EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 1 · 2019. 9. 26. · EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS...

EVALUACIÓN IN VITRO HONGOS ENDÓFITOS 1

EVALUACIÓN IN VITRO DE LA CAPACIDAD ANTAGÓNICA DE HONGOS

ENDÓFITOS AISLADOS DE MORINGA OLEÍFERA (L) EN EL CONTROL DE

PESTALOTIA PALMARUM (Q).

Samia Hasay Montoya Sánchez

UNIVERSIDAD DE SANTANDER UDES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS

BUCARAMANGA

2019


EVALUACIÓN IN VITRO DE LA CAPACIDAD ANTAGÓNICA DE HONGOS

ENDÓFITOS AISLADOS DE MORINGA OLEÍFERA (L) EN EL CONTROL DE

PESTALOTIA PALMARUM (Q).

Samia Hasay Montoya Sánchez

Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de Microbióloga

Industrial

Director

Beatriz Elena Guerra Sierra PhD

UNIVERSIDAD DE SANTANDER UDES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS

BUCARAMANGA

2019


“A Dios por permitirme haber llegado hasta este momento tan importante de mi formación profesional.

A mi madre, por ser el pilar más importante, por ser mi gran amiga y compañera, por su amor, paciencia

y esfuerzo. Gracias madre por tu apoyo incondicional eternamente agradecida contigo. TE AMO

MONA”


Agradecimientos

Primeramente, agradecerle a Dios por ser mi guía y acompañarme en el transcurso de mi vida,

brindándome paciencia y sabiduría para culminar con éxito mis metas propuestas.

A mi madre por ser mi guía, por ser mi apoyo incondicional, por su gran esfuerzo.

A mis abuelos por estar siempre a mi lado por colaborarme siempre que fuera necesario. A mis

tíos, tías, primos y primas por acompañarme en este proceso.

A mi Tutora Beatriz Elena Guerra Sierra, por su confianza puesta en mí, por su apoyo para con mi

trabajo. Gracias por los conocimientos brindados.

A Adriana Sandoval por su gran entrega, colaboración y seguimiento en cada uno de los momentos

de mi trabajo.

Mi agradecimiento a todos, familia y amigos que de una u otra manera me brindaron su

colaboración y se involucraron en este proyecto.


Contenido

Pág.

Resumen ....................................................................................................................................... 12

Abstract ........................................................................................................................................ 13

Introducción ................................................................................................................................ 14

1 Presentación del trabajo de grado ..................................................................................... 17

1.1 Planteamiento del Problema ....................................................................................... 17

1.2 Pregunta de Investigación ........................................................................................... 19

1.3 Hipótesis ..................................................................................................................... 19

1.4 Objetivos ..................................................................................................................... 19

1.4.1 Objetivo general .................................................................................................. 19

1.4.2 Objetivos específicos........................................................................................... 19

1.5 Justificación .................................................................................................................... 20

2 Marco teórico ....................................................................................................................... 22

2.1 Palma aceitera ............................................................................................................. 22

2.2 Insecto facilitador de la Pestaloptiosis ........................................................................ 24

2.3 Pestalotia palmarum................................................................................................... 26

2.3.1 Generalidades. ..................................................................................................... 27

2.4 Pestalotiopsis .............................................................................................................. 30

2.4.1 Controles Químicos. ............................................................................................ 30

2.5 Moringa oleífera Lam ................................................................................................ 32

2.6 Hongos endófitos ........................................................................................................ 34

2.6.1 Metabolitos secundarios. ..................................................................................... 36

2.6.2 Mecanismos de Acción. Los mecanismos de acción del antagonismo dual se

traducen en competencia por espacio y alimento, antibiosis, parasitismo y sinergismo. ...... 37

3 Metodología .......................................................................................................................... 39

3.1 Población y muestra.................................................................................................... 39

3.2 Sitio de estudio ........................................................................................................... 39

3.3 Manejo y tratamiento de las muestras ........................................................................ 39


3.4 Siembra de los fragmentos del material vegetal ......................................................... 40

3.5 Separación y purificación ........................................................................................... 40

3.6 Pruebas de antagonismo in vitro por cultivo dual ...................................................... 41

3.6.1 Preselección de hongos endófitos ....................................................................... 41

3.7 Análisis estadísticos .................................................................................................... 42

3.8 Identificación de las morfoespecies de hongos endófitos con mayor capacidad

antagónica.................................................................................................................................. 42

3.9 Evaluación de los mecanismos de antagonismo ......................................................... 42

3.10 Prueba cualitativa de Cocultivo de endófitos ............................................................. 43

4 Resultados y Discusión ........................................................................................................ 44

4.1 Aislamiento de hongos ............................................................................................... 44

4.2 Pruebas de antagonismo ............................................................................................. 47

4.3 Análisis estadístico ..................................................................................................... 51

4.3.1 Análisis de medias del crecimiento de hongos endófitos de M. oleífera en cultivo

dual con P. palmarum. .......................................................................................................... 51

4.3.2 Análisis de varianza ANOVA ............................................................................. 52

4.3.3 Prueba Tukey....................................................................................................... 54

4.4 Identificación de los hongos (género) con mayor capacidad antagónica ................... 56

4.5 Evaluación de los mecanismos de antagonistas. ........................................................ 60

4.6 Prueba cualitativa de cocultivo de endófitos .............................................................. 61

5 Conclusiones ......................................................................................................................... 65

6 Bibliografía ........................................................................................................................... 67

7 ANEXOS .............................................................................................................................. 77

7.1 Anexo 1....................................................................................................................... 77

7.2 Anexo 2....................................................................................................................... 77

7.3 Anexo 3...................................................................................................................... 78

7.4 Anexo 4....................................................................................................................... 79


Lista de Tablas

Pág.

Tabla 1.Codificación de hongos endófitos.................................................................................... 41

Tabla 2. Aislamiento de hongos endófitos de Moringa oleífera ................................................... 45

Tabla 3.Pruebas de antagonismos de los hongos endófitos frente a Pestalotia palmarum. .......... 48

Tabla 4.Análisis de varianza de los hongos que presentaron mayor capacidad antagónica ......... 53

Tabla 5.Análisis de varianza ANOVA.......................................................................................... 54

Tabla 6.Pruebas a posteriori Tukey .............................................................................................. 55

Tabla 7.Descripción de los hongos endófitos aislados de M.oleífera con mayor capacidad

antagónica a P. palmarum ............................................................................................................ 57

Tabla 8.Mecanismos de acción presentados entre los endófitos y el patógeno. ........................... 61

Tabla 9.Tratamientos de hongos endófitos de M. oleífera ,utilizados en prueba de cocultivo

contra P. palmarum. ...................................................................................................................... 62

Tabla 10.Pruebas que potenciaron el antagonismo de P. palmarum en cocultivo con hongos

endófitos ........................................................................................................................................ 63


Lista de Figuras

Pág.

Figura 1.Ciclo de vida de Leptopharsa gibbicarina ...................................................................... 25

Figura 2.Lesión típica en el envés de los foliolos, caracterizada por manchas, semicirculares de

color oliva a marrón oscuro, rodeadas por un borde amarillo indefinido de aspecto aceitoso. .... 26

Figura 3.Ciclo de vida de Pestalotia palmarum ............................................................................ 29

Figura 4.Beneficios, propiedades y aplicaciones de cada una de los tejidos de la planta Moringa

oleífera. ......................................................................................................................................... 33

Figura 5. Porcentaje de los aislados de Moringa oleífera por tejido ............................................. 46

Figura 6.Prueba de cultivo dual a) MT17: Trichoderma sp, b) MH5: Curvularia sp, c) MT12:

Fusarium sp d) MT11: Fusarium sp e) MT2: Fusarium sp f) MT6: Fusarium sp g) MT3:

Curvularia sp, h) Curvularia sp. .................................................................................................... 51

Figura 7. Análisis de medias de crecimiento de los hongos endófitos aislados de Moringa oleífera

en antagonismo con P. palmarum in vitro. ................................................................................... 52

Figura 8.Cepas de hongos endófitos de M. oleífera que presentan los mayores porcentajes de

inhibición in vitro contra el fitopatógeno P. palmarum : a. Trichoderma sp. b. Curvularia sp. c.

Fusarium sp. d. Fusarium sp e. Fusarium sp. f. Fusarium sp. g. Curvularia sp. h. Curvularia sp. 56

Figura 9.Estructuras microscópicas de hongos endófitos de M. oleífera que presentan los

mayores porcentajes de inhibición in vitro contra el fitopatógeno P. palmarum : a. Trichoderma

sp. b. Curvularia sp. c. Fusarium sp. d Fusarium sp . e. Fusarium sp. f. Fusarium sp. g. Curvularia

sp. h. Curvularia sp. ...................................................................................................................... 57

Figura 10.Prueba de cocultivo. Todas las figuras de la derecha muestran el anverso de los

cocultivos y las figuras de la izquierda el reverso. a. MH5 Curvularia sp), y MH2 (Curvularia sp)


en cocultivo. b) MT11 (Fusarium sp) y MT17 (Trichoderma sp). c).

MT2(Fusarium sp) y MT12(Fusarium sp). En el centro de las cajas el patógeno. ....................... 64


Lista de Anexos

Pág.

7.1 Anexo 1 .............................................................................................................................. 77

7.2 Anexo 2 .............................................................................................................................. 77

7.3 Anexo 3 ............................................................................................................................. 78

7.4 Anexo 4 .............................................................................................................................. 79


Título: Evaluación in vitro de la capacidad antagónica de hongos endófitos aislados de Moringa

oleífera (L) en el control de Pestalotia palmarum

Resumen

Autor(es): Samia Hasay Montoya Sánchez

Palabras claves: Antagonismo, Endófitos, Pestalotiopsis,

La Pestalotiopsis, producida por el hongo Pestalotia palmarum, es la principal enfermedad que

produce defoliación en los cultivos de palma aceitera en el trópico, esta enfermedad afecta de

manera considerable la sostenibilidad de los cultivos y su tratamiento convencional, implica un

daño al medio ambiente por la contaminación que genera. Por tal motivo, la búsqueda de

soluciones naturales innovadoras a esta problemática en el sector agroindustrial es de gran

importancia, como una alternativa al tratamiento químico. La adaptabilidad de los hongos

endófitos a sus hospedantes, los beneficios ecológicos que le brinda y los diversos mecanismos

antagónicos que poseen contra el control de plagas, los convierten en una buena alternativa. En

este trabajo, se evaluó la capacidad antagónica de los hongos endófitos aislados de Moringa

oleífera, en el control de Pestalotia palmarum, haciendo uso de métodos de aislamiento,

identificación y evaluación del antagonismo en conjunto con herramientas de análisis

estadísticos, que permitieran determinar si algunos de los hongos endófitos, podrían significar

una alternativa para el biocontrol de la Pestaloptiosis. Se determinó el potencial de 21 cepas de

hongos endófitos obtenidas de tejido sanos, como candidatas para el control biológico de P.

palmarum. De estos aislados, ocho cepas fúngicas fueron las más promisorias. Destacándose

entre estas, por su actividad antagónica in vitro frente al patógeno, la cepa MT17,

correspondiente a Trichoderma sp con el 87% de inhibición y MH5, correspondiente a

Curvularia sp con el 81 % de inhibición.


Title: In vitro evaluation of the antagonistic capacity of endophytic fungi isolated from Moringa

oleifera (L) in Pestalotia palmarum (Q).

Abstract

Author (s): Samia Hasay Montoya Sánchez

Keywords: Antagonism, Endophytes, Pestalotiopsis

Pestalotiopsis, produced by the fungus Pestalotia palmarum, is the main disease that causes

defoliation in oil palm crops in the tropics. This disease considerably affects the sustainability of

the crops and their conventional treatment, implies damage to the environment by the pollution it

generates. For this reason, the search for innovative natural solutions to this problem in the agro-

industrial sector is of great importance, as an alternative to chemical treatment. The adaptability

of endophytic fungi to their hosts, the ecological benefits they provide and the various

antagonistic mechanisms they have against pest control, make them a good alternative. In this

work, the antagonistic capacity of the endophyte fungi isolated from Moringa oleifera was

evaluated in the control of Pestalotia palmarum, making use of methods of isolation,

identification and evaluation of the antagonism in conjunction with statistical analysis tools,

which allowed determining if some of endophytic fungi, could mean an alternative for the

biocontrol of Pestaloptiosis. The potential of 21 endophytic fungal strains obtained from healthy

tissue was determined as candidates for the biological control of P. palmarum. Of these isolates,

eight fungal strains were the most promising. Standing out among these, for its in vitro

antagonistic activity against the pathogen, strain MT17, corresponding to Trichoderma sp with

87% inhibition and MH5, corresponding to Curvularia sp with 81% inhibition.


14

Introducción

La palma africana de aceite Elaeis guineensis Jacq, también conocida como palma aceitera es

considerada la principal fuente de aceite del mundo, es el cultivo oleaginoso que mayor cantidad

de aceite produce; con un rendimiento de 3 a 5 toneladas de aceite crudo de palma por hectárea y

de 600 a 1000kg de aceite de palmiste (Sánchez et al., 2013).

Su rendimiento es 10 veces superior a los demás cultivos, lo cual despierta un interés económico

en los países con condiciones adecuadas para el desarrollo del mismo. Los principales

exportadores de aceite de palma son Indonesia, Malasia, Tailandia, Nueva Guinea, Nigeria, entre

otros. En América existen plantaciones en Colombia, Ecuador, Perú; países donde hay grandes

extensiones de terreno dedicados a este cultivo y que siguen en crecimiento debido al desarrollo

económico que genera (Genty, Garzón y García, 2014).

La siembra de grandes plantaciones de palma aceitera ha ocasionado una modificación del

ambiente natural debido al establecimiento de monocultivos en grandes áreas del terreno, lo cual

origina un microclima diferente, con condiciones favorables para el desarrollo de plagas y

enfermedades. Dentro de las plagas encontramos una larga lista de insectos pertenecientes a

grupos taxonómicos diferentes, con comportamientos y condiciones ambientales para su

aparición (Calvache, 2001), estas plagas son consideradas de importancia económica por los

daños que causan en el follaje, tallo, frutos y el sistema radicular. Las plagas que se alimentan

del follaje tienen doble importancia ya que además de la defoliación, originan puertas de entrada

o son facilitadoras para hongos oportunistas que pueden causar enfermedades, siendo una de las

más importantes en América Central y América del Sur, comúnmente conocida como “añublo


15

foliar” o también Pestalotiopsis causada por el hongo Pestalotia palmarum (Escalante, et al.,

2010). Esta enfermedad afecta la economía del cultivo, pues dependiendo del grado de

defoliación puede ocasionar pérdidas hasta de un 40% de la producción (Calvache, 2001)

equivalentes a 5.6 Ton/ha/año y pérdidas en el follaje comprendidas entre el 19 y 66%(Escalante,

et al., 2010).

La Pestaloptiosis es considerada como una enfermedad causada por un complejo de hongos,

cuyo síntoma es la necrosis del área foliar con el consiguiente efecto sobre la capacidad

fotosintética de la planta. Las especies más importantes que conforman este complejo son

Pestalotia palmarum y P. glandicola (Genly, et al., 2014).

Se menciona que esta enfermedad está asociada con algún tipo de estrés por ejemplo deficiencias

en nutrientes como el magnesio, tiempos prolongados de sequía (Sánchez, 1990). El agente

patógeno importante y al que se le atribuye la mayor virulencia es Pestalotia palmarum. Este

género pertenece al phyllum Ascomycetes, clase Coelomycetes y a la familia

Amphisphaeriaceae. Las especies de Pestalotia palmarum, se encuentran en ecosistemas con

climas tropicales, no presentan especificidad por sus huéspedes, por lo tanto, pueden tener la

habilidad de infectar un amplio rango de huéspedes. Con respecto al ciclo de la enfermedad, se

afirma que las especies patogénicas del genero Pestalotia palmarum inicialmente hacen contacto

con el huésped en el lugar donde ocurre la infección, donde le precede una puerta de entrada

(estomas o lesiones por defoliadores), por medio de las conidias. Este inóculo puede sobrevivir a

condiciones adversas y puede causar infecciones primarias, el inoculo secundario producido por

el tejido enfermo puede causar infecciones secundarias e incrementar la severidad de esta

enfermedad. (Escalante, et al., 2010).


16

Uno de los aspectos importantes en la producción agrícola es el control y manejo de plagas y

enfermedades; (Maharachikumra, Guo, Chukeatirote, Bahkali y Hyde, 2011). La utilización

extensiva de compuestos químicos para el control de enfermedades, la emergencia de patógenos

resistentes a fungicidas, y el deterioro en la salud de productores y consumidores, han promovido

la búsqueda de alternativas viables que garanticen una mayor sostenibilidad en la producción

agrícola, minimizando el impacto sobre el medio ambiente.

Una de las alternativas para el manejo de plagas en cultivos de importancia económica, es el

control biológico, el cual utiliza agentes de control basados en microorganismos vivos o

productos naturales, que tienen un potencial comprobado para el manejo de plagas y se han

utilizado en todo el mundo (Chandler, et al., 2011)

Los hongos antagonistas utilizados en control biológico, constituyen una amplia gama de

especies entre los que se encuentran los hongos endófitos, estos organismos viven en asociación

con plantas en la mayor parte o en todo su ciclo de vida, se ubican en los espacios intercelulares

y, algunas veces, intracelularmente en diferentes tejidos como hojas, tallos, raíces, frutos y

semillas de muchas de ellas (Sánchez et al., 2013). Los hongos endófitos se han encontrado

asociados a plantas con propiedades medicinales (Mosquera, 2018, Gómez, López, Martínez y

Chacón,2016). Estos hongos presentan un interés particular debido a que se consideran

sintetizadores químicos al interior de la planta, ya que producen gran variedad de compuestos

que han sido utilizados ampliamente en la medicina, la agricultura y la industria por sus efectos

antibióticos o antimicóticos (Mosquera, 2018, Gómez, López, Martínez y Cachon 2016,

Giusiano, Rodolfi, Magianterra, Piontelli y Pico, 2010).

El propósito de este trabajo estuvo dirigido a aislar hongos endófitos de M. oleífera para evaluar

la capacidad antagónica frente a Pestalotia palmarum en ensayos in vitro.


17

1 Presentación del trabajo de grado

1.1 Planteamiento del Problema

La palma de aceite es el cultivo oleaginoso que mayor cantidad de aceite produce por unidad de

superficie. Con un contenido del 50% en el fruto, puede rendir de 3.000 a 5.000 Kg de aceite de

pulpa por hectárea (Mosquera, Gómez y Bernal, 2007) además de permitir el aprovechamiento

de la tierra mediante la utilización de cultivos marginales de manera que se considera una opción

supremamente rentable para la agroindustria de los países tropicales. (Gonzales, 2012)

A medida que el área de palma plantada en América latina ha logrado extenderse de manera

considerable, han surgido problemas de enfermedades no registradas anteriormente en regiones

tradicionalmente cultivadoras como África, Malasia e Indonesia (Sanchez, 1990). Algunas de

estas enfermedades han ocasionado millones de pérdidas en plantaciones de Colombia, como es

el caso de la Pestalotiopsis, causada por el hongo Pestalotia palmarum y que produce en la

planta una consecuente disminución del área foliar especialmente dañina en este tipo de

palmáceas, afectando considerablemente la tasa fotosintética de la planta, hecho que repercute

también en la producción del fruto. La enfermedad causada por este hongo, puede encontrarse

circunscrita solamente sobre los foliolos de las palmeras o avanzar hasta la base del peciolo de

las hojas, llegando en ocasiones a colonizar el pseudotallo y afectar al crecimiento de la palmera,

así como llegar a producir la muerte total de la planta (Gonzales, 2012)

En relación con su severidad, se han reportado disminuciones importantes en la producción de

palma aceitera, así como altos sobrecostos en el tratamiento y control de la enfermedad, el cual

tradicionalmente se hace mediante absorción radicular de un pesticida sistémico. Estos


18

tratamientos químicos, a medida que pasa el tiempo, se vuelven cada vez más ineficaces ya que,

aumentan su dosificación, por efectos de resistencia microbiana, y la frecuencia de aplicación es

cada vez más corta, por lo que se convierten en métodos insostenibles para las plantaciones de

palma de aceite (Mendez, 2000)

Es así como el control biológico se convierte en una opción atractiva para el tratamiento de

enfermedades en plantas, si se tiene en cuenta que los costos respecto al uso de tratamientos

químicos pueden resultar menores y de mayor eficiencia, pues, aunque los antagonistas pueden

actuar en forma más lenta y en menor escala, su acción puede ser muchísimo más estable y

duradera que la de los tratamientos convencionales. (Tovar, 2008)

Constantemente los seres humanos han realizado variados esfuerzos por encontrar productos que

ayuden a mejorar los cultivos partiendo específicamente desde lo sintético y recientemente

teniendo un énfasis en productos de origen natural; por lo cual las investigaciones se han visto

obligados a buscar fuentes naturales que promuevan la producción de componentes activos para

ser aplicados a nivel farmacéutico, industrial y agronómico, llevando así a los investigadores a

explorar la microbiota endófita, que ha sido objeto de atención en los últimos años debido al

abundante potencial que posee este para producir gran variedad de metabolitos secundarios que

bien podrían ser de gran ayuda a la sociedad en la cura o tratamiento de distintas patologías o

enfermedades, así como la solución a problemas agropecuarios.


19

1.2 Pregunta de Investigación

¿Los hongos endófitos de Moringa oleífera (L) presentan algún mecanismo de antagonismo para

el control de Pestalotia palmarum?

1.3 Hipótesis

Los hongos endófitos de M. oleífera tienen la capacidad de inhibir el fitopatógeno

Pestalotia palmarum in vitro

Los hongos endófitos de M. oleífera no tienen la capacidad de inhibir el fitopatógeno

Pestalotia palmarum in vitro

1.4 Objetivos

1.4.1 Objetivo general

Evaluar la capacidad antagónica de los hongos endófitos aislados de Moringa oleífera sobre

Pestalotia palmarum.

1.4.2 Objetivos específicos

Aislar hongos endófitos de los diferentes tejidos vegetales a partir de Moringa oleífera.

Determinar el efecto antagónico in vitro de hongos endófitos de Moringa oleífera frente

al hongo Pestalotia palmarum.


20

1.5 Justificación

Las investigaciones en los últimos años han estado enfocadas principalmente a la búsqueda de

soluciones biológicas para las enfermedades de los cultivos de importancia agroindustrial, para

mitigar los daños causados por productos químicos en el ambiente que también son causa del

calentamiento global (Li, et al. 2008; Molina, Pimente, Bertuci y Pastore 2012). Una de las

alternativas que surge para el control de fitopatógenos, son los hongos endófitos (Rodríguez

,2009); especies microbianas que son capaces de vivir y colonizar los espacios inter e

intracelulares de los tejidos de plantas superiores sin causar un daño aparente de los tejidos de la

planta, donde viven estos microorganismos, liberando una gran variedad de metabolitos

secundarios bioactivos, algunos son antibióticos con propiedades antifúngicas, antibacteriales e

insecticidas que pueden inhibir eficazmente el desarrollo de un gran número de microorganismos

,incluyendo fitopatógenos (Li, et al.,2008), como Pestalotia , un hongo fitopatógeno que

aprovecha las heridas causadas por el daño mecánico o por insectos, para invadir los tejidos de

las hojas de palma aceitera, causando marchitez o secamiento foliar por el complejo fungoso

denominado Pestalotiopsis, , constituyendo uno de sus principales problemas fitosanitarios que

reduce drásticamente el área foliar fotosintéticamente activa y afecta en forma significativa la

producción de racimos de fruta fresca. (Motta, 2004).

Se han utilizado diversos controles químicos y biológicos, pero hasta el momento es escasa o

nula la literatura que reporte datos de ensayos in vitro de preselección de hongos endófitos de

Moringa oleífera, con potencial antagónico para el agente causal de la Pestaloptiopsis lo que

representa una oportunidad interesante para reconocer si los hongos que se aislaron en este

trabajo poseen capacidad inhibitoria y por lo tanto podrían considerarse como una opción en el

tratamiento de esta enfermedad que afecta la palma de aceite en Colombia. Por lo tanto, el


21

conocimiento de la capacidad antagónica in vitro de los hongos endófitos asociados a plantas con

efectos medicinales, como Moringa oleífera, presentan un interés particular debido a que se

consideran sintetizadores químicos al interior de la planta, ya que producen gran variedad de

compuestos que han sido utilizados ampliamente en la medicina, la agricultura y la industria

(Sánchez, et al 2013) por sus efectos antibióticos o antimicóticos.

La preselección in vitro de los endófitos y la evaluación de su capacidad antagónica es el primer

paso en investigación, para estudios posteriores de aislamiento de extractos y compuestos

bioactivos de interés. El conocimiento sobre los hongos endofíticos genera gran interés por sus

posibles aplicaciones como biocidas eficientes, de baja toxicidad y alta compatibilidad con el

medio ambiente; además de ser promotores para el desarrollo de productos que estarían

destinados al control de hongos fitopatógenos, (Strobel y Daysi 2003).


22

2 Marco teórico

2.1 Palma aceitera

La palma de aceite (Elaeis guineensis Jacq) es un cultivo de climas cálidos que crece por debajo

de los 500 metros sobre el nivel del mar La expansión del cultivo en Colombia inició en la

década de 1960 y hoy ya cuenta con casi 500.000 ha sembradas, distribuidas en 105 municipios y

16 departamentos, que a su vez conforman las cuatro zonas palmeras del país (Fedepalma, 2014):

Zona Norte: Magdalena, Norte del Cesar, Atlántico, Guajira, Norte de Bolívar,

Córdoba, Urabá antioqueño y Sucre.

Zona Central: Santander, Norte de Santander, Sur del Cesar, Sur de Bolívar.

Zona Oriental: Meta, Cundinamarca, Casanare, Caquetá.

Zona Occidental: Nariño y Cauca.

Este cultivo se destaca por su alta rentabilidad y por su mayor producción de aceite. Debido a su

expansión en área de cultivo sembrado, ha generado un gran impacto ambiental y social debido a

que se han erradicado grandes extensiones de bosques de arbustos y árboles maderables,

afectando el equilibrio biológico del ecosistema y las propiedades del microclima (Henson,

1995). Esta erradicación de bosques también ha traído la aparición de enfermedades que no se

habían visto antes en otras zonas cultivadas, uno los casos más conocidos es la alta incidencia de

pudrición del cogollo en palma sembradas en áreas que una vez fueron bosque tropical húmedo

(Sánchez, 1990). Por otro lado, es el cambio a variedades con alguna susceptibilidad en

particular lo que causa la expresión de la enfermedad, como en el caso del hibrido OxG y la

Pestalotiopsis (Labarca, Sanabria y Arcia 2006).


23

El cultivo de la palma de aceite ha venido creciendo de manera exponencial en el país llegando a

posicionarlo como el cuarto productor de aceite de palma en el mundo (Fedepalma, 2014).

Colombia tiene aproximadamente 500.000 ha en producción, de las cuales 177.000 ha están

localizadas en los llanos orientales y con algunos proyectos de siembra por realizar ya que las

condiciones climáticas son favorables, además hay bastante mercado para el aceite de palma

(Fedepalma, 2014). Con este aumento de área cultivada los problemas sanitarios han aumentado

y se pueden encontrar enfermedades y plagas que hace 15 años no se conocían, enfermedades

letales como la marchitez letal y sorpresiva son las principales que afectan el cultivo ya que hasta

el momento su único control es la erradicación de las palmas enfermas; gracias al cruce de las

palmas Elaeis guineensis y Elaeis oleífera se creó el hibrido OxG el cual es resistente a la

marchitez letal y la pudrición de cogollo (Henson,1995). A pesar de esto hay una enfermedad a

la cual ha sido muy susceptible y aunque no causa la muerte si afecta a la producción, conocida

como Pestalotiopsis; esta es una enfermedad que afecta el follaje de la palma de aceite la cual es

producida por un el hongo Pestalotia palmarum el cual está presente en el ambiente por medio

de esporas (Labarca, et al., 2006).


24

2.2 Insecto facilitador de la Pestaloptiosis

La chinche de encaje, Leptopharsa gibbicarina Froeschner (Hemiptera: Tingidae), se encuentra

en plantaciones de palma de aceite en Colombia en las zonas Central y Norte, este insecto cobra

importancia económica debido a su relación con la enfermedad conocida como Pestalotiopsis,

causa un daño directo al succionar la savia de los foliolos por el envés de éstos, ocasionando la

aparición de puntos cloróticos en el haz, estas heridas que ocasiona en los foliolos facilitan la

entrada y establecimiento de diferentes hongos como Colletrotrichum sp., Curvularia sp.,

Helminthosporium sp., Gloesporium sp., Macrophoma sp., destacándose por su virulencia

Pestalotiopsis palmarum (Cooke) Steyaert y P. glandicola (Castagne) (Labarca et al., 2006;

Escalante et al., 2010).

El complejo Leptopharsa - Pestalotiopsis puede llegar a disminuír la producción de palma hasta

un 36% y sus efectos negativos pueden llegar a afectar la producción hasta por tres (Labarca et

al. 2006). La dinámica poblacional de L. Gibbicarina es afectado por varias especies de

organismos benéficos como son de Predadores, parasitoides y entomopatógenos (Aldana,

Aldana, Calvache y Franco 2010).

L gibbicarina, insecto facilitador de la Pestaloptiosis, llega a medir en su estado adulto de 2,69

mm a 2,91mm, no se puede definir una caracterización morfológica precisa por cuanto esta varía

de acuerdo a la patogenia. La especie está caracterizada principalmente por la presencia en el

pronoto de tres carenas dorsales, de las cuales la central es muy desarrollada y termina adelante

por una estructura globosa en forma de giba con células bien desarrolladas. La duración total del

ciclo es de 69 a 73 días, el cual comprende un periodo de incubación de huevo 16 días, ninfales

de 18 días y 36 días de vida para el adulto (Figura, 1). El ciclo dura 69 a 73 días, el cual

comprende un periodo de incubación de 15 días, 5 instares ninfales de 22 días y 32 días de vida


25

para el adulto macho o 36 días para la hembra, todo su período de vida lo desarrolla sobre el

envés de los foliólos, encontrándose el mayor número preferencialmente en los foliólos de la

parte media y apical de las hojas; ubicados a lo largo del foliolo generalmente en la parte media y

basal de éstos y sobre todo donde se presentan depresiones o pliegues. Son poco móviles y sólo

vuelan al ser molestados o cuando se trasladan a otra hoja u otra planta. (Genty, 2014).

Figura 1.Ciclo de vida de Leptopharsa gibbicarina

Fuente: (Cenipalma, 2014)

En la época de verano principalmente se desarrolla la Pestaloptiosis , las condiciones de luz,

permiten al insecto desarrollarse favorablemente, contaminando poco a poco el follaje de la

planta cuyo inicio generalmente se concentra en la parte media inferior, facilitando la entrada de

los hongos, “En la medida que las hojas de los niveles inferiores van siendo afectadas por el


26

hongo, las poblaciones del chinche se van desplazando hacia los niveles superiores, en donde las

hojas son más apetecibles” (Genty, 2014).

Una vez que el insecto pica la planta, provoca en ella una lesión y posteriormente en un par de

días se observa la aparición de las manchas foliares (Figura, 2), “Inicialmente se observa en el

envés del foliolo y por transparencia, manchas pequeñas de color azul verdoso, rodeadas por un

halo clorótico indefinido, que en fondo opaco presentan un aspecto aceitoso” (Jiménez, 1977).

Sin embargo, con el paso del tiempo las manchas cambian de color, sea por la transformación e

incubación del hongo, volviéndose de un color marrón rojizo, con un halo amarillento que

corresponde a la fase evolutiva del hongo dentro del parénquima.

Figura 2.Lesión típica en el envés de los foliolos, caracterizada por manchas,

semicirculares de color oliva a marrón oscuro, rodeadas por un borde amarillo indefinido de

aspecto aceitoso.

Fuente: Samia Montoya

2.3 Pestalotia palmarum

Pestalotia palmarum, agente principal causante del complejo “Pestaloptiosis”, es un hongo

cuyos síntomas iniciales se caracterizan por la aparición de manchas negras pequeñas y

circulares en el envés de los foliolos de la palma, a medida que la infección del hongo va

avanzando, estas lesiones se agrandan observándose de color blanco con bordes negros bien


27

marcados. En la zona central de las lesiones se observan los cuerpos fructíferos de este hongo.

Puede afectar tejidos que ya han sido afectados por otros patógenos más agresivos (Carmona,

Zapata y Wright, 1990).

Descripción Taxonómica:

Reino: Fungí

Sub-Reino: Dikarya

Filo: Ascomycota

Sub-Filo: Pezizomycotina

Clase: Sordariomycetes

Subclase: Xylariomycetidae

Orden: Xylariales

Familia: Amphisphaeriaceae

Género: Pestalosphaeria (anamorfo Pestalotiopsis).

La taxonomía de Pestalotia palmarum en sí misma resulta complicado describirla, ya que la

misma varía en características dependiendo en muchos casos de la especie con la que tienen

relación filogénica.

2.3.1 Generalidades.

Las especies de Pestalotiopsis no son altamente específicas del hospedador y los taxones pueden

tener la capacidad de infectar un rango de hospedadores (Keith, Velásquez y Zee, 2006). Las

especies de Pestalotiopsis causan una variedad de enfermedades en las plantas, incluidas las

lesiones del cancro, la muerte de los brotes, las manchas foliares, el tizón de la aguja, el tizón de

la punta, el tizón gris, el chancro, la clorosis severa, las pudriciones de la fruta y las manchas


28

foliares (Pirone 1978, Xu, Kusakari, Hosom, Todoya y Ouchi,1999, Tagne y Mathur 2001,

Sousa, Tavares, Geros y Lino,2004). Las especies de Pestalotiopsis son patógenos débiles u

oportunistas y pueden causar poco daño a las plantas ornamentales (Pirone, 1978), sin embargo,

algunas especies de Pestalotiopsis pueden causar graves daños a las plantas cultivadas en

macetas (Tagne y Mathur, 2001). Las especies patógenas de Pestalotiopsis inicialmente hacen

contacto con el huésped donde ocurre la infección (inóculo), probablemente por medio de las

conidias o esporas fragmentadas (Xu, et al.,1999). Estos inóculos pueden sobrevivir durante

condiciones climáticas adversas y pueden causar infecciones primarias. El inóculo secundario

producido en el tejido enfermo puede causar infecciones secundarias y aumentar la gravedad de

la enfermedad. (Keith et al., 2006).

Otras fuentes de contaminación están dadas por los desechos de los cultivos, las plantas en

existencia, los medios de cultivo utilizados, el suelo y las herramientas de viveros contaminados,

las gotas de agua salpicada (McQuilken y Hopkins, 2004, Elliott, Broschat, Uchida y Simone,

2004) y también esporas en el aire (Xu et al., 1999). La fase patógena se puede desencadenar por

una combinación de factores ambientales, susceptibilidad de las plantas y la virulencia del

patógeno. Sin embargo, se necesita más investigación para probar la relación patógena endofítica

en el género. Pestalotiopsis también se considera un patógeno débil (Madar, Solel y Kimchi,

1991), y la mayoría de los patógenos débiles penetran en el huésped a través de aberturas

naturales como estomas, lenticelas e hidatodos (Agrios, 2005).

Especies de Pestalotiopsis solo infectan plantas heridas o estresadas, por lo que las heridas de

poda u otros medios físicos desempeñan un papel importante en el desarrollo de la enfermedad

(Elliott et al., 2004, McQuilken y Hopkins, 2004, Keith et al., 2006, Wright, Rivera y

Flynn,1998). Las plantas también pueden estar estresadas debido a insectos, pesticidas o daños


29

por el sol. La alta temperatura, la alta precipitación y las actividades humanas también pueden

desencadenar infecciones, y esto puede conducir al desarrollo de la enfermedad (Tuset, Hinajeros

y Mira, 1999, Elliott et al., 2004). Las relaciones y ciclos de vida anamorfo-teleomorfas no son

bien conocidas para la mayoría de las especies, ya que la etapa sexual no se desarrolla a menudo

(Wright, 1998). Por lo tanto, los conidios, parecen jugar un papel clave en el suministro de los

inóculos. La fase anamórfica y Teleomórfica del patógeno se muestran en la Figura, 3.

Figura 3.Ciclo de vida de Pestalotia palmarum

(Maharachchikumbura, et al., 2011)


30

2.4 Pestalotiopsis

2.4.1 Controles Químicos.

La Pestaloptiosis ocasiona un daño económico en la palma aceitera causando la destrucción del

follaje, en específico este problema ha cobrado gran importancia considerando el área de cultivos

que están siendo afectadas en diversas plantaciones del país, las medidas de control han

considerado medidas preventivas y medidas curativas, de modo que se evite la propagación.

Entre las medidas de control se pueden verificar:

Nebulización de insecticidas

La aplicación de insecticidas nebulizables con equipos especiales ha resultado eficiente para

pequeños focos en cultivo joven (4 a 8 años). Con este sistema el producto llega con gran

facilidad a las áreas de mayor concentración de las poblaciones, ya que la nube asciende

lentamente y permanece durante un buen tiempo en la masa del follaje. Con el propoxur

nebulizable 5% a razón de 1 l/ha (PC) se han obtenido excelentes resultados haciendo dos

aplicaciones con intervalo de 15 a 20 días y con un rendimiento de 2 hectáreas/hora. Es muy

importante respetar el lapso de tiempo entre la primera y segunda aplicación, para asegurar la

destrucción de las últimas posturas eclosionadas y así poder lograr el corte completo del ciclo.

Una condición inevitable, es que los tratamientos se deben realizar en tiempo fresco, es decir en

las primeras horas de la mañana y de la noche (Genty,2014).

Fumigación aérea

Este tipo de aplicación se considera especialmente útil, para el control simultáneo de poblaciones

del chinche y defoliadores, los cuales en conjunto pueden ocasionar fuertes daños al cultivo. Se


31

usa igualmente cuando por dificultad de personal o falta de otros medios, sea éste el único

recurso disponible. Es importante recordar que los insecticidas, por tóxicos que sean, si están

correctamente empleados pueden evitar grandes perjuicios, no sólo a la palma directamente, sino

también a la fauna auxiliar. Una de las principales razones de lo anterior, es el uso de químicos

sobre áreas reducidas que permiten eliminar una fuerte infestación de plagas, con la seguridad de

que la fauna útil destruida en esta ocasión, será reemplazada muy rápidamente desde las zonas

exteriores. Al contrario, si se deja de tratar un sector pequeño por no dañar la fauna útil, es

posible que después de 2 o 3 generaciones, el problema sea de tal amplitud que habrá necesidad

de tratar con químicos una gran superficie destruyendo toda la fauna útil, sin la esperanza de

recolonizar en parásitos y predadores esta área grande antes de mucho tiempo (Genty, 2014).

Inyección Insecticidas

Este método de control ha resultado muy promisorio considerando su efectividad para la plaga e

inocuidad para la fauna auxiliar. Básicamente esta práctica consiste en efectuar una perforación

en el tallo de los árboles e introducirles insecticidas de acción sistémica, a la altura de 1 m., sobre

el nivel del suelo. Sobre el estipe se practica una perforación con una inclinación de 45 ° y con la

ayuda de una jeringa grande (50 ml.), se inyecta la dosis programada. Para impedir la entrada de

agua y patógenos, al siguiente día de aplicada la dosis total, se taponan las perforaciones con

trozos de madera fina (7 x 1,5 x 1,5 cm.), recubiertos por una pasta fungicida (mancozeb o

maneb). (Genty,2014).


32

2.5 Moringa oleífera Lam

M. oleífera es un árbol adaptado a trópicos y subtrópicos, nativo del Himalaya en India, pero

ampliamente distribuido en otras regiones de India, Asia, África, Sur de florida, Islas del Caribe

y América del Sur. Las características del árbol son: altura entre 10-12 m, tronco leñoso y recto

de diámetro entre 20-40 cm, rápido crecimiento alcanzando en un año 5 m de altura, algunas

variedades son anuales y pueden llegar a vivir 20 años, posee copa abierta tipo paraguas y alta

resistencia a plagas y enfermedades, su cultivo aporta gran cantidad de nutrientes al suelo,

además de protegerlo de factores externos como la erosión y la desecación, puede ser propagado

de manera sexual o asexual y cultivado en suelos pobres con escases de lluvia. (Duke, 1983) El

cultivo de M. oleífera es de rápido crecimiento y fácilmente cultivable en varias regiones secas

del trópico, bajo siembra intensiva puede mantenerse con 500 mil plantas/ha, la altitud máxima

del cultivo es 1.500 m.s.n.m, precipitación anual entre 250 mm y 4.000 mm, tolera varios

periodos de sequía, aunque se reduce la producción de hojas, se mantiene a temperatura ente 15 -

30º C, puede sobrevivir a 0º C por cortos periodos de tiempo con pérdidas de nuevo crecimiento,

requiere de suelos con pH entre 4,5-9, arenosos o con buen drenaje, tolerando suelos arcillosos

(Radovich, 2009).

Cultivo multipropósito del cual se puede derivar gran cantidad de subproductos de gran potencial

económico, generando nuevas perspectivas de progreso para los campesinos de la región Andina

y del Caribe Colombiano, sin generar impactos negativos al ambiente, el árbol presenta

características químicas como presencia de alcaloides, flavonoides, antocianinas,

proantocianinas, cinamatos y alto contenido de aceites, proteínas y azucares, por lo que la

especies es una fuente importante para la aplicación en varios sectores económicos. (Martin,

2013).


33

Los beneficios de esta planta (Figura, 4), van desde su sabor que es agradable y además no tiene

efectos secundarios y, sus hojas poseen proteínas, aminoácidos, vitaminas y minerales, además

de ello sus semillas segregan un aceite que contiene un 73% de ácido oleico, similar al aceite de

oliva que de sus semillas también se han visto características como las de presentar coagulantes

naturales, aclaramiento de aguas, indicador de contaminación. (Alfaro Y Martínez ,2008).

Figura 4.Beneficios, propiedades y aplicaciones de cada una de los tejidos de la planta

Moringa oleífera.

(Castro,2014).

El cultivo de M. oleífera, puede ser aprovechado para saneamiento y descontaminación de aguas

superficiales a partir de la semilla y la producción de carbón activado producto de sus residuos,

se ha comprobado su aplicación con éxito en programas de reforestación, protección y

fertilización de suelos, mejoramiento del ganado y aplicación en la industria farmacéutica, tales

características han superado las de otras especies vegetales usados con los mismos fines, por lo

cual en Colombia se tienen cultivos , pero no se ha explotado según sus propiedades, para la

cual se propone cultivos en la región Andina y Caribe, en donde el objetivo principal es una


34

sensibilización acerca de las propiedades y usos potenciales de la especie. (Alfaro y Martínez

2008).

Los metabolitos secundarios son de gran importancia en muchos campos de la investigación,

estos son derivados de hongos endófitos presentes en los tejidos de plantas medicinales como

M.oleífera, sus metabolitos pueden ser aislados y procesados para beneficio, en área

farmacéutica (Sousa et al., 2004). Los metabolitos secundarios mayormente obtenidos de la

planta medicinal Moringa oleífera son: los flavonoides, flavonoles, antocianinas, polifenoles,

alcaloides y taninos (Echavarria et al., 2016), los cuales son metabolitos de gran importancia en

la agricultura y en la medicina.

2.6 Hongos endófitos

Para iniciar la conceptualización y descripción de los hongos endófitos, resulta conveniente

destacar que los hongo son seres vivos con estructuras filamentosas y características

morfológicas complejas, denominados organismos heterótrofos que obtienen los nutrientes por

absorción de un sustrato determinado (Steinberg, 2007).Son microorganismos eucariotas, que se

reproducen tanto de forma asexual como sexual (Steinberg, 2007). Constituyen un grupo

bastante diverso en cuanto a su morfología, tamaño, hábitat y formas de nutrición. Están

relacionados de forma lejana con las plantas y más estrechamente relacionados con los animales,

pero son diferentes de cualquiera de los dos grupos. En su mayoría desarrollan cuerpos muy

difusos formados por una red de filamentos muy estrechos, tubulares y ramificados llamados

hifas. Estos filamentos o hifas, exudan enzimas y absorben los alimentos y su crecimiento se

realiza apicalmente. Aunque estos filamentos son muy estrechos, son colectivamente muy largos

y pueden explorar y explotar sustratos de alimentos de manera muy eficiente. Usualmente se


35

reproducen por medio de esporas, y posteriormente son liberadas al medio ambiente por diversos

mecanismos, conformando una gran diversidad morfológica de estructuras tanto macroscópicas

como microscópicas .El número de hongos que existe en el planeta no se puede determinar con

exactitud ,pues hay aún muchos subregistros y especies nuevas por estudiar, en una reciente

publicación de Hawksworth y Lücking, (2017 ), se estima que el número de especies podría

estar entre 2.2 y 3.8 millones.

Por otra parte, la palabra endófito, desde la concepción etimológica significa literalmente “dentro

de la planta”, pero específicamente se refiere a microorganismos, sean bacterias u hongos que no

producen daño aparente a la planta hospedera(Wilson, 1995).

Los hongos endófitos fueron descubiertos más o menos en el año de 1898, pero se predice que su

concepto o su palabra como tal “endófito” fue descrita por el señor Bary en (1866),con muy poca

importancia en su tiempo, pero que en años siguientes tomo fuerza en el área investigativa,

dando a conocer su capacidad de colonizar tejidos de plantas, sin ser patógeno para ellas y que

conforman una importante base de investigación farmacológica, dándonos a conocer su gran

importancia como agente antimicrobianos por la producción de metabolitos secundarios,

ayudando a la disminución de infecciones causadas por patógenos adyacentes.

Los microorganismos endófitos son aquellos hongos que permanecen dentro de tejidos vivos de

su hospedero, como agentes de protección, mostrando su aparición en una gran diversidad de

plantas, presentando características adaptativas bióticas y abióticas. (Steinberg, 2007).Los

hongos endófitos son organismos que viven en asociación simbiótica con las plantas en la mayor

parte o en todo su ciclo de vida, se encuentran en los espacios intercelulares y, algunas veces,

intracelularmente en las hojas y los tallos de muchas plantas, sin producir daños aparentes en los

tejidos, en algunos casos, los hongos endófitos confieren beneficios a la planta que pueden


36

resultar mutuos; utilizan los nutrientes que sintetiza la planta y ésta se beneficia de los

metabolitos bioactivos que ellos producen (Salgado y Caridad 2005).

El hongo endófito adquiere forma y función de acuerdo a la planta hospedera, así la relación

entre éstas puede variar, bien desde una patogénesis hasta el mutualismo, no obstante,

independiente una de la otra, en cualquiera de las relaciones ambos organismos producen

metabolitos secundarios potencialmente tóxicos. El hongo endófito produce factores de

virulencia, como exoenzimas y metabolitos fitotóxicos, mientras que la planta produce defensas,

tanto mecánicas como bioquímicas (Schütz y Boyle, 2005).

2.6.1 Metabolitos secundarios.

Los hongos endófitos pueden contribuir a la protección de su planta hospedera contra factores

bióticos (patógenos y herbívoros) y abióticos (estrés salino, térmico, presencia de metales, etc.),

por medio de tres mecanismos: 1) Directos: por medio de enzimas y/o metabolitos secundarios

con actividad anti-patógeno, producidos directamente por el hongo endófito. 2) Indirectos:

consisten en la inducción o incremento de la expresión de mecanismos de defensa químicos o

fisiológicos intrínsecos a su planta hospedera. 3) Ecológicos: se llevan a cabo por ocupación del

nicho ecológico, hiperparasitismo y predación (Gao, 2010). Un ejemplo de mecanismo de

defensa directo contra los patógenos de la hospedera es la producción de compuestos orgánicos

volátiles (VOCs, por sus siglas en inglés) del hongo endófito Muscodor yucatanensis, aislado de

Bursera simaruba (Burseraceae). Los extractos orgánicos derivados del medio de cultivo y del

micelio de M. yucatanensis y, principalmente, la mezcla de VOCs que produce, son letales para

los fitopatógenos Alternaria solani, Rhizoctonia sp., Phytophthora capsici y Phytophthora

parasitica. Algunos de los VOCs identificados son: octano, 2-pentilfurano, cariofileno,

aromadendreno, derivados del naftaleno, entre otros. El segundo mecanismo de protección a las


37

hospederas es evidenciado en la investigación realizada por Waller y colaboradores (2005), en

donde demostraron que la resistencia en la cebada (Hordeum vulgare, Poaceae) al ataque de

microorganismos patógenos es debida a la colonización de las raíces por el endófito

Piriformospora indica.

2.6.2 Mecanismos de Acción. Los mecanismos de acción del antagonismo dual se

traducen en competencia por espacio y alimento, antibiosis, parasitismo y

sinergismo.

Competencia por nutrientes: La inanición es la causa más común de muerte para

microorganismos, la competencia por nutrientes limitantes, resulta en un control

biológico de hongos Fitopatógenos, antagonistas y micoparasitos (Chet et al., 1997). Un

ejemplo claro de este mecanismo de acción se encuentra representado en hongos

filamentosos, donde la toma de hierro es esencial para la viabilidad de los mismos. Bajo

condiciones de deficiencias de hierro, el hongo excreto agentes quelantes específicos de

bajo peso molecular llamados sideroforos, que le permiten tomar el hierro en forma

reducida (Chávez, 2004).

La antibioticiosis: es un mecanismo benéfico indirecto que produce una interacción

negativa, lo cual será expuesto en lo sucesivo. Es una interacción biológica que consiste

en la imposibilidad de vivir unos organismos en las inmediaciones de otros, debido a que

éstos segregan una sustancia, llamada antibiótico, que provoca la muerte de aquellos.

Este tipo de interacción es muy comúnmente estudiada entre insectos y aquellas plantas

hospedadoras de las que se alimentan. Se llama antibiosis al efecto que se produce

https://es.wikipedia.org/wiki/Interacci%C3%B3n_biol%C3%B3gica

https://es.wikipedia.org/wiki/Antibi%C3%B3tico


38

cuando una especie produce una sustancia nociva para otra especie que compite con ella.

(Benítez et al., 2004).

Micoparasitismo: El ataque directo de un hongo a otro es un proceso muy complejo que

involucra eventos secuenciales, incluye reconocimiento, ataque y penetración

subsecuente y muerte al huésped. Trichoderma sp puede ejercer control directo por el

rango de parasitismo de hongo, detectando otros hongos y creciendo sobre él. (Benítez et

al., 2004).

Sinergismo: El sinergismo entre la actividad de enzimas líticas y antibióticos, es la mejor

estrategia para ser un buen controlador, además de abrir el campo para posibles cepas

transformantes que puedan producir las diferentes enzimas logrando un sinergismo que

sea relevante (Benítez, 2004). Es una interacción positiva en la que los miembros

cooperan y comparten nutrientes. Básicamente, remueven productos inhibitorios; se

estimulan mutuamente; incrementan aspectos benéficos de su fisiología; equilibran

microbiológicamente el suelo y crean un medio ambiente favorable para el crecimiento

de la planta. (Chávez, 2004).


39

3 Metodología

Diseño del estudio: experimental y descriptivo

3.1 Población y muestra

El muestreo se realizó en media hectárea de la Finca Manzanares, ubicada en el Municipio de

Piedecuesta, Santander, Latitud: 6.98743, Longitud: -73.0495 6° 59′ 15″ Norte, 73° 2′ 58″ Oeste.

Las muestras fueron tomadas al azar, se escogieron 20 plántulas de las cuales se tomaron hojas y

tallos (Pseudotallos) de tejidos sanos, de tonalidad más verdosa, jóvenes y sin fracturas.

Población N=20 plantas.

La cepa del hongo patógeno (P. palmarum) fue donada por la Plantación de palma aceitera

Indupalma, ubicada en el municipio de San Alberto del Departamento del Cesar.

3.2 Sitio de estudio

El desarrollo de la parte experimental del trabajo de grado se realizó en las instalaciones del

laboratorio de investigación e innovación en Biotecnología agroambiental de la Universidad de

Santander (LIIBAAM) UDES.

3.3 Manejo y tratamiento de las muestras

Los tejidos vegetales de M.oleífera fueron recolectadas de cultivos sanos en la finca Manzares,

Las muestras de plantas fueron recolectadas en bolsas de papel. El aislamiento de los hongos

endófitos se realizó a las 24 h de la recolección de muestras de plantas. Las muestras fueron

cortadas en segmentos de 1cmx 1cm. La esterilización se realizó de acuerdo al protocolo de

Arnold et al. (2007), con mínimas modificaciones.


40

La esterilización superficial se realizó por inmersión consecutiva durante 1 min en alcohol 70%

(v/v), 3 min en hipoclorito de sodio 0,8%, 1 min en alcohol 70% (v/v) y cinco lavados de 1 min

cada uno con agua destilada estéril. La efectividad del proceso de esterilización superficial se

comprobó mediante impresión del tejido sobre medio de cultivo con antibiótico.

3.4 Siembra de los fragmentos del material vegetal

Posterior al tratamiento de lavado y desinfección del material “sano” de M. oleífera, se procedió

con el corte de las hojas de cada lavado por separado en segmentos y después se hizo la siembra

de 4 fragmentos por caja de Petri. Uno alejado del otro ocupando la mayor distancia disponible

entre ellos, y este mismo proceso por triplicado de cada tratamiento en agar PDA suplementado

con Cloranfenicol de 0,05g/L con el fin de evitar el crecimiento bacteriano, sellados con parafilm

e incubados a 27 ± 2C por 5 - 8 día en cámara incubadora.

Se sembraron cuatro fragmentos por caja de Petri, con el fin de asegurar una amplia gama de

posibilidades de crecimiento por segmento sembrado, incrementando de esta forma los

organismos posibles presentes.

3.5 Separación y purificación

De las puntas hifales de los hongos en crecimiento, se recortó micelio (1x1cm2), y

posteriormente se sembraron en agar PDA suplementado con cloranfenicol, transferidos

asépticamente, se incubaron a 25°C por 8 días. Como medida de control de los hongos se

rotularán con la siguiente codificación:


41

Tabla 1.Codificación de hongos endófitos

3.6 Pruebas de antagonismo in vitro por cultivo dual

3.6.1 Preselección de hongos endófitos

Cada uno de los hongos antagonistas fue colocado por triplicado en un extremo de la caja de

Petri, con un disco de 5 mm de PDA suplementado con cloranfenicol 0.005g/l. a 1cm de la pared

de la placa de Petri. Después de un periodo de incubación a temperatura 25°C y con base en la

velocidad de crecimiento de los hongos, en el extremo opuesto de la caja de Petri, se colocó

otro disco de agar de 5 mm con el hongo patógeno a confrontar. El crecimiento de los

organismos en cada uno de los enfrentamientos fúngicos, fue evaluado cada 24 h. Se

consideraron tres repeticiones para cada enfrentamiento y para el tratamiento testigo. La

evaluación final fue considerada a los 9 días, cuando el patógeno cubrió totalmente la caja de

Petri en el tratamiento testigo (sin hongo antagonista). Para medir el efecto inhibitorio, de los

hongos antagónicos hacia el patógeno, se midió el crecimiento de estos últimos. El porcentaje de

inhibición se estimó con base en la diferencia obtenida entre el crecimiento obtenido de patógeno

Planta Moringa oleífera

(M)

Tejido vegetal :

Tallo (T)

Hoja(H)

Fecha: Corresponde a la

fecha de aislamiento

No. De

aislamiento

(1)

Ejemplo 03/10/18

MT1


42

confrontado con la cepa antagónica y el crecimiento de la cepa del respectivo patógeno sin

antagonista.

3.7 Análisis estadísticos

Los halos de inhibición del patógeno obtenidos con los veintidós hongos endófitos fueron

analizados por triplicado y los resultados obtenidos se analizaron teniendo en cuenta la

comparación de las medias utilizando análisis de varianza y pruebas a posteriori de comparación

de medias de Tukey (P ≤ 0.05), con un paquete estadístico SPSS versión 25.

3.8 Identificación de las morfoespecies de hongos endófitos con mayor capacidad

antagónica.

Los hongos más eficientes en el biocontrol de P.palmarum fueron identificados hasta el nivel de

género, con base en las características morfológicas , tanto macroscópicas como microscópicas,

estas últimas basadas en la observación, descripción e identificación de estructuras de

reproducción de los hongos , visualizadas en montajes con coloraciones específicas(azul de

lactofenol, Fushina, ácido láctico más etanol) y utilizando las herramientas de la microscopia

fotónica de luz y contraste de fases, siguiendo el protocolo descrito en la clave taxonómica de

Villegas (2005) y Samuels et al., (1999).

3.9 Evaluación de los mecanismos de antagonismo

A partir de las pruebas de inhibición del crecimiento de P. palmarum por los hongos

endófitos en los ensayos in vitro tanto en cultivo dual como cocultivos, se procedió a escoger

las mejores cepas fúngicas, para la evaluación y observación de la interacción entre las hifas de


43

los antagonistas con aquellas del patógeno por separado.

Los cultivos duales se utilizaron para evaluar dos mecanismos de antagonismo: A) Antibiosis y

B) Micoparasitismo. La antibiosis se estableció al comparar el crecimiento del Fitopatógeno en la

última evaluación antes del contacto hifal con el del testigo para igual período de tiempo.

Para indicar el micoparasitismo como posible mecanismo de acción de se realizaron

observaciones macroscópicas de los cultivos duales, tomándose como índice de micoparasitismo,

la invasión del antagonista sobre la superficie del micelio patógeno .Fue necesario comprobar el

micoparasitismo, por medio de microscopía, utilizando el microscopio de Fluorescencia y DIC

con aumento de 40x, donde se debieron analizar las interacciones de las hifas antagonistas con

las del patógeno, ya sea por enrollamiento o por penetración.

3.10 Prueba cualitativa de Cocultivo de endófitos

Preselección de los aislamientos nativos de los hongos endófitos por su antagonismo a Pestalotia

palmarum. En el centro de cajas Petri, con medio de cultivo PDA, se colocó un disco de 5 mm de

diámetro de medio PDA colonizado por el hongo patógeno y sobre el eje horizontal, a una

distancia de 3 cm del borde, cada uno de los 6 hongos endófitos seleccionados. Las cajas Petri

fueron incubadas a 25 °C. Durante un período de 9 de días, cada tercer día se registró la

inhibición y la esporulación de los hongos.

Patógeno


44

4 Resultados y Discusión

4.1 Aislamiento de hongos

A partir de hojas y tallos de M. oleífera, se lograron aislar e identificar 21 hongos, pertenecientes

a la clase Ascomicetes (Tabla2), obteniendo mayor porcentaje del tallo, 62% y el 38% de hojas

(Fig.5). Mosquera, W (2018) encontró un mayor número de hongos endófitos del área foliar, sin

embargo estos resultados pueden variar dependiendo de varios factores como edad de los

cultivos, tipo de semillas y suelos , se sabe muy poco acerca de la distribución de los hongos

endófitos en los tejidos de un mismo órgano, siendo posible encontrar diferentes especies en

cada uno de los tejidos de una hoja: parénquima, haces vasculares, dermis, etc., demostrando la

capacidad de cada especie de usar ciertos substratos específicos (Rodríguez, 1994).

En este trabajo aislamos 21 endófitos, un número muy similar de endófitos, fue aislado por

Souza et., al (2016) de esta misma especie vegetal, demostrando la biodiversidad endófitica en el

cultivo.

En este trabajo, los principales taxa aislados, en número fueron: Fusarium sp (8 morfoespecies),

Mycelia sterilia, micelios sin fructificaciones, (5 morfoespecies), Curvularia sp (4

morfoespecies), Trichoderma sp (1 morfoespecie), Cladosporium sp (1morfoespecies), Bipolaris

sp (1morfoespecie), Acremonium sp (1 morfoespecie), estos dos últimos, junto con Curvularia se

encuentran comúnmente en el aire como epifitos o en asociación con diversos sustratos (Kiffer &

Morelet, 1997).


45

Tabla 2. Aislamiento de hongos endófitos de Moringa oleífera

Género

fúngico

Codificación

fúngica

Tejido Planta

Curvularia sp MH5 Hoja

Mo

ringa

ole

ífer

a

Mycelia

sterilia

MT16 Tallo

Fusarium sp MT12 Tallo


Mycelia

sterilia

MT15 Tallo

Fusarum sp MT11 Tallo


Fusarium sp MH3 Hoja

Cladosporium

sp

MT8 Tallo


Mycelia

sterilia

MT7 Tallo

Curvularia sp MT3 Tallo

Mycelia

sterilia

MT5 Tallo

Acremonium

sp

MH8 Hoja

Bipolaris sp MT13 Hoja



Trichoderma

sp

MT17 Tallo

Fuasrium sp MT1 Tallo

Mycelia

sterilia

MT14 Hoja

Fusarium sp MT2 Hoja


46

Figura 5. Porcentaje de los aislados de Moringa oleífera por tejido

Algunos hongos endófitos, aislados se consideran patógenos como los géneros de Fusarium sp,

se conoce su distribución cosmopolita, su habilidad fitopatogénica en diversos hospedadores, la

producción de micotoxinas, su oportunismo y también su rol endofítico (Rubini, et al., 2005). Sin

embargo, algunas especies de Fusarium sp también ha sido reportado como un endófito con

amplia actividad biocontroladora. Según investigaciones recientes sobre poblaciones de hongos

endofíticos presentes en tejidos internos de raíces de banano y plátano, se ha determinado que

Trichoderma sp y Fusarium sp son los géneros más abundantes y tienen un alto potencial como

antagonistas de los nemátodos. Se han encontrado reducciones de hasta un 90% en la población

final de Radopholus similis en el sistema radical de plantas de banano protegidas con hongos

endofíticos de los géneros Fusarium sp y Trichoderma sp. (Bacony Yates, 2006). Las Cepas no

patogénicas de F. oxysporum han sido ampliamente documentadas como antagonistas de los

nemátodos fitoparásitos. Se ha observado que ciertos metabolitos producidos por esta especie

38%

62%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

Porcentaje

PO

RC

ENTA

JE

TEJIDO VEGETAL

hoja Tallo


47

provocan la muerte de los nemátodos en diversos cultivos. (Bacon y Yates, 2006, Chet, Inbar y

Jadar, 2006, Howell, 2003, Schulz, y Boyle, 2005).

Esta relación plantas- endófitos sugiere una producción activa de los metabolitos secundarios,

segregados por los dos organismos, el vegetal proporcionara defensas y el hongo fomentara

metabolitos de característica virulenta como los fitotóxicos y además algunas enzimas dañinas

como las exoenzimas. Por esta razón requiere un equilibrio conocida como la relación endofítica,

si no se da una relación equilibrada, el hongo por su capacidad virulenta se mostrará como

agente patógeno. (Schulz y Boyle, 2005).

4.2 Pruebas de antagonismo

Las especies de Pestalotia sp, son considerados un grupo diverso de hongos que afectan a

muchos cultivos diferentes a la palma aceitera, (Satini, et al., 2013, Zhang,

Maharachchikumbura, Tian y Hyde, 2013). Con relación a su biología, no hay claridad, pues aún

no se sabe si son parásitos obligados, o presentan especificidad con relación al huésped, o si son

endófitos que puedan llegar a ser patógenos una vez que el huésped se debilita. Actualmente hay

reportados 601 nombres de especies de Pestalotiopsis (Schulz y Boyle, 2005).

Para la selección de los hongos endófitos de M. oleífera, con mayor capacidad antagónica se

realizó la prueba de cultivo dual enfrentando los veintiún (21) hongos aislados con el hongo

patógeno P.palmarum , en medio de cultivo micológico agar papa dextrosa.

Se tomaron 3 medidas del crecimiento radial de los hongos endófitos a los 3,6, y 9 días,

expresadas en cm. Estas mediciones del crecimiento fúngico, se evaluaron como promedios del

porcentaje de inhibición del patógeno por los endófitos (Tabla 3).


48

Tabla 3.Pruebas de antagonismos de los hongos endófitos frente a Pestalotia palmarum.

Género

fúngico

Codificación

fúngica

Crecimiento del endófito

en cultivo dual en la

relación al patógeno (cm)

Promedio

del

crecimient

o

Promedi

o en

porcentaje

de

inhibición

3

días

6

días

9

días

Curvularia sp MH5 7 7 8 7,33 81,48%

Mycelia

sterilia

MT16 4 4 4,5 4,17 46,30%

Fusarium sp MT12 5,5 6 7 6,17 68,52%

Fusarium sp MT6 4,5 4,5 5 4,67 51,85%

Mycelia

sterilia

MT15 4 4 4 4,00 44,44%

Fusarium sp MT11 5 6,5 6,5 6,00 66,67%

Fusarium sp MT9 3,5 3,5 4 3,67 40,74%

Fusarium sp MH3 3 4 4 3,67 40,74%

Cladosporiu

m sp

MT8 3 3,5 3,5 3,33 37,04%

Fusarium sp MT18 3 3,5 4 3,50 38,89%

Mycelia

sterilia

MT7 3 3 3 3,00 33,33%

Curvularia sp MT3 4,5 4,5 5 4,67 51,85%

Mycelia

sterilia

MT5 3,5 4 4 3,83 42,59%

Acremonium

sp

MH8 3,5 3,5 3,5 3,50 38,89%

Bipolaris sp MT13 3,5 3,5 3,5 3,50 38,89%

Curvularia sp MH1 4 4 4,5 4,17 46,30%

Curvularia sp MH2 4 4,5 5 4,50 50,00%

Trichoderma

sp

MT17 7,5 8 8 7,83 87,04%

Fuasrium sp MT1 3,5 4 4 3,83 42,59%

Mycelia

sterilia

MT14 3 3,5 5 3,83 42,59%

Fusarium sp MT2 4,5 5 5,5 5,00 55,56%

Medi

a

4,48 49,82%


49

De acuerdo a los datos obtenidos en la Tabla 3, se aprecia que el mayor porcentaje de inhibición

del crecimiento de P. palmarum debido al antagonismo de cada uno de los hongos endófitos,

presentarón diferencias en relación al porcentaje de inhibición. Se encontraron ocho hongos, con

los mayores porcentajes de inhibición para el crecimiento del patógeno, estos valores estuvieron

por encima de la media de los 21 endófitos (Figura, 6). El mejor hongo fue el MT17, que

correspondió al genéro Trichoderma sp no solo por su inhibición, de crecimiento del patógeno,

como se observa en la figura 6, sino también por su tasa de crecimiento en cultivo dual frente al

patógeno, demostrando una competencia por el sustrato de crecimiento (ver anexo 4), además

estos datos fueron corroborados estadísticamente por el valor obtenido en la desviación estándar,

lo cual hace, que sea un dato confiable al mantenerse entre las medias. (Figura,7).

b.


50

a.

d.

c.

e.

d.

f.

g.

b.


51

Figura 6.Prueba de cultivo dual a) MT17: Trichoderma sp, b) MH5: Curvularia sp, c)

MT12: Fusarium sp d) MT11: Fusarium sp e) MT2: Fusarium sp f) MT6: Fusarium sp g) MT3:

Curvularia sp, h) Curvularia sp.

4.3 Análisis estadístico

Para evaluar los halos de inhibición y/o el crecimiento de los endófitos en cultivo dual con el

patógeno, se analizaron los resultados, teniendo en cuenta la comparación de las medias

obtenidas en los triplicados (Figura 7), utilizando análisis de varianza y pruebas a posteriori de

comparación de medias de Tukey (P ≤ 0.05), mediante las herramientas que ofrece el programa

de SPSS versión 25.

4.3.1 Análisis de medias del crecimiento de hongos endófitos de M. oleífera en cultivo

dual con P. palmarum.


52

Figura 7. Análisis de medias de crecimiento de los hongos endófitos aislados de Moringa

oleífera en antagonismo con P. palmarum in vitro.

*Los nombres de los géneros fúngicos correspondientes a cada código, que se muestran

en la tabla 2*

Como se observa en la Figura 7, inicialmente para seleccionar las mejores cepas de endófitos en

el biocontrol del fitopatógeno, se consideraron los valores que se ubicaron por encima de la

media promedio, para realizar el análisis de varianza y la prueba de Tukey.

4.3.2 Análisis de varianza ANOVA

Una vez realizado el análisis de media, se procedió a realizar el análisis de varianza como se

muestra a continuación.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

Cre

cim

ien

to i

n v

itro

( c

m )

de

ho

ng

os

end

ófi

tos

de

M.o

leif

era

en c

ult

ivo

du

al

co

n P

esta

loti

a p

alm

aru

m

Hongos endofitos aislados


53

Tabla 4.Análisis de varianza de los hongos que presentaron mayor capacidad antagónica

ANOVA

Grupos Repeticiones Suma Promedio Varianza

MT17 3 23,5 7,833 0,083

MH5 3 22 7,333 0,333

MT12 3 18,5 6,167 0,583

MT11 3 18 6,000 0,750

MT2 3 15 5,000 0,250

MT6 3 14 4,667 0,083

MT3 3 14 4,667 0,083

MH2 3 13,5 4,500 0,250

Los códigos corresponden, MT17: Trichoderma sp, MH5, MT3 Y MH2: Curvularia sp, MT12 y

MT2: Fusarium sp y MT11: Fusarium sp

Al realizar el análisis de varianza por los 8 grupos de hongos que obtuvieron mejor media, se

obtuvieron la respectiva suma de sus cuadrados, los grados de libertad, el valor F, la probabilidad

con el fin de identificar la significancia de los datos, como se muestra a continuación.


54

Tabla 5.Análisis de varianza ANOVA

Origen de

las

variaciones

Suma

de

cuadrados

Grados

de libertad

Promedio

de los

cuadrados

F Probabilidad Valor

crítico

para F

Entre

grupos

34,656 7 4,951 16,389 0,0000034 2,6572

Dentro de

los grupos

4,833 16 0,302

Total 39,490 23

Al obtener el promedio de los cuadrados o cuadrado medio del error entre grupos se observa que

el valor de F es 16,389 y es mayor al valor crítico para F (2,6572); por lo tanto, las medias

difieren significativamente o existe diferencia significativa en el promedio de inhibición en los

hongos.

Por lo tanto, se utilizó ANOVA, para que no se infle el error tipo 1, ya que el análisis se realizó

por grupos y no por parejas. Al tener el nivel de significancia del 0,05 o nivel de confianza del

95%, como la probabilidad es de 0,0000034 y es menor que 0,05, la hipótesis nula se rechaza

“Los hongos endófitos de M. oleífera no tienen la capacidad de inhibir el fitopatógeno Pestalotia

palmarum in vitro”, al menos un grupo el promedio es diferente.

4.3.3 Prueba Tukey

Para revisar los grupos que mostraron diferencias, se aplicó la prueba de Tukey, en primera

medida hallamos el MSe o cuadrado del error medio dividiendo la suma de cuadrados entre los

grados de libertad dentro de los grupos; el Multiplicador Qα lo hallamos a través de la tabla de

valores críticos para la prueba Tukey (ver Anexo 2).


55

Tabla 6.Pruebas a posteriori Tukey

Codificació

n fúngica

MT1

7

MH

5 MT12 MT11 MT2 MT6 MT3 MH2

MT17 0,5000

1,666

7

1,833

3

2,833

3

3,166

7

3,166

7

3,333

3

MH5

1,166

7

1,333

3

2,333

3

2,666

7

2,666

7

2,833

3

MT12

0,166

7

1,166

7

1,500

0

1,500

0

1,666

7

MT11

1,000

0

1,333

3

1,333

3

1,500

0

MT2

0,333

3

0,333

3

0,500

0

MT6

0,000

0

0,166

7

MT3

0,166

7

MH2

Los códigos corresponden, MT17: Trichoderma sp, MH5, MT3 Y MH2: Curvularia sp, MT11,

MT12 y MT2: Fusarium sp.

Los valores que se encuentran por encima del recuadro negro son la diferencia de las medias

entre cada grupo; por lo tanto, los valores que causan diferencia significativa son aquellos que se

encuentran subrayados en amarrillo, es decir MT17 y MH5 no tienen diferencia significativa, lo

mismo pasa con los valores de MH5, MT12 y MT11; los valores de MT12 con MT11, MT2,

MT6 y MT3; los valores de MT11 con MT2, Mt6, MT3 y MH2; los valores de MT2 con: MT6,

MT3 y MH2; los valores de MT3 con MH2.


56

4.4 Identificación de los hongos (género) con mayor capacidad antagónica

Las cepas microbianas, las estructuras y descripción de los hongos con mayor capacidad

antagónica, se resumen en las figuras 8 y 9(Tabla 7).

Figura 8.Cepas de hongos endófitos de M. oleífera que presentan los mayores

porcentajes de inhibición in vitro contra el fitopatógeno P. palmarum : a. Trichoderma sp. b.

Curvularia sp. c. Fusarium sp. d. Fusarium sp e. Fusarium sp. f. Fusarium sp. g. Curvularia sp.

h. Curvularia sp.

c.

d.

e.

f.

g.

h.

a.

b.


57

Figura 9.Estructuras microscópicas de hongos endófitos de M. oleífera que presentan los

mayores porcentajes de inhibición in vitro contra el fitopatógeno P. palmarum : a. Trichoderma

sp. b. Curvularia sp. c. Fusarium sp. d Fusarium sp . e. Fusarium sp. f. Fusarium sp. g.

Curvularia sp. h. Curvularia sp.

Tabla 7.Descripción de los hongos endófitos aislados de M.oleífera con mayor

capacidad antagónica a P. palmarum

Codificación

fúngica

Género

fúngico

Descripción

Macroscópica

Descripción

Microscópica

Taxonomía

MT17

Trichoderma

sp

Colonias que

crecen rápidamente y

esporulan en 3 días a

25ºC en

, Agar papa-

dextrosa y Agar

malta. Las colonias

son algodonosas al

inicio y luego se

compactan y

esporulan tomando

color verde de textura

granular

formando parches

concéntricos

Presenta hifas

hialinas septadas,

conidióforos, fiálides

y conidios. Los

conidióforos

Son ramificados y

pueden

ocasionalmente

disponerse en forma

piramidal.

Las fiálides son en

forma de botella

unidas a los

conidióforos en

ángulo recto. Las

fiálides se

observaron tanto

solitarias como

División:

Ascomycota

Clase:

Sordariomycetes

Orden:Hypocreal

es

Familia:Hypocrea

ceae

a.

c.

b.

f. e.

d.

h. g.


58

dispuestas en grupo.

Las conidias

miden entre 2,8

3,0 µm de diámetro

aproximadamente de

forma redonda u

ovalada

MH5

Curvularia

sp

Colonias: de

crecimiento

rápido, parecidas a

las de la gamuza, de

color negro, grisáceo.

Conidióforos

erectos, de forma

recta, septados,

conidios en sucesión

simpodial. Conidios

de forma semilunar,

redondeados en los

extremos marrón

pálido, De 3-tabiques.

División:

Ascomycota

Clase:Dothideom

ycetes

Orden:Pleosporal

es

Familia:Pleospora

ceae

MT12

Fusarium

sp

Colonias de

crecimiento rápido ,

su micelio es aéreo ,

abundante,

algodonoso y con

coloración variable

de blanco a rosado

durazno.

El micelio está

formado por hifas

septadas y los

conidióforos

presentan racimos de

macroconidias.

División:Ascomy

cota

Clase:Sordariomy

cetes

Orden:Hypocreal

es

Familia:Nectriace

ae

MT11

Fusarium

sp

Colonias de

crecimiento rápido ,


abundante,

algodonoso y con

color blanco.

El micelio está

formado por hifas

septadas y los

conidióforos


microconidias .

División:

Ascomycota

Subdivisión:

Pezizomycotina

Clase:Dothideom

ycetes

Orden:Pleosporal

es

Familia:Pleospora

ceae

MT2

Fusarium

sp

Colonias de

crecimiento rápido,


abundante,

algodonoso y con


de blanco a rosado

durazno.

El micelio está

formado por hifas

septadas y los

conidióforos


macroconidias.

División:Ascomy

cota

Clase:Sordariomy

cetes

Orden:Hypocreal

es

Familia:Nectriace

ae


59

MT6

Fusarium

sp

Colonias de

crecimiento rápido,

su micelio es áereo ,

abundante,

algodonoso y con


de blanco a rosado

durazno.

El micelio está

formado por hifas

septadas y los

conidióforos


macroconidias.

División:

Ascomycota

Clase:

Sordariomycetes

Orden:Hypocreal

es

Familia:Nectriace

ae

MT3

Curvularia sp

Colonias: de

crecimiento



color negro verdoso.

Conidióforos erectos,

de forma recta,

septados, conidios en

sucesión simpodial.

Conidios de forma

semilunar,

redondeados en los

extremos marrón

pálido, De 3-tabiques

División:Ascomy

cota

Clase:Dothideom

ycetes

Orden:Pleosporal

es

Familia:Pleospora

ceae

MH2

Curvularia sp

Colonias: de

crecimiento



color marrón oscuro.

Conidióforos erectos,

de forma recta,

septados, conidios en

sucesión simpodial.

Conidios de forma

semilunar,

redondeados en los

extremos marrón

pálido, De 3-tabiques

División:

Ascomycota

Clase:

Dothideomycetes

Orden:Pleosporal

es

Familia:Pleospora

ceae

Los hongos con mayor capacidad antagónica se identificaron como morfoespecies, hasta género,

con las descripciones macroscópicamente y por los análisis microscópicos de las estructuras

reproductivas de cada hongo, la identificación se realizó con el apoyo de las claves taxonómicas

ya mencionadas. Los endófitos que presentaron actividad antagónica in vitro frente a P.

palmarum fueron: MT17: Trichoderma sp, MH5, MT3 y MH2: Correspondiente a diferentes

morfoespecies de Curvularia sp, MT11, MT12, MT2 Y MT6: Correspondiente a diferentes

especies de Fusarium sp.


60

Mosquera, et al., (2018), realizó el aislamiento de hongos endófitos de M. oleífera de diferentes

tejidos de la planta, aislando diversas especies, las morfoespecies fúngicas similares con este

trabajo fueron: Curvularia sp y Mycelia sterilia, demostrando que existe una biodiversidad de

endófitos en esta especie de planta. Otros trabajos de endófitos con diferente especie de planta,

han mostrado una baja biodiversidad de endófitos (Sánchez et al., 2013)

4.5 Evaluación de los mecanismos de antagonistas.

Los ocho hongos que presentaron mayor actividad antagónica frente al patógeno P. palmarum,

mostraron tamaños de halos de inhibición significativos, expresados en diámetro (cm2) mayores

a 5 cm2 de (Figura 6) y en porcentaje de inhibición de crecimiento del patógeno P. palmarum,

por encima del 50% (Figura, 7), demostrando su tasa de crecimiento rápida y su actividad

antagónica, la cual se resume en la Tabla 8. A excepción de Trichoderma sp que mostró

Micoparasitismo, verificado por el enrollamiento que mostraron sus hifas en el crecimiento

micelial del patógeno P. palmaris en pruebas in vitro, todos los demás endófitos inhibieron al

patógeno por “antibiosis” (Tabla 8).

En relación a Trichoderma sp, se pudo observar como sus hifas crecieron a una tasa que supero

el crecimiento del patógeno, pudiéndose comprobar visualmente (ver anexo 3). Las especies del

género Trichoderma sp son los antagonistas más utilizados para el control de enfermedades de

plantas producidos por hongos Fitopatógenos, debido a su ubicuidad, a su facilidad para ser

aisladas y cultivadas, a su crecimiento rápido en un gran número de sustratos ya que no atacan a

plantas superiores. (Infante, et al., 2009). La actividad antagónica de cada una de las cepas

seleccionadas, también fue confirmada mediante pruebas de enfrentamiento dual en cultivos

modificados en lámina (ver anexo 3).


61

Tabla 8.Mecanismos de acción presentados entre los endófitos y el patógeno.

Codificación

fúngica

Género Mecanismo de acción

sobre Pestalotia palmarum

M17 Trichoderma

sp

Micoparasitismo

MH5 Curvularia sp Antibiosis

MT12 Fusarium sp Antibiosis




MT3 Curvularia sp Antibiosis

MH2 Curvularia sp Antibiosis

4.6 Prueba cualitativa de cocultivo de endófitos

Para esta prueba cualitativa se realizaron 56 tratamientos (Tabla 9), se logró enfrentar en varias

combinaciones los ocho hongos que mostraron mayor actividad antagónica frente al patógeno

P. palmarum. Para estos tratamientos se consideraron combinaciones con dos diferentes

morfoespecies de cada uno de los 8 endófitos seleccionados , los cuales se enfrentaron in vitro

con el fitopatógeno en estudio. , El cocultivo se llevó a cabo en medios micológicos ,logrando

evidenciar que todos los tratamientos realizados alcanzaron la inhibición del patógeno, en mayor

o menor grado, sin embargo, no todos lograron un porcentaje de inhibición mayor en en

relación a la acción de Trichoderma sp o de Curvularia sp. Un resultado evidente para mostrar

en este trabajo consistió en que cuando se evaluaron en Cocultivo morfoespecies del mismo

género por ejemplo Fusarium sp MT2 y Fusarium sp, MT12 frente al patógeno, o Curvularia sp

MH5 y Curvularia sp MH2 frente al patógeno, (Figura 10) se potenció la actividad antagónica

de cada endófito, en comparación de la capacidad de antagonismo que ejerce la cepa del

endófito aisladamente, cuando se enfrenta en cultivo dual con el patógeno, mostrando que el

cocultivo podría favorecer a ciertas especies del mismo género para la inhibición del patógeno,


62

también se observó que en cocultivo, la inhibición de la esporulación del patógeno fue mayor,

demostrando que en conjunto especies del mismo género ejercen acción sinérgica frente de P.

palmarum. (Figura 10). Por el contrario, la cepa endófita de Trichoderma sp, no trabaja en

cocultivo con los demás endófitos, demostrando su capacidad antagónica y su gran potencial

para el control biológico.

En la tabla 10 se muestran los resultados de las 15 combinaciones de endófitos que mostraron la

mayor inhibición del patógeno P. palmarum se muestra, en la columna de la izquierda la

codificación del endófito utilizado en el ensayo y en cada una de las columnas de la derecha los

tratamientos o combinaciones. Cabe resaltar que algunos hongos en la prueba de cultivo dual no

tuvieron el mejor resultado, pero al colocarlo en crecimiento in vitro con otro hongo

preferiblemente de su mismo género los resultados fueron los mejores.

Tabla 9.Tratamientos de hongos endófitos de M. oleífera ,utilizados en prueba de

cocultivo contra P. palmarum.

Tratamientos/Hong

o

MT17

vs

MH5

vs

MT12

vs

MT11

vs

MT2

vs

MT6

vs

MT3

vs

MH2

vs

1 MT1

1

MH2 MT1

7

MT2 MT1

2

MT1

2

MT1

2

MH5

2 MT1

2

MT1

2

MT1

2

MH5 MH5 MH5 MH5 MT1

2

3 MT2 MT2 MT2 MH2 MH2 MH2 MH2 MT2

4 MH5 MT1

7

MH5 MT1

7

MT1

7

MT1

7

MT1

7

MT1

7

5 MH2 MT1

1

MH2 MT1

1

MT1

1

MT1

1

MT1

1

MT1

1

6 MH3 MT6 MT6 MT6 MT6 MT6 MT6 MT6

7 MH4 MT3 MT3 MT3 MT3 MT3 MT3 MT3


63

Tabla 10.Pruebas que potenciaron el antagonismo de P. palmarum en cocultivo

con hongos endófitos

Codificación

fúngica

Tratamientos

1 2 3 4 5 6 7

MT17

MH5 X X

MT12 X X

MT11 X X X

MT2 X X

MT6 X X

MT3 X X

MH2 X X

a.

c.

b.


64

Figura 10.Prueba de cocultivo. Todas las figuras de la derecha muestran el anverso de

los cocultivos y las figuras de la izquierda el reverso. a. MH5 Curvularia sp), y MH2

(Curvularia sp) en cocultivo. b) MT11 (Fusarium sp) y MT17 (Trichoderma sp).

c). MT2(Fusarium sp) y MT12(Fusarium sp). En el centro de las cajas el patógeno.

Por su versatilidad, adaptabilidad y fácil manipulación, los hongos del género Trichoderma sp

han sido estudiados y utilizados como fungicidas biológicos en la agricultura, son de crecimiento

rápido y prolífico productor de esporas (Schuster y Schmoll, 2010) además, son conocidos como

estimuladores de crecimiento en las plantas. Trichoderma sp es resistente y tolerante a diversos

plaguicidas utilizados en la agricultura (Chaparro, Carvajal y Orduz, 2011), y es considerado

como uno de los hongos más importantes en aplicaciones industriales y como bioplaguicida

(Shoresh, Harman y Mastouri 2010).

Los hongos endófitos son comúnmente aislados de diferentes tipos de plantas y utilizados como

antagonistas, sin embargo, es escasa o nula la literatura en la que utilicen hongos endófitos

aislados de Moringa oleífera como antagonistas para P. palmarum. Los resultados obtenidos en

este trabajo son inéditos y por lo tanto pretenden servir como base para la continuación de los

trabajos de control biológico que adelanta el grupo de investigación Microbiota de la UDES.

c.


65

5 Conclusiones

En general, los hongos fitopatógenos foliares son una grave amenaza para la economía y

productividad de cultivos de interés agrícola como la palma aceitera, y también pueden

llegar a afectar la seguridad alimentaria mundial. Para contrarrestar estos patógenos, el

control biológico es una herramienta ecológicamente amigable.

En este trabajo se aislaron ocho hongos endófitos de M. oleífera que mostraron actividad

antagónica in vitro contra Pestalotia palmarum, fitopatógeno foliar de la palma aceitera,

estos correspondieron a Trichoderma sp, 1 aislamientos, Curvularia sp 3 aislamientos y

Fusarium sp, 4 aislamientos, demostrando su potencial para la obtención de compuestos

bioactivos de utilidad en control biológico.

Trichoderma sp, cepa MT17, fue el endófito que mostró mayor actividad antagónica para

P. palmarum por su tasa de crecimiento y micoparasitismo, este aislamiento se reporta

por primera vez en este trabajo como endófito de tallos de M. oleífera con un alto

porcentaje de inhibición en cultivo dual (87%), mostrando el gran potencial que tiene este

hongo en control de la Pestaloptiosis.

Curvularia sp cepa MH5 es otro endófito de importancia que debe ser considerado en el

control de la Pestaloptiosis en este trabajo mostro inhibición del patógeno en un 81%

seguido de Trichoderma sp.

Las pruebas de cocultivos con endófitos de M. oleífera para el control de P. palmarum

permitieron evidenciar mecanismos de Sinergismo entre diferentes especies, sin embargo,

los resultados de antagonismo no fueron mejores que las pruebas antagónicas del

patógeno en los ensayos de antagonismo dual.


66

La preselección in vitro de hongos endófitos con potencial biocontrolador frente a

fitopatógenos de interés en cultivos agrícolas de importancia económica, es el primer

paso para estudios posteriores y aplicaciones biotecnológicas en la obtención e

identificación de metabolitos secundarios activos.


67

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77

7 ANEXOS

7.1 Anexo 1

Figura 1. Estructuras microscópicas y cultivo de P. palmarum. a) Conidias típicas asexuales de

P.palmarum, mostrando cuatro septos, tres células centrales oscuras y una terminal hialina en

cada extremo, con tres apéndices apicales y uno basal más corto. b) Cepa Fúngica de Pestalotia

palmarum en agar papa-dextrosa.

7.2 Anexo 2

Tabla 1. Test de Tukey

HSD= 1,554887009

Multiplicador= 4,9

Mse= 0,302083333

n= 3

a.

b.

b.


78

7.3 Anexo 3

Figura 2. Interacción de hifas de endófitos de M. oleífera con el patógeno, P.palmarum en

prueba dual. a) MT17: Trichoderma sp, invadiendo toda la lámina e inhibiendo el crecimiento

del patógeno b) MH5: Curvularia sp, mostrando halo de inhibición o antibiosis frente al

patógeno, c) MT12: Fusarium sp mostrando halo de inhibición o antibiosis frente al patógeno d)

MT11: Fusarium sp mostrando halo de inhibición o antibiosis frente al patógeno e) MT2:

Fusarium sp mostrando halo de inhibición o antibiosis frente al patógeno f) Curvularia sp

mostrando halo de inhibición frente al patógeno.

a.

b.

d.

c.

d.

e.

f.


79

7.4 Anexo 4

Figura 3. Velocidad de crecimiento de Trichoderma sp y de Pestalotia palmarum (patógeno)

en cultivo dual

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4 5 6 7 8

Cre

cim

iento

ex

´res

ado e

n

dia

met

ro (

cm)

Crecimiento fúngico en días

Trichoderma sp Patogeno

a.

c.

b.

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