EXPRESIÓN DE EXPANSINAS Y CRECIMIENTO DE LAS CÉLULAS …
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Profesor Patrocinante. Dr. Daniel Calderini R. Instituto de Producción y Sanidad Vegetal. Facultad de Ciencias Agrarias. Profesor Co-Patrocinante. Dr. Ricardo Riegel S. Instituto de Producción y Sanidad Vegetal. Facultad de Ciencias Agrarias.
EXPRESIÓN DE EXPANSINAS Y CRECIMIENTO DE LAS CÉLULAS DEL PERICARPIO DURANTE EL LLENADO DE
GRANOS EN TRIGO. IMPORTANCIA DE ESTOS PROCESOS PARA LA DETERMINACIÓN DEL PESO FINAL DE GRANO
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico.
JAIME FELIPE HERRERA PAREDES VALDIVIA-CHILE
2011
A todos los que imaginan,
sueñan y desean ser mejores,
para mejorar a los demás.
AGRADECIMIENTOS
Muchas y preciosas personas me han beneficiado con su tiempo, paciencia y sus
experiencias de vida personal y profesional, para guiarme en mi formación.
Gracias al el Dr. Daniel Calderini R. por haberme aceptado en su proyecto de
investigación, su grupo de trabajo y por sobre todo aceptar el desafió de incorporar una
persona alejada de su formación profesional y área de investigación, otorgándome su
paciencia y conocimientos. También debo agradecer al Dr. Ricardo Riegel S., por
darme su confianza para incorporarme a su laboratorio y utilizarlo para el desarrollo del
proyecto. Junto a lo anterior, agradecer al equipo de trabajo del Dr. D. Calderini, por su
amabilidad y alegría, haciendo grato la estadía en el laboratorio, especialmente a
Carolina Lizana, por facilitarme el entendimiento de la fisiología vegetal con la mayor
amabilidad, paciencia y alegría.
Doy Gracias a mi madre, María Paredes, por darme la oportunidad de decidir mi
futuro, junto con su cariño y apoyo incondicional.
Esta tesis fue financiada por los aportes otorgados por Fondo de Desarrollo
Científico y Tecnológico (proyecto FONDECYT 1040125) y Proyecto de Cooperación
Internacional del Fondo de Desarrollo Científico y Tecnológico (proyecto FONDECYT
7060267).
I
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Pagina
1.0 RESUMEN 1
1.1 SUMMARY 2
2.0 INTRODUCCIÓN 3
2.1 Importancia y necesidades futuras de trigo. 3
2.2 Crecimiento de la producción de trigo. 4
2.3 Factores que determinan el rendimiento del trigo. 5
2.3.1 Determinantes del número de granos. 7
2.3.2 Determinantes del peso de los granos. 8
2.4 Células del pericarpio. 11
2.5 Expansinas. 12
2.5.1 Estructura de la pared vegetal. 13
2.5.2 Extensión celular. 16
2.5.3 Mecanismo de acción de las expansinas. 17
2.5.4 Función y localización de las expansinas. 18
2.6 Extensión celular y expresión de expansinas en trigo. 19
2.7 Implicancia de las células del pericarpio y de las expansinas en el
crecimiento y rendimiento de los granos de trigo. 20
2.8 Hipótesis y objetivos. 21
2.8.1 Hipótesis. 21
2.8.2 Objetivo general. 21
2.8.3 Objetivos específicos. 21
II
3.0 MATERIALES Y MÉTODOS 22
3.1 Materiales. 22
3.1.1 Material biológico. 22
3.1.2 Reactivos. 22
3.1.3 Instrumentos. 24
3.2 Métodos. 25
3.2.1 Antecedentes de cultivo. 25
3.2.2 Selección de muestras. 27
3.2.3 Medición y análisis de los componentes fisiológicos del grano. 27
3.2.4 Tinción y conteo de células endospermáticas. 30
3.2.5 Dimensiones de las células del pericarpio externo y células
cruzadas. 31
3.2.6 Extracción de RNA total. 31
3.2.7 Cuantificación de RNA total mediante espectrofotometría. 32
3.2.8 Síntesis de cDNA total. 33
3.2.9 Reacción de la polimerasa en cadena (PCR). 34
3.2.10 Visualización de los productos amplificados. 36
3.2.11 Reamplificaron y secuenciación de DNA. 36
4.0 RESULTADOS 37
4.1 Peso de los granos de Bacanora y Kambara a cosecha. 37
4.2 Dimensiones de los granos de Bacanora y Kambara a cosecha. 39
4.3.1 Dinámicas de acumulación de peso de los granos de Bacanora y
Kambara. 45
III
4.3.2 Dinámicas de acumulación de contenido hídrico de los granos de
Bacanora y Kambara. 49
4.3.3 Dinámicas de aumento de volumen de los granos de Bacanora y
Kambara. 53
4.4 Dinámicas de crecimiento de largo, alto y ancho de los granos de
Bacanora y Kambara. 53
4.4.1 Dinámicas de elongación de los granos de Bacanora y Kambara. 56
4.4.2 Dinámica de alto y ancho de los granos de Bacanora y Kambara. 59
4.5 Dinámicas del número de células del endosperma de los granos
de Bacanora y Kambara. 60
4.6 Extensión de las células del pericarpio de los granos 2 y 3 de
Bacanora y Kambara. 65
4.6.1 Extensión de las células del pericarpio externo de los granos 2 y 3
de Bacanora y Kambara. 65
4.6.2 Dinámicas de la extensión de las células del pericarpio externo de
los granos 2 y 3 de los genotipo Bacanora y Kambara. 69
4.6.3 Similitud entre las dinámicas de extensión longitudinal de las
células del pericarpio externo y la elongación de los granos 2 y 3
de Bacanora y Kambara. 72
4.6.4 Similitud entre las dinámicas de extensión del ancho de las células
del pericarpio externo y el crecimiento del ancho de los granos 2 y
3 de Bacanora y Kambara. 75
IV
4.6.5 Extensión de las células cruzadas de los granos 2 y 3 de Bacanora
y Kambara. 77
4.6.6 Similitud entre las dinámicas de extensión de las células cruzadas
y el crecimiento del ancho de los granos 2 y 3 de Bacanora y
Kambara. 81
4.7 Expresión de expansinas en los granos 2 y 3 de los genotipos
Bacanora y Kambara. 83
4.7.1 Niveles de expresión de las 6 expansinas en los granos 2 y 3 de
los genotipos Bacanora y Kambara. 86
4.7.2 Dinámicas de expresión de las 6 expansinas en los granos 2 y 3
de los genotipos Bacanora y Kambara. 89
4.7.3 Dinámicas de expresión de expansinas, de elongación y
acumulación de contenido hídrico de los granos 2 y 3 de los
genotipos Bacanora y Kambara. 91
5.0 DISCUSIÓN 93
6.0 CONCLUSIONES 101
7.0 CONSIDERACIONES 103
8.0 BIBLIOGRAFÍA 104
V
ÍNDICE DE FIGURAS
Pagina
Figura 1: Factores que determinan y asocian al rendimiento de los granos
trigo. 6
Figura 2: Evolución del peso, contenido hídrico y elongación de los
granos. 10
Figura 3: Modelos estructurales de la pared celular vegetal en corte
frontal y lateral. 15
Figura 4: Distribución de las parcelas en el experimento. 26
Figura 5: Asociación entre el peso y largo alcanzado por los granos. 40
Figura 6: Asociación entre el peso y volumen alcanzado por los granos. 41
Figura 7: Dinámicas peso seco, contenido hídrico y volumen de los
granos de Bacanora. 43
Figura 8: Dinámicas peso seco, contenido hídrico y volumen de los
granos de Kambara. 44
Figura 9: Asociación entre el peso de los granos a cosecha y la tasa de
acumulación de materia seca. 47
Figura 10: Asociación entre el peso y el máximo contenido hídrico. 51
Figura 11: Asociación entre el máximo contenido hídrico y la tasa de
acumulación de agua. 52
Figura 12: Dinámicas de largo, alto y ancho de los granos de Bacanora. 54
Figura 13: Dinámicas de largo, alto y ancho de los granos de Kambara. 55
VI
Figura 14: Asociación entre la máxima elongación de los granos y el
máximo contenido hídrico. 58
Figura 15: Dinámicas del número de células del endosperma. 61
Figura 16: Asociación entre el peso y el número de células
endospermáticas de los granos. 63
Figura 17: Asociación entre la tasa de división celular y el máximo número
de células del endosperma. 64
Figura 18: Crecimiento de las células del pericarpio externo de los granos
2 y 3 de Bacanora. 66
Figura 19: Crecimiento de las células del pericarpio externo de los granos
2 y 3 de Kambara. 67
Figura 20: Dinámicas de extensión de las células del pericarpio externo. 70
Figura 21: Dinámicas de extensión celular y del largo de los granos de
Bacanora. 73
Figura 22: Dinámicas de extensión celular y del largo de los granos de
Kambara. 74
Figura 23: Dinámicas del ancho celular y ancho de los granos. 76
Figura 24: Crecimiento de las células cruzadas de los granos 2 y 3 de
Bacanora. 78
Figura 25: Crecimiento de las células cruzadas de los granos 2 y 3 de
Kambara. 79
Figura 26: Dinámicas del largo de las células cruzadas y ancho de los
granos. 82
VII
Figura 27: Peso molecular de las 6 expansinas, 18S y controles negativos. 84
Figura 28: Expresión de las expansinas en los granos 2 y 3 de Bacanora. 87
Figura 29: Expresión de las expansinas en los granos 2 y 3 de Kambara. 88
Figura 30: Dinámica de expresión de las expansinas de Bacanora y
Kambara. 90
Figura 31: Dinámicas de expresión de expansinas, elongación de los
granos y contenido hídrico de los granos. 92
VIII
ÍNDICE DE TABLAS
Pagina
Tabla I: Secuencia de los oligonucleótidos y productos de PCR
generados desde la amplificación de los cDNA de los genes
estudiados. 35
Tabla II: Peso y dimensiones alcanzadas por las 4 posiciones de grano
de los genotipos Bacanora y Kambara a cosecha. 38
Tabla III: Determinantes de la acumulación de peso de las 4 posiciones
de grano de los genotipos Bacanora y Kambara. 46
Tabla IV: Determinantes de la acumulación de contenido hídrico de las 4
posiciones de grano de los genotipos Bacanora y Kambara. 50
Tabla V: Determinantes de la elongación de las 4 posiciones de grano de
los genotipos Bacanora y Kambara. 57
Tabla VI: Determinantes de las células endospermáticas de las 4
posiciones de grano de los genotipos Bacanora y Kambara. 62
Tabla VII: Variación de tamaño de las células del pericarpio externo de los
granos 2 y 3 de los genotipos Bacanora y Kambara. 68
Tabla VIII: Determinantes de la extensión de las células del pericarpio de
los granos 2 y 3 de los genotipo Bacanora y Kambara. 71
Tabla IX: Variación de tamaño de las células cruzadas de los granos 2 y
3 de los genotipo Bacanora y Kambara. 80
Tabla X: Productos de PCR reamplificados e identidad con otras
expansinas previamente descritas. 85
IX
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
Bac : Bacanora
CH : Contenido hídrico
CPE : Células del pericarpio externo
DDA : Días después de antesis o días desde antesis.
E EXP : Expresión de expansinas
EC : Extensión celular
EXLA : Expansin like A
EXLA : Expansin like B
EXPA : expansina
EXPB : expansina
FAA : Fijador Fenol/Aceto/Alcohólico
G2As : Group-2 pollens allergens
GH45 : Glucosido transferasa 45
Gr : Grano
Kam : Kambara
LG : Largo de grano
PG : Peso de grano
PS : Peso seco
SB : Tampón Sodio/Borato
TBE : Tampón Tris/Borato/EDTA
VG . Volumen de grano
X
Vol : Volumen
XTHs : Xyloglucanoendotransglicosilasa/hidrolasa
1
1.0 RESUMEN
El consumo de alimentos y biocombustibles presionaran una mayor producción
de trigo. Aumentar el rendimiento en base al peso de los granos es considerado una
posible solución. El peso está determinado por la tasa y tiempo de llenado de los
granos, pero se han asociado otros rasgos de peso, agua y tamaño. Adicionalmente, se
incorpora la expresión de expansinas (proteínas responsables de la extensión de la
pared celular) y el crecimiento de las células del pericarpio. Éstas estarían vinculadas al
crecimiento de la pared de las células del pericarpio, la elongación del grano y peso
final. Se estudió las dinámicas asociadas al crecimiento de los granos y comparó con la
expresión de expansinas, dinámicas de crecimiento de las células del pericarpio externo
(CPE) y cruzadas (CC). Los granos de dos cultivares de peso contrastante (Bacanora y
Kambara), fueron analizados desde antesis a madurez fisiológica en las dinámicas de
peso, contenido hídrico, células endospermáticas, dimensiones (alto, ancho y largo),
CPE y CC. Paralelamente se semicuantificó la expresión de 6 expansinas bajo RT-PCR
en los granos 2 y 3. El largo de las CPE y CC del grano 2 de Bacanora creció en
función del tiempo de 41,28 m a 155,15 m y 44,20 m a 126,56 m, en Kambara
creció de 30,26 m a 170,43 m y 30,37 m a 127,71 m. Las dinámicas de largo de las
CPE y CC fueron semejantes a las dinámicas de largo y ancho de los granos. La
expresión de expansinas no presentó diferencias significativa entre los genotipos y
posición de grano. La máxima expresión se presentó antes de 10 días desde antesis y
decayó en función del tiempo. Los granos de trigo tienen la mayor expresión de
expansinas en los períodos de activa acumulación de agua, elongación de las CPE y de
los granos, su expresión diminuye una vez definido el tamaño de grano.
2
1.1 SUMMARY
Food consumption and bio-fuels will pressure a higher wheat production. To
increase the performance based on the weight of the grains is considered a possible
solution. The weight is determined by the rate and duration of grain filling, but additional
features of weight, water and size have been asociated. In adition to this, the expresión
of expansins (proteins responsible for the extension of cell wall) and pericarp cell growth
has been incorporated. These would be linked to pericarp cell wall growth, grain
elongation and final weight. The dynamics asociated with grain growth were studied and
compared with expression of expansins, dynamics of external pericarp cell (CPE) and
crossed cells (CC) growth. The grains from two cultivars of contrasting weight (Bacanora
y Kambara), were analized from anthesis to physiologic maturity in dynamics of weight,
water content endospermatic cells, dimensions (height, width and lenght), CPE and CC.
In parallel the expression of 6 expansines were quantified by RT-PCR in grains 2 and 3.
The lenght of CPE and CC of grain 2 from Bacanora grew as a function of time from
41,28 m a 155,15 m and 44,20 m to 126,56 m; in Kambara it grew from 30,26 m
to 170,43 m and 30,37 m to 127,71 m. The dynamics of length of CPE and CC were
similar to those of lenght and width of grains. Expansins expression did not showed a
significant difference between genotypes and position of grain. The maximum
expression was showed before day 10 from anthesis and decreased as a function of
time. The wheat grains have the higher expression of expansins in periods of active
water acccumulation, and CPE and grain elongation. Their expression decreases once
the grain size is defined.
3
2.0 INTRODUCCIÓN
2.1 Importancia y necesidades futuras de trigo.
El trigo (Triticum aestivum L.) aporta un quinto del requerimiento calórico global
(Reynolds et al. 2009), y su productividad es de suma importancia para satisfacer las
futuras demandas. Por ello, desarrollar estrategias en su mejora genética constituye un
objetivo en la investigación de trigo.
Los progresos agronómicos y genéticos aumentaron la producción de trigo
(Reynolds et al., 2007; Evenson y Gollin, 2003), pero una serie de factores impulsan e
impulsarían una mayor demanda. La misma, no sería superada por las ganancias
genéticas y productivas anuales (Rosegrant y Cline, 2003; Sherman et al., 2005;
Fischer y Edmeades, 2010; Miralles y Slafer, 2007).
El continuo aumento de la población (> 8.500 millones de personas, 2030), el
mayor desarrollo económico, longevidad y expectativas de vida, aumentarían el
consumo calórico alimenticio per cápita (Rosegrant y Cline, 2003; FAO, 2002).
Los factores climáticos (Neelin et al. 2006; Bate et al., 2007) y ambientales
(Berman et al., 2005; Montgomery, 2007) condicionan la producción de trigo. El cambio
climático afectará negativamente la producción, impactando en la duración de las
etapas ontogénicas, la mayor probabilidad de déficit hídrico (Richards, 1992; Trethowan
et al., 2002), aumento en la salinidad de los suelos (Isla et al., 2003), eventos de shock
térmicos, reestructuración de las áreas de cultivo y otros (Reynolds et al., 1998).
Adicionalmente, se requerirá utilizar territorios del cordón tropical y subtropical (FAO,
2002), considerados poco aptos para el cultivo de trigo y de alto impacto ambiental.
4
La utilización del trigo como fuente de biocombustibles (grano: 66 GJ ha-1a-1;
planta completa: 72 GJ ha-1a-1; Shewry, 2009, Murphy y Power, 2008), establecerá una
competencia en su uso, sea para alimentación o generación de energía.
Los anteriores factores presionarán un mayor consumo de trigo, estimándose
una producción superior a 882 millones de t a-1 para el año 2020 (Cassman, 1999).
Considerando que se producen 605 millones de t a-1 de trigo en 214 millones de
hectáreas (FAOSTAT, 2007), las mismas que han tendido a estabilizarse e incluso
disminuir en los últimos 15 años, hace imperioso incrementar el rendimiento medio
mundial de 2,5 a más de 4,5 t ha-1 (Byrnes y Bumb, 1998; Rajaram, 2001), para evitar
los problemas de escasez alimentaria a futuro (Reynolds et al., 2009).
2.2 Crecimiento de la producción de trigo.
En la primera mitad del siglo XX, la producción de trigo creció por la introducción
de nuevas áreas de cultivo (Calderini y Slafer, 1998). En la segunda mitad aumentó
sostenidamente por mejoras en su manejo (Cassman, 1999), factores socio-
económicos globales (Calderini et al., 1998), y en gran medida al incremento del
rendimiento por la introducción de los genes del enanismo. Estos genes disminuyeron la
altura de planta, aumentando el número de granos y las hicieron menos propensas a
pérdidas por tendedura (Loss y Siddique, 1994; Calderini et al., 1995; Evans et al. 1999;
Rajaram, 2001). Lo anterior permitió duplicar la producción de trigo, sin embargo, desde
finales de los años 80 la ganancia por rendimiento anual ha sido menor (Fischer y
Edmeades, 2010).
5
Los genotipos actuales de trigo pueden alcanzar índices de cosecha próximos al
50% (Calderini et al., 1995), cercano al índice de cosecha máximo teórico calculado del
62% (Austin et al., 1980). Esto restringe las posibilidades de continuar incrementando el
rendimiento y la producción como se hizo en el pasado. Requiriendo profundizar los
conocimientos fisiológicos y genéticos involucrados en la determinación del número y
peso de los granos (Reynolds et al., 2009; Calderini et al., 1999a; 2001; Calderini y
Reynolds, 2000; Ugarte et al., 2007), para generar nuevas estrategias que posibiliten el
aumento del rendimiento del cultivo (Reynolds et al., 2001; Monneveux et al., 2003).
La combinación de mejoras agronómicas y fisiológicas, junto con la aplicación de
técnicas biotecnológicas, serán necesarias para resolver los desafíos actuales y futuros
del cultivo de trigo (Reynolds et al., 2009; Rajaram, 2001).
2.3 Factores que determinan el rendimiento del trigo.
El rendimiento del trigo, es el resultado de la interacción entre el número y peso
de los granos (Figura 1), y ambos responden a determinantes fisiológicos y genéticos
(Satorre et al., 2003; Evans y Fischer, 1999). La mejora genética permitió aumentar el
número de granos por unidad de superficie, pero con una disminución del peso medio
de los mismos, producto de los nuevos granos de menor peso potencial, ubicados en
las posiciones más distales de la espiga (Miralles y Slafer, 1995). Por otro lado, la
disminución del peso no sería debido a una limitación de importancia en la fuente de
asimilados (Satorre et al., 2003), lo que respalda las propuestas de incrementar el
rendimiento, a través del aumento del (I) número de granos (Calderini et al., 1999), (II)
el peso potencial de los mismos, o (III) ambos.
6
Figura 1: Factores que determinan y asocian al rendimiento de los granos trigo.
Componentes que determinan el número de granos de la espiga. Adicionalmente, los
determinantes fisiológicos y caracteres a los cuales se les ha asociado un afecto sobre
el peso de los granos (figura adaptada de Satorre et al., 2003).
7
2.3.1 Determinantes del número de granos.
El número de granos por unidad de superficie es el componente de mayor
asociación con el rendimiento del trigo (Figura 1; Demotes-Mainard y Jeuffroy, 2004;
Calderini et al., 1995), siendo afectado por el número de espigas, espiguillas y granos
dentro de las mismas (Reynolds et al., 2009). Este último está fuertemente
condicionado por el período entre 20 días previos a antesis y antesis (Fischer, 1985), en
dicho momento se establece el número de granos por espiguilla (Satorre et al., 2003).
Por ello, las condiciones de crecimiento durante este período modifican el número final
de granos del cultivo (Satorre et al., 2003).
La radiación absorbida por la planta afecta la tasa de crecimiento y acumulación
de asimilados previo a antesis (Slafer et al., 1990). Una alta producción de asimilados
resulta en una mayor partición a estructuras reproductivas (espigas), favoreciendo un
mayor número de flores fértiles y futuros granos (Miralles et al. 1998). La temperatura
afecta negativamente el número de granos, debido a que acelera la tasa de desarrollo,
reduciendo el número de flores fértiles y consecutivamente el número final de granos
(Satorre et al., 2003). Entre los factores agronómicos que pueden influenciar el número
de granos, está la fertilidad del suelo y la densidad de siembra (Satorre et al., 2003).
Para aumentar el número de granos se ha sugerido como estrategia, extender
los períodos de desarrollo de las espigas, aumentar la partición de asimilados a las
estructuras reproductivas y/o la disminución o inhibición de las estructuras no
reproductivas (Reynolds et al., 2009).
8
2.3.2 Determinantes del peso de los granos.
El peso de los granos está menos asociado con el rendimiento del cultivo
(Fischer, 1985), pero es el responsable de la acumulación de biomasa tras haberse
establecido el número de granos (Miralles et al., 2000; Satorre et al., 2003; Calderini et
al., 1999a). Los principales determinantes del peso son la tasa de llenado de grano y el
tiempo de de acumulación de asimilados (Egli, 1981). Paralelamente, se han asociado
una serie de caracteres que afectarían al peso de los granos, como los determinantes
de la acumulación de materia seca, el peso de los carpelos florales al momento de
antesis, el número de células del endosperma, el contenido hídrico máximo alcanzado
por los granos (Saini y Westgate, 2000) y el largo de los mismos (Figura 1). Aun así,
son poco conocidos los determinantes que controlan el peso potencial de los granos,
por ello se requiere de una mayor investigación sobre las bases fisiológicas que
controlan estos caracteres (Calderini et al., 1999b; Calderini et al., 2001).
Los trabajos recientes demuestran que cualquier perturbación en los 15 días
previos a la antesis afectan el peso de los granos (Calderini et al., 1999a, b). Dicho
período coincide con el crecimiento de los carpelos florales, cuyo peso en antesis está
asociado con el peso potencial de los granos (Calderini et al., 1999a; Calderini y
Reynolds, 2000, Satorre et al., 2003).
El desarrollo y acumulación de asimilados al interior de los granos, está vinculado
teóricamente al peso potencial de los granos (fuerza de los destinos). Esta acumulación
sigue una dinámica de crecimiento sigmoidea, con una etapa inicial de baja
acumulación de asimilados (fase lag), seguida de una etapa de rápida acumulación
9
(fase lineal), y finaliza en madurez fisiológica con la estabilización del peso de grano
(Figura 2; Calderini et al., 1997; Reymolds et al., 2001; Borras et al., 2004).
Paralelamente, desde antesis se produce un aumento en el número de células
endospermáticas, estas células son las responsables de contener los asimilados
sintetizados por la planta, y a su número se le atribuye una correlación positiva con el
peso final de los granos (Brocklehuerst, 1977; Gleadow et al., 1982).
La dinámica de acumulación de agua en los granos se inicia de forma acelerada
durante un período aproximado de 15 días, le sigue una segunda etapa sin variación del
contenido hídrico (plateau hídrico) y finaliza con una pérdida rápida de agua (Figura 2).
Este último período se encuentra próximo a la madurez fisiológica del grano (Stone et
al., 1995; Calderini et al., 2000; Wardlaw et al., 1995). Junto a la paridad de algunos
eventos entre las dinámicas de peso y acumulación de agua, se ha descrito una
asociación entre el máximo contenido hídrico y el peso de los granos (Schnyder y
Baum, 1992; Calderini et al., 2000).
Desde antesis hasta aproximadamente los 20 días después de antesis (DDA),
los granos presentan un crecimiento acelerado en sentido longitudinal, a contar de este
momento los granos detiene su elongación (Figura 2). Paralelamente, el grano crece en
las dimensiones de alto y ancho hasta madurez fisiológica. El resultado de la extensión
de cada una de las dimensiones del grano, genera el espacio (volumen) que contendrá
los asimilados. A este volumen se le ha asociado con el peso final de los granos (Millet
y Pinthus, 1984).
10
Bota
DDA
-20 0 20 40 60
Pe
so
(m
g)
y C
. H
ídri
co
(m
g)
0
20
40
60
80
-20 0 20 40 60
La
rgo
de
gra
no
(m
m)
0
2
4
6
8
PS
CH
Largo
Fase IIIFase I Fase II
Fase I Fase IVFase II Fase III
Fase II Fase I
Peso
C. Hídrico
Largo
Figura 2: Evolución del peso, contenido hídrico y elongación de los granos. Área
superior, dinámicas de acumulación de peso seco (PS; círculos llenos), acumulación de
contenido hídrico (CH; círculos vacíos) y elongación (Largo; triángulos llenos) de los
granos de trigo. Parte inferior, fases de la dinámica de acumulación de peso (Fase I = F.
lag; Fase II = F. lineal; Fase III = M. fisiológica), contenido hídrico (Fase I = acumulación
de agua; Fase II = plateau hídrico; Fase III = perdida de agua; Fase IV = contenido
hídrico a cosecha) y elongación de los granos (Fase I = elongación del grano; Fase II =
largo estable; figura adaptada de Satorre et al., 2003).
11
2.4 Células del pericarpio.
El grano de trigo está envuelto por el pericarpio, esta estructura está formada por
una serie de capas celulares estructuralmente diferenciadas. La epidermis e hipodermis
(pericarpio externo), presenta células alargadas en sentido longitudinal al grano. La
capa intermedia presenta las células cruzadas, que se alargan en sentido transversal al
grano (Carole et al., 2003). Las referencias actuales, solo indican que el tamaño de las
células del pericarpio no son afectadas por los alelos de enanismo, encontrándose
diferencias en el número de las mismas (Miralles et al., 1998).
La orientación y crecimiento de las células del pericarpio externo (CPE) y las
células cruzadas (CC), podrían jugar un rol clave en el largo y ancho de los granos,
determinado el volumen, forma (Yang et al., 2009; Gegas et al., 2010) y peso de los
mismos. A la vez, el tamaño de estas puede ser afectado por unas proteínas capaces
de modular la extensión de la pared celular llamadas Expansinas.
12
2.5 Expansinas.
A comienzos de los años 90, se aisló una proteína desde el tejido vegetal en
crecimiento, capaz de restaurar el crecimiento ácido de la pared celular de las plantas,
atribuyéndole una naturaleza bioquímica a la extensión de la pared celular. Esta
proteína y posterior familia proteica se les denominaron “Expansinas” (McQueen-Mason
y Cosgrove, 1995; Cosgrove, 1989).
Se han identificado cuatro familias de expansinas (Kende et al., 2004), las y
expansinas (EXPA y EXPB) con actividad experimental (Cosgrove, 1997, McQueen-
Mason et al., 1992), y las expansin like (EXLA y EXLB) por homología de secuencia
(Sampedro y Cosgrove, 2005). Las y expansinas presenta una similitud en tamaño
(~25-28 kDa) y secuencia (20 y 40%), diferenciándose en que las EXPA presentan un
motivo de N-glicosilación, y las EXPB presentan una larga inserción y una deleción
vecina al dominio 1 (Sampedro y Cosgrove, 2005). Los análisis de secuencia muestran
2 dominios altamente conservados, el dominio 1 presenta homología con glucósido
transferasa (GH45), pero sin actividad (McQueen-Mason et al., 1995; Cosgrove, 1997;
2000), y el dominio 2 no presenta homología con otras proteínas. La alta cantidad de
residuos aromáticos y polares hace presumir que este dominio es capaz de formar
puentes con los polisacáridos de la pared (Cosgrove 1997; Barre y Rougé, 2002).
Paralelamente, se ha descubierto homología parcial con el grupo 2 de los polen
alérgenos de las gramíneas-G2As y expansinas de otras especies como bacterias,
nematodos y moluscos (Sampedro y Cosgrove, 2005).
13
2.5.1 Estructura de la pared vegetal.
La pared primaria es la responsable de los cambios fisicoquímicos del desarrollo
celular (McCann et al., 1990; Cosgrove, 1999), está compuesta por una red de
polisacáridos de alto peso molecular de celulosa (30%), hemicelulosa (30%) y pectinas
(35%; Fujino et al., 2000), embebidos en una matriz hidratada de otros polisacáridos,
glicoproteínas (1-5%) y otras sustancias como ligninas, suberina y cutina (Carpita, 1996,
Somerville et al., 2004), cuya relación varía dentro de la misma pared, entre tejidos y
etapas del desarrollo (Sampedro y Cosgrove, 2005). La pared presenta entre 75 a 80%
de agua, formando un hidrogel relativamente denso y variable, que permite la extensión
celular (Lin et al., 1991). Esto la hace sensible a los fenómenos de deshidratación
(Edelmann, 1995), y jugar un rol determinante en la inhibición del crecimiento en
períodos de estrés hídrico (Chaze y Neumann, 1994).
La celulosa se organiza en paquetes lineales de 3 a 10 nm de diámetro y sobre 7
m de extensión, estabilizadas por puentes hidrogeno inter e intra-cadena (Saxena y
Brown, 2005). Las hemicelulosas (xiloglucanos y xilanos) se encuentran asociadas con
las microfibras de celulosa y están compuestas por largas fibras de celulosa o xilosa,
con ramificaciones menores de mucosa, galactosa o arabinosa (Rose, 2003). Las
pectinas se encuentran hidratadas y unidas a la superficie de la celulosa, y su
gelificación permite controlar la flexibilidad, porosidad (Vincken et al., 2003) o limitar la
extensión de la pared mediante la interacción con iones de calcio (Fry, 2004).
Según los modelos estructurales, las microfibras de celulosa y la matriz están
organizadas como dos redes independientes. Una red de pectinas de carácter funcional
y una red de celulosa-hemicelulosa de carácter estructural, determinando la forma,
14
dimension y expansión celular (Rose, 2003). El modelo “Tethered network” (Figura 3a),
propone que las microfibras de celulosa estarían ligadas en forma no covalente,
mediante largas cadenas de xiloglucanos, mientras que las pectinas y proteínas
constituirían una malla independiente y coexistente con la red de celulosa-xiloglucano
(Carpita y Gibeaut, 1993; Cosgrove et al., 1997; 2001; McCann et al., 1990; Nishitani,
1998). El modelo “Multicoat” propone que las microfibras de celulosa están inmersas y
recubiertas por capas de polisacáridos de la matriz, las pectinas rellenarían los espacios
y las uniones entre las redes, a través de enlaces no covalentes entre los diferentes
polisacáridos (Figura 3b). Ambos modelos de organización de la pared celular están
lejos de ser ratificados, ya que existen organizaciones dentro de las paredes aún más
complejas (Cosgrove, 1999; 2001).
La síntesis de la pared se realiza a través de 2 vías paralelas, la primera sintetiza
celulosa mediante un complejo enzimático transmembrana (Rosetta), la cual deposita
las fibras directamente sobre la pared (Schrick et al., 2004; Doblin et al., 2002). La
segunda vía sintetiza la mayoría de los componentes de la matriz, ellos son sintetizados
en el aparato de Golgi y transportados a la pared celular (Fry, 2004; Scheible y Pauly,
2004; Lerouxel et al., 2006), dicha matriz es posiblemente unida por una serie de
glicoproteínas (Rose, 2003).
15
Figura 3: Modelos estructurales de la pared celular vegetal en corte frontal y
lateral. Constitución y organización estructural de los diferentes componentes de la
pared vegetal de los modelos de Multicoat y Tethered network (figura adaptada de
Cosgrove, 2001).
16
2.5.2 Extensión celular.
La capacidad de extensión y reorganización de la pared celular de las plantas
está influenciada por estímulos ambientales como la luz, la gravedad, la anoxia, el
estrés hídrico u hormonas. Para ello, la pared transita de un estado rígido a uno
viscoelástico o relajado (Cosgrove, 2005), mediante una acidificación de la pared por
las ATPasa H+ de la membrana (Bibikova et al., 1998) y modificaciones bioquímicas de
sus componentes. Todo ello produce una relajación (stress relaxation) y posterior
ablandamiento de la pared (wall loosening). Paralelamente, desde el interior celular se
genera una presión de turgencia que impulsa a las paredes y desliza sus polímeros (cell
wall creep), provocando la extensión celular. Una vez finalizada la extensión de la
pared, ésta sufre un proceso de reconstrucción de las fibras de celulosa, junto a la
incorporación de una nueva matriz de polisacáridos (Sampedro y Cosgrove, 2005;
Marga et al., 2005).
Los avances bioquímicos y bioinformáticos han identificado 4 agentes putativos
responsables del ablandamiento de la pared. Las expansinas son consideradas como
agente primario por su capacidad de ablandar y extender la pared. Los
xyloglucanoendotransglicosilasa/hidrolasa (XTHs), los radicales hidroxilos y las endo-
(1,4)- -glucanasas son considerados agentes secundarios, porque solo modifican los
componentes de la pared, sin generar extensión (Rose, 2003; Sanpedro y Cosgrove,
2005).
Los radicales hidroxilos y peroxidasas de pared, hipotéticamente cortarían y
removerían los átomos de hidrógenos de las cadenas de polisacáridos (Fry, 2004;
Liszkay et al., 2003). Las endoglucanasas son visualizadas en las regiones no
17
cristalinas de celulosa, y tienen la capacidad de hidrolizar las uniones internas de las
cadenas glucosídicas, necesaria para la reorganización y síntesis de glucanos (Inouhe y
Nevins, 1998; Cosgrove, 1999; Ohmiya et al., 2000). Finalmente las XTHs, presentan
alta expresión en regiones de formación, elongación, post-elongación y remodelación
de pared (cortar y unir xiloglucanos), permitiendo la reestructuración o biosíntesis de la
misma (Fry, 2004; Antosiewicz et al., 1997; Chanliaud et al., 2004; McQueen-Mason et
al., 1993; Cosgrove, 1997; 1999; Darley et al., 2001; Saladié et al., 2006).
2.5.3 Mecanismo de acción de las expansinas.
Se desconoce el mecanismo como las expansinas ablandan y extienden la
pared, sin embargo, los primeros trabajos han sugerido que las expansinas debilitarían
los enlaces entre los polímeros de la matriz y de la superficie de la celulosa (Cosgrove,
2000a; 2000b; Darley et al., 2001). Las expansinas no generan un debilitamiento
progresivo de la pared, ni siquiera modifican la mecánica y la estructura de la misma, a
diferencia de las enzimas hidrolíticas o transglicosilasa (McQueen-Mason et al., 1993;
1995; Cosgrove, 1997). Se presume que pueden debilitar las uniones no covalentes
entre los glucanos, ya que pueden debilitar el papel de celulosa pura (red de glucanos
unidos por enlaces puente hidrogeno) o membranas artificiales de celulosa-xiloglucano,
sin mostrar acción hidrolítica (McQueen-Mason y Cosgrove, 1994). Los resultados
sugieren que las expansinas actuarían sobre los microfibras de celulosa y
secundariamente sobre los puentes de xiloglucanos, pero son insensibles a otros
polisacáridos.
18
A pesar de la homología de las expansinas con algunas endoglucanasas
(Tatusova y Madden, 1999), éstas actúan de forma diferente, ya que las primeras lo
realizan en forma inmediata, generando una relajación de la pared sin afectar su
mecánica, mientras que las endoglucanasas requieren de un tiempo mínimo de acción
(Yuan et al., 2001). Lo anterior ha sugerido que las expansinas abrirían la red celulosa-
xiloglucanos, generando la extensión inmediata de la pared, para una posterior acción
de las endoglucanasas (Cosgrove et al., 2002).
2.5.4 Función y localización de las expansinas.
La activación y expresión de los genes de expansinas se les ha asociado al
crecimiento y extensión celular (Vreegurg et al., 2005). Además se le ha descrito en
maduración de frutos, formación de xilemas (Gray-Mitsumune et al., 2004), germinación
de semillas (Chen y Bradford, 2000), emergencia de hojas (Belfield et al., 2005),
penetración de polen (Pezzotti et al., 2002) y especialmente en tejidos en crecimiento
(Rienhardt et al., 1998). A nivel celular, se mantienen acumuladas en el citoplasma,
pero principalmente distribuidas en la pared, acentuándose en estratos y puntos
específicos (Belestrini et al., 2005; Cosgrove et al., 2002). La sobreexpresión de
expansinas, genera un crecimiento precoz de primordios foliares, modifica la filotaxis del
meristema apical, provocando un crecimiento mayor y anormal de los tejidos vegetales
(Pien et al., 2001, Cosgrove et al., 2002; Cho y Cosgrove, 2000). La supresión génica
mediante sondas antisentido, ha podido reducir e inhibir el crecimiento de algunos
vegetales, mientras que en otros les ha otorgar una mayor resistencia mecánica de los
mismos (Cho y Cosgrove, 2000).
19
2.6 Extensión celular y expresión de expansinas en trigo.
La pared celular de trigo y otras monocotiledóneas es de tipo II, baja en pectinas
y xiloglucanos (< 2%), pero altas en xilanos (Carpita et al., 2001; Rose, 2003; Sanpedro
y Cosgrove, 2005). Según el modelo propuesto, los -glucanos y
glucuronoarabinoxilano cumplirían el rol de porosidad y de unión de las microfibras de
celulosa, ya que su presencia es dependiente del estado de desarrollo celular (Kim et
al., 2000) y sufren de degradación post-elongación celular (Carpita et al., 2001).
En trigo se han aislado expansinas desde el coleoptilo, con una máxima actividad
de elongación celular entre pH 4,0 y 4,5. Dicha actividad se ha visto inducida por
ditioteitrol (DTT), iones de magnesio y potasio, pero inhibida por iones de aluminio, zinc
y calcio 10 mM, al cual se le atribuye estimular la rigidez de la pared celular (Hepler,
2005; Gao et al., 2008). Los estudios de la expresión génica de expansinas en trigo han
permitido aislar y caracterizar una serie de 18 y expansinas (Lin et al., 2005), las
que han aumentado en estudios posteriores. Paralelamente se ha demostrado que las
expansinas poseen distintos niveles de expresión génica y proteica en diferentes
tejidos, órganos, etapas del desarrollo y tratamientos (Gao et al., 2008, Lizana et al.,
2010). En el caso de las 18 expansinas estudiadas en los granos de trigo, éstas
mostraron una variación en la expresión génica según el crecimiento del grano, donde
algunas se expresaron en forma constitutiva y otras sufrieron aumento o disminución de
su expresión (Lin et al., 2005).
20
2.7 Implicancia de las células del pericarpio y de las expansinas en el
crecimiento y rendimiento de los granos de trigo.
La urgencia de encontrar una posible solución a los problemas de escasez
alimenticia de hoy y a futuro, hace necesario conocer más íntimamente las diferentes
componentes fisiológicas envueltas en el desarrollo y crecimiento de los granos de trigo.
Por ello, conocer los caracteres implicados en la acumulación de materia seca y de
agua al interior de los granos, el crecimiento de los mismos, el número de células
endospermáticas, la extensión de las células del pericarpio y la expresión de
expansinas, resultan clave para comprender los determinantes del peso final de los
granos, y poder contribuir a su incremento en los programas de mejora genética del
cultivo, a través de herramientas para su manipulación.
De acuerdo a los antecedentes entregados, esta tesis plantea que existe una
relación entre las dinámicas de agua, el crecimiento de las células del pericarpio y la
expresión de 6 expansinas. Para ello, se estudiarán las variables que intervienen en el
crecimiento de los granos de 2 cultivares (Bacanora y Kambara) contrastante en su
peso de grano, y se les relacionará con las dinámicas de crecimiento de las células del
pericarpio, y la expresión de expansinas en diferentes períodos del llenado de los
mismos.
21
2.8 Hipótesis y objetivos.
2.8.1 Hipótesis.
El peso final de los granos de trigo está asociado con el tamaño de las células
del pericarpio, y las dinámicas de elongación de los mismos se relacionan en el tiempo
con la expresión de expansinas.
2.8.2 Objetivo general.
Estudiar las dinámicas de crecimiento de grano de trigo, junto con la extensión
de las células del pericarpio y expresión de expansinas, para mejorar el entendimiento
de las bases fisiológicas, celulares y moleculares involucradas en la determinación del
peso potencial de los granos.
2.8.3 Objetivos específicos.
Analizar las dinámicas de la materia seca y contenido hídrico de granos en
crecimiento de 2 cultivares de trigo con diferente peso potencial de los granos.
Evaluar las relaciones entre las distintas variables a explorar, para identificar los
caracteres más asociados con el peso final de los granos.
Analizar el efecto genotípico y de posición de grano dentro de la espiga sobre las
variables del grano a estudiar.
Estudiar las dinámicas dimensionales de los granos 2 y 3 de los mismos cultivos
y relacionarlas con las dinámicas de extensión de las células del pericarpio y los
niveles de expresión de mRNA de 6 expansinas.
Identificar la secuencia génica de las 6 expansinas estudiadas.
22
3.0 MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Materiales.
3.1.1 Material biológico.
El estudio utilizo el material biológico de dos cultivares de trigo primaveral
(Bacanora = Bac y Kambara = Kam) de alto contraste en el peso final de los granos.
Ambos cultivares han sido liberados por Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz
y Trigo (CIMMYT).
3.1.2 Reactivos.
MWG-Biotech: Síntesis de partidores.
Invitrogen: Set de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs, 100 mM), inhibidor de
ribonucleasas (RNaseOUT, 40 U/μl), transcriptasa reversa M-MLV (Moloney
Murine Leukemia Virus, 200 U/ l), DTT (0,1 M), reactivo de extracción de RNA
de plantas (PureLink Plant RNA Reagent), partidores óligo dT [Oligo(dT)20
Primer], agarosa (Ultrapure).
Sigma-Aldrich Co.: enzima celulasa (Cellulase from Aspergillus Níger), alfa-
amilasa (α-Amylase from Bacillus licheniformis Type XII-A, saline solution, 500-
1,000 units/mg protein (biuret) y Verde de metilo ~ 85%.
Merck & Co. Inc.: Acetato de calcio, ácido cítrico, fosfato de sodio dibasico,
acetato de sodio, fucsina básica, isopropanol, meta-bisulfito, carbón activo.
Fermentas: Taq DNA Polymerase (recombinant), marcador de peso molecular
(Gene Ruler 50 pb DNA Ladder).
23
Winkler: Etanol, ácido acético glacial, formaldehído, agua RNasa Free.
Vetec: Cloroformo, ácido bórico, hidróxido de sodio.
J.T. Baker: Cloruro de sodio, etanol.
Life Technology: Bromuro de etidio (GibcoBRL).
24
3.1.3 Instrumentos.
Agitador magnético, Glassco.
Cámara de Neubauer, Brand.
Balanza Analítica Excelente plus, Mettler Toledo.
Espectrofotómetro NanoDrop ND-1000, Thermo Scientific.
Freezer -70ºC MRF 401/86, Electrolux Medical Refrigeration.
Centrífuga Heraeus Christ, Heraeus Instrument.
Centrífuga refrigerada Biofuge Fresco, Heraeus Instrument.
Microondas, LG MS2047C.
Microscópio Axiolab, Carl Zeiss.
Pie de metro.
Block termoregulado Accu Block, Labnet International Inc.
Cámara digital L700, Samsung.
pHmetro, Extech Instruments.
Refrigerador y congelador ElectroCool, LG.
Congelador -20ºC FE 26, Electron.
Set de Micropipetas, Rainin.
Termociclador PTC-100TM, JM Research inc.
Termociclador PX2 Thermal Cycler, Thermo Electron Corporation.
Transiluminador, Vilber Lourmat.
Cámara de electroforesis y fuente de poder Mupid EX, Intelligent Power Supply.
Estufa termoregulada, Binder.
25
3.2 Métodos.
3.2.1 Antecedentes de cultivo.
El experimento se realizó en condiciones de campo en el fundo Santa Rosa (39º
47' 18"S, 73º 14' 5"O) de la Universidad Austral de Chile. La siembra fue el 1 de
Septiembre del 2006 y las parcelas se dispusieron bajo un diseño en bloque
completamente aleatorizado con 3 repeticiones (Figura 4), orientadas Norte-Sur. Cada
parcela presentó una densidad de siembra de 350 plantas m-2, distribuidas en 7 hileras
de 2 m de largo y espaciadas cada 15 cm.
La acidez del suelo fue controlada mediante la aplicación de cal, previo a la
siembra (4,0 t ha-1). Las parcelas se fertilizaron con N, P y K (350 Kg ha-1 KNO3, 300 Kg
ha-1 P2O5 y 120 Kg ha-1 KO2). Éstas se mantuvieron libres de enfermedades y plagas
mediante la aplicación de fungicida a las semillas (Priori: Azoxystrobin 25% p/v, 1,5 L
ha-1) e insecticida (Karate: Lambdacihalotrina 5% p/v, 150 ml ha-1) en caso de ataque
de pulgones. Las malezas se controlaron mediante remoción manual. Paralelamente,
las precipitaciones se complementaron con riego periódico para evitar posibles
deficiencias hídricas.
26
Figura 4: Distribución de las parcelas en el experimento. Diseño, orientación y
distribución de las parcelas. Donde Kam = Genotipo Kambara; Bac = Genotipo
Bacanora; R1-R2-R3 = Repeticiones; N = Norte.
2,0 m
0,9 m
7,0 m
7,0
m
1,0 m
1,0 m N
Kam R1
Kam R2
Kam R3
Bac R1
Bac R2
Bac R3
27
3.2.2 Selección de muestras.
El ciclo de cultivo y sus etapas fisiológicas fueron registrados mediante la escala
propuestas por Zadoks et al., (1974). El muestreo de los granos se realizó cada 2 o 3
días, entre los estados de bota-madurez fisiológica y antesis-madurez fisiológica.
Las muestras para expansinas se extrajeron desde bota a madurez fisiológica,
para ello se seleccionaron los granos 2 y 3 de las 4 espiguillas centrales de 4 espigas
de cada una de las parcelas, se congelaron con nitrógeno líquido y conservaron en un
congelador a -70 ºC.
Las muestras para el análisis de dimensiones de grano, células del pericarpio y
conteo de células del endosperma, se colectaron desde antesis hasta madurez
fisiológica. Se seleccionaron 6 espigas por parcela, 2 para el análisis de dimensiones, y
4 se conservaron en fijador FAA (etanol: ác. acético: agua destilada: formaldehído,
10:1:7:2) para análisis de células del pericarpio y del endosperma.
Alcanzada la madurez fisiológica del cultivo (cosecha), se colectaron 10 espigas
de cada una de las parcelas y se registraron las dimensiones físicas.
3.2.3 Medición y análisis de los componentes fisiológicos del grano.
A las 4 posiciones de granos presentes en las 2 espiguillas centrales de 2
espigas seleccionadas, se le registro el largo, alto y ancho mediante pie de metro. Se
registró el peso fresco de cada una de las posiciones de grano con una balanza
analítica de precisión y posteriormente se registró el peso seco de los mismo, tras 48 h
a 65 ºC en una estufa termoregulada. Este proceso se repitió con las muestras de
cosecha.
28
La variación del peso y las dimensiones fueron analizados bajos el programa
TBL (Table curve 2D v2.0.3 release note) respecto a los DDA. Posteriormente sus
resultantes fueron analizados estadísticamente bajo un análisis de varianza de múltiples
factores (p < 0,05; Fischer) con el programa STADISTICA 8.0.
Las dinámicas de peso, de elongación de los granos y extensión de las células
del pericarpio se adaptaron a un modelo hiperbólico. Los máximos valores, tiempos y
tasas de crecimiento se estimaron mediante un modelo lineal sujeto a 2 ecuaciones (1 y
2) con un punto de quiebre, descrito por Calderini et al., 1999b.
1. PG, LG, EC = a + bx si (x ≤ c)
2. PG, LG, EC = a + bx + bc si (x > c)
PG = Peso de grano (mg).
LG = Largo de grano (mm).
EC = Extensión celular ( m).
a = Intercepto con eje x (mg, mm y m).
b = Tasa de llenado de grano (mg d-1).
b = Tasa de elongación del grano (mm d-1).
b = Tasa de extensión celular ( m d-1).
c = Duración del llenado de grano o madurez fisiología (d).
c = Duración de la elongación de grano (d).
c = Duración de la extensión celular (d).
29
El contenido hídrico de los granos describe una curva parabólica, representada
como un modelo trilineal (ecuaciones 3, 4 y 5), semejante al modelo de Pepler et al.,
(2005). Éste fue adaptado y optimizado para TBL (Jandell, 1991), para describir los
datos de máximo contenido hídrico, la tasa acumulación de agua, duración de la
acumulación de agua, duración del contenido hídrico estable (plateau hídrico), máxima
duración del contenido hídrico estable y tasa de perdida de contenido hídrico. Este
modelo se adaptó para describir la tasa de división de las células endospermáticas y
número de células endospermáticas.
3. CH = d + ex si (x ≤ f)
4. CH = d + ef si (x > f)
5. CH = d + g(x – h) si (x ≥ h
CH = Contenido hídrico (mg).
d = Origen en eje x.
e = Tasa de acumulación de agua (mg d-1).
f = Duración de la acumulación de agua (d).
h = Máxima duración del plateau hídrico (d).
g = Tasa de perdida de agua (mm d-1).
x = Tiempo final después de antesis (d).
30
Para el cálculo del volumen del grano del grano, se consideró similar a un
elipsoide, y se determinó mediante la ecuación 6 (Miralles et al. 1998).
6. VG = 4/3 πabc
VG = Volumen de Grano
π = 3,1416
a = Largo
b = Ancho
c = Alto
3.2.4 Tinción y conteo de células endospermáticas.
La tinción de las células del endosperma del grano de trigo se realizó mediante
una modificación del método de Rijven y Wardlaw, (1966). Desde antesis, 2 granos de
cada una de las posiciones de las 2 espiguillas centrales de las espigas conservadas en
FAA, se fijaron con una solución de etanol-ácido acético (3:1) durante la noche. Se
separó y pesó el endosperma con balanza analítica. La muestra se depositó en
microtubos de 1,5 ml, se suspendió con 1,0 ml de agua destilada e incubó durante 10
minutos a 60 ºC. El endosperma tratado se tiñó con una solución de 0,3 ml de reactivo
de SCHIFF (Fucsina básica 1g, HCl 1N, Na2S2O5 1g) durante 1 hora en oscuridad. Se
lavó con agua destilada hasta eliminar totalmente el reactivo de tinción. El endosperma
lavado se digirió con 0,5 ml de tampon citrato-fosfato pH 5,0 y celulosina al 1% durante
2 horas a 40 ºC. Se maceró y centrifugó a 3.000 x g durante 20 minutos, se resuspendió
31
e incubó por 3 horas a 25 ºC con 1,75 ml de acetato de calcio 12,6 mM, 0,25 ml de
acetato de sodio 0,5 mM (pH 4,8) y 2.000 U/ml de -amilasa. La muestra teñida se
observó bajo microscopio, y contaron sus núcleos mediante cámara de neubauer.
3.2.5 Dimensiones de las células del pericarpio externo y células cruzadas.
La dimensión del largo y ancho de las CPE y células cruzadas se realizó bajo
microscopio, mediante tinción con verde de metilo (verde de metilo 1% p/v; etano- ác.
acético 99:1). Desde antesis, 2 granos de la posición 2 y 3 de las espiguillas centrales
de las espigas conservadas en FAA, se les realizó un corte en la región dorsal del
grano, se separó la capa de CPE y la capa de células cruzadas. Ambas capas fueron
bañadas con una gota de verde de metilo durante 1 minuto y lavadas con agua
destilada. Las capas teñidas se emplazaron en un portaobjeto graduado y se
visualizaron bajo microscopio a un aumento de 10X. Se capturó su imagen mediante
cámara fotográfica digital, se procesaron mediante el programa AxioVision (AxioVs40 V
4.8.1.0), y analizaron mediante el programa Excel 2003 y Stadistica 8.0.
Las muestras utilizadas para la medición del largo de las CPE fueron desde 5 a
29 DDA, con intervalos de 2 a 3 días, mientras que las mediciones para ancho de las
CPE y células cruzadas se realizaron a 5, 7, 13 y 29 DDA en Bacanora, y a los 3, 5, 13
y 27 DDA en Kambara.
3.2.6 Extracción de RNA total.
El RNA total se extrajo mediante el método descrito por el kit de extracción
PureLink Plant Reagent (Invitrogen). Para ello, los 4 granos seleccionados desde las
32
espiguillas centrales de 2 espigas de trigo, se recolectaron en un microtubos de 1,5 ml y
pulverizadon con nitrógeno liquido. A los granos triturados se le incorporó 1,0 ml de
reactivo PureLink Plan Reagent, se agitó vigorosamente y mantuvo a temperatura
ambiente por 5 minutos en forma horizontal. Se centrifugó a 12.000 x g por 2 minutos a
temperatura ambiente y transfirió el sobrenadante a un microtubo de 1,5 ml libre de
RNAsa. Se adicionó 0,2 ml de NaCl 5,0 M frío, mezcló ligeramente, se incorporó 1,2 ml
de cloroformo frío y se homogenizó mediante inversión de los tubos durante 3 minutos.
La solución se centrifugó a 12.000 x g durante 10 minutos a 4 ºC, se transfirió 0,35 ml
de la fase acuosa a un tubo de 1,5 ml libre de RNAsa, y se precipitó el RNA con 1,0 ml
de alcohol isopropílico. La muestra se incubó durante 10 minutos a temperatura
ambiente y luego se centrifugó a 12.000 x g por 10 minutos a 4 ºC. Se eliminó el
sobrenadante y se lavó el precipitado con 500 μl de alcohol etílico frío (75%). Se mezcló
suavemente, y centrifugó a 12.000 x g por 1 minutos a 4 ºC. El sobrenadante fue
removido cuidadosamente, y se dejó secar brevemente el precipitado hasta que se
evaporó todo el alcohol. Finalmente se resuspendió el sedimento con 30 μl de agua
libre de nucleasas. En los casos de presentar una solubilidad parcial del sedimento, se
re-centrifugó a 12.000 x g por 1 minutos a 4 ºC y se colectó el sobrenadante. Las
muestras purificadas de RNA se guardaron a -70 ºC.
3.2.7 Cuantificación de RNA total mediante espectrofotometría.
La cuantificación del RNA total se realizó mediante espectrofotometría, para lo
cual se midió la absorbancia a 260 nm a 2 l de muestra. Además, se determinó la
pureza del RNA, midiendo la absorbancia a 280 nm y calculando la razón A260/A280
33
(valor que debe ser superior a 1,8). La concentración aproximada de la muestra se
calculó utilizando la relación de 1 unidad de absorbancia a 260 nm que equivale a 40
µg/ml de RNA, mediante el programa informático ND-1000 v3.1.0 (NanoDrop
Technologies Inc).
3.2.8 Síntesis de cDNA total.
La RT-PCR se realizó siguiendo el procedimiento establecido por el kit-MLV
reverse Transcriptase (Invitrogen), utilizando una mezcla de oligonucleotidos poli-dT,
capaces de unirse a la cola poli a del mRNA. Para ello, se preparó en un tubo de 200 l
una solución con 7,5 μg de RNA total de cada muestra, 1,5 l del mix de dNTP (15
mM), 1,5 l de oligo dT12-18 (0,75 µg) y agua libre de nucleasas, hasta completar un
volumen de 18 l. La mezcla se incubó 5 minutos a 65 ºC y se transfirió inmediatamente
a hielo durante 2 minutos. Tras ello, se le incorporó 6 l de tampón de reacción (Tris-
HCl 75 mM, KCl 112,5 mM, MgCl2 4,5 mM, pH 8,3), 3 l de DTT 15,0 mM, 1,5 l (60
U/ l) de inhibidor de ribonucleasa recombinante (RNAsaOUT) y 1,5 l (300 U/ l) de
transcriptasa reversa (M-MLV), completando un volumen total de 30 μl. La solución
completa, se incubó 50 minutos a 37 ºC y 15 minutos a 70 ºC. El cDNA sintetizado fue
almacenado a -20 ºC para su posterior amplificación por PCR. Como control negativo
se realizó una RT-PCR siguiendo todos los pasos previamente descritos, reemplazando
el RNA por agua destilada.
34
3.2.9 Reacción de la polimerasa en cadena (PCR).
Se realizó como una reacción de PCR convencional, que utilizó como templado
el cDNA del procedimiento descrito anteriormente (3.2.8). Para ello, a un tubo estéril se
le incorporó 1,0 µl de templado, 0,5 l de cada uno de los partidores específicos (Tabla
I; 0,2 M), 0,5 l de dNTP (0,5 M), 2,5 l de tampón taq 10X, 1,5 l de MgCl2 (1,5
M), 0,125 l (0,3 U/ l) Taq polimerasa recombinante y 18,375 l agua libre de
nucleasas hasta completar un volumen de 25 l. Todas las mezcla fueron llevadas a un
termociclador, usando el programa: denaturación inicial a 94 ºC por 3 minutos, seguido
de 25 ciclos, cada uno compuesto por una denaturación a 94 ºC por 45 segundos,
apareamiento a 50 ºC por 45 segundos y extensión a 72 ºC por 45 segundos. Por
último, se realizó una extensión final a 72 ºC por 3 minutos. El producto de PCR fue
almacenado a -20 ºC, para una posterior visualización mediante electroforesis. Como
control negativo se utilizó un tubo que contenía todo lo anterior más agua como
templado (C- PCR), el segundo control negativo contenía todo lo anterior más el control
negativo de la transcripción reversa como templado (C- RT-PCR).
35
Tabla I: Secuencia de los oligonucleótidos y productos de PCR generados
desde la amplificación de los cDNA de los genes estudiados.
Gen Sentido / Antisentido Nº acceso
GenBank
Tamaño
producto (pb)
pTaExpA4 5'-AACTTCTGCCCGTCGAACTA-3'
5'-CCCTTCATGGTGAACCTCAT-3' AY543530 188
pTaExpA5 5'-ACCACATCCACACACGAGAG-3'
5'-CCACCAGCTCGAAGTAGTCC-3' AY543531 151
pTaExpA6a 5'-GTGCAACCCTCCTCGACAC-3'
5'-GGTCCCCTTCACCGACAT-3' AY543532 220
pTaExpA6b 5'-GCAACCCTCCCCGCGTC-3'
5'-GGTCCCCTTCACCGACAT-3' AY543532 218
pTaExpA6c 5'-CAATCCTCCCCGCGAAC-3'
5'-GGTCCCCTTCACCGACAT-3' AY543532 217
pTaExpA8 5'-ACTACGCACTCCCCAACAAC-3'
5'-AGAGCTCAAGTCACCGATGC-3' AY543534 156
18s rRNA 5'-GTGACGGGTGACGGAGAATT-3'
5'-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3'
Tabla adaptada de Lizana et al, 2010.
36
3.2.10 Visualización de los productos amplificados.
La migración electroforética del DNA se llevó a cabo en geles de agarosa al 2%.
Para ello, se fundió 0,8 g de agarosa en un volumen de 40 ml de tampón SB 1X (0,5nM
NaOH ajustado con ácido borico a pH 8,5). La solución se enfrió hasta ~ 55 ºC y añadió
2 l de bromuro de etidio (0,5 mg/ml). Se cargó en el gel 6 l de producto de PCR, junto
a 1,0 l de tampón de carga (TBE 6X, azul de bromofenol 0,03%, xilen cianol 0,03% y
glicerol 60 %), y paralelamente 1,5 g de estándar de peso molecular de 50 pb. La
corrida de electroforesis se llevo a cabo en tampón SB 1X, a un voltaje de 135v durante
20 minutos. La visualización de los productos de PCR y estándar se realizó sobre un
trans-iluminador de luz ultravioleta, desde la cual se capturó una imagen con cámara
fotográfica digital, mediante un sistema adaptado por el laboratorio. El producto
amplificado fue semi-cuantificado respecto a una concentración del estándar de peso
molecular, utilizando los programas Gel-Pro Analyzer 3.1 y Labimage 3.4.
3.2.11 Reamplificaron y secuenciación de DNA.
Se llevó a cabo utilizando el mismo proceso de amplificación descrito en
(métodos 3.2.9), utilizando como templado el producto de PCR diluido a una razón de
1:1.000 con agua destilada. El producto de la reamplificación fue secuenciado mediante
3730xl DNA analyzer (Macrogen, Corea). Las secuencias obtenidas fueron corregidas
mediante Chromas Lite 2.01 y Geneious Pro 4.7.6., y comparadas con el programa de
búsqueda NCBI blast y Geneious Pro 4.7.6.
37
4.0 RESULTADOS
4.1 Peso de los granos de Bacanora y Kambara a cosecha.
El peso de los granos de Bacanora y Kambara fluctuó entre 36 y 66 mg, siendo
afectado por el genotipo (p < 0,05) y la posición del grano (p < 0,05). Los granos de
Kambara fueron en promedio un 14% más pesados que los de Bacanora. Al mismo
tiempo, los granos de la posición 2 de ambos genotipos alcanzaron los mayores pesos,
seguidos por los granos 1, 3 y finalmente los granos 4. El máximo peso de grano lo
obtuvo el grano 2 de Kambara, mientras que el mínimo lo alcanzó el grano 4 del mismo
genotipo (Tabla II).
38
Tabla II: Peso y dimensiones alcanzadas por las 4 posiciones de grano de los
genotipos Bacanora y Kambara a cosecha.
Caracter
Genotipo
Posición de grano
Grano 1 Grano 2 Grano 3 Grano 4
Peso (mg)
Bac 51,61c ± 1,00 56,34bc ± 1,39 51,59c ± 1,20 37,40d ± 1,83
Kam 61,47ab ± 2,00 66,22a ± 2,51 57,79bc ± 2,45 36,35d ± 3,46
Ancho (mm)
Bac 3,99ab ± 0,10 3,75bc ± 0,07 3,83ab ± 0,03 3,41cd ± 0,06
Kam 4,03ab ± 0,13 4,19a ± 0,23 4,00ab ± 0,12 3,38d ± 0,14
Alto (mm)
Bac 2,98cd ± 0,04 3,36b ± 0,01 3,02cb ± 0,02 2,73e ± 0,02
Kam 3,61a ± 0,05 3,64a ± 0,08 3,10c ± 0,05 2,88de ± 0,08
Volumen (mm3)
Bac 42,00d ± 0,99 46,69c ± 0,91 43,14d ± 0,71 31,41e ± 0,81
Kam 56,97abc ± 3,24 62,98a ± 4,97 50,30bc ± 2,61 33,94e ± 2,70
Largo (mm)
Bac 6,913d ± 0,01 7,09cd ± 0,01 7,13c ± 0,03 6,44f ± 0,04
Kam 7,46b ± 0,10 7,87a ± 0,09 7,75a ± 0,08 6,65e ± 0,09
39
4.2 Dimensiones de los granos de Bacanora y Kambara a cosecha.
El largo, ancho y alto de los granos a cosecha fueron afectados por el genotipo
(alto y ancho p < 0,001; ancho p < 0,05), alcanzando mayores dimensiones los granos
de Kambara. La posición de grano afectó las dimensiones (p < 0,001), los granos 2 de
ambos genotipos alcanzar las mayores dimensiones, seguidos de los granos 3, 1 y
finalmente los granos 4. El grano 2 de Kambara alcanzó los máximos altos, anchos y
largos, mientras que el grano 4 de Bacanora presentó las menores dimensiones, a
excepción del ancho, el cual fue registrado por el grano 4 de Kambara (Tabla II).
El largo de los granos fluctuó entre 6,4 y 7,9 mm. Los granos de Kambara fueron
en promedio un 7,0% más largos que los de Bacanora. El alto y ancho presentaron
diferencias entre genotipo y posición de forma semejantes al largo, dependiendo de la
dimensión en estudio y la posición de grano en comparación (Tabla II).
El volumen calculado siguió un comportamiento similar al de las dimensiones,
siendo afectado por el genotipo (p < 0,001) y la posición (p < 0,001). Lo anterior permitió
que los granos de Kambara fueran un 18,5% más voluminoso que los granos de
Bacanora (Tabla II).
El largo y volumen alcanzado por los granos a cosecha, mostraron una fuerte y
positiva asociación con el peso alcanzado por los mismos, independientemente del
genotipo y la posición de grano considerada (Figuras 5 y 6).
40
Largo de grano (mm)
0 2 4 6 8 10
Peso
de g
ran
o (
mg
)
0
20
40
60
80
Bac
kam
y = 19,39x - 86,54
R2 = 0,84
p < 0,01
Figura 5: Asociación entre el peso y largo alcanzado por los granos. Relación entre
el peso y el largo de los granos (Gr1, Gr2, Gr3 y Gr4) de Bacanora (Bac; círculos llenos)
y Kambara (Kam; círculos vacíos) alcanzados a cosecha. Se advierte la recta de
regresión, sensibilidad (R2), la probabilidad (p) y el error estándar de las medias (barras
verticales y horizontales).
41
Volumen de grano (mm3)
0 20 40 60 80
Peso
de g
ran
o (
mg
)
0
20
40
60
80
Bac
Kam
y = 0,96x + 8,24
R2 = 0,93
p < 0,001
Figura 6: Asociación entre el peso y volumen alcanzado por los granos. Relación
entre el peso y el volumen de los granos (Gr1, Gr2, Gr3 y Gr4) de Bacanora (Bac;
círculos llenos) y Kambara (Kam; círculos vacíos) alcanzados a cosecha. Se advierte la
recta de regresión, sensibilidad (R2), la probabilidad (p) y el error estándar de las
medias (barras verticales y horizontales).
42
4.3 Dinámicas de acumulación de peso, contenido hídrico y volumen de los
granos de Bacanora y Kambara.
A contar de antesis, las 4 posiciones de granos de ambos genotipos aumentaron
progresivamente de volumen, materia seca y agua. Estos 3 caracteres siguieron
dinámicas propias, semejantes entre genotipos y posiciones de grano, pero diferentes
en sus valores máximos, tiempos y tasas (Figuras 7 y 8).
43
Días despues de antesis
0 10 20 30 40 50 60 70
0
20
40
60
80
0 10 20 30 40 50 60 70
P S
ec
o (
mg
), C
Híd
ric
o (
mg
) y V
olu
me
n (
mm
3)
0
20
40
60
80PS
CH
Vol
a b
c d
Figura 7: Dinámicas peso seco, contenido hídrico y volumen de los granos de
Bacanora. Acumulación de peso seco (PS; círculos llenos), acumulación de contenido
hídrico (CH; círculos vacíos) y aumento de volumen (Vol; triángulos llenos) de los
granos los granos 1 (a), 2 (b), 3 (c) y 4 (d) de Bacanora desde antesis a cosecha. Las
barras verticales representan el error estándar de las medias.
44
P S
ec
o (
mg
), C
Híd
rico
(m
g)
y V
olu
men
(m
m3
)
0
20
40
60
80
100
120 PS
CH
Vol
Días despues de antesis
0 10 20 30 40 50 60 70
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70
a b
c d
Figura 8: Dinámicas peso seco, contenido hídrico y volumen de los granos de
Kambara. Acumulación de peso seco (PS; círculos llenos), acumulación de contenido
hídrico (CH; círculos vacíos) y aumento de volumen (Vol; triángulos llenos) de los
granos los granos 1 (a), 2 (b), 3 (c) y 4 (d) de Kambara desde antesis a cosecha. Las
barras verticales representan el error estándar de las medias.
45
4.3.1 Dinámicas de acumulación de peso de los granos de Bacanora y Kambara.
La acumulación de peso de los granos siguió un crecimiento sigmoideo. La fase
lag perduró bajo los 10 DDA en Bacanora (Figura 7) y sobre los 15 DDA en Kambara
(Figura 8), este período se extendió a medida que los granos se alejan del raquis. La
fase lineal se mantuvo hasta aproximadamente los 45 DDA en Bacanora y sobre los 50
DDA en Kambara. Una vez alcanzada la madurez fisiológica, los granos cesaron su
acumulación de asimilados, manteniéndose estables hasta cosecha (Figuras 7 y 8).
El análisis de la dinámica del peso, determinó que los granos de Kambara
alcanzaron mayores pesos y tasas de acumulación de materia seca que los granos de
Bacanora (p < 0,001). El efecto de la posición de grano (p < 0,001), generó que los
granos 2 de ambos genotipos alcanzaran las mayores tasas y pesos, seguidos de los
granos 1, 3 y 4 respectivamente (Tabla III).
El peso máximo y la tasa de acumulación fluctuaron entre 38,70 y 68,90 mg y
1,00 a 1,90 mg d-1 respectivamente. El efecto genotipo-posición permitió que los granos
de Kambara fueran en promedio un 13,6% más pesado, y un 24% más veloces en
acumulación de asimilados (Tabla III). La regresión lineal entre el peso de los granos a
cosecha y la tasa de acumulación de materia seca mostró una asociación positiva entre
ambas variables (Figura 9).
46
Tabla III: Determinantes de la acumulación de peso de las 4 posiciones de grano
de los genotipos Bacanora y Kambara.
Caracter
Genotipo
Posición de grano
Grano 1 Grano 2 Grano 3 Grano 4
Peso máximo de grano (mg)
Bac 53,10d ± 1,12 58,46c ± 1,44 53,49d ± 1,02 38,72f ± 1,24
Kam 64,67b ± 0,58 68,86a ± 1,64 60,46c ± 1,45 43,02e ± 1,69
Duración de fase lag (d)
Bac 5,37d ± 0,47 6,83c ± 0,34 8,23b ± 0,40 9,84a ± 0,29
Kam 8,25b ± 0,39 8,65ab ± 0,37 9,70a ± 0,52 9,85a ± 0,56
Duración de fase exponencial (d)
Bac 39,94a ± 1,64 38,95a ± 1,69 37,94ab ± 1,04 36,16ab ± 1,06
Kam 36,91ab ± 0,16 36,82ab ± 1,45 34,25b ± 0,71 35,65ab ± 2,64
Madurez fisiológica (d)
Bac 45,65ab ± 0,16 45,96ab ± 0,96 46,00ab ± 0,56 47,07a ± 1,73
Kam 43,93ab ± 1,18 44,99ab ± 1,27 43,08b ± 1,70 42,41b ± 1,73
Tasa de acumulación de materia seca (mg d-1)
Bac 1,32c ± 0,02 1,50b ± 0,01 1,42bc ± 0,01 1,04d ± 0,03
Kam 1,80a ± 0,03 1,88a ± 0,08 1,83a ± 0,04 1,45b ± 0,06
47
Tasa de acumulación de materia seca (mg d-1
)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Peso
de g
ran
o(m
g)
0
20
40
60
80
Bac
Kam
y = 30,21x + 6,11
R2 = 0,66
p < 0,05
Figura 9: Asociación entre el peso de los granos a cosecha y la tasa de
acumulación de materia seca. Relación entre el peso alcanzado por los granos (Gr1,
Gr2, Gr3 y Gr4) de Bacanora (Bac; círculos llenos) y Kambara (Kam; círculos vacíos),
ante la tasa de acumulación de materia seca de los mismos. Se advierte la recta de
regresión, sensibilidad (R2), la probabilidad (p) y el error estándar de las medias (barras
verticales y horizontales).
48
El genotipo afectó el tiempo de las 3 etapas de acumulación de materia seca
(fase lineal y plateau hídrico p < 0,05; fase lag p < 0,001), mientras que la posición de
grano solo afectó la fase lag (p < 0,001). La fase lag perduró entre 5 a 10 DDA en
Bacanora y entre 8 a 10 DDA en Kambara, y en ambos genotipos la duración del la fase
lag se extendió a medida que el grano se alejaba del raquis (Tabla III). En la fase lineal,
los granos de Bacanora crecieron aceleradamente por más de 36 días, llegando hasta
40 días de crecimiento (Gr4), mientras que los granos de Kambara no superaron los 37
días de crecimiento lineal (Tabla III). A pesar de no existir una ratificación
estadísticamente concluyente, se apreció que, a medida que los granos se alejaban del
raquis tenían un menor tiempo de crecimiento exponencial. Finalmente, los granos de
Bacanora alcanzaron madurez fisiológica a contar de los 43 DDA, mientras que los
granos de Kambara 2 días después (Tabla III).
49
4.3.2 Dinámicas de acumulación de contenido hídrico de los granos de Bacanora
y Kambara.
Los granos de Bacanora acumularon agua entre 20 y 25 DDA (Figura 7),
mientras los granos de Kambara sobre los 25 DDA (Figura 8). Todos los granos se
mantuvieron en el plateau hídrico hasta aproximadamente los 45 DDA, momento
coincidente con la madurez fisiológica, y desde el cual se registró una pérdida abrupta
del contenido hídrico (Figuras 7 y 8).
El análisis de las dinámicas determinó que el MCH fluctuó entre 50,0 y 54,5 mg, y
la tasa de acumulación de agua entre 1,15 y 2,00 mg d-1. La primera fue afectada por el
genotipo (p < 0,001) y la posición de grano (p < 0,001), mientras que la segunda solo
por la posición de grano (p < 0,001). Los granos de Kambara acumularon un 22% más
de agua (MCH) que los granos de Bacanora (Tabla IV). En ambos caracteres los granos
2 alcanzaron los mayores valores, seguidos por los granos 1, 3 y 4 (Tabla IV). El peso
logrado por los granos a cosecha puede ser explicado por el MCH alcanzado por los
mismos (Figura 10), de forma independiente del genotipo y la posición de grano. Una
relación similar se observó entre el MCH y la tasa de acumulación de agua (Figura 11).
En promedio, los granos de Bacanora alcanzaron el MCH 5 días antes que
Kambara (p < 0,001). El tiempo se extendió a medida que los granos se alejaban del
raquis (p < 0,001). El plateau hídrico perduró 23 días en los granos de Bacanora y 17
días en los de Kambara (p < 0,01; Tabla IV). Este período finalizó a los 45,5 DDA,
tiempo compartido por todas las posiciones de grano de ambos genotipos, y fue
próximo a madurez fisiológica.
50
Tabla IV: Determinantes de la acumulación de contenido hídrico de las 4
posiciones de grano de los genotipos Bacanora y Kambara.
Caracter
Genotipo
Posición de grano
Grano 1 Grano 2 Grano 3 Grano 4
Máximo contenido hídrico (mg)
Bac 38,61d ± 0,56 43,34c ± 0,63 38,40d ± 0,74 25,56f ± 0,89
Kam 52,53a ± 1,39 54,48a ± 0,64 48,89b ± 0,55 31,86e ± 0,75
Duración de la acumulación de agua (d)
Bac 20,51c ± 0,80 21,55c ± 0,14 22,50c ± 1,28 22,56c ± 1,22
Kam 25,68b ± 1,01 25,68b ± 0,72 27,60ab ± 0,81 28,56a ± 0,52
Duración del plateau hídrico (d)
Bac 23,63a ± 0,76 23,14a ± 2,05 21,82ab ± 1,12 22,58ab ± 0,52
Kam 19,42ab ± 3,80 17,24ab ± 3,94 16,74ab ± 2,06 16,03b ± 1,47
Duración máxima del plateau hídrico (d)
Bac 44,14a ± 0,72 44,68a ± 2,12 44,32a ± 1,19 45,13a ± 0,76
Kam 45,01a ± 2,98 42,92a ± 4,38 44,34a ± 1,84 44,59a ± 1,57
Tasa de acumulación de agua (mg d-1)
Bac 1,82b ± 0,07 2,02ab ± 0,06 1,89b ± 0,10 1,33c ± 0,03
Kam 1,98ab ± 0,06 2,12a ± 0,11 1,82b ± 0,07 1,17c ± 0,02
51
Máximo Contenido Hídrico (mg)
0 10 20 30 40 50 60
Pe
so
de
gra
no
(m
g)
0
20
40
60
80
Bac
Kam
y = 1,02x + 9,91
R2 = 0,92
p < 0,001
Figura 10: Asociación entre el peso y el máximo contenido hídrico. Relación entre
el peso alcanzado por los granos (Gr1, Gr2, Gr3 y Gr4) de Bacanora (Bac; círculos
llenos) y Kambara (Kam; círculos vacíos) a cosecha, ante el máximo contenido hídrico
(MCH) alcanzado por los mismos. Se advierte la recta de regresión, sensibilidad (R2), la
probabilidad (p) y el error estándar de las medias (barras verticales y horizontales).
52
Tasa de acumulación de agua (mg d-1
)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Máxim
o C
on
ten
ido
Híd
rico
(m
g)
0
10
20
30
40
50
60
Bac
Kam
y = 25,01x - 2,58
R2 = 0,70
p < 0,01
Figura 11: Asociación entre el máximo contenido hídrico y la tasa de acumulación
de agua. Relación entre el máximo contenido hídrico (MCH) alcanzado por los granos
(Gr1, Gr2, Gr3 y Gr4) de Bacanora (Bac; círculos llenos) y Kambara (Kam; círculos
vacíos), ante la tasa de acumulación de agua de los mismos. Se advierte la recta de
regresión, sensibilidad (R2), la probabilidad (p) y el error estándar de las medias (barras
verticales y horizontales).
53
4.3.3 Dinámicas de aumento de volumen de los granos de Bacanora y Kambara.
En los primeros DDA, el volumen de los granos se incrementó en forma
semejante a la acumulación de agua. Después siguieron una evolución más lenta a
medida que se aproximaban a madurez fisiológica (45,5 DDA), momento desde el cual
disminuyó el volumen. Los granos fueron capaces de aumentar su volumen desde
menos de 10 mm3 (5 DDA) hasta más de 110 mm3 (Kam Gr2) o cerca de 90 mm3 (Bac
Gr2). Los volúmenes máximos alcanzados dependieron del genotipo y la posición de de
los granos (Figuras 7 y 8).
4.4 Dinámicas de crecimiento de largo, alto y ancho de los granos de Bacanora
y Kambara.
A contar de antesis, los granos crecieron en largo, alto y ancho, sobresaliendo el
alto a las otras dimensiones. Todos los granos siguieron dinámicas semejantes,
diferenciándose en los determinantes que los afectaron (Figuras 12 y 13).
54
La
rgo
(m
m),
Alt
o (
mm
) y A
nc
ho
(m
m)
0
2
4
6
8
Largo
Alto
Ancho
Días despues de antesis
0 10 20 30 40 50 60 70
0
2
4
6
8
0 10 20 30 40 50 60 70
a b
c d
Figura 12: Dinámicas de largo, alto y ancho de los granos de Bacanora. Variación
de las dimensiones de largo (círculos llenos), alto (círculos vacíos) y ancho (triángulos
llenos) de los granos 1 (a), 2 (b), 3 (c) y 4 (d) de Bacanora desde antesis a cosecha.
Las barras verticales representan el error estándar de las medias.
55
Larg
o (
mm
), A
lto
(m
m)
y A
nch
o (
mm
)
0
2
4
6
8
Largo
Alto
Ancho
Días despues de antesis
0 10 20 30 40 50 60 70
0
2
4
6
8
0 10 20 30 40 50 60 70
a b
c d
Figura 13: Dinámicas de largo, alto y ancho de los granos de Kambara. Variación
de las dimensiones de largo (círculos llenos), alto (círculos vacíos) y ancho (triángulos
llenos) de los granos 1 (a), 2 (b), 3 (c) y 4 (d) de Kambara desde antesis a cosecha. Las
barras verticales representan el error estándar de las medias.
56
4.4.1 Dinámicas de elongación de los granos de Bacanora y Kambara.
Los granos se alargaron aceleradamente hasta aproximadamente 15 DDA,
momento desde el cual se mantuvieron en forma estable hasta madurez fisiológica (~45
DDA). Con posterioridad a la madurez los granos mostraron una leve reducción en el
largo (Figuras 12 y 13).
El análisis de las dinámicas determinó que los granos alcanzaran una elongación
máxima entre 6,7 y 8,4 mm, dependiendo del efecto genotipo-posición (p < 0,001). Los
granos de Kambara fueron un 9,3% más largos que los de Bacanora. Las posiciones de
grano 2 alcanzaron la mayor longitud en contraparte a los granos 4 (Tabla V). El largo
máximo alcanzado por los granos presento una fuerte asociación con el MCH,
independientemente del genotipo y la posición (Figura 14).
A contar de los 15 DDA los granos de Bacanora detuvieron su elongación
acelerada, mientras que los Kambara fue a contar de los 20 DDA (p < 0,001; Tabla V).
En ambos genotipos el tiempo de elongación se hizo mayor a medida que los granos se
alejaban del raquis (p < 0,05). Los granos de Bacanora y Kambara demoraran 2 y 4,3
días en finalizar su proceso de elongación (Tabla V). En promedio, la tasa de
elongación de los granos fue un 12% mayor en Bacanora (Tabla V), siendo este rasgo
afectado principalmente por el genotipo (p < 0,01).
57
Tabla V: Determinantes de la elongación de las 4 posiciones de grano de los
genotipos Bacanora y Kambara.
Caracter
Genotipo
Posición de grano
Grano 1 Grano 2 Grano 3 Grano 4
Máxima elongación del grano (mm)
Bac 7,31de ± 0,02 7,57c ± 0,06 7,41cd ± 0,07 6,72f ± 0,05
Kam 8,08b ± 0,09 8,43a ± 0,07 8,32a ± 0,06 7,20e ± 0,01
Duración de la elongación (d-1)
Bac 15,42d ± 0,74 16,68cd ± 0,95 18,37bc ± 0,49 19,74ab ± 1,21
Kam 20,00ab ± 0,97 20,59a ± 1,09 21,48a ± 0,71 22,00a ± 1,14
Tasa de elongación (mm d-1)
Bac 0,30a ± 0,01 0,30a ± 0,02 0,31a ± 0,01 0,29ab ± 0,01
Kam 0,24c ± 0,01 0,27abc ± 0,01 0,28abc ± 0,01 0,25bc ± 0,02
58
Máximo Contenido Hídrico (mg)
0 10 20 30 40 50 60Má
xim
a e
lon
ga
ció
n d
e g
ran
o (
mm
)
0
2
4
6
8
Bac
Kam
y = 0,06x + 5,26
R2 = 0,93
p < 0,001
Figura 14: Asociación entre la máxima elongación de los granos y el máximo
contenido hídrico. Relación entre el máximo contenido hídrico alcanzado por los
granos (Gr1, Gr2, Gr3 y Gr4) de Bacanora (Bac; círculos llenos) y Kambara (Kam;
círculos vacíos), ante la máxima elongación alcanzada por los mismos. Se advierte la
recta de regresión, sensibilidad (R2), la probabilidad (p) y el error estándar de las
medias (barras verticales y horizontales).
59
4.4.2 Dinámica de alto y ancho de los granos de Bacanora y Kambara.
Antes de los 5 DDA el alto y ancho de los granos de ambos genotipos no
superaba los 2 mm. Ambas dimensiones siguieron una dinámica de crecimiento
semejante, diferenciándose en las magnitudes de sus dimensiones. Este crecimiento,
permitió alcanzar un alto y ancho máximo cercano a los 4 mm y 5 mm respectivamente.
Estos valores fueron alcanzados cerca de madurez fisiológica (~45 DDA), momento
desde el cual experimentaran un reducción en sus dimensiones. Las 2 dimensiones
presentaron variaciones según el genotipo y la posición de grano (Figuras 12 y 13).
60
4.5 Dinámicas del número de células del endosperma de los granos de
Bacanora y Kambara.
Una mínima o nula presencia de células del endosperma se registró en los
granos durante los primeros DDA (< 5 DDA). Desde esa fecha, se apreció una
significativa división celular, sobrepasando las 150.000 células por grano a los 18 DDA,
momento desde el cual se registró una disminución en su número (Figuras 15a y 15b).
El genotipo (p < 0,05) y la posición de grano (p < 0,001) provocaron que el
número de células del endosperma fluctuara entre 150.000 y 280.000. Los granos de
Bacanora alcanzaran un mayor número de células. Al mismo tiempo, en ambos
genotipos el número de células del endosperma disminuyó a medida que el grano se
ajaba del raquis (Tabla VI). La regresión lineal entre el peso de los granos a cosecha y
el máximo número de células del endosperma mostró una asociación positiva, pero de
baja sensibilidad (p = 0,06; Figura 16).
Tanto el tiempo en alcanzar el máximo número de células, como la tasa de
división celular fueron afectadas por el genotipo (p < 0,01) y la posición de grano (p <
0,001). Por ello, los granos de Bacanora alcanzaron el máximo número de células
endospermáticas 3 días antes que los de Kambara (18,2 DDA). Este tiempo se amplió a
medida que los granos se ajaban del raquis (Tabla VI). Las tasas de división celular
siguieron un comportamiento semejante al rasgo previamente analizado, y al mismo
tiempo presentaron una asociación positiva ante el máximo número de células del
endosperma (p < 0,001; Tabla VI y Figura 17).
61
Nº
de c
élu
las d
el
en
do
sp
erm
a (
10
3)
0
50
100
150
200
250
300Gr1
Gr2
Gr3
Gr4
Días despues de antesis
0 5 10 15 20 25
0
50
100
150
200
250
300
a
b
Figura 15: Dinámicas del número de células del endosperma. Variación en el
número de células del endosperma de los granos 1 (Gr1; círculos llenos), 2 (Gr2;
círculos vacíos), 3 (Gr3; triángulos llenos) y 4 (Gr4; triángulos vacíos) de Bacanora (a) y
Kambara (b) desde antesis hasta 25 días después de antesis. Las barras verticales
representan el error estándar de las medias.
62
Tabla VI: Determinantes de las células endospermáticas de las 4 posiciones de
grano de los genotipos Bacanora y Kambara.
Caracter
Genotipo
Posición de grano
Grano 1 Grano 2 Grano 3 Grano 4
Máximo número de células (Nº cel)
Bac 277.996a ± 17.389 256.786
ab ± 14.723 273.042
a ± 10.302 219.257
b ± 15.182
Kam 275.211a ± 29.420 246.277
ab ± 17.753 238.247
ab ± 42.127 158.094
c ± 26.495
Tasa de división celular (Nº cel d-1)
Bac 25.900a ± 308 21.662
abc ± 1.325 22.460
ab ± 2.060 17.058
c ± 921
Kam 21.324abc
± 717 17.064c ± 3.648 20.527
b ± 1.068 10.764
d ± 1.429
Duración de la división celular (d)
Bac 15,29d ± 0,04 16,96
cd ± 0,42 18,88
bc ± 0,22 19,91
ab ± 0,62
Kam 18,19bc
± 0,84 19,43ab
± 0,48 18,90bc
± 0,78 21,24a ± 1,18
63
Nº células endospermáticas (10
3)
0 50 100 150 200 250 300 350
Pe
so
de
gra
no
(m
g)
0
20
40
60
80
Bac
Kam
y = 1,8x10-4
+ 8,05
R2 = 0,46
p = 0,06
Figura 16: Asociación entre el peso y el número de células endospermáticas de
los granos. Relación entre el peso alcanzado por los granos (Gr1, Gr2, Gr3 y Gr4) de
Bacanora (Bac) y Kambara (Kam) a cosecha, ante el máximo número de células del
endosperma de los mismos. Se advierte la recta de regresión, sensibilidad (R2), la
probabilidad (p) y el error estándar de las medias (barras verticales y horizontales).
64
Tasa de division celular (10
3cel d
-1)
0 5 10 15 20 25 30
Nº
cé
lula
s e
nd
osp
erm
áti
cas
(10
3)
0
50
100
150
200
250
300
350
Bac
Kam
y = 8,09x + 84641,30
R2 = 0,86
p < 0,001
Figura 17: Asociación entre la tasa de división celular y el máximo número de
células del endosperma. Relación entre la máxima tasa de división celular de los
granos (Gr1, Gr2, Gr3 y Gr4) de Bacanora (Bac) y Kambara (Kam), ante el máximo
número de células del endosperma alcanzado por llos mismos. Se advierte la recta de
regresión, sensibilidad (R2), la probabilidad (p) y el error estándar de las medias (barras
verticales y horizontales).
65
4.6 Extensión de las células del pericarpio de los granos 2 y 3 de Bacanora y
Kambara.
4.6.1 Extensión de las células del pericarpio externo de los granos 2 y 3 de
Bacanora y Kambara.
Antes de los 5 DDA, las CPE de los granos 2 y 3 presentaron largos y anchos
dispares, ambas dimensiones mostraron un crecimiento continuo en función del tiempo,
haciéndose más amplias sus diferencias en tamaño (Figuras 18 y 19). Cerca de antesis,
el largo de las CPE no superó los 40 m y el ancho fue menor a 14 m (Tabla VII). A los
29 DDA, las células de Bacanora ampliaron el largo y ancho a 150 m y 28 m,
respectivamente. Las células de Kambara sobrepasaron los 170 m de largo y 25 m
de ancho (Tabla VII). El crecimiento continuo de las células las llevó a duplicar su ancho
y extender su largo hasta más de 8 veces el tamaño inicial.
66
Figura 18: Crecimiento de las células del pericarpio externo de los granos 2 y 3 de
Bacanora. Variación de tamaño de las células del pericarpio externo de los granos 2 (a,
b y c) y 3 (d, e y f) de Bacanora, a diferente días después de antesis (5, 13 y 29 DDA).
Las células se tiñeron con verde de metilo, se indica el ancho (flecha negra) y largo
(flecha roja) de las paredes celulares. El tamaño de referencia es de 50 m, y la imagen
de 27 DDA fue reducida (2:1) para una mejor visualización de las células.
Bac Gr2
50 µm 50 µm50 µm
5 13 29
DDA
50 µm 50 µm
Bac Gr3
5 13 29
DDA
a b c
d e f
67
Figura 19: Crecimiento de las células del pericarpio externo de los granos 2 y 3 de
Kambara. Variación de tamaño de las células del pericarpio externo de los granos 2 (a,
b y c) y 3 (d, e y f) de Kambara, a diferente días después de antesis (3, 13 y 27 DDA).
Las células se tiñeron con verde de metilo, se indica el ancho (flecha negra) y largo
(flecha roja) de las paredes celulares. El tamaño de referencia es de 50 m, y la imagen
de 27 DDA fue reducida (2:1) para una mejor visualización de las células.
Kam Gr2
3 13 27
DDA
Kam Gr3
3 13 27
DDA
50 µm 50 µm 50 µm
50 µm50 µm 50 µm
a b c
d e f
68
Tabla VII: Variación de tamaño de las células del pericarpio externo de los granos
2 y 3 de los genotipos Bacanora y Kambara.
Posición de grano
Caracter
Genotipo
Grano 2 Grano 3
Tamaño inicial Tamaño final Tamaño inicial Tamaño final
Largo células pericarpio ( m)
Bac 41,28a ± 6,54 155,12ª1 ± 4,42 25,61ab ± 1,52 158,71ª1 ± 6,12
Kam 30,26ab ± 7,99 170,43ª1 ± 7,85 20,27b ± 4,34 164,60ª1 ± 2,23
Ancho células pericarpio ( m)
Bac 12,74ª2 ± 0,66 29,78ª3 ± 1,45 12,49ª2 ± 0,58 27,42ab3 ± 0,38
Kam 13,60ª2 ± 2,07 26,02b3 ± 1,20 11,94ª2 ± 0,68 25,28b3 ± 0,25
69
4.6.2 Dinámicas de la extensión de las células del pericarpio externo de los
granos 2 y 3 de los genotipo Bacanora y Kambara.
Las CPE de los granos 2 y 3 de Bacanora se extendieron longitudinalmente
hasta aproximadamente 20 DDA (Figura 20a) y las células de Kambara superaron dicho
periodo (Figura 20b). Desde ese momento, las células detuvieron su extensión y
mantuvieron valores constantes. Las 2 posiciones de grano siguieron dinámicas de
crecimiento semejantes, alcanzando el mismo tamaño, tasa y tiempo de extensión de
sus células (Figuras 20a y 20b).
El análisis de las dinámicas de las CPE, determinó que el largo máximo
alcanzado por las células de Bacanora fue de 150 m, mientras que las células de
Kambara fueron 20 m más largas (Tabla VIII). Las CPE de Kambara se extendieron
hasta los 25,5 DDA, mientras que las de Bacanora hasta los 15 DDA. La tasa de
extensión celular fluctuó entre 6,2 y 10,7 m d-1, siendo superior en Bacanora (Tabla
VIII). Estos 3 determinantes de la extensión de las CPE fueron afectados por el
genotipo (p <0,001), pero presentaron escasas o nulas diferencias entre las 2
posiciones de grano.
70
Días despues de antesis
0 10 20 30 40
0
40
80
120
160
200 b
La
rgo
cé
lula
s p
eri
ca
rpio
ex
tern
o (
m)
0
40
80
120
160
200 Gr2
Gr3 a
Figura 20: Dinámicas de extensión de las células del pericarpio externo. Variación
del largo de las células del pericarpio de los granos 2 (Gr2; círculos llenos) y 3 (Gr3;
círculos vacíos) de Bacanora (a) y Kambara (b) desde antesis hasta 35 días después de
antesis. Las barras verticales representan el error estándar de las medias.
71
Tabla VIII: Determinantes de la extensión de las células del pericarpio de los
granos 2 y 3 de los genotipo Bacanora y Kambara.
Caracter
Genotipo
Posición de grano
Grano 2 Grano 3
Máxima extensión celular ( m)
Bac 148,87b ± 2,62 143,34b ± 2,82
Kam 172,80a ± 3,29 171,94a ± 2,50
Duración de la extensión celular (d)
Bac 15,66b ± 0,34 15,24b ± 0,70
Kam 25,55a ± 0,46 26,43a ± 1,35
Tasa de extensión celular ( m d-1)
Bac 9,17b ± 0,25 10,70b ± 1,03
Kam 6,43a ± 0,46 6,27a ± 0,30
72
4.6.3 Similitud entre las dinámicas de extensión longitudinal de las células del
pericarpio externo y la elongación de los granos 2 y 3 de Bacanora y
Kambara.
Las dinámicas de extensión de las CPE de los granos 2 y 3 de Bacanora,
siguieron un patrón de crecimiento longitudinal idéntico a la elongación de los mismos
granos, alargándose aceleradamente hasta aproximadamente los 15 DDA, continuando
con una menor variación de tamaño a medida que se acercaron a las máximas
dimensiones (20 DDA). Desde esa fecha los granos y células se mantuvieron en forma
constante (Figuras 21a y 21b).
En Kambara se repitió la similitud entre las dinámicas de elongación de los
granos y la extensión de las CPE. Ambas siguieron un aumento continuo de tamaño
desde antesis hasta aproximadamente 25 DDA, momento a partir del cual detuvieron su
extensión (Figuras 22a y 22b).
La variación de elongación de los granos y de extensión de las CPE, desde
antesis a los máximos fue mayor a nivel celular, este caracter generó que las tasas de
extensión celular sean más abruptas que las de elongación de los mismos granos
(Figuras 21a, 21b, 22a y 22b).
73
La
rgo
de
cé
lula
s d
el
pe
ric
arp
io e
xte
rno
(m
)
0
50
100
150
200
La
rgo
de
gra
no
(m
m)
0
2
4
6
8
10Largo CPE
Largo Gr
a
Días despues de antesis
0 10 20 30 40
0
50
100
150
200
0
2
4
6
8
10b
Figura 21: Dinámicas de extensión celular y del largo de los granos de Bacanora.
Variación en el largo de las células del pericarpio externo (Largo CPE; círculos llenos)
de los granos 2 (a) y 3 (b) de Bacanora ante el largo de grano (círculos vacíos) de los
mismos. Las líneas verticales corresponden al error estándar de las medias.
74
La
rgo
de
cé
lula
s d
el
pe
ric
arp
io e
xte
rno
(m
)
0
50
100
150
200
La
rgo
de
gra
no
(m
m)
0
2
4
6
8
10Largo CPE
Largo Gr
a
Días despues de antesis
0 10 20 30 40
0
50
100
150
200
0
2
4
6
8
10b
Figura 22: Dinámicas de extensión celular y del largo de los granos de Kambara.
Variación en el largo de las células del pericarpio externo (Largo CPE; círculos llenos)
de los granos 2 (a) y 3 (b) de Kambara ante el largo de grano (círculos vacíos) de los
mismos. Las líneas verticales corresponden al error estándar de las medias.
75
4.6.4 Similitud entre las dinámicas de extensión del ancho de las células del
pericarpio externo y el crecimiento del ancho de los granos 2 y 3 de
Bacanora y Kambara.
En los granos 2 y 3 de ambos genotipos, las CPE extendieron su ancho en forma
progresiva, siguiendo una dinámica de crecimiento relativamente semejante al
crecimiento del ancho de los mismos granos. Los granos de Bacanora mostraron una
leve superioridad en el ancho de las CPE, pero no es estadísticamente concluyente
(Figuras 23a y 23b).
76
Días despues de antesis
0 10 20 30 40 50 60
0
10
20
30
40
0
2
4
6
An
ch
o d
e c
élu
las d
el
peri
carp
io e
xte
rno
(m
)
0
10
20
30
40
An
ch
o d
e g
ran
o (
mm
)
0
2
4
6
Ancho CPE Gr2
Ancho CPE Gr3
Ancho Gr2
Ancho Gr3
a
b
Figura 23: Dinámicas del ancho celular y ancho de los granos. Comparación entre
las dinámicas de crecimiento del ancho de los granos 2 (círculos llenos) y 3 (círculos
vacíos) de Bacanora (a) y Kambara (b) ante el crecimiento del ancho de las células del
pericarpio externo de los mismos granos (CPE Gr2: gris oscuro; CPE Gr3: gris claro).
Las líneas verticales corresponden al error estándar de las medias.
77
4.6.5 Extensión de las células cruzadas de los granos 2 y 3 de Bacanora y
Kambara.
Próximo a antesis (< 5 DDA), las dimensiones de las células cruzadas de los
granos 2 y 3 de ambos genotipos fueron menores a 40 m de largo y 7 m de ancho,
siendo levemente mayores las dimensiones de las células de Bacanora (Figuras 24 y
25). Tras 27 DDA, las células cruzadas alcanzaron tamaños superiores a 110 m y 16
m de ancho (Tabla IX). Este crecimiento permitió a las células de los granos de
Bacanora duplicar su ancho y triplicar su largo, mientras que las células de Kambara
superaron esas diferencias de tamaño (Tabla IX).
78
Figura 24: Crecimiento de las células cruzadas de los granos 2 y 3 de Bacanora.
Variación de tamaño de las células cruzadas de los granos 2 (a, b y c) y 3 (d, e y f) de
Bacanora, a diferente días después de antesis (5, 13 y 29 DDA). Las células se tiñeron
con verde de metilo, se indica el ancho (flecha negra) y largo (flecha roja) de las
paredes celulares. El tamaño de referencia es de 50 m, y la imagen de 27 DDA fue
reducida (2:1) para una mejor visualización de las células.
Bac Gr2
5 13 29
DDA
Bac Gr3
5 13 29
DDA
50 µm 50 µm 50 µm
50 µm 50 µm 50 µm
a b c
d e f
79
Figura 25: Crecimiento de las células cruzadas de los granos 2 y 3 de Kambara.
Variación de tamaño de las células cruzadas de los granos 2 (a, b y c) y 3 (d, e y f) de
Kambara, a diferente días después de antesis (3, 13 y 27 DDA). Las células se tiñeron
con verde de metilo, se indica el ancho (flecha negra) y largo (flecha roja) de las
paredes celulares. El tamaño de referencia es de 50 m, y la imagen de 27 DDA fue
reducida (2:1) para una mejor visualización de las células.
Kam Gr2
3 13 27
DDA
Kam Gr3
3 13 27
DDA
50 µm 50 µm50 µm
50 µm 50 µm 50 µm
a b c
d e f
80
Tabla IX: Variación de tamaño de las células cruzadas de los granos 2 y 3 de los
genotipo Bacanora y Kambara.
Posición de Grano
Caracter
Genotipo
Grano 2 Grano 3
Tamaño inicial Tamaño final Tamaño inicial Tamaño final
Largo células cruzadas ( m)
Bac 44,20ª2 ± 3,26 126,56ab3 ± 7,88 38,08ab2 ± 2,20 109,29bc3 ± 5,71
Kam 30,37bc2 ± 4,00 127,71ª3 ± 4,43 26,09c2 ± 3,28 98,19c3 ± 1,17
Ancho células cruzadas ( m)
Bac 8,08a ± 0,46 18,49ª1 ± 2,80 7,17ab ± 0,22 14,48ª1 ± 0,40
Kam 6,42b ± 0,15 16,37ª1 ± 0,44 6,33b ± 0,40 15,79ª1 ± 0,50
81
4.6.6 Similitud entre las dinámicas de extensión de las células cruzadas y el
crecimiento del ancho de los granos 2 y 3 de Bacanora y Kambara.
Las células cruzadas de los granos 2 y 3 de ambos genotipos, crecieron en
forma progresiva en función del tiempo, tanto en ancho como en largo (transversal al
grano). Esta última presentó una dinámica relativamente semejante al crecimiento del
ancho de los mismos granos (Figuras 26a y 26b). Este caracter mostró una baja
diferencia a nivel de genotipo y posición de grano.
82
La
rgo
cé
lula
s c
ruza
da
s (
m)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
An
ch
o d
e g
ran
o (
mm
)
0
2
4
6
Largo CC Gr2
Largo CC Gr3
Ancho Gr2
Ancho Gr3
a
Días despues de antesis
0 10 20 30 40 50 60
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0
2
4
6b
Figura 26: Dinámicas del largo de las células cruzadas y ancho de los granos.
Comparación entre la variación del largo de las células cruzadas (CC) de los granos 2
(círculos llenos) y 3 (círculos vacíos) de Bacanora (a) y Kambara (b), ante la dinámica
de ancho de los mismos (CC Gr2: gris oscuro; CC Gr3: gris claro). Las líneas verticales
corresponden al error estándar de las medias.
83
4.7 Expresión de expansinas en los granos 2 y 3 de los genotipos Bacanora y
Kambara.
El tamaño de los productos de las 6 expansinas, fueron similares a los productos
planteados teóricamente (Tabla I; Figura 27). El control positivo 18S se expresó en
forma constitutiva. Los controles negativos de RT-PCR y PCR confirmaron la ausencia
de RNA y DNA contaminante en las preparaciones (Figura 27).
La reamplificación (materiales y métodos 3.2.11), secuenciación (Macrogen,
Corea) y análisis (Geneious Pro 4.7.6. y ClustalX) de los productos de PCR de 4
expansinas (pTaExpA6c, pTaExpA4, pTaExpA5 y pTaExpA8), confirmó su relación e
identidad con otras expansinas previamente descritas (BLASTn). La pTaExpA6c
presentó un 94% de identidad con la familia de expansinas A6, la pTaExpA4 tuvo un
91% de identidad con la expansinas A4, la pTaExpA5 reveló una identidad del 100%
con las A4 y finalmente la pTaExpA8 presentó una identidad del 96% con las
expansinas de trigo A8 (Tabla X).
84
Figura 27: Peso molecular de las 6 expansinas, 18S y controles negativos. Peso
molecular de los productos de PCR de las 6 expansinas (Tabla I) estudiadas, del control
positivo (18S) y de los controles negativos (PCR y RT-PCR). Se indica el peso
molecular del estándar de 50 pb y el peso molecular de los productos de PCR (M).
85
Tabla X: Productos de PCR reamplificados e identidad con otras expansinas
previamente descritas.
Expansinas pb Nº de
Acceso
Gen
expansinas Identidad
pTaExpA6c 182 AY543532 TaExpA6 94%
pTaExpA4 148 AY543530 TaExpA4 91%
pTaExpA5 74 FN556067 TaExpA5 100%
pTaExpA8 97 AY543534 TaExpA8 96%
86
4.7.1 Niveles de expresión de las 6 expansinas en los granos 2 y 3 de los
genotipos Bacanora y Kambara.
Los máximos niveles de expresión de las 6 expansinas se registraron en los
primeros DDA, estos disminuyeron en función del tiempo. Este comportamiento fue
relativamente semejante en los 2 genotipos y granos (Figuras 28a, 28b, 29a y 29b).
Individualmente, el grano 2 de Bacanora presentó las mayores expresiones de
expansinas a los 6 y 11 DDA, con una escasa variación entre ambas fechas. Desde los
18 DDA, las 6 expansinas declinaron su expresión. A los 26 y 34 DDA las expansinas
presentaron su menor expresión, con escasa diferencias entre ellas (Figura 26a).
En el grano 3 de Bacanora, las 6 expansinas declinaron su expresión a medida
que transcurrían los DDA, pero esta disminución varió de acuerdo a la repetición y
expansina estudiada. Por ejemplo, la pTaExpA5 (R1) prolongó la máxima expresión
hasta los 18 DDA, mientras que las restantes siguieron una dinámica semejante a las
del grano 2 (Figura 28b). En la repetición 2 (R2), las 6 expansinas mantuvieron una alta
expresión hasta los 18 DDA, posteriormente declinaron la expresión en forma abrupta
(Figura 28b). Finalmente, la repetición 3 (R3), advirtió una paulatina disminución en
expresión de las expansinas a medida que aumentaban los DDA (Figura 28b).
La expresión de las 6 expansinas en los granos 2 y 3 de Kambara, siguieron un
comportamiento semejante al de los granos de Bacanora. A los 4, 9 e inclusive 16 DDA,
presentaron la mayor expresión, seguido de una disminución de las mismas. Un caso
particular lo presentó la repetición 2 (R2) en ambos granos, donde a los 4 DDA registró
una baja expresión, la cual aumentó en las siguientes mediciones (9 y 16 DDA) y
posteriormente volvió a disminuir (Figuras 29a y 29b).
87
Figura 28: Expresión de las expansinas en los granos 2 y 3 de Bacanora.
Expresión de las 6 expansinas (pTaExpA6a, pTaExpA6b, pTaExpA6c, pTaExpA4,
pTaExpA5 y pTaExpA8) y control positivo (18S) en los granos 2 (a) y 3 (b) de Bacanora.
Se registran las 3 repeticiones de cultivo (R1, R2 y R3) y los distintos DDA (6, 11, 18, 26
y 34) en que se realizó la amplificación.
a
b
88
Figura 29: Expresión de las expansinas en los granos 2 y 3 de Kambara. Expresión
de las 6 expansinas (pTaExpA6a, pTaExpA6b, pTaExpA6c, pTaExpA4, pTaExpA5 y
pTaExpA8) y control positivo (18S) en los granos 2 (a) y 3 (b) de Kambara. Se registran
las 3 repeticiones de cultivo (R1, R2 y R3) y los distintos DDA (6, 11, 18, 26 y 34) en
que se realizó la amplificación.
a
b
89
4.7.2 Dinámicas de expresión de las 6 expansinas en los granos 2 y 3 de los
genotipos Bacanora y Kambara.
La semicuantificación y posterior normalización de los productos de PCR, reveló
que la expresión del control positivo 18S se mantuvo en forma constitutiva y semejante
en cada una de las repeticiones (Figuras 30a, 30b, 30c y 30d). La expresión de las 6
expansinas en ambos genotipos mostró un decaimiento sigmoideo en función del
tiempo (DDA). Las 2 fechas más cercanas a antesis presentaron la mayor expresión de
las expansinas. Con posterioridad (> 18 DDA), se registró una disminución en la
expresión de las 6 expansinas, haciéndose menor a medida que transcurrían los días,
donde las 2 últimas fechas de muestreo presentaron menor expresión (26 DDA y 34
DDA). Los granos 3 de ambos genotipos siguieron una dinámica semejante, pero más
distendida en el tiempo. A nivel de genotipo, los granos de Bacanora registraron una
menor expresión de expansinas en las ultimas fechas de análisis (Figuras 30b y 30d).
90
Días despues de antesis
0 10 20 30
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0 10 20 30
Exp
resio
n d
e e
xp
an
sin
as(%
rela
tivo
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
pTaExpA6a
pTaExpA6b
pTaExpA6c
pTaExpA4
pTaExpA5
pTaExpA8
18S
a b
c d
Figura 30: Dinámica de expresión de las expansinas de Bacanora y Kambara.
Variación en la expresión de las 6 expansinas (pTaExpA6a: círculos llenos, pTaExpA6b.
círculos vacíos, pTaExpA6c: triángulos llenos, pTaExpA4: triángulos vacíos, pTaExpA5:
cuadrados llenos y pTaExpA8: cuadrados vacíos) y el control positivo (18S: rombos
llenos) a diferentes DDA de los granos 2 y 3 de Bacanora (a y b) y Kambara (c y d). Los
gráficos muestra el promedio del decaimiento en porcentaje relativo de las distintas
expansinas y el error estándar de la media. La línea continua representa el promedio
del decaimiento de la expresión de las expansinas.
91
4.7.3 Dinámicas de expresión de expansinas, de elongación y acumulación de
contenido hídrico de los granos 2 y 3 de los genotipos Bacanora y
Kambara.
En promedio, hasta los 11 DDA los granos 2 de ambos genotipos presentaron la
máxima expresión de expansinas, momento paralelo a una fuerte acumulación de agua
al interior de los granos, y un acelerado alargamiento de los granos y células del
pericarpio. A contar de los 16 y 18 DDA diminuyó la expresión de las expansinas, al
igual que la tasa de alargamiento de los granos, mientras se mantenía la acelerada
acumulación de agua. Finalmente, las expansinas tuvieron su menor expresión después
de 24 y 26 DDA, momentos en los cuales los granos habían detenido su elongación y el
contenido hídrico se mantenía estable (Figuras 31a y 31c).
En los granos 3 de ambos genotipos, la máxima expresión se extendió
levemente hasta los 16 y 18 DDA, período en que los granos aún se encontraban en
activo alargamiento y captación de agua. Posteriormente, la expresión de expansinas
disminuyó progresivamente, mostrando su menor expresión a los 32 y 34 DDA,
momento en la cual los granos cesaron su alargamiento y el contenido hídrico se
mantenía estable (Figuras 31b y 31d).
92
La
rgo
de
gra
no
, c
on
ten
ido
hid
ric
o,
ex
pre
sio
n d
e e
xp
an
sin
as
(%
re
lati
vo
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
E Exp
Largo Gr
CH
a
0 10 20 30 40
d
Días despues de antesis
0 10 20 30 40
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0c
b
Figura 31: Dinámicas de expresión de expansinas, elongación de los granos y
contenido hídrico de los granos. Comparación entre el promedio de las dinámicas de
expresión de las expansinas (E Exp: círculos llenos y línea continua), las dinámicas de
elongación (largo Gr: círculos vacíos y línea discontinua) y de acumulación de agua
(CH: cuadrados llenos y línea punteada) de los granos 2 y 3 de Bacanora (a y b) y
Kambara (c y d) desde antesis a 50 DDA. Se ilustran las curvas representativas de las
diferentes dinámicas.
93
5.0 DISCUSIÓN
Los dos genotipos (Bacanora y Kambara) estudiados confirmaron sus diferencias
de peso (inferido de Rajaram, 2005), a la vez presentaron diferencias en las dinámicas
de crecimientos y caracteres que las diferencian (Miralles y Slafer, 1995). Esto potencia
a los genotipos estudiados como buenos modelos de análisis comparativo de trigo.
Constantemente los granos de las posiciones 1, 2 y 3 de Kambara superaron a los de
Bacanora en peso, volumen, largo, alto y ancho, además de los determinantes de la
elongación y contenido hídrico, entre otros. Los granos 4 de ambos genotipos
presentaron dinámicas y determinantes de crecimiento más retrasadas, erráticas y de
menor valoración, provocando una proximidad estadística entre ambos genotipos (Tabla
II, III, IV y otras).
Las mayores dimensiones, contenidos hídricos y tasas crecimiento logrados por
los granos de la posición 2, le permitieron alcanzar mayores volúmenes y pesos de
grano (Saini y Wesgate, 2000). Los granos 1 y 3 siguieron dinámicas de crecimiento
menores a las del grano 2, pero relativamente semejante entre ellos. El grano 4
presento las menores valoraciones a excepción del tiempo. Estos resultados
concuerdan con trabajos anteriores (Saini y Westgate, 2000; Calderini y Reynolds,
2000; Wardlaw et al., 1995).
El rango de peso alcanzado por los granos a cosecha (36,0 a 66,5 mg), es mayor
al reportado por los estudios de trigo con períodos de llenado extendidos (39-59 mg;
Dimmock y Gooding, 2002). El peso de los granos registró una alta correlación con el
volumen (Figura 6; Saini y Wesgate, 2000), el MCH (Figura 10; Saini y Wesgate, 2000)
94
y la tasa de acumulación de materia seca (Figura 9) de los mismos. Estas asociaciones
explican que el peso de los granos no solo fue efecto de la tasa de llenado, sino que
tienen una íntima asociación con el volumen y el contenido hídrico.
La dinámica de peso de los granos desde antesis a madurez fisiológica, describió
una curva de crecimiento sigmoideo (Satorre et al., 2003). El período de lento
crecimiento (Fase lag) fue mayor en los granos de Kambara (Tabla III, Figuras 7 y 8).
Los granos de Kambara se mantuvieron en crecimiento exponencial bajo 45 días, los
granos de Bacanora extendieron esta etapa 2 días. El menor tiempo de fase
exponencial y el mayor peso alcanzado por los granos de Kambara, determinó que la
diferencia de peso entre ambos genotipos y posiciones de grano, es producto de la tasa
de acumulación de materia seca, en lugar de la duración del llenado (Sofield et al.,
1977; Miralles y Slafer, 1995).
Las dinámicas de contenido hídrico siguieron curvas parabólicas desde antesis a
cosecha (Figuras 7 y 8). Los granos de Bacanora acumularon agua hasta
aproximadamente 20 DDA, los granos de Kambara extendieron este periodo en 5 días
(Tabla IV), sobrepasando lo predicho por Sofield et al., (1977) que estimaba este
período entre 14 y 21 DDA. La extensión de este período fue principalmente
consecuencia de las menores temperaturas, que afectaron las dinámicas hídricas del
crecimiento de los granos (Sofield et al., 1977). La tasa de acumulación de agua fue
indiferente entre los genotipos (Pepler et al., 2005), pero sí entre posiciones de grano.
El período de plateau hídrico (Sofield et al., 1977), culminó a los 44 DDA (Tabla IV), sin
discriminación de genotipo ni de posición de grano, siendo ligeramente anterior a
madurez fisiológica (Figuras 7 y 8) y no en forma conjunta como lo establece Sofield et
95
al., (1977), Schnyder y Baum, (1992) y Pepler et al., (2005). Considerando que las tasas
de acumulación de agua son similares y que los granos de Kambara alcanzaron
mayores contenidos hídricos (Tabla IV), sostiene que el principal agente de variación en
el MCH fue el tiempo. La variación de los determinantes que afectan las dinámicas de
agua y la paridad temporal con las dinámicas de peso, sostienen su vinculación con el
llenado de grano (Sofield et al., 1977; Schnyder y Baum, 1992; Pepler et al., 2005).
La dinámica del número de células endospermáticas fue semejante a la descrita
por Gleadow et al., (1982). Aunque los granos de Kambara presentaron mayores
tiempos de división celular, no fueron suficientes para alcanzar el máximo número de
células. Este atributo fue afectado principalmente por la tasa de división, existiendo una
fuerte correlación entre ambas variables (tasa de división celular vs máximo número de
células del endosperma). Por otra parte, la relación entre el peso final de los granos y el
máximo número de células del endosperma presentó una asociación débil (R2 = 0,46),
por lo que este atributo no jugó un papel importante en la determinación del peso de los
granos, como ha sido indicado en estudios previos (Brocklehurst, 1977; Borrás et al.,
2004). Considerando que el tiempo de división celular estuvo entre los períodos de
máxima elongación de los granos y máxima tasa de acumulación de agua, la dinámica
del número de células del endosperma estaría direccionada inicialmente a la división
celular y posteriormente a la acumulación de asimilados.
La acelerada elongación de los granos en los primeros DDA, permitió que estos
alcancen longitudes entre 6,70 y 8,50 mm (Tabla V), los que presentaron una fuerte
asociación con el peso final de los mismos (Figura 5). La dinámica de elongación de los
granos responde fuertemente a una curva hiperbólica (Tashiro y Wardlow, 1990) y no a
96
las sigmoides adaptadas para entender las dinámicas del peso seco y la acumulación
de contenido hídrico (Calderini et al., 1999b). Aunque la tasa de elongación de los
granos favoreció a Bacanora, la diferencia de tiempo entre ambos cultivares en alcanzar
la estabilización del largo, permitió a los granos de Kambara alcanzar mayores
longitudes. El tiempo en que los granos lograron su máxima longitud, cubre las
dinámicas de células endospermáticas (Lizana et al., 2009; Philippe et al., 2006),
coincide con los primeros días de la fase exponencial del llenado de grano y es anterior
a que los granos alcancen el MCH, advierte que el largo de loas granos se establece en
forma temprana, y de forma independiente a los otros caracteres que afectan el peso de
los granos. Ésto hace más cercana la hipótesis, de que el peso de los granos está
fuertemente determinada por el crecimiento del pericarpio (Calderini et al., 1999a, b;
Calderini y Reynolds, 2000).
El examen microscópico de las CPE de los granos 2 y 3 de ambos genotipos,
revelaron que estas extendieron sus dimensiones de largo y ancho en función del
tiempo (Figuras 18 y 19). Inicialmente las células fueron compactas y regulares, pero a
medida que avanzó el crecimiento de los granos, derivaron a células altamente
contrastantes en su largo y ancho (Tabla VII, Figura 18 y 19). El alargamiento de las
CPE describió una curva hiperbólica semejante a las de elongación de los granos
(Figura 20), siguiendo una acelerada extensión en los primeros DDA, la cual detuvieron
y se mantuvieron en forma constante a contar los 15 DDA. Lo anterior permitió que el
largo de las células creciera de 20 m (3-5 DDA) a más de 150 m (> 15 DDA; Tabla
VIII). Comparativamente, no existieron diferencias en tamaño, tasa y tiempo de
extensión entre las 2 posiciones de grano, pero a nivel de genotipo, las células de
97
Kambara alcanzaron una mayor extensión celular por efecto del tiempo (Tabla VIII). El
bajo número de granos analizados, no permitió establecer si las máximas extensiones
celulares están correlacionadas con la tasa o tiempo de extensión, pero un examen
preliminar arrojó que la máxima extensión de las CPE estuvo fuertemente asociada con
el largo de los granos (datos no mostrados).
El examen comparativo entre las dinámicas de elongación de los granos y de
extensión de sus células, mostró una alta similitud entre ambas dinámicas, siendo
sumamente coincidentes en el tiempo en que ambas dinámicas detuvieron su
crecimiento (Figuras 21 y 22). Considerando los resultados de la extensión de las
células del pericarpio, la elongación de los granos y la incidencia del peso de los
carpelos florales sobre el peso final de los mismos (Calderini et al., 1999b), soportan la
hipótesis que el peso de los granos está fuertemente afectado por el crecimiento del
pericarpio.
Las dinámicas del volumen, ancho y alto de los granos se mantuvieron en
crecimiento hasta madurez fisiológica (45 DDA) y desde el cual contrajeron sus
dimensiones (Tashiro y Wardlaw, 1990; Pepler et al., 2005). La diferencia de tiempo que
determinan del largo y las otras dimensiones del grano, advertirían que el largo de
grano tendría una mayor implicancia en la determinación del peso que el ancho y alto
de los mismos.
A pesar del bajo número de datos analizados para describir el ancho de las CPE
y el largo de las células cruzadas, en ambos tipos celulares se aprecio una extensión de
sus dimensiones en función del tiempo (Tablas VII y IX). Las células cruzadas
transitaron de células compactas y regulares, a células de fuerte contraste entre su
98
ancho y largo (Figuras 24, 25 y 26). Tanto el ancho de las CPE y al largo de las células
cruzadas siguieron una dinámica de crecimiento relativamente semejante al crecimiento
del ancho de los granos (Figuras 23 y 26), transformando este carácter en un buen
candidato de analisis futuros.
De acuerdo a lo descrito por Miralles et al., 1998, a los 15 DDA el largo y ancho
de las células del pericarpio no variarían según las diferentes o nula presencia de genes
del enanismo, atribuyendo que el genotipo no incide en el tamaño de las células del
pericarpio, y que los diferentes tamaños de grano sería efecto del número de células.
En este estudio se estableció que el largo de las CPE de Kambara fue mayor a las de
Bacanora, mientras que el ancho de las CPE y largo de las células cruzadas favorece a
los granos de Bacanora. Las diferencias entre los anchos de las CPE y largo de las
células cruzadas no pudieron ser resueltas aún, ya que la medición de sus células está
inmersa en las dinámicas de crecimiento del ancho de los granos, a diferencia del largo
de las CPE, que cubre completamente la dinámica de elongación de los granos.
La disparidad entre las dinámicas de elongación de los granos 2 y 3 de ambos
genotipos (Figura no mostrada), fue por efecto de su genotipo y las condiciones de
crecimiento (Miralles et al. 1998), hecho que se repitió en el llenado de grano. Esto da
pie a que su elongación fue afectada por la variación de contenido hídrico, los
determinantes de la elongación de los granos, extensión de sus células del pericarpio o
un factor molecular que interceda entre ambos rasgos. Ante lo ultimo, se ha descrito
una fluctuante expresión de transcritos en diferentes etapas del crecimiento del grano
(Laudencia-Chingcuanco et al., 2007) y entre ellas se encontrarían las expansinas.
99
Por la amplitud cromosómica del trigo, Liu et al., (2007), se ha estimado al menos
30 expansinas. Algunas se les ha descrito expresión en diferentes estructuras y etapas
de desarrollo del trigo, al igual que en diferentes etapas de crecimiento del grano (Lin et
al., 2005; Lizana et al., 2009). El RT-PCR de las 6 expansinas analizadas, describieron
niveles de expresión similares en los granos 2 y 3, al igual que en las 3 repeticiones de
ambos genotipos. En los primeros DDA expresaron altos niveles de transcritos, los que
se hicieron menores en función del tiempo (Figuras 28, 29 y 30). Este comportamiento
que presentaron las 6 expansinas en estudio, advirtiendo un solapamiento en su función
biológica (Lin et al., 2005). Los granos 2 de ambos genotipos presentaron su mayor
nivel de expresión ente 4 y 11 DDA (Figuras 30 y 31), momento en el cual los granos
estaban en su mayor período de elongación y acumulación de agua (Figuras 30 y 31),
semejante a la alta expresión descrita en tallos en elongación (anteras y filamentos del
tallo; Liu et al., 2007). A contar del los 16 DDA, los granos presentaron una disminución
en el nivel de expresión de las 6 expansinas (Figuras 30 y 31), momento próximo a la
máxima elongación de grano y en paralelo al ingreso de agua en los granos (Figura 31).
Tras 24 DDA, los niveles de expresión de las 6 expansinas se encontraron en su menor
e inclusive nula expresión (Figuras 28 y 29), período coincidente con fin de la
elongación de los granos y contenido hídrico estable (Figura 31). En los granos 3 de
ambos genotipos, la alta expresión de las 6 expansinas se extendió hasta los 16 DDA,
continuando con una disminución de sus niveles de expresión. Este comportamiento se
vio repetido en sus repeticiones (Figuras 28 y 29). Cabe destacar que la secuencia de
estas expansinas exhibieron una alta similitud con las expansinas previamente descritas
en las bases de datos (Tabla X), y que sus niveles de expresión fueron propios de cada
100
expansinas, del genotipo, la posición de grano y la repetición (Lin et al., 2005; Lizana et
al., 2009).
Dinámicamente la expresión de las expansinas siguió un decaimiento sigmoideo,
el cual se vio extendido en los granos 3 (Figura 30). Su dinámica de decaimiento se
presentó distante a las dinámicas de llenado de grano, pero inmersas en los períodos
de mayor crecimiento de las células del pericarpio, elongación de los granos y
acumulación de agua (Figura 31). Lo anterior advierte que la expresión y traducción de
expansinas, jugarían un papel importante en el crecimiento de los granos, facilitando la
extensión de las paredes de las células del pericarpio, elongación del pericarpio y de los
granos, y que estos adquieran los volúmenes de grano necesarios para contener una
mayor cantidad de asimilados.
101
6.0 CONCLUSIONES
Los granos de Kambara alcanzaron mayores pesos, largos y volumen en
cosecha respecto a los granos de Bacanora, a la vez presentaron mayores valoraciones
de CHM, extensiones de las CPE y células cruzadas.
En ambos genotipos, los granos 2 alcanzaron los máximos valores de los
distintos caracteres estudiados, les continuaron los granos 1, 3 y finalmente el grano 4.
El tiempo que los granos requirieron para desarrollar sus los diferentes
caracteres aumentó a medida que el grano se alejaban del raquis.
Los granos de Bacanora presentaron el máximo número de células
endospermáticas y una mayor tasa de división celular que los granos de Kambara, pero
la fuerte variación estadística las convierte en un mal candidato para el análisis del peso
de los granos, por ello se hace necesario implementar modificaciones o reestablecer los
criterios para su medición.
La elongación de los granos se detuvo a contar de los 15 DDA en Bacanora y
sobre los 20 DDA en Kambara. El alto, ancho y volumen crecieron hasta madurez
fisiológica.
Las CPE y células cruzadas extendieron su ancho y largo a medida que
transcurrió el llenado de grano, derivando de células pequeñas, regulares y compactas,
a células sumamente contrastantes en sus dimensiones de largo y ancho. La variación
de tamaño de las células fue dependiente del genotipo, pero indiferente de la posición
de grano (Gr2 y Gr3).
102
Las CPE siguieron una dinámica de extensión idéntica a la elongación de los
granos, presentando tiempo de crecimiento semejante. El ancho de las CPE y largo de
las células cruzadas presentaron un crecimiento relativamente semejante al crecimiento
transversal de los granos.
El presente estudio confirma que las 6 expansinas previamente descritas,
pertenecen a la familia A4, A5, A6 y A8 de las expansinas, todas ellas presentaron una
expresión relativamente semejante a nivel de genotipo, repetición y posición de grano.
La máxima expresión de las 6 expansinas se desarrolló antes de los 10 DDA,
seguido de una disminución de la misma a medida que aumentaban los DDA. La
expresión de estas expansinas mostró una dinámica de decaimiento sigmoideo.
La mayor expresión de expansinas fue coincidente con los períodos de activa
elongación de los granos, acumulación de agua y extensión de las CPE. Los menores
niveles de expresión se presentaron cuando los granos ya habían finalizado la
elongación, la extensión de sus células y el contenido hídrico se mantenía estable.
103
7.0 CONSIDERACIONES
Las innovaciones y respuestas logradas con esta investigación permiten
complementar la hipótesis planteada por Calderini et al., (1998), en ella se establece
que el peso potencial de los granos está condicionado por el crecimiento del pericarpio.
Para ello sería necesario profundizar las dinámicas CPE a las 4 posiciones de grano,
extender el período de análisis desde antesis hasta madurez fisiológica, utilizar otros
genotipos y diferentes años de cultivo. Paralelamente sería conveniente seguir las
dinámicas de peso y contenido hídrico de las 2 capas de células del pericarpio
estudiadas y complementarlas con el análisis de expresión de expansinas a nivel de
transcritos y proteínas.
104
8.0 BIBLIOGRAFÍA
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