EVALUACION DE LA CAPACIDAD FERMENTATIVA DE LAS LEVADURAS

I. OBJETIVOS:

Determinar la pérdida de peso y la cantidad de glucosa consumida por las soluciones

de levaduras.

Determinar el rendimiento real de las levadura (gr etanol/gr glucosa)

Determinar la eficiencia de las levaduras.

II. MARCO TEÓRICO:

GLUCOLISIS

Es una de las rutas más importante por su frecuencia en los seres vivos. El metabolismo de

la glucosa comienza con la glucólisis, (ciclo de Embden Meyerhof) acoplada a la ruta de las

pentosas. Durante la glucólisis una molécula de glucosa rinde dos moléculas de ácido

pirúvico, es decir una molécula de seis átomos de carbono se escinde en dos de tres.

Se puede estructurar en 2 etapas:

1. Pasar de Glucosa a Fructosa-1,6-difosfato.

2. Pasar de Fructosa-1,6-difosfato a dihidroxiacetona y gliceraldehido.

La primera fase es una fase de alteración química para dejar la molécula útil para la célula.

Primera fase de la glucólisis

1. La glucosa se fosforila en el alcohol por la hexoquinasa. La hexoquinasa une el fosfato

del ATP mediante un enlace fosfoéster y la transforma en Glucosa-6-fosfato. La Glucosa-6-

P está preparada para los procesos que continúan en la glucólisis. La fosforilación

transforma 1 molécula neutra en una molécula cargada negativamente. Hace que ahora, la

glucosa-6-P no pueda volver a salir por la membrana debido a su carga negativa.

2. A la célula no le gusta la forma aldosa y hace la forma cetosa (Fructosa-6-P). Es

realizado por la fosfoglucosa isomerasa.

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3. Implica la adquisición de un segundo fosfato que va a parar al C1 y forma la fructosa-

1,6-bisfosfato. Lo relaiza la fosfofructoquinasa-1 (PFK-1). La fructosa-1,6-bisfosfato es

completamente simétrica. La PFK-1 es un enzima clave en la glucólisis.

4. La fructosa-1,6-bisfosfato se parte por la mitad y da dos moléculas (dihidroxiacetona-

fosfato (DHAP) y gliceraldehido-3-fosfato (G3P)). La glucólisis se da a partir del

gliceraldehido-3-P. El equilibrio está desplazado hacia la dihidroxiacetona-fosfato. Sólo un

5% es Gliceraldehido-3-P. La desaparición continua de G3P transforma la DHAP en G3P.

Todo acaba siendo G3P.

Segunda fase de la glucólisis

A partir del G3P comienzan las transformaciones que dan lugar a Piruvato (Pyr)

(reacciones de oxidación).

1. La primera reacción es que el enzima Gliceraldehido-3-Fosfatodeshidrogenasa oxida el

grupo aldehído a ácido (gasta un NAD, que se reduce a NADH). Produce un enzima que es

capaz de incorporar un fosfato al ácido carboxílico correspondiente. Se forma un éster. La

fosforilación a nivel de sustrato se consigue porque hay ATP con un fosfato ya activado.

2. El 1,3-Bisfosfoglicerato cede 1 fosfato para sintetizar ATP. La reacción la cataliza la

fosfogliceratoquinasa. El producto de la síntesis de ATP es el 3-fosfoglicerato. Sufre

transformaciones que dan lugar a la síntesis de Pyruvato. El P3 debe pasar a la posición 2.

Se consigue mediante el enzima fosfogliceromutasa. La mutasa tiene un fosfato activo, que

se lo da a la posición 2. En un momento hay dos fosfatos, pero luego, se lo quita de la

posición 3. Todas las mutasas funcionan así. Se hace para liberar el OH en la posición 3.

3. Se produce la deshidratación del OH. Se transforma el alcohol en enol, por la enolasa. Es

parecido a Pyruvato, pero con enol y un fosfato. Se llama fosfoenolpiruvato (PEP). Es una

molécula muy inestable que se transforma en Pyruvato por la Pyruvatoquinasa y se acopla

la energía que se desprende para sintetizar ATP.

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ANÁLISIS ESTEQUIOMÉTRICO DE LA GLUCÓLISIS

Glucosa + 2Pi + 2 ADP + 2 NAD+ 2 Pyr + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O

La glucólisi es una vía que transforma la glucosa en Pyruvato y, a su vez, reduce 2 NAD+

del citosol a NADH y usa 2 Adp para formar 2 ATP.

La célula en cuanto puede, transforma otros monosacáridos a moléculas que están en la vía

de la glucólisis.

Figura 1. Diagrama de la glucolisis

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Limitaciones del Proceso

La determinación de los factores que limitan la glicólisis fermentativa del etanol son

complejos debido a la interrelación existente y a la naturaleza de los parámetros

intervinientes durante el proceso de fermentación. Algunos de ellos se deben tener en

cuenta en la fermentación alcohólica industrial. En las limitaciones que surgen durante el

proceso se pueden enumerar algunos de los más importantes como son:

Concentración de etanol resultante - Una de las principales limitaciones del proceso,

es la resistencia de las levaduras a las concentraciones de etanol (alcohol) que se

llegan a producir durante la fermentación, algunos microorganismos como el

saccharomyces cerevisiae pueden llegar a soportar hasta el 20% de concentración

en volumen. En ingeniería bioquímica estos crecimientos se definen y se modelizan

con las ecuaciones de crecimiento celular dadas por las ecuaciones de Tessier,

Moser y de la ecuación de Monod.

Acidez del substrato - El pH es un factor limitante en el proceso de la fermentación

ya que las levaduras se encuentran afectadas claramente por el ambiente, bien sea

alcalino o ácido. Por regla general el funcionamiento de las levaduras está en un

rango que va aproximadamente desde 3.5 a 5.5 pH. Los procesos industriales

procuran mantener los niveles óptimos de acidez durante la fermentación

usualmente mediante el empleo de disoluciones tampón. Los ácidos de algunas

frutas (ácido tartárico, málico) limitan a veces este proceso.

Concentración de azúcares - La concentración excesiva de hidratos de carbono en

forma de monosacáridos y disacáridos puede frenar la actividad bacteriana. De la

misma forma la baja concentración puede frenar el proceso. Las concentraciones

límite dependen del tipo de azúcar así como de la levadura responsable de la

fermentación. Las concentraciones de azúcares afectan a los procesos de osmosis

dentro de la membrana celular.

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Contacto con el aire - Una intervención de oxígeno (por mínima que sea) en el

proceso lo detiene por completo (es el denominado Efecto Pasteur). Esta es la razón

por la que los recipientes fermentadores se cierren herméticamente.

La temperatura - El proceso de fermentación es exotérmico, y las levaduras tienen

un régimen de funcionamiento en unos rangos de temperatura óptimos, se debe

entender además que las levaduras son seres mesófilos. Si se expone cualquier

levadura a una temperatura cercana o superior a 55 °C por un tiempo de 5 minutos

se produce su muerte. La mayoría cumple su misión a temperaturas de 30 °C.

Ritmo de crecimiento de las cepas - Durante la fermentación las cepas crecen en

número debido a las condiciones favorables que se presentan en el medio, esto hace

que se incremente la concentración de levaduras.

CICLO DE KREBS.

El ciclo de Krebs se desarrolla en las mitocondrias. El ácido pirúvico formado durante la

glucólisis se convierte en acetil CoA, el cual a través del ciclo de krebs se transforma en

anhidrido carbónico. El paso de ácido pirúvico a acetil CoA tiene lugar en la matriz

mitocondrial y es catalizado por la piruvato deshidrogenasa. El acetil CoA ahora entra en el

ciclo de krebs uniendose al ácido oxalacético para formar el ácido cítrico, por medio de una

isomerasa se transforma en isocítrico, el cual por medio de una descarboxilasa da lugar al

alfa-cetoglutárico, este paso supone la liberación de anhídrido carbónico y NADH.

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Figura 2. Diagrama del ciclo de krebs

El proceso comienza con la oxidación del piruvato, produciendo un acetil-CoA y un CO2.

El acetil-CoA reacciona con una molécula de oxalacetato (4 carbonos) para formar citrato

(6 carbonos), mediante una reacción de condensación.

A través de una serie de reacciones el citrato se convierte de nuevo en oxalacetato. El ciclo

consume netamente 1 acetil-CoA y produce 2 CO2. También consume 2 NAD+ y 1 FAD,

produciendo 3 NADH y 3 H+ y 1 FADH+.

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El resultado de un ciclo es (por cada molécula de piruvato): 1 GTP, 3 NADH, 1 FADH2,

2CO2

Cada molécula de glucosa produce (vía glucólisis) dos moléculas de piruvato, que a su vez

producen dos acetil-CoA, por lo que por cada molécula de glucosa en el ciclo de Krebs se

produce: 2 GTP, 6 NADH, 2 FADH2, 4CO2.

Por cada molécula de acetil CoA se forman dos moléculas de anhídrido carbónico, una

GTP, tres NADH y un FADH2, el ciclo necesita la incorporación de dos moléculas de agua.

En el ciclo de krebs se encuentran acopladas las lanzaderas, las cuales intervienen en

diferentes procesos anabólicos. De esta forma a partir del ciclo de krebs pueden formarse

aminoácidos, ácidos grasos incluso glucosa (gluconeogénesis).

FERMENTACIÓN

Todas las células están capacitadas para sintetizar ATP por el proceso de la glicólisis. En

muchas células, si el oxígeno no está presente, el piruvato es metabolizado en un proceso

llamado fermentación.

La fermentación complementa a la glicólisis y hace posible producir ATP continuamente en

la ausencia del oxígeno. Por la oxidación del NADH producido en la glicólisis, la

fermentación regenera el NAD+, el cual interviene otra vez en para producir más ATP.

C6H12O6 + 2 Pi + 2 ADP → 2 CH3-CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP + 25.5 kcal

Se puede ver que la fermentación alcohólica es desde el punto de vista energético una

reacción exotérmica, se libera una cierta cantidad de energía.

Un cálculo realizado sobre la reacción química muestra que el etanol resultante es casi un

51% del peso, los rendimientos obtenidos en la industria alcanzan el 7%.

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Figura 3. Proceso de fermentación

En la fermentación alcohólica, el ácido pirúvico de la gicólisis pierde un carbono en la

forma de bióxido de carbono para formas acetaldehido, el cual es reducido a alcohol etílico,

el NADH se convierte en NAD+ (es oxididado). Esta es la fermentación que ocurre

normalmente en las levaduras. Como en la fermentación del ácido láctico, la fermentación

alcohólica permite a la glicólis continuar y asegurar que el NADH regresa a su estado

oxidado (NAD+).

La energía neta ganada en la fermentación es de 2 moléculas/glucosa de ATP. En ambas

fermentaciones (láctica y alcohólica), todo el NADH producido en la glicólisis es

consumido en la fermentación, por lo tanto no hay producción neta de NADH, y ningún

NADH entra a la CTE y forma ATP.

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RESPIRACION:

La reacción química global de la respiración es la siguiente:

C6 H12 O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + energía (ATP)

En este punto la célula ha ganado solo 4 ATP, 2 en la glucólisis y dos en el ciclo de Krebs,

sin embargo ha capturado electrones energéticos en 10 NADH2 y 2 FADH2. Estos

transportadores depositan sus electrones en el sistema de transporte de electrones localizado

en la membrana interna de la mitocondria.

La cadena respiratoria está formada por una serie de transportadores de electrones situados

en la cara interna de las crestas mitocondriales y que son capaces de transferir los

electrones procedentes de la oxidación del sustrato hasta el oxígeno molecular, que se

reducirá formándose agua.

Como resultado de esta transferencia de electrones, los transportadores se oxidan y se

reducen alternativamente, liberándose una energía que en algunos casos es suficiente para

fosforilar el ADP y formar una molécula de ATP. Se trata de la fosforilación oxidativa que

permite ir almacenando en enlaces ricos en energía la energía contenida en las moléculas

NADH2, FADH2, NADPH2, que se liberan en la glucólisis y en el ciclo de Krebs y que

será más tarde fácilmente utilizada. Toda cadena respiratoria que comience por el NAD

conduce a la formación de 3 ATP mientras que si comienza por el FAD produce sólo 2

ATP. El rendimiento energético del NADP es similar al del NAD, así como el del GTP lo

es al del ATP.

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III. MATERIALES Y METODOLOGÍA

A. MATERIALES

Levadura instantánea (Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae)

Agua destilada

Matraces 250 ml.

Algodón

Azúcar

B. EQUIPOS

Brixometro

Balanza analítica Sartorius CPA224S, Max 220g, d=0.1mg.

C. METODOLOGIA

Pesar los matraces, para poder sacar cálculos posteriores,

Preparar dos soluciones de sacarosa al 10% y 20 %,

Luego de esto verter en las soluciones 1% de levadura, diluirla en la solución y

tapar con algodón la boca de los matraces,

Tomar peso y °Brix en el tiempo 0, luego tomar peso cada doce horas, luego de

cuatro pesadas tomar peso y °Brix para los cálculos,

Encontrar la pérdida de peso y cantidad de glucosa consumida(°Brix),

Determinar el rendimiento real (gr etanol/gr glucosa)

Calcular finalmente la eficiencia de las levaduras.

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IV. RESULTADOS

Tabla 1. Pesos iníciales

PESO DE LEVADURA 1,5PESO DE MATRAS 1 130,8PESO DE MATRAS 2 151,2

Tabla 2. Pesos y ºBrix: muestra 10 %

t PESO º BRIX0 282 10,6

12 280,6 - 274,5 - 274,1 2,9

Tabla 3. Pesos y ºBrix: muestra 20 %

t PESO º BRIX0 302,4 20,5

12 300,9 - 291,7 - 290,2 9,2

Tabla 4. Pérdida de peso y sacarosa consumida: muestra 10 %

PERDIDA DE PESO 7,9SACAROSA CONSUMIDA 11,8715

Tabla 5. Pérdida de peso y sacarosa consumida: muestra 10 %

PERDIDA DE PESO 12,2SACAROSA CONSUMIDA 18,208

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factores X/A 1,66Y/B 0,515

Tabla 6. Variables: muestra 10 %

X + Y 7,9A + B 11,8715

Tabla 7. Variables: muestra 20 %

X + Y 12,2A + B 18,208

Tabla 8. Encontrando valores de las variables: muestra 10 %

1.66A + 0.515B = 7,91.66(11.8715-B) + 0.515B = 7,9

(0.515B - 1.66B) + 1.66*11.8715 =

7,9

B = 10,312A = 1,560X = 2,590Y = 5,310

Tabla 9. encontrando valores de las variables: muestra 20 %

1.66A + 0.515B = 12,21.66(18.208 -B) + 0.515B = 12,2

(0.515B - 1.66B) + 1.66*18.208 = 12,2B = 15,743A = 2,465X = 4,093Y = 8,107

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Tabla 10. valores encontrados: muestra 10 %

CANTIDAD DE ETANOL 5.310*92/88 = 5,552CANTIDAD DE SACAROSA 11,872RENDIMIENTO REAL 46,766RENDIMIENTO TEORICO 184/342 = 53,801EFICIENCIA 86,924

Tabla 11: valores encontrados: muestra 20 %

CANTIDAD DE ETANOL 8.107*92/88 = 8,476CANTIDAD DE SACAROSA 18,208RENDIMIENTO REAL 46,551RENDIMIENTO TEORICO 184/342 = 53,801EFICIENCIA 86,524

V. DISCUSIONES Y CONCLUSIONES

La fermentación alcohólica es un proceso muy complejo; el incremento de la concentración

de etanol a medida que transcurre la fermentación supone un obstáculo para el correcto

crecimiento y desarrollo microbiano por los efectos negativos que esto conlleva (Oviedo et

al, 2009).

La fermentación está influenciada por varios factores como la temperatura, pH,

concentración de azúcares y otras variables que influyen en el crecimiento de los

microorganismos (Gómez, et al 2007).

La temperatura óptima para la formación de alcohol se estima en el rango de 32 °C a 35 °C

(Navarro et al, 1986).

Es sabido que a elevadas concentraciones de soluto, algunas levaduras experimentan una

plasmólisis celular, reducción del poro y otras alteraciones que disminuyen el crecimiento

microbiano lo cual sugeriría la baja o nula producción de etanol (Casas, 1999).

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El etanol afecta la permeabilidad de la membrana celular disminuyendo su selectividad, de

forma que las levaduras en un medio con alta concentración alcohólica pierden propiedades

funcionales y no pueden retener cofactores y coenzimas (Oviedo et al, 2009).

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Casas, E. 1999. Microorganismos responsables de alteraciones en alimentos altamente

azucarados. Universidad Complutense de Madrid. Tesis Doctoral. Facultad de Ciencias

Biológicas, Departamento de Microbiología. Madrid, España.

Gómez, S. et at; 2007. Capacidad fermentativa de cepas de Saccharomyces Cerevisiae

nativas de la región productora de mezcal de Durango. XII Congreso Nacional de

Biotecnología y Bioingeniería. México.

Navarro, A. et al; 1986. Producción de etanol por fermentación con alta concentración

levaduras. Revista Argentina de Microbiología 18 (1): 7-11.

Oviedo, L. et al; 2009. Levaduras autóctonas con capacidad fermentativa en la producción

de etanol a partir de pulpa de excedentes de plátano Musa (AAB Simmonds) en el

departamento de Córdoba, Colombia. Revista Colombiana de Biotecnología. Universidad

Nacional de Colombia. Vol. XI, Núm. 1. Colombia. pp. 40-47.

http://www.slideshare.net/.../glucolisis-2872239 - Estados Unidos

http://www.biologia.edu.ar/.../met3glicolisis.htm

http://www.biologiamyblog.files.wordpress.com/2010/03/glucolisis.pdf

http://www.ciclodekrebs.com/etapas_del_ciclo_de_krebs

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