, se analiza el efecto concomitante

del NO y el cianuro de sodio (NaCN) en el seno carotídeo vascularmente aislado in

vivo (SCA), sobre la respuesta hiperglucemiante con retención de glucosa por el

cerebro en ratas normales y diabéticas. Los experimentos se realizaron en ratas

Sprague-Dawley macho de 250 a 300 g de peso, anestesiadas con pentobarbital

sódico, según el siguiente protocolo: a) control 1, infusión simultánea de solución

salina (sol.sal.) en el SCA; b) control 2, infusión de NaCN y sol.sal. en el SCA; c)

experimental 1: infusión de NaCN y L-NAME (N-nitro-L-arginina metil éster), un

inhibidor de la NOS (sintasa de óxido nítrico), en el SCA; d) experimental 2: infusión

de NaCN y NPS (nitroprusiato de sodio), donador de NO, en el SCA. Se valoraron

los niveles de glucosa y de nitritos en la sangre venosa cerebral. En el experimental

2 el NO reforzó el estímulo anóxico, e incrementó la glucosa arterial con retención de

glucosa cerebral (reflejo hiperglucémico), así como los niveles de nitritos en el SNC.

En las ratas diabéticas, el NO falló para incrementar el reflejo hiperglucémico descrito

pero sí aumentó los niveles de nitritos. El L-NAME y el NPS mostraron efectos

opuestos sobre las variables estudiadas. El primero redujo la retención de glucosa

cerebral y los niveles de nitritos, mientras que el segundo los incrementó, tanto en

ratas normales como diabéticas. Las ratas diabéticas siempre mostraron niveles

inferiores de nitritos en comparación con las ratas normales, antes y después de la

estimulación RSCC. Se concluye que el NO, igual que el NaCN, inhibe la cadena

respiratoria mitocondrial y aumenta el reflejo hiperglucémico únicamente en las ratas

normales.

9

ABSTRACT

It has been postulated the existence of glucoreceptors in various sites of the

organism, particularly in the CNS and in the carotid bodies (CBs). Chemoreceptors of

the CBs (RSCC) have been found to increase afferent nerve activity to regulate

respiratory performance during hypoxia or hypoglycemia, causing glucose retention

by the brain. In the CBs, nitric oxide (NO) modulates chemosensory responses,

inhibiting the mitochondrial cytochrome c oxidase and oxygen consumption. The

metabolic disorders observed in diabetes mellitus are known to reduce glucose

utilization, affecting neuronal activity and the hypoxic sensitivity. The aim of this

thesis was to study the concomitant effects of NO and cyanide (NaCN), infused into

the carotid sinus temporarily isolated from the systemic circulation in vivo (SCA), on:

glucose retention by the brain and on nitrite levels in brain blood in normal and

diabetic rats. The experiments were carried out in male Sprague-Dawley rats

weighing 250-300 g, anesthetized with sodium pentobarbital, according to the

following protocol: a) control 1, saline was injected into the SCA; b) control 2, saline.

and NaCN injections were made into the SCA; c) experimental 1, NaCN and N-nitro-

L-arginine methyl éster (L-NAME- NO-synthase inhibitor) injections were made into

the SCA; d) experimental 2, NaCN and sodium nitroprusside (NPS- NO donor)

injections into the SCA. Glucose retention by the brain and nitrites in CNS blood

were assayed. In control 2 experiments, NO improves RSCC effect, increasing

arterial glucose levels and glucose retention by the brain (hyperglycemic reflex), as

well as nitrite levels in CNS. Opposite effects were obtained on the variables studied

when L-NAME or NPS were applied before NaCN infusion. In the first case, a

significant reduction in glucose retention by the brain and in nitrite levels in cerebral

blood were observed; while in the second, the values significantly increased, both, in

normal and diabetic rats. Before RSCC stimulation was performed or afterwards,

diabetic rats always showed lower nitrite levels in relation to normal rats. It is

concluded that NO, as NaCN, inhibits respiratory chain in the mitochondria, to

increase the hyperglycemic reflex only in normal rats.

10

INTRODUCCIÓN

La glucosa es un substrato esencial para el metabolismo celular, y en forma

especial para las células del sistema nervioso central (SNC), cuya actividad depende

de la disponibilidad de este carbohidrato. En los mamíferos, la neurotransmisión y en

general todas las funciones cerebrales, demandan un suministro continuo de energía

de substratos metabólicos (glucosa) que mantienen, entre otros, el potencial de

membrana. En efecto, los cambios en la utilización de la glucosa cerebral

constituyen un índice de la actividad neuronal. La barrera hemato-encefálica

condiciona el paso de substratos energéticos al cerebro, y en particular de la glucosa

(Lund-Andersen, 1979), por lo que es importante conocer los mecanismos y factores

precisos que regulan dicho transporte (Fray, Forsyth, Boutelle y Fillenz, 1996);

aunque sabemos que en el SNC las proteínas transportadoras de glucosa (GLUT 1 y

GLUT 3 principalmente) juegan un papel importante en este proceso.

La homeostasis de la glucosa se regula dentro de márgenes estrechos, tanto

por mecanismos nerviosos (Álvarez-Buylla y Carrasco-Zanini, 1960; Niijima, 1982;

Frizzell, Jones, Davis, Biggers, Myers, Connolly, Neal, Jaspan, Cherrington, 1993;

Burcelín, Dolci y Thorens, 2000; García, Millán, Balmaceda-Aguilera, Castro, Pastor,

Montecinos, Reinicke, Zuniga, Vera, Onate, Nualart, 2003; Uyama, Geerts y

Reynaert, 2004), como hormonales (Frohman, 1983; Heimberg, De Vos, Moens,

Quartier, Bouwers, Pipeleers, Van Schaftingen, Madsen y Schuit, 1996; Álvarez-

Buylla, Álvarez-Buylla, Mendoza, Montero y Álvarez-Buylla, 1997). La detección de

estados de hiper o hipoglucemia constituye el primer paso de dicha regulación, y

estas alteraciones en el nivel glucémico se acompañan, entonces, por reacciones

compensadoras (contrarregulación) que tienen por objeto regresar los niveles de

glucosa en la sangre a las concentraciones fisiológicas. Los desórdenes metabólicos

que alteran el suministro o la utilización de la glucosa, pueden afectar la actividad

neuronal, como ocurre en la diabetes mellitus tipo 1 (insulino-dependiente). Es de

esperar que existan sensores a la glucosa en distintas regiones del organismo

11

(Hevener, Bergman y Donovan, 2000) y particularmente en el SNC (Levin, Dun-

Meynell y Routh 1999; Penicaud, Leloup, Lorsignol, Alquier y Guillaod, 2002). El

papel fisiológico que juegan las distintas regiones glucosensibles no está bien

definido, y ninguna de ellas por sí sola, puede explicar las respuestas de

contrarregulación a la hiper o hipoglucemia (Koyama, Coker, Stone, Lacy, Jabbour,

Williams y Wasserman, 2000). Álvarez-Buylla y colaboradores demuestran la

participación del SNC en la homeostasis de la glucosa (Álvarez-Buylla, 1960;

Álvarez-Buylla, Segura y de Álvarez-Buylla, 1961a; 1961b; Goldraij y Álvarez-Buylla,

1971; Álvarez-Buylla, 1973; Álvarez-Buylla y de Álvarez-Buylla, 1975; Álvarez-Buylla

y Bencosme, 1981; Álvarez-Buylla, Rojas, de Álvarez-Buylla y Faria, 1986; Guarner y

Álvarez-Buylla, 1991; Álvarez-Buylla, Huberman, Montero, Lemus, Valles, de

Álvarez-Buylla, 2003). Aunque el hígado, la vena porta y el páncreas ejercen un

control periférico para mantener estables los niveles de glucosa en la sangre, los

cuerpos carotídeos (CC) que ocupan una posición estratégica en el inicio de la

circulación cerebral, así como sus características fisiológicas únicas, como son: una

rica vascularización (flujo sanguíneo de 2000 mL/min/100 g de tejido) y una tasa

metabólica muy elevada, llevaron al Dr. Ramón Álvarez-Buylla a postular su

participación en esta función vital para el organismo a nivel central. Las neuronas de

los CC son particularmente vulnerables a la falta simultánea de oxígeno y glucosa,

por lo que tendrían una función de especial importancia en la homeostasis cerebral

(Álvarez-Buylla y de Álvarez-Buylla, 1988, Álvarez-Buylla y Roces de Álvarez-Buylla,

1994). Durante la hipoxia crónica se presenta una reacción homeostática de

adaptación que tiende a compensar la hipoxia con hiperventilación (Álvarez-Buylla,

1951; Eyzaguirre y Zapata, 1984) e hiperglucemia (Álvarez-Buylla y Álvarez-Buylla,

1988, 1994). Este proceso homeostático compromete tanto a componentes

periféricos como centrales.

Experimentos posteriores in vitro, comprueban que los CC detectan cambios en

la glucemia del medio de cultivo (Pardal y López-Barneo, 2002). En el mismo

sentido, Koyama y col. en el 2000 plantean que los CC juegan un papel importante

en la respuesta contrarregulatoria después de una hipoglucemia insulínica ligera en

12

perros. Los receptores del seno-cuerpo carotídeo (RSCC) generan señales

quimiorreceptoras (Álvarez-Buylla, 1951, 1952; Eyzaguirre y Zapata, 1984) que

viajan por el nervio del seno carotídeo (NSC) hasta el ganglio cervical superior, rama

del nervio glosofaríngeo (IX par), para hacer su primer relevo en el núcleo del tracto

solitario (NTS) y mandar las proyecciones a centros superiores como el hipotálamo

(Ricardo y Koh, 1978; Housley, Martin-Body, Dawson y Sinclair, 1987; Finley y Katz,

1992). Se desconocen aún los mecanismos de la quimiotransducción en el CC, así

como los blancos precisos en las vías aferentes y efectoras de la regulación

glucémica.

El óxido nítrico (NO), que se sintetiza a partir de la L-arginina por la sintasa de

NO (NOS), es un mensajero biológico en el SNC y otros tejidos, que participa en

funciones fisiológicas con implicaciones homeostáticas (Wu y Morris, 1998). El NO

interviene en el transporte de glucosa en el músculo esquelético y durante el ejercicio

crónico se estimula la expresión de la NOS (Roberts, Barnard, Scheck y Balon,

1997). En experimentos in vitro el NO modula, también, la descarga quimiosensora

en el CC (Di Giulio, Grilli, De Lutiis, Di Natale, Sabatino y Felaco, 1998; Prabhakar,

Fields, Baker y Fletcher, 2001). Los inhibidores de la NOS incrementan la actividad

en el nervio del seno carotídeo en forma dosis-dependiente (Buerk y Lahiri, 2000).

Es decir, el NO en el CC actuaría mimetizando la respuesta al oxígeno e inhibiendo

la actividad quimiosensora. Sin embargo, algunos autores encuentran un papel

excitatorio del NO cuando el CC está en estado de normoxia, aumentando la

descarga quimiosensitiva; efecto mediado probablemente por una alteración en el

transporte de electrones y la fosforilación oxidativa en la cadena respiratoria (CR)

mitocondrial (Iturriaga, 2001). Se sabe que la mitocondria contiene una isoforma de

la NOS (probablemente, variante de la NOSn) denominada NOSm, capaz de

estimular la producción NO, en cantidad suficiente para regular su propia respiración

(Ghafourifar y Richter, 1997; Giulivi, Poderoso, Boveris, 1998; Iturriaga 2001).

La diabetes representa una serie de alteraciones de los mecanismos

homeostáticos de los niveles de glucosa en la sangre con alteración en la respuesta

13

ventilatoria a la hipoxia e hipercapnia. La insulina que es la hormona más importante

en el transporte de la glucosa a nivel periférico, participa también en la vasodilatación

y en la liberación del NO (Felaco, Grilli, De Lutiis, Patruno, Libertini, Taccardi, Di

Napoli, Di Giulio, Barbacane y Conti, 2001); es decir, la diabetes tiene semejanzas

con los estados de hipoxia crónica, pero existen controversias sobre la influencia de

la diabetes (hiperglucemia) en los niveles de NO en la sangre sistémica y en el SNC

(Kino, Yamato, Aomine, 2004). Con estos antecedentes se pensó que las ratas

diabéticas podrían representar un modelo que permitiera ahondar en el estudio de

las vías quimiorreceptoras del CC y la participación del NO en la homeostasis de la

glucosa.

En esta tesis de doctorado, se analiza el efecto concomitante del NO y el

cianuro de sodio (NaCN) en el seno carotídeo vascularmente aislado in vivo, en la

respuesta hiperglucemiante con retención de glucosa por el cerebro en ratas

normales y diabéticas.

14

ANTECEDENTES

Homeostasis de la glucosa y los quimiorreceptores

La homeostasis de la glucosa en los mamíferos; es decir, su regulación en el

medio interno, es un proceso controlado por múltiples factores. El organismo de los

mamíferos ha desarrollado mecanismos que mantienen las concentraciones de

glucosa dentro de márgenes estrechos, con sistemas sofisticados capaces de iniciar

reacciones compensadoras (contrarregulación) ante las desviaciones fisiológicas

(Koyama y col., 2000; La Fleur, 2003). Dentro de estas fronteras bioquímicas, está

presente un ritmo diario de las concentraciones de glucosa en el plasma, relacionado

con un reloj biológico localizado en estructuras superiores como el núcleo

supraquiasmático (La Fleur, 2003; Sankaran y Subramanian, 2006). El cerebro es un

órgano especialmente vulnerable y depende de un suministro eficiente de glucosa y

otros substratos energéticos desde la sangre (Almeida, Cidad, Delgado-Esteban,

Fernández, García-Nogales y Bolaños, 2005); la neurotransmisión, y el resto de las

funciones encefálicas, requieren un suministro constante de substratos metabólicos

capaces de mantener activo el potencial de membrana en los axones (Hawkins,

1989), por lo que, los cambios en la utilización de glucosa cerebral constituyen un

índice de la actividad neuronal (Sokoloff, 1977). Durante el desarrollo postnatal

temprano, el cerebro requiere, también, grandes cantidades de substratos

energéticos para apoyar el crecimiento de la neuroglia y otros tejidos; en este periodo

crítico se consume más de la mitad de la totalidad energética disponible para todo el

organismo tanto en el humano como en la rata (Gibbons, 1998). Y aquí surge la

pregunta de cómo es posible que el cerebro, adulto o en formación, compita con

tanto éxito por las fuentes energéticas. Este trabajo va dirigido a contestar, en parte,

esta incógnita.

Diversas estructuras, especializadas en detectar cambios en los niveles de

glucosa, participan en el control de la homeostasis energética y en las funciones

15

neuroendocrinas. Se han encontrado sensores a la glucosa en el páncreas

(Heimberg y col., 1996; Hatakeyama, Kishimoto, Nemoto, Kasai y Takahashi, 2006),

en el hígado (Adachi, Kobashi y Funahashi, 1995), en el SNC (Levin, 2002; Pocai,

Obici. Schwartz y Rosetti, 2005), en la vena porta (Donovan, Halter y Bergman, 1991;

Hevener y col., 2000) y en los CC (Álvarez-Buylla y de Álvarez-Buylla, 1988; Koyama

y col., 2000; Pardal y López Barneo, 2002). Las células glucosa-excitables se

despolarizan para aumentar su frecuencia de descarga cuando suben los niveles de

glucosa, y por el contrario, se hiperpolarizan disminuyendo su frecuencia de

descarga cuando disminuyen los niveles de glucosa; concurrentemente, la

concentración de K+ baja durante la hiperglucemia y sube durante la hipoglucemia.

Estos receptores se regulan por medio de una combinación de glucocinasa y

apertura o cierre de los canales de K+ sensibles a trifosfato de adenosina (ATP)

(KATP) derivado del metabolismo de la propia glucosa, aunque en los CC no se han

encontrado canales KATP. Cuando los niveles de glucosa bajan en forma crítica, este

carbohidrato adquiere la primacía para estimular a los detectores de glucosa, con

objeto de activar los mecanismos contrarreguladores que restauran el suministro vital

de este substrato (Levin, 2002). El glucógeno, cuyas concentraciones en el cerebro

son pequeñas (2-3 µmol/g en la rata), se encuentra principalmente en los astrocitos,

en contacto con los capilares sanguíneos (Kacem, Lacombe, Seylaz, Bonvento,

1998) y los espacios sinápticos (Grosche, Matyash, Moller, Verkhratsky,

Reichenbach, Kettenmann, 1999) por lo que son las primeras células del SNC en

captar la glucosa. Este hecho aunado a la característica de que el glucógeno no está

supeditado al ATP para iniciar su metabolismo (Clarke y Sokoloff, 1998), convierte al

glucógeno astrocitario en la reserva energética cerebral más importante para el

metabolismo del SNC. El conocimiento de los factores que regulan la utilización de

la glucosa en los astrocitos es relevante para entender el metabolismo energético

neuronal. Como ocurre con la glucosa, los niveles de glucógeno en el cerebro

cambian ante las variaciones de las concentraciones de glucosa plasmática, así

como durante las maniobras experimentales (Goldberg y O’Toole, 1969; Dienel y

Cruz, 2006). El papel del glucógeno no sólo está supeditado a ser una reserva de

16

carbohidratos durante la hipoglucemia, sino también bajo condiciones de equilibrio,

por lo que su degradación y síntesis son continuas.

A diferencia de otros tejidos, que tienen la capacidad de utilizar nutrientes

energéticos diversos para su metabolismo celular, el cerebro; es decir, las neuronas

en su estado normal, dependen casi exclusivamente de la glucosa como substrato

oxidativo, por lo que las únicas diferencias arterio-venosas positivas encontradas en

el cerebro humano, son para la glucosa y el oxígeno. La glucosa, en su metabolismo

oxidativo, utiliza casi la totalidad del consumo del oxígeno cerebral para proporcionar

una energía equivalente a 0.25 kcal/min (Sokoloff, 1960). La glucopenia o hipoxemia

cerebral evocan, en pocos segundos, una disminución de la actividad

electroencefalográfica con pérdida de la conciencia. La hipoxia o hipoglucemia

focales también producen cambios neuronales severos, con alteración de la

homeostasis iónica y la liberación anormal de neurotransmisores (Prabhakar y

Jacono, 2005; Levin, 2002). El único substrato capaz de substituir a la glucosa en

casos de una hipoglucemia severa, es la manosa, pero su efecto para restaurar las

funciones cerebrales tiene lugar a través de mecanismos que elevan los niveles de

glucosa en la sangre (Sloviter y Kamimoto, 1970). En los procesos de adaptación a

la hipoxia, generalmente aumenta la utilización de glucosa por vías que no involucran

el metabolismo aeróbico mitocondrial. Este fenómeno depende de la sobre-

expresión de los transportadores de la glucosa y de las enzimas glucolíticas (Beitner-

Johnson, Leibold y Millhorn, 1998). Aunque la insulina es un factor primordial para

aumentar la utilización de los sustratos energéticos en los tejidos periféricos, su

participación en la regulación del metabolismo cerebral es dudosa (Baskin, Figlewicz,

Woods, Porte y Dorsa, 1987; Hasselbach, Knudsen, Videbaek, Pinborg, Schmidt,

Holm y Paulson, 1999; Cheng, Reinhardt, Lee, Joncas, Patel y Bondy, 2000); se llega

a esta conclusión por el hecho de que tanto la cantidad de insulina sintetizada en el

cerebro, como la insulina circulante que cruza la barrera hematoencefálica, son muy

pequeñas (Coker, Studelska, Harmon, Burke y O’Malley, 1990; Reinhardt y Bondy,

1994). Aunque la barrera hematoencefálica condiciona el paso de los substratos

energéticos al cerebro, en particular de la glucosa (Lund-Andersen, 1979),

17

desconocemos en forma detallada los mecanismos y factores que regulan dicho

transporte (Fray y col., 1996). El paso a través de las membranas biológicas se lleva

a cabo por proteínas de membrana específicas, que en los mamíferos son

principalmente de dos clases, cotransportadoras Na+/glucosa y facilitadoras del

transporte de glucosa (GLUT) (Mueckler, 1994; Gould y Holman, 1993; Ibberson,

Uldry y Thorens, 1999). La glucosa atraviesa la barrera hematoencefálica por las

proteínas GLUT 1 y GLUT 3, aunque en los últimos años se han descubierto algunas

otras que también participan en el transporte de este carbohidrato (Ngarmukos,

Bauer y Kumagai, 2001; Komori, Morikawa, Tamura, Doi, Nanjo y Senba, 2005). Las

GLUT se encuentran en mayor proporción en el endotelio de los capilares cerebrales

y son capaces de transportar dos a tres veces más glucosa que la que normalmente

metaboliza el cerebro; actúan en forma estereoespecífica y son insulina-

independientes (Kalaria, Gravina, Schmidley, Perry y Harik, 1988). Los trastornos

metabólicos que alteran la expresión de estas proteínas, y por lo tanto, el suministro

de glucosa o su utilización por el SNC afectan significativamente la actividad

neuronal, como ocurre en el retardo mental, las convulsiones y la diabetes tipo 1 o

insulino-dependiente.

Canonn, Newton, Bright, Menkin y Moore (1929) encontraron la primera

evidencia de la participación del sistema nervioso simpático en la regulación de la

glucemia; demostraron que la secreción de insulina por hipoglucemia sistémica

produce un aumento de la actividad simpática, con la presencia de una glucopenia

local en el sistema nervioso autónomo. Estas investigaciones tienen el antecedente

de los trabajos de Claudio Bernard, que demuestran alteraciones en el metabolismo

de la glucosa después de producir lesiones en distintos puntos del SNC (Bernard,

1857). En años posteriores, utilizando microinyecciones de glucosa en el cerebro, se

propuso la existencia de “glucorreceptores” en el SNC, principalmente en el

hipotálamo ventromedial y lateral (Marshall y Mayer, 1956; Shimazu, 1981; Oomura,

1984; Levin, 2002). Estos últimos experimentos llevaron al concepto de que el

cerebro, por sí mismo, es un “detector” de la glucemia ambiental, y es capaz de

poner en marcha los mecanismos glucorreguladores necesarios ante variaciones no

18

fisiológicas. Muchos de los trabajos que involucran al SNC en la detección

glucémica se basan en experimentos que alteran el comportamiento normal, como es

el caso de las lesiones cerebrales, la estimulación eléctrica o la administración

directa en el SNC de análogos de la glucosa o de la glucosa misma (Benzo, 1982;

Cane, Artal y Bergman, 1986). En realidad estos procedimientos no proporcionan

una idea clara del papel que juega el cerebro para detectar de manera cuantitativa

los cambios en la glucemia y, lo que es más importante, para cuantificar los procesos

glucorregulatorios ante una hipoglucemia in vivo.

Lo descrito hasta ahora, indica que una disminución y/o un incremento de los

niveles de glucosa en el plasma inicia una respuesta neuroendocrina compleja que

corrige los cambios y preserva la función cerebral (Auer, 1986; Martin, Lloyd y

Cowan, 1994), pero desconocemos como y donde se detectan estos cambios en los

niveles de glucosa (Cane et al, 1986; Álvarez-Buylla y de Álvarez-Buylla, 1988;

Koyama y col., 2000). Álvarez-Buylla y col. proponen un nuevo papel para las

células del CC (células tipo I o glómicas) como “glucosa-detectoras”, y consideran

que los quimio-barorreceptores carotídeos intervienen en la integración de la

información de las dos variables más importantes para el metabolismo cerebral,

glucosa y oxígeno en experimentos in vivo (Álvarez-Buylla y de Álvarez-Buylla, 1988,

Álvarez-Buylla y Roces de Álvarez-Buylla, 1994; Álvarez-Buylla y col., 1997).

Los quimiorreceptores carotídeos localizados en los CC, son pequeños órganos

situados de forma bilateral en la bifurcación de ambas carótidas primitivas, y ayudan

a mantener la composición química de la sangre controlando la ventilación (Nurse,

2005). Su situación estratégica en la entrada del árbol arterial central los convierte

en estructuras ideales para llevar a cabo la retroalimentación mencionada, su rica

vascularización e inervación les permite detectar cambios mínimos en las variables

metabólicas (De Castro, 1928). Los receptores carotídeos, cuyos cuerpos

neuronales se encuentran en el ganglio petroso (McDonnald y Mitchell, 1981)

mandan su información sensora a través del nervio del seno carotídeo (NSC), rama

del nervio glosofaríngeo (González, Almara, Obeso, Rigual, 1994). Durante los

19

últimos años se han realizado intensas investigaciones para estudiar los mecanismos

de transducción por medio de los cuales los CC son capaces de percibir los cambios

en la pO2, pCO2 y pH; así como los mecanismos que se encargan de traducir el

potencial de receptor en un incremento de las descargas aferentes. Dichos estudios

llegan a la conclusión que las células quimiorreceptoras propiamente dichas, para

todos los estímulos, son las células tipo I o células glómicas (López-Barneo, Ortega-

Saenz, Piruat, García-Fernández, 2006; López-Barneo, Del Toro, Levitsky, Chiara,

Ortega-Sáenz, 2004; Nurse, 2005). Las células glómicas se encuentran formando

cúmulos, donde se realizan las sinapsis químicas y eléctricas en forma recíproca.

Estas células están en estrecha relación con las células tipo II, sustentaculares (glia-

semejantes) (McDonald y Mitchell, 1975) inervadas por fibras aferentes que se

activan ante los estados de hipoxia o hipercapnia, liberando dopamina y otros

transmisores como acetilcolina (ACh) y ATP (Acker y Starlinger, 1984; Fitzgerald,

Shirahata, Chang y Balbir, 2000; López Barneo, Pardal y Ortega Sáenz, 2001; Nurse,

2005) para estimular las fibras sensitivas aferentes (Ortega-Sáenz, Pardal,

Castellano, López Barneo, 2000) (Figura 1). Este tipo de células neurosecretoras

también se encuentran en el pulmón y en las células cromafines de las glándulas

adrenales, donde detectan cambios en la pO2, liberando catecolaminas ante la caída

de la pO2 (Wyatt y Peers, 1995; Zinker, Namdaran, Wilson, Lacy y Wasserman,

1994). El consumo de O2 del CC es de 1.3 mL/100 g -1/min (González y col., 1994),

esto daría una cantidad de ATP de 3.5 mmol kg -1 min -1, y la utilización de glucosa

del CC in vitro es aproximadamente de 120 µmol kg -1 min -1. Aunque sólo el 20 %

del CC está formado por células glómicas, éstas utilizan el 90 % de la glucosa. Por

lo tanto la producción de ATP por el metabolismo oxidativo en las células tipo 1 del

CC estaría en el rango de de 2.6 mmol kg -1 min-1. Los CC están formados por un

tejido neuroepitelial, con características similares a las glándulas endocrinas, que

posee mecanismos para detectar cambios en los niveles de oxígeno (Lawson, 1980;

Paulding, Schnell, Bauer, Striet, Nash, Kuznetsova, Czyzyk-Krzeska, 2002), pero

desconocemos los mecanismos precisos de la quimiotransducción (Bianchi, Cacchio,

Artese, Ferrero, Rapi, Grilli, Felaco, Di Giulio, 2003). Se sabe que las células tipo I

dopaminérgicas en los CC son las transductoras del estímulo hipóxico que en sus

20

vias de señalización comprenden el cierre de canales de K+ de distintos tipos,

facilitando la despolarización de la membrana, con entrada de Ca2+ extracelular y

liberación del neurotransmisor (Prabhakar, 2000). Durante la hipoxia o durante la

hipercapnia, se observa una co-liberación de ACh y ATP en cultivos de largo plazo

de células de CC tanto en las células tipo I como en las tipo II (Nurse y Fearon,

2002). Estos experimentos demuestran la existencia de mecanismos autocrinos y

paracrinos interactuando en el CC para liberar los distintos transmisores (Fearon y

col., 2001). La utilización de este tipo de cultivos ayuda a resolver controversias

sobre la biología del desarrollo, la fisiología y la bioquímica de las células

quimiorreceptores, así como su respuesta a la hipoxia

Figura 1. Microfotografía de las células glómicas en una rebanada delgada del CC de rata. (A) Pocas horas después del corte; baja resolución. (B) Agregados de células glómicas (glomérulos). Las células individuales pueden verse claramente (flecha). (C) Rebanada del CC teñida con anticuerpos anti-tirosina hidroxilasa. Note la apariencia típica de las células del glomus con núcleo grande y organización en glomérulos. Modificado de Pardal, Ludewig, García-Hirschfeld y López-Barneo y Pardal, 2000.

Citando al Dr. Álvarez-Buylla “las zonas reflexogénicas, cardioaórtica y

senocarotídea, ocupan posiciones estratégicas, en la iniciación de las circulaciones

21

sistémica y cerebral. Los baro y quimiorreceptores del seno-cuerpo carotídeo

proporcionan al cerebro la información sancional sobre diversas variables

fisiológicas, como son la presión arterial, los niveles de O2, de CO2, de pH y de

osmolaridad (Álvarez-Buylla, 1951, 1952; Eyzaguirre y Zapata, 1984) y también, de

los niveles de glucosa “ (Álvarez-Buylla y de Álvarez-Buylla, 1988; Álvarez-Buylla y

Roces de Álvarez-Buylla, 1994; Koyama y col., 2000; Pardal y López Barneo, 2002).

En efecto, en preparaciones de CC in vivo aislados de las circulaciones sistémica y

cerebral, en ratas anestesiadas con pentobarbital, la perfusión del seno carotídeo

con sangre cuyas concentraciones de glucosa son bajas (2.7 mM), aumenta la

glucosa en la sangre arterial (reflejo hiperglucémico), así como la captación de

glucosa cerebral; por el contrario, la perfusión del seno carotídeo con sangre rica en

glucosa (16.7 mM), no aumenta de forma significativa la glucosa arterial, pero si

disminuye significativamente la captación de glucosa cerebral y como consecuencia

aumenta la concentración de glucosa venosa (Álvarez-Buylla y col., 1988) (Fig. 2).

La estimulación baro-quimiorreceptora por oclusión de la carótida primitiva

(hipoxia) también produce un reflejo hiperglucémico, que no desaparece después de

la denervación de las fibras barorreceptoras ipsi- y contralaterales de los senos

carotídeos. En estos experimentos aumenta la concentración de glucosa en la vena

suprahepática indicando que el hígado participa en el mecanismo efector del reflejo

hiperglucémico (Álvarez-Buylla y col., 1997). Las vías efectoras de los reflejos

descritos no están bien aclaradas pero se sabe que participan la hipófisis, las

adrenales (Álvarez-Buylla y col., 1997) y la vasopresina (Montero, Yarkov, Álvarez-

Buylla, 2000; Yarkov, Montero, Lemus, Roces de Álvarez-Buylla y Álvarez-Buylla,

2001; Montero, Yarkov, Lemus, Mendoza, Valles, de Álvarez-Buylla y Álvarez-Buylla,

2003).

El CC madura después del nacimiento adquiriendo características funcionales y

estructurales en respuesta a los cambios ambientales; es decir, a los cambios en la

22

Figura 2. Cambios en la concentración de la glucosa sanguínea y en la retención de glucosa cerebral en ratas anestesiadas con perfusión de sangre rica o pobre en glucosa en el seno carotídeo circulatoriamente aislado. La perfusión de sangre con alta glucosa, provoca una disminución en la retención de glucosa cerebral (panel superior). Por el contrario, cuando se perfunde el seno carotídeo con sangre pobre en glucosa, se observa un aumento en las glucemias arterial y venosa, así como en la retención de glucosa cerebral (panel inferior). Tomado de: Álvarez-Buylla y de Álvarez-Buylla, 1988.

pO2, y probablemente, a los niveles de glucosa en la circulación local (Calder, Kumar

y Hanson, 1997; Fitzgerald, Shirahata, Chang, Balbir, 2006). Las poblaciones que

viven en localidades cuya altitud es mayor de 3000 m sobre el nivel del mar,

proporcionan un modelo experimental útil para estudiar los procesos de adaptación y

homeostasis de la glucosa ante este tipo de estrés a la hipoxia crónica (Sarkar,

Banerjee, Selvamurthy, 2003; Wilson, Roy y Lahiri, 2005). En estas condiciones, los

CC adquieren características especiales que se deben a las alteraciones en la

expresión genética de las proteínas encargadas de regular el crecimiento de las

células del glomus, fenómeno que depende de la sobre-regulación de las proteínas

23

GLUT y de las enzimas que participan en la degradación de la glucosa (Bunn y

Poyton, 1996; Behrooz y Ismail-Beigi, 1999; Semenza, 1999).

La información aferente proveniente de los quimiorreceptores del CC viaja por el

NSC y por el nervio glosofaríngeo hasta la médula dorso-medial en el núcleo del

tracto solitario (NTS) como primer relevo, aunque algunas de las fibras terminan en el

área postrema y en el núcleo del trigémino, para dirigirse después al hipotálamo

(Figura 3) (Cottle, 1964; Ricardo y Koh, 1978; Ciriello, Hrycyshyn y Calaresu, 1981;

Housley y col., 1987; Jordan y Spyer, 1986; Roder y Ciriello, 1992). El NTS es el

centro de integración visceral más importante en el tallo cerebral, en cuanto a

LCV

NTS

GCSGP

IXNSC

CC

V

HIPÓFISIS

HIPOTÁLAMO

NSO

CP

3VNPV

CC

ACI

ACE

V4

Figura 3. Vías nerviosas que comunican los receptores del CC con el hipotálamo. Las señales quimiorreceptoras viajan por el nervio del seno carotídeo (NSC) rama del glosofaríngeo (IX), llegan al ganglio petroso (GP) y al ganglio cervical superior (GCS), de allí al núcleo del tracto solitario (NTS) en donde hacen relevo con neuronas que se dirigen al hipotálamo. ACE, arteria carótida externa; ACI, arteria carótida interna; CC, cuerpo carotídeo; CP, carótida primitiva; GCS, ganglio cervical superior; GP, ganglio petroso; LC, locus coeruleus; NPV, núcleo paraventricular; NSO, núcleo supraóptico; V3, tercer ventrículo; V4, cuarto ventrículo. Modificado de: Ricardo y Koh, 1978; Housley y col., 1987.

24

funciones cardiovasculares y respiratorias se refiere (Daly, Ward, Wood, 1986;

McRitchie y Törk, 1994); y es importte señalar que el reflejo quimiorreceptor arterial

produce alteraciones en ambos efectores en forma simultánea (Davidson, Goldner y

McCloskey, 1976). Haciendo una analogía con lo que ocurre en el asta dorsal de la

médula espinal, se sugiere que el NTS modula las señales aferentes que le llegan

por mecanismos presinápticos en las propias terminales, o postsinápticos en los

cuerpos neuronales (Jordan y Spyer, 1986; Housley y Sinclair, 1988).

En estudios in vivo, la extirpación quirúrgica de los CC y de sus tejidos anexos

elimina las respuestas neuroendocrinas contrarregulatorias a una hipoglucemia

insulínica ligera (Koyama y col, 2000) y/o al ejercicio (Koyama, Coker, Denny, Lacy,

Jabbour, Williams. Wasserman, 2001) (Figura 4).

Figura 4. Velocidad de infusión de una solución de glucosa en la vena cava durante la hipoglucemia insulínica (1 mU/kg/min) en perros control con CC intactos (o) y en perros con extirpación de ambos CC (●). Note que es necesaria mayor velocidad de infusión de glucosa para mantener la hipoglucemia en los perros sin CC. Modificado de: Koyama y col, 2001.

25

Varios años después de los experimentos de Álvarez-Buylla (1981), Obeso, Almaraz,

González (1986) y Pardal y López-Barneo (2002), trabajando en preparaciones del

CC in vitro, llegan a la misma conclusión. Utilizando rebanadas finas de tejido que

mantienen la estructura del CC, así como su sensibilidad a la hipoxia, demuestran

que la falta de glucosa (glucopenia) en el medio induce una actividad secretora

semejante a la producida por la hipoxia (Pardal y López-Barneo, 2002); así mismo, la

estimulación hipóxica induce la activación simpática con la secreción de

catecolaminas (Figura 5). Las células del glomus carotídeo, al ser estimuladas por

Figura 5. Respuesta secretora de las células glómicas del CC in vitro a diferentes concentraciones de glucosa en condiciones de hipoxia y normoxia. (A) Aumento de la respuesta secretora durante la hipoxia (PO2 25 mmHg) a 0 mM de glucosa, y reducción de la secreción al aumentar la concentración de glucosa (5 mM). (B) Índice de secreción durante las 3 respuestas en A; 1,837, 5,816 y 1,729 fC/min. (C) Modulación de la actividad secretora al aumentar los niveles de glucosa en el baño (5-10 mM) en una célula glómica expuesta a tensión normal de oxígeno (PO2 = 90 mmHg). (D) Curva que expresa la secreción máxima de catecolaminas en respuesta a la concentración de glucosa. Modificado de Pardal y López Barneo, 2002.

26

la hipoxia, liberan catecolaminas y otros transmisores como la sustancia P, la

metencefalina, la ACh, etc. (Ureña, Fernández-Chacón, Benot, Álvarez de Toledo y

López-Barneo, 1994).

Óxido Nítrico (NO) y quimiorreceptores

El NO es un radical libre, gaseoso, liposoluble, membrana-permeante, de vida

media muy corta, reactivo y muy difusible (Fernández-Álvarez, Abudara y Morales,

1999), que participa como un mensajero biológico en diversas funciones fisiológicas,

tales como la regulación de la presión sanguínea, la transmisión sináptica, la

supresión de patógenos (Lowenstein, Dinerman y Snyder, 1994), así como en los

procesos de señalización intra- e intercelular en diversas funciones como en la

homeostasis de la glucosa (Shankar, Zhu, Ladd, Henry, Shen y Baron, 1998;

Bradley, Kingwell y McConell, 1999; Higaki, Hirshman, Fujii y Goodyear, 2001).

Interviene, también, en eventos fisiopatológicos, activando cadenas metabólicas

intracelulares a través de la síntesis de GMPc (Boucher, Moali y Tenu, 1999; Wang y

Robinson, 1997; Di Giulio y col., 1998; Fernández-Álvarez y col., 1999; Prabhakar y

col., 2001). Asimismo, en los últimos años numerosos reportes sugieren que el NO

participa en la modulación de la respiración durante la hipoxia (Prabhakar, 1999). La

vida media del NO en solución buffer a pH fisiológico y en condiciones de normoxia

es de 30 s, con una distancia de difusión radial de 540 µm; en la sangre, estos

valores disminuyen a 1 s y 100 µm respectivamente (Kelm y Schrader, 1988).

El NO fue encontrado originalmente en el endotelio vascular por lo que en un

principio se denominó como “factor de la relajación endotelial”; se sintetiza en

diversos tipos de células, como neuronas, músculo liso y macrófagos, entre otros

(Moncada, Palmer y Higgs, 1991). La biosíntesis del NO se lleva a cabo a partir de

la L-arginina y el NADPH, generando citrulina como coproducto, con la participación

de la sintasa del NO (NOS) y la diaforasa de NADPH como cofactores. Las

isoformas de la NOS más conocidas en los mamíferos son la NOSi (inducible),

27

sintetizada en respuesta a estímulos inmunológicos o inflamatorios, la NOSn

(neuronal), la NOSe (endotelial), y por último la NOSmt (mitocondrial) que parece ser

una modificación de la NOSn (Saavedra-Molina, Ramírez-Emiliano, Clemente-

Guerrero, Pérez-Vázquez, Aguilera-Aguirre, Gonzalez-Hernández, 2003). Aunque

las NOS varían ligeramente en su modo de expresión y regulación, todas las

isoformas catalizan la misma reacción, pero sólo la NOSn y NOSe son

Ca2+/calmodulina dependientes (Lowenstein y col., 1994; Boucher y col., 1999). La

NOSe y la NOSn son sensibles a distintas concentraciones de O2, sugiriendo que las

condiciones fisiopatológicas que cursan con una disminución de O2 en los tejidos,

producen un decremento en la producción de NO (Rengasamy y Johns, 1993).

El CC es altamente excitable por la inhibición de la fosforilación oxidativa, hecho

que convierte a la CR mitocondrial como organelo fundamental en la detección de

oxígeno a través de cambios en el metabolismo energético. Al parecer todos los

estímulos que actúan sobre los quimiorreceptores lo harían del mismo modo, esto es,

inhibiendo los canales de potasio, como los canales semejantes a TASK (canales de

potasio de doble poro rectificadores entrantes tardíos sensibles a acidez, por sus

siglas en inglés) denominados canales KB, localizado en la membrana de las células

tipo 1 del glomus. Estos canales son inhibidos por hipoxia o acidosis, despolarizando

a la célula e iniciando la actividad eléctrica y la entrada del calcio dependiente de

voltaje que estrimula la neurosecreción de las células tipo 1 del glomus carotídeo

para excitar las terminales nerviosas aferentes quimiorreceptoras. Los canales KB

son sensibles a inhibidores de la fosforilación oxidativa mitocondrial, lo que los hace

sensibles a los cambios de pH y oxígeno. Se ha señalado que la integridad de la

mitocondria es necesaria para la detección de oxígeno y pH; el hecho de que estas

células no respondan a la hipoxia cuando se inhibe la función mitocondrial, sugiere

una fuerte vinculación entre el metabolismo energético y la sensibilidad al oxígeno en

las células glómicas tipo 1 (Varas, Wyatt, Buckler, 2007). La CR mitocondrial

transporta los electrones provenientes del metabolismo oxidativo hacia un receptor

final, el O2, y acopla este proceso al bombeo de protones hacia el espacio

intermembranal, proceso que es responsable de la generación del potencial

28

electroquímico transmembranal necesario para la síntesis del ATP y la homeostasis

iónica en la mitocondria. En la CR se encuentran diversos grupos prostéticos con los

que se une el NO producido por la NOSmt para alterar su actividad (figura 6). El

cianuro, igual que el NO, es un inhibidor específico de la cit-c, que disminuye la

Figura 6. Cadena respiratoria (CR) en la mitocondria. Mitocondria formada por las membranas externa (ME) e interna (MI), la matriz y el espacio intermembranal (EIM). Los complejos I, II, III IV y V de la CR, la coencima Q y la citocromo oxidasa c (cit-c) se encuentran en la MI, el complejo V (ATP sintasa) se encuentra en el EIM; su lugar en la CR es de acuerdo a sus potenciales redox (-250 mV hasta +250 mV). Al oxidarse el NADH o el FADH2 ingresan electrones, pasan por los complejos hasta llegar al complejo IV donde se reduce el O2 a H2O. Se expulsan los protones y se establece el potencial trasmembranal (∆ψ, negativo adentro) con un gradiente electroquímico a través de la membrana. Los protones reingresan a la matriz por la ATP sintasa. El ∆ψ es la fuerza motriz de los cationes como el Ca2+. El Ca2+ ionizado en la mitocondria se mantiene bajo, por la formación de depósitos insolubles [Ca3 (PO4] o por intercambio con otros cationes como H+ o Na+. El NO compite con el O2 en el complejo IV y el consumo de O2 de manera reversible. Cuando el NO inhibe el consumo de O2 disminuye el ∆ψ y el ∆pH.

Tomado de Ghafourifar y Cadenas, 2005.

29

velocidad de degradación del NO en una solución. La concentración inhibitoria

media (IC50) del cianuro para el consumo de O2 es de 13.2 ± 1.8 µM. Una

concentración de 100 µM de SNAP (donador de NO) atenúa la IC50 del cianuro de

potasio (KCN). En cambio, el L-NAME aumenta la IC50 del NaCN hasta 59.6 ± 0.9

µM en el consumo de O2 (Leavesley, Prabhakaran, Borowitz y Isom, 2007). Estos

datos indican que el KCN activa la producción de NO mitocondrial y de este modo

potencia el bloqueo de la cit-c. La unión del O2, del NO o del KCN a la cit-c depende

del estado redox de la enzima, es decir, del estado reducido del núcleo de la enzima

(Fe2+/CuB+), del estado oxidado (Fea3

3+/CuB2+) o del estado parcialmente reducido

(Fea33+/CuB

+). El O2 y el NO se unen a la la cit-c en el estado reducido, mientras que

el KCN se une a la cit-c en los tres estadios, reducido, oxidado o parcialmente

reducido (Leavesley y col., 2007). El NO oxida la cit-c en presencia de NADH y

FADH con la formación de nitrosilo en milisegundos (ms), pero en presencia de

NaCN disminuye el tiempo de reducción del NO a nitrosilo. Es decir, el cianuro

compite con el NO por el sitio de unión a la cit-c mitocondrial, provocando un

aumento en la concentración de NO en las células (Staubauer, Giuffrè, Brunori, Sarti,

1998). Brown y Cooper (1994) señalan que el NO inhibe en forma reversible el

consumo de O2 bloqueando la cit-c mitocondrial in vivo. Aunque el NO mitocondrial

interfiere con la respiración, la síntesis de ATP y la regulación del potencial de

membrana mitocondrial (Okada, Takehara, Yabuki, Yoshioka, Yasuda, Inoue,

Utsumi, 1996; Ghafourifar, Bringold, Klein, Richter, 2001), la disminución del ATP no

contribuye a la inhibición persistente de la respiración provocada por el NO

(Clementi, Brown, Feelisch, Moncada, 1988). Por sus acciones sobre la CR, el NO

debe intervenir en los efectos citotóxicos sobre el SNC y otros tejidos (Cleete,

Cooper, Darley-Usmar, Moncada y Schapira, 1994), y puede causar una inhibición

persistente en la CR debido a la formación generalizada de peroxinitritos (OONO-)

(Beckman, Beckman, Chen, Marshall y Freeman, 1990) y/o nitroso-tioles (Clementi y

col., 1988) en el complejo I de la CR.

Por estos antecedentes, el papel fisiológico del NO en la regulación del

metabolismo energético mitocondrial de la célula es cada vez más evidente, pero

30

falta definir cómo se llevan a cabo esta función. Las acciones del NO sobre la CR

parecen depender de muchos factores entre los que tenemos la propia concentración

de NO en función de la regulación de las NOS (Ghafourifar y Richter, 1997;

Saavedra-Molina y col., 2003).

El NO es capaz de reaccionar en forma rápida y reversible con el Fe2+ del grupo

hemo de distintas metaloproteínas (Radi, 1996), mecanismo que activaría a la

guanilatociclasa citosólica (GCS) (Arnold, Aldred y Murad, 1977) e inhibiría a todas

las NOS (autoregulación) (Rogers e Ignarro, 1992). Una vez que el NO activa a la

CGS, se incrementa la concentración de GMPc intracelular a partir de GMP

(Schmidt, Schrammel, Koesling y Mayer 2001). El NO reacciona también con los

grupos hemo de la oxihemoglobina y mioglobina (“secuestradores” del NO) (Gillespie

y Sheng, 1989). Se han caracterizado tres genes diferentes que codifican para las

tres isoformas de NOS (Valdés, Mosqueira, Rey, Del Río e Iturriaga, 2002), y gran

número de trabajos sugieren que la biosíntesis del NO constituye un factor clave en

las respuestas fisiopatológicas del cerebro a los estados de hipoxia-isquemia, es

decir, de hipoglucemia (Bolaños y Almeida, 1999; Beltrán, Mathur, Duchen,

Erusalimsky y Moncada, 2000).

En la neurotransmisión y en el sistema cardiovascular las NOSn y NOSe en los

CC actúan como moduladores (Boucher y col., 1999; Kline y Prabhakar, 2000;

Valdés y col., 2002) (Figura 7). Utilizando técnicas inmunohistoquímicas se detecta

actividad NOS-positiva en las neuronas de la periferia del CC, así como en las

arterias y arteriolas intraglómicas, que desaparece después de la sección del NSC,

indicando su origen sensorial (Prabhakar, Kumar, Chang, Agani y Haxhiu, 1993;

Chugh, Katayama, Mokashi, Debout, Ray y Lahiri, 1994; Hohler, Mayer, Kummer,

1994). La NOS también se localiza en la vecindad del CC, tanto en las neuronas

preganglionares simpáticas como en las postganglionares parasimpáticas (Hohler y

col., 1994). Las hipótesis actuales sobre la función detectora de los

quimiorreceptores del CC en respuesta a la hipoxia, a la hipercapnia o a la acidez de

la sangre arterial, indican que las células dopaminérgicas del glomus son las

31

transductoras del estímulo químico inhibiendo los canales de K+; con la

despolarización consecuente, la entrada de Ca2+ y liberación del neurotransmisor

(González y col., 1994; López-Barneo, 1996; Prabhakar, 2000; Prabhakar y Overholt,

2000). Aunque se ha propuesto la presencia de una proteína, ya sea asociada a la

membrana, al grupo hemo, o al canal de K+, para identificar los detectores al oxígeno

(Nurse y Fearon, 2002) no hay evidencias al respecto. En el CC se han encontrado,

también, otros transmisores, como la ACh, la adenosina y el ATP, que generan

también la descarga quimiosensitiva en las terminales nerviosas de las neuronas

aferentes ante la hipoxia (Fitzgerald y col., 2000).

Figura 7. Síntesis, difusión y esfera de acción del NO en el sistema nervioso. En la parte central se representa la sinapsis glutamatérgica que establece contacto sináptico con un elemento postsináptico que contiene NOS. El neurotransmisor glutamato interactúa con el receptor NMDA para generar una corriente entrante de Ca2+ al elemento postsináptico. El aumento del Ca2+ intracelular promueve la síntesis de NO por activación de la NOS Ca2+/calmodulina dependiente. La línea punteada representa la esfera de acción del NO. El NO que difunde desde la postsinapsis podría actuar en cualquiera de los elementos celulares vecinos siempre que contengan la GC. GC, guanilato ciclasa; NMDA, N-metil-D-aspartato; NO, óxido nítrico; NOS, sintasa de NO. Modificado de: Fernández-Álvarez y col. 1999; Denicola, Souza, Radi y Lissi, 1996.

32

La administración de NO o sus donadores como el precursor L-arginina, reducen

la respuesta quimiosensitiva a la hipoxia en el CC del gato in vitro (Chugh,

Katayama, Mokashi, Bebout, Ray, Lahiri, 1994; Iturriaga, Alcayaga y Rey, 1998;

Iturriaga, Mosqueira y Villanueva, 2000; Valdés y col., 2002). Otro donador del NO,

como es el nitroprusiato de sodio (NPS, reduce en forma reversible las respuestas

quimiosensitivas del CC inducidas con una dosis única de NaCN o de nicotina en el

CC del gato (Alcayaga, Iturriaga, Ramírez, Readi, Quezada y Salinas, 1997). En

cambio, la inhibición de la NOS con la consecuente disminución en la producción de

NO, incrementa la frecuencia de las descargas quimiosensitivas carotídeas en el CC

in situ (Iturriaga y col., 1998) e in vitro (Wang, Stensaas, Bredt, Dinger y Fidone,

1994; Wang, Stensaas, Dinger y Fidone, 1995). En experimentos farmacológicos o

de supresión genética, se demuestra la participación de la NOSn y NOSe en la

producción de NO en el CC, tanto in vitro (Kline, Yang, Huang y Prabhakar, 1998)

como in vivo (Gozal, Torres, Gozal y Littwin., 1996), comprobando, de manera

indirecta, la participación de dichas isoformas de la NOS sobre la respuesta

ventilatoria inducida por la hipoxia histotóxica (NaCN).

Un inhibidor específico de la NOSn, como es la s-metil-L-tíocitrulina no modifica

la respuesta ventilatoria inducida por el NaCN en las ratas, en tanto que un inhibidor

no específico como el L-NAME aumenta significativamente la respuesta ventilatoria

(Gozal y col., 1996). Sin embargo, en ratones mutantes carentes de NOSn o NOSe,

la deficiencia de NOSn origina mayor respuesta ventilatoria a la hipoxia histotóxica y

a la hiperoxia cuando se compara con los controles silvestres; mientras que la

respuesta al NaCN y/o a la hiperoxia en los ratones desprovistos de NOSe no está

clara (Kline y col., 1998). En estos estudios no se hicieron registros en el NSC para

verificar las respuestas quimiosensitivas del CC. Buerk y Lahiri (2000) demuestran

una reducción del NO en los CC aislados de gatos que no altera la frecuencia de las

descargas en el NSC, después de perfundir con L-NAME (50 µM) durante 10 min. Al

aumentar la dosis de L-NAME hasta 250 µM, los niveles de NO disminuyen a los 22

min aumentando la frecuencia de las descargas en el NSC. Con dosis mayores de

33

L-NAME (500 µM) desaparece el NO en el tejido carotídeo, y decrece la actividad en

el NSC (Figura 8).

El nitroprusiato de sodio (NPS), donador de NO, incrementa el GMPc intracelular

en las células del glomus carotídeo y en las arteriolas del CC, para producir

hiperventilación (Wang, Stensaas, de Vente, Dinger y Fidone, 1991; Knowles y

Moncada, 1992). Todos estos experimentos demuestran la presencia de un control

nitroxidérgico en el CC, tanto sobre la actividad neuronal como sobre el flujo

sanguíneo.

Figura 8. Relación entre el nivel de NO en el cuerpo carotídeo perfundido de gato y la actividad eléctrica en el NSC. Al disminuir el la concentración de óxido nítrico (NO) en el tejido (panel inferior), por la perfusión de concentraciones crecientes de L-NAME, se incrementan las descargas en el nervio del seno carotídeo (ND) (panel superior). En el t = 50 min el NSC fue incapaz de sostener la actividad máxima.

Modificado de: Buerk y Lahiri, 2000.

En preparaciones del CC in vitro perfundidas con donadores y/o inhibidores de

la NOS a una presión constante, para evitar efectos vasculares (Iturriaga y col.,

2000), se demuestra que el NO sintetizado por la NOSe regula el flujo sanguíneo y

34

los cambios subsecuentes en la PO2 tisular del CC; mientras que el NO sintetizado

por la NOSn en las terminales de las fibras sensitivas “C” y en las neuronas

parasimpáticas, regula la excitabilidad de las células glómicas (Prabhakar y col.,

1993; Chugh y col., 1994; Wang y col., 1994, 1995; Lahiri y Buerk, 1998; Prabhakar,

1999; Valdés y col., 2002). Al inhibir la NOS con L-NAME se incrementa tanto la

respuesta basal en el NSC, como las respuestas a la hipoxia tisular producidas por el

NaCN y la dopamina en gatos anestesiados (Iturriaga y col., 1998), mientras que el

NPS incrementa la respuesta basal, pero reduce sólo la inhibición obtenida por

dopamina pero no por hiperoxia. Es posible que el NO, por ser una molécula ubicua,

module la quimiorrecepción del CC en diferentes blancos utilizando varios

mecanismos (Iturriaga y col., 1998; Prabhakar, 1999; Valdés y col., 2002).

En resumen, el NO produce: vasodilatación en el CC (Chugh y col., 1994; Wang

y col., 1994; Lahiri y Buerk, 1998), inhibición retrógrada de la excitabilidad de las

células del glomus (Wang y col., 1994), inhibición de la actividad de los canales de

Ca2+ de las células del glomus, modulación de la excitabilidad de las neuronas del

ganglio petroso (Alcayaga y col., 1997) e inhibición del metabolismo mitocondrial

(Iturriaga y col., 2000).

Óxido nítrico y la homeostasis de la glucosa

Es indudable que el SNC monitorea y regula los requerimientos energéticos del

organismo; pero queda por determinar el mecanismo por medio del cual el cerebro

realiza esta función detectora de los niveles de glucosa, y la forma en que dicha

información se utiliza para regular la homeostasis energética bajo condiciones

fisiológicas. Datos anteriores sugieren que el SNC participa en la patogénesis de

algunas formas de resistencia a la insulina (Shankar y col., 1998), pero será

importante estudiar si el NO participa en la homeostasis de la glucosa en el SNC en

condiciones fisiológicas. El NO podría ser el mediador potencial del transporte de

glucosa en el SNC, como ocurre en el músculo esquelético (Figura 9), tanto en los

35

estados de reposo como después del ejercicio (Balon y Nadler, 1997). El NO induce

la expresión de los transportadores a la glucosa, como son el GLUT1, GLUT3 y

GLUT4 (Etgen, Fryburg y Gibbs, 1997; Higaki y col., 2001), pero no se ha estudiado

el papel que juega dentro del SNC.

Vasodilatación

glucosainsulina

IRS IRS

PKC

Akt

insulina

SS

SS SS

PI3K

NO

NOSe

glucosainsulina

P P

+

+

++

Akt GLU

T4

GLU

T1

Miocito

Intersticio

Capilar

Sensibilidad a la Insulina

Figura 9. Modelo hipotético de la regulación que ejerce el NO sobre la acción de la insulina en la homeostasis de la glucosa a nivel del músculo esquelético. Akt, proteína kinasa serina-dependiente; GLUT1 y 4, proteína transportadora de glucosa;.IRS, substrato receptor de la insulina; NO, óxido nítrico; NOSe, sintasa de óxido nítrico endotelial; p, fosfato; PI3K, fosfatidilinositol 3-kinasa; PKC, proteína kinasa C. Modificado de Dallaire y Marette, 2004.

La inhibición de los niveles del NO, por infusión intracerebroventricular de L-

NAME, incrementa los niveles de glucosa en el plasma por encima de los

encontrados en grupos controles (Shankar y col., 1998). Observaciones recientes

sugieren que el NO es la molécula señalizadora que modula en forma fisiológica el

metabolismo de la glucosa, tanto en los astrocitos como en las neuronas (Almeida y

col., 2005); en los astrocitos el NO aumenta la glucólisis a través de un mecanismo

independiente de la glucogenolisis (Almeida, Cidad y Bolaños, 2002). Sin embargo,

36

la inhibición de la NOS no altera la utilización de glucosa cerebral, por lo que algunos

autores concluyen que el NO no participa en el metabolismo energético del cerebro

de la rata (Takahashi, Cook, Jehle, Kennedy y Sokoloff, 1995).

Trabajos anteriores de este laboratorio demuestran que el NO en el SNC

participa en el reflejo hiperglucemiante con retención de glucosa por el cerebro

después de estimular los RSCC con NaCN. En efecto, los donadores del NO

(nitroglicerina y NPS) inyectados en la cisterna magna, incrementan la retención de

glucosa por el cerebro, y por el contrario, un inhibidor del NO como el L-NAME

disminuye estos reflejos (Cadenas, 2003).

El óxido nítrico en la diabetes

La diabetes mellitus representa un grupo de enfermedades metabólicas

caracterizadas por presentar hiperglucemia con alteración en los mecanismos

homeostáticos, que desencadenan una serie de procesos patogénicos como la

destrucción autoinmune de las células beta del páncreas con la consecuente

disminución en la secreción de insulina, y anormalidades que dan como resultado un

aumento en la resistencia a la acción de la insulina (Fauci, Braunwald, Isselbacher,

1998). La fisiopatología de la diabetes se caracteriza por angiopatía, hipoxia tisular,

reducción en la respuesta ventilatoria a la hipoxia e hipercapnia. Además, la

diabetes se acompaña de aterosclerosis, neoformación de la red capilar, reducción

en el flujo sanguíneo de órganos, que induce una reducción en el suplemento de O2

al CC, hipertensión arterial y anomalías en el metabolismo de las lipoproteínas (The

Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus, 2003).

Las complicaciones agudas de la enfermedad son, entre otras, hiperglucemia con

cetoacidosis y el síndrome hiperosmolar sin cetoacidosis, o estados de hipoglucemia

que pueden ocurrir por el tratamiento con insulina o los hipoglucemiantes orales. Las

complicaciones crónicas, secundarias a la diabetes mellitus, incluyen: retinopatía con

pérdida potencial de la visión, nefropatía hasta insuficiencia renal, neuropatía

37

periférica con ulceración en las extremidades, disfunción gastrointestinal,

genitourinaria, cardiovascular y/o sexual. Existen múltiples evidencias que asocian a

la disfunción vascular con la diabetes mellitus.

La Organización Mundial de la Salud considera 4 tipos de diabetes:

1. La diabetes mellitus tipo 1, con destrucción de las células beta del

páncreas y deficiencia absoluta de insulina.

2. La diabetes mellitus tipo 2, con resistencia a la insulina y deficiencia

relativa de la misma hasta su falta total.

3. La diabetes gestacional, con intolerancia a la glucosa que se inicia o se

reconoce por primera vez durante el embarazo.

4. Otros tipos específicos de diabetes secundarias: a) defecto genético de la

función de las células ß; b) defecto genético de la acción de la insulina; c)

pancreatitis; d) trauma/pancreatectomía; e) drogas o inducción química

(pentamidina, ácido nicotínico, glucocorticoides, hormona tiroidea); f)

agonistas beta adrenérgicos (tiazidas); g) endocrinopatías como la

acromegalia, el síndrome de Cushing, el hipertiroidismo, el glucagonoma

y el feocromocitoma; h) infecciones (rubéola congénita, citomegalovirus).

La patogénesis de la diabetes se ha estudiado profusamente, pero la etiología

de este desorden metabólico permanece sin aclarar. La diabetes se caracteriza por

presentar una función anomal de las células beta con disminución de la secreción de

insulina (Polonsky, Sturis y Bell, 1996) o resistencia a la acción de la insulina

(principalmente en el músculo esquelético y en el tejido adiposo) (Yki-Jarvinen,

1994); se presenta también una disfunción hepática con sobreproducción de glucosa

(Garvey, Revers, Kolterman, Rubenstein y Olefsky, 1985). En todos los casos, la

atención de los investigadores se centra en las vías metabólicas de los órganos

involucrados. Es notorio que durante este estado diabético, los niveles de glucosa

en ayuno son elevados pero relativamente constantes dentro de márgenes

estrechos; hecho que sugiere la presencia de mecanismos reguladores “hacia

38

arriba”, es decir para un nivel alto de glucosa (DeFronzo, 1988). Este alto grado de

regulación en coordinación con el flujo de glucosa hepático, indica también, la

presencia de un sistema de control centralizado y complejo. La utilización de ratas

diabéticas como modelos para entender el proceso de esta enfermedad, permitirá

estudiar los cambios patofisiológicos que ocurren, y en última instancia poder

acceder a su tratamiento.

La administración sistémica de altas dosis de un competidor de la NOS como la

N-monomethyl-L-arginina (L-NMMA), induce una resistencia muy notoria a la insulina

en las ratas sanas, datos que apoyan la existencia de mecanismos centrales que

participan en la patogénesis de la diabetes, particularmente en algunas formas de

resistencia a la insulina (Shankar y col. 1998), es decir, en estos casos el NO a nivel

central influye sobre las vías efectoras para cambiar el nivel de la glucorregulación a

la alta (Shankar y col., 1998). Trabajos recientes encuentran que en los estados de

hipoxia, se presenta un aumento en la frecuencia ventilatoria como una reacción

homeostática de las células periféricas a los requerimientos de O2 y probablemente

de glucosa (Lahiri, Di Giulio y Roy, 2002). La disminución en la respuesta ventilatoria

a la hipoxia en los pacientes diabéticos, podría correlacionarse también con la

hiperglucemia, y la consecuente reducción en la conductividad del NSC, por la

neuropatía de las fibras sensitivas aferentes y motoras efectoras (Bianchi y col.,

2003). Existen controversias sobre la influencia de la diabetes (hiperglucemia) en los

niveles de NO en la sangre sistémica y en el SNC (Kino y col., 2004). Algunos

investigadores, utilizando técnicas inmunohistoquímicas, encuentran que en el CC in

vitro de ratas diabéticas aumenta la expresión de la NOSe y del NO (Bianchi y col.,

2003) (Figura 10A), hechos que asocian a la falta de sensibilidad de los CC a la

hipoxia por un incremento en la NOS, mecanismo que piensan juega un papel en la

adaptación del CC a la hipoxia. Otros autores, en cambio, indican que durante la

hiperglucemia se inhibe la producción de NOSmt (Brodsky, Gao, Li, Goligorsky,

2002) (Figura 10B). El NO disminuye durante la diabetes como consecuencia de

una reducción en los niveles de L-arginina (Pieper y Dondlinger, 1997; Kino y col.,

2004; Lei, Venkatakrishnan, Yu, Kazlauskas, 2007).

39

Se postula que el CC podría jugar un papel importante en la regulación de la

glucosa in vivo (Koyama y col., 2000). El incremento en la NOS sería el responsable

de la reducción en la respuesta ventilatoria en el estado diabético, así como en la

adaptación respiratoria durante la hipoxia crónica. La hipoxia aguda inhibe

normalmente la actividad enzimática, mientras que la hipoxia crónica estimula varias

enzimas entre ellas la NOS, aumentando la producción del NO, que representaría un

mecanismo de defensa homeostática (Bianchi y col., 2003).

Figura 10. A) Expresión de la NOSe en el cuerpo carotídeo de ratas control en condiciones de normoxia o hipoxia, y en ratas diabéticas durante la normoxia. B) Concentración de NO (fluorescencia) en ratas normales (ZL) y diabéticas (ZDF) en condiciones control y después de la estimulación hipóxica (A23187). A) Modificado de: Bianchi y col., 2003. B) Modificado de: Brodsky y col., 2000.

La estimulación de la NOS en el CC de las ratas diabéticas puede

correlacionarse también con los estados de hipoxia crónica en otros órganos debido

a la aterosclerosis, al incremento de la matriz extracelular y a otros factores que

aumentan la distancia de difusión entre la sangre y la mitocondria (Popel, Goldman,

Vadapalli, 2003). Bianchi y col. (2003) consideran que la diabetes afecta a los

quimiorreceptores por una modificación en la respuesta quimiotransductora, como

Fluorescencia

F luorescencia

Control A23187

B

Control DiabetesHipoxia

%NOS

10

20

30

40

50

A

40

resultado del incremento en la producción de radicales libres y enzimas oxidativas

que dañan potencialmente la membrana celular. Para estos autores, la correlación

entre diabetes e hipoxia crónica estaría relacionada con una disminución en la pO2

sanguínea, hecho que ocurre en ambas situaciones.

41

JUSTIFICACIÓN

La homeostasis de la glucosa es esencial para la vida. El número de personas

con trastornos en los mecanismos reguladores que controlan la homeostasis

glucémica es muy grande, y se preveé una tendencia de aumento en el número de

pacientes diabéticos durante los próximos años a nivel mundial. Como no

conocemos con precisión los mecanismos que regulan el metabolismo energético en

el medio interno, y en particular en el SNC, es difícil que podamos implementar los

enfoques terapéuticos para controlar la diabetes, en particular, los tipos 1 y 2.

Además de la existencia de neuronas capaces de detectar cambios en los niveles de

glucosa en diversas áreas cerebrales como en el hipotálamo, en los últimos años se

presentan evidencias que apoyan la presencia de glucorreceptores en los CC, que

juegan un papel importante en la glucorregulación in vivo, participando en las

respuestas contrarregulatorias a la hipoglucemia.

La insulina producida por las células beta del páncreas participa en: el

transporte de la glucosa a nivel periférico, y con ello en la regulación energética; en

la reabsorción de sodio; en la regulación vasomotora y en la liberación de NO.

Deben existir mecanismos en el SNC, que regulen el aporte de glucosa a nivel

central, es decir, que participen en el mantenimiento de los niveles apropiados de

este energético fundamental para la bioquímica cerebral. El estado diabético

representa un paradigma experimental que nos permitirá dilucidar los cambios que

ocurren a nivel central ante una falta de oxígeno en los RSCC in vivo, de manera

concomitante con inhibidores y/o donadores del NO.

42

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Las zonas reflexogénicas seno-carotídeas participan en la homeostasis de la

glucosa, en particular en la captación de glucosa por el SNC. Sin embargo, se

desconoce el o los mecanismos para llevar a cabo dicha regulación, en especial a

nivel del CC. La diabetes implica una serie de alteraciones en los procesos

homeostáticos semejantes a los que se presentan en un estado de hipoxia crónica

con alteración de la producción de óxido nítrico (NO). En esta tesis se plantea

dilucidar el efecto concomitante del NO y el cianuro de sodio (NaCN) en el seno

carotídeo aislado in vivo sobre el reflejo hiperglucémico por estimulación RSCC y los

niveles de nitritos en la sangre procedente del cerebro en ratas normales y

diabéticas.

HIPÓTESIS

El NO en el cuerpo carotídeo aislado de la circulación in vivo, en condiciones de

anoxia histotóxica (por estimulación de los quimiorreceptores del CC con NaCN),

interviene de manera diferencial para modular el metabolismo de la glucosa en ratas

normales y/o diabéticas.

OBJETIVOS

General

- Estudiar el efecto del NO en el cuerpo carotídeo sobre el reflejo

hiperglucemiante inducido por la anoxia histotóxica después de la inyección de

NaCN en el seno carotídeo aislado in vivo de ratas normales y diabéticas.

43

Específicos

- Determinar las concentraciones de nitritos en la sangre venosa del seno yugular

(proveniente del SNC), y las concentraciones de glucosa en la sangre arterial y

venosa encefálica, antes y después de inyectar sol. sal. en el seno carotídeo

circulatoriamente aislado en ratas normales y diabéticas.

- Determinar los niveles de nitritos en la sangre venosa del seno yugular y la

concentración de glucosa en la sangre arterial y venosa encefálica, antes y

después de estimular los RSCC con NaCN en el seno carotídeo

circulatoriamente aislado en ratas normales y diabéticas.

- Evaluar el efecto del L-NAME (inhibidor de la NOS) en el seno carotídeo

circulatoriamente aislado, sobre el reflejo hiperglucemiante en ratas normales y

diabéticas, antes y después de estimular los RSCC con NaCN; cuantificando los

niveles de nitritos en la sangre venosa del seno yugular y la concentración de

glucosa en la sangre arterial y venosa encefálica.

- Evaluar el efecto del NPS (donador de NO) en el seno carotídeo aislado, sobre

el reflejo hiperglucemiante en ratas normales y diabéticas, antes y después de

estimular los RSCC con NaCN; cuantificando los niveles de nitritos en la sangre

venosa del seno yugular y la concentración de glucosa en la sangre arterial y

venosa encefálica.

44

METODOLOGÍA

Animales y técnicas quirúrgicas generales

Los experimentos se realizaron en ratas Sprague-Dawley macho, de 250 a 300

g de peso corporal con ayuno de 12 horas y libre acceso al agua con glucosa al 10%;

experimentos anteriores mostraron que bajo estas condiciones los niveles de glucosa

se mantienen más estables en las ratas anestesiadas (Álvarez-Buylla y de Álvarez-

Buylla, 1988; Álvarez-Buylla y Roces de Álvarez-Buylla, 1994).

Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con la guía

de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (Guide for Care and Use

of Laboratory Animals, 1996). Los animales se anestesiaron con pentobarbital

sódico (3 mg/100 g, Anestesal, Pfizer), por vía intraperitoneal (i.p.). El nivel de

anestesia se mantuvo constante durante todo el experimento por goteo i.p. continuo

del anestésico diluido en sol sal. (0.063 mg/min). La profundidad de la anestesia se

vigiló periódicamente examinando el reflejo flexor de la pata al dolor y el reflejo

palpebral. Las ratas se mantuvieron con respiración artificial utilizando un respirador

Palmer conectado a una cánula endotraqueal (por traqueostomía), con frecuencia de

40 respiraciones/min y presión positiva hasta evitar los movimientos respiratorios

espontáneos de la rata. Se mantuvo la temperatura corporal a 37°C por medio de

una lámpara (Álvarez-Buylla y de Álvarez-Buylla, 1988). Las variables respiratorias,

basadas en los valores de pH, pO2 y pCO2 en la sangre arterial obtenida 10 min

antes de las manipulaciones experimentales y 16 min después, se mantuvieron

dentro de los límites normales (Ueki, Linn y Hossman, 1988). La rata se colocó

sobre la mesa de operaciones (Álvarez-Buylla, Quintanar-Stephano, Quintanar-

Stephano, Álvarez-Buylla, 1991) en decúbito dorsal. Se realizó una incisión por la

línea media en la cara ventral del cuello, desde el extremo cefálico del esternón

hasta 2 mm de la base del maxilar, para disecar la traquea e introducir la cánula

endotraqueal.

45

Estimulación de los RSCC

Para estimular los RSCC con NaCN e inyectar los fármacos utilizados, el seno

carotídeo izquierdo se aisló temporalmente de la circulación cefálica y general,

utilizando la técnica de Álvarez-Buylla y de Álvarez-Buylla (1988) (Figura 11). El

método fue el siguiente: disección roma para separar los músculos esternohioideo,

homohioideo y esternomastoideo hasta llegar a la carótida común o primitiva

izquierda, que se disecó en un tramo de 2-3 cm partiendo de la bifurcación carotídea

en dirección caudal. Las arterias: lingual, carótida externa y carótida interna

ipsilaterales se disecaron con la ayuda de ganchillos de vidrio sin interrumpir la

circulación en dichos vasos. La arteria lingual se puncionó con una aguja del número

20, para introducir un tubo de polietileno (Clay Adams PE-20) cuya punta se introdujo

hasta la carótida externa a 5 mm de la bifurcación de la carótida común. Este catéter

se utilizó para la inyección del NaCN durante 4-5 s, y para la extracción posterior de

la sangre que baña al seno carotídeo (6-7 s). Se pasó un hilo en forma de asa por

debajo de la carótida común (2 cm posterior a la bifurcación) y otro hilo igual en la

carótida interna (1.5 cm anterior a la bifurcación); estas ligaduras se utilizaron en

forma temporal durante el tiempo que duraron la administración de los fármacos. La

carótida interna (cerca del foramen yugular) y la carótida externa (por encima de la

arteria lingual) ipsilaterales se ocluyeron temporalmente (10-15 s) durante las

inyecciones de NaCN para evitar su paso a la circulación cefálica y/o circulación

general. Para producir isquemia cerebral sería necesario ocluir estos vasos por más

de 5 min (Wu, Fujihara, Yao, Qi, Li, Shimoji y Baba, 2003). Las arterias faríngea y

occipital izquierdas se ligaron en forma permanente. La estimulación de los RSCC

se realizó por una inyección lenta de 5 µg/100 g de NaCN en 0.1 mL de solución

salina (sol. sal.) a través de una aguja del No. 27 para evitar la estimulación

barorreceptora (Álvarez-Buylla, 1954). Con objeto de bloquear o aumentar los

efectos de la estimulación de los RSCC, inmediatamente después de terminar la

estimulación de estos receptores, se inyectaron un inhibidor de la NOS (L-NAME) o

un donador del NO (NPS) en el seno carotídeo circulatoriamente aislado.

46

Figura 11. Esquema que muestra el procedimiento quirúrgico en la rata. Cateterización de la arterial femoral y la vena yugular para la obtención de muestras de sangre arterial y venosa; estimulación de los receptores seno-cuerpo carotídeo aislados circulatoriamente. aa, aorta abdominal; acc, arteria carótida común; ace, arteria carótida externa; aci, arteria carótida interna; af, arteria femoral; al, arteria lingual; NSC, nervio del seno carotídeo; RCC, receptores del cuerpo carotídeo; sc, seno carotídeo; sy, seno yugular; y tc, tronco celiaco. Modificado de: Montero y col., 2000.

Obtención de sangre y procedimientos bioquímicos

Con la ayuda de ganchillos de vidrio, se disecó la vena yugular externa derecha

hasta llegar hasta el seno venoso yugular, para posteriormente cateterizarlo con un

tubo de silastic (Dow Corning 602-155). Después de incidir la región inguinal en la

47

cara interna y media del muslo izquierda, en sentido transversal al pliegue, hasta el

tercio superior, se visualizó el paquete vásculo-nervioso, se disecó la arteria femoral

para cateterizarla con un tubo de polietileno (PE-20 Clay Adams) hasta la aorta

abdominal. Las cateterizaciones de los vasos se realizaron con cánulas previamente

heparinizadas sin interrumpir su circulación normal (Álvarez-Buylla y Bencosme,

1981), verificando al final de cada experimento la posición correcta de los catéteres

(Figura 11).

Todas las medidas de gases (O2 y CO2) en sangre y pH en trabajos similares

determinados anteriormente en un analizador Micro 13 (Instrumentation Laboratory)

en mmHg y valores absolutos, respectivamente. se han encontrado dentro del rango

de los estándares comerciales (Ueki y col., 1988; Guarner y Álvarez-Buylla, 1991;

Montero, Mendoza, Valles, Lemus, Álvarez-Buylla, de Álvarez-Buylla, 2006). Por lo

que no hay cambios en estas variables por la cirugía o por las maniobras

experimentales.

Determinación de los niveles de glucosa en el plasma

Después de lavar por tres veces, con su propia sangre, los catéteres descritos,

se colectaron las muestras de sangre arterial y venosa de acuerdo al protocolo

experimental. Se tomaron 4 muestras de sangre arterial (arteria femoral) y 4

muestras de sangre venosa (seno yugular), durante un período de 20 min, para la

determinación de las concentraciones de glucosa en el plasma; la muestra t = -4 min

correspondió a la basal, y las muestras t = 4 min, t = 8 min y t =16 min

correspondieron a los tiempos experimentales, después de la estimulación de los

RSCC con NaCN simultáneamente con las inyecciones de sol. sal, L-NAME o NPS

en el seno carotídeo circulatoriamente aislado en el t = 0 min. En cada tiempo se

colectaron 0.15 mL de sangre arterial y 0.15 mL de sangre venosa. Para compensar

la pérdida de líquido, después de obtener cada par de muestras, las ratas recibieron

una inyección de 0.3 mL de sol. sal. Las muestras se mantuvieron en refrigeración

48

hasta su centrifugación. La sangre se centrifugó durante 5 min a una velocidad de

3000 rpm, utilizando una centrífuga refrigerada (Beckman T J-6). Como los niveles

de glucosa en la sangre de la aorta abdominal son iguales a los de la carótida, y los

valores de flujo sanguíneo no cambiaron después de la estimulación de los RSCC, la

retención de glucosa cerebral se calculó a partir de las diferencias arterio-venosas (a-

v) de glucosa entre las concentraciones de glucosa en la aorta abdominal y los del

seno yugular en µmol/mL (Álvarez-Buylla y col., 2003).

La concentración de glucosa en el plasma se midió por el método de la glucosa-

oxidasa (Analizador de glucosa Beckman 2) en µmol/mL, en muestras de 10 µL de

plasma. La glucosa se determinó a partir de la depleción de O2 en una solución de

glucosa-oxidasa saturada con O2; el consumo de O2 es directamente proporcional a

la concentración de glucosa en la muestra.

Determinación de los niveles de nitritos en el plasma. Método de Griess.

El reactivo de Griess consiste en una sulfanilamida y bicloruro de N-1-

nafiletilendiamina (NED), bajo condiciones ácidas (ácido fosfórico). Este sistema

detecta los nitritos (NO2-) en una gran variedad de líquidos biológicos y

experimentales tales como el plasma, suero, LCR, saliva, sudor, orina y medios de

cultivo celular, entre otros. La sensibilidad del método para los nitritos depende del

medio utilizado para su medición. El límite de detección es de 2.5 µM (125 pmol) de

nitritos (en agua desionizada ultrapura) (Granger, Taintor, Boockvar y Hibbs, 1996).

Para evitar la contaminación en las muestras de plasma con hemoglobina y

proteínas (requisito para esta técnica), la extracción de sangre se hizo lentamente, a

goteo. Para la determinación de los niveles de nitritos en el plasma se tomaron dos

muestras de sangre venosa encefálica de 1 mL cada una, a los tiempos t = -4 min

(control) y t = 8 min (experimental), restituyendo el volumen con sol. sal. después de

la extracción. El volumen total de sangre colectado fue de 3.2 mL aproximadamente,

49

menor del 15 % del volumen total, por lo que no produjo alteraciones hemodinámicas

significativas (Álvarez-Buylla y col., 1988). La muestra de sangre total para valorar

nitritos, se centrifugó a 3000 rpm en una centrífuga refrigerada (Beckman T-J 6)

durante 10 min para obtener el plasma. A 400 mL de plasma se les agregaron 400

mL de ácido perclórico frío al 20% para desnaturalizar las proteínas, se mezcló en el

vórtex durante 30 s y se centrifugó a 3000 rpm en una centrífuga refrigerada

(Beckman T-J 6) durante 10 min. Una vez obtenido el sobrenadante, se agregaron 5

µL de naranja de metilo al 0.05% y K2CO3 (3 M) gota a gota, para neutralizar, al

mismo tiempo que la mezcla se agitaba en el vórtex suavemente hasta que el color

rosado se tornó en amarillo claro, indicando un pH de 7.4. La muestra se conservó a

-70 ºC en el ultracongelador.

Protocolo para determinar la concentración de nitritos

Se preparó una curva de referencia con la solución de nitritos antes de cada

experimento con el fin de comparar la concentración de nitritos en las muestras

experimentales. Se preparó la solución de nitrato reductasa (5 µL = 50 mU) en el

buffer usado para las muestras experimentales añadiendo 20 µL en cada muestra

experimental o de estudio. Se agregaron 20 µL de NADPH (25 µM) y EDTA (10 mM)

y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente agregando 20 µL de glutámico

deshidrogenasa (5 µL = 100 mU). Posteriormente, se agregaron 20 µL de NH4Cl

(100mM) y 20 µL del ácido alfa-cetoglutárico (4 mM), que se incubó durante 10 min

a temperatura ambiente. Una vez transcurrido este tiempo, se agregaron 60 µL de

ácido 5-sulfasalicílico al 6%, se agitó cada 5 min durante 30 min, y se centrifugó a

10,000 rpm en una centrifuga refrigerada (Sorvall Instruments RC5C) durante 15 min.

Se extrajo el sobrenadante en alícuotas de 200 µL, agregando 50 µL de NH4Cl al 30

% y 30 µL de NaOH al 5 % para completar un volumen de 280 µL, para incorporar,

después, el reactivo de Griess con el mismo volumen (280 µL). Se incubó durante

20 min a temperatura ambiente protegido de la luz hasta desarrollar un color

magenta casi de manera inmediata. Se midió la absorbancia en todas las muestras

50

en un lapso de 40 min (lector de ELISA - Spectronic 21 D) con un filtro entre 520-550

nm (Tabla 1). Se determinó la absorbancia promedio de cada muestra experimental

calculando su concentración por comparación con la curva del estándar de los

nitritos. La concentración de nitritos se calculó a partir de la curva estándar corrida a

la par de los problemas. La curva se diseñó de acuerdo a los valores máximos y

mínimos esperados en las muestras problema con el fin de que todas las muestras

entraran en el rango de la curva. Una vez obtenida la curva de referencia con los

estándares de nitritos, se graficó el valor promedio de la absorbancia de cada

concentración del estándar de nitrito como función de ¨Y¨ contra la concentración de

nitritos como función de ¨X¨.

Reactivos de Griess

- Solución A:

Naphthyl-ethylen diamina 0.1%, disuelto en agua bidestilada.

- Solución B:

H3PO4 al 5 % (ácido fosfórico) disuelto en agua bidestilada.

- Sulfanilamida al 1% en ácido fosfórico se disuelve y se afora en el ácido

fosfórico al 5%.

- El reactivo de Griess se preparó mezclando las soluciones A y B 1:1, la mezcla

dura 12 horas a una temperatura de 4 °C, o más tiempo a -20 °C.

- La curva estándar se hizo con el NaNO2 100 µM en agua bidestilada.

Fármacos utilizados

• Pentobarbital sódico (Anestesal, Pfizer), 3 mg/100 g.

• Solución salina al 0.9 % (Pisa), 0.1 mL.

• Cianuro de sodio (NaCN, Sigma), 5 µg/100 g en 0.1 mL de sol. sal.

(Álvarez-Buylla y col., 1988).

51

• N-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME, Sigma), 250 µM en 0.1mL de sol.

sal. (Kadekaro, Terrell, Liu, Gestl, Bui, Summy-Long, 1998).

• Nitroprusiato de Sodio. (NPS, Sigma) 250 µg/100 g en 0.1mL de sol. sal.

(Iturriaga y col., 2000).

• Estreptozotocina. (Sigma) 50 mg/kg en 0.5 mL de sol. sal. i.p. (Szkudelski,

2001; Días, Porawski, Alonso, Marroni, Collado y González-Gallego, 2005).

TABLA 1. Protocolo para la determinación de nitritos.

BR (µL)

S1 S2 S3-7 P1 (µL)

Pn

1) Muestra o estándar - 200 1’) Agua 280 √ 2) Nitrato reductasa (5µl = 50mU) - 20 3) NADPH 25µM, EDTA 10mM EDTA - 20 4) Incubar a temperatura ambiente (30 min) - √ 5) Glutámico deshidrogenasa (5µl =100 mU) - 20 6) NH4CL 100 mM - 20

7) Ácido α-cetoglutárico 4 mM - 20 8) Incubar a temperatura ambiente (10 min) - √ 9) Ácido 5-sulfosalicílico al 6% - 60 10) Agitar cada 5 min durante 30 min - √ 11) Centrifugar a 10,000 rpm/15 min - √ 12) Alícuota de sobrenadante - 200 13) NH4Cl al 30% - 50 14) NaOH al 5% - 30 15) Reactivo de Griess 280 280 16) Incubar a temperatura ambiente (20 min) √ √ 17) Leer D. O. a 550 nm √ √

BR, agua con reactivo de Griess; D.O., densidad óptica en el espectrofotómetro; min, minutos; Pn; número de muestras experimentales; S, muestras estándar de la 1 a la 7.

52

Con las dosis mencionadas se produjo un efecto óptimo en estudios previos por

los autores citados.

Ratas diabéticas

Los animales diabéticos se pueden obtener por varios métodos (Álvarez-Buylla

y Carrasco-Zanini, 1960): la extirpación total del páncreas, la inyección i.p. o i.v. de

aloxano, y la inyección i.p. o i.v. de estreptozotocina (STZ). En este estudio se utilizó

la última opción por ser la menos traumática y menos tóxica para el organismo. La

inducción de la diabetes experimental en la rata utilizando fármacos que destruyen

selectivamente las células beta es un método muy conveniente y simple de llevar a

cabo, pero es necesario comprender los cambios que ocurren en las células beta del

páncreas, así como en todo el organismo, después de utilizar fármacos

diabetogénicos como el aloxano (2, 4, 5, 6-tetraoxipirimidina) o la estreptozotocina

(STZ) que tienen una acción citotóxica en los islotes del páncreas (Szkudelski,

Kandulkska, Okulicz, 1998). La acción tóxica del aloxano es la suma de varios

procesos oxidantes de grupos–SH esenciales, con inhibición de la glucocinasa y la

generación de radicales libres con alteraciones intracelulares en la homeostasis del

calcio. La STZ (2-deoxy-2-[3-(methyl1-3-nitrosoureido)-D-glucopiranosa] se sintetiza

por el Streptomycetes achromogenes, y se utiliza para inducir tanto la diabetes

mellitus tipo 1 (insulino-dependiente-IDDM) y como la tipo 2 (no insulino-

dependiente-NIDDM), según el momento de la inyección, la dosis empleada o su

frecuencia de inyección. Una dosis i.v. de STZ (40 a 60 mg/kg) en ratas adultas

puede inducir diabetes tipo 1 (Ganda, Rossini y Like, 1976), pero es posible utilizar

dosis mayores (Szkudelski, 2001). La STZ también se puede administrar por vía i.p.

en una dosis similar o mayor (Katsumata, Katsumata, Katsumata, 1992). Cuando se

inyectan 50 mg/kg de STZ por vía i.v. en ratas, 2 semanas después, la glucosa

sanguínea alcanza valores de 15 mmol/L (Szkudelski, 2001), y podemos considerar,

entonces, que la rata presenta diabetes. La STZ altera primero la oxidación de la

glucosa para ser captada por las células (Bedoya, Solano y Lucas, 1996), para

53

después disminuir la biosíntesis y sedcreción de insulina (Nukatsuka, Yoshimura,

Nishida, Kawada, 1990). Las células beta del páncreas captan la STZ a través del

transportador GLUT2, por lo que cuando se reduce la expresión de este

transportador, se previene la acción diabetogénica de la STZ (Thulesen, Orskov,

Holst, Poulsen, 1997). Este fármaco ocasiona cambios intracelulares en las células

beta, como fragmentación y alcalinización del DNA, hasta producir su muerte (Elsner,

Guldbakke, Tiedge, Munday, Lenzen, 2000).

Para verificar el establecimiento del estado diabético en el grupo de ratas que

recibieron la inyección de una dosis única de STZ (50 mg/kg peso, i.p., preparada

diariamente en una solución de citrato de sodio 10 mmol/L a pH 4.5), se realizó un

seguimiento de los niveles de de glucosa en la sangre total en ayuno durante 3 días

después de la inyección, tomando la muestra sanguínea de la vena de la cola. La

valoración de los niveles de glucosa, en estos casos, se realizó mediante una tira

reactiva (Accu-Chek). El principio de esta prueba consiste en la conversión, por la

enzima glucosa deshidrogenasa, de la glucosa en gluconolactona. La

gluconolactona crea una corriente eléctrica proporcional a la concentración de

glucosa en la sangre, que se lee en el medidor. Un nivel mayor de 14 mmol/L de

glucosa se consideró indicativo de diabetes tipo 1 de acuerdo a la literatura

anteriormente citada.

Protocolo experimental

Las ratas se dividieron al azar en 4 grupos, de 10 ratas cada uno; a su vez,

estos grupos se dividieron en dos subgrupos: ratas normales que recibieron una

inyección i.p. del vehículo para diluir la STZ (0.5 mL de citrato de sodio-pH 4.5), y

ratas diabéticas, que recibieron una inyección i.p. de STZ (50 mg/kg/0.5 mL de citrato

de sodio-pH 4.5) para alcanzar una concentración de glucosa en el plasma de 14

mmol/L o mayor. Los grupos se denominaron como:

54

- Control 1: a) dos inyecciones consecutivas de sol. sal. (100 µL) en el seno

carotídeo circulatoriamente aislado (15-20 s) en las ratas normales (n = 5); b)

mismas inyecciones que en “a” en las ratas diabéticas (n = 5).

- Control 2: a) estimulación de los RSCC con NaCN (5 µg/100 g/100 µL de sol.

sal.) en el seno carotídeo circulatoriamente aislado, seguida de una inyección

de sol. sal. (100 µL) en el mismo lugar (15-20 s) en las ratas normales (n = 5);

b) mismo procedimiento que en “a” en las ratas diabéticas (n = 5).

- Experimental 1: a) estimulación de los RSCC con NaCN (5 µg/100 g/100 µL

de sol. sal.) en el seno carotídeo circulatoriamente aislado, seguida de una

inyección de L-NAME (250 mM/100 µL de sol. sal.) en el mismo lugar (15-20

s) en las ratas normales (n = 5); b) mismo procedimiento que en “a” en las

ratas diabéticas (n = 5).

- Experimental 2: a) estimulación de los RSCC con NaCN (5 µg/100 g/100 µL

de sol. sal.) en el seno carotídeo circulatoriamente aislado, seguida de una

inyección de NPS (250 µg/100 g/100 µL de sol. sal.) en bolo en el mismo

lugar (15-20 s), en las ratas normales (n = 5); b) mismo procedimiento que en

“a” en las ratas diabéticas (n = 5).

Análisis estadístico

Las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando la prueba t de Student

comparando los valores experimentales con sus propias basales, y la prueba de

ANOVA con la prueba de Scheffè para la comparación múltiple. El nivel de

significancia se fijó en p < 0.05. En todas las gráficas los valores son medias

aritméticas y las líneas verticales representan los errores estándar. Las

probabilidades (valor de p) entre los datos reportados con respecto a su basal, se

calcularon como muestras pareadas.

55

RESULTADOS

Control 1. Inyección de sol. sal. por dos ocasiones en el seno carotídeo

circulatoriamente aislado

En condiciones basales, la concentración media de glucosa en la sangre arterial

en los subgrupos de ratas normales y diabéticas, fue de 126 ± 1 mg/dL y 456 ± 19

mg/dL, respectivamente; la concentración media de glucosa en la sangre venosa fue

de 115 ± 1 mg/dL en las ratas normales, y de 437 ± 16 mg/dL en las ratas diabéticas.

La retención de glucosa cerebral media fue de 11 ± 1 mg/dL en las ratas normales y

de 19 ± 4 mg/dL en las ratas diabéticas. Cuando se inyectó la sol. sal. (100 µL), en

el seno carotídeo circulatoriamente aislado, por dos ocasiones consecutivas, tanto en

las ratas normales como en las ratas diabéticas, no se observaron cambios

significativos en las concentraciones de glucosa arterial y venosa, ni en la retención

de glucosa cerebral en los tiempos estudiados (t = 4 min, t = 8 min, t = 16 min) (n = 5)

(tablas 2 y 3, figura 12A y B).

Tabla 2. Concentración de glucosa plasmática (mg/dL) en el grupo control 1.

Tiempo (min)

Ratas normales

(n=5)

Ratas diabéticas

(n=5)

Arterial

Venosa

Arterial

Venosa

-4

126 ± 1

115 ± 1

456 ± 19

437 ± 16

4 133 ± 2 122 ± 2 453 ± 22 436 ± 19

8 135 ± 2 123 ± 2 456 ± 23 438 ± 19

16 135 ± 2 122 ± 2 458 ± 24 438 ± 19

Se inyectó sol. sal. (100 µL) en dos ocasiones consecutivas en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (t = 0). Los datos se expresan como medias aritméticas ± EE (t de Student).

56

Tabla 3. Retención de glucosa cerebral (mg/dL) en el grupo control 1.

Tiempo (min)

Ratas normales

(n=5)

Ratas diabéticas

(n=5)

-4

11 ± 1

19 ± 4

4 11 ± 1 17 ± 3

8 12 ± 1 18 ± 5

16 13 ± 1 20 ± 6

Se inyectó sol. sal. (100 µL) en dos ocasiones consecutivas en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (t = 0). Los datos se expresan como medias ± EE (t de Student).

Con respecto a los niveles basales de nitritos en la sangre venosa cerebral, los

valores promedio observados en el subgrupo de las ratas normales fue de 0.6957 ±

0.089 nmol/mL, mientras que en el subgrupo de las ratas diabéticas fue de 0.1987 ±

0.062 nmol/mL. Después de las inyecciones de sol. sal. en el seno carotídeo

circulatoriamente aislado, no se observaron variaciones significativas (tabla 4 y figura 13A y 13 B).

Tabla 4. Concentración de nitritos (nmol/mL) en la sangre venosa cerebral en el grupo control 1.

Tiempo (min)

Ratas normales

(n=5)

Ratas diabéticas

(n=5)

-4

0.6957 ± 0.089

0.1987 ± 0.062

8 0.6892 ± 0.093 0.1782 ± 0.047

Se inyectó sol. sal. (100 µL) en dos ocasiones consecutivas en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (T = 0). Los datos se expresan como medias ± EE (t de Student).

57

Figura 12. Concentración de glucosa en el plasma y retención de glucosa cerebral en las ratas normales (A) y diabéticas (B) del grupo control 1. El tiempo cero (flecha) corresponde al momento de la inyección de 100 µL de solución salina (sol. sal.) por dos ocasiones de forma consecutiva en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (SCA). Los valores se expresan en medias aritméticas ± E.E. (t de Student).

-4 0 4 8 12 160

40

80

300

400

500

B

Ret

enci

ón d

egl

ucos

a (m

g/dL

)

Glu

cem

ia(m

g/dL

)

M in

-4 0 4 8 12 160

40

80

120

180

240

300

A Arterial Venosa- sol. sal. (100 µL)

- sol. sal. (100 µL) en el SCA

Glu

cem

ia

(mg/

dL)

Ret

enci

ón d

egl

ucos

a (m

g/dL

)

58

Figura 13. Concentración de nitritos en la sangre venosa cerebral en ratas normales (A) y diabéticas (B) del grupo control 1. La flecha indica el tiempo cero en el cual se inyectaron 100 µL de solución salina (sol. sal.) por dos ocasiones de forma consecutiva en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (SCA). Los valores se expresan en medias aritméticas ± E. E. (t de Student). Control 2. Estimulación de los RSCC con NaCN seguida de una inyección de sol. sal. en el seno carotídeo circulatoriamente aislado

Cuando se estimularon los RSCC con NaCN (5 µg/100 g/100 µL de sol. sal.) la

concentración media de glucosa en la sangre arterial en los subgrupos de ratas

normales y diabéticas, antes de la estimulación fue de 129 ± 1 mg/dL y 447 ± 17

mg/dL, respectivamente; la concentración media de glucosa en la sangre venosa fue

de 118 ± 3 mg/dL en las ratas normales, y de 430 ± 18 mg/dL en las ratas diabéticas.

La retención de glucosa cerebral media fue de 17 ± 2 mg/dL en las ratas normales y

de 17 ± 3 mg/dL en las ratas diabéticas. Después de la inyección de NaCN en el

seno carotídeo circulatoriamente aislado, se observaron cambios significativos en las

concentraciones de glucosa arterial y en la retención de glucosa cerebral tanto en las

ratas normales, como en las diabéticas. En las ratas normales, la glucosa arterial y

la retención de glucosa cerebral aumentaron de manera paulatina en todos los

tiempos estudiados (t = 4, t = 8 y t = 16) hasta llegar a 284 ± 5 mg/dL (t = 8, p =

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Min

A

80-4

- sol. sal. (100 µL)- sol. sal. (100 µL) en el SCA

Con

cent

raci

ón d

e ni

trito

s(n

mol

/mL)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

80-4

B

- sol. sal. (100 µL)- sol. sal. (100 µL) en el SCA

Min

59

0.00046) y 72 ± 4 mg/dL (t = 8 min, p = 0.016) respectivamente. En las ratas

diabéticas, la concentración de glucosa arterial también aumentó, llegando hasta 500

mg/dL ± 10 mg/dL en el t = 8 min (p = 0.0087), pero en la retención de glucosa

cerebral solo se observó un incremento significativo en el t = 16 min (p = 0.0086)

(tablas 5 y 6, figura 14A y 14B).

Tabla 5. Concentración de glucosa plasmática (mg/dL) en el grupo control 2.

Tiempo

Ratas normales

Ratas diabéticas

Arterial

Venosa

Arterial

Venosa

-4

129 ± 1

118 ± 3

447 ± 17

430 ± 18

4 151 ± 3** 127 ± 4 486 ± 13** 449 ± 20

8 217 ± 6** 166 ± 4 500 ± 10** 456 ± 18

16 284 ± 5*** 212 ± 3 503 ± 16* 460 ± 16

Se inyectó NaCN (5 µg/100 g/100 µL) y sol. sal. (100 µL) en forma consecutiva en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (t = 0). Los datos se expresan como medias aritméticas ± E. E. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 (t de Student).

Tabla 6. Retención de glucosa cerebral (mg/dL) en el grupo control 2.

Tiempo (min)

Ratas normales

(n=5)

Ratas diabéticas

(n=5)

-4

17 ± 2

17 ± 3

4 29 ± 2* 37 ± 8

8 51 ± 3* 44 ± 11

16 72 ± 4* 43 ± 7**

Se inyectó NaCN (5 µg/100 g/100 µL) y sol. sal. (100 µL) de forma consecutiva en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (t = 0). Los datos se expresan como medias aritméticas ± E. E. * p < 0.05, ** p < 0.01 (t de Student).

60

Figura 14. Concentración de glucosa en el plasma arterial y venoso, y retención de glucosa cerebral en ratas normales (A) y diabéticas (B) del grupo control 2. La flecha indica el tiempo cero en el cual se inyectaron el NaCN (5 µg/100 g/100 µL) y la sol. sal. (100 µL) de forma consecutiva en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (SCA). Note el aumento paulatino en las concentraciones de glucosa arterial y venosa (reflejo hiperglucémico) y la retención de glucosa en el tiempo. Los valores se expresan en medias aritméticas ± E. E. * p< 0.05, p < 0.01, p < 0.001 (t de Student contra sus propias basales).

-4 0 4 8 12 160

40

80

120

180

240

300

*

A

**

**

***

**

Arterial Venosa

- NaCN (5 µg/100 g/100 µL)- sol. sal. (100 µL) en el SCA

Ret

enci

ón d

egl

ucos

a (m

g/dL

)G

luce

mia

(mg/

dL)

-4 0 4 8 12 160

40

80

300

360

420

480

540 *B

*

****

Min

Ret

enci

ón d

egl

ucos

a (m

g/dL

) G

luce

mia

(m

g/dL

)

61

Con respecto a los niveles de nitritos en la sangre venosa cerebral, los valores

promedio encontrados en el subgrupo de las ratas normales fue de 0.6928 nmol/mL,

mientras que en el subgrupo de las ratas diabéticas fue de 0.1844 ± 0.041 nmol/mL.

Después de la estimulación con NaCN los nitritos en la sangre venosa cerebral

aumentaron significativamente en el t = 8 min hasta 1.4347 ± 0.17 (p = 0.019 t de

Student). Cuando comparamos este último valor con el obtenido en las ratas

normales del grupo 1 se observó un aumento significativo (p = 0.010) después de la

inyección de NaCN (N = 5); es decir, la estimulación anóxica elevó los niveles de

nitritos en la sangre procedente del cerebro (tabla 7, figura 13A y 15A).

Tabla 7. Concentración de nitritos (nmol/mL) en sangre venosa cerebral en el grupo control 2.

Tiempo (min)

Ratas normales

(n=5)

Ratas Diabéticas

(n=5)

-4

0.6928 ± 0.075

0.1844 ± 0.041

8 1.4347 ± 0.17** 1.1650 ± 0.223*

Se inyectó el NaCN (5 µg/100 g/100 µL) y la sol. sal. (100 µL), de forma consecutiva, en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (t = 0). Los datos se expresan como medias aritméticas ± E. E. * p < 0.05; ** p < 0.01 (t de Student con su propia basal).

Experimental 1. Estimulación de los RSCC con NaCN seguida de un inhibidor

de la NOS (L-NAME) en el seno carotídeo circulatoriamente aislado

La estimulación de los RSCC con NACN (5 µg/100 g en 100 µL de sol.sal.)

seguida de una inyección de un inhibidor de la NOS (L-NAME) (250 µM/100 µL) dio

como resultado la abolición del reflejo hiperglucemiante en todos los tiempos

estudiados en las ratas normales, por el contrario, en las ratas diabéticas se observó

un aumento significativo, desde una basal de 334 ± 19 mg/dL hasta alcanzar niveles

de 361 ± 19 mg/dL en el t = 4 min y 376 ± 19 mg /dL en el t = 8 min (p = 0.0086 y p =

62

0.0078, respectivamente) (tabla 8). La retención de glucosa por el cerebro no varió

significativamente durante el experimento (tabla 9). La concentración media de

glucosa basal en la sangre arterial en los subgrupos de ratas normales y diabéticas,

fue de 125 ± 5 mg/dL y 334 ± 19 mg/dL, respectivamente, mientras que la

concentración media de glucosa en la sangre venosa fue de 117 ± 4 mg/dL en las

ratas normales, y de 324 ± 21 mg/dL en las ratas diabéticas. La retención de glucosa

cerebral no varió significativamente durante el experimento, la basal media fue de 8 ±

3 mg/dL en las ratas normales y de 11 ± 4 mg/dL en las ratas diabéticas (n = 5)

(tablas 8 y 9, fig. 16A y 16B).

Figura 15. Concentración de nitritos en la sangre venosa cerebral en ratas normales (A) y diabéticas (B) del grupo control 2. La flecha indica el tiempo cero [inyección del NaCN - 5 µg/100 g/100 µL y de la sol. sal. - 100 µL, de forma consecutiva en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (SCA)]. Los valores se expresan en medias aritméticas ± E. E. (t de Student).

Con respecto a los niveles de nitritos en la sangre venosa cerebral, los valores

basales promedio encontrados en el subgrupo de las ratas normales fueron de

0.6390 ± 0.015 nmol/mL; después de la estimulación seguida por la infusión de un

inhibidor de la NOS, se observó un decremento significativo hasta 0.3011 ± 0.040

nmol/mL (p = 0.044), mientras que en el subgrupo de las ratas diabéticas fue de

0.3414 ± 0.103 nmol/mL en el t = -4 min y 0.1485 ± 0.097 nmol/mL en el t = 8 min

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

Con

cent

raci

ón d

e ni

trito

s(n

mol

/mL)

A

80-4

Min

**

- NaCN (5 µg/100 g/100 µL)- sol. sal. (100 µL)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

B

*

80-4

- NaCN (5 µg/100 g/100 µL)- sol. sal. (100 µL)

Min

63

(tabla 10, figura 17A y B). Al comparar el valor obtenido en las ratas normales

(control 2), después de la estimulación anóxica, con el valor obtenido en este grupo

en que se inyectó L-NAME después de una estimulación semejante (n = 5), se

registró un descenso significativo (p = 0.015) (tablas 7 y 10, figuras 15A y 17A).

Tabla 8. Concentración de glucosa plasmática (mg/dL) en el grupo experimental 1.

Tiempo

Ratas normales

Ratas diabéticas

Arterial

Venosa

Arterial

Venosa

-4

125 ± 5

117 ± 4

334 ± 19

324 ± 21

4 135 ± 7 122 ± 7 361 ± 19** 348 ± 19

8 141 ± 9 123 ± 10 376 ± 19** 357 ± 14

16 174 ± 20 141 ± 12 392 ± 35 366 ± 37

Se inyectó NaCN (5 µg/100 g/100 µL) y L-NAME (250 µM/100 µL) de forma consecutiva en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (t = 0). Los datos se expresan como medias ± E.E., ** p < 0.01 (t de Student).

Tabla 9. Retención de glucosa cerebral (mg/dL) en el grupo experimental 1.

Tiempo (min)

Ratas normales

(n=5)

Ratas diabéticas

(n=5)

-4

8 ± 3

11 ± 4

4 13 ± 3 14 ± 5

8 18 ± 3 19 ± 6

16 33 ± 10 26 ± 4

Se inyectó NaCN (5 µg/100 g/100 µL) y L-NAME (250 µM/100 µL) de forma consecutiva en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (t = 0). Los datos se expresan como medias aritméticas ± E. E. (t de Student).

64

Figura 16. Concentración de glucosa en el plasma arterial y venoso, y retención de glucosa cerebral en las ratas normales (A) y diabéticas (B) del grupo experimental 1. La flecha indica el tiempo cero, en el cual se inyectaron el NaCN (5 µg/100 g/100 µL) y el L-NAME (250 µM/100 µL) de forma consecutiva en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (SCA). Los valores se expresan en medias aritméticas ± E. E. ** p < 0.001 (t de Student).

-4 0 4 8 12 160

40

80

120

180

240

300

A - NaCN (5 µg/100 g/100 µL)- L-NAME (250 µM/100 µL) en el SCA

Ret

enci

ón d

e g

luco

sa (m

g/dL

)

Arterial Venosa

Glu

cem

ia(m

g/dL

)

-4 0 4 8 12 160

40

80

300

350

400

450B

****

Ret

enci

ón d

egl

ucos

a (m

g/dL

) G

luce

mia

(m

g/dL

)

M in

65

Tabla 10. Concentración de nitritos (nmol/mL) en la sangre venosa cerebral en el grupo experimental 1.

Tiempo (min)

Ratas normales

(n=5)

Ratas diabéticas

(n=5)

-4

0.6390 ± 0.015

0.3414 ± 0.103

8 0.3011 ± 0.040* 0.1485 ± 0.097*

Se inyectó NaCN (5 µg/100 g/100 µL) y L-NAME (250 µM/100 µL) de forma consecutiva en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (t = 0). Los datos se expresan como medias aritméticas ± E. E. * p < 0.05 (t de Student con su propia basal).

Figura 17. Concentración de nitritos en la sangre venosa cerebral en las ratas normales (A) y diabéticas (B) del grupo experimental 1. La flecha indica el tiempo cero, en el cual se inyectaron el NaCN (5 µg/100 g/100 µL) y el L-NAME (250 µM/100 µL) de forma consecutiva en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (SCA). Los valores se expresan en medias aritméticas ± E. E. * p < 0.05 (t de Student). Experimental 2: Estimulación de los RSCC con NaCN seguida de un donador

del NO (NPS) en el seno carotídeo circulatoriamente aislado.

La estimulación de los RSCC con NaCN (5 µg/100 g en 100 µL de sol. sal.),

seguida de una inyección de NPS (donador de NO) (250 µg/100 g/100 µL) en el

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

A

Min

-40-4

*

- NaCN (5 µg/100 g/100 µL)- L-NAME (250 µM/100 µL)

Con

cent

raci

ón d

e ni

trito

s(n

mol

/mL)

-4 0 40,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

*

- NaCN (5 µg/100 g/100 µL)- L-NAME (250 µM/100 µL)

B

Min

66

SCA, dio como resultado un incremento en el reflejo hiperglucemiante con retención

de glucosa por el cerebro cuando este grupo experimental se comparó con el grupo

control 2 (sólo estimulación de los RSCC) en los tiempos t = 8 min (p = 0.015,

ANOVA) y t = 16 min (p = 0.033, ANOVA) en las ratas normales (figura 19). En

efecto, las concentraciones de glucosa en la sangre arterial subieron desde 126 ± 1

Tabla 11. Concentración de glucosa plasmática (mg/dL) en el grupo experimental 2.

Tiempo

Ratas normales

Ratas diabéticas

Arterial

Venosa

Arterial

Venosa

-4

126 ± 1

110 ± 1

410 ± 22

395 ± 21

4 169 ± 2*** 127 ± 5 447 ± 25* 418 ± 27

8 236 ± 11*** 154 ± 7 488 ± 18** 449 ± 22

16 303 ± 5*** 196 ± 10 473 ± 28 446 ± 34

Se inyectó NaCN (5 µg/100 g/100 µL) y NPS (250 µg/100 g/100 µL) de forma consecutiva en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (t = 0). Los datos se expresan como medias aritméticas ± E. E. ** p < 0.01, *** p < 0.001 (t de Student).

mg/dL hasta 303 ± 5 mg/dL en el t = 16 min (p = 0.00024); en la sangre venosa se

observó un aumento desde 110 ± 1 hasta 196 ± 10 mg/dL en el t = 16 (p = 0.0035, t

de Student). Por el contrario, en las ratas diabéticas no se observó dicho

incremento, pero la concentración de glucosa arterial después de la estimulación

anóxica aumentó significativamente desde 410 ± 22 mg/dL hasta 488 ± 18 mg/dL en

el t = 8 min con respecto a sus valores basales (p = 0.0017, t de Student). La

retención de glucosa por el cerebro en las ratas normales, también aumentó

significativamente en todos los tiempos estudiados, desde 16 ± 2 mg/dL hasta 107 ±

4 mg /dL en el t = 16 min (p = 0.0015, t de Student) (n = 5) (tablas 11 y 12, figura 18A y B).

67

Tabla 12. Retención de glucosa cerebral (mg/dL) en el grupo experimental 2.

Tiempo (min)

Ratas normales

(n=5)

Ratas diabéticas

(n=5)

-4

16 ± 2

15 ± 1

4 42 ± 5* 29 ± 7

8 82 ± 8** 39 ± 7*

16 107 ± 4*** 27 ± 7

Se inyectó NaCN (5 µg/100 g/100 µL) y NPS (250 µg/100 g/100 µL) de forma consecutiva en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (t = 0). Los datos se expresan como medias aritméticas ± E.E. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p<0.001 (t de Student).

Tabla 13. Concentración de nitritos (nmol/mL) en la sangre venosa cerebral en el grupo experimental 2.

Tiempo (min)

Ratas normales

(n=5)

Ratas diabéticas

(n=5)

-4

0.947 ± 0.304

0.3078 ± 0.083

8 1.850 ± 1.160* 1.2713 ± 0.305**

Se inyectó NaCN (5 µg/100 g/100 µL) y NPS (250 µg/100 g/100 µL) de forma consecutiva en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (t = 0). Los datos se expresan como medias aritméticas ± E. E. * p < 0.05, ** p < 0.01 (t de Student).

Con respecto a los niveles de nitritos en la sangre venosa procedente del

cerebro los resultados obtenidos fueron los siguientes: el promedio basal en las ratas

normales fue de 0.947 ± 0.304 nmol/mL, mientras que en el grupo de las ratas

diabéticas fue de 0.3078 ± 0.083 nmol/mL; después de la estimulación RSCC y el

NPS en el SCA los valores aumentaron significativamente hasta 1.850 ± 0.160

nmol/mL (p = 0.035) y 1.213 ± 0.305 nmol/mL (p = 0.023), respectívamente (tabla 13, figura 19A y B).

68

Figura 18. Concentración de glucosa en el plasma arterial y en el venoso, y retención de glucosa cerebral en las ratas normales (A) y diabéticas (B) del grupo experimental 2. La flecha indica el tiempo cero en el cual se inyectó el NaCN (5 µg/100 g/100 µL) y el NPS (250 µg/100 g/100 µL) de forma consecutiva en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (SCA). Los valores se expresan en medias aritméticas ± E. E. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p< 0.001 (t de Student).

-4 0 4 8 12 160

40

80

120

180

240

300

A

***

*

***

***

***

**

- NaCN (5 µg/100 g/100 µL)- NPS (250 µg/100 g/100 µL) en el SCA

Ret

enci

ón d

egl

ucos

a (m

g/dL

)

Arterial Venosa

Glu

cem

ia(m

g/dL

)

-4 0 4 8 12 160

40

80

300

360

420

480

540B

Ret

enci

ón d

egl

ucos

a (m

g/dL

)G

luce

mia

(mg/

dL)

Min

*

***

69

Figura 19. Concentración de nitritos en la sangre venosa cerebral en ratas normales (A) y diabéticas (B) del grupo experimental 2. La flecha indica el tiempo cero en el cual se inyectó el NaCN (5 µg/100 g/100 µL) y el NPS (250 µg/100 g/100 µL) de forma consecutiva en el seno carotídeo circulatoriamente aislado (SCA). Los valores se expresan en medias aritméticas ± E. E. * p < 0.05 (t de Student).

Comparación de la retención de glucosa cerebral entre los grupos control 2 y

experimentales 1 y 2.

Al comparar los dos grupos experimentales con el control 2, en el que solo se

produjo una anoxia histotóxica en el SCA (comparación múltiple por ANOVA, con la

prueba de Scheffè), no se observaron diferencias significativas en el t = 4 min (p =

0.073 y 0.197 respectívamente), pero la comparación en los t = 8 min y t = 16 min si

fue significativa (p = 0.09 y p = 0.015 respectivamente). Cuando se aplicó un

inhibidor de la NOS en el SCA, se observó una clara inhibición del efecto de

retención de glucosa cerebral después de la estimulación RSCC solo en las ratas

normales. Por el contrario, la infusión del NPS en el SCA después de la estimulación

con NaCN incrementó el efecto de la retención de glucosa por el cerebro en las ratas

normales anestesiadas, mientras que en las ratas diabéticas anestesiadas los

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

2,4

2,8

3,2

B

*

80-4Min

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

2,4

2,8

3,2

A

*

80-4

Con

cent

raci

ón d

e ni

trito

s(n

mol

/mL)

MIn

70

valores se mantuvieron sin cambio (figura 20A y B). La comparación entre los dos

grupos experimentales en las ratas normales dio diferencias significativas en todos

los tiempos estudiados (p = 0.003, p = 0.000 y p = 0.000).

Figura 20. Comparación de las retenciones de glucosa cerebral en las ratas normales (A) y diabéticas (B) después del NaCN (5 µg/100 g/100 µL) en el SCA (C2), o después de la misma estimulación de los RSCC seguida por L-NAME (250 µM/100 µL) (E1), o después de la misma estimulación de los RSCC seguida por NPS (250 µg/100 g/100 µL) (E2). Los valores se expresan como medias aritméticas ± E. E. * + p < 0.05; ** ++ p < 0.01, +++ p < 0.001 (ANOVA); *se comparan las curvas entre E1 y E2 contra C2; + se comparan las curvas E1 y E2 entre sí.

0

20

40

60

80

100

120

++

+++

+++

A

*

*

*

**

1684-4

Ret

enci

ón d

e gl

ucos

a (m

g/dL

)

Min

0

20

40

60

80

100

120

B C2 E1 E2

1684-4Min

71

DISCUSIÓN

En este trabajo se presentan evidencias sobre el efecto del NO en el SCA

modificando el reflejo hiperglucémico con retención de glucosa por la estimulación de

los RSCC in situ en ratas normales y diabéticas. La estimulación de los receptores

seno-cuerpo carotídeo (RSCC) aumentó los niveles de glucosa en las sangres arterial

y venosa en las ratas anestesiadas normales y diabéticas por STZ. Esta maniobra

motivó, también, un incremento en los niveles de nitritos en la sangre venosa

procedente del encéfalo. Cuando se valoró la respuesta a la infusión de un inhibidor

de la NOS (L-NAME) o un donador del NO (NPS) en el SCA, se encontró que el

primero inhibió significativamente los efectos de la estimulación de los RSCC, en

tanto que el donador del NO los incrementó significativamente. Por lo que respecta a

las variables glucémicas, estos efectos o no se observaron, o disminuyeron

significativamente en las ratas diabéticas.

Las ratas diabéticas por STZ constituyen un modelo experimental bien

caracterizado para estudiar la diabetes tipos I y 2, valorando tanto el metabolismo

como las funciones vasculares de los animales (Wu y Meininger, 1995; Ozcelikay,

Tay, Guner, Tasyaran, Yildizoglu-Ari y Altan, 2000). El CC está formado por tejido

neuroepitelial y exhibe algunas características semejantes a los tejidos de las

glándulas endocrinas (Lawson, 1980; Paulding y col., 2002), precisamente, una de las

propiedades de la diabetes mellitus es la disfunción endotelial, que resulta en una

producción deficiente de NO (DeVriese, Verbeuren, Van de Voorde, Lamiere y

Vanhoutte, 2000). Estos hechos indicarían que este radical libre diatómico interviene

en la diabetes insulino-dependiente (Welsh y Sandler, 1994) incrementando la

sensibilidad a la insulina y mejorando, por lo tanto, la homeostasis de la glucosa

(Kohli, Meininger, Hayness, Yan, Self y Wu, 2004).

La presencia de peroxinitritos, formados espontáneamente cuando coexisten el

NO y el superóxido, llevó a suponer que estos compuestos tenían un efecto

72

coadyuvante en la destrucción de las células beta del páncreas durante las

inyecciones de STZ (Yamamoto, Uchigata y Okamoto, 1981). Si bién, en

determinadas condiciones experimentales, el NO se encuentra involucrado en los

efectos de la STZ, cuando se utiliza en una sola dosis, como en este trabajo, este

fármaco no participa de manera directa en la destrucción de las células beta del

páncreas para inducir la diabetes (Flodström, Tyrberg, Eizirik y Sandler, 1999;

Papaccio, Pisanti, Latronico, Ammendola y Galdieri, 2000); pero no se debe descartar

que en un proceso citotóxico como este, sean varias estructuras las que participen en

la destrucción de los islotes de Langerhans. La metodología empleada para obtener

las ratas diabéticas fue adecuada, y como se puede observar en todas las tablas del

presente trabajo, los niveles de glucosa basales, en ayuno, en las ratas diabéticas,

fueron significativamente mayores que los de las ratas normales (p = 0.0029). El

valor promedio de los niveles de glucosa venosa para las ratas diabéticas

anestesiadas fue de 437 ± 16 mg/dL, mientras que en las ratas normales

anestesiadas fue de 114 ± 1 mg/dL. Los valores de la glucemia venosa obtenidos en

las ratas diabéticas de este estudio se encuentran por encima de los reportados en

trabajos anteriores (274 ± 12 mg/dL). Esta diferencia puede deberse a la cepa de

ratas utilizadas y al tiempo que transcurre entre la inyección i.p. de STZ y el desarrollo

experimental en los estudios consultados (ratas Wistar, 7 días) (Rajasekaran,

Sivagnanam y Subramanian, 2005). Los procedimientos quirúrgicos generales

empleados en estos experimentos no motivaron cambios significativos en los niveles

de pO2 pCO2 y pH en la sangre arterial (Montero, 2006), por lo que los efectos del

NaCN en el SCA se deben atribuir a la estimulación de los quimiorreceptores del CC

(Eyzaguirre y Zapata, 1984) ya que la concentración utilizada de NaCN no estimula a

los barorreceptores (Álvarez-Buylla, 1954).

El NaCN provocó una anoxia histotóxica en las células tipo 1 o glómicas del CC,

es decir, simuló un efecto hipóxico, sin disminuir los niveles de O2. A diferencia de

experimentos anteriores in vitro en que se induce una hipoxia directamente en la

solución de perfusión; en estos casos, la disminución de O2 bloquea los canales de K+

sensibles al O2, provocando la despolarización de la membrana de las células del CC

73

para activar a los canales de Ca2+ dependientes de voltaje (aumenta el Ca2+

intracelular de manera directa); el Ca2+q es utilizado para liberar ell transmisor por

exocitosis con la consiguiente excitación de las fibras del NSC (Sato, Ikeda, Yoshizaki

y Koyano, 1991; Stea y Nurse, 1991; Acker, 1994). Normalmente, la hipoxia aguda

inhibe la actividad enzimática, y por el contrario, la hipoxia crónica la estimula,

constituyendo este proceso un mecanismo de defensa homeostático (Schmidt, 2002).

Cabe mencionar que en los experimentos aquí presentados, el animal tiene

respiración asistida, es decir, está ventilado con una pO2 tisular adecuada, por lo que

se piensa que en estas condiciones no entran en juego los mecanismos antes

citados.

El NO y el cianuro comparten vías de acción similares para inhibir la actividad

de la cit-c, y compiten por el O2 para regular la respiración mitocondrial (Brown,

2001). Es posible, entonces, que los mecanismos en los que interviene el NO como

neurotransmisor, participen en la homeostasis energética en forma semejante a lo

sugerido para el O2 (Clementi y col., 1999). En el CC, una vez que el NO difunde

hacia las células del glomus, inhibe a la cit-c y bloquea la CR alterando el potencial

electroquímico mitocondrial para liberar Ca2+ al citoplasma y estimular la migración

de las vesículas que almacenan la dopamina para su exocitosis (López-Barneo y

col,, 2001) (Figura 21). Trabajos anteriores sugieren que existe una interacción NO-

O2 como parte de un mecanismo de inhibición que modula la quimiorrecepción

carotídea. Además de su efecto inhibidor, el NO tiene un efecto dual que depende

de la presión parcial de O2. Durante la hipoxia el NO es un modulador inhibitorio,

mientras que durante la normoxia aumenta la actividad quimiorreceptora (Iturriaga,

2001).

Debido a la alta difusión y degradación del NO, los efectos biológicos que

desencadena este neurotransmisor son difíciles de interpretar, además, las

concentraciones utilizadas en experimentos in vitro varían considerablemente de las

que se pueden encontrar in vivo (Kelm, 1999; Schulz, Kelm y Heusch, 2004) como es

el caso de los experimentos aquí presentados.

74

Figura 21. Esquema hipotético de un modelo de la membrana de las células del CC

sensibles al oxígeno.

Por su capacidad de enlace con los compuestos hemo que compiten por el O2, el

NO puede mimetizar las respuestas de los CC a cambios en la pO2 (Katayama,

Chugh, Mokashi, Ray, Bebout y Lahiri, 1994), y durante la hipoxia crónica la expresión

de la NOS depende del nivel de hipoxia o de glucopenia, así como del tiempo real de

la exposición a dichos niveles de O2 o de glucosa ya sea en la sangre o en el medio

de cultivo (Schmidt, 2002).

La detección de O2 es de vital importancia para la sobrevida celular debido al

papel central del O2 como aceptor de electrones en la CR de la mitocondria, haciendo

posible la síntesis de ATP por medio de la fosforilación oxidativa, por lo que la falta de

O2 participa en forma crítica en la patogénesis de las principales causas de

mortalidad, como el infarto cerebral, el infarto de miocardio o la enfermedad pulmonar

crónica. La hipoxia aguda desencadena rapidamente ajustes contrarreculatorios

respiratorios y cardiovasculares (en la escala de segundos a un min). Respuestas

agudas que dependen de la modulación en los canales iónicos regulados por O2, que

se expresan preferencialmente en células específicas como los quimiorreceptores del

CC. La exposición de los CC a inhibidores del transporte de electrones (NaCN) que

Fibraaferente

Célula delglomus

Dopamina

[Ca ]2+

SNC

Núcleo

Mitocondria

ON

75

impiden la fosforilación oxidativa, aumenta la actividad en el NSC (López-Barneo y

col, 2001). El hecho fundamental para considerar la hipótesis mitocondrial como

primordial en la detección de los cambios de O2 es que la hipoxia reduce la actividad

de la cit-c en la mitocondria, con liberación de Ca2+ y secreción de neurotransmisores

(Chandel y Schumacker, 2000). El cianuro actúa a nivel mitocondrial de manera

semejante al NO, con la diferencia de que la concentración de NO en condiciones

normales se encuentra limitada a las concentraciones de la NOS, mientras que el

cianuro se administra en concentraciones tóxicas para producir un bloqueo total en la

CR que impide la transferencia de electrones y la salida de H+; al irse acumulando los

H+ en la matriz mitocondrial, baja el potencial de membrana mitocondrial y el potencial

electroquímico para iniciar la liberación de Ca2+ evitando su recaptura (Ghafourifar y

col., 2001). Las células glómicas in vitro responden a la hipoxia aumentando la

producción de NO, por un incremento en la producción de NOSe que se activa por la

entrada de Ca2+ (Ye, Tipoe, Fung, Fung, 2002); la presencia del NO en las

mitocondrias sugiere que la regulación hipóxica es a través de esta molécula (Di

Giulio, Grilli, Ciocca, Macri, Daniele, Sabatino, Cacchio, De Lutis, Da Porto, Di Natale

y Felaco, 2000; Yamamoto y col., 2006).

Aunque en las células del glomus carotídeo no se ha demostrado la presencia de

canales sensibles a potasio TASK-semejantes (modulados por ATP), las células 1 del

CC expresan el canal de potasio (KB) con propiedades similares a los canales TASK

(Williams y Buckler, 2004), por lo que su modulación por medio de neurotransmisores

tiene una influencia marcada sobre estas células y abre la posibilidad de que la

señalización del NO esté ligado a estos canales (Varas y col., 2007). Canales

semejantes son los reponsables de la función sensora de las células

quimiorreceptores en el locus coeruleus y en neuronas serotoninérgicas del núcleo

rafé (Washburn, Bayles, Guyenet, 2003).

En el grupo control 1, en el que las ratas normales y/o diabéticas se mantuvieron

en las condiciones experimentales, sin estimular los RSCC, no se observaron

cambios significativos en las variables estudiadas; los niveles de la glucosa y de los

76

nitritos permanecieron estables. Por el contrario, en el grupo control 2, cuando las

ratas recibieron una infusión de sol.sal. en el SCA después de estimular los RSCC

con NaCN, tanto las concentraciones de la glucosa arterial y venosa, como las

diferencias a-v de glucosa cerebral (retención de glucosa por cerebro) se elevaron

significativamente en ambos subgrupos de ratas. Estos resultados, confirmaron la

participación de los RSCC en la homeostasis de la glucosa (Álvarez-Buylla y de

Álvarez-Buylla, 1990; Montero, 1998; Montero y col., 2000; Cadenas, 2003), aunque,

en las ratas diabéticas el efecto sobre la retención de glucosa cerebral fue

significativamente menor y se presentó con mayor latencia. El comportamiento

observado en las ratas diabéticas recapitula un punto toral en el estudio de la

diabetes mellitus insulina-dependiente con el síndrome de resistencia a la insulina

(DeFronzo, 1988); los datos de esta tesis indican que las vías nitroxidérgicas

centrales podrían estar regulando y manteniendo la homeostasis de la glucosa en los

niveles de euglucemia, por lo que las alteraciones en dichas vías participarían en la

etiopatogénesis de ciertas formas de resistencia a la insulina, de manera semejante a

lo reportado por Dallaire y Marette (2002) en el sentido de que el NO es el eslavón

perdido entre la obesidad y el desarrollo de la resistencia a la insulina en la diabetes.

Por consiguiente, se puede considerar que el daño en las vías nitroxidérgicas

aferentes desde el cuerpo carotídeo pudiera estar relacionado con alteraciones en las

vías nitroxidérgicas eferentes, estrechamente vinculadas con alteraciones en el

metabolismo de la glucosa (Shankar y col., 1998). Es probable que el nivel tan alto

de glucosa arterial en la sangre que baña a los CC modifique su estructura,

disminuyendo la sensibilidad a la hipoxia histotóxica que representa la inyección de

NaCN. Aunque el descenso de glucosa activa a la NOSmt (Horn, Wolf, Duffy, Weiss,

Keilhoff y MacVicar, 2002), la hiperglucemia baja los niveles de NO en las

mitocondrias (Brodsky y col., 2002). Estos resultados no están relacionados con el

desarrollo de una neuropatía de las vías nerviosas aferentes y efectoras, ya que la

duración del estado diabético fue de solo 3 o 4 días y son necesarios más de 30 para

que aparezca este daño (Ferlito y Gallina, 1998; Dobretsov, Romanovsky y Stimers,

2007). La estimulación de los RSCC, por sí sola, elevó significativamente los niveles

de nitritos en el plasma de las ratas normales y diabéticas, indicando que el estímulo

77

a los RSCC con NaCN activa la producción del NO, no sólo en condiciones de

normoglucemia (Cadenas, 2005; Montero y col., 2006), sino también en condiciones

de hiperglucemia.

Durante la hipoxia intermitente, la NOSi contribuye para prevenir el daño por

isquemia/reperfusión; es decir, a diferencia de lo que ocurre con la hiperglucemia,

durante la isquemia se produce un aumento compensatorio de los nitritos en el tejido

cerebral (Bolanos y Almeida, 1999). Iturriaga y col. (2000) y otros (Tuzgen, Tanriover,

Uzan, Tureci, Tanriverdi, Gumustas, y Kuday, 2003) encuentran una reducción en la

producción del NO sólo en el inicio de la hipoxia (antes de 1 min). Ante la hipoxia

central y/o periférica en las ratas, se produce la activación de la expresión de genes

NOSn, con aumento de las proteínas NOS en las neuronas periféricas y centrales,

para aumentar la generación del NO (Prabhakar y col., 1996; Shibata, Araki, Hamada,

Sasaki, Shimazu y Fukuuchi, 1996). Es probable que el incremento de los nitritos que

observamos en nuestras ratas normales y diabéticas anestesiadas después de la

estimulación de los RSCC sea indicativo de este efecto homeostático.

Como ya se señaló, la L-arginina representa el substrato fisiológico responsable

de la síntesis del NO catalizada por la NOS (Pieper, 1998), y es interesante observar

que tanto en las ratas como en los humanos diabéticos, los niveles de L-arginina se

encuentran por debajo de los encontrados en los organismos normales (Ardawi, 1995;

Pieper y Dondlinger, 1997). En este trabajo, los niveles de nitritos en la sangre

procedente del SNC fueron siempre menores en las ratas diabéticas que en las ratas

normales en condiciones basales, es decir, antes de producir la hipoxia histotóxica en

el SCA. El descenso en los niveles de los nitritos podría correlacionarse, también,

con el aumento de la distancia de difusión entre la sangre y las mitocondrias que tiene

lugar en la diabetes (Habeck, Huckstorf, Behm, 1988), o con el daño que sufren los

propios CC (Lei y col., 2007). Sin embargo, la explicación más plausible es que la

hiperglucemia y/o la diabetes producen una disminución en la actividad de la NOS y

consecuentemente una disminución del NO, por un aumento de la PKA que provoca

78

la translocación de la proteína de choque térmico necesaria para la actividad de la

NOS (Lei y col., 2007).

Estimulación de los RSCC simultáneamente con la infusión de un inhibidor de la

NOS (L-NAME) en el seno carotídeo circulatoriamente aislado

La infusión de un inhibidor de la NOS como es el L-NAME en el SCA

inmediatamente después de la estimulación de los RSCC (experimental 1) abolió el

reflejo hiperglucemiante observado en las ratas normales anestesiadas después de la

estimulación de los RSCC. Tanto los niveles de glucosa en la sangre como la

retención de glucosa por el cerebro permanecieron sin cambios significativos. Es

interesante observar, que en las ratas diabéticas anestesiadas de este mismo grupo

sí hubo una hiperglucemia arterial significativa (con respecto a sus valores basales)

pero fue menos importante y se presentó con una latencia mayor que lo encontrado

para las ratas sanas. Esta respuesta es controversial y puede explicarse por el

incremento en la expresión de diversas NOS con aumento en los niveles de NO

observado in vitro en los CC de las ratas diabéticas (Bianchi y col., 2003). Es posible

que la dosis de L-NAME, utilizada en este trabajo, fuera insuficiente para inhibir la

gran concentración de la NOS reportada en las ratas diabéticas en el estudio anterior.

Será interesante estudiar en el futuro un grupo de ratas diabéticas, utilizando

concentraciones mayores a 250 µM de L-NAME para abolir el reflejo hiperglucémico,

caracterizando y cuantificando las NOS en los CCs extirpados al final de los

diferentes protocolos experimentales.

El L-NAME en el SCA inhibió el reflejo hiperglucemiante en las ratas normales,

efecto que se puede explicar por la reducción en los niveles de NO a nivel

mitocondrial inducido por el L-NAME (Tong, Wang y Cheng, 1997). Se sabe que el

L-NAME aumenta la amplitud de la respuesta a la hipoxia en las células del glomus

in vitro (Valdés y col., 2003), y no cambia la respuesta secretora de las células del

glomus a la hipoxia (Ortega-Sáenz, García-Fernández, Pardal, Álvarez y López-

79

Barneo, 2003). Es decir, el NaCN necesita de la presencia concomitante del NO

para realizar su efecto tóxico. El bloqueo de la NOS con L-NAME (20 mg/kg, i.p.)

incrementa los niveles plasmáticos de insulina y glucosa arterial, sugiriendo la

participación del NO en la homeostasis de la glucosa en forma independiente a la

secreción de insulina, por un efecto compensador del NO, más prominente en esta

función homeostática (Tong y col., 1997). La relación NO/O2 en la mitocondria debe

jugar un papel fisiológico crucial en la sensibilidad al oxígeno, y en la homeostasis de

la glucosa en las ratas (Tong y col., 1997). Los resultados de esta tesis en relación

con los efectos del L-NAME en el CC difieren de los encontrados por Buerk y Lahiri

(2000) en preparaciones in vitro, donde no encuentran hiperglucemia cuando

aumentan las descargas en el NSC después de la perfusión con L-NAME en

condiciones de hipoxia; es posible que en estas condiciones, la falta de O2 (20%)

produzca alteraciones en la homeostasis celular. En cambio, en los experimentos

realizados in vivo, en condiciones fisiológicas, y con una pO2 normal, el NaCN

generador de la hipoxia histotóxica, inhibió la CR mitocondrial mediante un bloqueo

selectivo de la citocromo c oxidasa (cit-c) (Leavesley y col., 2007).

Los nitritos en la sangre venosa cerebral disminuyeron en ambos subgrupos de

ratas, indicando que el L-NAME inhibe la producción del NO, tanto durante la

normoglucemia como durante la hiperglucemia, como se ha reportado en trabajos

previos de este laboratorio y otros (Valdés y col., 2003; Cadenas y col., 2003; Montero

y col., 2006).

Estimulación de los RSCC simultáneamente con la infusión de un donador del

NO (NPS) en el seno carotídeo circulatoriamente aislado

En la segunda serie experimental, se hizo la estimulación de los RSCC

acompañada de una infusión de un donador de NO (NPS) en el SCA de ratas

normales y diabéticas. Se observó una respuesta del reflejo hiperglucemiante mucho

más robusta con respecto a lo observado en las ratas normales con estimulación de

80

los RSCC sin el donador; es decir, las concentraciones de glucosa arterial fueron

mayores en el primer caso que en el segundo. El NO aumentó la actividad

quimiorreceptora ante un estímulo hipóxico a los RSCC reforzando el reflejo

hiperglucemiante con aumento en la retención de glucosa cerebral en las ratas

normales. Es posible que las concentraciones de NO liberado por el NPS alteren la

cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa en las mitocondrias de

las células del glomus (Iturriaga y col, 2000). Este aumento en la respuesta al NO

podría deberse al aumento de Ca2+ intracelular a través de la interacción del NO

sobre la GC soluble y el GMPc para activar a las fosfolipasas, y la formación de

bifosfato de inositol (IP2) y trifosfato de inositol (IP3) con la consiguiente liberación de

Ca2+ desde el retículo endoplásmico (Koesling y Friebe, 2000), para favorecer la

exocitosis y la liberación de dopamina u otros neurotransmisores de las células

glómicas (Horn y col., 2002). Otra explicación posible para el efecto sinérgico del NO

con el cianuro, observado unicamente en las ratas normales, sería el bloqueo de la

cit-c por el NO en la cadena CR (Leist, Single, Naumann, Fava, Simon, Kuhnle y

Nicotera, 1999), con el desarrollo de un déficit de ATP (Brookes, Bolanos y Heales,

1999), sufrimiento metabólico de las células y su despolarización. Como hemos visto,

el aumento en la concentración de Ca2+ intracelular para la liberación del

neurotransmisor puede provenir del exterior a través del NO aportado por el NPS, en

respuesta a la despolarización por el estímulo anóxico, y de las mitocondrias. Es

probable que el bloqueo de la CR provoque un predominio de la glucólisis anaeróbica

con la producción de ácido láctico, acidosis y el cierre de los canales de K+ (Buckler y

Vaughan-Jones, 1994). Aunque se conoce el papel del NaCN para inhibir

selectivamente la actividad de la cit-c (Ikegaya, Iwase, Hatanaka, Sakurada, Yoshida

y Takatori, 2001), su papel exacto en la quimiotransducción sensorial y

particularmente en la homeostasis de la glucosa estaría por definirse. No obstante, la

presencia necesaria del NO en el CC para que los quimiorreceptores respondan al

estímulo anóxico del cianuro en las ratas normales, en las ratas diabéticas este efecto

se enmascara por la hiperglucemia con un probable aumento en la producción de

ATP que compensa el sufrimiento metabólico durante la anoxia y disminuye la

actividad quimiorreceptora. Los resultados observados en los niveles de nitritos en el

81

plasma venoso cerebral después del NaCN y el NPS en el SCA en las ratas normales

y diabéticas, sugieren que el efecto del NO en las ratas normales es sinérgico al

efecto anóxico sobre la captación de glucosa por el cerebro.

Los resultados encontrados in vivo difieren con lo observado in vitro por otros

investigadores utilizando como donador del NO a la S-nitro-N-acetilpenicilamina

(SNAP) (Chugh y col, 1994; Wang y col., 1994; Alcayaga y col., 1997). El SNAP

redujo la descarga basal quimiosensora en el CC de gatos perfundidos in vitro

durante la hipoxia. La diferencia más importante entre estos dos tipos de

experimentos sería la presencia, en condiciones normales de oxigenación, de los

vasos sanguíneos y el tejido de músculo liso, que participan en la irrigación de los

tejidos con la aportación de hormonas, metabolitos, y nutrientes diversos, que

modifican las respuestas en el caso de los experimentos in vivo (Batrakova, Miller, Li,

Alakhov, Kabanov y Elmquist, 2001). Durante la normoxia la inyección de donadores

del NO incrementa la descarga quimiosensora en relación a la dosis, mostrando un

efecto dual del NO en el CC dependiente de los niveles de la pO2 (Iturriaga,

Villanueva, Mosqueira, 2000). El NPS en el seno carotídeo después de la

estimulación de los RSCC produjo incrementos en la glucemia arterial y en la

captación de glucosa por el cerebro mayores que los incrementos encontrados

únicamente con la estimulación de los RSCC tanto en las ratas normales como en

las diabéticas (control 2) (p = 0.015, t = 8 min). En trabajos anteriores de este

laboratorio el NPS infundido en la cisterna magna sin estimulación de los RSCC

produjo, también, indujo un incremento en la captación de glucosa cerebral

(Cadenas, 2003; Montero y col., 2006).

En las ratas diabéticas el NPS no reforzó el reflejo hiperglucemiante con

aumento en la retención de glucosa inducido por el NaCN, indicando, como ya se

dijo, que en condiciones de hiperglucemia la inhibición de la NOS disminuye la

síntesis de NO (Brodsky y col., 2002). La inhibición de la NOS por la hiperglucemia,

evita el desarrollo de la hipertrofia de los CC inducida por la anoxia (Lahiri, Mokashi,

Shirahata, Andronikou, 1990; Prabhakar y col., 2001). No debemos descartar el

82

efecto del NO sobre el aumento en la retención de glucosa cerebral a través de la

relajación vascular, que causaría un aumento en el flujo sanguíneo cerebral (Bolanos

y Almeida, 1999); si bién, este mecanismo no es tan claro en el cerebro como en el

músculo esquelético (Higaki y col., 2001). Con objeto de discriminar los efectos

sobre la musculatura lisa vascular, en experimentos futuros será interesante estudiar,

el reflejo hiperglucémico utilizando un inhibidor específico de la NOSn.

83

CONCLUSIONES

En base a los resultados obtenidos en las ratas normales y diabéticas en las que

se valoró el efecto del NO en el CC, inyectando donadores o inhibidores de este

neurotransmisor en el SCA, sobre el reflejo hiperglucemiante con retención de

glucosa cerebral después de la estimulación de los RSCC, se concluye lo siguiente:

1. La inyección de sol. sal. en el SCA sin la estimulación de los RSCC en las

ratas normales y diabéticas no produjo el reflejo hiperglucemiante ni aumentó

la retención de glucosa por el cerebro, tampoco se observaron modificaciones

en los niveles de nitritos.

2. La estimulación de los RSCC seguida de la inyección de sol. sal. en el SCA

produjo el reflejo hiperglucemiante con aumento en la retención de glucosa

cerebral y un incremento en los niveles de nitritos en la sangre venosa

encefálica, tanto en las ratas normales como en las diabéticas. Sin embargo,

el aumento en la retención de glucosa cerebral en las ratas diabéticas sólo se

observó en el t = 16 min.

3. La estimulación de los RSCC seguida de la inyección de L-NAME en el SCA

inhibió el reflejo hiperglucemiante y el aumento en la retención de glucosa

cerebral, los niveles de nitritos en la sangre venosa encefálica en las ratas

normales disminuyeron. En las ratas diabéticas el L-NAME produjo los

mismos efectos que en las ratas normales sin afectar el reflejo

hiperglucemiante que permaneció sin cambios..

4. La estimulación de los RSCC seguida de la inyección de NPS en el SCA

incrementó el reflejo hiperglucemiante con aumento en la retención de glucosa

cerebral sólo en las ratas normales. En las ratas diabéticas el NPS no reforzó

el reflejo hiperglucemiante ni el aumento en la retención de glucosa cerebra,

84

que sólo se observó en el t = 8 min. En ambas ratas se encontró un aumento

en los niveles de nitritos en la sangre venosa encefálica.

5. Los niveles de nitritos en la sangre procedente del SNC fueron siempre

menores en las ratas diabéticas que en las ratas normales, aún en

condiciones basales, es decir, antes de inducir la hipoxia histotóxica en el

SCA.

Estos resultados aportan evidencias en relación al estudio de la

quimiotransducción y la homeostasis de la glucosa. Es probable que la CR

mitocondrial tenga un papel central en este proceso ante el bloqueo selectivo de la cit-

c por el NO y el NaCN.

85

PERSPECTIVAS

Es cada vez más evidente que el NO sintetizado en el SNC juega papeles

fisiológicos importantes en la homeostasis de la glucosa. A la luz de la relación que

existe entre las concentraciones de glucosa en la sangre, la actividad

quimiorreceptora y los niveles de NO, se podrá ampliar el conocimiento sobre el

mecanismo por medio del cual el SNC es capaz de captar la glucosa para mantener

su metabolismo. El hecho de que la mitocondria tenga NO para regular su propia

respiración (Ghafourifar y Richter, 1997) sugiere que esta molécula debe ser

importante en el metabolismo energético. En este sentido se propone un modelo

hipotético de la quimiotransducción. En próximos trabajos, será importante estudiar:

a) si en la sangre procedente del cerebro, después de reforzar el reflejo

hiperglucemiante con NPS, se detecta la presencia de insulina en ratas normales y

diabéticas tipos 1 y 2; b) si el cociente mitocondrial NO/O2 es o no crucial para regular

la sensibilidad al oxígeno o a la glucosa en la propia función mitocondrial, y

profundizar en el estudio de estos mecanismos para entender la participación del NO

mitocondrial en la homeostasis energética, en particular del SNC en ratas normales y

diabéticas; c) estudiar el tejido de los CCs de las ratas normales y/o diabéticas

después de las manipulaciones aquí descritas, para analizar la expresión de la

NOSmt; d) será interesante estudiar un grupo de ratas diabéticas sometidas a los

protocolos aquí presentados, perfundiendo el SCA con concentraciones de L-NAME

mayores a 250 µM para abolir el reflejo hiperglucémico, caracterizando y

cuantificando las NOS a través de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa

con retrotranscripción (RT-PCR) en los CCs extirpados al finalizar los experimentos.

En el futuro, la disponibilidad de herramientas bioquímicas específicas para

determinar los niveles del NO y su participación en el metabolismo de los mamíferos

in vivo, nos permitirá desarrollar estrategias terapéuticas más adecuadas.

86

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