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Evolución Dirigida de Enzimas

Miguel Alcalde

Grupo de Biocatálisis Aplicada (Prof. A. Ballesteros)

Departamento de BiocatálisisInstituto de Catálisis y Petroleoquímica

CSIC, Madrid

Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales

DISEÑO RACIONAL DE BIOCATALIZADORES

Concepto: re-diseñar una enzima (cuya estructura 3D es conocida) mediante cambios puntuales en residuos específicos

Problemas:

•Necesidad de estructuras 3D del biocatalizador

•Debemos considerar las proteínas como moléculas dinámicas

•No es satisfactorio para diseñar catalizadores industriales:cambio en una propiedad a costa de otra


ALTERNATIVA: DISEÑO IRRACIONAL DE BIOCATALIZADORES

Concepto: utilizar el algoritmo de la evolución para el diseño de biocatalizadores

Ventajas frente al enfoque racional

•La Evolución es un poderosos algoritmo: Infinitas posibilidades.

•No es necesario el manejo de estructuras 3D

•Podemos realizar estudios mecanísticos “a posteriori”


1a Generación 4a Generación

3a Generación2a Generación

Charles Darwin (1809-1882)Padre de la Teoría Evolutiva

Miles de millones de añosEvolución natural

Evolución dirigida Semanas o mesesESCALA TEMPORAL


DESARROLLO INDUSTRIAL DE LA EVOLUCIÓN DIRIGIDA


SUBTILISINA EVOLUCIONADAMEDIANTE FAMILY SHUFFLING

COMPUESTO

ENZIMA INDUSTRIAL

LIPOLASA

SUBTILISINA

PEROXIDASA

ANTICUERPO VITAXIN

PROTEINA DE SANGRE

SUPRESOR DE TUMORES P53

ALFA INTERFERON

RECEPTOR DE CELULAS T

APLICACION

Pilas de combustible

Detergente para lavadoras



medicamento contra el cancer

Substituto sanguíneo

medicamento contra el cancer

fármaco antiviral

Medicamento para la artritis

COMPAÑIA

Oficina de Investigación Naval, USA

Novo Nordisk

Maxygen/Novo Nordisk

Novo Nordisk (Novozymes, A/S)

Ixsys

Diversa

Universidad de Texas, Austin

Maxygen

Universidad de Illinois


Aminoacil transferasap-nitrobencil-esterasaCitocromo P450 monooxigenasa

LacasaSubtilisinap-nitrobenzil-esterasa

Subtilisinap-nitrobenzil-esterasaCloroperoxidasaCitocromo P450 monooxigenasa

GalactoxidasaAtrazina hidrolasaTimidina quinasaAlquil-transferasaLipasaAspartato aminotransferasaDioxigenasaCitocromo P450 monooxigenasa

LipasaEsterasaTransaminasa

Proteína verde fluorescenteSubtilisina ELacasaPeroxidasa de rábanoGalactoxidasa

AUMENTO DE LA ACTIVIDAD

AUMENTO DE LA EXPRESION GENICA

AUMENTO DE LA ENANTIOSELECTIVIDAD

ALTERACION DE LA ESPECIFIDAD DE SUSTRATO

AUMENTO DE LA ACTIVIDAD EN PRESENCIA DE DISOLVENTES

AUMENTO DE LA TERMOESTABILIDAD

PROPIEDAD EVOLUCIONADAENZIMA



CREACION DE DIVERSIDAD

Mutagénesis aleatoria

Inserción de la librería de genesen un vector de expresión

Introducción de la librería/vectoren el microorganismo

mutación1Genes parentales

Recombinación

Transferencia de coloniasa platos multipocillo

Expresión de la enzima

SELECCION DE LA PROPIEDAD DESEADA

Gen “ganador”

NUEVA GENERACION

Crecimiento de las coloniasPlato maestro

2

45

6

7

SCREENING

“YOU GET WHAT YOU SCREEN FOR”

3


Plato de 96 pocillos

“Ganadores” de la generación

Diferentes métodos colorimétricos para evolucionardistintas propiedades de la enzima lacasa

Degradación de la lignina(blanqueado del papel)

Transformación de xenobióticos

Nivel de expresión en levadura

Evolución de rutas metabólicas:Búsqueda de carotenoidesen fase sólida

Colonias con diferentes colores, contienen distintos carotenoides.Para su análisis se empleanprocesadores digitales

Carotenoidesidentificados


O

OLacasa

(con/sin mediador)

OH

OH

solución NaBH4

Ensayo colorimetrico específico para biodegradación de PAHs

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.20

10

20

30

40

0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035

U/ml en reacción con mediador

U/ml en reacción sin mediador

Dec

olor

izac

ión

%

CON MEDIADOR

SIN MEDIADORTime 0

After 6 h

Baja toxicidad en levaduray E. coli

Ensayo de decolorización de PolyR478

Alcalde, Bulter and Arnold (2002). Colorimetric assays for biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbonsby fungal laccases. J. Biomol. Screen. Vol 7, 6: 537-543.


0 100 200 300 400 500 6000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

µMolar [NBPproduct]

Abs

(60

0n

m)

STYRENE OXIDE CALIBRATION CURVE

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

0.4

0.6

0.8

1.0

µMolar [purified 139-3]A

bs(6

00

nm

)

ENZYME CONCENTRATION

50-100 µMolar of product0.2 µMolar of enzymeDETECTION LIMIT

SENSITIVITY LIMIT

Alcalde, M, Farinas, ET and Arnold, FH (2004) Colorimetric high-throughput assay for the alkeneEpoxidation catalyzed by cytochrome P450 BM-3 variant 139-3. J. Biomol. Screen 9:141-145


clone0 20 40 60 80

rela

tive

activ

ity

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

COEFICIENTE DE VARIANZA: <10%

20 µl

Screening assay(ABTS)

Plato maestro

-Incubación durante 24 h en mediomínimo a 30 °C y 270 rpm

-Adición de medio de expresión.Incubación durante 24 h.

Transferencia De colonias

Centrifugación40µl sobrenadante

Plato de estabilidadconteniendo 80 µlStability buffer

-First rescreen (five wells per clone)-Second rescreen:Zymoprep, E.coli transformation, miniprep,yeast transformation

SelladoIncubación a 40 °C

48h

Selladode los platos

SCREENING DE ACTIVIDADY TERMOESTABILIDAD

EN LACASAS EXPRESADASEN LEVADURA


Mutazima, bajo indice de mutaciónScreening de actividad y termoestabilidad

0 1 2 3activ

idad

resi

dual

(uni

dade

s re

lativ

as)

0

1

2

3

número de mutantes

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

activ

idad

rela

tiva

0

1

2

3

Actividad inicial (unidades relativas)

8H935H1

35H1

Bulter, Sieber and Alcalde (2003). Screening mutant libraries in S. Cerevisiae. In: Directed Enzyme Evolution. Screening and selection methods. Methods in Molecular Biology Vol230. Eds: Arnold and Georgiou. Humana Press,Totowa,, New Jersey:99-108

3200 clones explorados


Mutagénesis aleatoria

Genes parentales

Recombinación

CREACION DE DIVERSIDAD

Inserción de la librería de genesen un vector de expresión

Introducción de la librería/vectoren el microorganismo

Transferencia de coloniasa platos multipocillo

Expresión de la enzima

SELECCION DE LA PROPIEDAD DESEADA

Gen “ganador”

NUEVA GENERACION

Crecimiento de las coloniasPlato maestro

12

3

45

6

7

mutación

SCREENING


AJUSTE DE LAS CONDICIONES DE LA MUTAGENESIS ALEATORIA

0

10

20

30

40

50

60

70

0 500 10000

20

40

60

80

100

120

0 200 400 600 800 1000

Alto índice de mutación: 4 pg/µl Bajo índice de mutación: 4 ng/µl

HERRAMIENTAS: mutazima y Taq polimerasas

EVOLUCIÓN ASEXUAL: PCR PROPENSO A ERROR



EVOLUCION SEXUAL: LA CRÍA MOLECULAR

ANIMALES Y PLANTAS CRÍA MOLECULAR

Dos organismos parentales Uno, dos o muchos “padres”

Unica y pequeña generación de cada cruce

Ilimitadas combinaciones de generaciones (sólo restringidasPor el método de screening)

Barreras filogenéticas estrictas(mismas especies)

Barreras filogenéticas muy flexibles(especies diferentes)

Ciclos temporales lentos (1 o dos por año)

Ciclos temporales rápidos (dos por semana)


“Barajado”del DNAGenes parentales

DNasa DNA polimerasa

PCRDigestión aleatoria del DNA parental

StEP

Repetición de los pasosde desnaturalización yextensión del DNA para conseguir genes completosGenes parentales

cebadores

Fragmentos cortos de DNAcreados por ciclos cortos de de hibridación y extensión

Tras la desnaturalización, los fragmentos se hibridan aleatoriamentecon los genes parentales continuando su extensión

“Barajado” in vivo del DNA

Genes parentales

Plásmido linearizado

Introducción de los Fragmentos parentales, junto con un plásmidolinearizado, en la

célula de levadura

1

43

2

O

OH

OH

CH2OH

OH

OH GOasanativa

O2

+ H2O2

O

OH

OH

CH2OH

OHOH

GOasamutante

O2

HRPABTS

Sun, Bulter, Alcalde, Petronia and Arnold (2002). Modification of galactose oxidase to introduce glucose 6-oxidase Activity. ChemBioChem. 8:781-783

O

OH

OH

CHO

OH

OH

APLICACIONES-Industria alimentaria-Marcado de azúcares-Polímeros sintéticos

O

OH

OH

CHO

OHOH ABTS? + H2O2HRP

Ensayo de screening no específico

Ejemplos: evolución dirigida de Galactooxidasa


DISEÑO COMBINATORIO Y COMPUTACIONAL

1.- Combinatorial saturation mutagenesis

ChemBioChem(2002)8:781-783

Q406F464

T495

H496

H581C228

W290

T272

R330F194


.

0 1 2 3 4 5 6

Generation

Rel

ativ

e ac

tivity

1

10

20

139-3

wtrandom mutagenesis

recombination

Starting point: Ed’s mutantOO2N

OO2N

OH

O-O2NH

O

P450NADPH

O2

+H2O

+

Ejemplos: evolución dirigida de Citocromo P450 monooxigenasa

Max

imum

turn

over

rate

(m

ole

subs

trate

/min

/mol

e en

zym

e)Maximum turnover rates for wildtype and 139-3*

propane butane pentane cyclohexane hexane octane lauric acid palmitic acid0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Wt139-3


*Glieder, A. Farinas, E.T. & Arnold, F.H. (2002). Nature Biotech. 20:1135-1139.


FIRST GENERATION (MUTAZYME)

0 100 200 300 400 500 600

0

1

2

3

0 100 200 300 400 500 600

0

1

2

3

NADPH depletion NBP product formation

clone clone

rela

tive

acti

vity

rela

tive

acti

vity

Farinas, ET, Alcalde, M and Arnold, FH (2004) Alkene epoxidation catalyzed by cytochrome P450 BM-3 139-3. Tetrahedron 60:525-528

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Activ

ity [A

U]

# Generations

-Error prone PCR (taq y mutazima)-In vivo DNA shuffling-StEP (Staggered extension proccess)-In vivo assembly recombination

Herramientas evolutivas utilizadas

Mejoras respecto a la enzima parental:-170 veces la actividad total-Expresión más alta descrita para una lacasa en levadura (18mg/l)-kcat incrementada 22 veces y expresión 8 veces

Bulter, Alcalde, Sieber, Meinhold, Schlachtbauer, and Arnold, F.H. (2003).Functional expression of a fungal laccase in S. Cerevisiae by directed evolution. Appl. Environ. Microbiol.69: 987-995 .

Ejemplos: evolución dirigida de lacasas para su expresión funcional

Modelo creado por molecular threadingCon la lacasa deMelanocarpusAlbomyces(76% de homología)


BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA

•Arnold, FH (2001). Combinatorial and computationalchallenges for biocatalyst design. Nature 409: 253-257

•Tao, H and Cornish, VW (2002) Milestones in directedenzyme evolution. Current Opinion in Chemical Biology. 858-864.

•Alcalde, M. (2003).Evolución Molecular Dirigida.Investigación y Ciencia. 326: 69-77.

•http://www.che.caltech.edu/groups/fha/

AGRADECIMIENTOS

CALTECH

Frances.H. ArnoldThomas BulterEdgardoFarinas

Pat CirinoLianHong Sun

Instituto de Catálisis Departamento de BiocatálisisGrupo de Biocatálisis AplicadaCSIC (www.icp.csic.es/abg)

Antonio Ballesteros Francisco J. PlouArantza Gómez de Segura Miren Zumárraga

Humberto GarcíaDolores ReyesNieves LópezManuel FerrerEitel Pastor

RMLCantisense 2antisense 1

RMLN sense 1 sense 2

PRIMERS50% MUTATION

3 PCR reactions

TRANSFORMATIONIN YEAST

Linear vector

PCR PRODUCTS

xxx

x x xx

xx x x

...

In vivo assembly recombination

5’

5’

3’

3’

Miguel Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales

Directed Evolution of a variant P450 BM3 for alkene epoxidation

CH CH2P450

NADPHCH CH2

K2CO3

CH2 NO2N+OH

NO2OH N CH

CH2 NO2N+OH

O

N

CH2

NO2

..+

Nucleophilic attackStyrene

NBP

Abs 600 nm


PROTOCOL STEP BY STEP

P450 Lysate in buffer with Styrene and NADPH

Sealed platesincubation at 80°C

for 30 min

5min room tp

Stop the reaction by addingNBP solution

Chilling on ice

Add DMF, K2CO3

READ INMEDIATELY AT 600nm


Inoculation of cloneswith 96-pin replicator

Plate with expression media

Incubation for 24h at 30 °C and 250 rpm

-

Centrifuge,discard the medium and frezeethe pellets at -20 °C

-Incubation for 24h at 30 °C and 250 rpm

-

colony transferto 96 deep well platesin LB media

Lysate the cellsand use supernantant for screening

Master plate

PROTOCOL

0 5 10 15 20 25 30

-0.3

-0.2

-0.1

0.0

Time (seconds)

Abs

(340

nm) DEPLETION ASSAY NBP ASSAY

Lacasa de Myceliophtora thermophila (MtL)

-oxidoreductasa extracelular (Blue copper protein)-4 iones Cu-Potencial redox 465 mV-glicoproteína ácida (pI 4.2)-572 aa-MW 85 kDa-Monómero

OH

OH

O

O

Laccase1/2 O2 + + H2O

O

O

LMS

Aplicaciones de las lacasas

- Eliminación de xenobióticos (PAHs)

- Industria papelera: blanqueado de la pasta de papel, deslignificación- Analíticas: Biosensores

LACCASE-MEDIATOR SYSTEM (LMS)Expansión del espectro de sustratos hacia Compuestos industrialmente importantes


Problema: Expresión demasiado baja para una mejora funcional del biocatalizador

Planteamiento: usar sistema sensible para mejorar expresión mediante evolución dirigida

Límite de detección: 10 µg /l (5 µU)Endpoint-assay λ: 418 nm

SS

NN

CH3 CH3

CH3 CH3

NN

NN

NN

SS

+.Laccase

O2

HO S3

SO3H

HO S3

SO3H

Mejor sistema: ABTS-assay (2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)

Alcalde and Bulter (2003). Colorimetric assays for screening laccases. In: Directed Enzyme Evolution. Screeningand Selection methods. Methods in Molecular Biology Vol230. Eds: Arnold and Georgiou. Humana Press, Totowa, New Jersey.193-202.



-Advent to oxygen in earth’s atmosphere: detoxification of oxygen

-All P450s have the same oxygen activating system

RH+O2 ROH+H2O2e-, 2H+

P450

P450 BACKGROUND

-Superfamily P450: mamalia, birds, fish, reptiles, amphibia, insects, plants, bacteria and fungi.

-10 P450s have been characterized by X-ray.- MW 46-57 kDa.-Single heme prosthetic group-Soret band (binding of CO at 450 in heme domain)-Redox potential (Fe2+/Fe3+) about -300 and -400 mV

- Little or no activity for alkanes.- Advantage over other alkane hydroxylases (MMO or AlkB). Easy to express

in E. coli, soluble, does not require additional electron transfer protein.

-Water-soluble heme enzyme-Natural fusion protein-120 kDa

-Inserts oxygen into subterminal C-H bonds of fatty acids (C12-C18)-Kcat 10-1000 fold higher than those eucaryotic fatty acid hydroxylases.

Cytochrome P450 monoxygenase BM3 from Bacillus megaterium



Fe3+ S

S1

Fe2+ S

e-

2

O2

Fe2+ S O23e-

Fe+ S

O2

4

2H+

H2O+SOH

5

H2O

Fe3+

O2-

2H+ H2O2

UNCOUPLING

2e-+2H+ H2O

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