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Rev Inv Vet Perú 2015; 26(2): 328-341http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v26i2.11007

1 Laboratorio de Microbiología y Parasitología Veterinaria, 2 Laboratorio de Histología, Embriologíay Patología Veterinaria, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de SanMarcos, Lima, Perú

3 E-mail: amanchegos@gmail.com

Recibido: 4 de enero de 2014Aceptado para publicación: 18 de setiembre de 2014

Expresión de Citocinas Pro-Inflamatorias de Leucocitos de Alpaca(Vicugna pacos) Inducidos por el Extracto de Macroquistes de

Sarcocystis aucheniae

EXPRESSION OF PRO-INFLAMMATORY CITOKINES OF ALPACA (VICUGNA PACOS) LEUKOCYTESINDUCED BY EXTRACT OF MACROCYST OF SARCOCYSTIS AUCHENIAE

Rocío Hinostroza S.1, Alberto Manchego S.1,3, Nieves Sandoval C.2,Kim-Lam Chiok C.1, Juan More B.1

RESUMEN

El objetivo del trabajo fue determinar la expresión de citocinas pro-inflamatorias deleucocitos de alpaca mediante el enfrentamiento antigénico de extracto de macroquistesde Sarcocystis aucheniae a diversas dosis y tiempos de exposición. Se empleó unaconcentración de leucocitos de 500 000/ml expuestos a 0.5, 1, 50, 500 y 1000 ng de extractode macroquistes de S. aucheniae e incubados por 1, 12 y 24 h. Se extrajo los ARNmensajeros (ARNm) totales de cada tratamiento con Trizol y se utilizaron en una RT-PCRtiempo real con cebadores específicos de la citosina TNF-α e interleucinas IL-1α, IL-1β eIL-6. Se observó que los niveles de ARNm de IL-1α y TNF-α generados a 1 h de incubacióneran detectables y comparativamente elevados con respecto al calibrador (leucocitos noexpuestos a extracto). La IL-1β se encontró incrementada en la concentración de 1 ng/mla las 24 h, mostrando una cinética de expresión negativa en comparación con el controlno tratado. La IL-6 no se evidenció mediante RT-PCR tiempo real. Asimismo, se realizó laobservación de viabilidad leucocitaria a los tiempos de 1, 12 y 24 h permitiendo corrobo-rar el efecto tóxico del extracto de macroquistes de S. aucheniae a altas concentraciones.

Palabras clave: Sarcocystis aucheniae, interleucinas, pro-inflamatorias, alpaca

ABSTRACT

The aim of this research was to determine the expression of proinflammatory cytokinesfrom alpaca leukocytes through the antigenic challenge with macrocyst extract ofSarcocystis aucheniae at various doses and exposure times. Leukocytes in a concentrationof 500 000 cells/ml were exposed to concentrations of 0.5, 1, 50, 500 and 1000 ng of

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Expresión de citocinas pro-inflamatorias de leucocitos de alpaca

macrocyst extract of S. aucheniae and incubated for 1, 12 and 24 h. The total messengerRNA (mRNA) was extracted for each treatment using Trizol and used to perform real-timeRT-PCR with specific primers for cytokine TNF-α and interleukins IL-1α, IL-1β and IL-6.The generated mRNA levels of IL-1α and TNF-α at 1 h were detectable and higher incomparison to the calibrator (leukocytes not exposed to the extract). IL-1β increased atthe 1 ng/ml concentration at 24 h showing a negative kinetic expression when comparedwith the untreated control group. IL-6 was not evidenced by RT-PCR real time. In addition,the leukocytes viability at 1, 12 and 24 h corroborated the toxic effect of the macrocystextract of S. aucheniae at high concentrations.

Key words: Sarcocystis aucheniae, interleukins, pro-inflammatory, alpaca

INTRODUCCIÓN

Las alpacas son animales emblemáticosdel Perú, siendo su crianza un soporte eco-nómico del poblador alto-andino. Las enfer-medades infecciosas, tanto bacterianas comoparasitarias, son un freno para el desarrollode la ganadería alpaquera, dado que causandisminución de la eficiencia productiva, pér-dida de calidad de la fibra, decomiso de lacarne y muerte de los animales (Moro, 1987).

Una de las parasitosis más prevalentesen las alpacas y llamas del país es lasarcocystiosis, la que ocasiona merma en lacalidad de la carne, además de limitar su ventay consumo. La mayor parte de la poblaciónde camélidos adultos se encuentra infectado,con seroprevalencias de 89.7% (Castro et al.,2004), debido al estrecho contacto con losperros pastores, pues el perro es el hospede-ro definitivo más importante en este tipo decrianza (Choque et al., 2007); sin embargo,poco se conoce sobre los mecanismos de in-fección parasitaria por Sarcocystisaucheniae, la forma de estimulación del sis-tema inmune y el mecanismo de reconoci-miento de sus antígenos (Leguía, 1991).

Los extractos de macroquistes de S.aucheniae han demostrado contener proteí-nas con poder tóxico, como la sarcocystina,que produce alteraciones de distinta severi-dad en el tejido digestivo y nervioso, cuando

los quistes son ingeridos. Asimismo, la sus-ceptibilidad y resistencia a estas toxinas va-ría entre especies (Sam et al., 1998). La Perleet al. (1999) demostraron la presencia demiositis eosinofílica en los hospederos inter-mediarios, mientras que otros autores seña-lan una adaptación al parásito sin lesiones fí-sicas evidentes, pero con buena respuestainmune (Uggla y Boxton, 1990).

El presente trabajo estuvo enfocado adeterminar si existe una respuesta inicial (pro-inflamatoria) de los leucocitos de alpaca alenfrentamiento antigénico de extracto demacroquistes de S. aucheniae teniendo enconsideración el tiempo de exposición. Paraesto, se detectó la expresión de deinterleucinas pro-inflamatorias de leucocitoscirculantes.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales y Muestras

Para la obtención de leucocitos, se re-colectó 7 ml de sangre entera porvenopunción de cinco alpacas (3 hembras y2 machos) de dos años de edad, procedentesde un rebaño de alpacas del IVITAMaranganí, Cusco, Perú. Se utilizaronvacutainers conteniendo EDTA. Todos losanimales fueron negativos a la presencia deanticuerpos contra S. aucheniae en la prue-ba de ELISA.

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R. Hinostroza et al.

Los macroquistes de S. aucheniae serecolectaron de la musculatura cervical decinco alpacas naturalmente infectadas, quefueron sacrificadas en el camal municipal dela ciudad de Huancavelica. Se utilizó mate-rial estéril. Los quistes recolectados conser-vaban sus respectivas envolturas quísticas yestaban libres de fibras musculares. Lasmuestras fueron colocadas en suero salinotamponado (PBS) para evitar la deshidrata-ción.

Extracción de Antígenos de Macroquis-tes

Los macroquistes fueron molidos en unmortero frío conteniendo 5 ml de PBS hastaobtener una pasta homogénea. Luego secentrifugó por 10 min a 1200 g y a 4 °C. Elpellet resultante fue re-suspendido en MedioMínimo Esencial (MEM) en la proporción de1 en 2 y la suspensión fue sometida a ultra-sonido utilizando el sonicador Fisher-300(Thermo Fisher Scientific) por 60 ciclos/s enintervalos de 60 s. La destrucción de lasmembranas celulares fue verificada al mi-croscopio. Los productos sonicados fueroncentrifugados a 3000 g por 20 min, siguiendoel protocolo descrito por Sam et al. (1998).El sobrenadante y el pellet se almacenaronpor separado a -20 °C.

La concentración de proteínas totales(antígenos totales) del extracto obtenido delpellet fue medido mediante el Qubit® 2.0Quantitation Starter Kit (Invitrogen,California, EEUU), empleando el reactivodesignado para proteínas y siguiendo las ins-trucciones del fabricante. La concentraciónde antígeno total fue ajustada para los trata-mientos empleados mediante dilución enMEM libre de antibióticos.

Obtención de Leucocitos

La sangre fresca de las alpacas secentrifugó en forma inmediata a la colecta, a700 g por 10 min. La capa flogística fue se-parada en crioviales de 2 ml. Los glóbulos

rojos de la capa flogística se retiraron agre-gando PBS 0.15M pH 7.2 y centrifugando a2500 rpm por 5 min. Se eliminó elsobrenadante y se agregó 5 volúmenes deTris 0.01M - cloruro de amonio 0.85% frío,se homogenizó e incubó a 4 °C durante 1 h.Luego, se centrifugó a 1200 g por 10 min yse eliminó el sobrenadante. Los leucocitos selavaron tres veces con PBS de manera simi-lar a lo descrito para eliminar restos de cloru-ro de amonio y se re-suspendieron en MEMlibre de antibióticos.

Procedimiento

Estimulación de leucocitos

Para determinar la calidad y viabilidadde los leucocitos purificados, se empleó elcolorante vital azul de tripán al 0.3% en pro-porción 1:2 con los leucocitos re-suspendidosen MEM. Las células vivas (brillantes y noteñidas de azul) se contaron en la cámara deNewbauer con microscopio óptico a 400x. Elcálculo del número de células vivas totalesde la suspensión se calculó con la siguientefórmula (Darling y Morgan, 1993): Númerode leucocitos/ml = Promedio de la sumatoriade los 4 cuadrantes x 2 x 10 000.

Las suspensiones fueron diluidas paraobtener 500 000 leucocitos vivos/ml de MEM.Se colocó 1 ml de suspensión de leucocitosen cada pocillo de microplaca de 12 pocillos.Los tratamientos experimentales consistieronen el enfrentamiento de esta dosis deleucocitos vivos a concentraciones crecien-tes de antígeno total de macroquistes de S.aucheniae (0.5, 1, 50, 500 y 1000 ng/ml),cada una por triplicado (tres pocillos por do-sis), por periodos de 1, 12 y 24 h.Adicionalmente, y por cada tratamiento, seagregó un control de leucocitos (500 000/ml)inoculados con suero fisiológico, que sirvióde calibrador en la prueba de PCR tiemporeal, para evaluar las variaciones normalesde la expresión de las interleucinas. Los tra-tamientos tuvieron tres repeticiones.

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Expresión de citocinas pro-inflamatorias de leucocitos de alpaca

Los enfrentamientos se realizaron enplacas de cultivo descartables y bajoincubación a 37 °C con 5% de CO2. Al finalde cada tratamiento, los leucocitos fueronrecuperados en crioviales de 1.5 ml ycentrifugados a 1200 g por 10 min. Elsobrenadante fue retirado y las células fue-ron congeladas a -35 °C hasta su uso en laextracción de ARN total.

Extracción de ARN celular

En la evaluación de la expresión deinterleucinas IL-1α, IL-1β, IL-6 y TNF-α, lasmuestras se procesaron con TRIzol®Reagent(Invitrogen, EEUU) para la obtención de losARN totales, siguiendo las instrucciones delfabricante.

Síntesis de cADN

Para la Transcripción Reversa (RT) seutilizó el kit SuperScript™ III Platinum®SYBR® Green Two-Step qRT-PCR Kit withROX (Invitrogen, EEUU), de acuerdo a las

instrucciones del fabricante. Se colocó 18 µldel master mix en tubos para termocicladoren tiempo real y se adicionaron 2 µl de mues-tra (0.5 µg de ARN total), para obtener unvolumen de reacción de 20 µl. Las muestrasfueron llevadas al termociclador PTC 200Chromo 4 (detector continuo de fluorescen-cia) de MJ Research, incubándose a 25 °Cpor 10 min, 37 ºC por 20 min y 85 °C por 5 minpara terminar la reacción. El producto obte-nido fue congelado a -70 °C hasta su uso enel PCR.

PCR Tiempo Real

El PCR en tiempo real se hizo en untermociclador equipado con un monitor dedetección de fluorescencia continua (MJResearch, BioRad), usando el agenteintercalante SYBR Green. Para esto se utili-zó el ADN complementario (ADNc) de losARN totales obtenidos en el paso anterior(RT). Asimismo, se emplearon losoligonucleótidos específicos de llama descri-tos por Odbileg et al (2005) indicados en elCuadro 1.

Cuadro 1. Oligonucleótidos y temperatura de hibridación para RT-PCR Tiempo Real para la detección de las interleucinas 1, 6 y TNF-α

Citocina Tamaño (pb)1 Oligonucleótidos Ta (°C) 2 Referencia

IL 1α F (5') 172 GATGCCTGAGACACCCAA 53 Odbileg et al. (2005) IL 1α R (3') GAAAGTCAGTGATCGAGGG

IL 1β F(5') 259 AAGTGGTGTTCTGCATGAGC 53 Odbileg et al. (2005) IL 1β R(3') TGACAAGTGCTGATGTACCA

IL 6 F(5') 193 CTCTGCAATGAGAAAGGAGA 51 Odbileg et al. (2005) IL 6 R(3') GGTAGTCCAGGTATATCTGA

TNF α F(5') 251 CTACTCCCAGGTCCTCCTGA 56 Odbileg et al. (2005) TNF α R(3') GGTAGTTGGGCATGTTGATC

GAPDH F (5') 356 GTGAAGGTCGGAGTGAACG 60 Patil et al. (2004) GAPDH R (3') GAGATGATGACCCTCTTGGC

1 Tamaño del producto en pares base 2 Temperatura de “annealing” o hibridación

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R. Hinostroza et al.

Para la reacción en tiempo real se em-pleó el kit SuperScript™ III Platinum®SYBR® Green Two-Step qRT-PCR Kit withROX (Invitrogen, EEUU), de acuerdo a lasinstrucciones del fabricante. Se utilizó eltermociclador mencionado anteriormente,empleándose protocolos de acuerdo a la tem-peratura de disociación de cada juego deoligonucleótidos (Odbileg et al., 2005).

Como control endógeno, se evaluó laproducción del ARNm del gen constitutivoGAPDH, necesario para la técnica cuantita-tiva y la evaluación de la técnica molecular.Se empleó el protocolo: 50 ºC por 2 min(incubación con UDG), 95 ºC por 10 min(inactivación UDG y activación de DNApolimerasa), seguido de 40 ciclos de 95 ºCpor 15 s y 60 ºC por 1 min. La mezcla dereacción contiene UDG, MgCl2 y dNTPs queincluye al dUTP, estableciendo un sistematampón y estabilizadores, asegurando quecualquier amplificado de ADN contieneuracilos, mientras que UDG elimina los resi-duos de uracilo del ADN de una o doble ca-dena degradando al ADN formado e impi-diendo que el ADN que contiene dUTP sirvacomo plantilla de PCRs futuros.

Para determinar la producción de losARNm de las citocinas IL-1α, IL-1α β, IL-6y TNF-α se empleó el siguiente protocolo:50 ºC por 2 min (incubación con UDG), 95 ºCpor 10 min (inactivación UDG y activaciónde DNA polimerasa), seguido de 40 ciclos de94 ºC por 30 s, temperatura de hibridación(Ta en °C), según cada juego de oligo-nucleótidos (ver Cuadro 1) por 30 s y 72 ºCpor 30 s.

Los resultados fueron evaluados a tra-vés del software Opticon Monitor v. 2.1,obteniéndose los valores de Ct (Cyclethreshold o ciclo umbral) para su uso en elanálisis 2-ΔΔCt como método de cuantificaciónrelativa y el valor de Tm (Temperatura de«melting» o disociación) de cada uno de losproductos para evaluar la especificidad de losproductos amplificados. Se hicieron tres re-peticiones por tratamiento y por cada

interleucina evaluada para obtener los pro-medios de Ct y Tm de cada tratamiento.

Cuantificación relativa de los productosde RT-PCR Tiempo Real (citocinas)

La cuantificación relativa de los resul-tados de las interleucinas se realizó con elmétodo 2-ÄÄCt o método Ct comparativo(Livak y Schmittgen, 2001; Pfaffl, 2001;Rebrikov y Trofimov, 2006), basado en elanálisis de los Ct de las muestras compara-dos con el Ct de un control endógeno(GAPDH) en relación a una muestracalibrador: N = 2-ΔΔCt, donde N = Cantidadrelativa de ARNm con respecto al calibrador;y ΔΔCt = Diferencia entre el control endógenoy el ARNm a analizar con respecto alcalibrador.

Los resultados son presentados comocantidades en número de veces con respectoa un calibrador. Se empleó un calibrador paracada periodo de tiempo evaluado, existiendotres calibradores que consistieron deleucocitos control incubados por 1, 12 y 24 h.Bajo este esquema, se compararon los nive-les de expresión de ARNm de las interleucinasbajo distintas concentraciones de dosis deantígeno completo en un mismo periodo detiempo. Igualmente, se compararon los nive-les de expresión bajo la misma concentra-ción de antígeno completo, pero en diferen-tes periodos de tiempo para evaluar el cam-bio de expresión a través del tiempo; tomán-dose como calibrador, leucocitos control a 1h de incubación como nivel basal de expre-sión.

Electroforesis de los productos de RT-PCR

Para el análisis de los productos del RT-PCR de interleucinas IL-1α, IL-1β, IL-6 yTNF-α se empleó la técnica de electroforesisen geles agarosa al 2% en buffer TBE 1x.Se tomaron 20 µl de los productos de PCR yse adicionaron 4 µl de buffer de carga 6x encada muestra, cargándose la mezcla en loscarriles del gel. Un carril fue utilizado para elmarcador de peso molecular Novagen PerfectDNA Ladder (Novagen, EEUU).

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Expresión de citocinas pro-inflamatorias de leucocitos de alpaca

La electroforesis se realizó a 100V por1 h en una cámara de electroforesis horizon-tal (Biorad, EEUU). Luego, las bandas deADN teñidas con bromuro de etidio fueronvisualizadas en un transiluminador UV.

Análisis Estadístico

Se calcularon los valores promedio2-ΔΔCt por cada tratamiento y tiempo. Se utili-zó el análisis de varianza para determinar siexiste diferencia estadística entre tratamien-tos por cada periodo y entre periodos de unmismo tratamiento. Se empleó el softwareStata SE v. 10.1.

Además, se determinó la correlaciónexistente entre la concentración de antígenocompleto de S. aucheniae y los niveles deexpresión de ARNm de cada interleucinaevaluadas bajo un mismo periodo.

RESULTADOS

RT-PCR Tiempo Real del ARNm deGAPDH

Todos los tratamientos mostraron la pre-sencia de ARNm de GAPDH, tanto en gelde electroforesis (Fig. 1) como en los resul-tados de PCR en tiempo real (Fig. 2). Seamplificó un producto único y específico con

Tm de 80.9 ± 0.3 o 83.3 ± 0.3 °C (Fig. 2),con correspondencia total con los productosde 356 pb observados en los geles de agarosaal 2% descritos por Patil et al. (2004), e indi-cando la viabilidad de los leucocitos duranteel periodo de evaluación. Los promedios deCt de cada tratamiento y controles fueronempleados en la técnica de cuantificaciónrelativa 2-ΔΔCt.

RT-PCR en Tiempo Real del ARNm deIL-1, IL-1, IL-6 y TNF-

Las pruebas de RT-PCR para amplifi-car las regiones escogidas de los mRNA dela IL-1α, IL1-β, IL-6 y TNF-α evidenciaronun producto específico en los geles de agarosaal 2% del tamaño esperado (Cuadro 2); asi-mismo, los valores de Ct y Tm de cada ensa-yo para determinar las citocinas se muestranen ese cuadro. Cabe destacar que no se de-tectó ARNm de la IL-6.

Cuantificación Relativa de lasInterleucinas según la Dosis de Antígeno

Las expresiones de la IL-1α a distintasconcentraciones del extracto y a distintashoras se presentan en la Fig. 3. La IL-1α seexpresa en sus niveles máximos a una menorconcentración de extracto (0.5 ng/ml) y a unahora de incubación, siendo 47.85 veces loexpresado en el calibrador (células no trata-

Cuadro 2. Detección de ARNm de citocinas pro-inflamatorias en leucocitos de alpacas expuestas a extracto de macroquistes de Sarcocystis aucheniae

Citocina Tamaño del producto (pb) Ct Tm (°C)

IL-1α 172 27.86 – 36.00 79.1 – 79.4

IL-1β 259 33.57 – 37.69 79.4 – 80.9

TNF-α 251 26.01 – 35.19 85.1 – 86.0 IL-6 No detectado No detectado No detectado

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R. Hinostroza et al.

das). La expresión disminuye con el aumen-to de concentración y con el tiempo deincubación (p<0.05), siendo sus coeficientesde correlación negativos en todos los casos,llegando a detectarse expresiones de la IL-1α menores a las de las celulas no tratadas.

El análisis para expresión de IL-1 ex-hibe un patrón distinto al mostrado por IL-1(Fig. 4). La máxima expresión relativa (37.95veces) se presentó a las 24 h de incubacióncon 1 ng/ml de extracto de macroquiste(p<0.05). Independientemente de la con-

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa al 2% de los productos del RT-PCR de GAPDH. 1:Novagen Perfect DNA 50 bp ladder; 2 y 3: vacío; 4: suero fisiológico x 24 h; 5: 0.5 ngx 1 h; 6: 1 ng x 1 h; 7: 50 ng x 1 h; 8: 500 ng x 1 h; 9: 1000 ng x 1 h; 10 y 11: vacío

Figura 2. Análisis de temperatura de disociación de los productos de RT-PCR Tiempo Realempleando oligonucleótidos GAPDH. Fucsia, naranja y azul Tm = 80.9 ± 0.3 °C;Rojo Tm = 83.3 °C; Verde Tm= 83.6 °C.

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Expresión de citocinas pro-inflamatorias de leucocitos de alpaca

Figura 3. Expresión relativa de ARNm de IL-1α según la concentración del extracto demacroquistes de S. aucheniae y el tiempo de incubación (* = p<0.05)

Figura 4. Expresión relativa de ARNm de IL-1 según la concentración del extracto demacroquistes de S. aucheniae y el tiempo de incubación (* = p<0.05)

SF 0.5 ng/ml 1 ng/ml 50 ng/ml 500 ng/ml 1 µg/ml1 hora 1 0.59 0.25 0.03 0.06 0.0512 horas 1 1.08 22.70 8.96 2.87 1.4024 horas 1 22.71 37.95 10.95 7.47 6.85

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Expr

esió

n re

lativ

a

* *

*

* *

SF 0.5 ng/ml 1 ng/ml 50 ng/ml 500 ng/ml 1 µg/ml

1 hora 1 47.85 13.83 0.16 0.25 0.0112 horas 1 12.64 0 10.13 2.12 1.7224 horas 1 1.83 0.86 0.54 0.60 0.23

0

10

20

30

40

50

60

Expr

esió

n re

lativ

a

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R. Hinostroza et al.

Figura 5. Expresión relativa de ARNm de TNF-α según la concentración del extracto demacroquistes de S. aucheniae y el tiempo de incubación (* = p<0.05)

Figura 6. Porcentaje de células vivas postratamiento con antígenos completos de Sarcocystisaucheniae según recuento en la cámara de Neubauer

SF 0.5 ng/ml 1 ng/ml 50 ng/ml 500 ng/ml 1 µg/ml1 hora 1 68.57 4.21 0.67 1.44 0.0312 horas 1 13.39 16.04 2.48 0.9624 horas 1 5.28 2.95 0.15 0.39 0.31

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Expr

esió

n re

lativ

a

* *

*

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

SF 0.5 ng/ml 1 ng/ml 50 ng/ml 500 ng/ml 1 µg/ml

Célu

las v

ivas

(%)

Dosis de antígeno

1 hora12 horas24 horas

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Expresión de citocinas pro-inflamatorias de leucocitos de alpaca

centración del antígeno, se encontró que amayor tiempo de exposición se obtuvo ma-yor producción de IL-1. Asimismo, se evi-dencia que a mayor concentración antigénica,menor es la expresión de ARNm de IL-1α,aunque superiores a las células no tratadasdespués de las 12 horas de exposición.

Los resultados para TNF- indican unpatrón de expresión similar a lo observadopara IL-1, encontrándose que los máximosniveles de expresión se ubican en el trata-miento de dosis mínima (0.5 ng/ml) y en elperiodo de 1 h de incubación (Fig. 5), dondela expresión llega hasta 68.4 veces lo expre-sado por el calibrador de una hora. Los nive-les descendieron conforme se aumentó ladosis antigénica, siendo significativa aún a las12 horas de exposición en baja dosis (p<0.05),pero llegando a niveles por debajo delcalibrador en la dosis de 1000 ng/ml.

Los niveles de expresión relativa mos-traron diferencia significativa entre grupos(p<0.05). Los coeficientes de correlación fue-ron de -0.33, -0.58 y de -0.50 a 1, 12 y 24 hde incubación. La correlación negativa entrela concentración antigénica empleada y laexpresión de ARNm implica que a mayordosis de antígeno se produce una menor ex-presión de ARNm.

Viabilidad Celular

La viabilidad de las células vivaspostratamiento con antígenos completos deSarcocystis aucheniae se muestra en la Fig.6. En general, la supervivencia de las célulases mayor cuanto menor es la concentraciónde antígeno. En el caso de 1 h de incubación,se observa una buena supervivencia (90%)hasta 1 ng/ml, determinándose una menorsupervivencia de células (40%) a partir de laconcentración de 50 ng/ml, en tanto que en elcaso de las 12 h de incubación, la supervi-vencia tiende a equilibrarse a partir de la do-sis de 1 ng/ml.

En el caso de las 24 h de incubación, lasdiferencias en el porcentaje de superviven-cia se acortan entre los tratamientos y el con-trol. El porcentaje de supervivencia llega a10% con la concentración más alta deantígeno y a 28% en el tratamiento control.

DISCUSIÓN

Los linfocitos circulantes de alpacas hanmostrado una expresión de diversos genesde citocinas pro-inflamatorias cuando fueronestimulados por el extracto completo de S.aucheniae a diversos tiempos de exposición;esto indica que los leucocitos son estimula-dos por diferentes moléculas que inducen lastransducciones de señales que desencadenenla expresión de las citocinas. Las alpacas uti-lizadas fueron negativas en la prueba deELISA para detectar anticuerpos contra S.auchenia, pero fueron criadas en un rebañocon animales positivos, según hallazgos en lanecropsia y en serología, lo que indicaría quehan sido expuestos naturalmente al parásitoen alguna etapa de su vida, y podría haberalgunas células sensibilizadas en los linfocitostratados, los cuales no afectarían los resulta-dos obtenidos, ya que solo se está estudiandolas citosinas proinflamatorias y no una res-puesta inmune adaptativa.

En este estudio se utilizaron leucocitoscirculantes en la sangre, lo que constituye unamezcla de células blancas como linfocitos,monocitos, neutrófilos, basófilos, eosinófilosy, en menor proporción, macrófagos, permi-tiendo que muchos de ellos reconozcan lasmoléculas que estimulan la producciónTNF-α e interleucinas (Dinarello, 2002). Enlos tejidos in vivo se ha demostrado que losmacrófagos son los mayormente estimuladospor moléculas extrañas para inducir la libera-ción y expresión de citocinas pro-inflamatorias(Gery y Waksman, 1972); sin embargo, en laconcentración de leucocitos in vitro, otrascélulas como monocitos, neutrófilos y otrosfagocitos, además de macrófagos, pueden

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R. Hinostroza et al.

procesar los potenciales antígenos del extractode S. aucheniae e inducir a la expresión deestas citocinas (Mosser et al., 1998).

IL-1α es producida por fagocitosmononucleares y linfocitos activados e indu-cidos por sustancias endotóxicas y antígenosintracelulares parasitarios (Dinarello yMoldawer, 1999), como S. aucheniae. En lacuantificación relativa se observó que los ni-veles de ARNm de IL-1α generados en unahora eran detectables y comparativamenteelevados con respecto al calibrador. En esteperiodo de tiempo, en situaciones in vivo, seinduce y produce la cantidad de interleucinanecesaria para su detección, llegando a unpico máximo a las tres horas (Lledó et al.,1994). En los niveles de expresión a las 12 y24 h se observa una curva similar al de unahora, pero sin que se genere una intensidadsimilar en los niveles de expresión, probable-mente debido a que los leucocitos, por sercélulas terminales no mitóticas, envejecen ypresentan muerte natural en el cultivo; sien-do esto corroborado por el grupo control.

Por otro lado, la disminución en la pro-ducción de los ARNm de la IL-1α, podríadeberse a la citotoxicidad producida por losantígenos, generando muerte celular en pocotiempo de cultivados (Solíz, 1997). Otro me-canismo de disminución de expresión es lasaturación de receptores específicos del 50%con una concentración proteica de 400 µg deligando específico; además que la afinidad deinductor (antígeno procesado) hacia el recep-tor específico para la producción de estainterleucuina disminuye con el paso del tiem-po (Lledó et al., 1994).

La IL-β mostró incremento mayor a laconcentración de 1 ng/ml a las 24 h, eviden-ciando una expresión después de las IL-1α yTNF-α. La IL-1β es una proteína pro-inflamatoria, que estimula su propia síntesis,así como de TNF-α y de otras proteínas aso-ciadas con la inflamación y las enfermeda-des autoinmunes (Dinarello, 2002), de allí quees necesaria su presencia en el medio paraautoestimularse y aumentar la expresión de

este gen. A pesar de la muerte de un grannúmero de leucocitos al final del experimen-to (24 h) o por la capacidad citotóxica delextracto de S. aucheniae, se observa unaexpresión mayor en relación al control, queindicaría que los leucocitos viables están pro-duciendo esta interleucina, aunque a nivelesmuy bajos.

La IL-1β está asociada a la prolifera-ción, diferenciación y apoptosis celular(Hazuda et al., 1988). La expresión de estainterleucina en el último periodo del experi-mento, cuando hay una alta muerte celular,puede estar asociada a apoptosis de estascélulas en cultivo. Se ha demostrado tambiénque la IL-1β promueve la producción de GM-CSF en linfocitos T cd4+ y en linfocitos Tγδ(Lukens et al., 2012), y estos se encuentranen grandes cantidades en la sangre de lasalpacas, pudiendo ser un mecanismo de se-ñalización secuencial en la regulación de ex-presión de citocinas proinflamatorias en estaespecie.

Se ha demostrado que la vida media delos isómeros de IL-1 son muy diferentes, sien-do la vida media intracelular de IL-1α de 15h y de la IL-1β de 2.5 h (Hazuda et al., 1988),lo cual también influiría en la persistencia dela estimulación en los periodos de tratamien-to. Esta discrepancia en la vida media es unreflejo de la diferente cinética con la que laIL-1α y IL-1β son secretadas. IL-1β se libe-ra continuamente a partir de 2 h de la sínte-sis, mientras que la secreción de IL-1α seretrasa por 10 h (Hazuda et al., 1988). Espor esto que se muestra el patrón ascenden-te en la IL-1β; es decir, se muestra un mayornivel de expresión conforme se incrementanlos periodos de incubación; mientras que enIL-1α se muestra una mayor expresión en 1 hde incubación y disminuye según seincrementa el periodo de incubación.

Se ha demostrado, además, que TNF-αexpresa altos niveles desde las primeras ho-ras de infección y actúa sinérgicamente conIL-1α (Vogel et al., 1987). Al emplearse latécnica de cuantificación relativa se pudo

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Expresión de citocinas pro-inflamatorias de leucocitos de alpaca

observar que sigue un patrón similar a IL-1α,lo cual es evidente ya que TNF-α induce lasíntesis de IL-1 (Tracey, 1994).

Las interleucinas 1α y TNF-α presen-taron patrones similares de respuesta, mos-trando una curva ascendente para las con-centraciones 0.5 y 1 ng/ml de antígeno y des-cendente para el resto. Esto demuestra queel extracto de macroquistes de S. aucheniaegenera una respuesta inmune al ser inocula-do en leucocitos de alpaca, evidenciado porcuantificación relativa de los productos deARNm de los tratamientos. Esta curva seproduce probablemente en respuesta al au-mento de carga antigénica sobre losleucocitos; es decir, que estas células gene-ran una respuesta inflamatoria de fase agu-da, porque actúan activamente como agen-tes pro-inflamatorios (Tizard, 2002). Esta si-militud de respuesta responde a la caracte-rística de TNF-α que activa macrófagos paraincrementar su propia síntesis y la de IL-1(Tizard, 2002). La respuesta de estas citocinaspor el antígeno parasitario protozoointracelular obligatorio (Tender, 1995) se en-cuentra relacionado, ya que TNF-α promue-ve la respuesta celular inmune contra la in-vasión de patógenos intracelulares (Stevenet al., 2002).

La interleucina IL-6 no se llegó a evi-denciar mediante RT-PCR tiempo real. Latécnica fue comprobada como válida median-te controles positivos de enterocitos de alpa-ca, lo cual indica su escasa participación comoinductor de la fase aguda de la inflamacióndonde participan los leucocitos de alpacas.Heinrich et al. (2003) indican que la IL-6 tie-ne funciones duales induciendo una respues-ta pro-inflamatoria y otra antiinflamatoria re-gulando la expresión de otras citocinas pro-inflamatorias; además de inhibir y ser anta-gonista regulador de la síntesis de IL-1,TNF-α y otras citocinas pro-inflamatoriasmayores (Santiago, 1995; Opal y De Palo,2000). Por otro lado, induce la síntesis deglucocorticoides (Ruzek et al., 1997), hormo-nas con función antiinflamatoria inespecífica.

La falta de evidencia también pudo deberseal poco tiempo empleado, ya que su funciónantiinflamatoria in vivo requiere de mayortiempo para expresarse.

CONCLUSIONES

Los leucocitos de alpaca expuestos aextractos de macroquistes deSarcocystis aucheniae a dosis entre 0.5a 1000 ng/ml expresan citocinasproinflamatorias como IL-1α, IL-β yTNF-α.

La mayor expresión de IL-1α y TNF-αen leucocitos estimulados por extractode macroquiste de S. aucheniae se pue-de detectar a una hora de incubación,mientras que la IL-1β se detecta mejora las 24 horas.

El extracto de macroquiste de S.aucheniae a altas concentraciones estóxico para los leucocitos de alpaca.

Agradecimiento

Los autores agradecen la colaboraciónfinanciera del FINCyT-PIBAP 2008 para eldesarrollo de esta investigación.

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