Examen Mediato, tejido animal - Microbiologia UNAH

Introdu c c i ón

En estas páginas dedicadas a las técnicas histológicas vamos a describir los procesos experimentales necesarios para obtener secciones teñidas y listas para observar al microscopio partiendo de tejidos vivos extraídos de un animal o de un vegetal. Por tanto, dedicaremos espacios a la obtención, fijación, inclusión, corte y tinción de los tejidos. (Kiernan, J.A. 2002)

Existen procedimientos para la observación de tejidos y células vivas que reciben el nombre de vitales. Por ejemplo, la observación del flujo sanguíneo en capilares del sistema circulatorio. Otra forma de observar células o tejidos vivos es mediante las técnicas histológicas supravitales, en los que las células y los tejidos se "cultivan" fuera del organismo, como es el caso de los cultivos de células y de tejidos. (Garlan Science 4ª edición).

Las técnicas histológicas postvitales son aquellas en las que las células mueren durante el proceso, pero las características morfológicas y moleculares que poseían en estdo vivo se conservan, más o menos dependiendo del tipo de técnica. Estas páginas estarán dedicadas a este tipo de técnicas, puesto que son las más comúnmente usadas en los laboratorios de histología. (Paraninfo 2ª Edición).

El procedimiento mediato o post-mortem tienen por finalidad preparar células, tejidos y órganos procedentes de seres en los que los procesos vitales se han detenido y es necesario conservar la estructura que tenían en vida. (Pawlina, W. 2005)

La calidad y la fidelidad con que una célula o un tejido muestren una imagen al microscopio, con las características morfológicas que poseían cuando estaban con vida, dependen esencialmente de la prontitud y el cuidado que se aplicó para obtener la muestra a ser procesada mediante los pasos mencionados anteriormente. (Seeley, R.R., Stephens, T.D., Tate, P. 2008)

Todas las técn icas t i enen en común e l que requ ie ren de un co r te muy de lgado de l te j i do (llamado corte histológico), y el montarlo en una lámina muy fina de vidrio, la cual se la someta diversas coloraciones antes de observarla al microscopio, ya que luego se la cubre por una laminilla.( Hayat M.A. 2000).

Obje t i v o s

1. Aprender los diferentes tipos de colorantes que se usan en coloración vital y como se deben aplicar.

2. Realizar cortes con el micrótomo con agilidad y destreza.

3. Obtener placas fijas mediante el examen mediato, realizando todo el proceso adecuadamente.

LABORATORIO DE TECNICAS HISTOLOGICAS 2

Mater ia l e s

SUSTANCIAS

• Xilol

• Agua destilada

• Cloroformo

• Alcohol etílico (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 99%, 100%)

• Parafina pura

• Agua destilada

• Agua alcalinizada

• Eosina

• Hematoxilina

• Pegamento Permount

• Pegamento Houpt

EQUIPO

• Micrótomo


• Estufa

• Microscopio

• Horno

• Termómetro

• Campana de gases

ELEMENTOS VARIOS

• Gradilla

• Pinzas

• Bisturí

• Barras de Leukart

• Placa de cobre

• Tubos de ensayo

• 13 Cubo de madera

• 23 Coplins

• Mechero

• Pincel

• Papel toalla

• 7 Porta objetos

• 7 Cubre objetos

Metodo l og íaOBTENCION DE LAS PIEZAS


SACRIFICIO DEL ANIMAL (ORGANISMO: HAMSTER ‘Charlie’)

Intoxicación se colocó el animal dentro de una campana de gases con un pedazo de algodón impregnado de una concentración de cloroformo suficiente como para matar al animal, la muerte del animal tardo unos 4 minutos, no fue dolorosa y charlie no sufrió.

EXTRACCION DE ORGANOSLuego del sacrificio se procedió a colocar el animal en posición para hacer la disección, se empezó cortando desde el tórax del animal y así empezar a sacar los órganos que se descomponen más fácilmente como: el páncreas, el tubo digestivo, la vesícula biliar. Luego se procedió a extraer los órganos que usaremos, en este caso (el riñón).


Imagen N°1

Descripción: Organismo a sacrificar Hamster (Cricetus cricetus - hámster común).

Imagen N°2

Descripción: Hámster intoxicado con cloroformo en la campana de gases

INFORME FINAL

REDUCCION A PIEZAS

Ya que los órganos no son del tamaño adecuado para la fijación entonces se procedió a cortarlos de 0.5 cm a 1.0 cm. En nuestro caso no fue necesario reducir el tamaño del órgano ya que era pequeño solo cortamos la parte superior (corte transversal) para identificar la posición del órgano.


Imagen N°3

Descripción: realizándole un corte longitudinal al organismo para la extracción de los órganos.

Imagen N°4

Descripción: extracción del Riñón de un Hámster

Imagen N°5

Descripción: pieza extraida Organo:Riñon

INFORME FINAL

FIJACION Una vez cortado el tejido este será llevado a la fijación para la conservación de las estructuras de la célula a observar se procede a sumergirlo en un buen fijador para parar los procesos vitales, tiempo que el órgano estuvo en el fijador fue de 12 horas.Ver imagen # 4.

El fijador se preparó con los siguientes reactivos:- Agua Destilada 100 ml- Formalina 10 ml- Ácido Acético 5 ml- Bicromato de Potasio 2.5 g

Luego le retiramos el fijador poniéndolo en agua corriente por 6 horas.Después de retirarle el fijador procedemos a deshidratar el órgano introduciéndolo a unos tubos de ensayo en donde cada uno contiene alcohol a diferente porcentaje y empezamos con el de 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 99, 100 %. Tenerlo en cada alcohol por 6 horas.Luego de deshidratarlo procedemos a al aclaramiento para esto introdujimos el órgano en un tubo de ensayo que contenía xilol.Para la fijación se requiere una serie de pasos que a continuación mostraremos


Imagen N°7

Descripción: Escala de alcoholes en el que vamos a sumergir el órgano.

Imagen N°6

Descripción: sumergiendo el órgano “riñón” en el fijador.

INFORME FINAL

Reactivo Tiempo (Horas)

1. Fijador 122. H2O (corriente) 63. OH 50% 64. OH 60% 65. OH 70% 66. OH 80% 67. OH 90% 68. OH 95% 69. OH 96% 610. OH 99 % 611. OH 99% 612 Xilol 6

Total 78

Tendremos un total de 3 días y 6 horas (78 horas) en el proceso de Fijación.

INCLUSION

INCLUSION GRADUAL EN PARAFINA

Después de fijar el órgano (Riñón de Hámster) procedemos a la inclusión gradual en parafina, introducimos el órgano el un beaker pequeño con parafina pura y lo colocamos en el horno por 24 horas a una temperatura de 56°C a 60°C.

INCLUSION DEFINITIVA EN PARAFINA

En la inclusión definitiva colocamos el órgano (Riñón de Hámster) en parafina fundida. Utilizando para este proceso una plataforma de cobre y colocamos sobre la plataforma las barras de Leukard seguidamente le echamos la parafina fundida y rápidamente colocamos el órgano sumergiéndolo en la parafina y con las agujas de disección le damos forma longitudinal para poder realizar el corte de esta manera.


Imagen N°8

Descripción: el órgano ya en parafina listo para ponerlo al horno.

INFORME FINAL

TALLADO

Después que la parafina se solidifique quitamos las Barras de Leukard y pegamos el cubo de parafina a un cubo de madera con ayuda de calor pegando el cubo de madera y el cubo de parafina y pasándolo por la llama de un mechero asta que este quede completamente pegado.

Eliminamos el exceso de parafina del cubo desbastándolo para obtener una forma de pirámide truncada y facilitar el corte en el micrótomo.


Imagen N° 9

Descripción: la parafina fundida lista para proceder a hacer los cubos de parafina con el órgano dentro de ella y utilizando las barras de Leukar y la plataforma de cobre.

Imagen N°10

Descripción: ilustración de cómo se debe hacer el tallado en el cubo de parafina.

INFORME FINAL

CORTE

Para obtener cortes finos utilizamos el Micrótomo Automático de Cuchilla Fija y Bloque Móvil, empezamos limpiando la cuchilla con xilol luego colocamos el bloque con el órgano en el micrótomo y con mucho cuidado colocamos la cuchilla en el micrótomo. Comenzamos a rotar la manecilla de micrótomo para obtener los cortes y los colocamos con la ayuda de un pincel los cortes en un porta objetos.

MONTAJE Colocamos los tejidos en una bandeja con agua corriente a una temperatura de 45°C a 50°C por 15 minutos, Seguidamente colocamos los tejidos en 7 porta objetos con el adhesivo temporal de Haupt (el adhesivo de Haupt se prepara mesclando partes iguales de albumina de huevo y Glicerina pura, se le agregan algunos cristales de


Imagen N°11

Descripción: cubo de madera adherido al cubo de parafina ya desbastado.

Imagen N°12

Descripción: cubo de parafina con el órgano colocado en el Micrótomo listo para proceder a realizar los cortes.

INFORME FINAL

timol o fenol para evitar la descomposición) y quitamos el exceso de agua con papel toalla. Pasamos el porta objetos brevemente por la llama de un mechero derritiendo la parafina para fijar completamente los cortes luego quitamos el exceso de parafina derretida con papel toalla.

COLORACION DEL TEJIDO

DESPARAFINIZACION

Colocamos los portaobjetos con los tejidos del riñon de Hamster en un coplin con xilol por 5 minutos y repetimos este proceso una ves mas con el fin de eliminar los residuos de parafina porque esta impide la coloración.

HIDRATACION

Colocamos 6 coplin con alcohol de manera descendente con los porcentajes de 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50% y sumergimos los 7 tejidos por 1 minutos en cada uno de los coplins que contienen alcohol con excepción del primer coplin con alcohol de 99% sumergimos los tejidos por 2 minutos. Este proceso es para que el colorante se


Imagen N° 13

Descripción: 7 tejidos en sus respectivos porta objetos pegados con el adhesivo temporal de Haupt

Imagen N° 14

INFORME FINAL

absorba mejor, continuando con el proceso sumergimos los tejidos en un coplin con agua destilada por 4 minutos para que la hidratación sea completa.

COLORACION PROPIAMENTE DICHA

Después de hidratar los tejidos los colocamos en un coplin con Hematoxilina (colorante para tejido animal) durante 8 minutos.

VIRAJE

Colocamos los tejidos en un coplin con alcohol acido durante 8 segundos para realizar a limpieza del colorante luego sumergimos los tejidos durante 2 minutos en agua alcalinizada. Este proceso lo realizamos para hacer un cambio de pH.

COLORACION CONSTANTE


Imagen N° 17

Imagen N° 16

Imagen N° 15

INFORME FINAL

Sumergimos los 7 tejidos en un coplin con Eosina (colorante para tejido animal) durante 2 minutos este proceso es para completar la coloración.

LAVADO

Colocamos 2 coplin uno con agua corriente y otro con agua destilada y sumergimos los tejido por 8 minutos en cada tejido este proceso lo realizamos para limpieza.

DESHIDRATACION

En la deshidratación colocamos 6 coplin con alcoholes en forma ascendente con los siguientes porcentajes 50%, 60%5, 70%, 80%, 90%, 95%, sumergiendo los tejidos por 1 minuto en cada coplin con alcohol excepto el alcohol de 99% que lo tendremos por 2 minutos para completar la deshidratación.

ACLARAMIENTO


Imagen N° 20

Imagen N° 18

Imagen N° 19

INFORME FINAL

Preparamos 2 coplin con xilol cada uno y sumergimos los tejidos durante 5 minutos en cada coplin con xilol este proceso es para clarificar los tejidos y completar el proceso de deshidratación para luego seguir con el montaje final que es la etapa final de todo el proceso por el que paso el órgano (Riñón Hámster.).

MONTAJE FINAL

Al finalizar la coloración el exceso de xilol se elimina con papel toalla. Sobre los tejidos ya coloreados se agregan 2 o 3 gotas de pegamento Permount (adhesivo permanente). Seguidamente colocamos el cubre objetos acercándolo lentamente al pegamento Pemount, presionando suavente sobre el cubre objetos para dispersar el pegamento, evitando que no se formen burbujas sobre el tejido. Después de realizar este paso con todas las placas se introduce al horno por 24 horas a una temperatura de 50°C a 60°C.

ROTULACION

Se coloca en cada porta objetos una viñeta permanente que lleve el siguiente dato: órgano, organismo, número de micras, periodo y ano, sección y número de grupo.


Imagen N° 21

Imagen N° 22

INFORME FINAL

Resu l tado sObtuvimos 2 placas fijas de el tejido animal “Riñón de Hámster” (Cricetus cricetus -

hámster común) debidamente rotuladas, en el cual podemos observar un corte longitudinal.


Imagen N° 23

Imagen N° 25

Imagen N° 24

INFORME FINAL

Conc lu s i one s

1. Las Técnicas Histológicas nos facilitan y brindan ayuda al realizar exámenes en los laboratorios para estudiar tejido y anomalidades de diferentes organismos.

2. El tejido en el examen inmediato es temporal por que lo podemos observar durante un periodo de tiempo corto en cambio los tejidos obtenidos en el examen mediato los podemos observar por un largo periodo de tiempo esta ventaja nos permite observar las partes de diferentes órganos.

3. Obtuvimos destrezas para obtener el corte en el micrótomo y para hacer los cambios en las diferentes sustancias que se utilizaron en el proceso de coloración.


Imagen N° 26

INFORME FINAL

Bibl i ogra f í a

• Kiernan, J.A. 2002

• Garlan Science 4ª edición

• Paraninfo 2ª Edición

• Pawlina, W. 2005

• Seeley, R.R., Stephens, T.D., Tate, P. 2008

• .Hayat M.A. 2000


INFORME FINAL


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