Experiencia N° 1

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO

Objetivo: Determinar el Km experimental de la pepsina (E) para la albúmina (S) , a partir de una gráfica de vi contra [S] (ecuación de Michaelis-Menten) y/o en una gráfica de dobles recíprocas 1/vi contra 1/[S] (ecuación de Lineweaver-Burk).

Materiales:

1. Gradillas y tubos de ensayo

2. Pipetas de vidrio

3. Espectrofotómetro

4. Baño María 37°C

5. Solución de albumina 50 mg%

6. Solución de pepsina 0.5 %

7. HCl 1N

8. Agua destilada

Procedimiento:

Proceder con la preparación de la siguiente batería de 8 tubos indicada a continuación.

Tubos N° 1 2 3 4 5 6 7 8

ml agua destilada

8 7 6 5 4 3 2 -

ml HCL 1N 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -

ml albumina 1 2 3 4 5 6 7 -

ml pepsina - - - - - - - 5

Leer los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 en el espectrofotómetro y considerar dichas lecturas (absorbancias) como Lectura Inicial.

Seguidamente, incubar los ocho tubos a 37°C por 5 minutos. Luego, medir 0.5 mL de pepsina del tubo 8 y añadirlo al tubo 1. Mezclar y

mantenerlo en incubación a 37°C por 5 min más. Posteriormente, proceder de la misma manera luego de 1 min más con el tubo

2 añadiéndole 0.5 mL de pepsina del tubo 8 y mantenerlo en incubación a 37°C, después seguir el mismo procedimiento para el tubo 3 y así sucesivamente hasta llegar al último tubo (tubo 7), siempre en incubación de 37°C.

Recordar que el tiempo de reacción para cada tubo es de 5 minutos luego del cual se debe sacar el tubo respectivo del baño maría y llevarlo a leer inmediatamente al espectrofotómetro a 440 nm. Considerar las segundas absorbancias como Lectura Final.

Hacer la diferencia respectiva:

ACTIVIDAD ENZIMATICA

1 2 3 4 5 6 7

Mesa 1 0,063 0,109 0,190 0,198 0,218 0,258 0,314

Mesa 5 0,069 0,144 0,197 0,317 0,315 0,373 0,163

Cálculo de la concentración de sustrato:

Se calculo con la siguiente fórmula : C1V1 = C2V2

Tubo Nº1: 50mg% × 1ml = [S] × 10ml……………………………… [S] = 5

Tubo Nº2: 50mg% × 2ml = [S] × 10ml……………………………… [S] = 10

Tubo Nº3: 50mg% × 3ml = [S] × 10ml……………………………… [S] = 15

Tubo Nº4: 50mg% × 4ml = [S] × 10ml……………………………… [S] = 20

Tubo Nº5: 50mg% × 5ml = [S] × 10ml……………………………… [S] = 25

Tubo Nº6: 50mg% × 6ml = [S] × 10ml……………………………… [S] = 30

Tubo Nº7: 50mg% × 7ml = [S] × 10ml……………………………… [S] = 35

Actividad enzimática = Lectura inicial – Lectura

Gráfico Act. Enzimática vs. [S] …… mesa 1

Gráfico Act. Enzimática vs. [S] …… mesa 5

Gráfica de dobles recíprocas 1/act. Enz. vs. 1/[S]…Mesa 1

Gráfica de dobles recíprocas 1/act. Enz. vs. 1/[S]…Mesa 5

Discusión de resultados :

Primeramente, con el cálculo de la concentración del sustrato, se notó un incremento progresivo de razón 5 con forme aumentaba también la cantidad que se añadía a los tubos respectivos.

Lo que se pudo observar a partir de la experiencia de los compañeros de las mesas 1 y 5 -que realizaron el experimento- es que los datos desde el inicio no coincidieron a pesar de que se trabajó con las mismas concentraciones y datos teóricos, razón por la cual podemos aducir que se produjo errores en el pipeteo de las muestras, además de que seguramente los tiempos de incubación no fueron exactamente los requeridos para el experimento.

Se observa que en el caso de la mesa 1, las absorbancias van incrementándose a medida que la concentración del sustrato (albúmina en este caso) también aumenta.

Caso contrario ocurrió en los datos obtenidos por la mesa 5, en los que se nota un incremento del valor de las segundas absorbancias hasta el tubo 4, luego la lectura del tubo 5 tiene un ligero descenso y vuelve a subir el valor en el tubo 6 hasta que desciende nuevamente en la toma de absorbancia del tubo 7. En este caso, las segundas lecturas (absorbancias) fueron irregulares, incrementando y descendiendo indistintamente.

Conclusiones

-Los experimentos realizados se basan en el conocimiento previo de la enzima y su naturaleza principalmente proteica que interviene en reacciones biológicas acelerando la velocidad de reacción .

-Existen factores que alteran la actividad enzimática como la concentración de sustrato o concentración de enzima los que a medida que estos se incrementan, también se da un aumento de la velocidad; también está el caso del pH que altera la actividad enzimática pues, basados en que como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica (pH óptimo).