Evaluación de la vía intrínseca extrínseca y común.

Mtra. Nelly UvalleIntegrantes:Juan Carlos Cadenas García.Jimena Yanneth Fernández Parrick.Desiree Hidalgo Niño.Edith Guadalupe Rodríguez Vázquez.Alexia Karime Sifuentes Villarreal.

Centro de BachilleratoTécnico industrial y

Servicios N°24.

5° “B”

Índice Introducción Vía intrínseca Video procedimiento tiempo de

recalcificacion Vía Extrínseca Video de tiempo de protombina Vía común Conclusión

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Introducción.Recibe este nombre debido a que antiguamente se pensaba que la sangre era capaz de coagular "intrínsecamente" por esta vía sin necesidad de contar con la ayuda de factores externos. Actualmente se sabe que esto no es exactamente así. De hecho la vía extrínseca es la que realmente inicia el proceso y la vía intrínseca sirve de amplificación y seguridad del proceso homeostático. Se la llama extrínseca ya que el estímulo inicial que desencadena la cascada es extravascular, esta vía requiere de factores ajenos a la sangre. Comienza cuando la sangre entra en contacto con tejidos lesionados o se mezcla con extractos de tejidos, se genera muy rápidamente factor Xa.Llegando al punto en que se activa el factor X, ambas vías confluyen en la llamada vía común.La vía común termina con la conversión de fibrinógeno en fibrina, y el posterior entrecruzamiento de la misma estabilizando el coágulo.

.

índice

EVALUACIÓN DE LA

VÍA INTRÍNSECA.

índice

• Esta constituida por dos grupos de factores independientes:• Sistema activador de contacto

• Factor XII• Factor XI• Cimógeno de alto peso molecular (HMWK)• Precalicreína

• Factores VIII y IX

Generalidades.

Principio general: se provee en forma artificial un método para mantener constate la activación por contacto y la participación plaquetaria (Pf3).

Fundamento• El plasma descalificado es colocado a 37°C y se mide

el tiempo que tarda la formación del coágulo cuando se mezcla con una solución de cloruro de calcio de concentración conocida

• Este estudio puede hacerse en plasma rico en plaquetas y en plasma pobre en plaquetas. Cuando se utiliza el primero, el examen evalúa todos los aspectos de la vía intrínseca, incluyendo el factor 3 plaquetario

• Es especialmente sensible a la inhibición por el anticoagulante Lúpico

• Cuando se utiliza plasma pobre en plaquetas, el tiempo de coagulación es más prolongado

Tiempo de Recalcificación.

Material

Valores Normales

• Citrato de sodio• Cloruro de calcio 0.25 M • Plasma normal, muestra

fresca, colectada de la misma manera que la muestra del paciente

• PRP = 120 segundos a 160 segundos

• PPP = 160 segundos a 200 segundos

1. Colocar 0.1 ml. De plasma en un tubo de ensaye.

2. Poner el plasma a baño maría por 1 min.3. Agregar 0.2 de CaCl2 inmediatamente que

se coloca el CaCl2 se pone en marcha el cronometro.

4. Agitar suavemente la mezcla y dejar reposar a 37°C durante 70 seg.

5. a partir de este tiempo inclinamos el tubo ligeramente cada 5 seg. hasta que se observa la formación del coagulo se detiene el cronometro y se anota el tiempo transcurrido.

Procedimiento

índce

Fundamento• El tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa)

involucra la recalcificación de plasma en presencia de una concentración estandarizada de cefalina (substituto plaquetario) y un activador del factor XII (kaolín)

• Este proceso minimiza las variables de la prueba debido a la estandarización de la activación de contacto y optimiza la concentración de fosfolípidos

• El TTPa es una prueba que valora la vía intrínseca de la coagulación (factores XII, XI, IX, VIII, X, V, II y I) excepto las plaquetas

Tiempo de Tromboplastina Parcial.

• Tubos de plástico o siliconizados

• Reactivo de TTPa • Cloruro de calcio

0.25 M • Plasma normal,

o plasma control normal

• El rango aceptado como normal, debe determinarse para cada tipo de reactivo

• La incubación prolongada acorta el tiempo de tromboplastina parcial activado

• Cuando se monitorea la terapia con heparina, cualquier activación del factor 4 plaquetario que es un potente inhibidor de la heparina, se libera si no hay una correcta centrifugación

Fuentes de errorMaterial

Procedimiento

• La sangre es colectada en una proporción 9:1 con citrato de sodio

• Centrifugar 15 minutos en 2,500 rpm. El plasma puede ser mantenido en una gradilla con hielo mientras se realiza la prueba. La prueba puede ser realizada en aparatos opticos o de forma manual.

• Pipetear 0.1 mL del plasma del paciente y agregar 0.1 mL de reactivo de tromboplastina parcial activada, la prueba debe hacerse por duplicado incubando a 37°C por 2 minutos, la incubación no debe exceder de 5 minutos

• Dispare con 0.1 mL de cloruro de calcio al mismo tiempo que se echa andar el cronómetro

• Lo mismo se realiza para un plasma testigo o al control

Valores normales

• De 28 segundos a 35 segundos, dependiendo del tipo de activador que tenga el reactivo que se esté usando.

Fundamento• El TTPa puede estar prolongado si hay una actividad

disminuida de algún factor de la coagulación o si se encuentra presente un anticoagulante circulante.

• El TTPa diferencial debe hacerse en todo paciente que tenga el TTPa prolongado, haciendo una mezcla de plasma del paciente con plasma normal v/v.

• Si la mezcla de los plasmas indica deficiencia de un factor el tiempo se corrige, en cambio cuando existe un anticoagulante presente el tiempo se prolonga.

• Se pueden hacer mezclas con plasma adsorto con sulfato de bario y con suero viejo, esto para identificar el factor deficiente.

Tiempo Diferencial.

Reactivos

• Plasma adsorto con sulfato de bario

• Suero envejecido por 3 días• Reactivo de TTPa• Cloruro de calcio 0.025 M

Procedimiento

• Se va a realizar una prueba de TTPa a cada una de las siguientes mezclas:• V/V plasma normal con el

plasma del paciente• V/V plasma normal con

plasma adsorto• V/V plasma paciente con

plasma adsorto• V/V plasma normal con

suero viejo• V/V plasma paciente con

suero viejo

• El plasma adsorto se prepara de la siguiente manera: a 1ml de plasma normal se le agregan 500 mg de sulfato de bario, se agita y se deja en un baño de agua por 5 minutos, centrifugar 10 minutos a 2,500 rpm y separar el sobrenadante. Repetir el procedimiento tres veces. El suero viejo se obtiene de un suero separado y refrigerado de 3 días

• A cada una de las mezclas se les realiza un tiempo de tromboplastina parcial activada. El Plasma adsorto contiene los factores I, V, VIII, XI, XII, mientras que el suero viejo contiene IX, X, XI, XII

Tiempos originales del paciente

TTPa TP Plasma deficiente

en F. V

Deficiencia indicada

TTPa TP PA SV PA SV

A N C NC VIII

A N C C XI, XIII, PRECAL.

A N C C IX

A A NC C NC C I

A A C NC NC V

A A NC C C X

A A NC NC C II

N A NC C C VII

N = tiempo normal; A = Tiempo anormal; C = Corrección parcial; NC = Tiempo no corregido; = No se realiza; PA = Plasma adsorto; SV = Suero normal envejecido.

Determinación de Factores.

Fundamento

• Este boiensayo es a aplicado al TTPa y permite cuantificar de forma individual algunos de los factores de la coagulación.

• Se utilizan plasmas deficientes en un solo factor. Estos pueden ser comerciales o se pueden preparar en el laboratorio a partir de un pool de plasmas normales los cuales deben tener el resto de los factores en exceso y constantes

Material

• Plasma citratado del paciente

• Plasma factor deficiente VIII, IX, XI, etc.

• Reactivo de TTPa• Cloruro de calcio

0.025M

• El procedimiento básico es igual para todos los factores

• La muestra debe ser obtenida en citrato de sodio en proporción 9:1

• Centrifugar 10 minutos a 2500 rpm y separar el sobrenadante, de manera ideal la centrifuga debe ser refrigerada

• El plasma debe ser almacenado en congelación si no se va a trabajar de inmediato o mantener de 2ºC a 8° C. Esto es debido a que la labilidad de los factores se aumenta a temperatura ambiente

• Hay que realizar una curva de referencia para cada uno de los plasmas deficientes, esto se puede llevar a cabo con un pool de plasmas normales o con un calibrador comercial

Procedimiento

• Haga diluciones del plasma de referencia normal con solución salina en tubos plásticos 1:10, 1:20, 1:40, y 1:80.• La dilución 1:10 representa el 100% de concentración• La dilución 1:20 representa el 50% de concentración• La dilución 1:40 representa el 25% de concentración• La dilución 1:80 representa el 12.5% de concentración• La preparación de la muestra problema y controles se

lleva a cabo en una dilución de 1:10 con solución salina

• En la copilla de muestra se coloca 0.1 mL del plasma problema o de la dilución del estándar correspondiente, se añade 0.1 mL del plasma sustrato deficiente, más 0.1ml del reactivo de TTPa; se incuba por 3 minutos y se dispara el cronómetro al agregar 0.1 mL del cloruro de calcio. Registrar el tiempo de formación del coágulo

• Los resultados de la curva se grafican en un papel semi-logarítmico, colocando en el eje de las “X” el porcentaje de actividad de factor VIII o el deficiente, y en el eje de las “Y” el tiempo de coagulación en segundos.

• Si el nivel del factor deficiente es muy bajo (<5%) el plasma se diluye de 1:5, y el resultado se divide por 2.

Variaciones fisiológicas.

Muchos factores pueden inducir un incremento en los niveles de un factor. Como sucede con factor VIII la terapia con anticonceptivos orales, el tratamiento con anticoagulantes orales o con corticoesteroides

Interpretación

• La interpretación es directa, sin embargo como en todos los procedimientos de coagulación, se requiere un estricto control de la técnica

• Otra posible complicación es la presencia de un inhibidor en el plasma de prueba

Valores Normales

60 % a 120 % de actividad del factor determinado.

EVALUACIÓN DE LA VÍA

EXTRÍNSECA.índice

Tiempo de Protrombina

Fundamento• El tiempo de protrombina es una medida de la

coagulación iniciada por la vía extrínseca• El estudio es desarrollado por la adición de

una tromboplastina completa (equivalente a la tromboplastina tisular) al plasma y añadiendo calcio

• Es afectado por la concentración de los diversos factores, el fibrinógeno, la protrombina y los factores V, VII, y X

Reactivos• Citrato de sodio 3.8 %• Reactivo de tromboplastina tisular• Plasma control normal• Plasma control anormal• Cloruro de calcio 0.025 M

• Recolectar la muestra por la técnica de la doble jeringa, vaciando la sangre en tubos de plástico o siliconizados utilizando el citrato de sodio como anticoagulante

• Centrifugue la sangre de 2,500 a 3,000 rpm por 10 minutos para preparar el plasma pobre en plaquetas, éste se mantiene en refrigeración o en hielo hasta que se realice la prueba, sin no va a realizarse de inmediato se puede congelar a -20°C

• Pipetee 0.2 mL del plasma problema e incubar 60 segundos a 37ºC y añadir el cloruro de calcio

• Registre el tiempo en segundos, por ciento de actividad, o INR.

Procedimiento.

Valores normales• De 11 segundos a 13 segundosInterpretaciónEl TP se encontrará prolongado:• Cuando exista una deficiencia de los factores I, II, ó

VII• Cuando existe hipofibrinogenemia se formara un

coágulo pero el tiempo estará prolongado, cuando existe una afibrinogenemia no se formara coágulo

• En deficiencias múltiples como sucede en los pacientes con cirrosis hepática, deficiencia de vitamina K, cuando sé esta en tratamiento de anticoagulantes orales

• La presencia de anticoagulantes circulantes dirigidos contra el factor V, o cuando se encuentra un anticoagulante tipo Lúpico

• Presencia de coagulación intravascular diseminada o de productos de degradación del fibrinógeno o fibrina elevados

• Disproteinemias, como sucede en el mieloma múltiple

índiceíndce

INR

• La estandarización internacional del TP (tiempo de protrombina) es la base del monitoreo para la terapia con anticoagulantes orales

• La Organización Mundial de la Salud junto con el Comité para Estandarización en Hematología y el Comité Internacional en Trombosis y Hemostasis han recomendado reportar el TP de pacientes en terapia con anticoagulantes orales usando el INR en vez de reportar los segundos obtenidos directamente. Esto hace que los resultados sean independientes de la marca de reactivos o los métodos utilizados en el ensayo

• El INR se basa en un rango o valor obtenido al dividir el TP del paciente por el TP de un pool de plasmas frescos normales o un plasma control normal

• Los reactivos utilizados deberán especificar en su literatura su ISI (Índice de Sensibilidad Internacional) que indica el grado de sensibilidad con respecto a las tromboplastinas de referencia preparadas con las normas internacionales de calidad. Deberán aportar también una tabla o gráfica que correlacione el TP en segundos con el ISI de cada lote de reactivo.

• El INR se determina de acuerdo a la siguiente ecuación:

IAC = TP paciente/TP testigo

• En donde:• IAC = rango del paciente o Índice de Anti

coagulación• INR = IACISI

CONDICION RANGO INR

Preoperatorio 1.5 a 2.5

Preoperatorio en cirugía de cadera

2 a 3

Prevención de trombosis Primaria y secundaria

2 a 3

Prevención de trombosis conhistoria de 2 ó más episodios

2.5 a 4

Prevención de tromboembolismo Arterial

3 a 4.5

EVALUACIÓN DE LA

VÍA COMÚN.

índice

Fundamento El tiempo de trombina es una medida estandarizada

de la conversión del fibrinógeno en fibrina mediante la adición de una cantidad conocida de trombina exógena y midiendo el tiempo que tarda la formación del coágulo.

Se puede encontrar prolongado por: Cantidad menor de fibrinógeno “hipofibrinogenemia”

Alteración en la estructura molecular del fibrinógeno “disfibrinogenemia”

La presencia de productos de degradación del fibrinógeno “PDF”

La presencia de heparina en el plasma y

Por la presencia de paraproteínas en el plasma

Tiempo de trombina.

Reactivos

Tubos siliconizados con citrato de sodio como anticoagulante

Cloruro de calcio 0.025 M Calibrador Plasma control

Colecte la sangre en proporción 9:1 con citrato de sodio

Centrifugué la sangre 10 minutos a 2,500 rpm y mantener el plasma en hielo

Reconstituya los reactivos de acuerdo a las especificaciones indicadas

En una cubeta del coagulómetro agregue 0.2 mL plasma problema ó plasma control, incube a 37ºC por 2 minutos y añada 0.2 del reactivo de trombina

Registre el tiempo en segundos

Tiempo de Trombina.Procedimiento

Causas de error

Valores Normales

Muestras parcialmente coaguladas

Trazas de heparina Trombina almacenada en

contenedores de vidrio no siliconizado.

De 18 segundos a 22 segundos.

Cuantificación de fibrinógeno.

Los métodos disponibles para el ensayo del fibrinógeno derivan en general de dos técnicas diferentes:

La cuantificación de la proteína coagulable.

La determinación de un tiempo de coagulación.

Método de Clauss.

Fundamento En este método el fibrinógeno se mide

utilizando un plasma diluido (1:10) al cual se le agrega un exceso de trombina (100 U/mL) y se mide el tiempo de la formación del coágulo. Tanto la dilución como el exceso de trombina sobrepasan la influencia de los inhibidores. Esté método es satisfactorio para ser usado en urgencias hemorrágicas y puede ser realizado rápidamente.

vReactivos.

Tubos siliconizados con citrato de sodio al 3.8% como anticoagulante

Solución salina Solución de trombina. Se puede hacer

una solución patrón añadiendo 100 mL de solución salina a un vial que contenga 1000 U de trombina bovina, dando una concentración final de 100 U/mL

Una mezcla de plasmas normales, o plasma de referencia comercial de concentración conocida de fibrinógeno

Equipo para la determinación de fibrinógeno

Coagulómetro o equipo automatizado Papel logarítmico de 2 ciclos en caso

de que el coagulómetro no tenga la curva integrada

Procedimiento: La sangre debe ser colectada

mediante la técnica de doble jeringa, y vaciar en tubos siliconizados con citrato de sodio en proporción 9:1, centrifugue inmediatamente durante 5 minutos a 3,000 rpm.

Reconstituya los reactivos comerciales como lo indican los insertos.

Prepare la solución de trabajo en caso de que se tenga trombina concentrada, o si tiene el equipo de fibrinógeno, seguir las instrucciones para reconstituir el reactivo de trombina que ya viene lista la solución de trabajo.

Los reactivos son estables entre 2ºC y 8ºC hasta la fecha de caducidad.

Usando la solución salina prepare diluciones 1:5, 1:15, 1:40 del estándar de plasma de concentración conocida de fibrinógeno.

Determine el tiempo de coagulación de cada dilución por duplicado, incubando 0.2 ml de plasma diluido en un baño de agua a 37oC por 3 minutos antes de añadir 0.1 ml de la solución de trombina que estará a temperatura de 37oC. Esto se hace por duplicado

Promedie el tiempo de coagulación de cada dilución y grafique los puntos en el papel logarítmico. El tiempo de coagulación en segundos debe graficarse sobe las ordenadas y la concentración de fibrinógeno sobre las abscisas

Realice una dilución 1:10 de la muestra del paciente con solución salina y pruébela por duplicado. Niveles muy altos requieren una dilución 1:20 y valores muy bajos una dilución 1:5 ó 1:2

El reporte se hace en mg/100dL. De manera ideal deberán llevar control normal y anormal.

Valores Normales

De 170 mg/dL a 410 mg/dL, con un valor medio de 290 mg/dL

Método de Parfenjev.Fundamento

Las proteínas del plasma tienen diferente solubilidad en diferentes soluciones. El reactivo de parfenjev precipita el fibrinógeno pero deja en solución las demás proteínas. El grado de turbidez está en relación con la concentración de fibrinógeno. Esta es una prueba precisa pero puede encontrar cambios significativos en la concentración de la proteína.

Reactivos Procedimiento

Citrato de sodio (0.1 M)

Solución de cloruro de sodio, NaCl (0.85%)

Reactivo de Parfenjev:

• Sulfato de amonio (NH4)2 SO4, 133.33g.

• Cloruro de Sodio (NaCl), 10 g.

• Agua destilada, 1000 mL.

•Ajuste el pH a 7.00 con hidróxido de sodio (NaOH), 10 M.

Tomar la muestra con la técnica de la doble jeringa y vaciar en tubos siliconizados con citrato de sodio en proporción 9:1

Centrifugue la sangre a 3,000 rpm por 10 minutos. Separe el plasma y mantenga a temperatura de 4oC

Marque dos cubetas del espectrofotómetro, una como B (blanco) y la otra como P (problema)

Ponga en el tubo B, 0.5 mL de plasma y 4.5 mL de solución de cloruro de sodio

Lea en un espectrofotómetro, a una longitud de onda de 510 nm. Se coloca el blanco y se calibra a 100% de transmitancia o a “0” de densidad óptica

En el tubo marcado P coloque 0.5 ml de plasma y agregue 4.5 ml de reactivo de parfenjev. Mezcle por inversión lenta, deje reposar exactamente 3 minutos y lea la densidad óptica

La concentración de fibrinógeno se obtiene por la siguiente ecuación:

Fibrinógeno (mg/dL) = D.O.P. (D.O. problema) + 0.019 X1000 0.509

Valores Normales

Varían de 200 mg/dL a 400

mg/dL.

Conclusión.

En estos temas realizamos diversas pruebas para ver los tiempos de coagulación en la sangre. Primero investigamos sobre las 3 vías de la fibrinólisis para poder realizar las practicas (vía intrínseca, extrínseca y común).

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