Universidad Andina Simoacuten Boliacutevar

Sede Ecuador

Aacuterea de Ambiente y Sustentabilidad

Maestriacutea en Cambio Climaacutetico Sustentabilidad y Desarrollo

Diversidad de hongos endoacutefitos asociados al frailejoacuten (Espeletia

hartwegiana) en un marco de cambio climaacutetico paacuteramo de Romerales

Quindiacuteo Colombia

Cristhian Aristizabal Ortiz

Tutor Jhon Alexander Osorio Romero

Quito 2021

2

3

Claacuteusula de cesioacuten de derecho de publicacioacuten

Yo Cristhian Aristizabal Ortiz autor del trabajo intitulado ldquoDiversidad de hongos

endoacutefitos asociados al frailejoacuten (Espeletia hartwegiana) en un marco de cambio climaacutetico en el

paacuteramo de Romerales Quindiacuteo Colombiardquo mediante el presente documento dejo constancia de

que la obra es de mi exclusiva autoriacutea y produccioacuten que la he elaborado para cumplir con uno de

los requisitos previos para la obtencioacuten del tiacutetulo de Magiacutester en Cambio Climaacutetico

Sustentabilidad y Desarrollo en la Universidad Andina Simoacuten Boliacutevar Sede Ecuador

1 Cedo a la Universidad Andina Simoacuten Boliacutevar Sede Ecuador los derechos exclusivos de

reproduccioacuten comunicacioacuten puacuteblica distribucioacuten y divulgacioacuten durante 36 meses a partir de mi

graduacioacuten pudiendo por lo tanto la Universidad utilizar y usar esta obra por cualquier medio

conocido o por conocer siempre y cuando no se lo haga para obtener beneficio econoacutemico Esta

autorizacioacuten incluye la reproduccioacuten total o parcial en los formatos virtual electroacutenico digital

oacuteptico como usos en red local y en internet

2 Declaro que en caso de presentarse cualquier reclamacioacuten de parte de terceros respecto de los

derechos de autora de la obra antes referida yo asumireacute toda responsabilidad frente a terceros y a

la Universidad

3 En esta fecha entrego a la Secretariacutea General el ejemplar respectivo y sus anexos en formato

impreso y digital o electroacutenico

Firma 23072021

Cristhian Aristizabal Ortiz

4

5

Resumen

Debido al aumento global de las temperaturas impulsado por el cambio climaacutetico de origen

antropogeacutenico y a la poca informacioacuten que se tiene sobre hongos endoacutefitos en especies de los

paacuteramos esta investigacioacuten buscoacute identificar y caracterizar la diversidad de hongos endoacutefitos del

frailejoacuten Espeletia hartwegiana Esta especie habita en los paacuteramos desde 3000 a 5000 metros de

lo que la hace una especie maacutes vulnerable a los aumentos de temperatura que se pronostican para

el antildeo 2100 de hasta 25degC La identificacioacuten y caracterizacioacuten de los hongos endoacutefitos se realizoacute

por medio de teacutecnicas filogenia molecular basado en datos de secuencias de genes muacuteltiples de

las regiones espaciadoras transcritas internas (ITS) en donde se encontraron un total de 15

geacuteneros de endoacutefitos como Nigrospora Trichoderma y Diaporthe con un total de 35 especies

Los hongos endoacutefitos encontrados podriacutean tener un rol vital en la supervivencia de esta especie

de frailejoacuten mediando la forma en coacutemo responde al estreacutes abioacutetico producido por el cambio

climaacutetico como aumento de la temperatura cambio en las precipitaciones y sequiacuteas ademaacutes del

estreacutes bioacutetico como virus bateriacuteas insectos y hongos fitopatoacutegenos

Palabras clave Cambio Climaacutetico Filogenia Molecular Hongos Endoacutefitos Paacuteramos

6

7

Con amor para mis padres Fernando Ivaacuten Aristizabal y mi madre Mariacutea Ligia

Ortiz

A Norberto Aristizabal y Natalia Aristizabal por creer en miacute

A mi hijo Joseacute David Aristizabal por representar las nuevas generaciones

A mi tutor Jhon Alexander Osorio por tenerme paciencia en este proceso de

aprendizaje y compartirme sus conocimientos

A Tatiana Tapias por darme su amor y llevarme por el camino de la virtud

siempre centrado

A la maestriacutea en Cambio Climaacutetico Sustentabilidad y Desarrollo por siempre

estar disponibles para miacute

A la Universidad Andina Simoacuten Boliacutevar por apoyar mi tesis de investigacioacuten

A la Repuacuteblica del Ecuador por abrirme sus puertas y darme un mejor futuro

8

9

Agradecimientos

Estos agradecimientos van dedicados para Ecuador que me brindoacute la oportunidad

poder estudiar una maestriacutea a mi tutor por aceptarme y acompantildearme en este proceso a

mi familia por creer en miacute y en los sacrificios que hice para irme a vivir a otro paiacutes solo y

sin dinero para poder umlsalir adelanteuml como decimos en Colombia a mi compantildeera

sentimental por siempre guiarme hacia el camino correcto disciplina compromiso y

entrega a la universidad Andina Simoacuten Boliacutevar por aceptarme en sus aulas de clase y

por ultimo a la Universidad del Quindiacuteo por abrirle la puerta a uno de sus egresados y

acogerlo de buena forma con sus instalaciones de laboratorio

Gracias y mil gracias a todos de corazoacuten sin duda esta experiencia cambio mi

vida en todos los sentidos

Desde hoy hasta el final que podriacutea llamarse infinito

10

11

Tabla de contenidos

Figuras mapas y tablashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13

Introduccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 15

Capiacutetulo primero Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

1 Antecedenteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

2 Justificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 25

3 Hipoacutetesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 26

4 Objetivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

41 Objetivo generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

42 Objetivos especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

Capiacutetulo segundo Materiales Meacutetodos y Resultadoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

1 Aacuterea de Estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

2 Colecta de material bioloacutegicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos

endoacutefitos)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32

5 Extraccioacuten de ADNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

7 Secuenciamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

8 Anaacutelisis Filogeneacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

Capiacutetulo Tercero Discusioacuten sobre los hongos endoacutefitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidadhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio

Climaacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42

Conclusioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 57

Obras citadashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 59

Anexoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 73

12

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphellip 73

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia 73

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphelliphellip74

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana 75

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un

estereoscopio 75

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 76

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas y

enviadas 76

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 75

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a Alemania a la Universidad Ruhr de

Bochum 77

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de

parsimoniahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 78

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X 78

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa

JmoldelTest 79

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE

(AIC) 81

13

Figuras mapas y tablas

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo

Colombiahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras

N necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefitohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y

abioacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en

medio de cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelialhelliphelliphellip 30

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la

teacutecnica de corte de hifa uacutenica helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de

cultivo Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12)

aislados de las hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana 31-32

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 10 Filograma obtenido a partir del anaacutelisis ML y MP del conjunto de datos ITS Aislados

de las hojas de frailejoacuten37

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip43

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e

Hypocreahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip46

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon48

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon

Biscogniauxia Nemania y Humiacutecolahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

14

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies

Massarina Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona

muestreadahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia 29-30

Tabla 2 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos

endoacutefitos en la especie Espeletia hartwegiana

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36

Tabla 3 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = presencia del genero

de hongo dentro de la especie de frailejoacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42-43

15

Introduccioacuten

Hay un libro abierto siempre para

todos los ojos la naturaleza

(Jean-Jacques Rousseau 1712-1778)

El cambio climaacutetico corresponde a un fenoacutemeno que afecta el planeta de manera natural

permitiendo mantener las condiciones climaacuteticas como la temperatura la precipitacioacuten entre

otras en un rango aceptable para la vida (Jimeacutenez 2010) Sin embargo dado el aumento de las

emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) principalmente asociado a las actividades

humanas y el alto consumo de combustibles foacutesiles los cambios en dichas condiciones han sido

alterados dando paso a un acelerado aumento de temperatura anual en las uacuteltimas deacutecadas con

precipitaciones y sequias maacutes frecuentes e intensas (IPCC 2020 5 Jimeacutenez 2010)

Acorde con el Panel Intergubernamental de Expertos en Cambio Climaacutetico (IPCC) para

fin de siglo el Cambio Climaacutetico se acrecentaraacute pronosticando un aumento de temperatura de 25

a 45 degC para el antildeo 2100 que tan solo para Colombia en los uacuteltimos 30 antildeos fue de 08degC

generando impactos notorios en las zonas de alta montantildea como los paacuteramos (Moreno y Palma

2016)

El cambio climaacutetico es un fenoacutemeno cuyos efectos alcanzaraacuten los paacuteramos los cuales son

ecosistemas de alta montantildea presente en elevaciones entre 3100 y 4700 m ubicados en el norte de

los Andes de Ameacuterica del Sur y el sur de Ameacuterica Central adyacente (Berdugo et al 2016) Estas

aacutereas se caracterizan por una vegetacioacuten principalmente endeacutemica compuesta por frailejones

matorrales y pastos (veacutease figura 1) (Garciacutea et al 2010)

Los ecosistemas de alta montantildea como los paacuteramos ofrecen diversos servicios

ambientales como la biodiversidad uacutenica que albergan los paisajes los suelos y su capacidad de

retener y almacenar agua (Morales et al 2019) Las formaciones vegetales juegan un papel

diferenciado en el mantenimiento de la humedad y las fuentes de agua en el ecosistema

presentando la capacidad de interceptar almacenar y regular los flujos hiacutedricos superficiales y

16

subterraacuteneos aportando los servicios de abastecimiento de agua para el 70 de la poblacioacuten de

Colombia (Vaacutesquez y Buitrago 2017)

Ademaacutes dada la caracteriacutestica de permanente humedad de su suelo la materia orgaacutenica

se descompone a menor velocidad logrando un efecto de retencioacuten y almacenamiento de carbono

(Anderson et al 2012) En Colombia se han realizado diferentes estudios sobre la distribucioacuten y

extensioacuten del ecosistema paramuno Rangel (2002 4) determinoacute que los paacuteramos colombianos

abarcaban aproximadamente el 26 de la superficie del paiacutes

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramos por Pedraza-Pentildealosa Betancur y Franco-Rosselli (2005)

En particular el paacuteramo Romerales se encuentra dentro del territorio adscrito a los

Parques Nacionales Naturales (PNN) especiacuteficamente el PNN de los Nevados en la cordillera

central colombiana hacia la zona norte del Departamento del Quindiacuteo con liacutemites fronterizos

entre los departamentos de Risaralda y Tolima Este paacuteramo es el hogar del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana el cual estaacute afrontando los efectos del cambio climaacutetico (veacutease mapa 1)

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona muestreada

17

Existe evidencia cientiacutefica concreta del aumento de temperatura en los Andes Tropicales

tambieacuten cambios significativos en los patrones de precipitacioacuten sumado a la disminucioacuten en la

incidencia del clima nublado lo que conduce a las plantas a mayor cantidad de horas expuestas a

la radiacioacuten solar (Ruiz et al 2009) Otro efecto grave que trae consigo el cambio climaacutetico es el

desplazamiento de especies en el gradiente altitudinal Con un aumento de 3degC se espera que las

especies se muevan ~600 m en buacutesqueda de su optimo teacutermico esto afectariacutea gravemente las

especies de paacuteramo como los frailejones Cuesta Camacho (2007)

Los frailejones son emblemaacuteticas plantas de paacuteramo y ecosistemas de alta montantildea

(MINAMBIENTE 2019) Pertenecen a la familia Asteraceae contiene cerca de 142 especies

agrupadas en ocho geacuteneros Carramboa Coespeletia Espeletia Espeletiopsis Libanothamnus

Paramiflos Ruilopezia y Tamania de estos los maacutes importantes y con mayor diversidad de

especies son Espeletia Espeletiopsis y Libanothamnus (Rivera y Torres 2001)

Poseen adaptaciones que les permite captar y retener grandes cantidades de agua de su

entorno permitiendo un balance ecosistemico (Farias 2013) La morfologiacutea singular del genero

Espeletia le permite acumular las hojas antiguas en forma de ldquoabrigordquo brindando proteccioacuten

contra las bajas temperaturas nocturnas de hasta 0degC Los fuertes vientos y la radiacioacuten solar los

cuales seraacuten cada vez maacutes intensos y frecuentes por causa del cambio climaacutetico (Cortes y

Sarmiento 2013 34) (veacutease figura 2)

Estas plantas son especies claves para la conservacioacuten de los paacuteramos y la lucha contra el

cambio climaacutetico debido a que ofrecen una gran variedad de servicios ecosisteacutemicos (Diacuteaz et al

2007) El paacuteramo es referente sin igual de fuente hiacutedrica ciudades como Bogotaacute y Quito obtienen

aproximadamente el 80 de su agua dulce de los paacuteramos (Buytaert et al 2006) Los frailejones

en su mayoriacutea endeacutemicos se han visto afectados por actividades humanas como la ganaderiacutea

extensiva agricultura (cultivos de papa y cebolla) mineriacutea de oro y carboacuten turismo no

controlado y quemas intencionales (Hofstede 2000) Esta situacioacuten podriacutea comprometer a

mediano y largo plazo la funcioacuten de captacioacuten regulacioacuten y suministro del agua para el consumo

18

en las ciudades colombianas ubicadas en las regiones de influencia de estos ecosistemas (Varela

2015)

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

No obstante en asociacioacuten con especies como el frailejoacuten de los Andes Tropicales

encontramos a los hongos cuyos roles en las interacciones bioloacutegicas son de vital importancia

Los hongos pueden ser endoacutefitos simbiontes mutualistas paraacutesitos y comensales y son capaces

de responder a las amenazas que plantea el cambio climaacutetico en cuanto a perturbaciones

ambientales aumento de temperatura y estreacutes hiacutedrico adaptaacutendose a la disponibilidad de recursos

modificando sus actividades enzimaacuteticas e incluso su genoma a lo largo del tiempo (Moreno et

al 2013)

Los hongos son clasificados seguacuten su forma de reproduccioacuten sea sexual o asexual en

donde se observan las diferencias estructurales internas entre los diferentes grupos tales como

sus esporas e hifas como lo indican Blackwell y Spatafora (2004) estos organismos estaacuten

divididos en cuatro grandes grupos los cuales son Ascomycota Basidiomycota

Chytridiomycota Zygomycota es justo en el grupo de los Ascomycota donde se encuentra gran

diversidad de hongos conocidos como ldquohongos endoacutefitosrdquo en donde su nombre ldquoendoacutefitordquo

significa ldquodentro de la plantardquo (endon dentro phyton planta)

19

Estos microorganismos fuacutengicos tienen la facilidad de pasar gran parte o todo su ciclo de

vida invadiendo los tejidos de su hospedero (planta) sin tener un efecto negativo evidente

(Leacuteveilleacute 1846 3 de Bary 1866 8) Por lo tanto el concepto de endoacutefito indica una asociacioacuten de

costo-beneficio pero de una forma mutualista entre el hongo y la planta hospedera permitiendo

la estadiacutea en sus tejidos vivos (Clay 1998 8) Los hongos endoacutefitos se han encontrado en todas

las plantas (algas musgos pastos plantas y vasculares) desde los bosques templados hasta los

bosques tropicales hallaacutendose una gran diversidad de plantas y en asociacioacuten gran diversidad de

hongos endoacutefitos (Saacutenchez et al 2010)

Se espera que los hongos endoacutefitos jueguen un papel cada vez maacutes importante potenciado

por el cambio climaacutetico en las enfermedades producidas en plantas como pudricioacuten radicular

mal blanco entre otras con los aumentos pronosticados de la temperatura y el estreacutes por sequiacutea

asociados al cambio climaacutetico (Desprez-Loustau et al 2006 Slippers y Wingfield 2007 6) Los

cambios en la cantidad de dioacutexido de carbono (CO2) y la disponibilidad de nitroacutegeno en el suelo

afectan de forma similar tanto a las plantas como a los hongos por ende las alteraciones

generadas por parte del cambio climaacutetico pueden causar desbalances en sus relaciones (Ies et al

2013)

Algunos estudios realizados en el antildeo 1898 donde se registraron los primeros hongos

endoacutefitos como el de Bary (1866) brindo la iniciativa de investigaciones que lograron explicar

los cuadros toxicoloacutegicos observados en animales los cuales se daban por el consumo de

semillas o en aacutereas de pastos (Poaceae) que posiblemente albergaban hongos Clavicipitaacuteceos

(familia del ergot) los cuales poseiacutean actividades enzimaacuteticas con micotoxinas

Por diversas situaciones no trascendioacute la investigacioacuten hasta que Bacon (1977) hizo

relacioacuten del hongo endoacutefito Neotyphodium coenophialum debido a una intoxicacioacuten del ganado

llamado ldquosiacutendrome de veranordquo cuando estos animales consumiacutean pastos de la especie Festuca

arundinacea (Poaceae) Funk en el antildeo 80 caracterizoacute la resistencia de las Poaceae que

albergaban hongos endoacutefitos que frecuentemente eran atacados por insectos (proteccioacuten contra

herbiacutevoros) (Saacutenchez et al 2010)

Compant y colaboradores (2010) mencionaron que tras experimentar en el laboratorio

con una gama de temperaturas en los hongos endoacutefitos aislados obtuvieron resultados variables

respecto al crecimiento es decir positivos y neutrales llegando a la conclusioacuten de que los

microorganismos asociados a las plantas son un factor importante que influye en la respuesta de

20

las plantas acorde a los cambios de temperatura lo que compromete las respuestas del frailejoacuten y

los hongos endoacutefitos frente al calentamiento global causado por el cambio climaacutetico

Con relacioacuten a los estudios realizados sobre hongos endoacutefitos en frailejones se han

encontrado al menos 100 especies con capacidades de inhibir hongos fitopatoacutegenos o herbivoriacutea

(Cabezas et al 2012)

Los geacuteneros de hongos endoacutefitos encontrados en anteriores estudios son Acremonium

Aspergillus Aureobasidium Colletotrichum Fusarium Gliocadium Nigrospora Paecilomyces

Penicillium Trichothecium Trichoderma y Sordaria (Pineda 2000 Programa Nacional para la

Evaluacioacuten del Estado y Afectacioacuten de los Frailejones en los Paacuteramos de Andes del Norte 2009)

Teniendo en cuenta que para Colombia hay poca informacioacuten sobre hongos endoacutefitos en

ecosistemas paramunos se hace fundamental la ampliacioacuten de maacutes informacioacuten referente al tema

debido a que solo existen estudios significativos en cafeacute leguminosas y rosas los cuales maacutes allaacute

de la identificacioacuten de geacuteneros de hongos endoacutefitos no incluyen el cambio climaacutetico y sus

posibles consecuencias (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016) En

teacuterminos filogeneacuteticos los hongos son el reino de la naturaleza maacutes cercano a los animales

(Hibbett et al 2018)

Las relaciones que posean las diferentes especies de endoacutefitos dentro de la especie de

frailejoacuten es de importancia conocerla mediante el uso de la filogenia molecular (Judd et al 2007)

mediante secuencias de ADN ARN o proteiacutenas (Cooke et al 2000) Dependiendo de la presencia

de especies agresivas de endoacutefitos como Nigrospora se puede tener un mejor conocimiento

sobre las consecuencias que trae consigo los impactos del cambio climaacutetico sobre estas plantas de

los Andes Tropicales (Foden et al 2009)

21

Capiacutetulo primero

Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitos

1 Antecedentes

Desde los estudios realizados por Leacuteveilleacute (1846) y Bary (1866) sobre hongos Endoacutefitos

en pastos de zonas templadas se ha logrado identificar que estos hongos son capaces de inducir

respuestas adaptativas a sus hospederos (Micotoxinas contra herbiacutevora adaptacioacuten a heladas o

climas extremos fijacioacuten de nutrientes) a cambio de alimento y hospedaje formando una relacioacuten

mutualista en la cual las dos especies involucradas son beneficiadas No obstante se ha reportado

que los hongos endoacutefitos ademaacutes de tener relaciones mutualistas con diferentes especies

vegetales se pueden tornar en especies patoacutegenas para su hospedero una vez la planta se

encuentra en condiciones desventajosas tornaacutendose asiacute el hongo endoacutefito en un hongo

fitopatoacutegeno (Herrera y Ulloa 1990 550)

Como se mencionoacute anteriormente los hongos endoacutefitos pueden pasar de un estado

mutualista a un estado de patogeacutenesis dada esta relacioacuten entre ambos organismos se producen

metabolitos secundarios potencialmente toacutexicos facilitando factores de virulencia dados por el

hongo endoacutefito como exoenzimas y metabolitos fitotoacutexicos a su vez la planta presenta defensas

tanto mecaacutenicas como bioquiacutemicas (Saacutenchez et al 2013 5)

Hasta la fecha los principales estudios de hongos endoacutefitos se han fijado en especies de

intereacutes econoacutemico y comercial tales como palma de aceite cafeacute leguminosas pastos de forrajeoacute

y diferentes tipos de rosas (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016)

Las especies modelo para el estudio de los hongos endoacutefitos han sido las gramiacuteneas

forrajeras en donde se han reportado especies de endoacutefitos asociados a los geacuteneros Lolium

Festuca y Brachiaria (Siegel et al 1987) no obstante Otero y Bayman (2009) han reportado un

creciente nuacutemero de estudios en orquiacutedeas epifitas tropicales relaciones con hongos micorrizicos

22

Actualmente existen escasos reportes de hongos endoacutefitos asociados a ecosistemas con

climas extremos (temperaturas extremas) como aacuterticos desiertos paacuteramos y zonas alpinas

especialmente para zonas de temperaturas friacuteas como lo son los paacuteramos (Lopera et al 2008

Leung et al 2011 Cabezas et al 2012 Miles et al 2012 Zhang y Yao 2015)

Investigadores como Lopera Leung y colaboradores (2011) han llegado a la conclusioacuten

de que los hongos endoacutefitos juegan un papel importante en las plantas a la hora de adaptarse a

ecosistemas de clima templado (Kivlin et al 2013 Zhang y Yao 2015)

En Colombia los trabajos con hongos endoacutefitos son pocos por ende trabajos como el de

Lopera y colaboradores (2008) con especies del genero Espeletia de los paacuteramos Colombianos

son pioneros ademaacutes del trabajo de Cabezas y colaboradores (2012 4) en el cual aislaron y

caracterizaron celulasas (enzimas descomponedores de la celulosa) extraiacutedas de hongos endoacutefitos

que se hallaban en especies de Espeletia posteriormente Lopera y Miles (2012) unieron

esfuerzos para continuar caracterizando la diversidad de hongos endoacutefitos en los paacuteramos andinos

colombianos enfocados en Espeletia con el objetivo de encontrar especies con potencial

biocontrolador

Existen trabajos tesis en los repositorios de diversas universidades de los antildeos 2014 y

2015 en los cuales se aborda el tema de los hongos endoacutefitos paacuteramos y especies de Espeletia

(frailejones) y de la familia Poaceae en donde se caracterizan las diversas especies de hongos

endoacutefitos por medio taxonomiacutea y biologiacutea molecular ademaacutes de buscar metabolitos secundarios

con fines medicinales o de biocontrol

Los trabajos en filogenia molecular de hongos endoacutefitos realizados en frailejones se han

visto enfocados maacutes hacia la buacutesqueda de la diversidad funcional en comunidades

microbioloacutegicas como por ejemplo el estudio realizado por Ruiz y colaboradores (2015) en

donde buscaron mediante el anaacutelisis molecular de raiacuteces necromasa hojas maduras y joacutevenes de

diferentes especies de Espeletia (veacutease figura 3) ubicada en los Andes neotroacutepicales

colombianos secuencias geneacuteticas de las regiones V5-V6 de la unidad 16S del rARN

23

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras N

necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefito Tomado de Ruiz y colaboradores (2015)

Este estudio analizoacute la composicioacuten de comunidades microbioanas y su diversidad

funcional en un ecosistema de alta montantildea en donde las temperaturas los rayos UV y la altura

juegan papeles determinantes como filtros ecoloacutegicos severos en donde solo pueden existir

especies que han desarrollado capacidades para adaptarse sobrevivir y colonizar dichas aacutereas

por ende cuando se analizaron las comunidades existentes dentro de estas especies de Espeletia

Encontraron que algunas especies halladas podriacutean tener roles importantes como

productores de metabolitos secundarios enzimas o incluso como bioremediadores y que las

comunidades microbianas eran diferentes tanto en sus hojas como en sus raiacuteces y en la

necromasa

A medida que las deacutecadas avanzan y la evidencia sobre el cambio climaacutetico se hace maacutes

robusta y evidente los estudios en los hongos endoacutefitos han tomado vital importancia al estar

asociados con cultivos de especies comestibles escases de agua y de tierras productivas sumado

a los efectos negativos que trae consigo el cambio climaacutetico para las diferentes plantaciones y

cosechas a nivel global

Es por eso que Lu Yan y colaboradores (2019) analizaron los efectos positivos que teniacutean

la colonizacioacuten de hongos endoacutefitos en las plantas en donde ratificaron que los hongos endoacutefitos

dentro la planta generan metabolitos antimicrobianos estimulan las respuestas inmunoloacutegicas y

compiten por espacio dentro de la planta con diferentes patoacutegenos incrementando asiacute la

resistencia contra herbiacutevoros y la resistencia al estreacutes salino (factores bioacuteticos)

Ademaacutes de ayudar a la planta contra el estreacutes abioacutetico causado principalmente por

factores climaacuteticos como la falta de agua (estreacutes hiacutedrico) las temperaturas extremas la

intensidad de los rayos UV y los metales pesados como la muestra la figura 4 debido a esto se

24

concluyoacute que las fitohormonas cumplen un papel importante en la colonizacioacuten de hongos

endoacutefitos dentro de la planta

Aun que se ha reportado que los hongos endoacutefitos se pueden usar como biocontroladores

diferentes estudios reportan que el uso de hongos endoacutefitos puede tener efectos adversos como

un retraso significativo en el crecimiento de la planta con el uso de la especie Cryptosporiopsis

sp (Terhonen et al 2016) Otro reporte indica la fecundidad y supervivencia de enemigos

naturales como paraacutesitos esto es debido a que los hongos endoacutefitos transfieren sus toxinas y

alcaloides cuando son ingeridos por paraacutesitos u otros enemigos naturales de las plantas (Lopez y

Sword 2015)

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y abioacutetico

Bajo estreacutes bioacutetico (herbiacutevoros y patoacutegenos) y abioacutetico (sequiacutea salinidad metales pesados y otros) (a) se

inducen respuestas de defensa de las plantas (b) los endoacutefitos producen metabolitos protectores y

modulan la viacutea de las fitohormonas para mejorar la inmunidad de las plantas (c) tomada de Lu yan y

colaboradores (2019 7)

25

2 Justificacioacuten

La presente investigacioacuten pretende identificar y caracterizar que especies de hongos

endoacutefitos estaacuten asociadas al frailejoacuten Espeletia hartwegiana y que posibles implicaciones podriacutea

tener que estas especies se encuentren dentro de esta especie de alta montantildea La importancia de

conocer esta informacioacuten reside en que los hongos endoacutefitos pueden beneficiar o perjudicar a la

adaptacioacuten y resistencia de especies vegetales en los distintos escenarios climaacuteticos propuestos

por la ciencia (IPCC 2020)

El calentamiento global podriacutea afectar el equilibrio de los hongos endoacutefitos en especies

vegetales generando desbalances en la planta o la peacuterdida de especies endoacutefitas de importancia

biotecnoloacutegica Por ejemplo se podriacutean perder especies endoacutefitas con potencial para control

bioloacutegico de plagas y enfermedades de plantas como productores de enzimas y metabolitos

secundarios degradacioacuten de plaacutesticos o biorremediacioacuten entre otros (Schulz et al 2002) Por

ello se hace fundamental estudiar los hongos endoacutefitos en ecosistemas de paacuteramo ya que en

Colombia y en los paacuteramos en general han sido poco estudiados y su efecto sobre las plantas de

alta montantildea podriacutea ser clave en el mantenimiento de sus poblaciones

26

3 Hipoacutetesis

H1 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute diferente en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo diferentes los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten tambieacuten seria

modificada

H0 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute similar en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo similares los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten continuariacutean

como se ha registrado con anterioridad

27

4 Objetivos

41 Objetivo general

Caracterizar la diversidad de hongos endoacutefitos presentes en los frailejones

de la especie Espeletia hartwegiana en el paacuteramo de Romerales tomando en cuenta su

relacioacuten con el cambio climaacutetico

42 Objetivos especiacuteficos

Identificar los hongos endoacutefitos asociados en Espeletia hartwegiana del

paacuteramo de Romerales

Hallar relaciones filogeneacuteticas entre las diferentes especies de hongos

Endoacutefitos encontradas en Espeletia hartwegiana

Advertir las repercusiones del cambio climaacutetico sobre Espeletia

hartwegiana en base a su diversidad de hongos endoacutefitos

28

29

Capiacutetulo segundo

Materiales Meacutetodos y Resultados

1 Aacuterea de Estudio

El trabajo se realizoacute en el paacuteramo de Romerales ubicado en la zona alta del municipio de

Salento Quindiacuteo (4deg39202N 75deg25506W) con una extensioacuten aproximada de 6794 ha (Cano

et al 2015)

2 Colecta de material bioloacutegico

La colecta del material bioloacutegico se realizoacute mediante muestreos aleatorios lo largo del

paacuteramo tomando coordenadas de cada punto de colecta (veacutease anexo 3) las hojas se colectaron

por medio de tijeras podadoras siendo empacadas cada una en bolsas Ziploc diferentes se

colectoacute un total de 15 hojas cada una correspondiente a una planta de frailejoacuten para un total de

15 plantas muestreadas de E hartwegiana

Adicionalmente las bolsas Ziploc fueron marcadas con los datos de colecta en campo y

transportadas a los laboratorios del Programa de Biologiacutea de la Universidad del Quindiacuteo para su

procesamiento

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetales

Las muestras obtenidas fueron lavadas con agua para eliminar el exceso de residuos se

cortaron 4 trozos de cada hoja con un tamantildeo aproximado de 05 a 10 cm (veacutease figura 5) luego

cada trozo de hoja se sometioacute a una esterilizacioacuten la cual se completoacute con algunas modificaciones

acorde al procedimiento descrito por (Osorio et al 2017) especiacutefico para el aislamiento de

30

hongos endoacutefitos que consiste en sumergir perioacutedicamente el material vegetal en etanol al 90

durante un minuto seguido de hipoclorito de sodio (NaClO) al 4 por un minuto continuando

con etanol al 70 durante un minuto y por uacuteltimo se lavaraacuten con agua destilada todo dentro de la

campana de flujo

Las cuatro secciones de hoja se transfirieron a una caja de Petri para un total de 15 cajas

de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA) (una caja de Petri por cada 4 cortes de hoja)

Posteriormente las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente (25degC aproximadamente)

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en medio de

cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelial caja de Petri de 20ml de capacidad

Pasadas 3 semanas se revisaron los cultivos fuacutengicos con el fin de revisar el crecimiento

del micelio y hacer un repique a un cultivo puro una vez maduros se procedioacute a utilizar la teacutecnica

de corte de hifa uacutenica (Osorio et al 2017) esta teacutecnica consistioacute en tomar la punta de la hifa con

ayuda de un estereoscopio y un bisturiacute de grado quiruacutergico agua destilada alcohol al 70 y un

mechero para mantener el bisturiacute esterilizado una vez identificada la hifa ideal para cultivar de

forma pura (veacutease figura 6) con el bisturiacute se procedioacute a cortar el agar PDA en forma de cuadro

con una medida aproximada de 3 miliacutemetros cuadrados

31

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la teacutecnica de

corte de hifa uacutenica

Se esperoacute entre 3 a 5 semanas a que crecieran los cultivos puros aislados de las hifas uacutenicas en

nuevas cajas de Petri con agar PDA

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos endoacutefitos)

Los hongos cultivados de forma pura consiguieron un crecimiento micelial significativo a partir

de los 15 diacuteas a temperatura ambiente como lo demuestra la figura 7 que contiene doce de los

cultivos maacutes representativos con su respectivos micelios aeacutereos desarrollados donde variacutean sus

colores formas y consistencias esto indicando que pertenecen a diferentes especies

2

1

3

32

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de cultivo

Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12) aislados de las

hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

5 Extraccioacuten de ADN

4

5

6

7

8

9

10

11

12

33

Una vez el micelio de los hongos se encontraba desarrollado en la cantidad necesaria se

procedioacute a extraer el ADN genoacutemico siguiendo el protocolo de extraccioacuten de Raeder y Broda

(1985) por medio de un barrido superficial del micelio evitando tomar el agar este micelio

posteriormente se colocoacute en tubos Eppendorf esteacuteriles de 2 ml y se pulverizoacute mediante el uso de

un asa microbioloacutegica y 1ml de buffer de extraccioacuten compuesto de Tris-HCL 1 M pH 78 EDTA

05 M Ph 8 SDS 10 wv NaCL y agua destilada para cada tubo a continuacioacuten se agregoacute 800

ul de etanol al 70 500 ul de fenol y se mezcloacute

Se adicionoacute 300 ul de cloroformo y se mezcloacute de nuevo de alliacute se llevoacute a la centrifuga a

10000 rpm por 60 minutos luego de centrifugar se forma un sobrenadante el cual es transferido

en su totalidad a un nuevo tuvo Eppendorf de 15 ml en el cual se agregaron 400 ul de cloroformo

y se llevoacute a la centrifuga a 10000 rpm por 10 minutos en donde nuevamente se forma un

sobrenadante aunque esta vez solo se toman 500 ul del tubo para ser transferidos otro tubo

Eppendorf de 15 ml ya en el nuevo tubo se adicionaron 50 ul de NaAC y se invirtioacute varias veces

para homogenizar la mezcla a continuacioacuten se guardoacute en el refrigerador a 4degC toda la noche

Al diacutea siguiente se tomaron las muestras en los tubos Eppendorf y se centrifugaron a

10000 rpm por 30 minutos (Formacioacuten del Pellet de ADN) cuando la centrifuga terminoacute se

procedioacute a remover el etanol ya sin etanol se agregoacute de nuevo 1 ml de etanol al 70 a cada tubo

y se centrifugoacute a 10000 rpm por 5 minutos en este paso se removioacute el etanol y se dejoacute secar el

pellet de ADN una vez el etanol se evaporoacute se re suspendioacute el pellet en 100 ul de agua grado

molecular o Sabax con 5 ul de RNAsa con el fin de evitar la presencia de moleacuteculas de ARN

posteriormente se incubaron a 37degC por 30 minutos y se guardaron para su envioacute a -20degC

(Raeder y Broda 1985)

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengica

Una vez se secuenciaron las muestras de ADN enviadas a la Universidad Ruhr de

Bochum Alemania se hizo el ensamblaje de las secuencias en contigs y scaffolds en el

programa CLC Main Workbench 8 (Nicola et al 2013) Como lo muestra la figura 8 donde se

muestran los pasos esenciales de una teacutecnica de Metagenoacutemica donde posteriormente se

analizaron con maacutes detalle mediante teacutecnicas filogeneacuteticas

34

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemico Fuente Thomas y colaboradores (2012)

7 Secuenciamiento

Se extrajoacute con eacutexito un total de 35 muestras de hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

Espeletia hartwegiana (veacutease figura 9) que posteriormente fueron secuenciadas por la

Universidad Ruhr de Bochum (Alemania) logrando un total de 70 secuencias incluyendo

aquellas obtenidas en Genk Bank

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de frailejoacuten

Espeletia hartwegiana

35

8 Anaacutelisis Filogeneacutetico

Se aislaron 35 secuencias basadas en la especie Espeletia hartwegiana fueron

comparadas posteriormente con 35 secuencias de especies publicados en GenBank

(httpblastncbinihgovblastcgi) se obtuvo un total de 70 secuencias Las secuencias de

consenso ITS 58S DNA obtenidas se usaron para realizar buacutesquedas BLAST en GenBank

usando BLASTn (Altschul et al 1990) con el fin de identificar mediante las secuencias aisladas

los geacuteneros o las especies maacutes cercanas La matriz de datos fue alineada en MAFFT v7 (Katoh y

Standley 2013) Se utilizaron las especies Coprinellus xanthothrix y Coprinellus domesticus

como grupos externos

Los anaacutelisis de las secuencias para construir los arboles filogeneacuteticos de Maacutexima

Parsimonia (MP) fueron realizados usando PAUP v40b10 (Swofford 2003) Para el anaacutelisis de

Maacutexima Verosimilitud o ML por sus siglas en ingleacutes (Maximum Likelihood) se utilizoacute

JmodelTest (Darriba et al 2012) con el cual se infirieron los criterios del modelo de sustitucioacuten

apropiado utilizando los criterios de informacioacuten de Akaike (AIC) (Akaike 1974)

Los anaacutelisis de ML se realizaron con el programa PhyML v 30 (Guindon y Gascuel

2003) teniendo en cuenta la proporcioacuten de sitios invariables Los valores de soporte de confianza

para los nodos se estimaron mediante 1000 anaacutelisis de arranque de replicacioacuten La alineacioacuten de

los datos de la secuencias de ITS para 70 aislamientos determinoacute quince geacuteneros siendo los

siguientes Annulohypoxylon Biscogniauxia Colletotrichum Crassiparies Cryptocoryneum

Cyphellophora Diaporthe Daldinia Humiacutecola Hypoxylon Hypocrea Nemania Nigrospora

Massarina y Trichoderma de los cuales se obtuvieron 11 clados principales (veacutease figura 10)

Con base en estos resultados todos los aislamientos se analizaron maacutes a fondo dentro de los

geacuteneros hasta llegar a especie (veacutease tabla 1)

36

Geacuteneros Especie Especie Especie Especie Especie Especie Especie

Annulohypoxylon A nitens A bahnphaden

gense

Biscogniauxia B petrensis

Colletotrichum C gloeosporioides

C gigasporum

Cyphellophora C

reptans

Crassiparies C quadrisporus

Cryptocoryneum C

longicondensatum

Daldinia D dennisii D

eschscholtzi

D

conceacutentri

ca

Diaporthe D

longicolla

D

foeniculina

D

anacardi

i

D

macada

miae

Humiacutecola H

fuscoatra

Hypoxylon H

trugodes

H

pulicicidum

Hypocrea H

koningii

Massarina M albocarnis

Nemania N

primolutea

Nigrospora N sacchari N rubi N sphaeric

a

N hainanen

sis

N oryzae

N gorlenko

ana

N aurantia

ca

Trichoderma T trixiae T

olivascens

T

paraviridescens

T

viridescens

T

samuelsii

T viride

Grupo Externo Coprinellus C

domesticus

C

xanthothrix

Tabla 1 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos endoacutefitos en la

especie Espeletia hartwegiana

37

38

Figura 10 Filograma consenso obtenido con el programa MEGA ndashX a partir del anaacutelisis ML y MP del

conjunto de datos ITS Aislados de las hojas de frailejoacuten Los coacutedigos en Verde son las secuencias que se

aislaron (aislados) en este estudio los coacutedigos y nombres en Negro son las secuencias encontradas por

identidad en GenBank Los valores de soporte de bootstrapgt 70 se indican cerca de los nodos como MP

ML = valores de soporte de bootstrap lt70

El nuacutemero de caracteres los modelos de sustitucioacuten usada asiacute como otros resultados

estadiacutesticos de las pruebas de Maacutexima Parsimonia y Maacutexima Verosimilitud generados a partir de

los anaacutelisis filogeneacuteticos de los conjuntos de datos se muestran en los anexos

39

Capiacutetulo Tercero

Discusioacuten sobre los hongos endofitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicas

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidad de Endoacutefitos

Tanto la temperatura la estacionalidad y los tipos de precipitacioacuten son factores de vital

importancia para la composicioacuten de las diferentes comunidades y la arquitectura vegetal Estos

factores limitan muchos de los procesos ecosisteacutemicos ya que existe una estrecha relacioacuten entre

las variaciones climaacuteticas y las variaciones dentro de los ecosistemas Por lo tanto se espera que

el cambio climaacutetico transforme los ecosistemas Andinos tal como los conocemos hoy (Colwell et

al 2008) modificando las relaciones mutualistas entre plantas y hospederos

Posiblemente la resiliencia y resistencia de muchos ecosistemas como el paacuteramo sean

superadas en este siglo por una combinacioacuten sin precedentes de disturbios tales como el cambio

climaacutetico perturbaciones asociadas a este (sequiacuteas fuegos invasioacuten de especies exoacuteticas

inundaciones) y otros factores como organismos oportunistas (hongos endoacutefitos) cambios en el

uso del suelo contaminacioacuten y sobreexplotacioacuten de recursos (IPCC 2020)

Considerando que el frailejoacuten Espeletia hartwegiana es una especie de alta montantildea

(paacuteramos) endeacutemica de la cordillera Central de los Andes (Schultz y Carl 1856) se encuentra

dentro de los ecosistemas andinos en donde a su vez se ha comprobado la existencia de los

hongos endoacutefitos es de tener en cuenta el papel de estos organismos endoacutefitos ya que los

paacuteramos son ecosistemas particularmente sensibles a los efectos adversos del cambio climaacutetico

en especial al calentamiento global al estar ubicados en los troacutepicos generando asiacute ventanas de

40

oportunidades para que los hongos endoacutefitos alteren su estado mutualista y pasen a ser

patogeacutenicos (Colwell et al 2008 7)

No obstante existe consenso en que las temperaturas aumentaraacuten especiacuteficamente a

grandes alturas y que la precipitacioacuten posiblemente se incrementaraacute en algunas zonas disminuiraacute

en otras y se produciraacute en patrones estacionales alterados con mayor intensidad y frecuencia

(Marengo et al 2009)

Los frailejones se ven en constante estreacutes por el uso del suelo dado en los paacuteramos como

es el caso del paacuteramo Romerales un paacuteramo que se ha visto afectado por las quemas y la

ganaderiacutea (Molinillo y Monasterio 2001) Esto aumenta asiacute las condiciones de estreacutes intriacutensecas a

las que estaacuten expuestas estas plantas de paacuteramo las cuales suministran valiosos bienes y servicios

ecosisteacutemicos como el abastecimiento continuo de agua para usos domeacutesticos agriacutecolas e

industriales (Buytaert et al 2006 4) servicios que se podriacutean ver en decrecimiento si las

ventanas de oportunidades se abren con maacutes frecuencia dando pie al cambio de estado de los

hongos endoacutefitos que existen dentro de los frailejones de la zona

En los paacuteramos de Chingaza Rabanal Guerrero Iguaque Merchaacuten y Sumapaz se han

realizado estudios de aislamientos de hongos en especies de frailejoacuten diferentes a la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana tales como Espeletia argentea Espeletia arbelaezii Espeletia

boyacensis Espeletia grandiflora Espeletia miradorensis y Espeletia uribei por ende se ha

reportado la presencia de hongos endoacutefitos y fitopatoacutegenos (Tabla 2) (Gaitan 2018 17)

Frailejones Espeletia

argentea

Espeletia

arbelaezii

Espeletia

boyacensis

Espeletia

grandiflora

Espeletia

miradorensis

Espeletia

uribei

Aspergillus X X X X

Annulohypoxylon X X X

Curvularia X X X

Epicoccum X X X

Fusarium X X X

41

Tabla 2 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = a presencia del genero de

hongo dentro de la especie de frailejoacuten

Los geacuteneros de hongos en rojo son los geacuteneros que se encontraron en comuacuten con los

geacuteneros hallados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana de un total de 15 geacuteneros 3

han sido reportados anteriormente en estudios similares ( 20 de geacuteneros identificados)

Dentro de un marco de cambio climaacutetico es importante la metodologiacutea de muestreo

como lo fue el formato de muestreo en puntos aleatorios realizado en el presente estudio se llevoacute

acabo principalmente por la homogeneidad de los frailejones en el paacuteramo como lo indica el

manual de meacutetodos baacutesicos de muestreo y anaacutelisis de ecologiacutea vegetal (BOLFOR 2000 9) donde

se menciona que el muestreo aleatorio se utiliza cuando se dispone de poca informacioacuten previa de

las caracteriacutesticas de las poblaciones a medirse en este caso la poblacioacuten a identificarse fueron

los hongos endoacutefitos que se hallaban dentro de las formaciones homogeacuteneas de los frailejones

No obstante el muestreo aleatorio tambieacuten presenta limitaciones a la hora de comparar los

hongos endoacutefitos a lo largo del gradiente altitudinal (muestreo aleatorio estratificado) dejando de

percibir informacioacuten proveniente de los distintos microclimas que se encuentran y de las

incidencias que podriacutean causar a la hora de identificar los geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten ademaacutes de posibles micro efectos del cambio climaacutetico a lo

largo del gradiente altitudinal (Caacutemara et al 2008)

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio Climaacutetico

Nigrospora X X X X X

Penicillium X X X

Pleospora X X X X

Trichoderma X X X X

42

Las teacutecnicas empleadas en este estudio para lograr aislar e identificar los hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana se hacen importantes dentro del cambio

climaacutetico debido a que el margen de error en la identificacioacuten molecular es reducido (Bakermans

et al 2014) Al ser reducido el margen de error se pudo conocer con mayor certeza que especies

y geacuteneros de hongos endoacutefitos se encuentra dentro de la planta

Al conocer sus identidades es posible conocer las capacidades que tienen cada una de

estas especies de hongos endoacutefitos de producir metabolitos secundarios de infiltrarse y proteger

los tejidos de la planta de condiciones bioacuteticas y abioacuteticas competir contra herbiacutevoros y

fitopatoacutegenos (Schulz et al 2002) Con sus capacidades reconocidas es posible vincular los

efectos del cambio climaacutetico como estreacutes hiacutedrico aumento de la temperatura migraciones

tempranas enfermedades emergentes aumentos de la precipitacioacuten y heladas severas con las

reacciones por parte de los hongos endoacutefitos Estas reacciones podriacutean desencadenar aumentos de

la patogenicidad en las poblaciones de frailejones debido a los constantes disturbios y estreacutes al

que se ve sometido la planta generando asiacute notables declives poblacionales (Mendoza 2010)

Las relaciones filogeneacuteticas entre las especies halladas toman relevancia debido a las

sinergias positivas o negativas que se pueden presentar dependiendo de las especies que se

encuentren asociadas dentro de la planta (Lamichhane y Venturi 2015) como por ejemplo

Nigrospora y Colletotrichum pueden activar una sinergia negativa aumentando la virulencia y

afectando la especie Espeletia hartwegiana

Las especies de hongos endoacutefitos se identificaron por medio de secuencias obtenidas de

las regiones ITS (regioacuten de espaciadores internos transcritos) las cuales son regiones altamente

conservadas con tasas de evolucioacuten muy lentas en el tiempo permitiendo hacer inferencias

filogeneacuteticas (Baldwin et al 1995 Hamby y Zimmer 1992) es por ello que se usaron para

generar las diferentes identificaciones de los hongos endoacutefitos logrando asiacute identificar al geacutenero

Nigrospora con un total de 7 especies N sacchari N rubi N sphaerica N hainanensis N

gorlenkoana N oryzae y N aurantiaca pertenecientes a la familia Apiosporaceae orden

Xylariales Divisioacuten Ascomicota (veacutease figura 11) (Wang et al 2017)

Dentro del marco del cambio climaacutetico Nigrospora se caracteriza por poseer una

distribucioacuten cosmopolita y una amplia gama de hueacutespedes como lo es en este caso la especie E

hartwegiana que habita en los Andes Tropicales que se veraacuten alterados por los efectos del

cambio climaacutetico este geacutenero se ha logrado aislar en su forma endoacutefita en tallos y hojas de

43

diversas plantas tambieacuten como saprofitos en detritos hojarasca y larvas muertas (Uzor et al

2015 1)

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

Los hongos endoacutefitos hallados en esta investigacioacuten se encontraron dentro de la especie

de frailejoacuten E hartwegiana la cual pertenece a los Andes Tropicales ubicados maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos Estos ecosistemas son sensibles a los efectos del cambio

climaacutetico por su altura su alto endemismo y su sensibilidad al efecto de borde Cuando las

especies lentildeosas empiecen a migrar a lo largo del gradiente altitudinal es posible que los

frailejones se encuentren con suelos agrestes en donde sus semillas no podraacuten fijarse y los efectos

adversos de hongos como Nigrospora N oryzae y N sphaerica seraacuten maacutes notables

aprovechando las ventanas de oportunidad que generen los desbalances climaacuteticos (Sharma et al

2013)

Los cambios en los patrones climaacuteticos potenciaran la especie N sphaerica dentro del

frailejoacuten la cual tiene la capacidad de causar tizoacuten foliar en la especie Camellia sinensis siendo

una planta de teacute perteneciente a la divisioacuten de las magnolifiotas como el geacutenero Espeletia (Liu et

al 2015) Nigrospora fue el geacutenero maacutes ampliamente aislado en las identificaciones generadas a

partir de las hojas de frailejoacuten esto se veriacutea explicado debido a que N sphaerica tiene un

mecanismo de descarga de esporas efectivo que puede proyectar a la fuerza sus esporas a una

distancia de hasta 2 cm en vertical y 68 cm en horizontal como lo demostroacute Webster (1952)

ademaacutes el estudio de Wu y colaboradores (2004) tambieacuten evidencioacute que las esporas de

44

Nigrospora son uno de los grupos maacutes dominantes en la atmoacutesfera y estaacuten asociadas con

tormentas de polvo

La gran capacidad colonizadora del geacutenero Nigrospora le permite adaptarse a las

condiciones climaacuteticas cambiantes con la estrategia de dispersioacuten de sus esporas logrando

distanciarse del frailejoacuten hospedero para encontrar nuevos hospederos producto de las

migraciones tempranas a lo largo del gradiente altitudinal (Riveros 2010)

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

por encima del 80 lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen menos

mutaciones en los nodos internos del aacuterbol basados en la distribucioacuten de probabilidad asignadas

a los posibles arboles resultantes dando lugar a una hipoacutetesis evolutiva maacutes confiable (Schmidt y

Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 es decir el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes

corto (menos cambios) y el cual se ajusta mejor a los datos (Swofford 1997)

Teniendo asiacute una inferencia filogeneacuteticamente robusta los geacuteneros Collectotrichum y

Nigrospora pertenecen a la Divisioacuten Ascomycota ambos geacuteneros son particularmente agresivos

con las plantas en especial la especie Colletotrichum gloeosporioides la cual es la fase asexual

de Glomerella cingulata (Raj et al 2013) Se caracteriza por tener un amplio rango de

hospederos entre ellos el frailejoacuten a los cuales les causa una enfermedad conocida pudricioacuten

amarga antracnosis o chancros siendo esta la necrosis de frutos flores nervios y tallos

(Gonzaacutelez et al 2006 4)

Uno de los primeros reportes de afectaciones a especies de frailejoacuten se obtuvo en el 2009

en el Parque Natural Nacional Chingaza Colombia en donde encontraron las especies de

frailejoacuten Espeletia grandiflora y Espeletia uribei afectadas debido a insectos y una especie de

hongo del genero Colletotrichum (Medina 2009- 9 Hartung y Burton 1981)

Por ende que estos dos geacuteneros de hongos se encuentren juntos podriacutea tener

implicaciones en el aumento de virulencia potenciado a su vez por los desbalances abioacuteticos

causados por el cambio climaacutetico como lo han mencionado Belisario y colaboradores (2002) es

posible que las afectaciones no sean producidas por un uacutenico hongo si no por un complejo de

varios generando sinergismos entre diferentes especies que solas no hariacutean dantildeo a la planta pero

juntas podriacutean ser causantes de enfermedad (Lamichhane y Venturi 2015 4) aun mas en un

45

marco de cambio climaacutetico que gradualmente aumenta sus efectos nocivos sobre los paacuteramos

aumentando la temperatura cambios en la precipitacioacuten heladas intensas cambios en la

nubosidad mayor exposicioacuten a la radiacioacuten solar teniendo por resultado un iacutendice de estreacutes

mayor en las plantas de paacuteramo generando ventanas de oportunidades para que los hongos

endoacutefitos modifiquen sus roles de protector a patoacutegeno

En frailejones tambieacuten se ha reportado la presencia de Nigrospora y Trichoderma por

Bonilla y Argenis (2005) maacutes especiacuteficamente en la especie Espeletia grandiflora la cual es una

especie que habita en los paacuteramos de Colombia Ecuador y Venezuela en conjunto con Espeletia

hartwegiana (Luteyn 1999 3) El hecho que existan estos dos geacuteneros presentes en los frailejones

advierte de un equilibrio entre hongos endoacutefitos que se puede romper bajo las tensiones del

cambiante clima maacutes aun en los sensibles paacuteramos alto andinos

En cuanto a N sacchari se tiene reporte que es un productor de metabolitos con una

notable actividad herbicida demostrado en plantas cultivadas en invernadero (Fukushima et al

1998 2) debido a que existe evidencia que sugiere que los hongos endoacutefitos han evolucionado

directamente de hongos patoacutegenos (Schulz et al 1999 4) sumado al estreacutes del cambio climaacutetico

en cualquier momento de extrema tensioacuten hiacutedrica caloacuterica o heladas en estos ecosistemas de alta

montantildea Estos anomaliacuteas ambientales podriacutea disparar mecanismos de accioacuten fitopatoacutegenos

dentro de los frailejones generando un declive notable en sus poblaciones y por ende un declive

de la cantidad recurso hiacutedrico aguas abajo y su regulacioacuten (Diacuteaz et al 2002 5)

Como se mencionoacute anteriormente los medios de propagacioacuten de estos hongos endoacutefitos

pueden ser por medio de esporas que estaacuten en el ambiente aunque tambieacuten los vectores que

juegan un rol clave en su dispersioacuten son los insectos ya que estos pueden transportar esporas o

partes del hongo en su cuerpo patas o aparato bucal (Eigenbrode et al 2018 5)

Considerando la dispersioacuten homogeacutenea de los frailejones dentro del paacuteramo la carga

esporas en el ambiente y la herbivoriacutea de insectos es probable que se puedan ver infectados la

mayoriacutea de individuos (Varela 2016) es por ello que en el futuro puede que las afectaciones en

frailejones no sean producidas por hongos fitopatoacutegenos si no por hongos endoacutefitos que tuvieron

la ventana de oportunidad gracias al cambio climaacutetico aumento de la temperatura aumento en

las concentraciones de CO2 y alteraciones de precipitacioacuten que pueden hacer susceptible la planta

al ataque de estos hongos (Chakraborty 2011 Elad y Pertot 2014)

46

Para que se genere la enfermedad esta depende de la interaccioacuten de tres o cuatro factores

1) hospedero susceptible 2) agente causal (virulento) 3) condiciones ambientales favorables y 4)

tiempo (Francl 2001 2) la falta de alguno de ellos no permite que el patoacutegeno produzca la

enfermedad en la planta debido a ello algunas especies de frailejoacuten pueden tener una o dos cepas

que puedan actuar como fitopatoacutegenos pero no estaacuten activas si no estaacute completa su asociacioacuten

con otro patoacutegeno u otro factor

Ademaacutes existe un estudio que evaluoacute el efecto de la temperatura sobre la capacidad de

Fusarium verticillioides para generar infeccioacuten en plantas de maiacutez se probaron bajo 3 escenarios

de temperatura como resultados obtuvieron que la enfermedad de este hongo se veiacutea potenciada

por el aumento de temperatura en temperaturas por encima de 35degC (Murillo et al 2008) este

estudio da soporte a la hipoacutetesis de que existen factores que influyen significativamente a la

infeccioacuten en la planta tal vez el paacuteramo difiacutecilmente alcance 35degC no obstante la mayoriacutea de

especies son sensibles a cambios de temperatura de hasta de 1degC en donde modifican su

comportamiento rutas metaboacutelicas interacciones ecoloacutegicas y por ende sus defensas se ven

alteradas

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e Hypocrea

El geacutenero Trichoderma con seis especies diferentes (veacutease figura 12) fue el segundo

geacutenero maacutes numeroso despueacutes de Nigrospora que contoacute con siete especies aunque las primeras

especies que se analizaron fueron especies que principalmente actuaban generando enfermedades

en las plantas en las que se encontraban ante disturbios el geacutenero Trichoderma pertenece a la

47

familia Hypocreaceae y se caracteriza por tener una gran capacidad biocontroladora sobre

fitopatoacutegenos como Fusarium oxysporum los cuales podriacutean llegar masivamente con las

migraciones tempranas de insectos y plantas lentildeosas (Miles et al 2012 7)

No solo actuacutean repeliendo patoacutegenos internos si no tambieacuten patoacutegenos externos como

insectos que desean consumir u aprovechar la planta ya que estos pueden secretar diferentes

metabolitos secundarios y enzimas que actuacutean inhibiendo su desarrollo (Boughalleb-M et al

2018 8)

Es bien conocido que el geacutenero Trichoderma produce amplio rango de sustancias

antibioacuteticas ademaacutes de poseer la caracteriacutestica de parasitar otros hongos (Howell 2002 6)

Debido a la competencia que generan las especies del genero Trichoderma por espacio y

nutrientes inhiben o degradan pectinasas y otras enzimas que son esenciales para que los hongos

fitopatoacutegenos como Botrytis cinerea penetre en la superficie de las hojas logrando proteger de

esta forma al frailejoacuten que se veraacute expuesto a nuevas amenazas microbioloacutegicas auspiciadas por

los cambios en los patrones climaacutetico (Zimand et al 1996)

Ademaacutes de la capacidad del Trichoderma sp para atacar o inhibir el crecimiento de

patoacutegenos de plantas directamente descubrimientos recientes indican que tambieacuten pueden inducir

resistencia sisteacutemica y localizada a una variedad de patoacutegenos de plantas tales como el frijol es

protegido por Trichoderma harzianum de especies fitopatoacutegenas como Colletotrichum

lindemuthianum Botrytis cineacuterea las cuales producen lesiones en las hojas de la planta (Harman

y Howell 2004) Incluso se descubrioacute que ciertas especies de Trichoderma tienen una influencia

sustancial en el buen crecimiento y desarrollo de las plantas sin y con condiciones de estreacutes

climaacutetico (Lorito 1998)

Como lo demostraron Bonilla y Argenis (2005) en su estudio llevado a cabo en el

frailejoacuten Espeletia grandiflora diferentes cepas pertenecientes a Trichoderma pueden proteger

esta especie de paacuteramo de organismos fitopatoacutegenos emergentes por el cambio climaacutetico por

ende si puede proteger a E grandiflora tambieacuten puede proteger la especie E hartwegiana lo

que le permitiraacute sobrellevar diferentes ataques fortuitos de patoacutegenos e insectos que nunca han

logrado alcanzar las altitudes de paacuteramo (3200 - 5000 m)

Cuando el cambio climaacutetico aumente la temperatura en 1degC o 2degC traeraacute consigo sus

efectos de modificacioacuten en cuanto a la estructura y composicioacuten de las especies de plantas que

48

existen en zonas altas para este escenario basado en los caacutelculos de Thuiller (2007) las especies

se habriacutean desplazado en el gradiente altitudinal aproximadamente 450 metros para el antildeo 2070

Las consecuencias de este desplazamiento serian uacutenicas debido a que gran cantidad de

insectos y patoacutegenos tendriacutean migraciones tempranas en el gradiente altitudinal en buacutesqueda de

su optimo teacutermico llevando a cabo un proceso conocido como Termofilizacioacuten (Cuesta et al

2019) es ahiacute donde entra en juego la proteccioacuten que le pueden brindar especies endoacutefitos como

las que pertenecen al geacutenero Trichoderma en el marco de cambio climaacutetico

En concordancia con las cepas de Trichoderma y el geacutenero Hypocrea que tambieacuten

pertenece a la familia Hypocreaceae se conocen maacutes de 700 secuencias de peptaiboles (peacuteptidos

bioloacutegicamente activos) de ambos geacuteneros donde algunos de eacutestos son ecoloacutegica y

comercialmente relevantes debido a su potencial antimicrobiano actividad enzimaacutetica uacutetil para

competir por espacio y alimento de los nuevos patoacutegenos emergentes procedentes de las

alteraciones climaacuteticas y las migraciones tempranas (Degenkolb et al 2008 6)

En cuanto al geacutenero Hypocrea tambieacuten se ha reportado actividad antimicrobiana y anti

fuacutengica contra Staphylococcus aureus y Fusarium oxysporum (Gogoi et al 2008 2) habitando

los geacuteneros Trichoderma e Hypocrea dentro de especies de frailejoacuten como E hartwegiana se

espera que puedan generar sinergias de proteccioacuten que las ayude a combatir los fuertes y

extremos eventos climaacuteticos

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

del 100 (veacutease figura 13) lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen

menos mutaciones en los nodos internos del aacuterbol por ende este aacuterbol contiene la menor

cantidad de mutaciones o cambios dentro sus nodos internos teniendo como resultado una

hipoacutetesis evolutiva confiable (Schmidt y Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 que

indica que el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes corto (menos cambios) y el cual se ajusta

mejor a los datos (Swofford 1997)

49

El geacutenero Annulohypoxylon es de importancia dentro del marco del cambio climaacutetico ya

que pertenece a la familia Xylariaceae y se caracteriza por poseer metabolitos secundarios

antitumorales-citotoacutexicos como la anuloescuamulina que ayudan a combatir el estreacutes abioacutetico

(Cheng et al 2012) estas cepas de hongos son principalmente saprofitos y oportunistas han sido

reportadas en hojas sanas y afectadas de frailejones en otros estudios (Gonzaacutelez 2012 Nonsoque

2012) siendo un geacutenero resiliente a las perturbaciones ambientales como los cambios en los

patrones climaacuteticos su relacioacuten como mutualista dentro del frailejoacuten se mantendraacute hasta que el

frailejoacuten se adapte o colapse ante el estreacutes abioacutetico

Aunque no se conocen como fitopatoacutegenos al contrario pueden actuar como mutualistas

no se descarta que puedan estar involucrados en el desarrollo de diferentes enfermedades en

plantas cuando las condiciones ecosistemicas se alteran a puntos extremos (Gonzalez et al 2017)

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon Biscogniauxia

Nemania y Humiacutecola

El geacutenero Daldinia posee unos valores de MPML correspondientes a 10094 con lo cual

se encuentra bien soportado estadiacutesticamente el geacutenero Daldinia se encuentra ubicado en la

familia Xylariaceae al igual que el geacutenero Hypoxylon Biscogniauxia y Nemania que en su

respectivo orden contienen un soporte estadiacutestico MPML de 10082 10099 y 100100 (veacutease

figura 14) los cuales pertenecen a la divisioacuten Ascomycota las cepas de Daldinia se caracterizan

principalmente por ser especies endoacutefitas teniendo la capacidad de estar dentro de su hueacutesped

mucho tiempo sin causarle dantildeo o al menos un dantildeo evidente por medio de su estado asexual

50

No obstante su estado se puede modificar cuando las condiciones externas se modifican

abruptamente en poco tiempo como es el caso de las alteraciones en la temperatura

precipitacioacuten y concentraciones de dioacutexido de carbono (CO2) auspiciados por el cambio

climaacutetico (Saacutenchez et al 2013)

Un estudio realizado por Prieto (2017) en la especie de frailejoacuten E grandiflora encontroacute

que la especie Daldinia eschscholtzii estaba asociado en el siacutentoma de clorosis (falta de clorofila

en las hojas) Tambieacuten se reportoacute que especies de Daldinia como Daldinia conceacutentrica tienen la

capacidad de controlar nematodos fitopatoacutegenos (Silva et al 2020 104) los cuales pueden invadir

y romper los tejidos de la planta dantildeando sus estructuras los nematodos tambieacuten seraacuten sujetos a

migraciones tempranas por el cambio climaacutetico que trae consigo presiones de seleccioacuten por ende

nuevas amenazas para los frailejones (Nakashima et al 2007)

Como hemos visto hasta este punto las especies de hongos endoacutefitos se muestran en

muchos casos como benefactores y protectores de las diferentes plantas en las que habitan

incluyendo diferentes especies de frailejones

Los hongos endoacutefitos protegen tanto de factores bioacuteticos como virus hongos

fitopatoacutegenos bacterias insectos y factores abioacuteticos como las intemperancias del clima no

obstante en su relacioacuten endoacutefita geacuteneros como Hypoxylon que pertenece igual que Daldinia a la

familia Xylariaceae pueden tener roles amenazadores en conjunto con el cambio climaacutetico

seguacuten Gonzales y colaboradores (2019) inocularon cepas pertenecientes al geacutenero Hypoxylon en

hojas de Theobroma cacao y encontraron que en 48 horas se comenzoacute a notar las marcas de

clorosis y deshidratacioacuten foliar esto demuestra que cepas de este geacutenero pueden tener efectos

fitopatoacutegenos ocasionando muerte descendente pudricioacuten del tronco negro y resinosis de ramas

de mezquite (De la Torre-Almaraacutez et al 2003 De la Torre-Almaraacutez et al 2009)

La presencia de este geacutenero dentro del frailejoacuten en un marco del cambio climaacutetico lo

convierte en una amenaza latente ya que las condiciones seraacuten cada vez maacutes agrestes en los

paacuteramos de los Andes Tropicales Puede favorecer el desarrollo de este geacutenero que tiene las

enzimas necesarias para producir la pudricioacuten del tronco negro entre otras enfermedades

relevantes

51

Tambieacuten las especies del geacutenero Hypoxylon se han reportado como endoacutefitos en tejidos de

plantas lentildeosas o herbaacuteceas (Petrini y Petrini 1985 3) asiacute como saprofitos o fitopatoacutegenos

deacutebiles en madera de aacuterboles de zonas templadas o tropicales (Miller 1961) como lo menciona

Miller (1961)

Los geacuteneros Biscogniauxia Nemania tambieacuten estaacuten dentro de la familia Xylariaceae y

Divisioacuten Ascomycota un aspecto interesante de las especies de Biscogniauxia es que son

paraacutesitos exclusivos de las angiospermas dicotiledoacuteneas en donde concluyeron que todas las

especies pertenecientes a este geacutenero son patoacutegenos umllevesuml que se aprovechan de situaciones de

sequiacutea y estreacutes hiacutedrico para aumentar su patogenicidad (Ju et al 1998)

La especie de frailejoacuten E hartwegiana es una Dicotiledoacutenea eso explica porque

podemos encontrar esta especie de hongo endoacutefito en el frailejoacuten del presente estudio siendo de

vital importancia denotar que las especies de Biscogniauxia se aprovechan especialmente de las

situacioacuten de sequiacutea y estreacutes hiacutedrico difiacutecilmente las especies de este geacutenero podriacutean afectar a los

frailejones debido a que se caracterizan por ser reguladores de los ciclos hiacutedricos el agua es el

recurso que maacutes tiende a existir en un paacuteramo por la estructura de sus suelos compuesta por

andosoles porosos y necromasa acumulada teniendo asiacute un alto iacutendice de retencioacuten hiacutedrica

(Hernandez y Muntildeoz 2015) de modo que el cambio climaacutetico no favorece al geacutenero

Biscogniauxia en su estado patogeacutenico dentro del ecosistema de paacuteramo

En cuanto al geacutenero Nemania Da Silva y colaboradores (2018) llevaron a cabo una

investigacioacuten en la cual identificaron cepas pertenecientes a los geacuteneros Colletotrichum

Phyllosticta Xylaria Nemania y Alternaria en la especie ornamental Pachystachys lutea en

donde las mismas cepas fueron ensayadas para inhibir el crecimiento de hongos fitopatoacutegenos

como Colletotrichum sp en donde encontraron que Nemania era capaz de inhibir por medio de la

secrecioacuten de distintas enzimas el crecimiento de dichas especies gracias a su actividad

enzimaacutetica el geacutenero Nemania puede compensar los desequilibrios causados por el cambio

climaacutetico en teacuterminos de hongos fitopatoacutegenos

Hay que tener en cuenta que los elementos que dan forma a las interacciones planta-

endoacutefito incluyen el modo de transmisioacuten el patroacuten de infeccioacuten la edad de la planta las

condiciones ambientales potenciadas por el cambio climaacutetico y los antecedentes geneacuteticos (Aly et

al 2011 6) Los frailejones de la especie E hartwegiana que se muestrearon para el estudio se

52

tomoacute las hojas sanas lo que indica que poseiacutean estas cepas de endoacutefitos en equilibrio siendo este

uno de los pocos reportes de este geacutenero en especies de alta montantildea en los Andes Tropicales

El geacutenero Humiacutecola se encuentra soportado por un MPML de 10076 siendo una

hipoacutetesis evolutiva considerable es el uacutenico de la figura 14 que no estaacute dentro de la familia

Xylariaceae ya que pertenece a la familia Chaetomiaceae aunque se halla en la divisioacuten

Ascomycota se podriacutea considerar a la especie Humiacutecola fuscoatra como una de las especies de

endoacutefitos maacutes umlinofensivasuml debido a trabajos de investigacioacuten reportados como el de Menzies y

colaboradores (1998) y el de Naik y colaboradores (2009)

Humiacutecola fuscoatra no se considera un peligro latente para la especie E hartwegiana ya

que existe en equilibrio con su entorno Estaacute comprobado por medio de caracterizaciones

quiacutemicas que Humiacutecola fuscoatra es un importante productor de moleacuteculas de estimacioacuten

medica como el resorciacuteclico y lactonas aacutecidas (Mejia et al 2014) Por lo tanto es una especie

prometedora con un reservorio de metabolitos secundarios de importancia medicinal e industrial

que de seguir los efectos nocivos del cambio climaacutetico en los Andes Tropicales maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos esta especie podriacutea desaparecer

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies Massarina

Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

Uno de los grupos mejores soportados en este cladograma es el grupo de Diaporthe en el

cual se encontraron cuatro especies siendo uno con maacutes abundancia de especies del estudio y que

posee un MPML de 10085 10089 y 10095 acorde a sus 3 nodos (veacutease figura 15) teniendo asiacute

una hipoacutetesis evolutiva confiable de estas relaciones las especies de Diaporthe pertenecen a la

familia Diaporthaceae de la divisioacuten Ascomycota y son especies de endoacutefitos que se distinguen

por inhibir el crecimiento de hongos patoacutegenos en el hospedero que se encuentren El estudio de

53

Da Silva y colaboradores (2018) mostroacute que cepas de Diaporthe sp Inhibieron el crecimiento de

Fusarium oxysporum y Colletotrichum sp hongos fitopatoacutegenos que aumentaran su presencia

aprovechando las alteraciones producidas por el cambio climaacutetico en los paacuteramos

Las especies de este geacutenero estaacuten en continuo cambio entre endoacutefitos y patoacutegenos

funcionando en la mayoriacutea de los casos en una relacioacuten mutualista en donde le brindan a la planta

mayor tolerancia a las sequias proteccioacuten de patoacutegenos y pestes caracteriacutestica uacutetil frente a los

retos ecoloacutegicos que plantea el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales (Hubbard et al 2014)

se conocen cerca de 800 especies de este geacutenero asociadas a una amplia gama de plantas

vasculares a nivel mundial (Rossman et al 2015)

Esto explica porque las especies de Diaporthe fueron una de las maacutes numerosas

encontradas en la especie de alta montantildea E hartwegiana teniendo en cuenta que esta especie

pasa raacutepidamente de un estado endoacutefito a un estado patogeacutenico y dada su faacutecil y alta distribucioacuten

representa un peligro en conjunto con el cambio climaacutetico para las especies de alta montantildea como

los frailejones y supone una amenaza para el balance hiacutedrico y ecosistemico en el futuro

El geacutenero Crassiparies de la familia Neohendersoniaceae y el geacutenero Massarina de la

familia Massarinaceae pertenecen al orden Pleosporales aunque se discute debido a las

similaridades morfoloacutegicas y genoacutemicas con Massarina si Crassiparies deberiacutea estar en la

familia Massarinaceae (Hyde et al 2013 4) Se tiene poca informacioacuten sobre la especie

Crassiparies quadrisporus por ende este puede ser uno de los primeros reportes de esta especie

en una especie de alta montantildea como lo es el frailejoacuten especiacuteficamente en la especie E

hartwegiana en un marco de cambio climaacutetico el geacutenero Crassiparies necesita mayores estudios

a nivel ecoloacutegico y microbioloacutegico para entender su papel dentro de esta crisis climaacutetica

Mientras tanto el geacutenero Massarina ha logrado ser aislado de agua dulce con el fin de

obtener fuentes de productos naturales bioloacutegicamente activos por medio de las investigaciones

quiacutemicas de Shearer (1999 2001) en una especie de Massarina obtuvieron como resultado el

aislamiento de tres nuevos sequiterpenoides y dos lactonas derivadas de policeacutetidos con nuevos

sistemas de anillos lo que indica que esta especie tambieacuten puede tener un rol importante

mediante la produccioacuten de enzimas y metabolitos secundarios en el marco de las invasiones

bioloacutegicas impulsadas por el cambio climaacutetico

54

El geacutenero Cryptocoryneum de la familia Cryptocoryneaceae existe poca informacioacuten de

sus mecanismos de accioacuten como endoacutefito o patoacutegeno maacutes aun en especies de los Andes

Tropicales este podriacutea ser uno de los primeros reportes sobre esta especie de hongo en una

especie de frailejoacuten especiacuteficamente E hartwegiana en el 2015 se reportoacute en Brasil el

descubrimiento de una nueva especie del genero Cryptocoryneum trataacutendose de Cryptocoryneum

parvulum hallada en las hojas de la especie Araucaria angustifolia (Gimnosperma) (Silva et al

2015 1) la informacioacuten sobre el geacutenero Cryptocoryneum en relacioacuten al cambio climaacutetico y sus

efectos dentro de especies de alta montantildea como el frailejoacuten auacuten son poco conocidas

Uno de los geacuteneros maacutes cercanos a los grupos externos del cladograma es Cyphellophora

perteneciente a la familia Cyphellophoraceae el cual posee un MPML de 10091 logrando una

hipoacutetesis evolutiva confiable Diversas especies de Cyphellophora han logrado ser aisladas de

infecciones superficiales de la piel o las untildeas en humanos y de materiales vegetales (Decock et

al 2003 Cheewangkoon et al 2009) Esto indica su amplia distribucioacuten y su capacidad para ser

patogeacutenica tanto en plantas como en animales maacutes aun en condiciones desfavorables para la

planta como son las condiciones de cambio climaacutetico

De la especie Cyphellophora reptans se tiene reporte que su morfologiacutea es muy similar a

la de una levadura por lo que es faacutecilmente confundida con una (Reacuteblovaacute et al 2013) Es posible

que este sea el uacutenico reporte de Cyphellophora reptans en las hojas de un frailejoacuten o especie de

alta montantildea que habite en los troacutepicos como E hartwegiana debido a ello sus mecanismos de

accioacuten en especies de paramo dentro de un marco de cambio climaacutetico es poco conocido Se

necesitan mayores estudios enfocados en esta especie para entender su ecologiacutea y dinamismo

ecoloacutegico respecto a los cambios en las variables ambientales

Se eligieron las especies Coprinellus domesticus y Coprinellus xanthothrix como grupos

externos con el fin de enraizar el aacuterbol debido a que pertenecen a la Divisioacuten Basidiomycota la

cual difiere en grado de la divisioacuten Ascomycota aunque conserva semejanzas conocidos como

caracteres ancestrales o plesiomorficos que avanzan a medida la filogenia se construye con los

datos de las diferentes secuencias de especies evidenciando novedades evolutivas conocidas

como apomorfias que cuando se dan en un grupo en particular pasan a ser sinapomorfias es decir

novedades evolutivas dentro de un grupo particular (Lehtonen 2020) Se optoacute por enraizar con

55

estas dos especies con el objetivo de dar robustez al aacuterbol filogeneacutetico (Barriel y 1998) lo cual se

consiguioacute como se nota en los estadiacutesticos del aacuterbol filogeneacutetico

56

57

Conclusiones

Se rechaza la hipoacutetesis nula (H0) y se concluye que la identificacioacuten y caracterizacioacuten

molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo Colombia es diferente en 80 de sus geacuteneros y

especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos realizadas en especies de frailejoacuten

Por lo tanto los nuevos geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos encontrados en el frailejoacuten

plantean nuevos desafiacuteos respecto al cambio climaacutetico ya que tienen un rol vital en la

supervivencia de estas especies de alta montantildea como los frailejones debido a su relacioacuten

mutualista o patoacutegena maacutes aun en los paacuteramos que son altamente sensibles a los efectos del

cambio climaacutetico incluso tan sensibles como las zonas polares (Bradley et al 2006)

La mayoriacutea de especies encontradas en el presente estudio tienen potencial para ayudar a

combatir el estreacutes abioacutetico producido por el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales

Especiacuteficamente pueden ayudar a combatir el estreacutes bioacutetico producido por virus hongos

bacterias e insectos en un marco de cambio climaacutetico aumentos de temperatura cambios en la

concentracioacuten de CO2 cambios en la precipitacioacuten migraciones tempranas cambios en la

nubosidad disponibilidad hiacutedrica alteraciones en la estructura y composicioacuten de las especies

endeacutemicas del paacuteramo

58

59

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Wood S N 2001 umlmgcv GAMs and generalized ridge regression for R R newsuml 1 (2) 20-25

Wu PC Tsai JC Li FC 2004 Increased levels of ambient fungal spores in Taiwan are associated

with dust events from China Atmospheric Environment 38 4879ndash4886

Yan L Zhu J Zhao X Shi J Jiang C Shao D 2019 Beneficial effects of endophytic fungi

colonization on plants Appl Microbiol Biotechnol 103 (8) 3327-3340 12 de

noviembre 101007s00253-019-09713-2

Zimand G Elad Y amp Chet I 1996 Effect of Trichoderma harzianum on Botrytis cinerea

pathogenicity Phytopathology 86 1255ndash1260

Zhang T Yao YF 2015 Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in

the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific Plos One 10 (6)

73

Anexos

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombia

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia

hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

74

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

Coordenadas Geograacuteficas

(Latitud)

De la Colecta del

Material Bioloacutegico total de 15

muestras (Longitud)

LAT N 4deg 37 5871717 LONG W 75deg 25

3292611

LAT N 4deg 37 5885220 LONG W 75deg 25

3271217

LAT N 4deg 37 5884485 LONG W 75deg 25

3312103

LAT N 4deg 36 5995487 LONG W 75deg 27

3045854

LAT N 4deg 37 6195784 LONG W 75deg 30

3292611

LAT N 4deg 40 159171 LONG W 75deg 26

380142

LAT N 4deg 40 363762 LONG W 75deg 26

209072

LAT N 4deg 40 399832 LONG W 75deg 27

173554

LAT N 4deg 40 383965 LONG W 75deg 27

464325

LAT N 4deg 39 486438 LONG W 75deg 27

173559

LAT N 4deg 40 56894 LONG W 75deg 26

568287

LAT N 4deg 40 159174 LONG W 75deg 27

190654

LAT N 4deg 40 125083 LONG W 75deg 26

345912

LAT N 4deg 40 116691 LONG W 75deg 27

208264

LAT N 4deg 40 314698 LONG W 75deg 27

140791

75

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un estereoscopio con el propoacutesito de seleccionar la

maacutes indicada y luego sembrar un cultivo puro a partir de ese micelio

76

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados las

copias se conservaron con glicerol a -80degC en un ultra congelador de Thermo Scientifictrade

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas

y enviadas

77

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicos de forma segura y esteacuteril propiedad de la Universidad del Quindiacuteo

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a la Universidad Ruhr de Bochum (Alemania)

78

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de parsimonia

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X en donde se

observa en amarillo la secuencia umlTCATTAuml la cual es una secuencia altamente conservada

que se usa para marcar el inicio de la misma en hongos endoacutefitos

79

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa JmoldelTest usados para generar el

aacuterbol de relaciones filogeneacuteticas a partir de la regioacuten ITS de los hongos endoacutefitos aislados

total de modelos evaluados 88

ID Nombre Particioacuten lnL P AIC detaAIC Peso Cumpeso Udelta

1 JC 0 100820157 138 204400314 1341348 0 1 -

2 JC+I 0 98912511 139 200605022 9618188 0 1 -

3 JC+G 0 95470113 139 193720225 2733392 0 1 -

4 JC+I+G 0 95467507 140 193735014 274818 0 1 -

5 F81 0 100658095 141 204136189 13149356 0 1 -

6 F81+I 0 98761481 142 200362962 9376128 0 1 -

7 F81+G 0 95314814 142 193469628 2482794 0 1 -

8 F81+I+G 0 95324364 143 193508729 2521895 0 1 -

9 K80 10010 99734495 139 20224899 11262157 0 1 -

10 K80+I 10010 97835191 140 198470382 7483549 0 1 -

11 K80+G 10010 94227821 140 191255643 268809 0 1 -

12 K80+I+G 10010 94209963 141 191239926 253092 0 1 -

13 HKY 10010 99648091 142 202136181 11149348 0 1 -

14 HKY+I 10010 97761512 143 198383024 7396191 0 1 -

15 HKY+G 10010 94170799 143 191201599 214765 0 1 -

16 HKY+I+G 10010 94118678 144 191117357 130523 600E-04 0999 -

17 TrNef 10020 99564653 140 201929306 10942472 0 1 -

18 TrNef+I 10020 97712623 141 198245245 7258412 0 1 -

19 TrNef+G 10020 94150977 141 191121955 135121 400E-04 09994 -

20 TrNef+I+G 10020 94132131 142 191104263 117429 00011 09959 -

21 TrN 10020 99563809 143 201987618 11000784 0 1 -

22 TrN+I 10020 97702964 144 198285929 7299095 0 1 -

23 TrN+G 10020 94094235 144 191068469 81635 00065 09719 -

24 TrN+I+G 10020 94101378 145 191102757 115923 00012 09948 -

25 TPM1 12210 99713879 140 202227759 11240925 0 1 -

26 TPM1+I 12210 97826641 141 198473282 7486449 0 1 -

27 TPM1+G 12210 94249837 141 191319674 33284 0 1 -

28 TPM1+I+G 12210 942022 142 1912444 257566 0 1 -

29 TPM1uf 12210 99663473 143 202186945 11200112 0 1 -

30 TPM1uf+I 12210 97879458 144 198638917 7652083 0 1 -

31 TPM1uf+G 12210 94137349 144 191154699 167865 100E-04 09999 -

32 TPM1uf+I+G 12210 94141897 145 191183794 196961 0 1 -

80

33 TPM2 10212 99722544 140 202245087 11258254 0 1 -

34 TPM2+I 10212 97828213 141 198476426 7489592 0 1 -

35 TPM2+G 10212 94185859 141 191191718 204885 0 1 -

36 TPM2+I+G 10212 94153667 142 191147335 160501 100E-04 09998 -

37 TPM2uf 10212 99648091 143 202156182 11169348 0 1 -

38 TPM2uf+I 10212 97757018 144 198394035 7407202 0 1 -

39 TPM2uf+G 10212 941052 144 1910904 103566 00022 09904 -

40 TPM2uf+I+G 10212 9408801 145 19107602 89187 00044 0982 -

41 TPM3 12012 99768005 140 20233601 11349176 0 1 -

42 TPM3+I 12012 97958099 141 198736198 7749364 0 1 -

43 TPM3+G 12012 94227963 141 191275926 289093 0 1 -

44 TPM3+I+G 12012 94323885 142 191487769 500936 0 1 -

45 TPM3uf 12012 99625421 143 202110843 11124009 0 1 -

46 TPM3uf+I 12012 97770469 144 198420939 7434105 0 1 -

47 TPM3uf+G 12012 94165576 144 191211152 224319 0 1 -

48 TPM3uf+I+G 12012 94150861 145 191201721 214888 0 1 -

49 TIM1ef 12230 99592239 141 202004478 11017644 0 1 -

50 TIM1ef+I 12230 97822787 142 198485574 749874 0 1 -

51 TIM1ef+G 12230 94121043 142 191082087 95253 00033 09853 -

52 TIM1ef+I+G 12230 94122386 143 191104772 117939 00011 09969 -

53 TIM1 12230 99518653 144 201917306 10930473 0 1 -

54 TIM1+I 12230 9781156 145 19852312 7536286 0 1 -

55 TIM1+G 12230 94105198 145 191110396 123562 800E-04 09977 -

56 TIM1+I+G 12230 94087158 146 191094317 107483 00018 09922 -

57 TIM2ef 10232 99550617 141 201921233 109344 0 1 -

58 TIM2ef+I 10232 97704602 142 198249204 726237 0 1 -

59 TIM2ef+G 10232 94093484 142 191026968 40135 00516 0852 -

60 TIM2ef+I+G 10232 94073864 143 191007729 20895 0135 07169 -

61 TIM2 10232 99530022 144 201940044 1095321 0 1 -

62 TIM2+I 10232 97820158 145 198540315 7553482 0 1 -

63 TIM2+G 10232 94058678 145 191017356 30523 00834 08004 -

64 TIM2+I+G 10232 94060837 146 191041674 54841 00247 09248 -

65 TIM3ef 12032 99546286 141 201912572 10925739 0 1 -

66 TIM3ef+I 12032 97713931 142 198267862 7281028 0 1 -

67 TIM3ef+G 12032 94129376 142 191098753 111919 00014 09936 -

68 TIM3ef+I+G 12032 94112005 143 191084009 97176 0003 09883 -

69 TIM3 12032 99514376 144 201908751 10921918 0 1 -

70 TIM3+I 12032 97700023 145 198300047 7313213 0 1 -

71 TIM3+G 12032 94115323 145 191130646 143812 300E-04 09997 -

72 TIM3+I+G 12032 94096941 146 191113882 127048 700E-04 09984 -

73 TVMef 12314 9970418 142 20224836 11261526 0 1 -

74 TVMef+I 12314 97940598 143 198741196 7754363 0 1 -

81

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE (AIC)

75 TVMef+G 12314 94159829 143 191179657 192824 0 09999 -

76 TVMef+I+G 12314 94160993 144 191201987 215153 0 1 -

77 TVM 12314 99615991 145 202131982 11145148 0 1 -

78 TVM+I 12314 97746676 146 198413353 7426519 0 1 -

79 TVM+G 12314 94075503 146 191071005 84171 00057 09776 -

80 TVM+I+G 12314 94052588 147 191045176 58342 00208 09456 -

81 SYM 12345 99543166 143 201946331 10959498 0 1 -

82 SYM+I 12345 97757103 144 198394207 7407373 0 1 -

83 SYM+G 12345 94083056 144 191046112 59278 00198 09654 -

84 SYM+I+G 12345 94050035 145 19100007 13236 0198 05819 -

85 GTR 12345 99529525 146 20197905 10992217 0 1 -

86 GTR+I 12345 97686178 147 198312356 7325522 0 1 -

87 GTR+G 12345 94044194 147 191028387 41553 00481 09001 -

88 GTR+I+G 12345 94013417 148 190986834 0 03839 03839 -

3

Claacuteusula de cesioacuten de derecho de publicacioacuten

Yo Cristhian Aristizabal Ortiz autor del trabajo intitulado ldquoDiversidad de hongos

endoacutefitos asociados al frailejoacuten (Espeletia hartwegiana) en un marco de cambio climaacutetico en el

paacuteramo de Romerales Quindiacuteo Colombiardquo mediante el presente documento dejo constancia de

que la obra es de mi exclusiva autoriacutea y produccioacuten que la he elaborado para cumplir con uno de

los requisitos previos para la obtencioacuten del tiacutetulo de Magiacutester en Cambio Climaacutetico

Sustentabilidad y Desarrollo en la Universidad Andina Simoacuten Boliacutevar Sede Ecuador

1 Cedo a la Universidad Andina Simoacuten Boliacutevar Sede Ecuador los derechos exclusivos de

reproduccioacuten comunicacioacuten puacuteblica distribucioacuten y divulgacioacuten durante 36 meses a partir de mi

graduacioacuten pudiendo por lo tanto la Universidad utilizar y usar esta obra por cualquier medio

conocido o por conocer siempre y cuando no se lo haga para obtener beneficio econoacutemico Esta

autorizacioacuten incluye la reproduccioacuten total o parcial en los formatos virtual electroacutenico digital

oacuteptico como usos en red local y en internet

2 Declaro que en caso de presentarse cualquier reclamacioacuten de parte de terceros respecto de los

derechos de autora de la obra antes referida yo asumireacute toda responsabilidad frente a terceros y a

la Universidad

3 En esta fecha entrego a la Secretariacutea General el ejemplar respectivo y sus anexos en formato

impreso y digital o electroacutenico

Firma 23072021

Cristhian Aristizabal Ortiz

4

5

Resumen

Debido al aumento global de las temperaturas impulsado por el cambio climaacutetico de origen

antropogeacutenico y a la poca informacioacuten que se tiene sobre hongos endoacutefitos en especies de los

paacuteramos esta investigacioacuten buscoacute identificar y caracterizar la diversidad de hongos endoacutefitos del

frailejoacuten Espeletia hartwegiana Esta especie habita en los paacuteramos desde 3000 a 5000 metros de

lo que la hace una especie maacutes vulnerable a los aumentos de temperatura que se pronostican para

el antildeo 2100 de hasta 25degC La identificacioacuten y caracterizacioacuten de los hongos endoacutefitos se realizoacute

por medio de teacutecnicas filogenia molecular basado en datos de secuencias de genes muacuteltiples de

las regiones espaciadoras transcritas internas (ITS) en donde se encontraron un total de 15

geacuteneros de endoacutefitos como Nigrospora Trichoderma y Diaporthe con un total de 35 especies

Los hongos endoacutefitos encontrados podriacutean tener un rol vital en la supervivencia de esta especie

de frailejoacuten mediando la forma en coacutemo responde al estreacutes abioacutetico producido por el cambio

climaacutetico como aumento de la temperatura cambio en las precipitaciones y sequiacuteas ademaacutes del

estreacutes bioacutetico como virus bateriacuteas insectos y hongos fitopatoacutegenos

Palabras clave Cambio Climaacutetico Filogenia Molecular Hongos Endoacutefitos Paacuteramos

6

7

Con amor para mis padres Fernando Ivaacuten Aristizabal y mi madre Mariacutea Ligia

Ortiz

A Norberto Aristizabal y Natalia Aristizabal por creer en miacute

A mi hijo Joseacute David Aristizabal por representar las nuevas generaciones

A mi tutor Jhon Alexander Osorio por tenerme paciencia en este proceso de

aprendizaje y compartirme sus conocimientos

A Tatiana Tapias por darme su amor y llevarme por el camino de la virtud

siempre centrado

A la maestriacutea en Cambio Climaacutetico Sustentabilidad y Desarrollo por siempre

estar disponibles para miacute

A la Universidad Andina Simoacuten Boliacutevar por apoyar mi tesis de investigacioacuten

A la Repuacuteblica del Ecuador por abrirme sus puertas y darme un mejor futuro

8

9

Agradecimientos

Estos agradecimientos van dedicados para Ecuador que me brindoacute la oportunidad

poder estudiar una maestriacutea a mi tutor por aceptarme y acompantildearme en este proceso a

mi familia por creer en miacute y en los sacrificios que hice para irme a vivir a otro paiacutes solo y

sin dinero para poder umlsalir adelanteuml como decimos en Colombia a mi compantildeera

sentimental por siempre guiarme hacia el camino correcto disciplina compromiso y

entrega a la universidad Andina Simoacuten Boliacutevar por aceptarme en sus aulas de clase y

por ultimo a la Universidad del Quindiacuteo por abrirle la puerta a uno de sus egresados y

acogerlo de buena forma con sus instalaciones de laboratorio

Gracias y mil gracias a todos de corazoacuten sin duda esta experiencia cambio mi

vida en todos los sentidos

Desde hoy hasta el final que podriacutea llamarse infinito

10

11

Tabla de contenidos

Figuras mapas y tablashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13

Introduccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 15

Capiacutetulo primero Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

1 Antecedenteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

2 Justificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 25

3 Hipoacutetesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 26

4 Objetivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

41 Objetivo generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

42 Objetivos especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

Capiacutetulo segundo Materiales Meacutetodos y Resultadoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

1 Aacuterea de Estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

2 Colecta de material bioloacutegicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos

endoacutefitos)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32

5 Extraccioacuten de ADNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

7 Secuenciamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

8 Anaacutelisis Filogeneacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

Capiacutetulo Tercero Discusioacuten sobre los hongos endoacutefitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidadhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio

Climaacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42

Conclusioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 57

Obras citadashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 59

Anexoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 73

12

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphellip 73

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia 73

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphelliphellip74

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana 75

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un

estereoscopio 75

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 76

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas y

enviadas 76

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 75

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a Alemania a la Universidad Ruhr de

Bochum 77

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de

parsimoniahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 78

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X 78

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa

JmoldelTest 79

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE

(AIC) 81

13

Figuras mapas y tablas

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo

Colombiahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras

N necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefitohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y

abioacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en

medio de cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelialhelliphelliphellip 30

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la

teacutecnica de corte de hifa uacutenica helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de

cultivo Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12)

aislados de las hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana 31-32

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 10 Filograma obtenido a partir del anaacutelisis ML y MP del conjunto de datos ITS Aislados

de las hojas de frailejoacuten37

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip43

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e

Hypocreahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip46

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon48

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon

Biscogniauxia Nemania y Humiacutecolahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

14

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies

Massarina Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona

muestreadahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia 29-30

Tabla 2 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos

endoacutefitos en la especie Espeletia hartwegiana

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36

Tabla 3 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = presencia del genero

de hongo dentro de la especie de frailejoacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42-43

15

Introduccioacuten

Hay un libro abierto siempre para

todos los ojos la naturaleza

(Jean-Jacques Rousseau 1712-1778)

El cambio climaacutetico corresponde a un fenoacutemeno que afecta el planeta de manera natural

permitiendo mantener las condiciones climaacuteticas como la temperatura la precipitacioacuten entre

otras en un rango aceptable para la vida (Jimeacutenez 2010) Sin embargo dado el aumento de las

emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) principalmente asociado a las actividades

humanas y el alto consumo de combustibles foacutesiles los cambios en dichas condiciones han sido

alterados dando paso a un acelerado aumento de temperatura anual en las uacuteltimas deacutecadas con

precipitaciones y sequias maacutes frecuentes e intensas (IPCC 2020 5 Jimeacutenez 2010)

Acorde con el Panel Intergubernamental de Expertos en Cambio Climaacutetico (IPCC) para

fin de siglo el Cambio Climaacutetico se acrecentaraacute pronosticando un aumento de temperatura de 25

a 45 degC para el antildeo 2100 que tan solo para Colombia en los uacuteltimos 30 antildeos fue de 08degC

generando impactos notorios en las zonas de alta montantildea como los paacuteramos (Moreno y Palma

2016)

El cambio climaacutetico es un fenoacutemeno cuyos efectos alcanzaraacuten los paacuteramos los cuales son

ecosistemas de alta montantildea presente en elevaciones entre 3100 y 4700 m ubicados en el norte de

los Andes de Ameacuterica del Sur y el sur de Ameacuterica Central adyacente (Berdugo et al 2016) Estas

aacutereas se caracterizan por una vegetacioacuten principalmente endeacutemica compuesta por frailejones

matorrales y pastos (veacutease figura 1) (Garciacutea et al 2010)

Los ecosistemas de alta montantildea como los paacuteramos ofrecen diversos servicios

ambientales como la biodiversidad uacutenica que albergan los paisajes los suelos y su capacidad de

retener y almacenar agua (Morales et al 2019) Las formaciones vegetales juegan un papel

diferenciado en el mantenimiento de la humedad y las fuentes de agua en el ecosistema

presentando la capacidad de interceptar almacenar y regular los flujos hiacutedricos superficiales y

16

subterraacuteneos aportando los servicios de abastecimiento de agua para el 70 de la poblacioacuten de

Colombia (Vaacutesquez y Buitrago 2017)

Ademaacutes dada la caracteriacutestica de permanente humedad de su suelo la materia orgaacutenica

se descompone a menor velocidad logrando un efecto de retencioacuten y almacenamiento de carbono

(Anderson et al 2012) En Colombia se han realizado diferentes estudios sobre la distribucioacuten y

extensioacuten del ecosistema paramuno Rangel (2002 4) determinoacute que los paacuteramos colombianos

abarcaban aproximadamente el 26 de la superficie del paiacutes

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramos por Pedraza-Pentildealosa Betancur y Franco-Rosselli (2005)

En particular el paacuteramo Romerales se encuentra dentro del territorio adscrito a los

Parques Nacionales Naturales (PNN) especiacuteficamente el PNN de los Nevados en la cordillera

central colombiana hacia la zona norte del Departamento del Quindiacuteo con liacutemites fronterizos

entre los departamentos de Risaralda y Tolima Este paacuteramo es el hogar del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana el cual estaacute afrontando los efectos del cambio climaacutetico (veacutease mapa 1)

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona muestreada

17

Existe evidencia cientiacutefica concreta del aumento de temperatura en los Andes Tropicales

tambieacuten cambios significativos en los patrones de precipitacioacuten sumado a la disminucioacuten en la

incidencia del clima nublado lo que conduce a las plantas a mayor cantidad de horas expuestas a

la radiacioacuten solar (Ruiz et al 2009) Otro efecto grave que trae consigo el cambio climaacutetico es el

desplazamiento de especies en el gradiente altitudinal Con un aumento de 3degC se espera que las

especies se muevan ~600 m en buacutesqueda de su optimo teacutermico esto afectariacutea gravemente las

especies de paacuteramo como los frailejones Cuesta Camacho (2007)

Los frailejones son emblemaacuteticas plantas de paacuteramo y ecosistemas de alta montantildea

(MINAMBIENTE 2019) Pertenecen a la familia Asteraceae contiene cerca de 142 especies

agrupadas en ocho geacuteneros Carramboa Coespeletia Espeletia Espeletiopsis Libanothamnus

Paramiflos Ruilopezia y Tamania de estos los maacutes importantes y con mayor diversidad de

especies son Espeletia Espeletiopsis y Libanothamnus (Rivera y Torres 2001)

Poseen adaptaciones que les permite captar y retener grandes cantidades de agua de su

entorno permitiendo un balance ecosistemico (Farias 2013) La morfologiacutea singular del genero

Espeletia le permite acumular las hojas antiguas en forma de ldquoabrigordquo brindando proteccioacuten

contra las bajas temperaturas nocturnas de hasta 0degC Los fuertes vientos y la radiacioacuten solar los

cuales seraacuten cada vez maacutes intensos y frecuentes por causa del cambio climaacutetico (Cortes y

Sarmiento 2013 34) (veacutease figura 2)

Estas plantas son especies claves para la conservacioacuten de los paacuteramos y la lucha contra el

cambio climaacutetico debido a que ofrecen una gran variedad de servicios ecosisteacutemicos (Diacuteaz et al

2007) El paacuteramo es referente sin igual de fuente hiacutedrica ciudades como Bogotaacute y Quito obtienen

aproximadamente el 80 de su agua dulce de los paacuteramos (Buytaert et al 2006) Los frailejones

en su mayoriacutea endeacutemicos se han visto afectados por actividades humanas como la ganaderiacutea

extensiva agricultura (cultivos de papa y cebolla) mineriacutea de oro y carboacuten turismo no

controlado y quemas intencionales (Hofstede 2000) Esta situacioacuten podriacutea comprometer a

mediano y largo plazo la funcioacuten de captacioacuten regulacioacuten y suministro del agua para el consumo

18

en las ciudades colombianas ubicadas en las regiones de influencia de estos ecosistemas (Varela

2015)

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

No obstante en asociacioacuten con especies como el frailejoacuten de los Andes Tropicales

encontramos a los hongos cuyos roles en las interacciones bioloacutegicas son de vital importancia

Los hongos pueden ser endoacutefitos simbiontes mutualistas paraacutesitos y comensales y son capaces

de responder a las amenazas que plantea el cambio climaacutetico en cuanto a perturbaciones

ambientales aumento de temperatura y estreacutes hiacutedrico adaptaacutendose a la disponibilidad de recursos

modificando sus actividades enzimaacuteticas e incluso su genoma a lo largo del tiempo (Moreno et

al 2013)

Los hongos son clasificados seguacuten su forma de reproduccioacuten sea sexual o asexual en

donde se observan las diferencias estructurales internas entre los diferentes grupos tales como

sus esporas e hifas como lo indican Blackwell y Spatafora (2004) estos organismos estaacuten

divididos en cuatro grandes grupos los cuales son Ascomycota Basidiomycota

Chytridiomycota Zygomycota es justo en el grupo de los Ascomycota donde se encuentra gran

diversidad de hongos conocidos como ldquohongos endoacutefitosrdquo en donde su nombre ldquoendoacutefitordquo

significa ldquodentro de la plantardquo (endon dentro phyton planta)

19

Estos microorganismos fuacutengicos tienen la facilidad de pasar gran parte o todo su ciclo de

vida invadiendo los tejidos de su hospedero (planta) sin tener un efecto negativo evidente

(Leacuteveilleacute 1846 3 de Bary 1866 8) Por lo tanto el concepto de endoacutefito indica una asociacioacuten de

costo-beneficio pero de una forma mutualista entre el hongo y la planta hospedera permitiendo

la estadiacutea en sus tejidos vivos (Clay 1998 8) Los hongos endoacutefitos se han encontrado en todas

las plantas (algas musgos pastos plantas y vasculares) desde los bosques templados hasta los

bosques tropicales hallaacutendose una gran diversidad de plantas y en asociacioacuten gran diversidad de

hongos endoacutefitos (Saacutenchez et al 2010)

Se espera que los hongos endoacutefitos jueguen un papel cada vez maacutes importante potenciado

por el cambio climaacutetico en las enfermedades producidas en plantas como pudricioacuten radicular

mal blanco entre otras con los aumentos pronosticados de la temperatura y el estreacutes por sequiacutea

asociados al cambio climaacutetico (Desprez-Loustau et al 2006 Slippers y Wingfield 2007 6) Los

cambios en la cantidad de dioacutexido de carbono (CO2) y la disponibilidad de nitroacutegeno en el suelo

afectan de forma similar tanto a las plantas como a los hongos por ende las alteraciones

generadas por parte del cambio climaacutetico pueden causar desbalances en sus relaciones (Ies et al

2013)

Algunos estudios realizados en el antildeo 1898 donde se registraron los primeros hongos

endoacutefitos como el de Bary (1866) brindo la iniciativa de investigaciones que lograron explicar

los cuadros toxicoloacutegicos observados en animales los cuales se daban por el consumo de

semillas o en aacutereas de pastos (Poaceae) que posiblemente albergaban hongos Clavicipitaacuteceos

(familia del ergot) los cuales poseiacutean actividades enzimaacuteticas con micotoxinas

Por diversas situaciones no trascendioacute la investigacioacuten hasta que Bacon (1977) hizo

relacioacuten del hongo endoacutefito Neotyphodium coenophialum debido a una intoxicacioacuten del ganado

llamado ldquosiacutendrome de veranordquo cuando estos animales consumiacutean pastos de la especie Festuca

arundinacea (Poaceae) Funk en el antildeo 80 caracterizoacute la resistencia de las Poaceae que

albergaban hongos endoacutefitos que frecuentemente eran atacados por insectos (proteccioacuten contra

herbiacutevoros) (Saacutenchez et al 2010)

Compant y colaboradores (2010) mencionaron que tras experimentar en el laboratorio

con una gama de temperaturas en los hongos endoacutefitos aislados obtuvieron resultados variables

respecto al crecimiento es decir positivos y neutrales llegando a la conclusioacuten de que los

microorganismos asociados a las plantas son un factor importante que influye en la respuesta de

20

las plantas acorde a los cambios de temperatura lo que compromete las respuestas del frailejoacuten y

los hongos endoacutefitos frente al calentamiento global causado por el cambio climaacutetico

Con relacioacuten a los estudios realizados sobre hongos endoacutefitos en frailejones se han

encontrado al menos 100 especies con capacidades de inhibir hongos fitopatoacutegenos o herbivoriacutea

(Cabezas et al 2012)

Los geacuteneros de hongos endoacutefitos encontrados en anteriores estudios son Acremonium

Aspergillus Aureobasidium Colletotrichum Fusarium Gliocadium Nigrospora Paecilomyces

Penicillium Trichothecium Trichoderma y Sordaria (Pineda 2000 Programa Nacional para la

Evaluacioacuten del Estado y Afectacioacuten de los Frailejones en los Paacuteramos de Andes del Norte 2009)

Teniendo en cuenta que para Colombia hay poca informacioacuten sobre hongos endoacutefitos en

ecosistemas paramunos se hace fundamental la ampliacioacuten de maacutes informacioacuten referente al tema

debido a que solo existen estudios significativos en cafeacute leguminosas y rosas los cuales maacutes allaacute

de la identificacioacuten de geacuteneros de hongos endoacutefitos no incluyen el cambio climaacutetico y sus

posibles consecuencias (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016) En

teacuterminos filogeneacuteticos los hongos son el reino de la naturaleza maacutes cercano a los animales

(Hibbett et al 2018)

Las relaciones que posean las diferentes especies de endoacutefitos dentro de la especie de

frailejoacuten es de importancia conocerla mediante el uso de la filogenia molecular (Judd et al 2007)

mediante secuencias de ADN ARN o proteiacutenas (Cooke et al 2000) Dependiendo de la presencia

de especies agresivas de endoacutefitos como Nigrospora se puede tener un mejor conocimiento

sobre las consecuencias que trae consigo los impactos del cambio climaacutetico sobre estas plantas de

los Andes Tropicales (Foden et al 2009)

21

Capiacutetulo primero

Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitos

1 Antecedentes

Desde los estudios realizados por Leacuteveilleacute (1846) y Bary (1866) sobre hongos Endoacutefitos

en pastos de zonas templadas se ha logrado identificar que estos hongos son capaces de inducir

respuestas adaptativas a sus hospederos (Micotoxinas contra herbiacutevora adaptacioacuten a heladas o

climas extremos fijacioacuten de nutrientes) a cambio de alimento y hospedaje formando una relacioacuten

mutualista en la cual las dos especies involucradas son beneficiadas No obstante se ha reportado

que los hongos endoacutefitos ademaacutes de tener relaciones mutualistas con diferentes especies

vegetales se pueden tornar en especies patoacutegenas para su hospedero una vez la planta se

encuentra en condiciones desventajosas tornaacutendose asiacute el hongo endoacutefito en un hongo

fitopatoacutegeno (Herrera y Ulloa 1990 550)

Como se mencionoacute anteriormente los hongos endoacutefitos pueden pasar de un estado

mutualista a un estado de patogeacutenesis dada esta relacioacuten entre ambos organismos se producen

metabolitos secundarios potencialmente toacutexicos facilitando factores de virulencia dados por el

hongo endoacutefito como exoenzimas y metabolitos fitotoacutexicos a su vez la planta presenta defensas

tanto mecaacutenicas como bioquiacutemicas (Saacutenchez et al 2013 5)

Hasta la fecha los principales estudios de hongos endoacutefitos se han fijado en especies de

intereacutes econoacutemico y comercial tales como palma de aceite cafeacute leguminosas pastos de forrajeoacute

y diferentes tipos de rosas (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016)

Las especies modelo para el estudio de los hongos endoacutefitos han sido las gramiacuteneas

forrajeras en donde se han reportado especies de endoacutefitos asociados a los geacuteneros Lolium

Festuca y Brachiaria (Siegel et al 1987) no obstante Otero y Bayman (2009) han reportado un

creciente nuacutemero de estudios en orquiacutedeas epifitas tropicales relaciones con hongos micorrizicos

22

Actualmente existen escasos reportes de hongos endoacutefitos asociados a ecosistemas con

climas extremos (temperaturas extremas) como aacuterticos desiertos paacuteramos y zonas alpinas

especialmente para zonas de temperaturas friacuteas como lo son los paacuteramos (Lopera et al 2008

Leung et al 2011 Cabezas et al 2012 Miles et al 2012 Zhang y Yao 2015)

Investigadores como Lopera Leung y colaboradores (2011) han llegado a la conclusioacuten

de que los hongos endoacutefitos juegan un papel importante en las plantas a la hora de adaptarse a

ecosistemas de clima templado (Kivlin et al 2013 Zhang y Yao 2015)

En Colombia los trabajos con hongos endoacutefitos son pocos por ende trabajos como el de

Lopera y colaboradores (2008) con especies del genero Espeletia de los paacuteramos Colombianos

son pioneros ademaacutes del trabajo de Cabezas y colaboradores (2012 4) en el cual aislaron y

caracterizaron celulasas (enzimas descomponedores de la celulosa) extraiacutedas de hongos endoacutefitos

que se hallaban en especies de Espeletia posteriormente Lopera y Miles (2012) unieron

esfuerzos para continuar caracterizando la diversidad de hongos endoacutefitos en los paacuteramos andinos

colombianos enfocados en Espeletia con el objetivo de encontrar especies con potencial

biocontrolador

Existen trabajos tesis en los repositorios de diversas universidades de los antildeos 2014 y

2015 en los cuales se aborda el tema de los hongos endoacutefitos paacuteramos y especies de Espeletia

(frailejones) y de la familia Poaceae en donde se caracterizan las diversas especies de hongos

endoacutefitos por medio taxonomiacutea y biologiacutea molecular ademaacutes de buscar metabolitos secundarios

con fines medicinales o de biocontrol

Los trabajos en filogenia molecular de hongos endoacutefitos realizados en frailejones se han

visto enfocados maacutes hacia la buacutesqueda de la diversidad funcional en comunidades

microbioloacutegicas como por ejemplo el estudio realizado por Ruiz y colaboradores (2015) en

donde buscaron mediante el anaacutelisis molecular de raiacuteces necromasa hojas maduras y joacutevenes de

diferentes especies de Espeletia (veacutease figura 3) ubicada en los Andes neotroacutepicales

colombianos secuencias geneacuteticas de las regiones V5-V6 de la unidad 16S del rARN

23

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras N

necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefito Tomado de Ruiz y colaboradores (2015)

Este estudio analizoacute la composicioacuten de comunidades microbioanas y su diversidad

funcional en un ecosistema de alta montantildea en donde las temperaturas los rayos UV y la altura

juegan papeles determinantes como filtros ecoloacutegicos severos en donde solo pueden existir

especies que han desarrollado capacidades para adaptarse sobrevivir y colonizar dichas aacutereas

por ende cuando se analizaron las comunidades existentes dentro de estas especies de Espeletia

Encontraron que algunas especies halladas podriacutean tener roles importantes como

productores de metabolitos secundarios enzimas o incluso como bioremediadores y que las

comunidades microbianas eran diferentes tanto en sus hojas como en sus raiacuteces y en la

necromasa

A medida que las deacutecadas avanzan y la evidencia sobre el cambio climaacutetico se hace maacutes

robusta y evidente los estudios en los hongos endoacutefitos han tomado vital importancia al estar

asociados con cultivos de especies comestibles escases de agua y de tierras productivas sumado

a los efectos negativos que trae consigo el cambio climaacutetico para las diferentes plantaciones y

cosechas a nivel global

Es por eso que Lu Yan y colaboradores (2019) analizaron los efectos positivos que teniacutean

la colonizacioacuten de hongos endoacutefitos en las plantas en donde ratificaron que los hongos endoacutefitos

dentro la planta generan metabolitos antimicrobianos estimulan las respuestas inmunoloacutegicas y

compiten por espacio dentro de la planta con diferentes patoacutegenos incrementando asiacute la

resistencia contra herbiacutevoros y la resistencia al estreacutes salino (factores bioacuteticos)

Ademaacutes de ayudar a la planta contra el estreacutes abioacutetico causado principalmente por

factores climaacuteticos como la falta de agua (estreacutes hiacutedrico) las temperaturas extremas la

intensidad de los rayos UV y los metales pesados como la muestra la figura 4 debido a esto se

24

concluyoacute que las fitohormonas cumplen un papel importante en la colonizacioacuten de hongos

endoacutefitos dentro de la planta

Aun que se ha reportado que los hongos endoacutefitos se pueden usar como biocontroladores

diferentes estudios reportan que el uso de hongos endoacutefitos puede tener efectos adversos como

un retraso significativo en el crecimiento de la planta con el uso de la especie Cryptosporiopsis

sp (Terhonen et al 2016) Otro reporte indica la fecundidad y supervivencia de enemigos

naturales como paraacutesitos esto es debido a que los hongos endoacutefitos transfieren sus toxinas y

alcaloides cuando son ingeridos por paraacutesitos u otros enemigos naturales de las plantas (Lopez y

Sword 2015)

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y abioacutetico

Bajo estreacutes bioacutetico (herbiacutevoros y patoacutegenos) y abioacutetico (sequiacutea salinidad metales pesados y otros) (a) se

inducen respuestas de defensa de las plantas (b) los endoacutefitos producen metabolitos protectores y

modulan la viacutea de las fitohormonas para mejorar la inmunidad de las plantas (c) tomada de Lu yan y

colaboradores (2019 7)

25

2 Justificacioacuten

La presente investigacioacuten pretende identificar y caracterizar que especies de hongos

endoacutefitos estaacuten asociadas al frailejoacuten Espeletia hartwegiana y que posibles implicaciones podriacutea

tener que estas especies se encuentren dentro de esta especie de alta montantildea La importancia de

conocer esta informacioacuten reside en que los hongos endoacutefitos pueden beneficiar o perjudicar a la

adaptacioacuten y resistencia de especies vegetales en los distintos escenarios climaacuteticos propuestos

por la ciencia (IPCC 2020)

El calentamiento global podriacutea afectar el equilibrio de los hongos endoacutefitos en especies

vegetales generando desbalances en la planta o la peacuterdida de especies endoacutefitas de importancia

biotecnoloacutegica Por ejemplo se podriacutean perder especies endoacutefitas con potencial para control

bioloacutegico de plagas y enfermedades de plantas como productores de enzimas y metabolitos

secundarios degradacioacuten de plaacutesticos o biorremediacioacuten entre otros (Schulz et al 2002) Por

ello se hace fundamental estudiar los hongos endoacutefitos en ecosistemas de paacuteramo ya que en

Colombia y en los paacuteramos en general han sido poco estudiados y su efecto sobre las plantas de

alta montantildea podriacutea ser clave en el mantenimiento de sus poblaciones

26

3 Hipoacutetesis

H1 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute diferente en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo diferentes los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten tambieacuten seria

modificada

H0 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute similar en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo similares los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten continuariacutean

como se ha registrado con anterioridad

27

4 Objetivos

41 Objetivo general

Caracterizar la diversidad de hongos endoacutefitos presentes en los frailejones

de la especie Espeletia hartwegiana en el paacuteramo de Romerales tomando en cuenta su

relacioacuten con el cambio climaacutetico

42 Objetivos especiacuteficos

Identificar los hongos endoacutefitos asociados en Espeletia hartwegiana del

paacuteramo de Romerales

Hallar relaciones filogeneacuteticas entre las diferentes especies de hongos

Endoacutefitos encontradas en Espeletia hartwegiana

Advertir las repercusiones del cambio climaacutetico sobre Espeletia

hartwegiana en base a su diversidad de hongos endoacutefitos

28

29

Capiacutetulo segundo

Materiales Meacutetodos y Resultados

1 Aacuterea de Estudio

El trabajo se realizoacute en el paacuteramo de Romerales ubicado en la zona alta del municipio de

Salento Quindiacuteo (4deg39202N 75deg25506W) con una extensioacuten aproximada de 6794 ha (Cano

et al 2015)

2 Colecta de material bioloacutegico

La colecta del material bioloacutegico se realizoacute mediante muestreos aleatorios lo largo del

paacuteramo tomando coordenadas de cada punto de colecta (veacutease anexo 3) las hojas se colectaron

por medio de tijeras podadoras siendo empacadas cada una en bolsas Ziploc diferentes se

colectoacute un total de 15 hojas cada una correspondiente a una planta de frailejoacuten para un total de

15 plantas muestreadas de E hartwegiana

Adicionalmente las bolsas Ziploc fueron marcadas con los datos de colecta en campo y

transportadas a los laboratorios del Programa de Biologiacutea de la Universidad del Quindiacuteo para su

procesamiento

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetales

Las muestras obtenidas fueron lavadas con agua para eliminar el exceso de residuos se

cortaron 4 trozos de cada hoja con un tamantildeo aproximado de 05 a 10 cm (veacutease figura 5) luego

cada trozo de hoja se sometioacute a una esterilizacioacuten la cual se completoacute con algunas modificaciones

acorde al procedimiento descrito por (Osorio et al 2017) especiacutefico para el aislamiento de

30

hongos endoacutefitos que consiste en sumergir perioacutedicamente el material vegetal en etanol al 90

durante un minuto seguido de hipoclorito de sodio (NaClO) al 4 por un minuto continuando

con etanol al 70 durante un minuto y por uacuteltimo se lavaraacuten con agua destilada todo dentro de la

campana de flujo

Las cuatro secciones de hoja se transfirieron a una caja de Petri para un total de 15 cajas

de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA) (una caja de Petri por cada 4 cortes de hoja)

Posteriormente las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente (25degC aproximadamente)

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en medio de

cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelial caja de Petri de 20ml de capacidad

Pasadas 3 semanas se revisaron los cultivos fuacutengicos con el fin de revisar el crecimiento

del micelio y hacer un repique a un cultivo puro una vez maduros se procedioacute a utilizar la teacutecnica

de corte de hifa uacutenica (Osorio et al 2017) esta teacutecnica consistioacute en tomar la punta de la hifa con

ayuda de un estereoscopio y un bisturiacute de grado quiruacutergico agua destilada alcohol al 70 y un

mechero para mantener el bisturiacute esterilizado una vez identificada la hifa ideal para cultivar de

forma pura (veacutease figura 6) con el bisturiacute se procedioacute a cortar el agar PDA en forma de cuadro

con una medida aproximada de 3 miliacutemetros cuadrados

31

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la teacutecnica de

corte de hifa uacutenica

Se esperoacute entre 3 a 5 semanas a que crecieran los cultivos puros aislados de las hifas uacutenicas en

nuevas cajas de Petri con agar PDA

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos endoacutefitos)

Los hongos cultivados de forma pura consiguieron un crecimiento micelial significativo a partir

de los 15 diacuteas a temperatura ambiente como lo demuestra la figura 7 que contiene doce de los

cultivos maacutes representativos con su respectivos micelios aeacutereos desarrollados donde variacutean sus

colores formas y consistencias esto indicando que pertenecen a diferentes especies

2

1

3

32

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de cultivo

Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12) aislados de las

hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

5 Extraccioacuten de ADN

4

5

6

7

8

9

10

11

12

33

Una vez el micelio de los hongos se encontraba desarrollado en la cantidad necesaria se

procedioacute a extraer el ADN genoacutemico siguiendo el protocolo de extraccioacuten de Raeder y Broda

(1985) por medio de un barrido superficial del micelio evitando tomar el agar este micelio

posteriormente se colocoacute en tubos Eppendorf esteacuteriles de 2 ml y se pulverizoacute mediante el uso de

un asa microbioloacutegica y 1ml de buffer de extraccioacuten compuesto de Tris-HCL 1 M pH 78 EDTA

05 M Ph 8 SDS 10 wv NaCL y agua destilada para cada tubo a continuacioacuten se agregoacute 800

ul de etanol al 70 500 ul de fenol y se mezcloacute

Se adicionoacute 300 ul de cloroformo y se mezcloacute de nuevo de alliacute se llevoacute a la centrifuga a

10000 rpm por 60 minutos luego de centrifugar se forma un sobrenadante el cual es transferido

en su totalidad a un nuevo tuvo Eppendorf de 15 ml en el cual se agregaron 400 ul de cloroformo

y se llevoacute a la centrifuga a 10000 rpm por 10 minutos en donde nuevamente se forma un

sobrenadante aunque esta vez solo se toman 500 ul del tubo para ser transferidos otro tubo

Eppendorf de 15 ml ya en el nuevo tubo se adicionaron 50 ul de NaAC y se invirtioacute varias veces

para homogenizar la mezcla a continuacioacuten se guardoacute en el refrigerador a 4degC toda la noche

Al diacutea siguiente se tomaron las muestras en los tubos Eppendorf y se centrifugaron a

10000 rpm por 30 minutos (Formacioacuten del Pellet de ADN) cuando la centrifuga terminoacute se

procedioacute a remover el etanol ya sin etanol se agregoacute de nuevo 1 ml de etanol al 70 a cada tubo

y se centrifugoacute a 10000 rpm por 5 minutos en este paso se removioacute el etanol y se dejoacute secar el

pellet de ADN una vez el etanol se evaporoacute se re suspendioacute el pellet en 100 ul de agua grado

molecular o Sabax con 5 ul de RNAsa con el fin de evitar la presencia de moleacuteculas de ARN

posteriormente se incubaron a 37degC por 30 minutos y se guardaron para su envioacute a -20degC

(Raeder y Broda 1985)

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengica

Una vez se secuenciaron las muestras de ADN enviadas a la Universidad Ruhr de

Bochum Alemania se hizo el ensamblaje de las secuencias en contigs y scaffolds en el

programa CLC Main Workbench 8 (Nicola et al 2013) Como lo muestra la figura 8 donde se

muestran los pasos esenciales de una teacutecnica de Metagenoacutemica donde posteriormente se

analizaron con maacutes detalle mediante teacutecnicas filogeneacuteticas

34

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemico Fuente Thomas y colaboradores (2012)

7 Secuenciamiento

Se extrajoacute con eacutexito un total de 35 muestras de hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

Espeletia hartwegiana (veacutease figura 9) que posteriormente fueron secuenciadas por la

Universidad Ruhr de Bochum (Alemania) logrando un total de 70 secuencias incluyendo

aquellas obtenidas en Genk Bank

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de frailejoacuten

Espeletia hartwegiana

35

8 Anaacutelisis Filogeneacutetico

Se aislaron 35 secuencias basadas en la especie Espeletia hartwegiana fueron

comparadas posteriormente con 35 secuencias de especies publicados en GenBank

(httpblastncbinihgovblastcgi) se obtuvo un total de 70 secuencias Las secuencias de

consenso ITS 58S DNA obtenidas se usaron para realizar buacutesquedas BLAST en GenBank

usando BLASTn (Altschul et al 1990) con el fin de identificar mediante las secuencias aisladas

los geacuteneros o las especies maacutes cercanas La matriz de datos fue alineada en MAFFT v7 (Katoh y

Standley 2013) Se utilizaron las especies Coprinellus xanthothrix y Coprinellus domesticus

como grupos externos

Los anaacutelisis de las secuencias para construir los arboles filogeneacuteticos de Maacutexima

Parsimonia (MP) fueron realizados usando PAUP v40b10 (Swofford 2003) Para el anaacutelisis de

Maacutexima Verosimilitud o ML por sus siglas en ingleacutes (Maximum Likelihood) se utilizoacute

JmodelTest (Darriba et al 2012) con el cual se infirieron los criterios del modelo de sustitucioacuten

apropiado utilizando los criterios de informacioacuten de Akaike (AIC) (Akaike 1974)

Los anaacutelisis de ML se realizaron con el programa PhyML v 30 (Guindon y Gascuel

2003) teniendo en cuenta la proporcioacuten de sitios invariables Los valores de soporte de confianza

para los nodos se estimaron mediante 1000 anaacutelisis de arranque de replicacioacuten La alineacioacuten de

los datos de la secuencias de ITS para 70 aislamientos determinoacute quince geacuteneros siendo los

siguientes Annulohypoxylon Biscogniauxia Colletotrichum Crassiparies Cryptocoryneum

Cyphellophora Diaporthe Daldinia Humiacutecola Hypoxylon Hypocrea Nemania Nigrospora

Massarina y Trichoderma de los cuales se obtuvieron 11 clados principales (veacutease figura 10)

Con base en estos resultados todos los aislamientos se analizaron maacutes a fondo dentro de los

geacuteneros hasta llegar a especie (veacutease tabla 1)

36

Geacuteneros Especie Especie Especie Especie Especie Especie Especie

Annulohypoxylon A nitens A bahnphaden

gense

Biscogniauxia B petrensis

Colletotrichum C gloeosporioides

C gigasporum

Cyphellophora C

reptans

Crassiparies C quadrisporus

Cryptocoryneum C

longicondensatum

Daldinia D dennisii D

eschscholtzi

D

conceacutentri

ca

Diaporthe D

longicolla

D

foeniculina

D

anacardi

i

D

macada

miae

Humiacutecola H

fuscoatra

Hypoxylon H

trugodes

H

pulicicidum

Hypocrea H

koningii

Massarina M albocarnis

Nemania N

primolutea

Nigrospora N sacchari N rubi N sphaeric

a

N hainanen

sis

N oryzae

N gorlenko

ana

N aurantia

ca

Trichoderma T trixiae T

olivascens

T

paraviridescens

T

viridescens

T

samuelsii

T viride

Grupo Externo Coprinellus C

domesticus

C

xanthothrix

Tabla 1 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos endoacutefitos en la

especie Espeletia hartwegiana

37

38

Figura 10 Filograma consenso obtenido con el programa MEGA ndashX a partir del anaacutelisis ML y MP del

conjunto de datos ITS Aislados de las hojas de frailejoacuten Los coacutedigos en Verde son las secuencias que se

aislaron (aislados) en este estudio los coacutedigos y nombres en Negro son las secuencias encontradas por

identidad en GenBank Los valores de soporte de bootstrapgt 70 se indican cerca de los nodos como MP

ML = valores de soporte de bootstrap lt70

El nuacutemero de caracteres los modelos de sustitucioacuten usada asiacute como otros resultados

estadiacutesticos de las pruebas de Maacutexima Parsimonia y Maacutexima Verosimilitud generados a partir de

los anaacutelisis filogeneacuteticos de los conjuntos de datos se muestran en los anexos

39

Capiacutetulo Tercero

Discusioacuten sobre los hongos endofitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicas

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidad de Endoacutefitos

Tanto la temperatura la estacionalidad y los tipos de precipitacioacuten son factores de vital

importancia para la composicioacuten de las diferentes comunidades y la arquitectura vegetal Estos

factores limitan muchos de los procesos ecosisteacutemicos ya que existe una estrecha relacioacuten entre

las variaciones climaacuteticas y las variaciones dentro de los ecosistemas Por lo tanto se espera que

el cambio climaacutetico transforme los ecosistemas Andinos tal como los conocemos hoy (Colwell et

al 2008) modificando las relaciones mutualistas entre plantas y hospederos

Posiblemente la resiliencia y resistencia de muchos ecosistemas como el paacuteramo sean

superadas en este siglo por una combinacioacuten sin precedentes de disturbios tales como el cambio

climaacutetico perturbaciones asociadas a este (sequiacuteas fuegos invasioacuten de especies exoacuteticas

inundaciones) y otros factores como organismos oportunistas (hongos endoacutefitos) cambios en el

uso del suelo contaminacioacuten y sobreexplotacioacuten de recursos (IPCC 2020)

Considerando que el frailejoacuten Espeletia hartwegiana es una especie de alta montantildea

(paacuteramos) endeacutemica de la cordillera Central de los Andes (Schultz y Carl 1856) se encuentra

dentro de los ecosistemas andinos en donde a su vez se ha comprobado la existencia de los

hongos endoacutefitos es de tener en cuenta el papel de estos organismos endoacutefitos ya que los

paacuteramos son ecosistemas particularmente sensibles a los efectos adversos del cambio climaacutetico

en especial al calentamiento global al estar ubicados en los troacutepicos generando asiacute ventanas de

40

oportunidades para que los hongos endoacutefitos alteren su estado mutualista y pasen a ser

patogeacutenicos (Colwell et al 2008 7)

No obstante existe consenso en que las temperaturas aumentaraacuten especiacuteficamente a

grandes alturas y que la precipitacioacuten posiblemente se incrementaraacute en algunas zonas disminuiraacute

en otras y se produciraacute en patrones estacionales alterados con mayor intensidad y frecuencia

(Marengo et al 2009)

Los frailejones se ven en constante estreacutes por el uso del suelo dado en los paacuteramos como

es el caso del paacuteramo Romerales un paacuteramo que se ha visto afectado por las quemas y la

ganaderiacutea (Molinillo y Monasterio 2001) Esto aumenta asiacute las condiciones de estreacutes intriacutensecas a

las que estaacuten expuestas estas plantas de paacuteramo las cuales suministran valiosos bienes y servicios

ecosisteacutemicos como el abastecimiento continuo de agua para usos domeacutesticos agriacutecolas e

industriales (Buytaert et al 2006 4) servicios que se podriacutean ver en decrecimiento si las

ventanas de oportunidades se abren con maacutes frecuencia dando pie al cambio de estado de los

hongos endoacutefitos que existen dentro de los frailejones de la zona

En los paacuteramos de Chingaza Rabanal Guerrero Iguaque Merchaacuten y Sumapaz se han

realizado estudios de aislamientos de hongos en especies de frailejoacuten diferentes a la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana tales como Espeletia argentea Espeletia arbelaezii Espeletia

boyacensis Espeletia grandiflora Espeletia miradorensis y Espeletia uribei por ende se ha

reportado la presencia de hongos endoacutefitos y fitopatoacutegenos (Tabla 2) (Gaitan 2018 17)

Frailejones Espeletia

argentea

Espeletia

arbelaezii

Espeletia

boyacensis

Espeletia

grandiflora

Espeletia

miradorensis

Espeletia

uribei

Aspergillus X X X X

Annulohypoxylon X X X

Curvularia X X X

Epicoccum X X X

Fusarium X X X

41

Tabla 2 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = a presencia del genero de

hongo dentro de la especie de frailejoacuten

Los geacuteneros de hongos en rojo son los geacuteneros que se encontraron en comuacuten con los

geacuteneros hallados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana de un total de 15 geacuteneros 3

han sido reportados anteriormente en estudios similares ( 20 de geacuteneros identificados)

Dentro de un marco de cambio climaacutetico es importante la metodologiacutea de muestreo

como lo fue el formato de muestreo en puntos aleatorios realizado en el presente estudio se llevoacute

acabo principalmente por la homogeneidad de los frailejones en el paacuteramo como lo indica el

manual de meacutetodos baacutesicos de muestreo y anaacutelisis de ecologiacutea vegetal (BOLFOR 2000 9) donde

se menciona que el muestreo aleatorio se utiliza cuando se dispone de poca informacioacuten previa de

las caracteriacutesticas de las poblaciones a medirse en este caso la poblacioacuten a identificarse fueron

los hongos endoacutefitos que se hallaban dentro de las formaciones homogeacuteneas de los frailejones

No obstante el muestreo aleatorio tambieacuten presenta limitaciones a la hora de comparar los

hongos endoacutefitos a lo largo del gradiente altitudinal (muestreo aleatorio estratificado) dejando de

percibir informacioacuten proveniente de los distintos microclimas que se encuentran y de las

incidencias que podriacutean causar a la hora de identificar los geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten ademaacutes de posibles micro efectos del cambio climaacutetico a lo

largo del gradiente altitudinal (Caacutemara et al 2008)

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio Climaacutetico

Nigrospora X X X X X

Penicillium X X X

Pleospora X X X X

Trichoderma X X X X

42

Las teacutecnicas empleadas en este estudio para lograr aislar e identificar los hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana se hacen importantes dentro del cambio

climaacutetico debido a que el margen de error en la identificacioacuten molecular es reducido (Bakermans

et al 2014) Al ser reducido el margen de error se pudo conocer con mayor certeza que especies

y geacuteneros de hongos endoacutefitos se encuentra dentro de la planta

Al conocer sus identidades es posible conocer las capacidades que tienen cada una de

estas especies de hongos endoacutefitos de producir metabolitos secundarios de infiltrarse y proteger

los tejidos de la planta de condiciones bioacuteticas y abioacuteticas competir contra herbiacutevoros y

fitopatoacutegenos (Schulz et al 2002) Con sus capacidades reconocidas es posible vincular los

efectos del cambio climaacutetico como estreacutes hiacutedrico aumento de la temperatura migraciones

tempranas enfermedades emergentes aumentos de la precipitacioacuten y heladas severas con las

reacciones por parte de los hongos endoacutefitos Estas reacciones podriacutean desencadenar aumentos de

la patogenicidad en las poblaciones de frailejones debido a los constantes disturbios y estreacutes al

que se ve sometido la planta generando asiacute notables declives poblacionales (Mendoza 2010)

Las relaciones filogeneacuteticas entre las especies halladas toman relevancia debido a las

sinergias positivas o negativas que se pueden presentar dependiendo de las especies que se

encuentren asociadas dentro de la planta (Lamichhane y Venturi 2015) como por ejemplo

Nigrospora y Colletotrichum pueden activar una sinergia negativa aumentando la virulencia y

afectando la especie Espeletia hartwegiana

Las especies de hongos endoacutefitos se identificaron por medio de secuencias obtenidas de

las regiones ITS (regioacuten de espaciadores internos transcritos) las cuales son regiones altamente

conservadas con tasas de evolucioacuten muy lentas en el tiempo permitiendo hacer inferencias

filogeneacuteticas (Baldwin et al 1995 Hamby y Zimmer 1992) es por ello que se usaron para

generar las diferentes identificaciones de los hongos endoacutefitos logrando asiacute identificar al geacutenero

Nigrospora con un total de 7 especies N sacchari N rubi N sphaerica N hainanensis N

gorlenkoana N oryzae y N aurantiaca pertenecientes a la familia Apiosporaceae orden

Xylariales Divisioacuten Ascomicota (veacutease figura 11) (Wang et al 2017)

Dentro del marco del cambio climaacutetico Nigrospora se caracteriza por poseer una

distribucioacuten cosmopolita y una amplia gama de hueacutespedes como lo es en este caso la especie E

hartwegiana que habita en los Andes Tropicales que se veraacuten alterados por los efectos del

cambio climaacutetico este geacutenero se ha logrado aislar en su forma endoacutefita en tallos y hojas de

43

diversas plantas tambieacuten como saprofitos en detritos hojarasca y larvas muertas (Uzor et al

2015 1)

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

Los hongos endoacutefitos hallados en esta investigacioacuten se encontraron dentro de la especie

de frailejoacuten E hartwegiana la cual pertenece a los Andes Tropicales ubicados maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos Estos ecosistemas son sensibles a los efectos del cambio

climaacutetico por su altura su alto endemismo y su sensibilidad al efecto de borde Cuando las

especies lentildeosas empiecen a migrar a lo largo del gradiente altitudinal es posible que los

frailejones se encuentren con suelos agrestes en donde sus semillas no podraacuten fijarse y los efectos

adversos de hongos como Nigrospora N oryzae y N sphaerica seraacuten maacutes notables

aprovechando las ventanas de oportunidad que generen los desbalances climaacuteticos (Sharma et al

2013)

Los cambios en los patrones climaacuteticos potenciaran la especie N sphaerica dentro del

frailejoacuten la cual tiene la capacidad de causar tizoacuten foliar en la especie Camellia sinensis siendo

una planta de teacute perteneciente a la divisioacuten de las magnolifiotas como el geacutenero Espeletia (Liu et

al 2015) Nigrospora fue el geacutenero maacutes ampliamente aislado en las identificaciones generadas a

partir de las hojas de frailejoacuten esto se veriacutea explicado debido a que N sphaerica tiene un

mecanismo de descarga de esporas efectivo que puede proyectar a la fuerza sus esporas a una

distancia de hasta 2 cm en vertical y 68 cm en horizontal como lo demostroacute Webster (1952)

ademaacutes el estudio de Wu y colaboradores (2004) tambieacuten evidencioacute que las esporas de

44

Nigrospora son uno de los grupos maacutes dominantes en la atmoacutesfera y estaacuten asociadas con

tormentas de polvo

La gran capacidad colonizadora del geacutenero Nigrospora le permite adaptarse a las

condiciones climaacuteticas cambiantes con la estrategia de dispersioacuten de sus esporas logrando

distanciarse del frailejoacuten hospedero para encontrar nuevos hospederos producto de las

migraciones tempranas a lo largo del gradiente altitudinal (Riveros 2010)

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

por encima del 80 lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen menos

mutaciones en los nodos internos del aacuterbol basados en la distribucioacuten de probabilidad asignadas

a los posibles arboles resultantes dando lugar a una hipoacutetesis evolutiva maacutes confiable (Schmidt y

Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 es decir el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes

corto (menos cambios) y el cual se ajusta mejor a los datos (Swofford 1997)

Teniendo asiacute una inferencia filogeneacuteticamente robusta los geacuteneros Collectotrichum y

Nigrospora pertenecen a la Divisioacuten Ascomycota ambos geacuteneros son particularmente agresivos

con las plantas en especial la especie Colletotrichum gloeosporioides la cual es la fase asexual

de Glomerella cingulata (Raj et al 2013) Se caracteriza por tener un amplio rango de

hospederos entre ellos el frailejoacuten a los cuales les causa una enfermedad conocida pudricioacuten

amarga antracnosis o chancros siendo esta la necrosis de frutos flores nervios y tallos

(Gonzaacutelez et al 2006 4)

Uno de los primeros reportes de afectaciones a especies de frailejoacuten se obtuvo en el 2009

en el Parque Natural Nacional Chingaza Colombia en donde encontraron las especies de

frailejoacuten Espeletia grandiflora y Espeletia uribei afectadas debido a insectos y una especie de

hongo del genero Colletotrichum (Medina 2009- 9 Hartung y Burton 1981)

Por ende que estos dos geacuteneros de hongos se encuentren juntos podriacutea tener

implicaciones en el aumento de virulencia potenciado a su vez por los desbalances abioacuteticos

causados por el cambio climaacutetico como lo han mencionado Belisario y colaboradores (2002) es

posible que las afectaciones no sean producidas por un uacutenico hongo si no por un complejo de

varios generando sinergismos entre diferentes especies que solas no hariacutean dantildeo a la planta pero

juntas podriacutean ser causantes de enfermedad (Lamichhane y Venturi 2015 4) aun mas en un

45

marco de cambio climaacutetico que gradualmente aumenta sus efectos nocivos sobre los paacuteramos

aumentando la temperatura cambios en la precipitacioacuten heladas intensas cambios en la

nubosidad mayor exposicioacuten a la radiacioacuten solar teniendo por resultado un iacutendice de estreacutes

mayor en las plantas de paacuteramo generando ventanas de oportunidades para que los hongos

endoacutefitos modifiquen sus roles de protector a patoacutegeno

En frailejones tambieacuten se ha reportado la presencia de Nigrospora y Trichoderma por

Bonilla y Argenis (2005) maacutes especiacuteficamente en la especie Espeletia grandiflora la cual es una

especie que habita en los paacuteramos de Colombia Ecuador y Venezuela en conjunto con Espeletia

hartwegiana (Luteyn 1999 3) El hecho que existan estos dos geacuteneros presentes en los frailejones

advierte de un equilibrio entre hongos endoacutefitos que se puede romper bajo las tensiones del

cambiante clima maacutes aun en los sensibles paacuteramos alto andinos

En cuanto a N sacchari se tiene reporte que es un productor de metabolitos con una

notable actividad herbicida demostrado en plantas cultivadas en invernadero (Fukushima et al

1998 2) debido a que existe evidencia que sugiere que los hongos endoacutefitos han evolucionado

directamente de hongos patoacutegenos (Schulz et al 1999 4) sumado al estreacutes del cambio climaacutetico

en cualquier momento de extrema tensioacuten hiacutedrica caloacuterica o heladas en estos ecosistemas de alta

montantildea Estos anomaliacuteas ambientales podriacutea disparar mecanismos de accioacuten fitopatoacutegenos

dentro de los frailejones generando un declive notable en sus poblaciones y por ende un declive

de la cantidad recurso hiacutedrico aguas abajo y su regulacioacuten (Diacuteaz et al 2002 5)

Como se mencionoacute anteriormente los medios de propagacioacuten de estos hongos endoacutefitos

pueden ser por medio de esporas que estaacuten en el ambiente aunque tambieacuten los vectores que

juegan un rol clave en su dispersioacuten son los insectos ya que estos pueden transportar esporas o

partes del hongo en su cuerpo patas o aparato bucal (Eigenbrode et al 2018 5)

Considerando la dispersioacuten homogeacutenea de los frailejones dentro del paacuteramo la carga

esporas en el ambiente y la herbivoriacutea de insectos es probable que se puedan ver infectados la

mayoriacutea de individuos (Varela 2016) es por ello que en el futuro puede que las afectaciones en

frailejones no sean producidas por hongos fitopatoacutegenos si no por hongos endoacutefitos que tuvieron

la ventana de oportunidad gracias al cambio climaacutetico aumento de la temperatura aumento en

las concentraciones de CO2 y alteraciones de precipitacioacuten que pueden hacer susceptible la planta

al ataque de estos hongos (Chakraborty 2011 Elad y Pertot 2014)

46

Para que se genere la enfermedad esta depende de la interaccioacuten de tres o cuatro factores

1) hospedero susceptible 2) agente causal (virulento) 3) condiciones ambientales favorables y 4)

tiempo (Francl 2001 2) la falta de alguno de ellos no permite que el patoacutegeno produzca la

enfermedad en la planta debido a ello algunas especies de frailejoacuten pueden tener una o dos cepas

que puedan actuar como fitopatoacutegenos pero no estaacuten activas si no estaacute completa su asociacioacuten

con otro patoacutegeno u otro factor

Ademaacutes existe un estudio que evaluoacute el efecto de la temperatura sobre la capacidad de

Fusarium verticillioides para generar infeccioacuten en plantas de maiacutez se probaron bajo 3 escenarios

de temperatura como resultados obtuvieron que la enfermedad de este hongo se veiacutea potenciada

por el aumento de temperatura en temperaturas por encima de 35degC (Murillo et al 2008) este

estudio da soporte a la hipoacutetesis de que existen factores que influyen significativamente a la

infeccioacuten en la planta tal vez el paacuteramo difiacutecilmente alcance 35degC no obstante la mayoriacutea de

especies son sensibles a cambios de temperatura de hasta de 1degC en donde modifican su

comportamiento rutas metaboacutelicas interacciones ecoloacutegicas y por ende sus defensas se ven

alteradas

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e Hypocrea

El geacutenero Trichoderma con seis especies diferentes (veacutease figura 12) fue el segundo

geacutenero maacutes numeroso despueacutes de Nigrospora que contoacute con siete especies aunque las primeras

especies que se analizaron fueron especies que principalmente actuaban generando enfermedades

en las plantas en las que se encontraban ante disturbios el geacutenero Trichoderma pertenece a la

47

familia Hypocreaceae y se caracteriza por tener una gran capacidad biocontroladora sobre

fitopatoacutegenos como Fusarium oxysporum los cuales podriacutean llegar masivamente con las

migraciones tempranas de insectos y plantas lentildeosas (Miles et al 2012 7)

No solo actuacutean repeliendo patoacutegenos internos si no tambieacuten patoacutegenos externos como

insectos que desean consumir u aprovechar la planta ya que estos pueden secretar diferentes

metabolitos secundarios y enzimas que actuacutean inhibiendo su desarrollo (Boughalleb-M et al

2018 8)

Es bien conocido que el geacutenero Trichoderma produce amplio rango de sustancias

antibioacuteticas ademaacutes de poseer la caracteriacutestica de parasitar otros hongos (Howell 2002 6)

Debido a la competencia que generan las especies del genero Trichoderma por espacio y

nutrientes inhiben o degradan pectinasas y otras enzimas que son esenciales para que los hongos

fitopatoacutegenos como Botrytis cinerea penetre en la superficie de las hojas logrando proteger de

esta forma al frailejoacuten que se veraacute expuesto a nuevas amenazas microbioloacutegicas auspiciadas por

los cambios en los patrones climaacutetico (Zimand et al 1996)

Ademaacutes de la capacidad del Trichoderma sp para atacar o inhibir el crecimiento de

patoacutegenos de plantas directamente descubrimientos recientes indican que tambieacuten pueden inducir

resistencia sisteacutemica y localizada a una variedad de patoacutegenos de plantas tales como el frijol es

protegido por Trichoderma harzianum de especies fitopatoacutegenas como Colletotrichum

lindemuthianum Botrytis cineacuterea las cuales producen lesiones en las hojas de la planta (Harman

y Howell 2004) Incluso se descubrioacute que ciertas especies de Trichoderma tienen una influencia

sustancial en el buen crecimiento y desarrollo de las plantas sin y con condiciones de estreacutes

climaacutetico (Lorito 1998)

Como lo demostraron Bonilla y Argenis (2005) en su estudio llevado a cabo en el

frailejoacuten Espeletia grandiflora diferentes cepas pertenecientes a Trichoderma pueden proteger

esta especie de paacuteramo de organismos fitopatoacutegenos emergentes por el cambio climaacutetico por

ende si puede proteger a E grandiflora tambieacuten puede proteger la especie E hartwegiana lo

que le permitiraacute sobrellevar diferentes ataques fortuitos de patoacutegenos e insectos que nunca han

logrado alcanzar las altitudes de paacuteramo (3200 - 5000 m)

Cuando el cambio climaacutetico aumente la temperatura en 1degC o 2degC traeraacute consigo sus

efectos de modificacioacuten en cuanto a la estructura y composicioacuten de las especies de plantas que

48

existen en zonas altas para este escenario basado en los caacutelculos de Thuiller (2007) las especies

se habriacutean desplazado en el gradiente altitudinal aproximadamente 450 metros para el antildeo 2070

Las consecuencias de este desplazamiento serian uacutenicas debido a que gran cantidad de

insectos y patoacutegenos tendriacutean migraciones tempranas en el gradiente altitudinal en buacutesqueda de

su optimo teacutermico llevando a cabo un proceso conocido como Termofilizacioacuten (Cuesta et al

2019) es ahiacute donde entra en juego la proteccioacuten que le pueden brindar especies endoacutefitos como

las que pertenecen al geacutenero Trichoderma en el marco de cambio climaacutetico

En concordancia con las cepas de Trichoderma y el geacutenero Hypocrea que tambieacuten

pertenece a la familia Hypocreaceae se conocen maacutes de 700 secuencias de peptaiboles (peacuteptidos

bioloacutegicamente activos) de ambos geacuteneros donde algunos de eacutestos son ecoloacutegica y

comercialmente relevantes debido a su potencial antimicrobiano actividad enzimaacutetica uacutetil para

competir por espacio y alimento de los nuevos patoacutegenos emergentes procedentes de las

alteraciones climaacuteticas y las migraciones tempranas (Degenkolb et al 2008 6)

En cuanto al geacutenero Hypocrea tambieacuten se ha reportado actividad antimicrobiana y anti

fuacutengica contra Staphylococcus aureus y Fusarium oxysporum (Gogoi et al 2008 2) habitando

los geacuteneros Trichoderma e Hypocrea dentro de especies de frailejoacuten como E hartwegiana se

espera que puedan generar sinergias de proteccioacuten que las ayude a combatir los fuertes y

extremos eventos climaacuteticos

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

del 100 (veacutease figura 13) lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen

menos mutaciones en los nodos internos del aacuterbol por ende este aacuterbol contiene la menor

cantidad de mutaciones o cambios dentro sus nodos internos teniendo como resultado una

hipoacutetesis evolutiva confiable (Schmidt y Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 que

indica que el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes corto (menos cambios) y el cual se ajusta

mejor a los datos (Swofford 1997)

49

El geacutenero Annulohypoxylon es de importancia dentro del marco del cambio climaacutetico ya

que pertenece a la familia Xylariaceae y se caracteriza por poseer metabolitos secundarios

antitumorales-citotoacutexicos como la anuloescuamulina que ayudan a combatir el estreacutes abioacutetico

(Cheng et al 2012) estas cepas de hongos son principalmente saprofitos y oportunistas han sido

reportadas en hojas sanas y afectadas de frailejones en otros estudios (Gonzaacutelez 2012 Nonsoque

2012) siendo un geacutenero resiliente a las perturbaciones ambientales como los cambios en los

patrones climaacuteticos su relacioacuten como mutualista dentro del frailejoacuten se mantendraacute hasta que el

frailejoacuten se adapte o colapse ante el estreacutes abioacutetico

Aunque no se conocen como fitopatoacutegenos al contrario pueden actuar como mutualistas

no se descarta que puedan estar involucrados en el desarrollo de diferentes enfermedades en

plantas cuando las condiciones ecosistemicas se alteran a puntos extremos (Gonzalez et al 2017)

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon Biscogniauxia

Nemania y Humiacutecola

El geacutenero Daldinia posee unos valores de MPML correspondientes a 10094 con lo cual

se encuentra bien soportado estadiacutesticamente el geacutenero Daldinia se encuentra ubicado en la

familia Xylariaceae al igual que el geacutenero Hypoxylon Biscogniauxia y Nemania que en su

respectivo orden contienen un soporte estadiacutestico MPML de 10082 10099 y 100100 (veacutease

figura 14) los cuales pertenecen a la divisioacuten Ascomycota las cepas de Daldinia se caracterizan

principalmente por ser especies endoacutefitas teniendo la capacidad de estar dentro de su hueacutesped

mucho tiempo sin causarle dantildeo o al menos un dantildeo evidente por medio de su estado asexual

50

No obstante su estado se puede modificar cuando las condiciones externas se modifican

abruptamente en poco tiempo como es el caso de las alteraciones en la temperatura

precipitacioacuten y concentraciones de dioacutexido de carbono (CO2) auspiciados por el cambio

climaacutetico (Saacutenchez et al 2013)

Un estudio realizado por Prieto (2017) en la especie de frailejoacuten E grandiflora encontroacute

que la especie Daldinia eschscholtzii estaba asociado en el siacutentoma de clorosis (falta de clorofila

en las hojas) Tambieacuten se reportoacute que especies de Daldinia como Daldinia conceacutentrica tienen la

capacidad de controlar nematodos fitopatoacutegenos (Silva et al 2020 104) los cuales pueden invadir

y romper los tejidos de la planta dantildeando sus estructuras los nematodos tambieacuten seraacuten sujetos a

migraciones tempranas por el cambio climaacutetico que trae consigo presiones de seleccioacuten por ende

nuevas amenazas para los frailejones (Nakashima et al 2007)

Como hemos visto hasta este punto las especies de hongos endoacutefitos se muestran en

muchos casos como benefactores y protectores de las diferentes plantas en las que habitan

incluyendo diferentes especies de frailejones

Los hongos endoacutefitos protegen tanto de factores bioacuteticos como virus hongos

fitopatoacutegenos bacterias insectos y factores abioacuteticos como las intemperancias del clima no

obstante en su relacioacuten endoacutefita geacuteneros como Hypoxylon que pertenece igual que Daldinia a la

familia Xylariaceae pueden tener roles amenazadores en conjunto con el cambio climaacutetico

seguacuten Gonzales y colaboradores (2019) inocularon cepas pertenecientes al geacutenero Hypoxylon en

hojas de Theobroma cacao y encontraron que en 48 horas se comenzoacute a notar las marcas de

clorosis y deshidratacioacuten foliar esto demuestra que cepas de este geacutenero pueden tener efectos

fitopatoacutegenos ocasionando muerte descendente pudricioacuten del tronco negro y resinosis de ramas

de mezquite (De la Torre-Almaraacutez et al 2003 De la Torre-Almaraacutez et al 2009)

La presencia de este geacutenero dentro del frailejoacuten en un marco del cambio climaacutetico lo

convierte en una amenaza latente ya que las condiciones seraacuten cada vez maacutes agrestes en los

paacuteramos de los Andes Tropicales Puede favorecer el desarrollo de este geacutenero que tiene las

enzimas necesarias para producir la pudricioacuten del tronco negro entre otras enfermedades

relevantes

51

Tambieacuten las especies del geacutenero Hypoxylon se han reportado como endoacutefitos en tejidos de

plantas lentildeosas o herbaacuteceas (Petrini y Petrini 1985 3) asiacute como saprofitos o fitopatoacutegenos

deacutebiles en madera de aacuterboles de zonas templadas o tropicales (Miller 1961) como lo menciona

Miller (1961)

Los geacuteneros Biscogniauxia Nemania tambieacuten estaacuten dentro de la familia Xylariaceae y

Divisioacuten Ascomycota un aspecto interesante de las especies de Biscogniauxia es que son

paraacutesitos exclusivos de las angiospermas dicotiledoacuteneas en donde concluyeron que todas las

especies pertenecientes a este geacutenero son patoacutegenos umllevesuml que se aprovechan de situaciones de

sequiacutea y estreacutes hiacutedrico para aumentar su patogenicidad (Ju et al 1998)

La especie de frailejoacuten E hartwegiana es una Dicotiledoacutenea eso explica porque

podemos encontrar esta especie de hongo endoacutefito en el frailejoacuten del presente estudio siendo de

vital importancia denotar que las especies de Biscogniauxia se aprovechan especialmente de las

situacioacuten de sequiacutea y estreacutes hiacutedrico difiacutecilmente las especies de este geacutenero podriacutean afectar a los

frailejones debido a que se caracterizan por ser reguladores de los ciclos hiacutedricos el agua es el

recurso que maacutes tiende a existir en un paacuteramo por la estructura de sus suelos compuesta por

andosoles porosos y necromasa acumulada teniendo asiacute un alto iacutendice de retencioacuten hiacutedrica

(Hernandez y Muntildeoz 2015) de modo que el cambio climaacutetico no favorece al geacutenero

Biscogniauxia en su estado patogeacutenico dentro del ecosistema de paacuteramo

En cuanto al geacutenero Nemania Da Silva y colaboradores (2018) llevaron a cabo una

investigacioacuten en la cual identificaron cepas pertenecientes a los geacuteneros Colletotrichum

Phyllosticta Xylaria Nemania y Alternaria en la especie ornamental Pachystachys lutea en

donde las mismas cepas fueron ensayadas para inhibir el crecimiento de hongos fitopatoacutegenos

como Colletotrichum sp en donde encontraron que Nemania era capaz de inhibir por medio de la

secrecioacuten de distintas enzimas el crecimiento de dichas especies gracias a su actividad

enzimaacutetica el geacutenero Nemania puede compensar los desequilibrios causados por el cambio

climaacutetico en teacuterminos de hongos fitopatoacutegenos

Hay que tener en cuenta que los elementos que dan forma a las interacciones planta-

endoacutefito incluyen el modo de transmisioacuten el patroacuten de infeccioacuten la edad de la planta las

condiciones ambientales potenciadas por el cambio climaacutetico y los antecedentes geneacuteticos (Aly et

al 2011 6) Los frailejones de la especie E hartwegiana que se muestrearon para el estudio se

52

tomoacute las hojas sanas lo que indica que poseiacutean estas cepas de endoacutefitos en equilibrio siendo este

uno de los pocos reportes de este geacutenero en especies de alta montantildea en los Andes Tropicales

El geacutenero Humiacutecola se encuentra soportado por un MPML de 10076 siendo una

hipoacutetesis evolutiva considerable es el uacutenico de la figura 14 que no estaacute dentro de la familia

Xylariaceae ya que pertenece a la familia Chaetomiaceae aunque se halla en la divisioacuten

Ascomycota se podriacutea considerar a la especie Humiacutecola fuscoatra como una de las especies de

endoacutefitos maacutes umlinofensivasuml debido a trabajos de investigacioacuten reportados como el de Menzies y

colaboradores (1998) y el de Naik y colaboradores (2009)

Humiacutecola fuscoatra no se considera un peligro latente para la especie E hartwegiana ya

que existe en equilibrio con su entorno Estaacute comprobado por medio de caracterizaciones

quiacutemicas que Humiacutecola fuscoatra es un importante productor de moleacuteculas de estimacioacuten

medica como el resorciacuteclico y lactonas aacutecidas (Mejia et al 2014) Por lo tanto es una especie

prometedora con un reservorio de metabolitos secundarios de importancia medicinal e industrial

que de seguir los efectos nocivos del cambio climaacutetico en los Andes Tropicales maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos esta especie podriacutea desaparecer

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies Massarina

Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

Uno de los grupos mejores soportados en este cladograma es el grupo de Diaporthe en el

cual se encontraron cuatro especies siendo uno con maacutes abundancia de especies del estudio y que

posee un MPML de 10085 10089 y 10095 acorde a sus 3 nodos (veacutease figura 15) teniendo asiacute

una hipoacutetesis evolutiva confiable de estas relaciones las especies de Diaporthe pertenecen a la

familia Diaporthaceae de la divisioacuten Ascomycota y son especies de endoacutefitos que se distinguen

por inhibir el crecimiento de hongos patoacutegenos en el hospedero que se encuentren El estudio de

53

Da Silva y colaboradores (2018) mostroacute que cepas de Diaporthe sp Inhibieron el crecimiento de

Fusarium oxysporum y Colletotrichum sp hongos fitopatoacutegenos que aumentaran su presencia

aprovechando las alteraciones producidas por el cambio climaacutetico en los paacuteramos

Las especies de este geacutenero estaacuten en continuo cambio entre endoacutefitos y patoacutegenos

funcionando en la mayoriacutea de los casos en una relacioacuten mutualista en donde le brindan a la planta

mayor tolerancia a las sequias proteccioacuten de patoacutegenos y pestes caracteriacutestica uacutetil frente a los

retos ecoloacutegicos que plantea el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales (Hubbard et al 2014)

se conocen cerca de 800 especies de este geacutenero asociadas a una amplia gama de plantas

vasculares a nivel mundial (Rossman et al 2015)

Esto explica porque las especies de Diaporthe fueron una de las maacutes numerosas

encontradas en la especie de alta montantildea E hartwegiana teniendo en cuenta que esta especie

pasa raacutepidamente de un estado endoacutefito a un estado patogeacutenico y dada su faacutecil y alta distribucioacuten

representa un peligro en conjunto con el cambio climaacutetico para las especies de alta montantildea como

los frailejones y supone una amenaza para el balance hiacutedrico y ecosistemico en el futuro

El geacutenero Crassiparies de la familia Neohendersoniaceae y el geacutenero Massarina de la

familia Massarinaceae pertenecen al orden Pleosporales aunque se discute debido a las

similaridades morfoloacutegicas y genoacutemicas con Massarina si Crassiparies deberiacutea estar en la

familia Massarinaceae (Hyde et al 2013 4) Se tiene poca informacioacuten sobre la especie

Crassiparies quadrisporus por ende este puede ser uno de los primeros reportes de esta especie

en una especie de alta montantildea como lo es el frailejoacuten especiacuteficamente en la especie E

hartwegiana en un marco de cambio climaacutetico el geacutenero Crassiparies necesita mayores estudios

a nivel ecoloacutegico y microbioloacutegico para entender su papel dentro de esta crisis climaacutetica

Mientras tanto el geacutenero Massarina ha logrado ser aislado de agua dulce con el fin de

obtener fuentes de productos naturales bioloacutegicamente activos por medio de las investigaciones

quiacutemicas de Shearer (1999 2001) en una especie de Massarina obtuvieron como resultado el

aislamiento de tres nuevos sequiterpenoides y dos lactonas derivadas de policeacutetidos con nuevos

sistemas de anillos lo que indica que esta especie tambieacuten puede tener un rol importante

mediante la produccioacuten de enzimas y metabolitos secundarios en el marco de las invasiones

bioloacutegicas impulsadas por el cambio climaacutetico

54

El geacutenero Cryptocoryneum de la familia Cryptocoryneaceae existe poca informacioacuten de

sus mecanismos de accioacuten como endoacutefito o patoacutegeno maacutes aun en especies de los Andes

Tropicales este podriacutea ser uno de los primeros reportes sobre esta especie de hongo en una

especie de frailejoacuten especiacuteficamente E hartwegiana en el 2015 se reportoacute en Brasil el

descubrimiento de una nueva especie del genero Cryptocoryneum trataacutendose de Cryptocoryneum

parvulum hallada en las hojas de la especie Araucaria angustifolia (Gimnosperma) (Silva et al

2015 1) la informacioacuten sobre el geacutenero Cryptocoryneum en relacioacuten al cambio climaacutetico y sus

efectos dentro de especies de alta montantildea como el frailejoacuten auacuten son poco conocidas

Uno de los geacuteneros maacutes cercanos a los grupos externos del cladograma es Cyphellophora

perteneciente a la familia Cyphellophoraceae el cual posee un MPML de 10091 logrando una

hipoacutetesis evolutiva confiable Diversas especies de Cyphellophora han logrado ser aisladas de

infecciones superficiales de la piel o las untildeas en humanos y de materiales vegetales (Decock et

al 2003 Cheewangkoon et al 2009) Esto indica su amplia distribucioacuten y su capacidad para ser

patogeacutenica tanto en plantas como en animales maacutes aun en condiciones desfavorables para la

planta como son las condiciones de cambio climaacutetico

De la especie Cyphellophora reptans se tiene reporte que su morfologiacutea es muy similar a

la de una levadura por lo que es faacutecilmente confundida con una (Reacuteblovaacute et al 2013) Es posible

que este sea el uacutenico reporte de Cyphellophora reptans en las hojas de un frailejoacuten o especie de

alta montantildea que habite en los troacutepicos como E hartwegiana debido a ello sus mecanismos de

accioacuten en especies de paramo dentro de un marco de cambio climaacutetico es poco conocido Se

necesitan mayores estudios enfocados en esta especie para entender su ecologiacutea y dinamismo

ecoloacutegico respecto a los cambios en las variables ambientales

Se eligieron las especies Coprinellus domesticus y Coprinellus xanthothrix como grupos

externos con el fin de enraizar el aacuterbol debido a que pertenecen a la Divisioacuten Basidiomycota la

cual difiere en grado de la divisioacuten Ascomycota aunque conserva semejanzas conocidos como

caracteres ancestrales o plesiomorficos que avanzan a medida la filogenia se construye con los

datos de las diferentes secuencias de especies evidenciando novedades evolutivas conocidas

como apomorfias que cuando se dan en un grupo en particular pasan a ser sinapomorfias es decir

novedades evolutivas dentro de un grupo particular (Lehtonen 2020) Se optoacute por enraizar con

55

estas dos especies con el objetivo de dar robustez al aacuterbol filogeneacutetico (Barriel y 1998) lo cual se

consiguioacute como se nota en los estadiacutesticos del aacuterbol filogeneacutetico

56

57

Conclusiones

Se rechaza la hipoacutetesis nula (H0) y se concluye que la identificacioacuten y caracterizacioacuten

molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo Colombia es diferente en 80 de sus geacuteneros y

especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos realizadas en especies de frailejoacuten

Por lo tanto los nuevos geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos encontrados en el frailejoacuten

plantean nuevos desafiacuteos respecto al cambio climaacutetico ya que tienen un rol vital en la

supervivencia de estas especies de alta montantildea como los frailejones debido a su relacioacuten

mutualista o patoacutegena maacutes aun en los paacuteramos que son altamente sensibles a los efectos del

cambio climaacutetico incluso tan sensibles como las zonas polares (Bradley et al 2006)

La mayoriacutea de especies encontradas en el presente estudio tienen potencial para ayudar a

combatir el estreacutes abioacutetico producido por el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales

Especiacuteficamente pueden ayudar a combatir el estreacutes bioacutetico producido por virus hongos

bacterias e insectos en un marco de cambio climaacutetico aumentos de temperatura cambios en la

concentracioacuten de CO2 cambios en la precipitacioacuten migraciones tempranas cambios en la

nubosidad disponibilidad hiacutedrica alteraciones en la estructura y composicioacuten de las especies

endeacutemicas del paacuteramo

58

59

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Anexos

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombia

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia

hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

74

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

Coordenadas Geograacuteficas

(Latitud)

De la Colecta del

Material Bioloacutegico total de 15

muestras (Longitud)

LAT N 4deg 37 5871717 LONG W 75deg 25

3292611

LAT N 4deg 37 5885220 LONG W 75deg 25

3271217

LAT N 4deg 37 5884485 LONG W 75deg 25

3312103

LAT N 4deg 36 5995487 LONG W 75deg 27

3045854

LAT N 4deg 37 6195784 LONG W 75deg 30

3292611

LAT N 4deg 40 159171 LONG W 75deg 26

380142

LAT N 4deg 40 363762 LONG W 75deg 26

209072

LAT N 4deg 40 399832 LONG W 75deg 27

173554

LAT N 4deg 40 383965 LONG W 75deg 27

464325

LAT N 4deg 39 486438 LONG W 75deg 27

173559

LAT N 4deg 40 56894 LONG W 75deg 26

568287

LAT N 4deg 40 159174 LONG W 75deg 27

190654

LAT N 4deg 40 125083 LONG W 75deg 26

345912

LAT N 4deg 40 116691 LONG W 75deg 27

208264

LAT N 4deg 40 314698 LONG W 75deg 27

140791

75

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un estereoscopio con el propoacutesito de seleccionar la

maacutes indicada y luego sembrar un cultivo puro a partir de ese micelio

76

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados las

copias se conservaron con glicerol a -80degC en un ultra congelador de Thermo Scientifictrade

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas

y enviadas

77

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicos de forma segura y esteacuteril propiedad de la Universidad del Quindiacuteo

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a la Universidad Ruhr de Bochum (Alemania)

78

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de parsimonia

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X en donde se

observa en amarillo la secuencia umlTCATTAuml la cual es una secuencia altamente conservada

que se usa para marcar el inicio de la misma en hongos endoacutefitos

79

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa JmoldelTest usados para generar el

aacuterbol de relaciones filogeneacuteticas a partir de la regioacuten ITS de los hongos endoacutefitos aislados

total de modelos evaluados 88

ID Nombre Particioacuten lnL P AIC detaAIC Peso Cumpeso Udelta

1 JC 0 100820157 138 204400314 1341348 0 1 -

2 JC+I 0 98912511 139 200605022 9618188 0 1 -

3 JC+G 0 95470113 139 193720225 2733392 0 1 -

4 JC+I+G 0 95467507 140 193735014 274818 0 1 -

5 F81 0 100658095 141 204136189 13149356 0 1 -

6 F81+I 0 98761481 142 200362962 9376128 0 1 -

7 F81+G 0 95314814 142 193469628 2482794 0 1 -

8 F81+I+G 0 95324364 143 193508729 2521895 0 1 -

9 K80 10010 99734495 139 20224899 11262157 0 1 -

10 K80+I 10010 97835191 140 198470382 7483549 0 1 -

11 K80+G 10010 94227821 140 191255643 268809 0 1 -

12 K80+I+G 10010 94209963 141 191239926 253092 0 1 -

13 HKY 10010 99648091 142 202136181 11149348 0 1 -

14 HKY+I 10010 97761512 143 198383024 7396191 0 1 -

15 HKY+G 10010 94170799 143 191201599 214765 0 1 -

16 HKY+I+G 10010 94118678 144 191117357 130523 600E-04 0999 -

17 TrNef 10020 99564653 140 201929306 10942472 0 1 -

18 TrNef+I 10020 97712623 141 198245245 7258412 0 1 -

19 TrNef+G 10020 94150977 141 191121955 135121 400E-04 09994 -

20 TrNef+I+G 10020 94132131 142 191104263 117429 00011 09959 -

21 TrN 10020 99563809 143 201987618 11000784 0 1 -

22 TrN+I 10020 97702964 144 198285929 7299095 0 1 -

23 TrN+G 10020 94094235 144 191068469 81635 00065 09719 -

24 TrN+I+G 10020 94101378 145 191102757 115923 00012 09948 -

25 TPM1 12210 99713879 140 202227759 11240925 0 1 -

26 TPM1+I 12210 97826641 141 198473282 7486449 0 1 -

27 TPM1+G 12210 94249837 141 191319674 33284 0 1 -

28 TPM1+I+G 12210 942022 142 1912444 257566 0 1 -

29 TPM1uf 12210 99663473 143 202186945 11200112 0 1 -

30 TPM1uf+I 12210 97879458 144 198638917 7652083 0 1 -

31 TPM1uf+G 12210 94137349 144 191154699 167865 100E-04 09999 -

32 TPM1uf+I+G 12210 94141897 145 191183794 196961 0 1 -

80

33 TPM2 10212 99722544 140 202245087 11258254 0 1 -

34 TPM2+I 10212 97828213 141 198476426 7489592 0 1 -

35 TPM2+G 10212 94185859 141 191191718 204885 0 1 -

36 TPM2+I+G 10212 94153667 142 191147335 160501 100E-04 09998 -

37 TPM2uf 10212 99648091 143 202156182 11169348 0 1 -

38 TPM2uf+I 10212 97757018 144 198394035 7407202 0 1 -

39 TPM2uf+G 10212 941052 144 1910904 103566 00022 09904 -

40 TPM2uf+I+G 10212 9408801 145 19107602 89187 00044 0982 -

41 TPM3 12012 99768005 140 20233601 11349176 0 1 -

42 TPM3+I 12012 97958099 141 198736198 7749364 0 1 -

43 TPM3+G 12012 94227963 141 191275926 289093 0 1 -

44 TPM3+I+G 12012 94323885 142 191487769 500936 0 1 -

45 TPM3uf 12012 99625421 143 202110843 11124009 0 1 -

46 TPM3uf+I 12012 97770469 144 198420939 7434105 0 1 -

47 TPM3uf+G 12012 94165576 144 191211152 224319 0 1 -

48 TPM3uf+I+G 12012 94150861 145 191201721 214888 0 1 -

49 TIM1ef 12230 99592239 141 202004478 11017644 0 1 -

50 TIM1ef+I 12230 97822787 142 198485574 749874 0 1 -

51 TIM1ef+G 12230 94121043 142 191082087 95253 00033 09853 -

52 TIM1ef+I+G 12230 94122386 143 191104772 117939 00011 09969 -

53 TIM1 12230 99518653 144 201917306 10930473 0 1 -

54 TIM1+I 12230 9781156 145 19852312 7536286 0 1 -

55 TIM1+G 12230 94105198 145 191110396 123562 800E-04 09977 -

56 TIM1+I+G 12230 94087158 146 191094317 107483 00018 09922 -

57 TIM2ef 10232 99550617 141 201921233 109344 0 1 -

58 TIM2ef+I 10232 97704602 142 198249204 726237 0 1 -

59 TIM2ef+G 10232 94093484 142 191026968 40135 00516 0852 -

60 TIM2ef+I+G 10232 94073864 143 191007729 20895 0135 07169 -

61 TIM2 10232 99530022 144 201940044 1095321 0 1 -

62 TIM2+I 10232 97820158 145 198540315 7553482 0 1 -

63 TIM2+G 10232 94058678 145 191017356 30523 00834 08004 -

64 TIM2+I+G 10232 94060837 146 191041674 54841 00247 09248 -

65 TIM3ef 12032 99546286 141 201912572 10925739 0 1 -

66 TIM3ef+I 12032 97713931 142 198267862 7281028 0 1 -

67 TIM3ef+G 12032 94129376 142 191098753 111919 00014 09936 -

68 TIM3ef+I+G 12032 94112005 143 191084009 97176 0003 09883 -

69 TIM3 12032 99514376 144 201908751 10921918 0 1 -

70 TIM3+I 12032 97700023 145 198300047 7313213 0 1 -

71 TIM3+G 12032 94115323 145 191130646 143812 300E-04 09997 -

72 TIM3+I+G 12032 94096941 146 191113882 127048 700E-04 09984 -

73 TVMef 12314 9970418 142 20224836 11261526 0 1 -

74 TVMef+I 12314 97940598 143 198741196 7754363 0 1 -

81

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE (AIC)

75 TVMef+G 12314 94159829 143 191179657 192824 0 09999 -

76 TVMef+I+G 12314 94160993 144 191201987 215153 0 1 -

77 TVM 12314 99615991 145 202131982 11145148 0 1 -

78 TVM+I 12314 97746676 146 198413353 7426519 0 1 -

79 TVM+G 12314 94075503 146 191071005 84171 00057 09776 -

80 TVM+I+G 12314 94052588 147 191045176 58342 00208 09456 -

81 SYM 12345 99543166 143 201946331 10959498 0 1 -

82 SYM+I 12345 97757103 144 198394207 7407373 0 1 -

83 SYM+G 12345 94083056 144 191046112 59278 00198 09654 -

84 SYM+I+G 12345 94050035 145 19100007 13236 0198 05819 -

85 GTR 12345 99529525 146 20197905 10992217 0 1 -

86 GTR+I 12345 97686178 147 198312356 7325522 0 1 -

87 GTR+G 12345 94044194 147 191028387 41553 00481 09001 -

88 GTR+I+G 12345 94013417 148 190986834 0 03839 03839 -

4

5

Resumen

Debido al aumento global de las temperaturas impulsado por el cambio climaacutetico de origen

antropogeacutenico y a la poca informacioacuten que se tiene sobre hongos endoacutefitos en especies de los

paacuteramos esta investigacioacuten buscoacute identificar y caracterizar la diversidad de hongos endoacutefitos del

frailejoacuten Espeletia hartwegiana Esta especie habita en los paacuteramos desde 3000 a 5000 metros de

lo que la hace una especie maacutes vulnerable a los aumentos de temperatura que se pronostican para

el antildeo 2100 de hasta 25degC La identificacioacuten y caracterizacioacuten de los hongos endoacutefitos se realizoacute

por medio de teacutecnicas filogenia molecular basado en datos de secuencias de genes muacuteltiples de

las regiones espaciadoras transcritas internas (ITS) en donde se encontraron un total de 15

geacuteneros de endoacutefitos como Nigrospora Trichoderma y Diaporthe con un total de 35 especies

Los hongos endoacutefitos encontrados podriacutean tener un rol vital en la supervivencia de esta especie

de frailejoacuten mediando la forma en coacutemo responde al estreacutes abioacutetico producido por el cambio

climaacutetico como aumento de la temperatura cambio en las precipitaciones y sequiacuteas ademaacutes del

estreacutes bioacutetico como virus bateriacuteas insectos y hongos fitopatoacutegenos

Palabras clave Cambio Climaacutetico Filogenia Molecular Hongos Endoacutefitos Paacuteramos

6

7

Con amor para mis padres Fernando Ivaacuten Aristizabal y mi madre Mariacutea Ligia

Ortiz

A Norberto Aristizabal y Natalia Aristizabal por creer en miacute

A mi hijo Joseacute David Aristizabal por representar las nuevas generaciones

A mi tutor Jhon Alexander Osorio por tenerme paciencia en este proceso de

aprendizaje y compartirme sus conocimientos

A Tatiana Tapias por darme su amor y llevarme por el camino de la virtud

siempre centrado

A la maestriacutea en Cambio Climaacutetico Sustentabilidad y Desarrollo por siempre

estar disponibles para miacute

A la Universidad Andina Simoacuten Boliacutevar por apoyar mi tesis de investigacioacuten

A la Repuacuteblica del Ecuador por abrirme sus puertas y darme un mejor futuro

8

9

Agradecimientos

Estos agradecimientos van dedicados para Ecuador que me brindoacute la oportunidad

poder estudiar una maestriacutea a mi tutor por aceptarme y acompantildearme en este proceso a

mi familia por creer en miacute y en los sacrificios que hice para irme a vivir a otro paiacutes solo y

sin dinero para poder umlsalir adelanteuml como decimos en Colombia a mi compantildeera

sentimental por siempre guiarme hacia el camino correcto disciplina compromiso y

entrega a la universidad Andina Simoacuten Boliacutevar por aceptarme en sus aulas de clase y

por ultimo a la Universidad del Quindiacuteo por abrirle la puerta a uno de sus egresados y

acogerlo de buena forma con sus instalaciones de laboratorio

Gracias y mil gracias a todos de corazoacuten sin duda esta experiencia cambio mi

vida en todos los sentidos

Desde hoy hasta el final que podriacutea llamarse infinito

10

11

Tabla de contenidos

Figuras mapas y tablashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13

Introduccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 15

Capiacutetulo primero Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

1 Antecedenteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

2 Justificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 25

3 Hipoacutetesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 26

4 Objetivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

41 Objetivo generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

42 Objetivos especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

Capiacutetulo segundo Materiales Meacutetodos y Resultadoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

1 Aacuterea de Estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

2 Colecta de material bioloacutegicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos

endoacutefitos)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32

5 Extraccioacuten de ADNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

7 Secuenciamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

8 Anaacutelisis Filogeneacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

Capiacutetulo Tercero Discusioacuten sobre los hongos endoacutefitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidadhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio

Climaacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42

Conclusioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 57

Obras citadashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 59

Anexoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 73

12

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphellip 73

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia 73

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphelliphellip74

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana 75

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un

estereoscopio 75

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 76

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas y

enviadas 76

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 75

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a Alemania a la Universidad Ruhr de

Bochum 77

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de

parsimoniahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 78

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X 78

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa

JmoldelTest 79

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE

(AIC) 81

13

Figuras mapas y tablas

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo

Colombiahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras

N necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefitohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y

abioacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en

medio de cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelialhelliphelliphellip 30

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la

teacutecnica de corte de hifa uacutenica helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de

cultivo Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12)

aislados de las hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana 31-32

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 10 Filograma obtenido a partir del anaacutelisis ML y MP del conjunto de datos ITS Aislados

de las hojas de frailejoacuten37

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip43

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e

Hypocreahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip46

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon48

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon

Biscogniauxia Nemania y Humiacutecolahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

14

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies

Massarina Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona

muestreadahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia 29-30

Tabla 2 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos

endoacutefitos en la especie Espeletia hartwegiana

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36

Tabla 3 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = presencia del genero

de hongo dentro de la especie de frailejoacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42-43

15

Introduccioacuten

Hay un libro abierto siempre para

todos los ojos la naturaleza

(Jean-Jacques Rousseau 1712-1778)

El cambio climaacutetico corresponde a un fenoacutemeno que afecta el planeta de manera natural

permitiendo mantener las condiciones climaacuteticas como la temperatura la precipitacioacuten entre

otras en un rango aceptable para la vida (Jimeacutenez 2010) Sin embargo dado el aumento de las

emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) principalmente asociado a las actividades

humanas y el alto consumo de combustibles foacutesiles los cambios en dichas condiciones han sido

alterados dando paso a un acelerado aumento de temperatura anual en las uacuteltimas deacutecadas con

precipitaciones y sequias maacutes frecuentes e intensas (IPCC 2020 5 Jimeacutenez 2010)

Acorde con el Panel Intergubernamental de Expertos en Cambio Climaacutetico (IPCC) para

fin de siglo el Cambio Climaacutetico se acrecentaraacute pronosticando un aumento de temperatura de 25

a 45 degC para el antildeo 2100 que tan solo para Colombia en los uacuteltimos 30 antildeos fue de 08degC

generando impactos notorios en las zonas de alta montantildea como los paacuteramos (Moreno y Palma

2016)

El cambio climaacutetico es un fenoacutemeno cuyos efectos alcanzaraacuten los paacuteramos los cuales son

ecosistemas de alta montantildea presente en elevaciones entre 3100 y 4700 m ubicados en el norte de

los Andes de Ameacuterica del Sur y el sur de Ameacuterica Central adyacente (Berdugo et al 2016) Estas

aacutereas se caracterizan por una vegetacioacuten principalmente endeacutemica compuesta por frailejones

matorrales y pastos (veacutease figura 1) (Garciacutea et al 2010)

Los ecosistemas de alta montantildea como los paacuteramos ofrecen diversos servicios

ambientales como la biodiversidad uacutenica que albergan los paisajes los suelos y su capacidad de

retener y almacenar agua (Morales et al 2019) Las formaciones vegetales juegan un papel

diferenciado en el mantenimiento de la humedad y las fuentes de agua en el ecosistema

presentando la capacidad de interceptar almacenar y regular los flujos hiacutedricos superficiales y

16

subterraacuteneos aportando los servicios de abastecimiento de agua para el 70 de la poblacioacuten de

Colombia (Vaacutesquez y Buitrago 2017)

Ademaacutes dada la caracteriacutestica de permanente humedad de su suelo la materia orgaacutenica

se descompone a menor velocidad logrando un efecto de retencioacuten y almacenamiento de carbono

(Anderson et al 2012) En Colombia se han realizado diferentes estudios sobre la distribucioacuten y

extensioacuten del ecosistema paramuno Rangel (2002 4) determinoacute que los paacuteramos colombianos

abarcaban aproximadamente el 26 de la superficie del paiacutes

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramos por Pedraza-Pentildealosa Betancur y Franco-Rosselli (2005)

En particular el paacuteramo Romerales se encuentra dentro del territorio adscrito a los

Parques Nacionales Naturales (PNN) especiacuteficamente el PNN de los Nevados en la cordillera

central colombiana hacia la zona norte del Departamento del Quindiacuteo con liacutemites fronterizos

entre los departamentos de Risaralda y Tolima Este paacuteramo es el hogar del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana el cual estaacute afrontando los efectos del cambio climaacutetico (veacutease mapa 1)

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona muestreada

17

Existe evidencia cientiacutefica concreta del aumento de temperatura en los Andes Tropicales

tambieacuten cambios significativos en los patrones de precipitacioacuten sumado a la disminucioacuten en la

incidencia del clima nublado lo que conduce a las plantas a mayor cantidad de horas expuestas a

la radiacioacuten solar (Ruiz et al 2009) Otro efecto grave que trae consigo el cambio climaacutetico es el

desplazamiento de especies en el gradiente altitudinal Con un aumento de 3degC se espera que las

especies se muevan ~600 m en buacutesqueda de su optimo teacutermico esto afectariacutea gravemente las

especies de paacuteramo como los frailejones Cuesta Camacho (2007)

Los frailejones son emblemaacuteticas plantas de paacuteramo y ecosistemas de alta montantildea

(MINAMBIENTE 2019) Pertenecen a la familia Asteraceae contiene cerca de 142 especies

agrupadas en ocho geacuteneros Carramboa Coespeletia Espeletia Espeletiopsis Libanothamnus

Paramiflos Ruilopezia y Tamania de estos los maacutes importantes y con mayor diversidad de

especies son Espeletia Espeletiopsis y Libanothamnus (Rivera y Torres 2001)

Poseen adaptaciones que les permite captar y retener grandes cantidades de agua de su

entorno permitiendo un balance ecosistemico (Farias 2013) La morfologiacutea singular del genero

Espeletia le permite acumular las hojas antiguas en forma de ldquoabrigordquo brindando proteccioacuten

contra las bajas temperaturas nocturnas de hasta 0degC Los fuertes vientos y la radiacioacuten solar los

cuales seraacuten cada vez maacutes intensos y frecuentes por causa del cambio climaacutetico (Cortes y

Sarmiento 2013 34) (veacutease figura 2)

Estas plantas son especies claves para la conservacioacuten de los paacuteramos y la lucha contra el

cambio climaacutetico debido a que ofrecen una gran variedad de servicios ecosisteacutemicos (Diacuteaz et al

2007) El paacuteramo es referente sin igual de fuente hiacutedrica ciudades como Bogotaacute y Quito obtienen

aproximadamente el 80 de su agua dulce de los paacuteramos (Buytaert et al 2006) Los frailejones

en su mayoriacutea endeacutemicos se han visto afectados por actividades humanas como la ganaderiacutea

extensiva agricultura (cultivos de papa y cebolla) mineriacutea de oro y carboacuten turismo no

controlado y quemas intencionales (Hofstede 2000) Esta situacioacuten podriacutea comprometer a

mediano y largo plazo la funcioacuten de captacioacuten regulacioacuten y suministro del agua para el consumo

18

en las ciudades colombianas ubicadas en las regiones de influencia de estos ecosistemas (Varela

2015)

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

No obstante en asociacioacuten con especies como el frailejoacuten de los Andes Tropicales

encontramos a los hongos cuyos roles en las interacciones bioloacutegicas son de vital importancia

Los hongos pueden ser endoacutefitos simbiontes mutualistas paraacutesitos y comensales y son capaces

de responder a las amenazas que plantea el cambio climaacutetico en cuanto a perturbaciones

ambientales aumento de temperatura y estreacutes hiacutedrico adaptaacutendose a la disponibilidad de recursos

modificando sus actividades enzimaacuteticas e incluso su genoma a lo largo del tiempo (Moreno et

al 2013)

Los hongos son clasificados seguacuten su forma de reproduccioacuten sea sexual o asexual en

donde se observan las diferencias estructurales internas entre los diferentes grupos tales como

sus esporas e hifas como lo indican Blackwell y Spatafora (2004) estos organismos estaacuten

divididos en cuatro grandes grupos los cuales son Ascomycota Basidiomycota

Chytridiomycota Zygomycota es justo en el grupo de los Ascomycota donde se encuentra gran

diversidad de hongos conocidos como ldquohongos endoacutefitosrdquo en donde su nombre ldquoendoacutefitordquo

significa ldquodentro de la plantardquo (endon dentro phyton planta)

19

Estos microorganismos fuacutengicos tienen la facilidad de pasar gran parte o todo su ciclo de

vida invadiendo los tejidos de su hospedero (planta) sin tener un efecto negativo evidente

(Leacuteveilleacute 1846 3 de Bary 1866 8) Por lo tanto el concepto de endoacutefito indica una asociacioacuten de

costo-beneficio pero de una forma mutualista entre el hongo y la planta hospedera permitiendo

la estadiacutea en sus tejidos vivos (Clay 1998 8) Los hongos endoacutefitos se han encontrado en todas

las plantas (algas musgos pastos plantas y vasculares) desde los bosques templados hasta los

bosques tropicales hallaacutendose una gran diversidad de plantas y en asociacioacuten gran diversidad de

hongos endoacutefitos (Saacutenchez et al 2010)

Se espera que los hongos endoacutefitos jueguen un papel cada vez maacutes importante potenciado

por el cambio climaacutetico en las enfermedades producidas en plantas como pudricioacuten radicular

mal blanco entre otras con los aumentos pronosticados de la temperatura y el estreacutes por sequiacutea

asociados al cambio climaacutetico (Desprez-Loustau et al 2006 Slippers y Wingfield 2007 6) Los

cambios en la cantidad de dioacutexido de carbono (CO2) y la disponibilidad de nitroacutegeno en el suelo

afectan de forma similar tanto a las plantas como a los hongos por ende las alteraciones

generadas por parte del cambio climaacutetico pueden causar desbalances en sus relaciones (Ies et al

2013)

Algunos estudios realizados en el antildeo 1898 donde se registraron los primeros hongos

endoacutefitos como el de Bary (1866) brindo la iniciativa de investigaciones que lograron explicar

los cuadros toxicoloacutegicos observados en animales los cuales se daban por el consumo de

semillas o en aacutereas de pastos (Poaceae) que posiblemente albergaban hongos Clavicipitaacuteceos

(familia del ergot) los cuales poseiacutean actividades enzimaacuteticas con micotoxinas

Por diversas situaciones no trascendioacute la investigacioacuten hasta que Bacon (1977) hizo

relacioacuten del hongo endoacutefito Neotyphodium coenophialum debido a una intoxicacioacuten del ganado

llamado ldquosiacutendrome de veranordquo cuando estos animales consumiacutean pastos de la especie Festuca

arundinacea (Poaceae) Funk en el antildeo 80 caracterizoacute la resistencia de las Poaceae que

albergaban hongos endoacutefitos que frecuentemente eran atacados por insectos (proteccioacuten contra

herbiacutevoros) (Saacutenchez et al 2010)

Compant y colaboradores (2010) mencionaron que tras experimentar en el laboratorio

con una gama de temperaturas en los hongos endoacutefitos aislados obtuvieron resultados variables

respecto al crecimiento es decir positivos y neutrales llegando a la conclusioacuten de que los

microorganismos asociados a las plantas son un factor importante que influye en la respuesta de

20

las plantas acorde a los cambios de temperatura lo que compromete las respuestas del frailejoacuten y

los hongos endoacutefitos frente al calentamiento global causado por el cambio climaacutetico

Con relacioacuten a los estudios realizados sobre hongos endoacutefitos en frailejones se han

encontrado al menos 100 especies con capacidades de inhibir hongos fitopatoacutegenos o herbivoriacutea

(Cabezas et al 2012)

Los geacuteneros de hongos endoacutefitos encontrados en anteriores estudios son Acremonium

Aspergillus Aureobasidium Colletotrichum Fusarium Gliocadium Nigrospora Paecilomyces

Penicillium Trichothecium Trichoderma y Sordaria (Pineda 2000 Programa Nacional para la

Evaluacioacuten del Estado y Afectacioacuten de los Frailejones en los Paacuteramos de Andes del Norte 2009)

Teniendo en cuenta que para Colombia hay poca informacioacuten sobre hongos endoacutefitos en

ecosistemas paramunos se hace fundamental la ampliacioacuten de maacutes informacioacuten referente al tema

debido a que solo existen estudios significativos en cafeacute leguminosas y rosas los cuales maacutes allaacute

de la identificacioacuten de geacuteneros de hongos endoacutefitos no incluyen el cambio climaacutetico y sus

posibles consecuencias (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016) En

teacuterminos filogeneacuteticos los hongos son el reino de la naturaleza maacutes cercano a los animales

(Hibbett et al 2018)

Las relaciones que posean las diferentes especies de endoacutefitos dentro de la especie de

frailejoacuten es de importancia conocerla mediante el uso de la filogenia molecular (Judd et al 2007)

mediante secuencias de ADN ARN o proteiacutenas (Cooke et al 2000) Dependiendo de la presencia

de especies agresivas de endoacutefitos como Nigrospora se puede tener un mejor conocimiento

sobre las consecuencias que trae consigo los impactos del cambio climaacutetico sobre estas plantas de

los Andes Tropicales (Foden et al 2009)

21

Capiacutetulo primero

Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitos

1 Antecedentes

Desde los estudios realizados por Leacuteveilleacute (1846) y Bary (1866) sobre hongos Endoacutefitos

en pastos de zonas templadas se ha logrado identificar que estos hongos son capaces de inducir

respuestas adaptativas a sus hospederos (Micotoxinas contra herbiacutevora adaptacioacuten a heladas o

climas extremos fijacioacuten de nutrientes) a cambio de alimento y hospedaje formando una relacioacuten

mutualista en la cual las dos especies involucradas son beneficiadas No obstante se ha reportado

que los hongos endoacutefitos ademaacutes de tener relaciones mutualistas con diferentes especies

vegetales se pueden tornar en especies patoacutegenas para su hospedero una vez la planta se

encuentra en condiciones desventajosas tornaacutendose asiacute el hongo endoacutefito en un hongo

fitopatoacutegeno (Herrera y Ulloa 1990 550)

Como se mencionoacute anteriormente los hongos endoacutefitos pueden pasar de un estado

mutualista a un estado de patogeacutenesis dada esta relacioacuten entre ambos organismos se producen

metabolitos secundarios potencialmente toacutexicos facilitando factores de virulencia dados por el

hongo endoacutefito como exoenzimas y metabolitos fitotoacutexicos a su vez la planta presenta defensas

tanto mecaacutenicas como bioquiacutemicas (Saacutenchez et al 2013 5)

Hasta la fecha los principales estudios de hongos endoacutefitos se han fijado en especies de

intereacutes econoacutemico y comercial tales como palma de aceite cafeacute leguminosas pastos de forrajeoacute

y diferentes tipos de rosas (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016)

Las especies modelo para el estudio de los hongos endoacutefitos han sido las gramiacuteneas

forrajeras en donde se han reportado especies de endoacutefitos asociados a los geacuteneros Lolium

Festuca y Brachiaria (Siegel et al 1987) no obstante Otero y Bayman (2009) han reportado un

creciente nuacutemero de estudios en orquiacutedeas epifitas tropicales relaciones con hongos micorrizicos

22

Actualmente existen escasos reportes de hongos endoacutefitos asociados a ecosistemas con

climas extremos (temperaturas extremas) como aacuterticos desiertos paacuteramos y zonas alpinas

especialmente para zonas de temperaturas friacuteas como lo son los paacuteramos (Lopera et al 2008

Leung et al 2011 Cabezas et al 2012 Miles et al 2012 Zhang y Yao 2015)

Investigadores como Lopera Leung y colaboradores (2011) han llegado a la conclusioacuten

de que los hongos endoacutefitos juegan un papel importante en las plantas a la hora de adaptarse a

ecosistemas de clima templado (Kivlin et al 2013 Zhang y Yao 2015)

En Colombia los trabajos con hongos endoacutefitos son pocos por ende trabajos como el de

Lopera y colaboradores (2008) con especies del genero Espeletia de los paacuteramos Colombianos

son pioneros ademaacutes del trabajo de Cabezas y colaboradores (2012 4) en el cual aislaron y

caracterizaron celulasas (enzimas descomponedores de la celulosa) extraiacutedas de hongos endoacutefitos

que se hallaban en especies de Espeletia posteriormente Lopera y Miles (2012) unieron

esfuerzos para continuar caracterizando la diversidad de hongos endoacutefitos en los paacuteramos andinos

colombianos enfocados en Espeletia con el objetivo de encontrar especies con potencial

biocontrolador

Existen trabajos tesis en los repositorios de diversas universidades de los antildeos 2014 y

2015 en los cuales se aborda el tema de los hongos endoacutefitos paacuteramos y especies de Espeletia

(frailejones) y de la familia Poaceae en donde se caracterizan las diversas especies de hongos

endoacutefitos por medio taxonomiacutea y biologiacutea molecular ademaacutes de buscar metabolitos secundarios

con fines medicinales o de biocontrol

Los trabajos en filogenia molecular de hongos endoacutefitos realizados en frailejones se han

visto enfocados maacutes hacia la buacutesqueda de la diversidad funcional en comunidades

microbioloacutegicas como por ejemplo el estudio realizado por Ruiz y colaboradores (2015) en

donde buscaron mediante el anaacutelisis molecular de raiacuteces necromasa hojas maduras y joacutevenes de

diferentes especies de Espeletia (veacutease figura 3) ubicada en los Andes neotroacutepicales

colombianos secuencias geneacuteticas de las regiones V5-V6 de la unidad 16S del rARN

23

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras N

necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefito Tomado de Ruiz y colaboradores (2015)

Este estudio analizoacute la composicioacuten de comunidades microbioanas y su diversidad

funcional en un ecosistema de alta montantildea en donde las temperaturas los rayos UV y la altura

juegan papeles determinantes como filtros ecoloacutegicos severos en donde solo pueden existir

especies que han desarrollado capacidades para adaptarse sobrevivir y colonizar dichas aacutereas

por ende cuando se analizaron las comunidades existentes dentro de estas especies de Espeletia

Encontraron que algunas especies halladas podriacutean tener roles importantes como

productores de metabolitos secundarios enzimas o incluso como bioremediadores y que las

comunidades microbianas eran diferentes tanto en sus hojas como en sus raiacuteces y en la

necromasa

A medida que las deacutecadas avanzan y la evidencia sobre el cambio climaacutetico se hace maacutes

robusta y evidente los estudios en los hongos endoacutefitos han tomado vital importancia al estar

asociados con cultivos de especies comestibles escases de agua y de tierras productivas sumado

a los efectos negativos que trae consigo el cambio climaacutetico para las diferentes plantaciones y

cosechas a nivel global

Es por eso que Lu Yan y colaboradores (2019) analizaron los efectos positivos que teniacutean

la colonizacioacuten de hongos endoacutefitos en las plantas en donde ratificaron que los hongos endoacutefitos

dentro la planta generan metabolitos antimicrobianos estimulan las respuestas inmunoloacutegicas y

compiten por espacio dentro de la planta con diferentes patoacutegenos incrementando asiacute la

resistencia contra herbiacutevoros y la resistencia al estreacutes salino (factores bioacuteticos)

Ademaacutes de ayudar a la planta contra el estreacutes abioacutetico causado principalmente por

factores climaacuteticos como la falta de agua (estreacutes hiacutedrico) las temperaturas extremas la

intensidad de los rayos UV y los metales pesados como la muestra la figura 4 debido a esto se

24

concluyoacute que las fitohormonas cumplen un papel importante en la colonizacioacuten de hongos

endoacutefitos dentro de la planta

Aun que se ha reportado que los hongos endoacutefitos se pueden usar como biocontroladores

diferentes estudios reportan que el uso de hongos endoacutefitos puede tener efectos adversos como

un retraso significativo en el crecimiento de la planta con el uso de la especie Cryptosporiopsis

sp (Terhonen et al 2016) Otro reporte indica la fecundidad y supervivencia de enemigos

naturales como paraacutesitos esto es debido a que los hongos endoacutefitos transfieren sus toxinas y

alcaloides cuando son ingeridos por paraacutesitos u otros enemigos naturales de las plantas (Lopez y

Sword 2015)

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y abioacutetico

Bajo estreacutes bioacutetico (herbiacutevoros y patoacutegenos) y abioacutetico (sequiacutea salinidad metales pesados y otros) (a) se

inducen respuestas de defensa de las plantas (b) los endoacutefitos producen metabolitos protectores y

modulan la viacutea de las fitohormonas para mejorar la inmunidad de las plantas (c) tomada de Lu yan y

colaboradores (2019 7)

25

2 Justificacioacuten

La presente investigacioacuten pretende identificar y caracterizar que especies de hongos

endoacutefitos estaacuten asociadas al frailejoacuten Espeletia hartwegiana y que posibles implicaciones podriacutea

tener que estas especies se encuentren dentro de esta especie de alta montantildea La importancia de

conocer esta informacioacuten reside en que los hongos endoacutefitos pueden beneficiar o perjudicar a la

adaptacioacuten y resistencia de especies vegetales en los distintos escenarios climaacuteticos propuestos

por la ciencia (IPCC 2020)

El calentamiento global podriacutea afectar el equilibrio de los hongos endoacutefitos en especies

vegetales generando desbalances en la planta o la peacuterdida de especies endoacutefitas de importancia

biotecnoloacutegica Por ejemplo se podriacutean perder especies endoacutefitas con potencial para control

bioloacutegico de plagas y enfermedades de plantas como productores de enzimas y metabolitos

secundarios degradacioacuten de plaacutesticos o biorremediacioacuten entre otros (Schulz et al 2002) Por

ello se hace fundamental estudiar los hongos endoacutefitos en ecosistemas de paacuteramo ya que en

Colombia y en los paacuteramos en general han sido poco estudiados y su efecto sobre las plantas de

alta montantildea podriacutea ser clave en el mantenimiento de sus poblaciones

26

3 Hipoacutetesis

H1 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute diferente en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo diferentes los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten tambieacuten seria

modificada

H0 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute similar en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo similares los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten continuariacutean

como se ha registrado con anterioridad

27

4 Objetivos

41 Objetivo general

Caracterizar la diversidad de hongos endoacutefitos presentes en los frailejones

de la especie Espeletia hartwegiana en el paacuteramo de Romerales tomando en cuenta su

relacioacuten con el cambio climaacutetico

42 Objetivos especiacuteficos

Identificar los hongos endoacutefitos asociados en Espeletia hartwegiana del

paacuteramo de Romerales

Hallar relaciones filogeneacuteticas entre las diferentes especies de hongos

Endoacutefitos encontradas en Espeletia hartwegiana

Advertir las repercusiones del cambio climaacutetico sobre Espeletia

hartwegiana en base a su diversidad de hongos endoacutefitos

28

29

Capiacutetulo segundo

Materiales Meacutetodos y Resultados

1 Aacuterea de Estudio

El trabajo se realizoacute en el paacuteramo de Romerales ubicado en la zona alta del municipio de

Salento Quindiacuteo (4deg39202N 75deg25506W) con una extensioacuten aproximada de 6794 ha (Cano

et al 2015)

2 Colecta de material bioloacutegico

La colecta del material bioloacutegico se realizoacute mediante muestreos aleatorios lo largo del

paacuteramo tomando coordenadas de cada punto de colecta (veacutease anexo 3) las hojas se colectaron

por medio de tijeras podadoras siendo empacadas cada una en bolsas Ziploc diferentes se

colectoacute un total de 15 hojas cada una correspondiente a una planta de frailejoacuten para un total de

15 plantas muestreadas de E hartwegiana

Adicionalmente las bolsas Ziploc fueron marcadas con los datos de colecta en campo y

transportadas a los laboratorios del Programa de Biologiacutea de la Universidad del Quindiacuteo para su

procesamiento

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetales

Las muestras obtenidas fueron lavadas con agua para eliminar el exceso de residuos se

cortaron 4 trozos de cada hoja con un tamantildeo aproximado de 05 a 10 cm (veacutease figura 5) luego

cada trozo de hoja se sometioacute a una esterilizacioacuten la cual se completoacute con algunas modificaciones

acorde al procedimiento descrito por (Osorio et al 2017) especiacutefico para el aislamiento de

30

hongos endoacutefitos que consiste en sumergir perioacutedicamente el material vegetal en etanol al 90

durante un minuto seguido de hipoclorito de sodio (NaClO) al 4 por un minuto continuando

con etanol al 70 durante un minuto y por uacuteltimo se lavaraacuten con agua destilada todo dentro de la

campana de flujo

Las cuatro secciones de hoja se transfirieron a una caja de Petri para un total de 15 cajas

de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA) (una caja de Petri por cada 4 cortes de hoja)

Posteriormente las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente (25degC aproximadamente)

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en medio de

cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelial caja de Petri de 20ml de capacidad

Pasadas 3 semanas se revisaron los cultivos fuacutengicos con el fin de revisar el crecimiento

del micelio y hacer un repique a un cultivo puro una vez maduros se procedioacute a utilizar la teacutecnica

de corte de hifa uacutenica (Osorio et al 2017) esta teacutecnica consistioacute en tomar la punta de la hifa con

ayuda de un estereoscopio y un bisturiacute de grado quiruacutergico agua destilada alcohol al 70 y un

mechero para mantener el bisturiacute esterilizado una vez identificada la hifa ideal para cultivar de

forma pura (veacutease figura 6) con el bisturiacute se procedioacute a cortar el agar PDA en forma de cuadro

con una medida aproximada de 3 miliacutemetros cuadrados

31

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la teacutecnica de

corte de hifa uacutenica

Se esperoacute entre 3 a 5 semanas a que crecieran los cultivos puros aislados de las hifas uacutenicas en

nuevas cajas de Petri con agar PDA

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos endoacutefitos)

Los hongos cultivados de forma pura consiguieron un crecimiento micelial significativo a partir

de los 15 diacuteas a temperatura ambiente como lo demuestra la figura 7 que contiene doce de los

cultivos maacutes representativos con su respectivos micelios aeacutereos desarrollados donde variacutean sus

colores formas y consistencias esto indicando que pertenecen a diferentes especies

2

1

3

32

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de cultivo

Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12) aislados de las

hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

5 Extraccioacuten de ADN

4

5

6

7

8

9

10

11

12

33

Una vez el micelio de los hongos se encontraba desarrollado en la cantidad necesaria se

procedioacute a extraer el ADN genoacutemico siguiendo el protocolo de extraccioacuten de Raeder y Broda

(1985) por medio de un barrido superficial del micelio evitando tomar el agar este micelio

posteriormente se colocoacute en tubos Eppendorf esteacuteriles de 2 ml y se pulverizoacute mediante el uso de

un asa microbioloacutegica y 1ml de buffer de extraccioacuten compuesto de Tris-HCL 1 M pH 78 EDTA

05 M Ph 8 SDS 10 wv NaCL y agua destilada para cada tubo a continuacioacuten se agregoacute 800

ul de etanol al 70 500 ul de fenol y se mezcloacute

Se adicionoacute 300 ul de cloroformo y se mezcloacute de nuevo de alliacute se llevoacute a la centrifuga a

10000 rpm por 60 minutos luego de centrifugar se forma un sobrenadante el cual es transferido

en su totalidad a un nuevo tuvo Eppendorf de 15 ml en el cual se agregaron 400 ul de cloroformo

y se llevoacute a la centrifuga a 10000 rpm por 10 minutos en donde nuevamente se forma un

sobrenadante aunque esta vez solo se toman 500 ul del tubo para ser transferidos otro tubo

Eppendorf de 15 ml ya en el nuevo tubo se adicionaron 50 ul de NaAC y se invirtioacute varias veces

para homogenizar la mezcla a continuacioacuten se guardoacute en el refrigerador a 4degC toda la noche

Al diacutea siguiente se tomaron las muestras en los tubos Eppendorf y se centrifugaron a

10000 rpm por 30 minutos (Formacioacuten del Pellet de ADN) cuando la centrifuga terminoacute se

procedioacute a remover el etanol ya sin etanol se agregoacute de nuevo 1 ml de etanol al 70 a cada tubo

y se centrifugoacute a 10000 rpm por 5 minutos en este paso se removioacute el etanol y se dejoacute secar el

pellet de ADN una vez el etanol se evaporoacute se re suspendioacute el pellet en 100 ul de agua grado

molecular o Sabax con 5 ul de RNAsa con el fin de evitar la presencia de moleacuteculas de ARN

posteriormente se incubaron a 37degC por 30 minutos y se guardaron para su envioacute a -20degC

(Raeder y Broda 1985)

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengica

Una vez se secuenciaron las muestras de ADN enviadas a la Universidad Ruhr de

Bochum Alemania se hizo el ensamblaje de las secuencias en contigs y scaffolds en el

programa CLC Main Workbench 8 (Nicola et al 2013) Como lo muestra la figura 8 donde se

muestran los pasos esenciales de una teacutecnica de Metagenoacutemica donde posteriormente se

analizaron con maacutes detalle mediante teacutecnicas filogeneacuteticas

34

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemico Fuente Thomas y colaboradores (2012)

7 Secuenciamiento

Se extrajoacute con eacutexito un total de 35 muestras de hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

Espeletia hartwegiana (veacutease figura 9) que posteriormente fueron secuenciadas por la

Universidad Ruhr de Bochum (Alemania) logrando un total de 70 secuencias incluyendo

aquellas obtenidas en Genk Bank

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de frailejoacuten

Espeletia hartwegiana

35

8 Anaacutelisis Filogeneacutetico

Se aislaron 35 secuencias basadas en la especie Espeletia hartwegiana fueron

comparadas posteriormente con 35 secuencias de especies publicados en GenBank

(httpblastncbinihgovblastcgi) se obtuvo un total de 70 secuencias Las secuencias de

consenso ITS 58S DNA obtenidas se usaron para realizar buacutesquedas BLAST en GenBank

usando BLASTn (Altschul et al 1990) con el fin de identificar mediante las secuencias aisladas

los geacuteneros o las especies maacutes cercanas La matriz de datos fue alineada en MAFFT v7 (Katoh y

Standley 2013) Se utilizaron las especies Coprinellus xanthothrix y Coprinellus domesticus

como grupos externos

Los anaacutelisis de las secuencias para construir los arboles filogeneacuteticos de Maacutexima

Parsimonia (MP) fueron realizados usando PAUP v40b10 (Swofford 2003) Para el anaacutelisis de

Maacutexima Verosimilitud o ML por sus siglas en ingleacutes (Maximum Likelihood) se utilizoacute

JmodelTest (Darriba et al 2012) con el cual se infirieron los criterios del modelo de sustitucioacuten

apropiado utilizando los criterios de informacioacuten de Akaike (AIC) (Akaike 1974)

Los anaacutelisis de ML se realizaron con el programa PhyML v 30 (Guindon y Gascuel

2003) teniendo en cuenta la proporcioacuten de sitios invariables Los valores de soporte de confianza

para los nodos se estimaron mediante 1000 anaacutelisis de arranque de replicacioacuten La alineacioacuten de

los datos de la secuencias de ITS para 70 aislamientos determinoacute quince geacuteneros siendo los

siguientes Annulohypoxylon Biscogniauxia Colletotrichum Crassiparies Cryptocoryneum

Cyphellophora Diaporthe Daldinia Humiacutecola Hypoxylon Hypocrea Nemania Nigrospora

Massarina y Trichoderma de los cuales se obtuvieron 11 clados principales (veacutease figura 10)

Con base en estos resultados todos los aislamientos se analizaron maacutes a fondo dentro de los

geacuteneros hasta llegar a especie (veacutease tabla 1)

36

Geacuteneros Especie Especie Especie Especie Especie Especie Especie

Annulohypoxylon A nitens A bahnphaden

gense

Biscogniauxia B petrensis

Colletotrichum C gloeosporioides

C gigasporum

Cyphellophora C

reptans

Crassiparies C quadrisporus

Cryptocoryneum C

longicondensatum

Daldinia D dennisii D

eschscholtzi

D

conceacutentri

ca

Diaporthe D

longicolla

D

foeniculina

D

anacardi

i

D

macada

miae

Humiacutecola H

fuscoatra

Hypoxylon H

trugodes

H

pulicicidum

Hypocrea H

koningii

Massarina M albocarnis

Nemania N

primolutea

Nigrospora N sacchari N rubi N sphaeric

a

N hainanen

sis

N oryzae

N gorlenko

ana

N aurantia

ca

Trichoderma T trixiae T

olivascens

T

paraviridescens

T

viridescens

T

samuelsii

T viride

Grupo Externo Coprinellus C

domesticus

C

xanthothrix

Tabla 1 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos endoacutefitos en la

especie Espeletia hartwegiana

37

38

Figura 10 Filograma consenso obtenido con el programa MEGA ndashX a partir del anaacutelisis ML y MP del

conjunto de datos ITS Aislados de las hojas de frailejoacuten Los coacutedigos en Verde son las secuencias que se

aislaron (aislados) en este estudio los coacutedigos y nombres en Negro son las secuencias encontradas por

identidad en GenBank Los valores de soporte de bootstrapgt 70 se indican cerca de los nodos como MP

ML = valores de soporte de bootstrap lt70

El nuacutemero de caracteres los modelos de sustitucioacuten usada asiacute como otros resultados

estadiacutesticos de las pruebas de Maacutexima Parsimonia y Maacutexima Verosimilitud generados a partir de

los anaacutelisis filogeneacuteticos de los conjuntos de datos se muestran en los anexos

39

Capiacutetulo Tercero

Discusioacuten sobre los hongos endofitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicas

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidad de Endoacutefitos

Tanto la temperatura la estacionalidad y los tipos de precipitacioacuten son factores de vital

importancia para la composicioacuten de las diferentes comunidades y la arquitectura vegetal Estos

factores limitan muchos de los procesos ecosisteacutemicos ya que existe una estrecha relacioacuten entre

las variaciones climaacuteticas y las variaciones dentro de los ecosistemas Por lo tanto se espera que

el cambio climaacutetico transforme los ecosistemas Andinos tal como los conocemos hoy (Colwell et

al 2008) modificando las relaciones mutualistas entre plantas y hospederos

Posiblemente la resiliencia y resistencia de muchos ecosistemas como el paacuteramo sean

superadas en este siglo por una combinacioacuten sin precedentes de disturbios tales como el cambio

climaacutetico perturbaciones asociadas a este (sequiacuteas fuegos invasioacuten de especies exoacuteticas

inundaciones) y otros factores como organismos oportunistas (hongos endoacutefitos) cambios en el

uso del suelo contaminacioacuten y sobreexplotacioacuten de recursos (IPCC 2020)

Considerando que el frailejoacuten Espeletia hartwegiana es una especie de alta montantildea

(paacuteramos) endeacutemica de la cordillera Central de los Andes (Schultz y Carl 1856) se encuentra

dentro de los ecosistemas andinos en donde a su vez se ha comprobado la existencia de los

hongos endoacutefitos es de tener en cuenta el papel de estos organismos endoacutefitos ya que los

paacuteramos son ecosistemas particularmente sensibles a los efectos adversos del cambio climaacutetico

en especial al calentamiento global al estar ubicados en los troacutepicos generando asiacute ventanas de

40

oportunidades para que los hongos endoacutefitos alteren su estado mutualista y pasen a ser

patogeacutenicos (Colwell et al 2008 7)

No obstante existe consenso en que las temperaturas aumentaraacuten especiacuteficamente a

grandes alturas y que la precipitacioacuten posiblemente se incrementaraacute en algunas zonas disminuiraacute

en otras y se produciraacute en patrones estacionales alterados con mayor intensidad y frecuencia

(Marengo et al 2009)

Los frailejones se ven en constante estreacutes por el uso del suelo dado en los paacuteramos como

es el caso del paacuteramo Romerales un paacuteramo que se ha visto afectado por las quemas y la

ganaderiacutea (Molinillo y Monasterio 2001) Esto aumenta asiacute las condiciones de estreacutes intriacutensecas a

las que estaacuten expuestas estas plantas de paacuteramo las cuales suministran valiosos bienes y servicios

ecosisteacutemicos como el abastecimiento continuo de agua para usos domeacutesticos agriacutecolas e

industriales (Buytaert et al 2006 4) servicios que se podriacutean ver en decrecimiento si las

ventanas de oportunidades se abren con maacutes frecuencia dando pie al cambio de estado de los

hongos endoacutefitos que existen dentro de los frailejones de la zona

En los paacuteramos de Chingaza Rabanal Guerrero Iguaque Merchaacuten y Sumapaz se han

realizado estudios de aislamientos de hongos en especies de frailejoacuten diferentes a la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana tales como Espeletia argentea Espeletia arbelaezii Espeletia

boyacensis Espeletia grandiflora Espeletia miradorensis y Espeletia uribei por ende se ha

reportado la presencia de hongos endoacutefitos y fitopatoacutegenos (Tabla 2) (Gaitan 2018 17)

Frailejones Espeletia

argentea

Espeletia

arbelaezii

Espeletia

boyacensis

Espeletia

grandiflora

Espeletia

miradorensis

Espeletia

uribei

Aspergillus X X X X

Annulohypoxylon X X X

Curvularia X X X

Epicoccum X X X

Fusarium X X X

41

Tabla 2 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = a presencia del genero de

hongo dentro de la especie de frailejoacuten

Los geacuteneros de hongos en rojo son los geacuteneros que se encontraron en comuacuten con los

geacuteneros hallados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana de un total de 15 geacuteneros 3

han sido reportados anteriormente en estudios similares ( 20 de geacuteneros identificados)

Dentro de un marco de cambio climaacutetico es importante la metodologiacutea de muestreo

como lo fue el formato de muestreo en puntos aleatorios realizado en el presente estudio se llevoacute

acabo principalmente por la homogeneidad de los frailejones en el paacuteramo como lo indica el

manual de meacutetodos baacutesicos de muestreo y anaacutelisis de ecologiacutea vegetal (BOLFOR 2000 9) donde

se menciona que el muestreo aleatorio se utiliza cuando se dispone de poca informacioacuten previa de

las caracteriacutesticas de las poblaciones a medirse en este caso la poblacioacuten a identificarse fueron

los hongos endoacutefitos que se hallaban dentro de las formaciones homogeacuteneas de los frailejones

No obstante el muestreo aleatorio tambieacuten presenta limitaciones a la hora de comparar los

hongos endoacutefitos a lo largo del gradiente altitudinal (muestreo aleatorio estratificado) dejando de

percibir informacioacuten proveniente de los distintos microclimas que se encuentran y de las

incidencias que podriacutean causar a la hora de identificar los geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten ademaacutes de posibles micro efectos del cambio climaacutetico a lo

largo del gradiente altitudinal (Caacutemara et al 2008)

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio Climaacutetico

Nigrospora X X X X X

Penicillium X X X

Pleospora X X X X

Trichoderma X X X X

42

Las teacutecnicas empleadas en este estudio para lograr aislar e identificar los hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana se hacen importantes dentro del cambio

climaacutetico debido a que el margen de error en la identificacioacuten molecular es reducido (Bakermans

et al 2014) Al ser reducido el margen de error se pudo conocer con mayor certeza que especies

y geacuteneros de hongos endoacutefitos se encuentra dentro de la planta

Al conocer sus identidades es posible conocer las capacidades que tienen cada una de

estas especies de hongos endoacutefitos de producir metabolitos secundarios de infiltrarse y proteger

los tejidos de la planta de condiciones bioacuteticas y abioacuteticas competir contra herbiacutevoros y

fitopatoacutegenos (Schulz et al 2002) Con sus capacidades reconocidas es posible vincular los

efectos del cambio climaacutetico como estreacutes hiacutedrico aumento de la temperatura migraciones

tempranas enfermedades emergentes aumentos de la precipitacioacuten y heladas severas con las

reacciones por parte de los hongos endoacutefitos Estas reacciones podriacutean desencadenar aumentos de

la patogenicidad en las poblaciones de frailejones debido a los constantes disturbios y estreacutes al

que se ve sometido la planta generando asiacute notables declives poblacionales (Mendoza 2010)

Las relaciones filogeneacuteticas entre las especies halladas toman relevancia debido a las

sinergias positivas o negativas que se pueden presentar dependiendo de las especies que se

encuentren asociadas dentro de la planta (Lamichhane y Venturi 2015) como por ejemplo

Nigrospora y Colletotrichum pueden activar una sinergia negativa aumentando la virulencia y

afectando la especie Espeletia hartwegiana

Las especies de hongos endoacutefitos se identificaron por medio de secuencias obtenidas de

las regiones ITS (regioacuten de espaciadores internos transcritos) las cuales son regiones altamente

conservadas con tasas de evolucioacuten muy lentas en el tiempo permitiendo hacer inferencias

filogeneacuteticas (Baldwin et al 1995 Hamby y Zimmer 1992) es por ello que se usaron para

generar las diferentes identificaciones de los hongos endoacutefitos logrando asiacute identificar al geacutenero

Nigrospora con un total de 7 especies N sacchari N rubi N sphaerica N hainanensis N

gorlenkoana N oryzae y N aurantiaca pertenecientes a la familia Apiosporaceae orden

Xylariales Divisioacuten Ascomicota (veacutease figura 11) (Wang et al 2017)

Dentro del marco del cambio climaacutetico Nigrospora se caracteriza por poseer una

distribucioacuten cosmopolita y una amplia gama de hueacutespedes como lo es en este caso la especie E

hartwegiana que habita en los Andes Tropicales que se veraacuten alterados por los efectos del

cambio climaacutetico este geacutenero se ha logrado aislar en su forma endoacutefita en tallos y hojas de

43

diversas plantas tambieacuten como saprofitos en detritos hojarasca y larvas muertas (Uzor et al

2015 1)

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

Los hongos endoacutefitos hallados en esta investigacioacuten se encontraron dentro de la especie

de frailejoacuten E hartwegiana la cual pertenece a los Andes Tropicales ubicados maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos Estos ecosistemas son sensibles a los efectos del cambio

climaacutetico por su altura su alto endemismo y su sensibilidad al efecto de borde Cuando las

especies lentildeosas empiecen a migrar a lo largo del gradiente altitudinal es posible que los

frailejones se encuentren con suelos agrestes en donde sus semillas no podraacuten fijarse y los efectos

adversos de hongos como Nigrospora N oryzae y N sphaerica seraacuten maacutes notables

aprovechando las ventanas de oportunidad que generen los desbalances climaacuteticos (Sharma et al

2013)

Los cambios en los patrones climaacuteticos potenciaran la especie N sphaerica dentro del

frailejoacuten la cual tiene la capacidad de causar tizoacuten foliar en la especie Camellia sinensis siendo

una planta de teacute perteneciente a la divisioacuten de las magnolifiotas como el geacutenero Espeletia (Liu et

al 2015) Nigrospora fue el geacutenero maacutes ampliamente aislado en las identificaciones generadas a

partir de las hojas de frailejoacuten esto se veriacutea explicado debido a que N sphaerica tiene un

mecanismo de descarga de esporas efectivo que puede proyectar a la fuerza sus esporas a una

distancia de hasta 2 cm en vertical y 68 cm en horizontal como lo demostroacute Webster (1952)

ademaacutes el estudio de Wu y colaboradores (2004) tambieacuten evidencioacute que las esporas de

44

Nigrospora son uno de los grupos maacutes dominantes en la atmoacutesfera y estaacuten asociadas con

tormentas de polvo

La gran capacidad colonizadora del geacutenero Nigrospora le permite adaptarse a las

condiciones climaacuteticas cambiantes con la estrategia de dispersioacuten de sus esporas logrando

distanciarse del frailejoacuten hospedero para encontrar nuevos hospederos producto de las

migraciones tempranas a lo largo del gradiente altitudinal (Riveros 2010)

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

por encima del 80 lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen menos

mutaciones en los nodos internos del aacuterbol basados en la distribucioacuten de probabilidad asignadas

a los posibles arboles resultantes dando lugar a una hipoacutetesis evolutiva maacutes confiable (Schmidt y

Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 es decir el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes

corto (menos cambios) y el cual se ajusta mejor a los datos (Swofford 1997)

Teniendo asiacute una inferencia filogeneacuteticamente robusta los geacuteneros Collectotrichum y

Nigrospora pertenecen a la Divisioacuten Ascomycota ambos geacuteneros son particularmente agresivos

con las plantas en especial la especie Colletotrichum gloeosporioides la cual es la fase asexual

de Glomerella cingulata (Raj et al 2013) Se caracteriza por tener un amplio rango de

hospederos entre ellos el frailejoacuten a los cuales les causa una enfermedad conocida pudricioacuten

amarga antracnosis o chancros siendo esta la necrosis de frutos flores nervios y tallos

(Gonzaacutelez et al 2006 4)

Uno de los primeros reportes de afectaciones a especies de frailejoacuten se obtuvo en el 2009

en el Parque Natural Nacional Chingaza Colombia en donde encontraron las especies de

frailejoacuten Espeletia grandiflora y Espeletia uribei afectadas debido a insectos y una especie de

hongo del genero Colletotrichum (Medina 2009- 9 Hartung y Burton 1981)

Por ende que estos dos geacuteneros de hongos se encuentren juntos podriacutea tener

implicaciones en el aumento de virulencia potenciado a su vez por los desbalances abioacuteticos

causados por el cambio climaacutetico como lo han mencionado Belisario y colaboradores (2002) es

posible que las afectaciones no sean producidas por un uacutenico hongo si no por un complejo de

varios generando sinergismos entre diferentes especies que solas no hariacutean dantildeo a la planta pero

juntas podriacutean ser causantes de enfermedad (Lamichhane y Venturi 2015 4) aun mas en un

45

marco de cambio climaacutetico que gradualmente aumenta sus efectos nocivos sobre los paacuteramos

aumentando la temperatura cambios en la precipitacioacuten heladas intensas cambios en la

nubosidad mayor exposicioacuten a la radiacioacuten solar teniendo por resultado un iacutendice de estreacutes

mayor en las plantas de paacuteramo generando ventanas de oportunidades para que los hongos

endoacutefitos modifiquen sus roles de protector a patoacutegeno

En frailejones tambieacuten se ha reportado la presencia de Nigrospora y Trichoderma por

Bonilla y Argenis (2005) maacutes especiacuteficamente en la especie Espeletia grandiflora la cual es una

especie que habita en los paacuteramos de Colombia Ecuador y Venezuela en conjunto con Espeletia

hartwegiana (Luteyn 1999 3) El hecho que existan estos dos geacuteneros presentes en los frailejones

advierte de un equilibrio entre hongos endoacutefitos que se puede romper bajo las tensiones del

cambiante clima maacutes aun en los sensibles paacuteramos alto andinos

En cuanto a N sacchari se tiene reporte que es un productor de metabolitos con una

notable actividad herbicida demostrado en plantas cultivadas en invernadero (Fukushima et al

1998 2) debido a que existe evidencia que sugiere que los hongos endoacutefitos han evolucionado

directamente de hongos patoacutegenos (Schulz et al 1999 4) sumado al estreacutes del cambio climaacutetico

en cualquier momento de extrema tensioacuten hiacutedrica caloacuterica o heladas en estos ecosistemas de alta

montantildea Estos anomaliacuteas ambientales podriacutea disparar mecanismos de accioacuten fitopatoacutegenos

dentro de los frailejones generando un declive notable en sus poblaciones y por ende un declive

de la cantidad recurso hiacutedrico aguas abajo y su regulacioacuten (Diacuteaz et al 2002 5)

Como se mencionoacute anteriormente los medios de propagacioacuten de estos hongos endoacutefitos

pueden ser por medio de esporas que estaacuten en el ambiente aunque tambieacuten los vectores que

juegan un rol clave en su dispersioacuten son los insectos ya que estos pueden transportar esporas o

partes del hongo en su cuerpo patas o aparato bucal (Eigenbrode et al 2018 5)

Considerando la dispersioacuten homogeacutenea de los frailejones dentro del paacuteramo la carga

esporas en el ambiente y la herbivoriacutea de insectos es probable que se puedan ver infectados la

mayoriacutea de individuos (Varela 2016) es por ello que en el futuro puede que las afectaciones en

frailejones no sean producidas por hongos fitopatoacutegenos si no por hongos endoacutefitos que tuvieron

la ventana de oportunidad gracias al cambio climaacutetico aumento de la temperatura aumento en

las concentraciones de CO2 y alteraciones de precipitacioacuten que pueden hacer susceptible la planta

al ataque de estos hongos (Chakraborty 2011 Elad y Pertot 2014)

46

Para que se genere la enfermedad esta depende de la interaccioacuten de tres o cuatro factores

1) hospedero susceptible 2) agente causal (virulento) 3) condiciones ambientales favorables y 4)

tiempo (Francl 2001 2) la falta de alguno de ellos no permite que el patoacutegeno produzca la

enfermedad en la planta debido a ello algunas especies de frailejoacuten pueden tener una o dos cepas

que puedan actuar como fitopatoacutegenos pero no estaacuten activas si no estaacute completa su asociacioacuten

con otro patoacutegeno u otro factor

Ademaacutes existe un estudio que evaluoacute el efecto de la temperatura sobre la capacidad de

Fusarium verticillioides para generar infeccioacuten en plantas de maiacutez se probaron bajo 3 escenarios

de temperatura como resultados obtuvieron que la enfermedad de este hongo se veiacutea potenciada

por el aumento de temperatura en temperaturas por encima de 35degC (Murillo et al 2008) este

estudio da soporte a la hipoacutetesis de que existen factores que influyen significativamente a la

infeccioacuten en la planta tal vez el paacuteramo difiacutecilmente alcance 35degC no obstante la mayoriacutea de

especies son sensibles a cambios de temperatura de hasta de 1degC en donde modifican su

comportamiento rutas metaboacutelicas interacciones ecoloacutegicas y por ende sus defensas se ven

alteradas

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e Hypocrea

El geacutenero Trichoderma con seis especies diferentes (veacutease figura 12) fue el segundo

geacutenero maacutes numeroso despueacutes de Nigrospora que contoacute con siete especies aunque las primeras

especies que se analizaron fueron especies que principalmente actuaban generando enfermedades

en las plantas en las que se encontraban ante disturbios el geacutenero Trichoderma pertenece a la

47

familia Hypocreaceae y se caracteriza por tener una gran capacidad biocontroladora sobre

fitopatoacutegenos como Fusarium oxysporum los cuales podriacutean llegar masivamente con las

migraciones tempranas de insectos y plantas lentildeosas (Miles et al 2012 7)

No solo actuacutean repeliendo patoacutegenos internos si no tambieacuten patoacutegenos externos como

insectos que desean consumir u aprovechar la planta ya que estos pueden secretar diferentes

metabolitos secundarios y enzimas que actuacutean inhibiendo su desarrollo (Boughalleb-M et al

2018 8)

Es bien conocido que el geacutenero Trichoderma produce amplio rango de sustancias

antibioacuteticas ademaacutes de poseer la caracteriacutestica de parasitar otros hongos (Howell 2002 6)

Debido a la competencia que generan las especies del genero Trichoderma por espacio y

nutrientes inhiben o degradan pectinasas y otras enzimas que son esenciales para que los hongos

fitopatoacutegenos como Botrytis cinerea penetre en la superficie de las hojas logrando proteger de

esta forma al frailejoacuten que se veraacute expuesto a nuevas amenazas microbioloacutegicas auspiciadas por

los cambios en los patrones climaacutetico (Zimand et al 1996)

Ademaacutes de la capacidad del Trichoderma sp para atacar o inhibir el crecimiento de

patoacutegenos de plantas directamente descubrimientos recientes indican que tambieacuten pueden inducir

resistencia sisteacutemica y localizada a una variedad de patoacutegenos de plantas tales como el frijol es

protegido por Trichoderma harzianum de especies fitopatoacutegenas como Colletotrichum

lindemuthianum Botrytis cineacuterea las cuales producen lesiones en las hojas de la planta (Harman

y Howell 2004) Incluso se descubrioacute que ciertas especies de Trichoderma tienen una influencia

sustancial en el buen crecimiento y desarrollo de las plantas sin y con condiciones de estreacutes

climaacutetico (Lorito 1998)

Como lo demostraron Bonilla y Argenis (2005) en su estudio llevado a cabo en el

frailejoacuten Espeletia grandiflora diferentes cepas pertenecientes a Trichoderma pueden proteger

esta especie de paacuteramo de organismos fitopatoacutegenos emergentes por el cambio climaacutetico por

ende si puede proteger a E grandiflora tambieacuten puede proteger la especie E hartwegiana lo

que le permitiraacute sobrellevar diferentes ataques fortuitos de patoacutegenos e insectos que nunca han

logrado alcanzar las altitudes de paacuteramo (3200 - 5000 m)

Cuando el cambio climaacutetico aumente la temperatura en 1degC o 2degC traeraacute consigo sus

efectos de modificacioacuten en cuanto a la estructura y composicioacuten de las especies de plantas que

48

existen en zonas altas para este escenario basado en los caacutelculos de Thuiller (2007) las especies

se habriacutean desplazado en el gradiente altitudinal aproximadamente 450 metros para el antildeo 2070

Las consecuencias de este desplazamiento serian uacutenicas debido a que gran cantidad de

insectos y patoacutegenos tendriacutean migraciones tempranas en el gradiente altitudinal en buacutesqueda de

su optimo teacutermico llevando a cabo un proceso conocido como Termofilizacioacuten (Cuesta et al

2019) es ahiacute donde entra en juego la proteccioacuten que le pueden brindar especies endoacutefitos como

las que pertenecen al geacutenero Trichoderma en el marco de cambio climaacutetico

En concordancia con las cepas de Trichoderma y el geacutenero Hypocrea que tambieacuten

pertenece a la familia Hypocreaceae se conocen maacutes de 700 secuencias de peptaiboles (peacuteptidos

bioloacutegicamente activos) de ambos geacuteneros donde algunos de eacutestos son ecoloacutegica y

comercialmente relevantes debido a su potencial antimicrobiano actividad enzimaacutetica uacutetil para

competir por espacio y alimento de los nuevos patoacutegenos emergentes procedentes de las

alteraciones climaacuteticas y las migraciones tempranas (Degenkolb et al 2008 6)

En cuanto al geacutenero Hypocrea tambieacuten se ha reportado actividad antimicrobiana y anti

fuacutengica contra Staphylococcus aureus y Fusarium oxysporum (Gogoi et al 2008 2) habitando

los geacuteneros Trichoderma e Hypocrea dentro de especies de frailejoacuten como E hartwegiana se

espera que puedan generar sinergias de proteccioacuten que las ayude a combatir los fuertes y

extremos eventos climaacuteticos

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

del 100 (veacutease figura 13) lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen

menos mutaciones en los nodos internos del aacuterbol por ende este aacuterbol contiene la menor

cantidad de mutaciones o cambios dentro sus nodos internos teniendo como resultado una

hipoacutetesis evolutiva confiable (Schmidt y Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 que

indica que el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes corto (menos cambios) y el cual se ajusta

mejor a los datos (Swofford 1997)

49

El geacutenero Annulohypoxylon es de importancia dentro del marco del cambio climaacutetico ya

que pertenece a la familia Xylariaceae y se caracteriza por poseer metabolitos secundarios

antitumorales-citotoacutexicos como la anuloescuamulina que ayudan a combatir el estreacutes abioacutetico

(Cheng et al 2012) estas cepas de hongos son principalmente saprofitos y oportunistas han sido

reportadas en hojas sanas y afectadas de frailejones en otros estudios (Gonzaacutelez 2012 Nonsoque

2012) siendo un geacutenero resiliente a las perturbaciones ambientales como los cambios en los

patrones climaacuteticos su relacioacuten como mutualista dentro del frailejoacuten se mantendraacute hasta que el

frailejoacuten se adapte o colapse ante el estreacutes abioacutetico

Aunque no se conocen como fitopatoacutegenos al contrario pueden actuar como mutualistas

no se descarta que puedan estar involucrados en el desarrollo de diferentes enfermedades en

plantas cuando las condiciones ecosistemicas se alteran a puntos extremos (Gonzalez et al 2017)

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon Biscogniauxia

Nemania y Humiacutecola

El geacutenero Daldinia posee unos valores de MPML correspondientes a 10094 con lo cual

se encuentra bien soportado estadiacutesticamente el geacutenero Daldinia se encuentra ubicado en la

familia Xylariaceae al igual que el geacutenero Hypoxylon Biscogniauxia y Nemania que en su

respectivo orden contienen un soporte estadiacutestico MPML de 10082 10099 y 100100 (veacutease

figura 14) los cuales pertenecen a la divisioacuten Ascomycota las cepas de Daldinia se caracterizan

principalmente por ser especies endoacutefitas teniendo la capacidad de estar dentro de su hueacutesped

mucho tiempo sin causarle dantildeo o al menos un dantildeo evidente por medio de su estado asexual

50

No obstante su estado se puede modificar cuando las condiciones externas se modifican

abruptamente en poco tiempo como es el caso de las alteraciones en la temperatura

precipitacioacuten y concentraciones de dioacutexido de carbono (CO2) auspiciados por el cambio

climaacutetico (Saacutenchez et al 2013)

Un estudio realizado por Prieto (2017) en la especie de frailejoacuten E grandiflora encontroacute

que la especie Daldinia eschscholtzii estaba asociado en el siacutentoma de clorosis (falta de clorofila

en las hojas) Tambieacuten se reportoacute que especies de Daldinia como Daldinia conceacutentrica tienen la

capacidad de controlar nematodos fitopatoacutegenos (Silva et al 2020 104) los cuales pueden invadir

y romper los tejidos de la planta dantildeando sus estructuras los nematodos tambieacuten seraacuten sujetos a

migraciones tempranas por el cambio climaacutetico que trae consigo presiones de seleccioacuten por ende

nuevas amenazas para los frailejones (Nakashima et al 2007)

Como hemos visto hasta este punto las especies de hongos endoacutefitos se muestran en

muchos casos como benefactores y protectores de las diferentes plantas en las que habitan

incluyendo diferentes especies de frailejones

Los hongos endoacutefitos protegen tanto de factores bioacuteticos como virus hongos

fitopatoacutegenos bacterias insectos y factores abioacuteticos como las intemperancias del clima no

obstante en su relacioacuten endoacutefita geacuteneros como Hypoxylon que pertenece igual que Daldinia a la

familia Xylariaceae pueden tener roles amenazadores en conjunto con el cambio climaacutetico

seguacuten Gonzales y colaboradores (2019) inocularon cepas pertenecientes al geacutenero Hypoxylon en

hojas de Theobroma cacao y encontraron que en 48 horas se comenzoacute a notar las marcas de

clorosis y deshidratacioacuten foliar esto demuestra que cepas de este geacutenero pueden tener efectos

fitopatoacutegenos ocasionando muerte descendente pudricioacuten del tronco negro y resinosis de ramas

de mezquite (De la Torre-Almaraacutez et al 2003 De la Torre-Almaraacutez et al 2009)

La presencia de este geacutenero dentro del frailejoacuten en un marco del cambio climaacutetico lo

convierte en una amenaza latente ya que las condiciones seraacuten cada vez maacutes agrestes en los

paacuteramos de los Andes Tropicales Puede favorecer el desarrollo de este geacutenero que tiene las

enzimas necesarias para producir la pudricioacuten del tronco negro entre otras enfermedades

relevantes

51

Tambieacuten las especies del geacutenero Hypoxylon se han reportado como endoacutefitos en tejidos de

plantas lentildeosas o herbaacuteceas (Petrini y Petrini 1985 3) asiacute como saprofitos o fitopatoacutegenos

deacutebiles en madera de aacuterboles de zonas templadas o tropicales (Miller 1961) como lo menciona

Miller (1961)

Los geacuteneros Biscogniauxia Nemania tambieacuten estaacuten dentro de la familia Xylariaceae y

Divisioacuten Ascomycota un aspecto interesante de las especies de Biscogniauxia es que son

paraacutesitos exclusivos de las angiospermas dicotiledoacuteneas en donde concluyeron que todas las

especies pertenecientes a este geacutenero son patoacutegenos umllevesuml que se aprovechan de situaciones de

sequiacutea y estreacutes hiacutedrico para aumentar su patogenicidad (Ju et al 1998)

La especie de frailejoacuten E hartwegiana es una Dicotiledoacutenea eso explica porque

podemos encontrar esta especie de hongo endoacutefito en el frailejoacuten del presente estudio siendo de

vital importancia denotar que las especies de Biscogniauxia se aprovechan especialmente de las

situacioacuten de sequiacutea y estreacutes hiacutedrico difiacutecilmente las especies de este geacutenero podriacutean afectar a los

frailejones debido a que se caracterizan por ser reguladores de los ciclos hiacutedricos el agua es el

recurso que maacutes tiende a existir en un paacuteramo por la estructura de sus suelos compuesta por

andosoles porosos y necromasa acumulada teniendo asiacute un alto iacutendice de retencioacuten hiacutedrica

(Hernandez y Muntildeoz 2015) de modo que el cambio climaacutetico no favorece al geacutenero

Biscogniauxia en su estado patogeacutenico dentro del ecosistema de paacuteramo

En cuanto al geacutenero Nemania Da Silva y colaboradores (2018) llevaron a cabo una

investigacioacuten en la cual identificaron cepas pertenecientes a los geacuteneros Colletotrichum

Phyllosticta Xylaria Nemania y Alternaria en la especie ornamental Pachystachys lutea en

donde las mismas cepas fueron ensayadas para inhibir el crecimiento de hongos fitopatoacutegenos

como Colletotrichum sp en donde encontraron que Nemania era capaz de inhibir por medio de la

secrecioacuten de distintas enzimas el crecimiento de dichas especies gracias a su actividad

enzimaacutetica el geacutenero Nemania puede compensar los desequilibrios causados por el cambio

climaacutetico en teacuterminos de hongos fitopatoacutegenos

Hay que tener en cuenta que los elementos que dan forma a las interacciones planta-

endoacutefito incluyen el modo de transmisioacuten el patroacuten de infeccioacuten la edad de la planta las

condiciones ambientales potenciadas por el cambio climaacutetico y los antecedentes geneacuteticos (Aly et

al 2011 6) Los frailejones de la especie E hartwegiana que se muestrearon para el estudio se

52

tomoacute las hojas sanas lo que indica que poseiacutean estas cepas de endoacutefitos en equilibrio siendo este

uno de los pocos reportes de este geacutenero en especies de alta montantildea en los Andes Tropicales

El geacutenero Humiacutecola se encuentra soportado por un MPML de 10076 siendo una

hipoacutetesis evolutiva considerable es el uacutenico de la figura 14 que no estaacute dentro de la familia

Xylariaceae ya que pertenece a la familia Chaetomiaceae aunque se halla en la divisioacuten

Ascomycota se podriacutea considerar a la especie Humiacutecola fuscoatra como una de las especies de

endoacutefitos maacutes umlinofensivasuml debido a trabajos de investigacioacuten reportados como el de Menzies y

colaboradores (1998) y el de Naik y colaboradores (2009)

Humiacutecola fuscoatra no se considera un peligro latente para la especie E hartwegiana ya

que existe en equilibrio con su entorno Estaacute comprobado por medio de caracterizaciones

quiacutemicas que Humiacutecola fuscoatra es un importante productor de moleacuteculas de estimacioacuten

medica como el resorciacuteclico y lactonas aacutecidas (Mejia et al 2014) Por lo tanto es una especie

prometedora con un reservorio de metabolitos secundarios de importancia medicinal e industrial

que de seguir los efectos nocivos del cambio climaacutetico en los Andes Tropicales maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos esta especie podriacutea desaparecer

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies Massarina

Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

Uno de los grupos mejores soportados en este cladograma es el grupo de Diaporthe en el

cual se encontraron cuatro especies siendo uno con maacutes abundancia de especies del estudio y que

posee un MPML de 10085 10089 y 10095 acorde a sus 3 nodos (veacutease figura 15) teniendo asiacute

una hipoacutetesis evolutiva confiable de estas relaciones las especies de Diaporthe pertenecen a la

familia Diaporthaceae de la divisioacuten Ascomycota y son especies de endoacutefitos que se distinguen

por inhibir el crecimiento de hongos patoacutegenos en el hospedero que se encuentren El estudio de

53

Da Silva y colaboradores (2018) mostroacute que cepas de Diaporthe sp Inhibieron el crecimiento de

Fusarium oxysporum y Colletotrichum sp hongos fitopatoacutegenos que aumentaran su presencia

aprovechando las alteraciones producidas por el cambio climaacutetico en los paacuteramos

Las especies de este geacutenero estaacuten en continuo cambio entre endoacutefitos y patoacutegenos

funcionando en la mayoriacutea de los casos en una relacioacuten mutualista en donde le brindan a la planta

mayor tolerancia a las sequias proteccioacuten de patoacutegenos y pestes caracteriacutestica uacutetil frente a los

retos ecoloacutegicos que plantea el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales (Hubbard et al 2014)

se conocen cerca de 800 especies de este geacutenero asociadas a una amplia gama de plantas

vasculares a nivel mundial (Rossman et al 2015)

Esto explica porque las especies de Diaporthe fueron una de las maacutes numerosas

encontradas en la especie de alta montantildea E hartwegiana teniendo en cuenta que esta especie

pasa raacutepidamente de un estado endoacutefito a un estado patogeacutenico y dada su faacutecil y alta distribucioacuten

representa un peligro en conjunto con el cambio climaacutetico para las especies de alta montantildea como

los frailejones y supone una amenaza para el balance hiacutedrico y ecosistemico en el futuro

El geacutenero Crassiparies de la familia Neohendersoniaceae y el geacutenero Massarina de la

familia Massarinaceae pertenecen al orden Pleosporales aunque se discute debido a las

similaridades morfoloacutegicas y genoacutemicas con Massarina si Crassiparies deberiacutea estar en la

familia Massarinaceae (Hyde et al 2013 4) Se tiene poca informacioacuten sobre la especie

Crassiparies quadrisporus por ende este puede ser uno de los primeros reportes de esta especie

en una especie de alta montantildea como lo es el frailejoacuten especiacuteficamente en la especie E

hartwegiana en un marco de cambio climaacutetico el geacutenero Crassiparies necesita mayores estudios

a nivel ecoloacutegico y microbioloacutegico para entender su papel dentro de esta crisis climaacutetica

Mientras tanto el geacutenero Massarina ha logrado ser aislado de agua dulce con el fin de

obtener fuentes de productos naturales bioloacutegicamente activos por medio de las investigaciones

quiacutemicas de Shearer (1999 2001) en una especie de Massarina obtuvieron como resultado el

aislamiento de tres nuevos sequiterpenoides y dos lactonas derivadas de policeacutetidos con nuevos

sistemas de anillos lo que indica que esta especie tambieacuten puede tener un rol importante

mediante la produccioacuten de enzimas y metabolitos secundarios en el marco de las invasiones

bioloacutegicas impulsadas por el cambio climaacutetico

54

El geacutenero Cryptocoryneum de la familia Cryptocoryneaceae existe poca informacioacuten de

sus mecanismos de accioacuten como endoacutefito o patoacutegeno maacutes aun en especies de los Andes

Tropicales este podriacutea ser uno de los primeros reportes sobre esta especie de hongo en una

especie de frailejoacuten especiacuteficamente E hartwegiana en el 2015 se reportoacute en Brasil el

descubrimiento de una nueva especie del genero Cryptocoryneum trataacutendose de Cryptocoryneum

parvulum hallada en las hojas de la especie Araucaria angustifolia (Gimnosperma) (Silva et al

2015 1) la informacioacuten sobre el geacutenero Cryptocoryneum en relacioacuten al cambio climaacutetico y sus

efectos dentro de especies de alta montantildea como el frailejoacuten auacuten son poco conocidas

Uno de los geacuteneros maacutes cercanos a los grupos externos del cladograma es Cyphellophora

perteneciente a la familia Cyphellophoraceae el cual posee un MPML de 10091 logrando una

hipoacutetesis evolutiva confiable Diversas especies de Cyphellophora han logrado ser aisladas de

infecciones superficiales de la piel o las untildeas en humanos y de materiales vegetales (Decock et

al 2003 Cheewangkoon et al 2009) Esto indica su amplia distribucioacuten y su capacidad para ser

patogeacutenica tanto en plantas como en animales maacutes aun en condiciones desfavorables para la

planta como son las condiciones de cambio climaacutetico

De la especie Cyphellophora reptans se tiene reporte que su morfologiacutea es muy similar a

la de una levadura por lo que es faacutecilmente confundida con una (Reacuteblovaacute et al 2013) Es posible

que este sea el uacutenico reporte de Cyphellophora reptans en las hojas de un frailejoacuten o especie de

alta montantildea que habite en los troacutepicos como E hartwegiana debido a ello sus mecanismos de

accioacuten en especies de paramo dentro de un marco de cambio climaacutetico es poco conocido Se

necesitan mayores estudios enfocados en esta especie para entender su ecologiacutea y dinamismo

ecoloacutegico respecto a los cambios en las variables ambientales

Se eligieron las especies Coprinellus domesticus y Coprinellus xanthothrix como grupos

externos con el fin de enraizar el aacuterbol debido a que pertenecen a la Divisioacuten Basidiomycota la

cual difiere en grado de la divisioacuten Ascomycota aunque conserva semejanzas conocidos como

caracteres ancestrales o plesiomorficos que avanzan a medida la filogenia se construye con los

datos de las diferentes secuencias de especies evidenciando novedades evolutivas conocidas

como apomorfias que cuando se dan en un grupo en particular pasan a ser sinapomorfias es decir

novedades evolutivas dentro de un grupo particular (Lehtonen 2020) Se optoacute por enraizar con

55

estas dos especies con el objetivo de dar robustez al aacuterbol filogeneacutetico (Barriel y 1998) lo cual se

consiguioacute como se nota en los estadiacutesticos del aacuterbol filogeneacutetico

56

57

Conclusiones

Se rechaza la hipoacutetesis nula (H0) y se concluye que la identificacioacuten y caracterizacioacuten

molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo Colombia es diferente en 80 de sus geacuteneros y

especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos realizadas en especies de frailejoacuten

Por lo tanto los nuevos geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos encontrados en el frailejoacuten

plantean nuevos desafiacuteos respecto al cambio climaacutetico ya que tienen un rol vital en la

supervivencia de estas especies de alta montantildea como los frailejones debido a su relacioacuten

mutualista o patoacutegena maacutes aun en los paacuteramos que son altamente sensibles a los efectos del

cambio climaacutetico incluso tan sensibles como las zonas polares (Bradley et al 2006)

La mayoriacutea de especies encontradas en el presente estudio tienen potencial para ayudar a

combatir el estreacutes abioacutetico producido por el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales

Especiacuteficamente pueden ayudar a combatir el estreacutes bioacutetico producido por virus hongos

bacterias e insectos en un marco de cambio climaacutetico aumentos de temperatura cambios en la

concentracioacuten de CO2 cambios en la precipitacioacuten migraciones tempranas cambios en la

nubosidad disponibilidad hiacutedrica alteraciones en la estructura y composicioacuten de las especies

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58

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Anexos

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombia

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia

hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

74

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

Coordenadas Geograacuteficas

(Latitud)

De la Colecta del

Material Bioloacutegico total de 15

muestras (Longitud)

LAT N 4deg 37 5871717 LONG W 75deg 25

3292611

LAT N 4deg 37 5885220 LONG W 75deg 25

3271217

LAT N 4deg 37 5884485 LONG W 75deg 25

3312103

LAT N 4deg 36 5995487 LONG W 75deg 27

3045854

LAT N 4deg 37 6195784 LONG W 75deg 30

3292611

LAT N 4deg 40 159171 LONG W 75deg 26

380142

LAT N 4deg 40 363762 LONG W 75deg 26

209072

LAT N 4deg 40 399832 LONG W 75deg 27

173554

LAT N 4deg 40 383965 LONG W 75deg 27

464325

LAT N 4deg 39 486438 LONG W 75deg 27

173559

LAT N 4deg 40 56894 LONG W 75deg 26

568287

LAT N 4deg 40 159174 LONG W 75deg 27

190654

LAT N 4deg 40 125083 LONG W 75deg 26

345912

LAT N 4deg 40 116691 LONG W 75deg 27

208264

LAT N 4deg 40 314698 LONG W 75deg 27

140791

75

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un estereoscopio con el propoacutesito de seleccionar la

maacutes indicada y luego sembrar un cultivo puro a partir de ese micelio

76

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados las

copias se conservaron con glicerol a -80degC en un ultra congelador de Thermo Scientifictrade

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas

y enviadas

77

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicos de forma segura y esteacuteril propiedad de la Universidad del Quindiacuteo

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a la Universidad Ruhr de Bochum (Alemania)

78

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de parsimonia

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X en donde se

observa en amarillo la secuencia umlTCATTAuml la cual es una secuencia altamente conservada

que se usa para marcar el inicio de la misma en hongos endoacutefitos

79

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa JmoldelTest usados para generar el

aacuterbol de relaciones filogeneacuteticas a partir de la regioacuten ITS de los hongos endoacutefitos aislados

total de modelos evaluados 88

ID Nombre Particioacuten lnL P AIC detaAIC Peso Cumpeso Udelta

1 JC 0 100820157 138 204400314 1341348 0 1 -

2 JC+I 0 98912511 139 200605022 9618188 0 1 -

3 JC+G 0 95470113 139 193720225 2733392 0 1 -

4 JC+I+G 0 95467507 140 193735014 274818 0 1 -

5 F81 0 100658095 141 204136189 13149356 0 1 -

6 F81+I 0 98761481 142 200362962 9376128 0 1 -

7 F81+G 0 95314814 142 193469628 2482794 0 1 -

8 F81+I+G 0 95324364 143 193508729 2521895 0 1 -

9 K80 10010 99734495 139 20224899 11262157 0 1 -

10 K80+I 10010 97835191 140 198470382 7483549 0 1 -

11 K80+G 10010 94227821 140 191255643 268809 0 1 -

12 K80+I+G 10010 94209963 141 191239926 253092 0 1 -

13 HKY 10010 99648091 142 202136181 11149348 0 1 -

14 HKY+I 10010 97761512 143 198383024 7396191 0 1 -

15 HKY+G 10010 94170799 143 191201599 214765 0 1 -

16 HKY+I+G 10010 94118678 144 191117357 130523 600E-04 0999 -

17 TrNef 10020 99564653 140 201929306 10942472 0 1 -

18 TrNef+I 10020 97712623 141 198245245 7258412 0 1 -

19 TrNef+G 10020 94150977 141 191121955 135121 400E-04 09994 -

20 TrNef+I+G 10020 94132131 142 191104263 117429 00011 09959 -

21 TrN 10020 99563809 143 201987618 11000784 0 1 -

22 TrN+I 10020 97702964 144 198285929 7299095 0 1 -

23 TrN+G 10020 94094235 144 191068469 81635 00065 09719 -

24 TrN+I+G 10020 94101378 145 191102757 115923 00012 09948 -

25 TPM1 12210 99713879 140 202227759 11240925 0 1 -

26 TPM1+I 12210 97826641 141 198473282 7486449 0 1 -

27 TPM1+G 12210 94249837 141 191319674 33284 0 1 -

28 TPM1+I+G 12210 942022 142 1912444 257566 0 1 -

29 TPM1uf 12210 99663473 143 202186945 11200112 0 1 -

30 TPM1uf+I 12210 97879458 144 198638917 7652083 0 1 -

31 TPM1uf+G 12210 94137349 144 191154699 167865 100E-04 09999 -

32 TPM1uf+I+G 12210 94141897 145 191183794 196961 0 1 -

80

33 TPM2 10212 99722544 140 202245087 11258254 0 1 -

34 TPM2+I 10212 97828213 141 198476426 7489592 0 1 -

35 TPM2+G 10212 94185859 141 191191718 204885 0 1 -

36 TPM2+I+G 10212 94153667 142 191147335 160501 100E-04 09998 -

37 TPM2uf 10212 99648091 143 202156182 11169348 0 1 -

38 TPM2uf+I 10212 97757018 144 198394035 7407202 0 1 -

39 TPM2uf+G 10212 941052 144 1910904 103566 00022 09904 -

40 TPM2uf+I+G 10212 9408801 145 19107602 89187 00044 0982 -

41 TPM3 12012 99768005 140 20233601 11349176 0 1 -

42 TPM3+I 12012 97958099 141 198736198 7749364 0 1 -

43 TPM3+G 12012 94227963 141 191275926 289093 0 1 -

44 TPM3+I+G 12012 94323885 142 191487769 500936 0 1 -

45 TPM3uf 12012 99625421 143 202110843 11124009 0 1 -

46 TPM3uf+I 12012 97770469 144 198420939 7434105 0 1 -

47 TPM3uf+G 12012 94165576 144 191211152 224319 0 1 -

48 TPM3uf+I+G 12012 94150861 145 191201721 214888 0 1 -

49 TIM1ef 12230 99592239 141 202004478 11017644 0 1 -

50 TIM1ef+I 12230 97822787 142 198485574 749874 0 1 -

51 TIM1ef+G 12230 94121043 142 191082087 95253 00033 09853 -

52 TIM1ef+I+G 12230 94122386 143 191104772 117939 00011 09969 -

53 TIM1 12230 99518653 144 201917306 10930473 0 1 -

54 TIM1+I 12230 9781156 145 19852312 7536286 0 1 -

55 TIM1+G 12230 94105198 145 191110396 123562 800E-04 09977 -

56 TIM1+I+G 12230 94087158 146 191094317 107483 00018 09922 -

57 TIM2ef 10232 99550617 141 201921233 109344 0 1 -

58 TIM2ef+I 10232 97704602 142 198249204 726237 0 1 -

59 TIM2ef+G 10232 94093484 142 191026968 40135 00516 0852 -

60 TIM2ef+I+G 10232 94073864 143 191007729 20895 0135 07169 -

61 TIM2 10232 99530022 144 201940044 1095321 0 1 -

62 TIM2+I 10232 97820158 145 198540315 7553482 0 1 -

63 TIM2+G 10232 94058678 145 191017356 30523 00834 08004 -

64 TIM2+I+G 10232 94060837 146 191041674 54841 00247 09248 -

65 TIM3ef 12032 99546286 141 201912572 10925739 0 1 -

66 TIM3ef+I 12032 97713931 142 198267862 7281028 0 1 -

67 TIM3ef+G 12032 94129376 142 191098753 111919 00014 09936 -

68 TIM3ef+I+G 12032 94112005 143 191084009 97176 0003 09883 -

69 TIM3 12032 99514376 144 201908751 10921918 0 1 -

70 TIM3+I 12032 97700023 145 198300047 7313213 0 1 -

71 TIM3+G 12032 94115323 145 191130646 143812 300E-04 09997 -

72 TIM3+I+G 12032 94096941 146 191113882 127048 700E-04 09984 -

73 TVMef 12314 9970418 142 20224836 11261526 0 1 -

74 TVMef+I 12314 97940598 143 198741196 7754363 0 1 -

81

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE (AIC)

75 TVMef+G 12314 94159829 143 191179657 192824 0 09999 -

76 TVMef+I+G 12314 94160993 144 191201987 215153 0 1 -

77 TVM 12314 99615991 145 202131982 11145148 0 1 -

78 TVM+I 12314 97746676 146 198413353 7426519 0 1 -

79 TVM+G 12314 94075503 146 191071005 84171 00057 09776 -

80 TVM+I+G 12314 94052588 147 191045176 58342 00208 09456 -

81 SYM 12345 99543166 143 201946331 10959498 0 1 -

82 SYM+I 12345 97757103 144 198394207 7407373 0 1 -

83 SYM+G 12345 94083056 144 191046112 59278 00198 09654 -

84 SYM+I+G 12345 94050035 145 19100007 13236 0198 05819 -

85 GTR 12345 99529525 146 20197905 10992217 0 1 -

86 GTR+I 12345 97686178 147 198312356 7325522 0 1 -

87 GTR+G 12345 94044194 147 191028387 41553 00481 09001 -

88 GTR+I+G 12345 94013417 148 190986834 0 03839 03839 -

5

Resumen

Debido al aumento global de las temperaturas impulsado por el cambio climaacutetico de origen

antropogeacutenico y a la poca informacioacuten que se tiene sobre hongos endoacutefitos en especies de los

paacuteramos esta investigacioacuten buscoacute identificar y caracterizar la diversidad de hongos endoacutefitos del

frailejoacuten Espeletia hartwegiana Esta especie habita en los paacuteramos desde 3000 a 5000 metros de

lo que la hace una especie maacutes vulnerable a los aumentos de temperatura que se pronostican para

el antildeo 2100 de hasta 25degC La identificacioacuten y caracterizacioacuten de los hongos endoacutefitos se realizoacute

por medio de teacutecnicas filogenia molecular basado en datos de secuencias de genes muacuteltiples de

las regiones espaciadoras transcritas internas (ITS) en donde se encontraron un total de 15

geacuteneros de endoacutefitos como Nigrospora Trichoderma y Diaporthe con un total de 35 especies

Los hongos endoacutefitos encontrados podriacutean tener un rol vital en la supervivencia de esta especie

de frailejoacuten mediando la forma en coacutemo responde al estreacutes abioacutetico producido por el cambio

climaacutetico como aumento de la temperatura cambio en las precipitaciones y sequiacuteas ademaacutes del

estreacutes bioacutetico como virus bateriacuteas insectos y hongos fitopatoacutegenos

Palabras clave Cambio Climaacutetico Filogenia Molecular Hongos Endoacutefitos Paacuteramos

6

7

Con amor para mis padres Fernando Ivaacuten Aristizabal y mi madre Mariacutea Ligia

Ortiz

A Norberto Aristizabal y Natalia Aristizabal por creer en miacute

A mi hijo Joseacute David Aristizabal por representar las nuevas generaciones

A mi tutor Jhon Alexander Osorio por tenerme paciencia en este proceso de

aprendizaje y compartirme sus conocimientos

A Tatiana Tapias por darme su amor y llevarme por el camino de la virtud

siempre centrado

A la maestriacutea en Cambio Climaacutetico Sustentabilidad y Desarrollo por siempre

estar disponibles para miacute

A la Universidad Andina Simoacuten Boliacutevar por apoyar mi tesis de investigacioacuten

A la Repuacuteblica del Ecuador por abrirme sus puertas y darme un mejor futuro

8

9

Agradecimientos

Estos agradecimientos van dedicados para Ecuador que me brindoacute la oportunidad

poder estudiar una maestriacutea a mi tutor por aceptarme y acompantildearme en este proceso a

mi familia por creer en miacute y en los sacrificios que hice para irme a vivir a otro paiacutes solo y

sin dinero para poder umlsalir adelanteuml como decimos en Colombia a mi compantildeera

sentimental por siempre guiarme hacia el camino correcto disciplina compromiso y

entrega a la universidad Andina Simoacuten Boliacutevar por aceptarme en sus aulas de clase y

por ultimo a la Universidad del Quindiacuteo por abrirle la puerta a uno de sus egresados y

acogerlo de buena forma con sus instalaciones de laboratorio

Gracias y mil gracias a todos de corazoacuten sin duda esta experiencia cambio mi

vida en todos los sentidos

Desde hoy hasta el final que podriacutea llamarse infinito

10

11

Tabla de contenidos

Figuras mapas y tablashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13

Introduccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 15

Capiacutetulo primero Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

1 Antecedenteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

2 Justificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 25

3 Hipoacutetesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 26

4 Objetivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

41 Objetivo generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

42 Objetivos especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

Capiacutetulo segundo Materiales Meacutetodos y Resultadoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

1 Aacuterea de Estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

2 Colecta de material bioloacutegicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos

endoacutefitos)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32

5 Extraccioacuten de ADNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

7 Secuenciamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

8 Anaacutelisis Filogeneacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

Capiacutetulo Tercero Discusioacuten sobre los hongos endoacutefitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidadhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio

Climaacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42

Conclusioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 57

Obras citadashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 59

Anexoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 73

12

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphellip 73

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia 73

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphelliphellip74

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana 75

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un

estereoscopio 75

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 76

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas y

enviadas 76

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 75

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a Alemania a la Universidad Ruhr de

Bochum 77

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de

parsimoniahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 78

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X 78

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa

JmoldelTest 79

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE

(AIC) 81

13

Figuras mapas y tablas

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo

Colombiahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras

N necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefitohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y

abioacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en

medio de cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelialhelliphelliphellip 30

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la

teacutecnica de corte de hifa uacutenica helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de

cultivo Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12)

aislados de las hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana 31-32

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 10 Filograma obtenido a partir del anaacutelisis ML y MP del conjunto de datos ITS Aislados

de las hojas de frailejoacuten37

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip43

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e

Hypocreahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip46

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon48

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon

Biscogniauxia Nemania y Humiacutecolahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

14

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies

Massarina Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona

muestreadahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia 29-30

Tabla 2 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos

endoacutefitos en la especie Espeletia hartwegiana

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36

Tabla 3 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = presencia del genero

de hongo dentro de la especie de frailejoacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42-43

15

Introduccioacuten

Hay un libro abierto siempre para

todos los ojos la naturaleza

(Jean-Jacques Rousseau 1712-1778)

El cambio climaacutetico corresponde a un fenoacutemeno que afecta el planeta de manera natural

permitiendo mantener las condiciones climaacuteticas como la temperatura la precipitacioacuten entre

otras en un rango aceptable para la vida (Jimeacutenez 2010) Sin embargo dado el aumento de las

emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) principalmente asociado a las actividades

humanas y el alto consumo de combustibles foacutesiles los cambios en dichas condiciones han sido

alterados dando paso a un acelerado aumento de temperatura anual en las uacuteltimas deacutecadas con

precipitaciones y sequias maacutes frecuentes e intensas (IPCC 2020 5 Jimeacutenez 2010)

Acorde con el Panel Intergubernamental de Expertos en Cambio Climaacutetico (IPCC) para

fin de siglo el Cambio Climaacutetico se acrecentaraacute pronosticando un aumento de temperatura de 25

a 45 degC para el antildeo 2100 que tan solo para Colombia en los uacuteltimos 30 antildeos fue de 08degC

generando impactos notorios en las zonas de alta montantildea como los paacuteramos (Moreno y Palma

2016)

El cambio climaacutetico es un fenoacutemeno cuyos efectos alcanzaraacuten los paacuteramos los cuales son

ecosistemas de alta montantildea presente en elevaciones entre 3100 y 4700 m ubicados en el norte de

los Andes de Ameacuterica del Sur y el sur de Ameacuterica Central adyacente (Berdugo et al 2016) Estas

aacutereas se caracterizan por una vegetacioacuten principalmente endeacutemica compuesta por frailejones

matorrales y pastos (veacutease figura 1) (Garciacutea et al 2010)

Los ecosistemas de alta montantildea como los paacuteramos ofrecen diversos servicios

ambientales como la biodiversidad uacutenica que albergan los paisajes los suelos y su capacidad de

retener y almacenar agua (Morales et al 2019) Las formaciones vegetales juegan un papel

diferenciado en el mantenimiento de la humedad y las fuentes de agua en el ecosistema

presentando la capacidad de interceptar almacenar y regular los flujos hiacutedricos superficiales y

16

subterraacuteneos aportando los servicios de abastecimiento de agua para el 70 de la poblacioacuten de

Colombia (Vaacutesquez y Buitrago 2017)

Ademaacutes dada la caracteriacutestica de permanente humedad de su suelo la materia orgaacutenica

se descompone a menor velocidad logrando un efecto de retencioacuten y almacenamiento de carbono

(Anderson et al 2012) En Colombia se han realizado diferentes estudios sobre la distribucioacuten y

extensioacuten del ecosistema paramuno Rangel (2002 4) determinoacute que los paacuteramos colombianos

abarcaban aproximadamente el 26 de la superficie del paiacutes

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramos por Pedraza-Pentildealosa Betancur y Franco-Rosselli (2005)

En particular el paacuteramo Romerales se encuentra dentro del territorio adscrito a los

Parques Nacionales Naturales (PNN) especiacuteficamente el PNN de los Nevados en la cordillera

central colombiana hacia la zona norte del Departamento del Quindiacuteo con liacutemites fronterizos

entre los departamentos de Risaralda y Tolima Este paacuteramo es el hogar del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana el cual estaacute afrontando los efectos del cambio climaacutetico (veacutease mapa 1)

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona muestreada

17

Existe evidencia cientiacutefica concreta del aumento de temperatura en los Andes Tropicales

tambieacuten cambios significativos en los patrones de precipitacioacuten sumado a la disminucioacuten en la

incidencia del clima nublado lo que conduce a las plantas a mayor cantidad de horas expuestas a

la radiacioacuten solar (Ruiz et al 2009) Otro efecto grave que trae consigo el cambio climaacutetico es el

desplazamiento de especies en el gradiente altitudinal Con un aumento de 3degC se espera que las

especies se muevan ~600 m en buacutesqueda de su optimo teacutermico esto afectariacutea gravemente las

especies de paacuteramo como los frailejones Cuesta Camacho (2007)

Los frailejones son emblemaacuteticas plantas de paacuteramo y ecosistemas de alta montantildea

(MINAMBIENTE 2019) Pertenecen a la familia Asteraceae contiene cerca de 142 especies

agrupadas en ocho geacuteneros Carramboa Coespeletia Espeletia Espeletiopsis Libanothamnus

Paramiflos Ruilopezia y Tamania de estos los maacutes importantes y con mayor diversidad de

especies son Espeletia Espeletiopsis y Libanothamnus (Rivera y Torres 2001)

Poseen adaptaciones que les permite captar y retener grandes cantidades de agua de su

entorno permitiendo un balance ecosistemico (Farias 2013) La morfologiacutea singular del genero

Espeletia le permite acumular las hojas antiguas en forma de ldquoabrigordquo brindando proteccioacuten

contra las bajas temperaturas nocturnas de hasta 0degC Los fuertes vientos y la radiacioacuten solar los

cuales seraacuten cada vez maacutes intensos y frecuentes por causa del cambio climaacutetico (Cortes y

Sarmiento 2013 34) (veacutease figura 2)

Estas plantas son especies claves para la conservacioacuten de los paacuteramos y la lucha contra el

cambio climaacutetico debido a que ofrecen una gran variedad de servicios ecosisteacutemicos (Diacuteaz et al

2007) El paacuteramo es referente sin igual de fuente hiacutedrica ciudades como Bogotaacute y Quito obtienen

aproximadamente el 80 de su agua dulce de los paacuteramos (Buytaert et al 2006) Los frailejones

en su mayoriacutea endeacutemicos se han visto afectados por actividades humanas como la ganaderiacutea

extensiva agricultura (cultivos de papa y cebolla) mineriacutea de oro y carboacuten turismo no

controlado y quemas intencionales (Hofstede 2000) Esta situacioacuten podriacutea comprometer a

mediano y largo plazo la funcioacuten de captacioacuten regulacioacuten y suministro del agua para el consumo

18

en las ciudades colombianas ubicadas en las regiones de influencia de estos ecosistemas (Varela

2015)

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

No obstante en asociacioacuten con especies como el frailejoacuten de los Andes Tropicales

encontramos a los hongos cuyos roles en las interacciones bioloacutegicas son de vital importancia

Los hongos pueden ser endoacutefitos simbiontes mutualistas paraacutesitos y comensales y son capaces

de responder a las amenazas que plantea el cambio climaacutetico en cuanto a perturbaciones

ambientales aumento de temperatura y estreacutes hiacutedrico adaptaacutendose a la disponibilidad de recursos

modificando sus actividades enzimaacuteticas e incluso su genoma a lo largo del tiempo (Moreno et

al 2013)

Los hongos son clasificados seguacuten su forma de reproduccioacuten sea sexual o asexual en

donde se observan las diferencias estructurales internas entre los diferentes grupos tales como

sus esporas e hifas como lo indican Blackwell y Spatafora (2004) estos organismos estaacuten

divididos en cuatro grandes grupos los cuales son Ascomycota Basidiomycota

Chytridiomycota Zygomycota es justo en el grupo de los Ascomycota donde se encuentra gran

diversidad de hongos conocidos como ldquohongos endoacutefitosrdquo en donde su nombre ldquoendoacutefitordquo

significa ldquodentro de la plantardquo (endon dentro phyton planta)

19

Estos microorganismos fuacutengicos tienen la facilidad de pasar gran parte o todo su ciclo de

vida invadiendo los tejidos de su hospedero (planta) sin tener un efecto negativo evidente

(Leacuteveilleacute 1846 3 de Bary 1866 8) Por lo tanto el concepto de endoacutefito indica una asociacioacuten de

costo-beneficio pero de una forma mutualista entre el hongo y la planta hospedera permitiendo

la estadiacutea en sus tejidos vivos (Clay 1998 8) Los hongos endoacutefitos se han encontrado en todas

las plantas (algas musgos pastos plantas y vasculares) desde los bosques templados hasta los

bosques tropicales hallaacutendose una gran diversidad de plantas y en asociacioacuten gran diversidad de

hongos endoacutefitos (Saacutenchez et al 2010)

Se espera que los hongos endoacutefitos jueguen un papel cada vez maacutes importante potenciado

por el cambio climaacutetico en las enfermedades producidas en plantas como pudricioacuten radicular

mal blanco entre otras con los aumentos pronosticados de la temperatura y el estreacutes por sequiacutea

asociados al cambio climaacutetico (Desprez-Loustau et al 2006 Slippers y Wingfield 2007 6) Los

cambios en la cantidad de dioacutexido de carbono (CO2) y la disponibilidad de nitroacutegeno en el suelo

afectan de forma similar tanto a las plantas como a los hongos por ende las alteraciones

generadas por parte del cambio climaacutetico pueden causar desbalances en sus relaciones (Ies et al

2013)

Algunos estudios realizados en el antildeo 1898 donde se registraron los primeros hongos

endoacutefitos como el de Bary (1866) brindo la iniciativa de investigaciones que lograron explicar

los cuadros toxicoloacutegicos observados en animales los cuales se daban por el consumo de

semillas o en aacutereas de pastos (Poaceae) que posiblemente albergaban hongos Clavicipitaacuteceos

(familia del ergot) los cuales poseiacutean actividades enzimaacuteticas con micotoxinas

Por diversas situaciones no trascendioacute la investigacioacuten hasta que Bacon (1977) hizo

relacioacuten del hongo endoacutefito Neotyphodium coenophialum debido a una intoxicacioacuten del ganado

llamado ldquosiacutendrome de veranordquo cuando estos animales consumiacutean pastos de la especie Festuca

arundinacea (Poaceae) Funk en el antildeo 80 caracterizoacute la resistencia de las Poaceae que

albergaban hongos endoacutefitos que frecuentemente eran atacados por insectos (proteccioacuten contra

herbiacutevoros) (Saacutenchez et al 2010)

Compant y colaboradores (2010) mencionaron que tras experimentar en el laboratorio

con una gama de temperaturas en los hongos endoacutefitos aislados obtuvieron resultados variables

respecto al crecimiento es decir positivos y neutrales llegando a la conclusioacuten de que los

microorganismos asociados a las plantas son un factor importante que influye en la respuesta de

20

las plantas acorde a los cambios de temperatura lo que compromete las respuestas del frailejoacuten y

los hongos endoacutefitos frente al calentamiento global causado por el cambio climaacutetico

Con relacioacuten a los estudios realizados sobre hongos endoacutefitos en frailejones se han

encontrado al menos 100 especies con capacidades de inhibir hongos fitopatoacutegenos o herbivoriacutea

(Cabezas et al 2012)

Los geacuteneros de hongos endoacutefitos encontrados en anteriores estudios son Acremonium

Aspergillus Aureobasidium Colletotrichum Fusarium Gliocadium Nigrospora Paecilomyces

Penicillium Trichothecium Trichoderma y Sordaria (Pineda 2000 Programa Nacional para la

Evaluacioacuten del Estado y Afectacioacuten de los Frailejones en los Paacuteramos de Andes del Norte 2009)

Teniendo en cuenta que para Colombia hay poca informacioacuten sobre hongos endoacutefitos en

ecosistemas paramunos se hace fundamental la ampliacioacuten de maacutes informacioacuten referente al tema

debido a que solo existen estudios significativos en cafeacute leguminosas y rosas los cuales maacutes allaacute

de la identificacioacuten de geacuteneros de hongos endoacutefitos no incluyen el cambio climaacutetico y sus

posibles consecuencias (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016) En

teacuterminos filogeneacuteticos los hongos son el reino de la naturaleza maacutes cercano a los animales

(Hibbett et al 2018)

Las relaciones que posean las diferentes especies de endoacutefitos dentro de la especie de

frailejoacuten es de importancia conocerla mediante el uso de la filogenia molecular (Judd et al 2007)

mediante secuencias de ADN ARN o proteiacutenas (Cooke et al 2000) Dependiendo de la presencia

de especies agresivas de endoacutefitos como Nigrospora se puede tener un mejor conocimiento

sobre las consecuencias que trae consigo los impactos del cambio climaacutetico sobre estas plantas de

los Andes Tropicales (Foden et al 2009)

21

Capiacutetulo primero

Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitos

1 Antecedentes

Desde los estudios realizados por Leacuteveilleacute (1846) y Bary (1866) sobre hongos Endoacutefitos

en pastos de zonas templadas se ha logrado identificar que estos hongos son capaces de inducir

respuestas adaptativas a sus hospederos (Micotoxinas contra herbiacutevora adaptacioacuten a heladas o

climas extremos fijacioacuten de nutrientes) a cambio de alimento y hospedaje formando una relacioacuten

mutualista en la cual las dos especies involucradas son beneficiadas No obstante se ha reportado

que los hongos endoacutefitos ademaacutes de tener relaciones mutualistas con diferentes especies

vegetales se pueden tornar en especies patoacutegenas para su hospedero una vez la planta se

encuentra en condiciones desventajosas tornaacutendose asiacute el hongo endoacutefito en un hongo

fitopatoacutegeno (Herrera y Ulloa 1990 550)

Como se mencionoacute anteriormente los hongos endoacutefitos pueden pasar de un estado

mutualista a un estado de patogeacutenesis dada esta relacioacuten entre ambos organismos se producen

metabolitos secundarios potencialmente toacutexicos facilitando factores de virulencia dados por el

hongo endoacutefito como exoenzimas y metabolitos fitotoacutexicos a su vez la planta presenta defensas

tanto mecaacutenicas como bioquiacutemicas (Saacutenchez et al 2013 5)

Hasta la fecha los principales estudios de hongos endoacutefitos se han fijado en especies de

intereacutes econoacutemico y comercial tales como palma de aceite cafeacute leguminosas pastos de forrajeoacute

y diferentes tipos de rosas (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016)

Las especies modelo para el estudio de los hongos endoacutefitos han sido las gramiacuteneas

forrajeras en donde se han reportado especies de endoacutefitos asociados a los geacuteneros Lolium

Festuca y Brachiaria (Siegel et al 1987) no obstante Otero y Bayman (2009) han reportado un

creciente nuacutemero de estudios en orquiacutedeas epifitas tropicales relaciones con hongos micorrizicos

22

Actualmente existen escasos reportes de hongos endoacutefitos asociados a ecosistemas con

climas extremos (temperaturas extremas) como aacuterticos desiertos paacuteramos y zonas alpinas

especialmente para zonas de temperaturas friacuteas como lo son los paacuteramos (Lopera et al 2008

Leung et al 2011 Cabezas et al 2012 Miles et al 2012 Zhang y Yao 2015)

Investigadores como Lopera Leung y colaboradores (2011) han llegado a la conclusioacuten

de que los hongos endoacutefitos juegan un papel importante en las plantas a la hora de adaptarse a

ecosistemas de clima templado (Kivlin et al 2013 Zhang y Yao 2015)

En Colombia los trabajos con hongos endoacutefitos son pocos por ende trabajos como el de

Lopera y colaboradores (2008) con especies del genero Espeletia de los paacuteramos Colombianos

son pioneros ademaacutes del trabajo de Cabezas y colaboradores (2012 4) en el cual aislaron y

caracterizaron celulasas (enzimas descomponedores de la celulosa) extraiacutedas de hongos endoacutefitos

que se hallaban en especies de Espeletia posteriormente Lopera y Miles (2012) unieron

esfuerzos para continuar caracterizando la diversidad de hongos endoacutefitos en los paacuteramos andinos

colombianos enfocados en Espeletia con el objetivo de encontrar especies con potencial

biocontrolador

Existen trabajos tesis en los repositorios de diversas universidades de los antildeos 2014 y

2015 en los cuales se aborda el tema de los hongos endoacutefitos paacuteramos y especies de Espeletia

(frailejones) y de la familia Poaceae en donde se caracterizan las diversas especies de hongos

endoacutefitos por medio taxonomiacutea y biologiacutea molecular ademaacutes de buscar metabolitos secundarios

con fines medicinales o de biocontrol

Los trabajos en filogenia molecular de hongos endoacutefitos realizados en frailejones se han

visto enfocados maacutes hacia la buacutesqueda de la diversidad funcional en comunidades

microbioloacutegicas como por ejemplo el estudio realizado por Ruiz y colaboradores (2015) en

donde buscaron mediante el anaacutelisis molecular de raiacuteces necromasa hojas maduras y joacutevenes de

diferentes especies de Espeletia (veacutease figura 3) ubicada en los Andes neotroacutepicales

colombianos secuencias geneacuteticas de las regiones V5-V6 de la unidad 16S del rARN

23

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras N

necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefito Tomado de Ruiz y colaboradores (2015)

Este estudio analizoacute la composicioacuten de comunidades microbioanas y su diversidad

funcional en un ecosistema de alta montantildea en donde las temperaturas los rayos UV y la altura

juegan papeles determinantes como filtros ecoloacutegicos severos en donde solo pueden existir

especies que han desarrollado capacidades para adaptarse sobrevivir y colonizar dichas aacutereas

por ende cuando se analizaron las comunidades existentes dentro de estas especies de Espeletia

Encontraron que algunas especies halladas podriacutean tener roles importantes como

productores de metabolitos secundarios enzimas o incluso como bioremediadores y que las

comunidades microbianas eran diferentes tanto en sus hojas como en sus raiacuteces y en la

necromasa

A medida que las deacutecadas avanzan y la evidencia sobre el cambio climaacutetico se hace maacutes

robusta y evidente los estudios en los hongos endoacutefitos han tomado vital importancia al estar

asociados con cultivos de especies comestibles escases de agua y de tierras productivas sumado

a los efectos negativos que trae consigo el cambio climaacutetico para las diferentes plantaciones y

cosechas a nivel global

Es por eso que Lu Yan y colaboradores (2019) analizaron los efectos positivos que teniacutean

la colonizacioacuten de hongos endoacutefitos en las plantas en donde ratificaron que los hongos endoacutefitos

dentro la planta generan metabolitos antimicrobianos estimulan las respuestas inmunoloacutegicas y

compiten por espacio dentro de la planta con diferentes patoacutegenos incrementando asiacute la

resistencia contra herbiacutevoros y la resistencia al estreacutes salino (factores bioacuteticos)

Ademaacutes de ayudar a la planta contra el estreacutes abioacutetico causado principalmente por

factores climaacuteticos como la falta de agua (estreacutes hiacutedrico) las temperaturas extremas la

intensidad de los rayos UV y los metales pesados como la muestra la figura 4 debido a esto se

24

concluyoacute que las fitohormonas cumplen un papel importante en la colonizacioacuten de hongos

endoacutefitos dentro de la planta

Aun que se ha reportado que los hongos endoacutefitos se pueden usar como biocontroladores

diferentes estudios reportan que el uso de hongos endoacutefitos puede tener efectos adversos como

un retraso significativo en el crecimiento de la planta con el uso de la especie Cryptosporiopsis

sp (Terhonen et al 2016) Otro reporte indica la fecundidad y supervivencia de enemigos

naturales como paraacutesitos esto es debido a que los hongos endoacutefitos transfieren sus toxinas y

alcaloides cuando son ingeridos por paraacutesitos u otros enemigos naturales de las plantas (Lopez y

Sword 2015)

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y abioacutetico

Bajo estreacutes bioacutetico (herbiacutevoros y patoacutegenos) y abioacutetico (sequiacutea salinidad metales pesados y otros) (a) se

inducen respuestas de defensa de las plantas (b) los endoacutefitos producen metabolitos protectores y

modulan la viacutea de las fitohormonas para mejorar la inmunidad de las plantas (c) tomada de Lu yan y

colaboradores (2019 7)

25

2 Justificacioacuten

La presente investigacioacuten pretende identificar y caracterizar que especies de hongos

endoacutefitos estaacuten asociadas al frailejoacuten Espeletia hartwegiana y que posibles implicaciones podriacutea

tener que estas especies se encuentren dentro de esta especie de alta montantildea La importancia de

conocer esta informacioacuten reside en que los hongos endoacutefitos pueden beneficiar o perjudicar a la

adaptacioacuten y resistencia de especies vegetales en los distintos escenarios climaacuteticos propuestos

por la ciencia (IPCC 2020)

El calentamiento global podriacutea afectar el equilibrio de los hongos endoacutefitos en especies

vegetales generando desbalances en la planta o la peacuterdida de especies endoacutefitas de importancia

biotecnoloacutegica Por ejemplo se podriacutean perder especies endoacutefitas con potencial para control

bioloacutegico de plagas y enfermedades de plantas como productores de enzimas y metabolitos

secundarios degradacioacuten de plaacutesticos o biorremediacioacuten entre otros (Schulz et al 2002) Por

ello se hace fundamental estudiar los hongos endoacutefitos en ecosistemas de paacuteramo ya que en

Colombia y en los paacuteramos en general han sido poco estudiados y su efecto sobre las plantas de

alta montantildea podriacutea ser clave en el mantenimiento de sus poblaciones

26

3 Hipoacutetesis

H1 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute diferente en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo diferentes los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten tambieacuten seria

modificada

H0 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute similar en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo similares los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten continuariacutean

como se ha registrado con anterioridad

27

4 Objetivos

41 Objetivo general

Caracterizar la diversidad de hongos endoacutefitos presentes en los frailejones

de la especie Espeletia hartwegiana en el paacuteramo de Romerales tomando en cuenta su

relacioacuten con el cambio climaacutetico

42 Objetivos especiacuteficos

Identificar los hongos endoacutefitos asociados en Espeletia hartwegiana del

paacuteramo de Romerales

Hallar relaciones filogeneacuteticas entre las diferentes especies de hongos

Endoacutefitos encontradas en Espeletia hartwegiana

Advertir las repercusiones del cambio climaacutetico sobre Espeletia

hartwegiana en base a su diversidad de hongos endoacutefitos

28

29

Capiacutetulo segundo

Materiales Meacutetodos y Resultados

1 Aacuterea de Estudio

El trabajo se realizoacute en el paacuteramo de Romerales ubicado en la zona alta del municipio de

Salento Quindiacuteo (4deg39202N 75deg25506W) con una extensioacuten aproximada de 6794 ha (Cano

et al 2015)

2 Colecta de material bioloacutegico

La colecta del material bioloacutegico se realizoacute mediante muestreos aleatorios lo largo del

paacuteramo tomando coordenadas de cada punto de colecta (veacutease anexo 3) las hojas se colectaron

por medio de tijeras podadoras siendo empacadas cada una en bolsas Ziploc diferentes se

colectoacute un total de 15 hojas cada una correspondiente a una planta de frailejoacuten para un total de

15 plantas muestreadas de E hartwegiana

Adicionalmente las bolsas Ziploc fueron marcadas con los datos de colecta en campo y

transportadas a los laboratorios del Programa de Biologiacutea de la Universidad del Quindiacuteo para su

procesamiento

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetales

Las muestras obtenidas fueron lavadas con agua para eliminar el exceso de residuos se

cortaron 4 trozos de cada hoja con un tamantildeo aproximado de 05 a 10 cm (veacutease figura 5) luego

cada trozo de hoja se sometioacute a una esterilizacioacuten la cual se completoacute con algunas modificaciones

acorde al procedimiento descrito por (Osorio et al 2017) especiacutefico para el aislamiento de

30

hongos endoacutefitos que consiste en sumergir perioacutedicamente el material vegetal en etanol al 90

durante un minuto seguido de hipoclorito de sodio (NaClO) al 4 por un minuto continuando

con etanol al 70 durante un minuto y por uacuteltimo se lavaraacuten con agua destilada todo dentro de la

campana de flujo

Las cuatro secciones de hoja se transfirieron a una caja de Petri para un total de 15 cajas

de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA) (una caja de Petri por cada 4 cortes de hoja)

Posteriormente las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente (25degC aproximadamente)

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en medio de

cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelial caja de Petri de 20ml de capacidad

Pasadas 3 semanas se revisaron los cultivos fuacutengicos con el fin de revisar el crecimiento

del micelio y hacer un repique a un cultivo puro una vez maduros se procedioacute a utilizar la teacutecnica

de corte de hifa uacutenica (Osorio et al 2017) esta teacutecnica consistioacute en tomar la punta de la hifa con

ayuda de un estereoscopio y un bisturiacute de grado quiruacutergico agua destilada alcohol al 70 y un

mechero para mantener el bisturiacute esterilizado una vez identificada la hifa ideal para cultivar de

forma pura (veacutease figura 6) con el bisturiacute se procedioacute a cortar el agar PDA en forma de cuadro

con una medida aproximada de 3 miliacutemetros cuadrados

31

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la teacutecnica de

corte de hifa uacutenica

Se esperoacute entre 3 a 5 semanas a que crecieran los cultivos puros aislados de las hifas uacutenicas en

nuevas cajas de Petri con agar PDA

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos endoacutefitos)

Los hongos cultivados de forma pura consiguieron un crecimiento micelial significativo a partir

de los 15 diacuteas a temperatura ambiente como lo demuestra la figura 7 que contiene doce de los

cultivos maacutes representativos con su respectivos micelios aeacutereos desarrollados donde variacutean sus

colores formas y consistencias esto indicando que pertenecen a diferentes especies

2

1

3

32

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de cultivo

Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12) aislados de las

hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

5 Extraccioacuten de ADN

4

5

6

7

8

9

10

11

12

33

Una vez el micelio de los hongos se encontraba desarrollado en la cantidad necesaria se

procedioacute a extraer el ADN genoacutemico siguiendo el protocolo de extraccioacuten de Raeder y Broda

(1985) por medio de un barrido superficial del micelio evitando tomar el agar este micelio

posteriormente se colocoacute en tubos Eppendorf esteacuteriles de 2 ml y se pulverizoacute mediante el uso de

un asa microbioloacutegica y 1ml de buffer de extraccioacuten compuesto de Tris-HCL 1 M pH 78 EDTA

05 M Ph 8 SDS 10 wv NaCL y agua destilada para cada tubo a continuacioacuten se agregoacute 800

ul de etanol al 70 500 ul de fenol y se mezcloacute

Se adicionoacute 300 ul de cloroformo y se mezcloacute de nuevo de alliacute se llevoacute a la centrifuga a

10000 rpm por 60 minutos luego de centrifugar se forma un sobrenadante el cual es transferido

en su totalidad a un nuevo tuvo Eppendorf de 15 ml en el cual se agregaron 400 ul de cloroformo

y se llevoacute a la centrifuga a 10000 rpm por 10 minutos en donde nuevamente se forma un

sobrenadante aunque esta vez solo se toman 500 ul del tubo para ser transferidos otro tubo

Eppendorf de 15 ml ya en el nuevo tubo se adicionaron 50 ul de NaAC y se invirtioacute varias veces

para homogenizar la mezcla a continuacioacuten se guardoacute en el refrigerador a 4degC toda la noche

Al diacutea siguiente se tomaron las muestras en los tubos Eppendorf y se centrifugaron a

10000 rpm por 30 minutos (Formacioacuten del Pellet de ADN) cuando la centrifuga terminoacute se

procedioacute a remover el etanol ya sin etanol se agregoacute de nuevo 1 ml de etanol al 70 a cada tubo

y se centrifugoacute a 10000 rpm por 5 minutos en este paso se removioacute el etanol y se dejoacute secar el

pellet de ADN una vez el etanol se evaporoacute se re suspendioacute el pellet en 100 ul de agua grado

molecular o Sabax con 5 ul de RNAsa con el fin de evitar la presencia de moleacuteculas de ARN

posteriormente se incubaron a 37degC por 30 minutos y se guardaron para su envioacute a -20degC

(Raeder y Broda 1985)

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengica

Una vez se secuenciaron las muestras de ADN enviadas a la Universidad Ruhr de

Bochum Alemania se hizo el ensamblaje de las secuencias en contigs y scaffolds en el

programa CLC Main Workbench 8 (Nicola et al 2013) Como lo muestra la figura 8 donde se

muestran los pasos esenciales de una teacutecnica de Metagenoacutemica donde posteriormente se

analizaron con maacutes detalle mediante teacutecnicas filogeneacuteticas

34

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemico Fuente Thomas y colaboradores (2012)

7 Secuenciamiento

Se extrajoacute con eacutexito un total de 35 muestras de hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

Espeletia hartwegiana (veacutease figura 9) que posteriormente fueron secuenciadas por la

Universidad Ruhr de Bochum (Alemania) logrando un total de 70 secuencias incluyendo

aquellas obtenidas en Genk Bank

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de frailejoacuten

Espeletia hartwegiana

35

8 Anaacutelisis Filogeneacutetico

Se aislaron 35 secuencias basadas en la especie Espeletia hartwegiana fueron

comparadas posteriormente con 35 secuencias de especies publicados en GenBank

(httpblastncbinihgovblastcgi) se obtuvo un total de 70 secuencias Las secuencias de

consenso ITS 58S DNA obtenidas se usaron para realizar buacutesquedas BLAST en GenBank

usando BLASTn (Altschul et al 1990) con el fin de identificar mediante las secuencias aisladas

los geacuteneros o las especies maacutes cercanas La matriz de datos fue alineada en MAFFT v7 (Katoh y

Standley 2013) Se utilizaron las especies Coprinellus xanthothrix y Coprinellus domesticus

como grupos externos

Los anaacutelisis de las secuencias para construir los arboles filogeneacuteticos de Maacutexima

Parsimonia (MP) fueron realizados usando PAUP v40b10 (Swofford 2003) Para el anaacutelisis de

Maacutexima Verosimilitud o ML por sus siglas en ingleacutes (Maximum Likelihood) se utilizoacute

JmodelTest (Darriba et al 2012) con el cual se infirieron los criterios del modelo de sustitucioacuten

apropiado utilizando los criterios de informacioacuten de Akaike (AIC) (Akaike 1974)

Los anaacutelisis de ML se realizaron con el programa PhyML v 30 (Guindon y Gascuel

2003) teniendo en cuenta la proporcioacuten de sitios invariables Los valores de soporte de confianza

para los nodos se estimaron mediante 1000 anaacutelisis de arranque de replicacioacuten La alineacioacuten de

los datos de la secuencias de ITS para 70 aislamientos determinoacute quince geacuteneros siendo los

siguientes Annulohypoxylon Biscogniauxia Colletotrichum Crassiparies Cryptocoryneum

Cyphellophora Diaporthe Daldinia Humiacutecola Hypoxylon Hypocrea Nemania Nigrospora

Massarina y Trichoderma de los cuales se obtuvieron 11 clados principales (veacutease figura 10)

Con base en estos resultados todos los aislamientos se analizaron maacutes a fondo dentro de los

geacuteneros hasta llegar a especie (veacutease tabla 1)

36

Geacuteneros Especie Especie Especie Especie Especie Especie Especie

Annulohypoxylon A nitens A bahnphaden

gense

Biscogniauxia B petrensis

Colletotrichum C gloeosporioides

C gigasporum

Cyphellophora C

reptans

Crassiparies C quadrisporus

Cryptocoryneum C

longicondensatum

Daldinia D dennisii D

eschscholtzi

D

conceacutentri

ca

Diaporthe D

longicolla

D

foeniculina

D

anacardi

i

D

macada

miae

Humiacutecola H

fuscoatra

Hypoxylon H

trugodes

H

pulicicidum

Hypocrea H

koningii

Massarina M albocarnis

Nemania N

primolutea

Nigrospora N sacchari N rubi N sphaeric

a

N hainanen

sis

N oryzae

N gorlenko

ana

N aurantia

ca

Trichoderma T trixiae T

olivascens

T

paraviridescens

T

viridescens

T

samuelsii

T viride

Grupo Externo Coprinellus C

domesticus

C

xanthothrix

Tabla 1 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos endoacutefitos en la

especie Espeletia hartwegiana

37

38

Figura 10 Filograma consenso obtenido con el programa MEGA ndashX a partir del anaacutelisis ML y MP del

conjunto de datos ITS Aislados de las hojas de frailejoacuten Los coacutedigos en Verde son las secuencias que se

aislaron (aislados) en este estudio los coacutedigos y nombres en Negro son las secuencias encontradas por

identidad en GenBank Los valores de soporte de bootstrapgt 70 se indican cerca de los nodos como MP

ML = valores de soporte de bootstrap lt70

El nuacutemero de caracteres los modelos de sustitucioacuten usada asiacute como otros resultados

estadiacutesticos de las pruebas de Maacutexima Parsimonia y Maacutexima Verosimilitud generados a partir de

los anaacutelisis filogeneacuteticos de los conjuntos de datos se muestran en los anexos

39

Capiacutetulo Tercero

Discusioacuten sobre los hongos endofitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicas

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidad de Endoacutefitos

Tanto la temperatura la estacionalidad y los tipos de precipitacioacuten son factores de vital

importancia para la composicioacuten de las diferentes comunidades y la arquitectura vegetal Estos

factores limitan muchos de los procesos ecosisteacutemicos ya que existe una estrecha relacioacuten entre

las variaciones climaacuteticas y las variaciones dentro de los ecosistemas Por lo tanto se espera que

el cambio climaacutetico transforme los ecosistemas Andinos tal como los conocemos hoy (Colwell et

al 2008) modificando las relaciones mutualistas entre plantas y hospederos

Posiblemente la resiliencia y resistencia de muchos ecosistemas como el paacuteramo sean

superadas en este siglo por una combinacioacuten sin precedentes de disturbios tales como el cambio

climaacutetico perturbaciones asociadas a este (sequiacuteas fuegos invasioacuten de especies exoacuteticas

inundaciones) y otros factores como organismos oportunistas (hongos endoacutefitos) cambios en el

uso del suelo contaminacioacuten y sobreexplotacioacuten de recursos (IPCC 2020)

Considerando que el frailejoacuten Espeletia hartwegiana es una especie de alta montantildea

(paacuteramos) endeacutemica de la cordillera Central de los Andes (Schultz y Carl 1856) se encuentra

dentro de los ecosistemas andinos en donde a su vez se ha comprobado la existencia de los

hongos endoacutefitos es de tener en cuenta el papel de estos organismos endoacutefitos ya que los

paacuteramos son ecosistemas particularmente sensibles a los efectos adversos del cambio climaacutetico

en especial al calentamiento global al estar ubicados en los troacutepicos generando asiacute ventanas de

40

oportunidades para que los hongos endoacutefitos alteren su estado mutualista y pasen a ser

patogeacutenicos (Colwell et al 2008 7)

No obstante existe consenso en que las temperaturas aumentaraacuten especiacuteficamente a

grandes alturas y que la precipitacioacuten posiblemente se incrementaraacute en algunas zonas disminuiraacute

en otras y se produciraacute en patrones estacionales alterados con mayor intensidad y frecuencia

(Marengo et al 2009)

Los frailejones se ven en constante estreacutes por el uso del suelo dado en los paacuteramos como

es el caso del paacuteramo Romerales un paacuteramo que se ha visto afectado por las quemas y la

ganaderiacutea (Molinillo y Monasterio 2001) Esto aumenta asiacute las condiciones de estreacutes intriacutensecas a

las que estaacuten expuestas estas plantas de paacuteramo las cuales suministran valiosos bienes y servicios

ecosisteacutemicos como el abastecimiento continuo de agua para usos domeacutesticos agriacutecolas e

industriales (Buytaert et al 2006 4) servicios que se podriacutean ver en decrecimiento si las

ventanas de oportunidades se abren con maacutes frecuencia dando pie al cambio de estado de los

hongos endoacutefitos que existen dentro de los frailejones de la zona

En los paacuteramos de Chingaza Rabanal Guerrero Iguaque Merchaacuten y Sumapaz se han

realizado estudios de aislamientos de hongos en especies de frailejoacuten diferentes a la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana tales como Espeletia argentea Espeletia arbelaezii Espeletia

boyacensis Espeletia grandiflora Espeletia miradorensis y Espeletia uribei por ende se ha

reportado la presencia de hongos endoacutefitos y fitopatoacutegenos (Tabla 2) (Gaitan 2018 17)

Frailejones Espeletia

argentea

Espeletia

arbelaezii

Espeletia

boyacensis

Espeletia

grandiflora

Espeletia

miradorensis

Espeletia

uribei

Aspergillus X X X X

Annulohypoxylon X X X

Curvularia X X X

Epicoccum X X X

Fusarium X X X

41

Tabla 2 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = a presencia del genero de

hongo dentro de la especie de frailejoacuten

Los geacuteneros de hongos en rojo son los geacuteneros que se encontraron en comuacuten con los

geacuteneros hallados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana de un total de 15 geacuteneros 3

han sido reportados anteriormente en estudios similares ( 20 de geacuteneros identificados)

Dentro de un marco de cambio climaacutetico es importante la metodologiacutea de muestreo

como lo fue el formato de muestreo en puntos aleatorios realizado en el presente estudio se llevoacute

acabo principalmente por la homogeneidad de los frailejones en el paacuteramo como lo indica el

manual de meacutetodos baacutesicos de muestreo y anaacutelisis de ecologiacutea vegetal (BOLFOR 2000 9) donde

se menciona que el muestreo aleatorio se utiliza cuando se dispone de poca informacioacuten previa de

las caracteriacutesticas de las poblaciones a medirse en este caso la poblacioacuten a identificarse fueron

los hongos endoacutefitos que se hallaban dentro de las formaciones homogeacuteneas de los frailejones

No obstante el muestreo aleatorio tambieacuten presenta limitaciones a la hora de comparar los

hongos endoacutefitos a lo largo del gradiente altitudinal (muestreo aleatorio estratificado) dejando de

percibir informacioacuten proveniente de los distintos microclimas que se encuentran y de las

incidencias que podriacutean causar a la hora de identificar los geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten ademaacutes de posibles micro efectos del cambio climaacutetico a lo

largo del gradiente altitudinal (Caacutemara et al 2008)

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio Climaacutetico

Nigrospora X X X X X

Penicillium X X X

Pleospora X X X X

Trichoderma X X X X

42

Las teacutecnicas empleadas en este estudio para lograr aislar e identificar los hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana se hacen importantes dentro del cambio

climaacutetico debido a que el margen de error en la identificacioacuten molecular es reducido (Bakermans

et al 2014) Al ser reducido el margen de error se pudo conocer con mayor certeza que especies

y geacuteneros de hongos endoacutefitos se encuentra dentro de la planta

Al conocer sus identidades es posible conocer las capacidades que tienen cada una de

estas especies de hongos endoacutefitos de producir metabolitos secundarios de infiltrarse y proteger

los tejidos de la planta de condiciones bioacuteticas y abioacuteticas competir contra herbiacutevoros y

fitopatoacutegenos (Schulz et al 2002) Con sus capacidades reconocidas es posible vincular los

efectos del cambio climaacutetico como estreacutes hiacutedrico aumento de la temperatura migraciones

tempranas enfermedades emergentes aumentos de la precipitacioacuten y heladas severas con las

reacciones por parte de los hongos endoacutefitos Estas reacciones podriacutean desencadenar aumentos de

la patogenicidad en las poblaciones de frailejones debido a los constantes disturbios y estreacutes al

que se ve sometido la planta generando asiacute notables declives poblacionales (Mendoza 2010)

Las relaciones filogeneacuteticas entre las especies halladas toman relevancia debido a las

sinergias positivas o negativas que se pueden presentar dependiendo de las especies que se

encuentren asociadas dentro de la planta (Lamichhane y Venturi 2015) como por ejemplo

Nigrospora y Colletotrichum pueden activar una sinergia negativa aumentando la virulencia y

afectando la especie Espeletia hartwegiana

Las especies de hongos endoacutefitos se identificaron por medio de secuencias obtenidas de

las regiones ITS (regioacuten de espaciadores internos transcritos) las cuales son regiones altamente

conservadas con tasas de evolucioacuten muy lentas en el tiempo permitiendo hacer inferencias

filogeneacuteticas (Baldwin et al 1995 Hamby y Zimmer 1992) es por ello que se usaron para

generar las diferentes identificaciones de los hongos endoacutefitos logrando asiacute identificar al geacutenero

Nigrospora con un total de 7 especies N sacchari N rubi N sphaerica N hainanensis N

gorlenkoana N oryzae y N aurantiaca pertenecientes a la familia Apiosporaceae orden

Xylariales Divisioacuten Ascomicota (veacutease figura 11) (Wang et al 2017)

Dentro del marco del cambio climaacutetico Nigrospora se caracteriza por poseer una

distribucioacuten cosmopolita y una amplia gama de hueacutespedes como lo es en este caso la especie E

hartwegiana que habita en los Andes Tropicales que se veraacuten alterados por los efectos del

cambio climaacutetico este geacutenero se ha logrado aislar en su forma endoacutefita en tallos y hojas de

43

diversas plantas tambieacuten como saprofitos en detritos hojarasca y larvas muertas (Uzor et al

2015 1)

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

Los hongos endoacutefitos hallados en esta investigacioacuten se encontraron dentro de la especie

de frailejoacuten E hartwegiana la cual pertenece a los Andes Tropicales ubicados maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos Estos ecosistemas son sensibles a los efectos del cambio

climaacutetico por su altura su alto endemismo y su sensibilidad al efecto de borde Cuando las

especies lentildeosas empiecen a migrar a lo largo del gradiente altitudinal es posible que los

frailejones se encuentren con suelos agrestes en donde sus semillas no podraacuten fijarse y los efectos

adversos de hongos como Nigrospora N oryzae y N sphaerica seraacuten maacutes notables

aprovechando las ventanas de oportunidad que generen los desbalances climaacuteticos (Sharma et al

2013)

Los cambios en los patrones climaacuteticos potenciaran la especie N sphaerica dentro del

frailejoacuten la cual tiene la capacidad de causar tizoacuten foliar en la especie Camellia sinensis siendo

una planta de teacute perteneciente a la divisioacuten de las magnolifiotas como el geacutenero Espeletia (Liu et

al 2015) Nigrospora fue el geacutenero maacutes ampliamente aislado en las identificaciones generadas a

partir de las hojas de frailejoacuten esto se veriacutea explicado debido a que N sphaerica tiene un

mecanismo de descarga de esporas efectivo que puede proyectar a la fuerza sus esporas a una

distancia de hasta 2 cm en vertical y 68 cm en horizontal como lo demostroacute Webster (1952)

ademaacutes el estudio de Wu y colaboradores (2004) tambieacuten evidencioacute que las esporas de

44

Nigrospora son uno de los grupos maacutes dominantes en la atmoacutesfera y estaacuten asociadas con

tormentas de polvo

La gran capacidad colonizadora del geacutenero Nigrospora le permite adaptarse a las

condiciones climaacuteticas cambiantes con la estrategia de dispersioacuten de sus esporas logrando

distanciarse del frailejoacuten hospedero para encontrar nuevos hospederos producto de las

migraciones tempranas a lo largo del gradiente altitudinal (Riveros 2010)

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

por encima del 80 lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen menos

mutaciones en los nodos internos del aacuterbol basados en la distribucioacuten de probabilidad asignadas

a los posibles arboles resultantes dando lugar a una hipoacutetesis evolutiva maacutes confiable (Schmidt y

Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 es decir el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes

corto (menos cambios) y el cual se ajusta mejor a los datos (Swofford 1997)

Teniendo asiacute una inferencia filogeneacuteticamente robusta los geacuteneros Collectotrichum y

Nigrospora pertenecen a la Divisioacuten Ascomycota ambos geacuteneros son particularmente agresivos

con las plantas en especial la especie Colletotrichum gloeosporioides la cual es la fase asexual

de Glomerella cingulata (Raj et al 2013) Se caracteriza por tener un amplio rango de

hospederos entre ellos el frailejoacuten a los cuales les causa una enfermedad conocida pudricioacuten

amarga antracnosis o chancros siendo esta la necrosis de frutos flores nervios y tallos

(Gonzaacutelez et al 2006 4)

Uno de los primeros reportes de afectaciones a especies de frailejoacuten se obtuvo en el 2009

en el Parque Natural Nacional Chingaza Colombia en donde encontraron las especies de

frailejoacuten Espeletia grandiflora y Espeletia uribei afectadas debido a insectos y una especie de

hongo del genero Colletotrichum (Medina 2009- 9 Hartung y Burton 1981)

Por ende que estos dos geacuteneros de hongos se encuentren juntos podriacutea tener

implicaciones en el aumento de virulencia potenciado a su vez por los desbalances abioacuteticos

causados por el cambio climaacutetico como lo han mencionado Belisario y colaboradores (2002) es

posible que las afectaciones no sean producidas por un uacutenico hongo si no por un complejo de

varios generando sinergismos entre diferentes especies que solas no hariacutean dantildeo a la planta pero

juntas podriacutean ser causantes de enfermedad (Lamichhane y Venturi 2015 4) aun mas en un

45

marco de cambio climaacutetico que gradualmente aumenta sus efectos nocivos sobre los paacuteramos

aumentando la temperatura cambios en la precipitacioacuten heladas intensas cambios en la

nubosidad mayor exposicioacuten a la radiacioacuten solar teniendo por resultado un iacutendice de estreacutes

mayor en las plantas de paacuteramo generando ventanas de oportunidades para que los hongos

endoacutefitos modifiquen sus roles de protector a patoacutegeno

En frailejones tambieacuten se ha reportado la presencia de Nigrospora y Trichoderma por

Bonilla y Argenis (2005) maacutes especiacuteficamente en la especie Espeletia grandiflora la cual es una

especie que habita en los paacuteramos de Colombia Ecuador y Venezuela en conjunto con Espeletia

hartwegiana (Luteyn 1999 3) El hecho que existan estos dos geacuteneros presentes en los frailejones

advierte de un equilibrio entre hongos endoacutefitos que se puede romper bajo las tensiones del

cambiante clima maacutes aun en los sensibles paacuteramos alto andinos

En cuanto a N sacchari se tiene reporte que es un productor de metabolitos con una

notable actividad herbicida demostrado en plantas cultivadas en invernadero (Fukushima et al

1998 2) debido a que existe evidencia que sugiere que los hongos endoacutefitos han evolucionado

directamente de hongos patoacutegenos (Schulz et al 1999 4) sumado al estreacutes del cambio climaacutetico

en cualquier momento de extrema tensioacuten hiacutedrica caloacuterica o heladas en estos ecosistemas de alta

montantildea Estos anomaliacuteas ambientales podriacutea disparar mecanismos de accioacuten fitopatoacutegenos

dentro de los frailejones generando un declive notable en sus poblaciones y por ende un declive

de la cantidad recurso hiacutedrico aguas abajo y su regulacioacuten (Diacuteaz et al 2002 5)

Como se mencionoacute anteriormente los medios de propagacioacuten de estos hongos endoacutefitos

pueden ser por medio de esporas que estaacuten en el ambiente aunque tambieacuten los vectores que

juegan un rol clave en su dispersioacuten son los insectos ya que estos pueden transportar esporas o

partes del hongo en su cuerpo patas o aparato bucal (Eigenbrode et al 2018 5)

Considerando la dispersioacuten homogeacutenea de los frailejones dentro del paacuteramo la carga

esporas en el ambiente y la herbivoriacutea de insectos es probable que se puedan ver infectados la

mayoriacutea de individuos (Varela 2016) es por ello que en el futuro puede que las afectaciones en

frailejones no sean producidas por hongos fitopatoacutegenos si no por hongos endoacutefitos que tuvieron

la ventana de oportunidad gracias al cambio climaacutetico aumento de la temperatura aumento en

las concentraciones de CO2 y alteraciones de precipitacioacuten que pueden hacer susceptible la planta

al ataque de estos hongos (Chakraborty 2011 Elad y Pertot 2014)

46

Para que se genere la enfermedad esta depende de la interaccioacuten de tres o cuatro factores

1) hospedero susceptible 2) agente causal (virulento) 3) condiciones ambientales favorables y 4)

tiempo (Francl 2001 2) la falta de alguno de ellos no permite que el patoacutegeno produzca la

enfermedad en la planta debido a ello algunas especies de frailejoacuten pueden tener una o dos cepas

que puedan actuar como fitopatoacutegenos pero no estaacuten activas si no estaacute completa su asociacioacuten

con otro patoacutegeno u otro factor

Ademaacutes existe un estudio que evaluoacute el efecto de la temperatura sobre la capacidad de

Fusarium verticillioides para generar infeccioacuten en plantas de maiacutez se probaron bajo 3 escenarios

de temperatura como resultados obtuvieron que la enfermedad de este hongo se veiacutea potenciada

por el aumento de temperatura en temperaturas por encima de 35degC (Murillo et al 2008) este

estudio da soporte a la hipoacutetesis de que existen factores que influyen significativamente a la

infeccioacuten en la planta tal vez el paacuteramo difiacutecilmente alcance 35degC no obstante la mayoriacutea de

especies son sensibles a cambios de temperatura de hasta de 1degC en donde modifican su

comportamiento rutas metaboacutelicas interacciones ecoloacutegicas y por ende sus defensas se ven

alteradas

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e Hypocrea

El geacutenero Trichoderma con seis especies diferentes (veacutease figura 12) fue el segundo

geacutenero maacutes numeroso despueacutes de Nigrospora que contoacute con siete especies aunque las primeras

especies que se analizaron fueron especies que principalmente actuaban generando enfermedades

en las plantas en las que se encontraban ante disturbios el geacutenero Trichoderma pertenece a la

47

familia Hypocreaceae y se caracteriza por tener una gran capacidad biocontroladora sobre

fitopatoacutegenos como Fusarium oxysporum los cuales podriacutean llegar masivamente con las

migraciones tempranas de insectos y plantas lentildeosas (Miles et al 2012 7)

No solo actuacutean repeliendo patoacutegenos internos si no tambieacuten patoacutegenos externos como

insectos que desean consumir u aprovechar la planta ya que estos pueden secretar diferentes

metabolitos secundarios y enzimas que actuacutean inhibiendo su desarrollo (Boughalleb-M et al

2018 8)

Es bien conocido que el geacutenero Trichoderma produce amplio rango de sustancias

antibioacuteticas ademaacutes de poseer la caracteriacutestica de parasitar otros hongos (Howell 2002 6)

Debido a la competencia que generan las especies del genero Trichoderma por espacio y

nutrientes inhiben o degradan pectinasas y otras enzimas que son esenciales para que los hongos

fitopatoacutegenos como Botrytis cinerea penetre en la superficie de las hojas logrando proteger de

esta forma al frailejoacuten que se veraacute expuesto a nuevas amenazas microbioloacutegicas auspiciadas por

los cambios en los patrones climaacutetico (Zimand et al 1996)

Ademaacutes de la capacidad del Trichoderma sp para atacar o inhibir el crecimiento de

patoacutegenos de plantas directamente descubrimientos recientes indican que tambieacuten pueden inducir

resistencia sisteacutemica y localizada a una variedad de patoacutegenos de plantas tales como el frijol es

protegido por Trichoderma harzianum de especies fitopatoacutegenas como Colletotrichum

lindemuthianum Botrytis cineacuterea las cuales producen lesiones en las hojas de la planta (Harman

y Howell 2004) Incluso se descubrioacute que ciertas especies de Trichoderma tienen una influencia

sustancial en el buen crecimiento y desarrollo de las plantas sin y con condiciones de estreacutes

climaacutetico (Lorito 1998)

Como lo demostraron Bonilla y Argenis (2005) en su estudio llevado a cabo en el

frailejoacuten Espeletia grandiflora diferentes cepas pertenecientes a Trichoderma pueden proteger

esta especie de paacuteramo de organismos fitopatoacutegenos emergentes por el cambio climaacutetico por

ende si puede proteger a E grandiflora tambieacuten puede proteger la especie E hartwegiana lo

que le permitiraacute sobrellevar diferentes ataques fortuitos de patoacutegenos e insectos que nunca han

logrado alcanzar las altitudes de paacuteramo (3200 - 5000 m)

Cuando el cambio climaacutetico aumente la temperatura en 1degC o 2degC traeraacute consigo sus

efectos de modificacioacuten en cuanto a la estructura y composicioacuten de las especies de plantas que

48

existen en zonas altas para este escenario basado en los caacutelculos de Thuiller (2007) las especies

se habriacutean desplazado en el gradiente altitudinal aproximadamente 450 metros para el antildeo 2070

Las consecuencias de este desplazamiento serian uacutenicas debido a que gran cantidad de

insectos y patoacutegenos tendriacutean migraciones tempranas en el gradiente altitudinal en buacutesqueda de

su optimo teacutermico llevando a cabo un proceso conocido como Termofilizacioacuten (Cuesta et al

2019) es ahiacute donde entra en juego la proteccioacuten que le pueden brindar especies endoacutefitos como

las que pertenecen al geacutenero Trichoderma en el marco de cambio climaacutetico

En concordancia con las cepas de Trichoderma y el geacutenero Hypocrea que tambieacuten

pertenece a la familia Hypocreaceae se conocen maacutes de 700 secuencias de peptaiboles (peacuteptidos

bioloacutegicamente activos) de ambos geacuteneros donde algunos de eacutestos son ecoloacutegica y

comercialmente relevantes debido a su potencial antimicrobiano actividad enzimaacutetica uacutetil para

competir por espacio y alimento de los nuevos patoacutegenos emergentes procedentes de las

alteraciones climaacuteticas y las migraciones tempranas (Degenkolb et al 2008 6)

En cuanto al geacutenero Hypocrea tambieacuten se ha reportado actividad antimicrobiana y anti

fuacutengica contra Staphylococcus aureus y Fusarium oxysporum (Gogoi et al 2008 2) habitando

los geacuteneros Trichoderma e Hypocrea dentro de especies de frailejoacuten como E hartwegiana se

espera que puedan generar sinergias de proteccioacuten que las ayude a combatir los fuertes y

extremos eventos climaacuteticos

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

del 100 (veacutease figura 13) lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen

menos mutaciones en los nodos internos del aacuterbol por ende este aacuterbol contiene la menor

cantidad de mutaciones o cambios dentro sus nodos internos teniendo como resultado una

hipoacutetesis evolutiva confiable (Schmidt y Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 que

indica que el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes corto (menos cambios) y el cual se ajusta

mejor a los datos (Swofford 1997)

49

El geacutenero Annulohypoxylon es de importancia dentro del marco del cambio climaacutetico ya

que pertenece a la familia Xylariaceae y se caracteriza por poseer metabolitos secundarios

antitumorales-citotoacutexicos como la anuloescuamulina que ayudan a combatir el estreacutes abioacutetico

(Cheng et al 2012) estas cepas de hongos son principalmente saprofitos y oportunistas han sido

reportadas en hojas sanas y afectadas de frailejones en otros estudios (Gonzaacutelez 2012 Nonsoque

2012) siendo un geacutenero resiliente a las perturbaciones ambientales como los cambios en los

patrones climaacuteticos su relacioacuten como mutualista dentro del frailejoacuten se mantendraacute hasta que el

frailejoacuten se adapte o colapse ante el estreacutes abioacutetico

Aunque no se conocen como fitopatoacutegenos al contrario pueden actuar como mutualistas

no se descarta que puedan estar involucrados en el desarrollo de diferentes enfermedades en

plantas cuando las condiciones ecosistemicas se alteran a puntos extremos (Gonzalez et al 2017)

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon Biscogniauxia

Nemania y Humiacutecola

El geacutenero Daldinia posee unos valores de MPML correspondientes a 10094 con lo cual

se encuentra bien soportado estadiacutesticamente el geacutenero Daldinia se encuentra ubicado en la

familia Xylariaceae al igual que el geacutenero Hypoxylon Biscogniauxia y Nemania que en su

respectivo orden contienen un soporte estadiacutestico MPML de 10082 10099 y 100100 (veacutease

figura 14) los cuales pertenecen a la divisioacuten Ascomycota las cepas de Daldinia se caracterizan

principalmente por ser especies endoacutefitas teniendo la capacidad de estar dentro de su hueacutesped

mucho tiempo sin causarle dantildeo o al menos un dantildeo evidente por medio de su estado asexual

50

No obstante su estado se puede modificar cuando las condiciones externas se modifican

abruptamente en poco tiempo como es el caso de las alteraciones en la temperatura

precipitacioacuten y concentraciones de dioacutexido de carbono (CO2) auspiciados por el cambio

climaacutetico (Saacutenchez et al 2013)

Un estudio realizado por Prieto (2017) en la especie de frailejoacuten E grandiflora encontroacute

que la especie Daldinia eschscholtzii estaba asociado en el siacutentoma de clorosis (falta de clorofila

en las hojas) Tambieacuten se reportoacute que especies de Daldinia como Daldinia conceacutentrica tienen la

capacidad de controlar nematodos fitopatoacutegenos (Silva et al 2020 104) los cuales pueden invadir

y romper los tejidos de la planta dantildeando sus estructuras los nematodos tambieacuten seraacuten sujetos a

migraciones tempranas por el cambio climaacutetico que trae consigo presiones de seleccioacuten por ende

nuevas amenazas para los frailejones (Nakashima et al 2007)

Como hemos visto hasta este punto las especies de hongos endoacutefitos se muestran en

muchos casos como benefactores y protectores de las diferentes plantas en las que habitan

incluyendo diferentes especies de frailejones

Los hongos endoacutefitos protegen tanto de factores bioacuteticos como virus hongos

fitopatoacutegenos bacterias insectos y factores abioacuteticos como las intemperancias del clima no

obstante en su relacioacuten endoacutefita geacuteneros como Hypoxylon que pertenece igual que Daldinia a la

familia Xylariaceae pueden tener roles amenazadores en conjunto con el cambio climaacutetico

seguacuten Gonzales y colaboradores (2019) inocularon cepas pertenecientes al geacutenero Hypoxylon en

hojas de Theobroma cacao y encontraron que en 48 horas se comenzoacute a notar las marcas de

clorosis y deshidratacioacuten foliar esto demuestra que cepas de este geacutenero pueden tener efectos

fitopatoacutegenos ocasionando muerte descendente pudricioacuten del tronco negro y resinosis de ramas

de mezquite (De la Torre-Almaraacutez et al 2003 De la Torre-Almaraacutez et al 2009)

La presencia de este geacutenero dentro del frailejoacuten en un marco del cambio climaacutetico lo

convierte en una amenaza latente ya que las condiciones seraacuten cada vez maacutes agrestes en los

paacuteramos de los Andes Tropicales Puede favorecer el desarrollo de este geacutenero que tiene las

enzimas necesarias para producir la pudricioacuten del tronco negro entre otras enfermedades

relevantes

51

Tambieacuten las especies del geacutenero Hypoxylon se han reportado como endoacutefitos en tejidos de

plantas lentildeosas o herbaacuteceas (Petrini y Petrini 1985 3) asiacute como saprofitos o fitopatoacutegenos

deacutebiles en madera de aacuterboles de zonas templadas o tropicales (Miller 1961) como lo menciona

Miller (1961)

Los geacuteneros Biscogniauxia Nemania tambieacuten estaacuten dentro de la familia Xylariaceae y

Divisioacuten Ascomycota un aspecto interesante de las especies de Biscogniauxia es que son

paraacutesitos exclusivos de las angiospermas dicotiledoacuteneas en donde concluyeron que todas las

especies pertenecientes a este geacutenero son patoacutegenos umllevesuml que se aprovechan de situaciones de

sequiacutea y estreacutes hiacutedrico para aumentar su patogenicidad (Ju et al 1998)

La especie de frailejoacuten E hartwegiana es una Dicotiledoacutenea eso explica porque

podemos encontrar esta especie de hongo endoacutefito en el frailejoacuten del presente estudio siendo de

vital importancia denotar que las especies de Biscogniauxia se aprovechan especialmente de las

situacioacuten de sequiacutea y estreacutes hiacutedrico difiacutecilmente las especies de este geacutenero podriacutean afectar a los

frailejones debido a que se caracterizan por ser reguladores de los ciclos hiacutedricos el agua es el

recurso que maacutes tiende a existir en un paacuteramo por la estructura de sus suelos compuesta por

andosoles porosos y necromasa acumulada teniendo asiacute un alto iacutendice de retencioacuten hiacutedrica

(Hernandez y Muntildeoz 2015) de modo que el cambio climaacutetico no favorece al geacutenero

Biscogniauxia en su estado patogeacutenico dentro del ecosistema de paacuteramo

En cuanto al geacutenero Nemania Da Silva y colaboradores (2018) llevaron a cabo una

investigacioacuten en la cual identificaron cepas pertenecientes a los geacuteneros Colletotrichum

Phyllosticta Xylaria Nemania y Alternaria en la especie ornamental Pachystachys lutea en

donde las mismas cepas fueron ensayadas para inhibir el crecimiento de hongos fitopatoacutegenos

como Colletotrichum sp en donde encontraron que Nemania era capaz de inhibir por medio de la

secrecioacuten de distintas enzimas el crecimiento de dichas especies gracias a su actividad

enzimaacutetica el geacutenero Nemania puede compensar los desequilibrios causados por el cambio

climaacutetico en teacuterminos de hongos fitopatoacutegenos

Hay que tener en cuenta que los elementos que dan forma a las interacciones planta-

endoacutefito incluyen el modo de transmisioacuten el patroacuten de infeccioacuten la edad de la planta las

condiciones ambientales potenciadas por el cambio climaacutetico y los antecedentes geneacuteticos (Aly et

al 2011 6) Los frailejones de la especie E hartwegiana que se muestrearon para el estudio se

52

tomoacute las hojas sanas lo que indica que poseiacutean estas cepas de endoacutefitos en equilibrio siendo este

uno de los pocos reportes de este geacutenero en especies de alta montantildea en los Andes Tropicales

El geacutenero Humiacutecola se encuentra soportado por un MPML de 10076 siendo una

hipoacutetesis evolutiva considerable es el uacutenico de la figura 14 que no estaacute dentro de la familia

Xylariaceae ya que pertenece a la familia Chaetomiaceae aunque se halla en la divisioacuten

Ascomycota se podriacutea considerar a la especie Humiacutecola fuscoatra como una de las especies de

endoacutefitos maacutes umlinofensivasuml debido a trabajos de investigacioacuten reportados como el de Menzies y

colaboradores (1998) y el de Naik y colaboradores (2009)

Humiacutecola fuscoatra no se considera un peligro latente para la especie E hartwegiana ya

que existe en equilibrio con su entorno Estaacute comprobado por medio de caracterizaciones

quiacutemicas que Humiacutecola fuscoatra es un importante productor de moleacuteculas de estimacioacuten

medica como el resorciacuteclico y lactonas aacutecidas (Mejia et al 2014) Por lo tanto es una especie

prometedora con un reservorio de metabolitos secundarios de importancia medicinal e industrial

que de seguir los efectos nocivos del cambio climaacutetico en los Andes Tropicales maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos esta especie podriacutea desaparecer

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies Massarina

Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

Uno de los grupos mejores soportados en este cladograma es el grupo de Diaporthe en el

cual se encontraron cuatro especies siendo uno con maacutes abundancia de especies del estudio y que

posee un MPML de 10085 10089 y 10095 acorde a sus 3 nodos (veacutease figura 15) teniendo asiacute

una hipoacutetesis evolutiva confiable de estas relaciones las especies de Diaporthe pertenecen a la

familia Diaporthaceae de la divisioacuten Ascomycota y son especies de endoacutefitos que se distinguen

por inhibir el crecimiento de hongos patoacutegenos en el hospedero que se encuentren El estudio de

53

Da Silva y colaboradores (2018) mostroacute que cepas de Diaporthe sp Inhibieron el crecimiento de

Fusarium oxysporum y Colletotrichum sp hongos fitopatoacutegenos que aumentaran su presencia

aprovechando las alteraciones producidas por el cambio climaacutetico en los paacuteramos

Las especies de este geacutenero estaacuten en continuo cambio entre endoacutefitos y patoacutegenos

funcionando en la mayoriacutea de los casos en una relacioacuten mutualista en donde le brindan a la planta

mayor tolerancia a las sequias proteccioacuten de patoacutegenos y pestes caracteriacutestica uacutetil frente a los

retos ecoloacutegicos que plantea el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales (Hubbard et al 2014)

se conocen cerca de 800 especies de este geacutenero asociadas a una amplia gama de plantas

vasculares a nivel mundial (Rossman et al 2015)

Esto explica porque las especies de Diaporthe fueron una de las maacutes numerosas

encontradas en la especie de alta montantildea E hartwegiana teniendo en cuenta que esta especie

pasa raacutepidamente de un estado endoacutefito a un estado patogeacutenico y dada su faacutecil y alta distribucioacuten

representa un peligro en conjunto con el cambio climaacutetico para las especies de alta montantildea como

los frailejones y supone una amenaza para el balance hiacutedrico y ecosistemico en el futuro

El geacutenero Crassiparies de la familia Neohendersoniaceae y el geacutenero Massarina de la

familia Massarinaceae pertenecen al orden Pleosporales aunque se discute debido a las

similaridades morfoloacutegicas y genoacutemicas con Massarina si Crassiparies deberiacutea estar en la

familia Massarinaceae (Hyde et al 2013 4) Se tiene poca informacioacuten sobre la especie

Crassiparies quadrisporus por ende este puede ser uno de los primeros reportes de esta especie

en una especie de alta montantildea como lo es el frailejoacuten especiacuteficamente en la especie E

hartwegiana en un marco de cambio climaacutetico el geacutenero Crassiparies necesita mayores estudios

a nivel ecoloacutegico y microbioloacutegico para entender su papel dentro de esta crisis climaacutetica

Mientras tanto el geacutenero Massarina ha logrado ser aislado de agua dulce con el fin de

obtener fuentes de productos naturales bioloacutegicamente activos por medio de las investigaciones

quiacutemicas de Shearer (1999 2001) en una especie de Massarina obtuvieron como resultado el

aislamiento de tres nuevos sequiterpenoides y dos lactonas derivadas de policeacutetidos con nuevos

sistemas de anillos lo que indica que esta especie tambieacuten puede tener un rol importante

mediante la produccioacuten de enzimas y metabolitos secundarios en el marco de las invasiones

bioloacutegicas impulsadas por el cambio climaacutetico

54

El geacutenero Cryptocoryneum de la familia Cryptocoryneaceae existe poca informacioacuten de

sus mecanismos de accioacuten como endoacutefito o patoacutegeno maacutes aun en especies de los Andes

Tropicales este podriacutea ser uno de los primeros reportes sobre esta especie de hongo en una

especie de frailejoacuten especiacuteficamente E hartwegiana en el 2015 se reportoacute en Brasil el

descubrimiento de una nueva especie del genero Cryptocoryneum trataacutendose de Cryptocoryneum

parvulum hallada en las hojas de la especie Araucaria angustifolia (Gimnosperma) (Silva et al

2015 1) la informacioacuten sobre el geacutenero Cryptocoryneum en relacioacuten al cambio climaacutetico y sus

efectos dentro de especies de alta montantildea como el frailejoacuten auacuten son poco conocidas

Uno de los geacuteneros maacutes cercanos a los grupos externos del cladograma es Cyphellophora

perteneciente a la familia Cyphellophoraceae el cual posee un MPML de 10091 logrando una

hipoacutetesis evolutiva confiable Diversas especies de Cyphellophora han logrado ser aisladas de

infecciones superficiales de la piel o las untildeas en humanos y de materiales vegetales (Decock et

al 2003 Cheewangkoon et al 2009) Esto indica su amplia distribucioacuten y su capacidad para ser

patogeacutenica tanto en plantas como en animales maacutes aun en condiciones desfavorables para la

planta como son las condiciones de cambio climaacutetico

De la especie Cyphellophora reptans se tiene reporte que su morfologiacutea es muy similar a

la de una levadura por lo que es faacutecilmente confundida con una (Reacuteblovaacute et al 2013) Es posible

que este sea el uacutenico reporte de Cyphellophora reptans en las hojas de un frailejoacuten o especie de

alta montantildea que habite en los troacutepicos como E hartwegiana debido a ello sus mecanismos de

accioacuten en especies de paramo dentro de un marco de cambio climaacutetico es poco conocido Se

necesitan mayores estudios enfocados en esta especie para entender su ecologiacutea y dinamismo

ecoloacutegico respecto a los cambios en las variables ambientales

Se eligieron las especies Coprinellus domesticus y Coprinellus xanthothrix como grupos

externos con el fin de enraizar el aacuterbol debido a que pertenecen a la Divisioacuten Basidiomycota la

cual difiere en grado de la divisioacuten Ascomycota aunque conserva semejanzas conocidos como

caracteres ancestrales o plesiomorficos que avanzan a medida la filogenia se construye con los

datos de las diferentes secuencias de especies evidenciando novedades evolutivas conocidas

como apomorfias que cuando se dan en un grupo en particular pasan a ser sinapomorfias es decir

novedades evolutivas dentro de un grupo particular (Lehtonen 2020) Se optoacute por enraizar con

55

estas dos especies con el objetivo de dar robustez al aacuterbol filogeneacutetico (Barriel y 1998) lo cual se

consiguioacute como se nota en los estadiacutesticos del aacuterbol filogeneacutetico

56

57

Conclusiones

Se rechaza la hipoacutetesis nula (H0) y se concluye que la identificacioacuten y caracterizacioacuten

molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo Colombia es diferente en 80 de sus geacuteneros y

especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos realizadas en especies de frailejoacuten

Por lo tanto los nuevos geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos encontrados en el frailejoacuten

plantean nuevos desafiacuteos respecto al cambio climaacutetico ya que tienen un rol vital en la

supervivencia de estas especies de alta montantildea como los frailejones debido a su relacioacuten

mutualista o patoacutegena maacutes aun en los paacuteramos que son altamente sensibles a los efectos del

cambio climaacutetico incluso tan sensibles como las zonas polares (Bradley et al 2006)

La mayoriacutea de especies encontradas en el presente estudio tienen potencial para ayudar a

combatir el estreacutes abioacutetico producido por el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales

Especiacuteficamente pueden ayudar a combatir el estreacutes bioacutetico producido por virus hongos

bacterias e insectos en un marco de cambio climaacutetico aumentos de temperatura cambios en la

concentracioacuten de CO2 cambios en la precipitacioacuten migraciones tempranas cambios en la

nubosidad disponibilidad hiacutedrica alteraciones en la estructura y composicioacuten de las especies

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73

Anexos

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombia

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia

hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

74

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

Coordenadas Geograacuteficas

(Latitud)

De la Colecta del

Material Bioloacutegico total de 15

muestras (Longitud)

LAT N 4deg 37 5871717 LONG W 75deg 25

3292611

LAT N 4deg 37 5885220 LONG W 75deg 25

3271217

LAT N 4deg 37 5884485 LONG W 75deg 25

3312103

LAT N 4deg 36 5995487 LONG W 75deg 27

3045854

LAT N 4deg 37 6195784 LONG W 75deg 30

3292611

LAT N 4deg 40 159171 LONG W 75deg 26

380142

LAT N 4deg 40 363762 LONG W 75deg 26

209072

LAT N 4deg 40 399832 LONG W 75deg 27

173554

LAT N 4deg 40 383965 LONG W 75deg 27

464325

LAT N 4deg 39 486438 LONG W 75deg 27

173559

LAT N 4deg 40 56894 LONG W 75deg 26

568287

LAT N 4deg 40 159174 LONG W 75deg 27

190654

LAT N 4deg 40 125083 LONG W 75deg 26

345912

LAT N 4deg 40 116691 LONG W 75deg 27

208264

LAT N 4deg 40 314698 LONG W 75deg 27

140791

75

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un estereoscopio con el propoacutesito de seleccionar la

maacutes indicada y luego sembrar un cultivo puro a partir de ese micelio

76

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados las

copias se conservaron con glicerol a -80degC en un ultra congelador de Thermo Scientifictrade

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas

y enviadas

77

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicos de forma segura y esteacuteril propiedad de la Universidad del Quindiacuteo

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a la Universidad Ruhr de Bochum (Alemania)

78

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de parsimonia

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X en donde se

observa en amarillo la secuencia umlTCATTAuml la cual es una secuencia altamente conservada

que se usa para marcar el inicio de la misma en hongos endoacutefitos

79

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa JmoldelTest usados para generar el

aacuterbol de relaciones filogeneacuteticas a partir de la regioacuten ITS de los hongos endoacutefitos aislados

total de modelos evaluados 88

ID Nombre Particioacuten lnL P AIC detaAIC Peso Cumpeso Udelta

1 JC 0 100820157 138 204400314 1341348 0 1 -

2 JC+I 0 98912511 139 200605022 9618188 0 1 -

3 JC+G 0 95470113 139 193720225 2733392 0 1 -

4 JC+I+G 0 95467507 140 193735014 274818 0 1 -

5 F81 0 100658095 141 204136189 13149356 0 1 -

6 F81+I 0 98761481 142 200362962 9376128 0 1 -

7 F81+G 0 95314814 142 193469628 2482794 0 1 -

8 F81+I+G 0 95324364 143 193508729 2521895 0 1 -

9 K80 10010 99734495 139 20224899 11262157 0 1 -

10 K80+I 10010 97835191 140 198470382 7483549 0 1 -

11 K80+G 10010 94227821 140 191255643 268809 0 1 -

12 K80+I+G 10010 94209963 141 191239926 253092 0 1 -

13 HKY 10010 99648091 142 202136181 11149348 0 1 -

14 HKY+I 10010 97761512 143 198383024 7396191 0 1 -

15 HKY+G 10010 94170799 143 191201599 214765 0 1 -

16 HKY+I+G 10010 94118678 144 191117357 130523 600E-04 0999 -

17 TrNef 10020 99564653 140 201929306 10942472 0 1 -

18 TrNef+I 10020 97712623 141 198245245 7258412 0 1 -

19 TrNef+G 10020 94150977 141 191121955 135121 400E-04 09994 -

20 TrNef+I+G 10020 94132131 142 191104263 117429 00011 09959 -

21 TrN 10020 99563809 143 201987618 11000784 0 1 -

22 TrN+I 10020 97702964 144 198285929 7299095 0 1 -

23 TrN+G 10020 94094235 144 191068469 81635 00065 09719 -

24 TrN+I+G 10020 94101378 145 191102757 115923 00012 09948 -

25 TPM1 12210 99713879 140 202227759 11240925 0 1 -

26 TPM1+I 12210 97826641 141 198473282 7486449 0 1 -

27 TPM1+G 12210 94249837 141 191319674 33284 0 1 -

28 TPM1+I+G 12210 942022 142 1912444 257566 0 1 -

29 TPM1uf 12210 99663473 143 202186945 11200112 0 1 -

30 TPM1uf+I 12210 97879458 144 198638917 7652083 0 1 -

31 TPM1uf+G 12210 94137349 144 191154699 167865 100E-04 09999 -

32 TPM1uf+I+G 12210 94141897 145 191183794 196961 0 1 -

80

33 TPM2 10212 99722544 140 202245087 11258254 0 1 -

34 TPM2+I 10212 97828213 141 198476426 7489592 0 1 -

35 TPM2+G 10212 94185859 141 191191718 204885 0 1 -

36 TPM2+I+G 10212 94153667 142 191147335 160501 100E-04 09998 -

37 TPM2uf 10212 99648091 143 202156182 11169348 0 1 -

38 TPM2uf+I 10212 97757018 144 198394035 7407202 0 1 -

39 TPM2uf+G 10212 941052 144 1910904 103566 00022 09904 -

40 TPM2uf+I+G 10212 9408801 145 19107602 89187 00044 0982 -

41 TPM3 12012 99768005 140 20233601 11349176 0 1 -

42 TPM3+I 12012 97958099 141 198736198 7749364 0 1 -

43 TPM3+G 12012 94227963 141 191275926 289093 0 1 -

44 TPM3+I+G 12012 94323885 142 191487769 500936 0 1 -

45 TPM3uf 12012 99625421 143 202110843 11124009 0 1 -

46 TPM3uf+I 12012 97770469 144 198420939 7434105 0 1 -

47 TPM3uf+G 12012 94165576 144 191211152 224319 0 1 -

48 TPM3uf+I+G 12012 94150861 145 191201721 214888 0 1 -

49 TIM1ef 12230 99592239 141 202004478 11017644 0 1 -

50 TIM1ef+I 12230 97822787 142 198485574 749874 0 1 -

51 TIM1ef+G 12230 94121043 142 191082087 95253 00033 09853 -

52 TIM1ef+I+G 12230 94122386 143 191104772 117939 00011 09969 -

53 TIM1 12230 99518653 144 201917306 10930473 0 1 -

54 TIM1+I 12230 9781156 145 19852312 7536286 0 1 -

55 TIM1+G 12230 94105198 145 191110396 123562 800E-04 09977 -

56 TIM1+I+G 12230 94087158 146 191094317 107483 00018 09922 -

57 TIM2ef 10232 99550617 141 201921233 109344 0 1 -

58 TIM2ef+I 10232 97704602 142 198249204 726237 0 1 -

59 TIM2ef+G 10232 94093484 142 191026968 40135 00516 0852 -

60 TIM2ef+I+G 10232 94073864 143 191007729 20895 0135 07169 -

61 TIM2 10232 99530022 144 201940044 1095321 0 1 -

62 TIM2+I 10232 97820158 145 198540315 7553482 0 1 -

63 TIM2+G 10232 94058678 145 191017356 30523 00834 08004 -

64 TIM2+I+G 10232 94060837 146 191041674 54841 00247 09248 -

65 TIM3ef 12032 99546286 141 201912572 10925739 0 1 -

66 TIM3ef+I 12032 97713931 142 198267862 7281028 0 1 -

67 TIM3ef+G 12032 94129376 142 191098753 111919 00014 09936 -

68 TIM3ef+I+G 12032 94112005 143 191084009 97176 0003 09883 -

69 TIM3 12032 99514376 144 201908751 10921918 0 1 -

70 TIM3+I 12032 97700023 145 198300047 7313213 0 1 -

71 TIM3+G 12032 94115323 145 191130646 143812 300E-04 09997 -

72 TIM3+I+G 12032 94096941 146 191113882 127048 700E-04 09984 -

73 TVMef 12314 9970418 142 20224836 11261526 0 1 -

74 TVMef+I 12314 97940598 143 198741196 7754363 0 1 -

81

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE (AIC)

75 TVMef+G 12314 94159829 143 191179657 192824 0 09999 -

76 TVMef+I+G 12314 94160993 144 191201987 215153 0 1 -

77 TVM 12314 99615991 145 202131982 11145148 0 1 -

78 TVM+I 12314 97746676 146 198413353 7426519 0 1 -

79 TVM+G 12314 94075503 146 191071005 84171 00057 09776 -

80 TVM+I+G 12314 94052588 147 191045176 58342 00208 09456 -

81 SYM 12345 99543166 143 201946331 10959498 0 1 -

82 SYM+I 12345 97757103 144 198394207 7407373 0 1 -

83 SYM+G 12345 94083056 144 191046112 59278 00198 09654 -

84 SYM+I+G 12345 94050035 145 19100007 13236 0198 05819 -

85 GTR 12345 99529525 146 20197905 10992217 0 1 -

86 GTR+I 12345 97686178 147 198312356 7325522 0 1 -

87 GTR+G 12345 94044194 147 191028387 41553 00481 09001 -

88 GTR+I+G 12345 94013417 148 190986834 0 03839 03839 -

6

7

Con amor para mis padres Fernando Ivaacuten Aristizabal y mi madre Mariacutea Ligia

Ortiz

A Norberto Aristizabal y Natalia Aristizabal por creer en miacute

A mi hijo Joseacute David Aristizabal por representar las nuevas generaciones

A mi tutor Jhon Alexander Osorio por tenerme paciencia en este proceso de

aprendizaje y compartirme sus conocimientos

A Tatiana Tapias por darme su amor y llevarme por el camino de la virtud

siempre centrado

A la maestriacutea en Cambio Climaacutetico Sustentabilidad y Desarrollo por siempre

estar disponibles para miacute

A la Universidad Andina Simoacuten Boliacutevar por apoyar mi tesis de investigacioacuten

A la Repuacuteblica del Ecuador por abrirme sus puertas y darme un mejor futuro

8

9

Agradecimientos

Estos agradecimientos van dedicados para Ecuador que me brindoacute la oportunidad

poder estudiar una maestriacutea a mi tutor por aceptarme y acompantildearme en este proceso a

mi familia por creer en miacute y en los sacrificios que hice para irme a vivir a otro paiacutes solo y

sin dinero para poder umlsalir adelanteuml como decimos en Colombia a mi compantildeera

sentimental por siempre guiarme hacia el camino correcto disciplina compromiso y

entrega a la universidad Andina Simoacuten Boliacutevar por aceptarme en sus aulas de clase y

por ultimo a la Universidad del Quindiacuteo por abrirle la puerta a uno de sus egresados y

acogerlo de buena forma con sus instalaciones de laboratorio

Gracias y mil gracias a todos de corazoacuten sin duda esta experiencia cambio mi

vida en todos los sentidos

Desde hoy hasta el final que podriacutea llamarse infinito

10

11

Tabla de contenidos

Figuras mapas y tablashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13

Introduccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 15

Capiacutetulo primero Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

1 Antecedenteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

2 Justificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 25

3 Hipoacutetesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 26

4 Objetivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

41 Objetivo generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

42 Objetivos especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

Capiacutetulo segundo Materiales Meacutetodos y Resultadoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

1 Aacuterea de Estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

2 Colecta de material bioloacutegicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos

endoacutefitos)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32

5 Extraccioacuten de ADNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

7 Secuenciamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

8 Anaacutelisis Filogeneacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

Capiacutetulo Tercero Discusioacuten sobre los hongos endoacutefitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidadhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio

Climaacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42

Conclusioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 57

Obras citadashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 59

Anexoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 73

12

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphellip 73

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia 73

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphelliphellip74

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana 75

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un

estereoscopio 75

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 76

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas y

enviadas 76

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 75

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a Alemania a la Universidad Ruhr de

Bochum 77

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de

parsimoniahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 78

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X 78

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa

JmoldelTest 79

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE

(AIC) 81

13

Figuras mapas y tablas

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo

Colombiahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras

N necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefitohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y

abioacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en

medio de cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelialhelliphelliphellip 30

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la

teacutecnica de corte de hifa uacutenica helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de

cultivo Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12)

aislados de las hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana 31-32

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 10 Filograma obtenido a partir del anaacutelisis ML y MP del conjunto de datos ITS Aislados

de las hojas de frailejoacuten37

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip43

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e

Hypocreahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip46

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon48

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon

Biscogniauxia Nemania y Humiacutecolahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

14

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies

Massarina Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona

muestreadahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia 29-30

Tabla 2 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos

endoacutefitos en la especie Espeletia hartwegiana

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36

Tabla 3 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = presencia del genero

de hongo dentro de la especie de frailejoacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42-43

15

Introduccioacuten

Hay un libro abierto siempre para

todos los ojos la naturaleza

(Jean-Jacques Rousseau 1712-1778)

El cambio climaacutetico corresponde a un fenoacutemeno que afecta el planeta de manera natural

permitiendo mantener las condiciones climaacuteticas como la temperatura la precipitacioacuten entre

otras en un rango aceptable para la vida (Jimeacutenez 2010) Sin embargo dado el aumento de las

emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) principalmente asociado a las actividades

humanas y el alto consumo de combustibles foacutesiles los cambios en dichas condiciones han sido

alterados dando paso a un acelerado aumento de temperatura anual en las uacuteltimas deacutecadas con

precipitaciones y sequias maacutes frecuentes e intensas (IPCC 2020 5 Jimeacutenez 2010)

Acorde con el Panel Intergubernamental de Expertos en Cambio Climaacutetico (IPCC) para

fin de siglo el Cambio Climaacutetico se acrecentaraacute pronosticando un aumento de temperatura de 25

a 45 degC para el antildeo 2100 que tan solo para Colombia en los uacuteltimos 30 antildeos fue de 08degC

generando impactos notorios en las zonas de alta montantildea como los paacuteramos (Moreno y Palma

2016)

El cambio climaacutetico es un fenoacutemeno cuyos efectos alcanzaraacuten los paacuteramos los cuales son

ecosistemas de alta montantildea presente en elevaciones entre 3100 y 4700 m ubicados en el norte de

los Andes de Ameacuterica del Sur y el sur de Ameacuterica Central adyacente (Berdugo et al 2016) Estas

aacutereas se caracterizan por una vegetacioacuten principalmente endeacutemica compuesta por frailejones

matorrales y pastos (veacutease figura 1) (Garciacutea et al 2010)

Los ecosistemas de alta montantildea como los paacuteramos ofrecen diversos servicios

ambientales como la biodiversidad uacutenica que albergan los paisajes los suelos y su capacidad de

retener y almacenar agua (Morales et al 2019) Las formaciones vegetales juegan un papel

diferenciado en el mantenimiento de la humedad y las fuentes de agua en el ecosistema

presentando la capacidad de interceptar almacenar y regular los flujos hiacutedricos superficiales y

16

subterraacuteneos aportando los servicios de abastecimiento de agua para el 70 de la poblacioacuten de

Colombia (Vaacutesquez y Buitrago 2017)

Ademaacutes dada la caracteriacutestica de permanente humedad de su suelo la materia orgaacutenica

se descompone a menor velocidad logrando un efecto de retencioacuten y almacenamiento de carbono

(Anderson et al 2012) En Colombia se han realizado diferentes estudios sobre la distribucioacuten y

extensioacuten del ecosistema paramuno Rangel (2002 4) determinoacute que los paacuteramos colombianos

abarcaban aproximadamente el 26 de la superficie del paiacutes

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramos por Pedraza-Pentildealosa Betancur y Franco-Rosselli (2005)

En particular el paacuteramo Romerales se encuentra dentro del territorio adscrito a los

Parques Nacionales Naturales (PNN) especiacuteficamente el PNN de los Nevados en la cordillera

central colombiana hacia la zona norte del Departamento del Quindiacuteo con liacutemites fronterizos

entre los departamentos de Risaralda y Tolima Este paacuteramo es el hogar del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana el cual estaacute afrontando los efectos del cambio climaacutetico (veacutease mapa 1)

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona muestreada

17

Existe evidencia cientiacutefica concreta del aumento de temperatura en los Andes Tropicales

tambieacuten cambios significativos en los patrones de precipitacioacuten sumado a la disminucioacuten en la

incidencia del clima nublado lo que conduce a las plantas a mayor cantidad de horas expuestas a

la radiacioacuten solar (Ruiz et al 2009) Otro efecto grave que trae consigo el cambio climaacutetico es el

desplazamiento de especies en el gradiente altitudinal Con un aumento de 3degC se espera que las

especies se muevan ~600 m en buacutesqueda de su optimo teacutermico esto afectariacutea gravemente las

especies de paacuteramo como los frailejones Cuesta Camacho (2007)

Los frailejones son emblemaacuteticas plantas de paacuteramo y ecosistemas de alta montantildea

(MINAMBIENTE 2019) Pertenecen a la familia Asteraceae contiene cerca de 142 especies

agrupadas en ocho geacuteneros Carramboa Coespeletia Espeletia Espeletiopsis Libanothamnus

Paramiflos Ruilopezia y Tamania de estos los maacutes importantes y con mayor diversidad de

especies son Espeletia Espeletiopsis y Libanothamnus (Rivera y Torres 2001)

Poseen adaptaciones que les permite captar y retener grandes cantidades de agua de su

entorno permitiendo un balance ecosistemico (Farias 2013) La morfologiacutea singular del genero

Espeletia le permite acumular las hojas antiguas en forma de ldquoabrigordquo brindando proteccioacuten

contra las bajas temperaturas nocturnas de hasta 0degC Los fuertes vientos y la radiacioacuten solar los

cuales seraacuten cada vez maacutes intensos y frecuentes por causa del cambio climaacutetico (Cortes y

Sarmiento 2013 34) (veacutease figura 2)

Estas plantas son especies claves para la conservacioacuten de los paacuteramos y la lucha contra el

cambio climaacutetico debido a que ofrecen una gran variedad de servicios ecosisteacutemicos (Diacuteaz et al

2007) El paacuteramo es referente sin igual de fuente hiacutedrica ciudades como Bogotaacute y Quito obtienen

aproximadamente el 80 de su agua dulce de los paacuteramos (Buytaert et al 2006) Los frailejones

en su mayoriacutea endeacutemicos se han visto afectados por actividades humanas como la ganaderiacutea

extensiva agricultura (cultivos de papa y cebolla) mineriacutea de oro y carboacuten turismo no

controlado y quemas intencionales (Hofstede 2000) Esta situacioacuten podriacutea comprometer a

mediano y largo plazo la funcioacuten de captacioacuten regulacioacuten y suministro del agua para el consumo

18

en las ciudades colombianas ubicadas en las regiones de influencia de estos ecosistemas (Varela

2015)

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

No obstante en asociacioacuten con especies como el frailejoacuten de los Andes Tropicales

encontramos a los hongos cuyos roles en las interacciones bioloacutegicas son de vital importancia

Los hongos pueden ser endoacutefitos simbiontes mutualistas paraacutesitos y comensales y son capaces

de responder a las amenazas que plantea el cambio climaacutetico en cuanto a perturbaciones

ambientales aumento de temperatura y estreacutes hiacutedrico adaptaacutendose a la disponibilidad de recursos

modificando sus actividades enzimaacuteticas e incluso su genoma a lo largo del tiempo (Moreno et

al 2013)

Los hongos son clasificados seguacuten su forma de reproduccioacuten sea sexual o asexual en

donde se observan las diferencias estructurales internas entre los diferentes grupos tales como

sus esporas e hifas como lo indican Blackwell y Spatafora (2004) estos organismos estaacuten

divididos en cuatro grandes grupos los cuales son Ascomycota Basidiomycota

Chytridiomycota Zygomycota es justo en el grupo de los Ascomycota donde se encuentra gran

diversidad de hongos conocidos como ldquohongos endoacutefitosrdquo en donde su nombre ldquoendoacutefitordquo

significa ldquodentro de la plantardquo (endon dentro phyton planta)

19

Estos microorganismos fuacutengicos tienen la facilidad de pasar gran parte o todo su ciclo de

vida invadiendo los tejidos de su hospedero (planta) sin tener un efecto negativo evidente

(Leacuteveilleacute 1846 3 de Bary 1866 8) Por lo tanto el concepto de endoacutefito indica una asociacioacuten de

costo-beneficio pero de una forma mutualista entre el hongo y la planta hospedera permitiendo

la estadiacutea en sus tejidos vivos (Clay 1998 8) Los hongos endoacutefitos se han encontrado en todas

las plantas (algas musgos pastos plantas y vasculares) desde los bosques templados hasta los

bosques tropicales hallaacutendose una gran diversidad de plantas y en asociacioacuten gran diversidad de

hongos endoacutefitos (Saacutenchez et al 2010)

Se espera que los hongos endoacutefitos jueguen un papel cada vez maacutes importante potenciado

por el cambio climaacutetico en las enfermedades producidas en plantas como pudricioacuten radicular

mal blanco entre otras con los aumentos pronosticados de la temperatura y el estreacutes por sequiacutea

asociados al cambio climaacutetico (Desprez-Loustau et al 2006 Slippers y Wingfield 2007 6) Los

cambios en la cantidad de dioacutexido de carbono (CO2) y la disponibilidad de nitroacutegeno en el suelo

afectan de forma similar tanto a las plantas como a los hongos por ende las alteraciones

generadas por parte del cambio climaacutetico pueden causar desbalances en sus relaciones (Ies et al

2013)

Algunos estudios realizados en el antildeo 1898 donde se registraron los primeros hongos

endoacutefitos como el de Bary (1866) brindo la iniciativa de investigaciones que lograron explicar

los cuadros toxicoloacutegicos observados en animales los cuales se daban por el consumo de

semillas o en aacutereas de pastos (Poaceae) que posiblemente albergaban hongos Clavicipitaacuteceos

(familia del ergot) los cuales poseiacutean actividades enzimaacuteticas con micotoxinas

Por diversas situaciones no trascendioacute la investigacioacuten hasta que Bacon (1977) hizo

relacioacuten del hongo endoacutefito Neotyphodium coenophialum debido a una intoxicacioacuten del ganado

llamado ldquosiacutendrome de veranordquo cuando estos animales consumiacutean pastos de la especie Festuca

arundinacea (Poaceae) Funk en el antildeo 80 caracterizoacute la resistencia de las Poaceae que

albergaban hongos endoacutefitos que frecuentemente eran atacados por insectos (proteccioacuten contra

herbiacutevoros) (Saacutenchez et al 2010)

Compant y colaboradores (2010) mencionaron que tras experimentar en el laboratorio

con una gama de temperaturas en los hongos endoacutefitos aislados obtuvieron resultados variables

respecto al crecimiento es decir positivos y neutrales llegando a la conclusioacuten de que los

microorganismos asociados a las plantas son un factor importante que influye en la respuesta de

20

las plantas acorde a los cambios de temperatura lo que compromete las respuestas del frailejoacuten y

los hongos endoacutefitos frente al calentamiento global causado por el cambio climaacutetico

Con relacioacuten a los estudios realizados sobre hongos endoacutefitos en frailejones se han

encontrado al menos 100 especies con capacidades de inhibir hongos fitopatoacutegenos o herbivoriacutea

(Cabezas et al 2012)

Los geacuteneros de hongos endoacutefitos encontrados en anteriores estudios son Acremonium

Aspergillus Aureobasidium Colletotrichum Fusarium Gliocadium Nigrospora Paecilomyces

Penicillium Trichothecium Trichoderma y Sordaria (Pineda 2000 Programa Nacional para la

Evaluacioacuten del Estado y Afectacioacuten de los Frailejones en los Paacuteramos de Andes del Norte 2009)

Teniendo en cuenta que para Colombia hay poca informacioacuten sobre hongos endoacutefitos en

ecosistemas paramunos se hace fundamental la ampliacioacuten de maacutes informacioacuten referente al tema

debido a que solo existen estudios significativos en cafeacute leguminosas y rosas los cuales maacutes allaacute

de la identificacioacuten de geacuteneros de hongos endoacutefitos no incluyen el cambio climaacutetico y sus

posibles consecuencias (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016) En

teacuterminos filogeneacuteticos los hongos son el reino de la naturaleza maacutes cercano a los animales

(Hibbett et al 2018)

Las relaciones que posean las diferentes especies de endoacutefitos dentro de la especie de

frailejoacuten es de importancia conocerla mediante el uso de la filogenia molecular (Judd et al 2007)

mediante secuencias de ADN ARN o proteiacutenas (Cooke et al 2000) Dependiendo de la presencia

de especies agresivas de endoacutefitos como Nigrospora se puede tener un mejor conocimiento

sobre las consecuencias que trae consigo los impactos del cambio climaacutetico sobre estas plantas de

los Andes Tropicales (Foden et al 2009)

21

Capiacutetulo primero

Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitos

1 Antecedentes

Desde los estudios realizados por Leacuteveilleacute (1846) y Bary (1866) sobre hongos Endoacutefitos

en pastos de zonas templadas se ha logrado identificar que estos hongos son capaces de inducir

respuestas adaptativas a sus hospederos (Micotoxinas contra herbiacutevora adaptacioacuten a heladas o

climas extremos fijacioacuten de nutrientes) a cambio de alimento y hospedaje formando una relacioacuten

mutualista en la cual las dos especies involucradas son beneficiadas No obstante se ha reportado

que los hongos endoacutefitos ademaacutes de tener relaciones mutualistas con diferentes especies

vegetales se pueden tornar en especies patoacutegenas para su hospedero una vez la planta se

encuentra en condiciones desventajosas tornaacutendose asiacute el hongo endoacutefito en un hongo

fitopatoacutegeno (Herrera y Ulloa 1990 550)

Como se mencionoacute anteriormente los hongos endoacutefitos pueden pasar de un estado

mutualista a un estado de patogeacutenesis dada esta relacioacuten entre ambos organismos se producen

metabolitos secundarios potencialmente toacutexicos facilitando factores de virulencia dados por el

hongo endoacutefito como exoenzimas y metabolitos fitotoacutexicos a su vez la planta presenta defensas

tanto mecaacutenicas como bioquiacutemicas (Saacutenchez et al 2013 5)

Hasta la fecha los principales estudios de hongos endoacutefitos se han fijado en especies de

intereacutes econoacutemico y comercial tales como palma de aceite cafeacute leguminosas pastos de forrajeoacute

y diferentes tipos de rosas (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016)

Las especies modelo para el estudio de los hongos endoacutefitos han sido las gramiacuteneas

forrajeras en donde se han reportado especies de endoacutefitos asociados a los geacuteneros Lolium

Festuca y Brachiaria (Siegel et al 1987) no obstante Otero y Bayman (2009) han reportado un

creciente nuacutemero de estudios en orquiacutedeas epifitas tropicales relaciones con hongos micorrizicos

22

Actualmente existen escasos reportes de hongos endoacutefitos asociados a ecosistemas con

climas extremos (temperaturas extremas) como aacuterticos desiertos paacuteramos y zonas alpinas

especialmente para zonas de temperaturas friacuteas como lo son los paacuteramos (Lopera et al 2008

Leung et al 2011 Cabezas et al 2012 Miles et al 2012 Zhang y Yao 2015)

Investigadores como Lopera Leung y colaboradores (2011) han llegado a la conclusioacuten

de que los hongos endoacutefitos juegan un papel importante en las plantas a la hora de adaptarse a

ecosistemas de clima templado (Kivlin et al 2013 Zhang y Yao 2015)

En Colombia los trabajos con hongos endoacutefitos son pocos por ende trabajos como el de

Lopera y colaboradores (2008) con especies del genero Espeletia de los paacuteramos Colombianos

son pioneros ademaacutes del trabajo de Cabezas y colaboradores (2012 4) en el cual aislaron y

caracterizaron celulasas (enzimas descomponedores de la celulosa) extraiacutedas de hongos endoacutefitos

que se hallaban en especies de Espeletia posteriormente Lopera y Miles (2012) unieron

esfuerzos para continuar caracterizando la diversidad de hongos endoacutefitos en los paacuteramos andinos

colombianos enfocados en Espeletia con el objetivo de encontrar especies con potencial

biocontrolador

Existen trabajos tesis en los repositorios de diversas universidades de los antildeos 2014 y

2015 en los cuales se aborda el tema de los hongos endoacutefitos paacuteramos y especies de Espeletia

(frailejones) y de la familia Poaceae en donde se caracterizan las diversas especies de hongos

endoacutefitos por medio taxonomiacutea y biologiacutea molecular ademaacutes de buscar metabolitos secundarios

con fines medicinales o de biocontrol

Los trabajos en filogenia molecular de hongos endoacutefitos realizados en frailejones se han

visto enfocados maacutes hacia la buacutesqueda de la diversidad funcional en comunidades

microbioloacutegicas como por ejemplo el estudio realizado por Ruiz y colaboradores (2015) en

donde buscaron mediante el anaacutelisis molecular de raiacuteces necromasa hojas maduras y joacutevenes de

diferentes especies de Espeletia (veacutease figura 3) ubicada en los Andes neotroacutepicales

colombianos secuencias geneacuteticas de las regiones V5-V6 de la unidad 16S del rARN

23

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras N

necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefito Tomado de Ruiz y colaboradores (2015)

Este estudio analizoacute la composicioacuten de comunidades microbioanas y su diversidad

funcional en un ecosistema de alta montantildea en donde las temperaturas los rayos UV y la altura

juegan papeles determinantes como filtros ecoloacutegicos severos en donde solo pueden existir

especies que han desarrollado capacidades para adaptarse sobrevivir y colonizar dichas aacutereas

por ende cuando se analizaron las comunidades existentes dentro de estas especies de Espeletia

Encontraron que algunas especies halladas podriacutean tener roles importantes como

productores de metabolitos secundarios enzimas o incluso como bioremediadores y que las

comunidades microbianas eran diferentes tanto en sus hojas como en sus raiacuteces y en la

necromasa

A medida que las deacutecadas avanzan y la evidencia sobre el cambio climaacutetico se hace maacutes

robusta y evidente los estudios en los hongos endoacutefitos han tomado vital importancia al estar

asociados con cultivos de especies comestibles escases de agua y de tierras productivas sumado

a los efectos negativos que trae consigo el cambio climaacutetico para las diferentes plantaciones y

cosechas a nivel global

Es por eso que Lu Yan y colaboradores (2019) analizaron los efectos positivos que teniacutean

la colonizacioacuten de hongos endoacutefitos en las plantas en donde ratificaron que los hongos endoacutefitos

dentro la planta generan metabolitos antimicrobianos estimulan las respuestas inmunoloacutegicas y

compiten por espacio dentro de la planta con diferentes patoacutegenos incrementando asiacute la

resistencia contra herbiacutevoros y la resistencia al estreacutes salino (factores bioacuteticos)

Ademaacutes de ayudar a la planta contra el estreacutes abioacutetico causado principalmente por

factores climaacuteticos como la falta de agua (estreacutes hiacutedrico) las temperaturas extremas la

intensidad de los rayos UV y los metales pesados como la muestra la figura 4 debido a esto se

24

concluyoacute que las fitohormonas cumplen un papel importante en la colonizacioacuten de hongos

endoacutefitos dentro de la planta

Aun que se ha reportado que los hongos endoacutefitos se pueden usar como biocontroladores

diferentes estudios reportan que el uso de hongos endoacutefitos puede tener efectos adversos como

un retraso significativo en el crecimiento de la planta con el uso de la especie Cryptosporiopsis

sp (Terhonen et al 2016) Otro reporte indica la fecundidad y supervivencia de enemigos

naturales como paraacutesitos esto es debido a que los hongos endoacutefitos transfieren sus toxinas y

alcaloides cuando son ingeridos por paraacutesitos u otros enemigos naturales de las plantas (Lopez y

Sword 2015)

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y abioacutetico

Bajo estreacutes bioacutetico (herbiacutevoros y patoacutegenos) y abioacutetico (sequiacutea salinidad metales pesados y otros) (a) se

inducen respuestas de defensa de las plantas (b) los endoacutefitos producen metabolitos protectores y

modulan la viacutea de las fitohormonas para mejorar la inmunidad de las plantas (c) tomada de Lu yan y

colaboradores (2019 7)

25

2 Justificacioacuten

La presente investigacioacuten pretende identificar y caracterizar que especies de hongos

endoacutefitos estaacuten asociadas al frailejoacuten Espeletia hartwegiana y que posibles implicaciones podriacutea

tener que estas especies se encuentren dentro de esta especie de alta montantildea La importancia de

conocer esta informacioacuten reside en que los hongos endoacutefitos pueden beneficiar o perjudicar a la

adaptacioacuten y resistencia de especies vegetales en los distintos escenarios climaacuteticos propuestos

por la ciencia (IPCC 2020)

El calentamiento global podriacutea afectar el equilibrio de los hongos endoacutefitos en especies

vegetales generando desbalances en la planta o la peacuterdida de especies endoacutefitas de importancia

biotecnoloacutegica Por ejemplo se podriacutean perder especies endoacutefitas con potencial para control

bioloacutegico de plagas y enfermedades de plantas como productores de enzimas y metabolitos

secundarios degradacioacuten de plaacutesticos o biorremediacioacuten entre otros (Schulz et al 2002) Por

ello se hace fundamental estudiar los hongos endoacutefitos en ecosistemas de paacuteramo ya que en

Colombia y en los paacuteramos en general han sido poco estudiados y su efecto sobre las plantas de

alta montantildea podriacutea ser clave en el mantenimiento de sus poblaciones

26

3 Hipoacutetesis

H1 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute diferente en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo diferentes los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten tambieacuten seria

modificada

H0 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute similar en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo similares los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten continuariacutean

como se ha registrado con anterioridad

27

4 Objetivos

41 Objetivo general

Caracterizar la diversidad de hongos endoacutefitos presentes en los frailejones

de la especie Espeletia hartwegiana en el paacuteramo de Romerales tomando en cuenta su

relacioacuten con el cambio climaacutetico

42 Objetivos especiacuteficos

Identificar los hongos endoacutefitos asociados en Espeletia hartwegiana del

paacuteramo de Romerales

Hallar relaciones filogeneacuteticas entre las diferentes especies de hongos

Endoacutefitos encontradas en Espeletia hartwegiana

Advertir las repercusiones del cambio climaacutetico sobre Espeletia

hartwegiana en base a su diversidad de hongos endoacutefitos

28

29

Capiacutetulo segundo

Materiales Meacutetodos y Resultados

1 Aacuterea de Estudio

El trabajo se realizoacute en el paacuteramo de Romerales ubicado en la zona alta del municipio de

Salento Quindiacuteo (4deg39202N 75deg25506W) con una extensioacuten aproximada de 6794 ha (Cano

et al 2015)

2 Colecta de material bioloacutegico

La colecta del material bioloacutegico se realizoacute mediante muestreos aleatorios lo largo del

paacuteramo tomando coordenadas de cada punto de colecta (veacutease anexo 3) las hojas se colectaron

por medio de tijeras podadoras siendo empacadas cada una en bolsas Ziploc diferentes se

colectoacute un total de 15 hojas cada una correspondiente a una planta de frailejoacuten para un total de

15 plantas muestreadas de E hartwegiana

Adicionalmente las bolsas Ziploc fueron marcadas con los datos de colecta en campo y

transportadas a los laboratorios del Programa de Biologiacutea de la Universidad del Quindiacuteo para su

procesamiento

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetales

Las muestras obtenidas fueron lavadas con agua para eliminar el exceso de residuos se

cortaron 4 trozos de cada hoja con un tamantildeo aproximado de 05 a 10 cm (veacutease figura 5) luego

cada trozo de hoja se sometioacute a una esterilizacioacuten la cual se completoacute con algunas modificaciones

acorde al procedimiento descrito por (Osorio et al 2017) especiacutefico para el aislamiento de

30

hongos endoacutefitos que consiste en sumergir perioacutedicamente el material vegetal en etanol al 90

durante un minuto seguido de hipoclorito de sodio (NaClO) al 4 por un minuto continuando

con etanol al 70 durante un minuto y por uacuteltimo se lavaraacuten con agua destilada todo dentro de la

campana de flujo

Las cuatro secciones de hoja se transfirieron a una caja de Petri para un total de 15 cajas

de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA) (una caja de Petri por cada 4 cortes de hoja)

Posteriormente las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente (25degC aproximadamente)

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en medio de

cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelial caja de Petri de 20ml de capacidad

Pasadas 3 semanas se revisaron los cultivos fuacutengicos con el fin de revisar el crecimiento

del micelio y hacer un repique a un cultivo puro una vez maduros se procedioacute a utilizar la teacutecnica

de corte de hifa uacutenica (Osorio et al 2017) esta teacutecnica consistioacute en tomar la punta de la hifa con

ayuda de un estereoscopio y un bisturiacute de grado quiruacutergico agua destilada alcohol al 70 y un

mechero para mantener el bisturiacute esterilizado una vez identificada la hifa ideal para cultivar de

forma pura (veacutease figura 6) con el bisturiacute se procedioacute a cortar el agar PDA en forma de cuadro

con una medida aproximada de 3 miliacutemetros cuadrados

31

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la teacutecnica de

corte de hifa uacutenica

Se esperoacute entre 3 a 5 semanas a que crecieran los cultivos puros aislados de las hifas uacutenicas en

nuevas cajas de Petri con agar PDA

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos endoacutefitos)

Los hongos cultivados de forma pura consiguieron un crecimiento micelial significativo a partir

de los 15 diacuteas a temperatura ambiente como lo demuestra la figura 7 que contiene doce de los

cultivos maacutes representativos con su respectivos micelios aeacutereos desarrollados donde variacutean sus

colores formas y consistencias esto indicando que pertenecen a diferentes especies

2

1

3

32

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de cultivo

Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12) aislados de las

hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

5 Extraccioacuten de ADN

4

5

6

7

8

9

10

11

12

33

Una vez el micelio de los hongos se encontraba desarrollado en la cantidad necesaria se

procedioacute a extraer el ADN genoacutemico siguiendo el protocolo de extraccioacuten de Raeder y Broda

(1985) por medio de un barrido superficial del micelio evitando tomar el agar este micelio

posteriormente se colocoacute en tubos Eppendorf esteacuteriles de 2 ml y se pulverizoacute mediante el uso de

un asa microbioloacutegica y 1ml de buffer de extraccioacuten compuesto de Tris-HCL 1 M pH 78 EDTA

05 M Ph 8 SDS 10 wv NaCL y agua destilada para cada tubo a continuacioacuten se agregoacute 800

ul de etanol al 70 500 ul de fenol y se mezcloacute

Se adicionoacute 300 ul de cloroformo y se mezcloacute de nuevo de alliacute se llevoacute a la centrifuga a

10000 rpm por 60 minutos luego de centrifugar se forma un sobrenadante el cual es transferido

en su totalidad a un nuevo tuvo Eppendorf de 15 ml en el cual se agregaron 400 ul de cloroformo

y se llevoacute a la centrifuga a 10000 rpm por 10 minutos en donde nuevamente se forma un

sobrenadante aunque esta vez solo se toman 500 ul del tubo para ser transferidos otro tubo

Eppendorf de 15 ml ya en el nuevo tubo se adicionaron 50 ul de NaAC y se invirtioacute varias veces

para homogenizar la mezcla a continuacioacuten se guardoacute en el refrigerador a 4degC toda la noche

Al diacutea siguiente se tomaron las muestras en los tubos Eppendorf y se centrifugaron a

10000 rpm por 30 minutos (Formacioacuten del Pellet de ADN) cuando la centrifuga terminoacute se

procedioacute a remover el etanol ya sin etanol se agregoacute de nuevo 1 ml de etanol al 70 a cada tubo

y se centrifugoacute a 10000 rpm por 5 minutos en este paso se removioacute el etanol y se dejoacute secar el

pellet de ADN una vez el etanol se evaporoacute se re suspendioacute el pellet en 100 ul de agua grado

molecular o Sabax con 5 ul de RNAsa con el fin de evitar la presencia de moleacuteculas de ARN

posteriormente se incubaron a 37degC por 30 minutos y se guardaron para su envioacute a -20degC

(Raeder y Broda 1985)

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengica

Una vez se secuenciaron las muestras de ADN enviadas a la Universidad Ruhr de

Bochum Alemania se hizo el ensamblaje de las secuencias en contigs y scaffolds en el

programa CLC Main Workbench 8 (Nicola et al 2013) Como lo muestra la figura 8 donde se

muestran los pasos esenciales de una teacutecnica de Metagenoacutemica donde posteriormente se

analizaron con maacutes detalle mediante teacutecnicas filogeneacuteticas

34

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemico Fuente Thomas y colaboradores (2012)

7 Secuenciamiento

Se extrajoacute con eacutexito un total de 35 muestras de hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

Espeletia hartwegiana (veacutease figura 9) que posteriormente fueron secuenciadas por la

Universidad Ruhr de Bochum (Alemania) logrando un total de 70 secuencias incluyendo

aquellas obtenidas en Genk Bank

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de frailejoacuten

Espeletia hartwegiana

35

8 Anaacutelisis Filogeneacutetico

Se aislaron 35 secuencias basadas en la especie Espeletia hartwegiana fueron

comparadas posteriormente con 35 secuencias de especies publicados en GenBank

(httpblastncbinihgovblastcgi) se obtuvo un total de 70 secuencias Las secuencias de

consenso ITS 58S DNA obtenidas se usaron para realizar buacutesquedas BLAST en GenBank

usando BLASTn (Altschul et al 1990) con el fin de identificar mediante las secuencias aisladas

los geacuteneros o las especies maacutes cercanas La matriz de datos fue alineada en MAFFT v7 (Katoh y

Standley 2013) Se utilizaron las especies Coprinellus xanthothrix y Coprinellus domesticus

como grupos externos

Los anaacutelisis de las secuencias para construir los arboles filogeneacuteticos de Maacutexima

Parsimonia (MP) fueron realizados usando PAUP v40b10 (Swofford 2003) Para el anaacutelisis de

Maacutexima Verosimilitud o ML por sus siglas en ingleacutes (Maximum Likelihood) se utilizoacute

JmodelTest (Darriba et al 2012) con el cual se infirieron los criterios del modelo de sustitucioacuten

apropiado utilizando los criterios de informacioacuten de Akaike (AIC) (Akaike 1974)

Los anaacutelisis de ML se realizaron con el programa PhyML v 30 (Guindon y Gascuel

2003) teniendo en cuenta la proporcioacuten de sitios invariables Los valores de soporte de confianza

para los nodos se estimaron mediante 1000 anaacutelisis de arranque de replicacioacuten La alineacioacuten de

los datos de la secuencias de ITS para 70 aislamientos determinoacute quince geacuteneros siendo los

siguientes Annulohypoxylon Biscogniauxia Colletotrichum Crassiparies Cryptocoryneum

Cyphellophora Diaporthe Daldinia Humiacutecola Hypoxylon Hypocrea Nemania Nigrospora

Massarina y Trichoderma de los cuales se obtuvieron 11 clados principales (veacutease figura 10)

Con base en estos resultados todos los aislamientos se analizaron maacutes a fondo dentro de los

geacuteneros hasta llegar a especie (veacutease tabla 1)

36

Geacuteneros Especie Especie Especie Especie Especie Especie Especie

Annulohypoxylon A nitens A bahnphaden

gense

Biscogniauxia B petrensis

Colletotrichum C gloeosporioides

C gigasporum

Cyphellophora C

reptans

Crassiparies C quadrisporus

Cryptocoryneum C

longicondensatum

Daldinia D dennisii D

eschscholtzi

D

conceacutentri

ca

Diaporthe D

longicolla

D

foeniculina

D

anacardi

i

D

macada

miae

Humiacutecola H

fuscoatra

Hypoxylon H

trugodes

H

pulicicidum

Hypocrea H

koningii

Massarina M albocarnis

Nemania N

primolutea

Nigrospora N sacchari N rubi N sphaeric

a

N hainanen

sis

N oryzae

N gorlenko

ana

N aurantia

ca

Trichoderma T trixiae T

olivascens

T

paraviridescens

T

viridescens

T

samuelsii

T viride

Grupo Externo Coprinellus C

domesticus

C

xanthothrix

Tabla 1 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos endoacutefitos en la

especie Espeletia hartwegiana

37

38

Figura 10 Filograma consenso obtenido con el programa MEGA ndashX a partir del anaacutelisis ML y MP del

conjunto de datos ITS Aislados de las hojas de frailejoacuten Los coacutedigos en Verde son las secuencias que se

aislaron (aislados) en este estudio los coacutedigos y nombres en Negro son las secuencias encontradas por

identidad en GenBank Los valores de soporte de bootstrapgt 70 se indican cerca de los nodos como MP

ML = valores de soporte de bootstrap lt70

El nuacutemero de caracteres los modelos de sustitucioacuten usada asiacute como otros resultados

estadiacutesticos de las pruebas de Maacutexima Parsimonia y Maacutexima Verosimilitud generados a partir de

los anaacutelisis filogeneacuteticos de los conjuntos de datos se muestran en los anexos

39

Capiacutetulo Tercero

Discusioacuten sobre los hongos endofitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicas

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidad de Endoacutefitos

Tanto la temperatura la estacionalidad y los tipos de precipitacioacuten son factores de vital

importancia para la composicioacuten de las diferentes comunidades y la arquitectura vegetal Estos

factores limitan muchos de los procesos ecosisteacutemicos ya que existe una estrecha relacioacuten entre

las variaciones climaacuteticas y las variaciones dentro de los ecosistemas Por lo tanto se espera que

el cambio climaacutetico transforme los ecosistemas Andinos tal como los conocemos hoy (Colwell et

al 2008) modificando las relaciones mutualistas entre plantas y hospederos

Posiblemente la resiliencia y resistencia de muchos ecosistemas como el paacuteramo sean

superadas en este siglo por una combinacioacuten sin precedentes de disturbios tales como el cambio

climaacutetico perturbaciones asociadas a este (sequiacuteas fuegos invasioacuten de especies exoacuteticas

inundaciones) y otros factores como organismos oportunistas (hongos endoacutefitos) cambios en el

uso del suelo contaminacioacuten y sobreexplotacioacuten de recursos (IPCC 2020)

Considerando que el frailejoacuten Espeletia hartwegiana es una especie de alta montantildea

(paacuteramos) endeacutemica de la cordillera Central de los Andes (Schultz y Carl 1856) se encuentra

dentro de los ecosistemas andinos en donde a su vez se ha comprobado la existencia de los

hongos endoacutefitos es de tener en cuenta el papel de estos organismos endoacutefitos ya que los

paacuteramos son ecosistemas particularmente sensibles a los efectos adversos del cambio climaacutetico

en especial al calentamiento global al estar ubicados en los troacutepicos generando asiacute ventanas de

40

oportunidades para que los hongos endoacutefitos alteren su estado mutualista y pasen a ser

patogeacutenicos (Colwell et al 2008 7)

No obstante existe consenso en que las temperaturas aumentaraacuten especiacuteficamente a

grandes alturas y que la precipitacioacuten posiblemente se incrementaraacute en algunas zonas disminuiraacute

en otras y se produciraacute en patrones estacionales alterados con mayor intensidad y frecuencia

(Marengo et al 2009)

Los frailejones se ven en constante estreacutes por el uso del suelo dado en los paacuteramos como

es el caso del paacuteramo Romerales un paacuteramo que se ha visto afectado por las quemas y la

ganaderiacutea (Molinillo y Monasterio 2001) Esto aumenta asiacute las condiciones de estreacutes intriacutensecas a

las que estaacuten expuestas estas plantas de paacuteramo las cuales suministran valiosos bienes y servicios

ecosisteacutemicos como el abastecimiento continuo de agua para usos domeacutesticos agriacutecolas e

industriales (Buytaert et al 2006 4) servicios que se podriacutean ver en decrecimiento si las

ventanas de oportunidades se abren con maacutes frecuencia dando pie al cambio de estado de los

hongos endoacutefitos que existen dentro de los frailejones de la zona

En los paacuteramos de Chingaza Rabanal Guerrero Iguaque Merchaacuten y Sumapaz se han

realizado estudios de aislamientos de hongos en especies de frailejoacuten diferentes a la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana tales como Espeletia argentea Espeletia arbelaezii Espeletia

boyacensis Espeletia grandiflora Espeletia miradorensis y Espeletia uribei por ende se ha

reportado la presencia de hongos endoacutefitos y fitopatoacutegenos (Tabla 2) (Gaitan 2018 17)

Frailejones Espeletia

argentea

Espeletia

arbelaezii

Espeletia

boyacensis

Espeletia

grandiflora

Espeletia

miradorensis

Espeletia

uribei

Aspergillus X X X X

Annulohypoxylon X X X

Curvularia X X X

Epicoccum X X X

Fusarium X X X

41

Tabla 2 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = a presencia del genero de

hongo dentro de la especie de frailejoacuten

Los geacuteneros de hongos en rojo son los geacuteneros que se encontraron en comuacuten con los

geacuteneros hallados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana de un total de 15 geacuteneros 3

han sido reportados anteriormente en estudios similares ( 20 de geacuteneros identificados)

Dentro de un marco de cambio climaacutetico es importante la metodologiacutea de muestreo

como lo fue el formato de muestreo en puntos aleatorios realizado en el presente estudio se llevoacute

acabo principalmente por la homogeneidad de los frailejones en el paacuteramo como lo indica el

manual de meacutetodos baacutesicos de muestreo y anaacutelisis de ecologiacutea vegetal (BOLFOR 2000 9) donde

se menciona que el muestreo aleatorio se utiliza cuando se dispone de poca informacioacuten previa de

las caracteriacutesticas de las poblaciones a medirse en este caso la poblacioacuten a identificarse fueron

los hongos endoacutefitos que se hallaban dentro de las formaciones homogeacuteneas de los frailejones

No obstante el muestreo aleatorio tambieacuten presenta limitaciones a la hora de comparar los

hongos endoacutefitos a lo largo del gradiente altitudinal (muestreo aleatorio estratificado) dejando de

percibir informacioacuten proveniente de los distintos microclimas que se encuentran y de las

incidencias que podriacutean causar a la hora de identificar los geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten ademaacutes de posibles micro efectos del cambio climaacutetico a lo

largo del gradiente altitudinal (Caacutemara et al 2008)

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio Climaacutetico

Nigrospora X X X X X

Penicillium X X X

Pleospora X X X X

Trichoderma X X X X

42

Las teacutecnicas empleadas en este estudio para lograr aislar e identificar los hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana se hacen importantes dentro del cambio

climaacutetico debido a que el margen de error en la identificacioacuten molecular es reducido (Bakermans

et al 2014) Al ser reducido el margen de error se pudo conocer con mayor certeza que especies

y geacuteneros de hongos endoacutefitos se encuentra dentro de la planta

Al conocer sus identidades es posible conocer las capacidades que tienen cada una de

estas especies de hongos endoacutefitos de producir metabolitos secundarios de infiltrarse y proteger

los tejidos de la planta de condiciones bioacuteticas y abioacuteticas competir contra herbiacutevoros y

fitopatoacutegenos (Schulz et al 2002) Con sus capacidades reconocidas es posible vincular los

efectos del cambio climaacutetico como estreacutes hiacutedrico aumento de la temperatura migraciones

tempranas enfermedades emergentes aumentos de la precipitacioacuten y heladas severas con las

reacciones por parte de los hongos endoacutefitos Estas reacciones podriacutean desencadenar aumentos de

la patogenicidad en las poblaciones de frailejones debido a los constantes disturbios y estreacutes al

que se ve sometido la planta generando asiacute notables declives poblacionales (Mendoza 2010)

Las relaciones filogeneacuteticas entre las especies halladas toman relevancia debido a las

sinergias positivas o negativas que se pueden presentar dependiendo de las especies que se

encuentren asociadas dentro de la planta (Lamichhane y Venturi 2015) como por ejemplo

Nigrospora y Colletotrichum pueden activar una sinergia negativa aumentando la virulencia y

afectando la especie Espeletia hartwegiana

Las especies de hongos endoacutefitos se identificaron por medio de secuencias obtenidas de

las regiones ITS (regioacuten de espaciadores internos transcritos) las cuales son regiones altamente

conservadas con tasas de evolucioacuten muy lentas en el tiempo permitiendo hacer inferencias

filogeneacuteticas (Baldwin et al 1995 Hamby y Zimmer 1992) es por ello que se usaron para

generar las diferentes identificaciones de los hongos endoacutefitos logrando asiacute identificar al geacutenero

Nigrospora con un total de 7 especies N sacchari N rubi N sphaerica N hainanensis N

gorlenkoana N oryzae y N aurantiaca pertenecientes a la familia Apiosporaceae orden

Xylariales Divisioacuten Ascomicota (veacutease figura 11) (Wang et al 2017)

Dentro del marco del cambio climaacutetico Nigrospora se caracteriza por poseer una

distribucioacuten cosmopolita y una amplia gama de hueacutespedes como lo es en este caso la especie E

hartwegiana que habita en los Andes Tropicales que se veraacuten alterados por los efectos del

cambio climaacutetico este geacutenero se ha logrado aislar en su forma endoacutefita en tallos y hojas de

43

diversas plantas tambieacuten como saprofitos en detritos hojarasca y larvas muertas (Uzor et al

2015 1)

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

Los hongos endoacutefitos hallados en esta investigacioacuten se encontraron dentro de la especie

de frailejoacuten E hartwegiana la cual pertenece a los Andes Tropicales ubicados maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos Estos ecosistemas son sensibles a los efectos del cambio

climaacutetico por su altura su alto endemismo y su sensibilidad al efecto de borde Cuando las

especies lentildeosas empiecen a migrar a lo largo del gradiente altitudinal es posible que los

frailejones se encuentren con suelos agrestes en donde sus semillas no podraacuten fijarse y los efectos

adversos de hongos como Nigrospora N oryzae y N sphaerica seraacuten maacutes notables

aprovechando las ventanas de oportunidad que generen los desbalances climaacuteticos (Sharma et al

2013)

Los cambios en los patrones climaacuteticos potenciaran la especie N sphaerica dentro del

frailejoacuten la cual tiene la capacidad de causar tizoacuten foliar en la especie Camellia sinensis siendo

una planta de teacute perteneciente a la divisioacuten de las magnolifiotas como el geacutenero Espeletia (Liu et

al 2015) Nigrospora fue el geacutenero maacutes ampliamente aislado en las identificaciones generadas a

partir de las hojas de frailejoacuten esto se veriacutea explicado debido a que N sphaerica tiene un

mecanismo de descarga de esporas efectivo que puede proyectar a la fuerza sus esporas a una

distancia de hasta 2 cm en vertical y 68 cm en horizontal como lo demostroacute Webster (1952)

ademaacutes el estudio de Wu y colaboradores (2004) tambieacuten evidencioacute que las esporas de

44

Nigrospora son uno de los grupos maacutes dominantes en la atmoacutesfera y estaacuten asociadas con

tormentas de polvo

La gran capacidad colonizadora del geacutenero Nigrospora le permite adaptarse a las

condiciones climaacuteticas cambiantes con la estrategia de dispersioacuten de sus esporas logrando

distanciarse del frailejoacuten hospedero para encontrar nuevos hospederos producto de las

migraciones tempranas a lo largo del gradiente altitudinal (Riveros 2010)

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

por encima del 80 lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen menos

mutaciones en los nodos internos del aacuterbol basados en la distribucioacuten de probabilidad asignadas

a los posibles arboles resultantes dando lugar a una hipoacutetesis evolutiva maacutes confiable (Schmidt y

Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 es decir el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes

corto (menos cambios) y el cual se ajusta mejor a los datos (Swofford 1997)

Teniendo asiacute una inferencia filogeneacuteticamente robusta los geacuteneros Collectotrichum y

Nigrospora pertenecen a la Divisioacuten Ascomycota ambos geacuteneros son particularmente agresivos

con las plantas en especial la especie Colletotrichum gloeosporioides la cual es la fase asexual

de Glomerella cingulata (Raj et al 2013) Se caracteriza por tener un amplio rango de

hospederos entre ellos el frailejoacuten a los cuales les causa una enfermedad conocida pudricioacuten

amarga antracnosis o chancros siendo esta la necrosis de frutos flores nervios y tallos

(Gonzaacutelez et al 2006 4)

Uno de los primeros reportes de afectaciones a especies de frailejoacuten se obtuvo en el 2009

en el Parque Natural Nacional Chingaza Colombia en donde encontraron las especies de

frailejoacuten Espeletia grandiflora y Espeletia uribei afectadas debido a insectos y una especie de

hongo del genero Colletotrichum (Medina 2009- 9 Hartung y Burton 1981)

Por ende que estos dos geacuteneros de hongos se encuentren juntos podriacutea tener

implicaciones en el aumento de virulencia potenciado a su vez por los desbalances abioacuteticos

causados por el cambio climaacutetico como lo han mencionado Belisario y colaboradores (2002) es

posible que las afectaciones no sean producidas por un uacutenico hongo si no por un complejo de

varios generando sinergismos entre diferentes especies que solas no hariacutean dantildeo a la planta pero

juntas podriacutean ser causantes de enfermedad (Lamichhane y Venturi 2015 4) aun mas en un

45

marco de cambio climaacutetico que gradualmente aumenta sus efectos nocivos sobre los paacuteramos

aumentando la temperatura cambios en la precipitacioacuten heladas intensas cambios en la

nubosidad mayor exposicioacuten a la radiacioacuten solar teniendo por resultado un iacutendice de estreacutes

mayor en las plantas de paacuteramo generando ventanas de oportunidades para que los hongos

endoacutefitos modifiquen sus roles de protector a patoacutegeno

En frailejones tambieacuten se ha reportado la presencia de Nigrospora y Trichoderma por

Bonilla y Argenis (2005) maacutes especiacuteficamente en la especie Espeletia grandiflora la cual es una

especie que habita en los paacuteramos de Colombia Ecuador y Venezuela en conjunto con Espeletia

hartwegiana (Luteyn 1999 3) El hecho que existan estos dos geacuteneros presentes en los frailejones

advierte de un equilibrio entre hongos endoacutefitos que se puede romper bajo las tensiones del

cambiante clima maacutes aun en los sensibles paacuteramos alto andinos

En cuanto a N sacchari se tiene reporte que es un productor de metabolitos con una

notable actividad herbicida demostrado en plantas cultivadas en invernadero (Fukushima et al

1998 2) debido a que existe evidencia que sugiere que los hongos endoacutefitos han evolucionado

directamente de hongos patoacutegenos (Schulz et al 1999 4) sumado al estreacutes del cambio climaacutetico

en cualquier momento de extrema tensioacuten hiacutedrica caloacuterica o heladas en estos ecosistemas de alta

montantildea Estos anomaliacuteas ambientales podriacutea disparar mecanismos de accioacuten fitopatoacutegenos

dentro de los frailejones generando un declive notable en sus poblaciones y por ende un declive

de la cantidad recurso hiacutedrico aguas abajo y su regulacioacuten (Diacuteaz et al 2002 5)

Como se mencionoacute anteriormente los medios de propagacioacuten de estos hongos endoacutefitos

pueden ser por medio de esporas que estaacuten en el ambiente aunque tambieacuten los vectores que

juegan un rol clave en su dispersioacuten son los insectos ya que estos pueden transportar esporas o

partes del hongo en su cuerpo patas o aparato bucal (Eigenbrode et al 2018 5)

Considerando la dispersioacuten homogeacutenea de los frailejones dentro del paacuteramo la carga

esporas en el ambiente y la herbivoriacutea de insectos es probable que se puedan ver infectados la

mayoriacutea de individuos (Varela 2016) es por ello que en el futuro puede que las afectaciones en

frailejones no sean producidas por hongos fitopatoacutegenos si no por hongos endoacutefitos que tuvieron

la ventana de oportunidad gracias al cambio climaacutetico aumento de la temperatura aumento en

las concentraciones de CO2 y alteraciones de precipitacioacuten que pueden hacer susceptible la planta

al ataque de estos hongos (Chakraborty 2011 Elad y Pertot 2014)

46

Para que se genere la enfermedad esta depende de la interaccioacuten de tres o cuatro factores

1) hospedero susceptible 2) agente causal (virulento) 3) condiciones ambientales favorables y 4)

tiempo (Francl 2001 2) la falta de alguno de ellos no permite que el patoacutegeno produzca la

enfermedad en la planta debido a ello algunas especies de frailejoacuten pueden tener una o dos cepas

que puedan actuar como fitopatoacutegenos pero no estaacuten activas si no estaacute completa su asociacioacuten

con otro patoacutegeno u otro factor

Ademaacutes existe un estudio que evaluoacute el efecto de la temperatura sobre la capacidad de

Fusarium verticillioides para generar infeccioacuten en plantas de maiacutez se probaron bajo 3 escenarios

de temperatura como resultados obtuvieron que la enfermedad de este hongo se veiacutea potenciada

por el aumento de temperatura en temperaturas por encima de 35degC (Murillo et al 2008) este

estudio da soporte a la hipoacutetesis de que existen factores que influyen significativamente a la

infeccioacuten en la planta tal vez el paacuteramo difiacutecilmente alcance 35degC no obstante la mayoriacutea de

especies son sensibles a cambios de temperatura de hasta de 1degC en donde modifican su

comportamiento rutas metaboacutelicas interacciones ecoloacutegicas y por ende sus defensas se ven

alteradas

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e Hypocrea

El geacutenero Trichoderma con seis especies diferentes (veacutease figura 12) fue el segundo

geacutenero maacutes numeroso despueacutes de Nigrospora que contoacute con siete especies aunque las primeras

especies que se analizaron fueron especies que principalmente actuaban generando enfermedades

en las plantas en las que se encontraban ante disturbios el geacutenero Trichoderma pertenece a la

47

familia Hypocreaceae y se caracteriza por tener una gran capacidad biocontroladora sobre

fitopatoacutegenos como Fusarium oxysporum los cuales podriacutean llegar masivamente con las

migraciones tempranas de insectos y plantas lentildeosas (Miles et al 2012 7)

No solo actuacutean repeliendo patoacutegenos internos si no tambieacuten patoacutegenos externos como

insectos que desean consumir u aprovechar la planta ya que estos pueden secretar diferentes

metabolitos secundarios y enzimas que actuacutean inhibiendo su desarrollo (Boughalleb-M et al

2018 8)

Es bien conocido que el geacutenero Trichoderma produce amplio rango de sustancias

antibioacuteticas ademaacutes de poseer la caracteriacutestica de parasitar otros hongos (Howell 2002 6)

Debido a la competencia que generan las especies del genero Trichoderma por espacio y

nutrientes inhiben o degradan pectinasas y otras enzimas que son esenciales para que los hongos

fitopatoacutegenos como Botrytis cinerea penetre en la superficie de las hojas logrando proteger de

esta forma al frailejoacuten que se veraacute expuesto a nuevas amenazas microbioloacutegicas auspiciadas por

los cambios en los patrones climaacutetico (Zimand et al 1996)

Ademaacutes de la capacidad del Trichoderma sp para atacar o inhibir el crecimiento de

patoacutegenos de plantas directamente descubrimientos recientes indican que tambieacuten pueden inducir

resistencia sisteacutemica y localizada a una variedad de patoacutegenos de plantas tales como el frijol es

protegido por Trichoderma harzianum de especies fitopatoacutegenas como Colletotrichum

lindemuthianum Botrytis cineacuterea las cuales producen lesiones en las hojas de la planta (Harman

y Howell 2004) Incluso se descubrioacute que ciertas especies de Trichoderma tienen una influencia

sustancial en el buen crecimiento y desarrollo de las plantas sin y con condiciones de estreacutes

climaacutetico (Lorito 1998)

Como lo demostraron Bonilla y Argenis (2005) en su estudio llevado a cabo en el

frailejoacuten Espeletia grandiflora diferentes cepas pertenecientes a Trichoderma pueden proteger

esta especie de paacuteramo de organismos fitopatoacutegenos emergentes por el cambio climaacutetico por

ende si puede proteger a E grandiflora tambieacuten puede proteger la especie E hartwegiana lo

que le permitiraacute sobrellevar diferentes ataques fortuitos de patoacutegenos e insectos que nunca han

logrado alcanzar las altitudes de paacuteramo (3200 - 5000 m)

Cuando el cambio climaacutetico aumente la temperatura en 1degC o 2degC traeraacute consigo sus

efectos de modificacioacuten en cuanto a la estructura y composicioacuten de las especies de plantas que

48

existen en zonas altas para este escenario basado en los caacutelculos de Thuiller (2007) las especies

se habriacutean desplazado en el gradiente altitudinal aproximadamente 450 metros para el antildeo 2070

Las consecuencias de este desplazamiento serian uacutenicas debido a que gran cantidad de

insectos y patoacutegenos tendriacutean migraciones tempranas en el gradiente altitudinal en buacutesqueda de

su optimo teacutermico llevando a cabo un proceso conocido como Termofilizacioacuten (Cuesta et al

2019) es ahiacute donde entra en juego la proteccioacuten que le pueden brindar especies endoacutefitos como

las que pertenecen al geacutenero Trichoderma en el marco de cambio climaacutetico

En concordancia con las cepas de Trichoderma y el geacutenero Hypocrea que tambieacuten

pertenece a la familia Hypocreaceae se conocen maacutes de 700 secuencias de peptaiboles (peacuteptidos

bioloacutegicamente activos) de ambos geacuteneros donde algunos de eacutestos son ecoloacutegica y

comercialmente relevantes debido a su potencial antimicrobiano actividad enzimaacutetica uacutetil para

competir por espacio y alimento de los nuevos patoacutegenos emergentes procedentes de las

alteraciones climaacuteticas y las migraciones tempranas (Degenkolb et al 2008 6)

En cuanto al geacutenero Hypocrea tambieacuten se ha reportado actividad antimicrobiana y anti

fuacutengica contra Staphylococcus aureus y Fusarium oxysporum (Gogoi et al 2008 2) habitando

los geacuteneros Trichoderma e Hypocrea dentro de especies de frailejoacuten como E hartwegiana se

espera que puedan generar sinergias de proteccioacuten que las ayude a combatir los fuertes y

extremos eventos climaacuteticos

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

del 100 (veacutease figura 13) lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen

menos mutaciones en los nodos internos del aacuterbol por ende este aacuterbol contiene la menor

cantidad de mutaciones o cambios dentro sus nodos internos teniendo como resultado una

hipoacutetesis evolutiva confiable (Schmidt y Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 que

indica que el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes corto (menos cambios) y el cual se ajusta

mejor a los datos (Swofford 1997)

49

El geacutenero Annulohypoxylon es de importancia dentro del marco del cambio climaacutetico ya

que pertenece a la familia Xylariaceae y se caracteriza por poseer metabolitos secundarios

antitumorales-citotoacutexicos como la anuloescuamulina que ayudan a combatir el estreacutes abioacutetico

(Cheng et al 2012) estas cepas de hongos son principalmente saprofitos y oportunistas han sido

reportadas en hojas sanas y afectadas de frailejones en otros estudios (Gonzaacutelez 2012 Nonsoque

2012) siendo un geacutenero resiliente a las perturbaciones ambientales como los cambios en los

patrones climaacuteticos su relacioacuten como mutualista dentro del frailejoacuten se mantendraacute hasta que el

frailejoacuten se adapte o colapse ante el estreacutes abioacutetico

Aunque no se conocen como fitopatoacutegenos al contrario pueden actuar como mutualistas

no se descarta que puedan estar involucrados en el desarrollo de diferentes enfermedades en

plantas cuando las condiciones ecosistemicas se alteran a puntos extremos (Gonzalez et al 2017)

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon Biscogniauxia

Nemania y Humiacutecola

El geacutenero Daldinia posee unos valores de MPML correspondientes a 10094 con lo cual

se encuentra bien soportado estadiacutesticamente el geacutenero Daldinia se encuentra ubicado en la

familia Xylariaceae al igual que el geacutenero Hypoxylon Biscogniauxia y Nemania que en su

respectivo orden contienen un soporte estadiacutestico MPML de 10082 10099 y 100100 (veacutease

figura 14) los cuales pertenecen a la divisioacuten Ascomycota las cepas de Daldinia se caracterizan

principalmente por ser especies endoacutefitas teniendo la capacidad de estar dentro de su hueacutesped

mucho tiempo sin causarle dantildeo o al menos un dantildeo evidente por medio de su estado asexual

50

No obstante su estado se puede modificar cuando las condiciones externas se modifican

abruptamente en poco tiempo como es el caso de las alteraciones en la temperatura

precipitacioacuten y concentraciones de dioacutexido de carbono (CO2) auspiciados por el cambio

climaacutetico (Saacutenchez et al 2013)

Un estudio realizado por Prieto (2017) en la especie de frailejoacuten E grandiflora encontroacute

que la especie Daldinia eschscholtzii estaba asociado en el siacutentoma de clorosis (falta de clorofila

en las hojas) Tambieacuten se reportoacute que especies de Daldinia como Daldinia conceacutentrica tienen la

capacidad de controlar nematodos fitopatoacutegenos (Silva et al 2020 104) los cuales pueden invadir

y romper los tejidos de la planta dantildeando sus estructuras los nematodos tambieacuten seraacuten sujetos a

migraciones tempranas por el cambio climaacutetico que trae consigo presiones de seleccioacuten por ende

nuevas amenazas para los frailejones (Nakashima et al 2007)

Como hemos visto hasta este punto las especies de hongos endoacutefitos se muestran en

muchos casos como benefactores y protectores de las diferentes plantas en las que habitan

incluyendo diferentes especies de frailejones

Los hongos endoacutefitos protegen tanto de factores bioacuteticos como virus hongos

fitopatoacutegenos bacterias insectos y factores abioacuteticos como las intemperancias del clima no

obstante en su relacioacuten endoacutefita geacuteneros como Hypoxylon que pertenece igual que Daldinia a la

familia Xylariaceae pueden tener roles amenazadores en conjunto con el cambio climaacutetico

seguacuten Gonzales y colaboradores (2019) inocularon cepas pertenecientes al geacutenero Hypoxylon en

hojas de Theobroma cacao y encontraron que en 48 horas se comenzoacute a notar las marcas de

clorosis y deshidratacioacuten foliar esto demuestra que cepas de este geacutenero pueden tener efectos

fitopatoacutegenos ocasionando muerte descendente pudricioacuten del tronco negro y resinosis de ramas

de mezquite (De la Torre-Almaraacutez et al 2003 De la Torre-Almaraacutez et al 2009)

La presencia de este geacutenero dentro del frailejoacuten en un marco del cambio climaacutetico lo

convierte en una amenaza latente ya que las condiciones seraacuten cada vez maacutes agrestes en los

paacuteramos de los Andes Tropicales Puede favorecer el desarrollo de este geacutenero que tiene las

enzimas necesarias para producir la pudricioacuten del tronco negro entre otras enfermedades

relevantes

51

Tambieacuten las especies del geacutenero Hypoxylon se han reportado como endoacutefitos en tejidos de

plantas lentildeosas o herbaacuteceas (Petrini y Petrini 1985 3) asiacute como saprofitos o fitopatoacutegenos

deacutebiles en madera de aacuterboles de zonas templadas o tropicales (Miller 1961) como lo menciona

Miller (1961)

Los geacuteneros Biscogniauxia Nemania tambieacuten estaacuten dentro de la familia Xylariaceae y

Divisioacuten Ascomycota un aspecto interesante de las especies de Biscogniauxia es que son

paraacutesitos exclusivos de las angiospermas dicotiledoacuteneas en donde concluyeron que todas las

especies pertenecientes a este geacutenero son patoacutegenos umllevesuml que se aprovechan de situaciones de

sequiacutea y estreacutes hiacutedrico para aumentar su patogenicidad (Ju et al 1998)

La especie de frailejoacuten E hartwegiana es una Dicotiledoacutenea eso explica porque

podemos encontrar esta especie de hongo endoacutefito en el frailejoacuten del presente estudio siendo de

vital importancia denotar que las especies de Biscogniauxia se aprovechan especialmente de las

situacioacuten de sequiacutea y estreacutes hiacutedrico difiacutecilmente las especies de este geacutenero podriacutean afectar a los

frailejones debido a que se caracterizan por ser reguladores de los ciclos hiacutedricos el agua es el

recurso que maacutes tiende a existir en un paacuteramo por la estructura de sus suelos compuesta por

andosoles porosos y necromasa acumulada teniendo asiacute un alto iacutendice de retencioacuten hiacutedrica

(Hernandez y Muntildeoz 2015) de modo que el cambio climaacutetico no favorece al geacutenero

Biscogniauxia en su estado patogeacutenico dentro del ecosistema de paacuteramo

En cuanto al geacutenero Nemania Da Silva y colaboradores (2018) llevaron a cabo una

investigacioacuten en la cual identificaron cepas pertenecientes a los geacuteneros Colletotrichum

Phyllosticta Xylaria Nemania y Alternaria en la especie ornamental Pachystachys lutea en

donde las mismas cepas fueron ensayadas para inhibir el crecimiento de hongos fitopatoacutegenos

como Colletotrichum sp en donde encontraron que Nemania era capaz de inhibir por medio de la

secrecioacuten de distintas enzimas el crecimiento de dichas especies gracias a su actividad

enzimaacutetica el geacutenero Nemania puede compensar los desequilibrios causados por el cambio

climaacutetico en teacuterminos de hongos fitopatoacutegenos

Hay que tener en cuenta que los elementos que dan forma a las interacciones planta-

endoacutefito incluyen el modo de transmisioacuten el patroacuten de infeccioacuten la edad de la planta las

condiciones ambientales potenciadas por el cambio climaacutetico y los antecedentes geneacuteticos (Aly et

al 2011 6) Los frailejones de la especie E hartwegiana que se muestrearon para el estudio se

52

tomoacute las hojas sanas lo que indica que poseiacutean estas cepas de endoacutefitos en equilibrio siendo este

uno de los pocos reportes de este geacutenero en especies de alta montantildea en los Andes Tropicales

El geacutenero Humiacutecola se encuentra soportado por un MPML de 10076 siendo una

hipoacutetesis evolutiva considerable es el uacutenico de la figura 14 que no estaacute dentro de la familia

Xylariaceae ya que pertenece a la familia Chaetomiaceae aunque se halla en la divisioacuten

Ascomycota se podriacutea considerar a la especie Humiacutecola fuscoatra como una de las especies de

endoacutefitos maacutes umlinofensivasuml debido a trabajos de investigacioacuten reportados como el de Menzies y

colaboradores (1998) y el de Naik y colaboradores (2009)

Humiacutecola fuscoatra no se considera un peligro latente para la especie E hartwegiana ya

que existe en equilibrio con su entorno Estaacute comprobado por medio de caracterizaciones

quiacutemicas que Humiacutecola fuscoatra es un importante productor de moleacuteculas de estimacioacuten

medica como el resorciacuteclico y lactonas aacutecidas (Mejia et al 2014) Por lo tanto es una especie

prometedora con un reservorio de metabolitos secundarios de importancia medicinal e industrial

que de seguir los efectos nocivos del cambio climaacutetico en los Andes Tropicales maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos esta especie podriacutea desaparecer

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies Massarina

Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

Uno de los grupos mejores soportados en este cladograma es el grupo de Diaporthe en el

cual se encontraron cuatro especies siendo uno con maacutes abundancia de especies del estudio y que

posee un MPML de 10085 10089 y 10095 acorde a sus 3 nodos (veacutease figura 15) teniendo asiacute

una hipoacutetesis evolutiva confiable de estas relaciones las especies de Diaporthe pertenecen a la

familia Diaporthaceae de la divisioacuten Ascomycota y son especies de endoacutefitos que se distinguen

por inhibir el crecimiento de hongos patoacutegenos en el hospedero que se encuentren El estudio de

53

Da Silva y colaboradores (2018) mostroacute que cepas de Diaporthe sp Inhibieron el crecimiento de

Fusarium oxysporum y Colletotrichum sp hongos fitopatoacutegenos que aumentaran su presencia

aprovechando las alteraciones producidas por el cambio climaacutetico en los paacuteramos

Las especies de este geacutenero estaacuten en continuo cambio entre endoacutefitos y patoacutegenos

funcionando en la mayoriacutea de los casos en una relacioacuten mutualista en donde le brindan a la planta

mayor tolerancia a las sequias proteccioacuten de patoacutegenos y pestes caracteriacutestica uacutetil frente a los

retos ecoloacutegicos que plantea el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales (Hubbard et al 2014)

se conocen cerca de 800 especies de este geacutenero asociadas a una amplia gama de plantas

vasculares a nivel mundial (Rossman et al 2015)

Esto explica porque las especies de Diaporthe fueron una de las maacutes numerosas

encontradas en la especie de alta montantildea E hartwegiana teniendo en cuenta que esta especie

pasa raacutepidamente de un estado endoacutefito a un estado patogeacutenico y dada su faacutecil y alta distribucioacuten

representa un peligro en conjunto con el cambio climaacutetico para las especies de alta montantildea como

los frailejones y supone una amenaza para el balance hiacutedrico y ecosistemico en el futuro

El geacutenero Crassiparies de la familia Neohendersoniaceae y el geacutenero Massarina de la

familia Massarinaceae pertenecen al orden Pleosporales aunque se discute debido a las

similaridades morfoloacutegicas y genoacutemicas con Massarina si Crassiparies deberiacutea estar en la

familia Massarinaceae (Hyde et al 2013 4) Se tiene poca informacioacuten sobre la especie

Crassiparies quadrisporus por ende este puede ser uno de los primeros reportes de esta especie

en una especie de alta montantildea como lo es el frailejoacuten especiacuteficamente en la especie E

hartwegiana en un marco de cambio climaacutetico el geacutenero Crassiparies necesita mayores estudios

a nivel ecoloacutegico y microbioloacutegico para entender su papel dentro de esta crisis climaacutetica

Mientras tanto el geacutenero Massarina ha logrado ser aislado de agua dulce con el fin de

obtener fuentes de productos naturales bioloacutegicamente activos por medio de las investigaciones

quiacutemicas de Shearer (1999 2001) en una especie de Massarina obtuvieron como resultado el

aislamiento de tres nuevos sequiterpenoides y dos lactonas derivadas de policeacutetidos con nuevos

sistemas de anillos lo que indica que esta especie tambieacuten puede tener un rol importante

mediante la produccioacuten de enzimas y metabolitos secundarios en el marco de las invasiones

bioloacutegicas impulsadas por el cambio climaacutetico

54

El geacutenero Cryptocoryneum de la familia Cryptocoryneaceae existe poca informacioacuten de

sus mecanismos de accioacuten como endoacutefito o patoacutegeno maacutes aun en especies de los Andes

Tropicales este podriacutea ser uno de los primeros reportes sobre esta especie de hongo en una

especie de frailejoacuten especiacuteficamente E hartwegiana en el 2015 se reportoacute en Brasil el

descubrimiento de una nueva especie del genero Cryptocoryneum trataacutendose de Cryptocoryneum

parvulum hallada en las hojas de la especie Araucaria angustifolia (Gimnosperma) (Silva et al

2015 1) la informacioacuten sobre el geacutenero Cryptocoryneum en relacioacuten al cambio climaacutetico y sus

efectos dentro de especies de alta montantildea como el frailejoacuten auacuten son poco conocidas

Uno de los geacuteneros maacutes cercanos a los grupos externos del cladograma es Cyphellophora

perteneciente a la familia Cyphellophoraceae el cual posee un MPML de 10091 logrando una

hipoacutetesis evolutiva confiable Diversas especies de Cyphellophora han logrado ser aisladas de

infecciones superficiales de la piel o las untildeas en humanos y de materiales vegetales (Decock et

al 2003 Cheewangkoon et al 2009) Esto indica su amplia distribucioacuten y su capacidad para ser

patogeacutenica tanto en plantas como en animales maacutes aun en condiciones desfavorables para la

planta como son las condiciones de cambio climaacutetico

De la especie Cyphellophora reptans se tiene reporte que su morfologiacutea es muy similar a

la de una levadura por lo que es faacutecilmente confundida con una (Reacuteblovaacute et al 2013) Es posible

que este sea el uacutenico reporte de Cyphellophora reptans en las hojas de un frailejoacuten o especie de

alta montantildea que habite en los troacutepicos como E hartwegiana debido a ello sus mecanismos de

accioacuten en especies de paramo dentro de un marco de cambio climaacutetico es poco conocido Se

necesitan mayores estudios enfocados en esta especie para entender su ecologiacutea y dinamismo

ecoloacutegico respecto a los cambios en las variables ambientales

Se eligieron las especies Coprinellus domesticus y Coprinellus xanthothrix como grupos

externos con el fin de enraizar el aacuterbol debido a que pertenecen a la Divisioacuten Basidiomycota la

cual difiere en grado de la divisioacuten Ascomycota aunque conserva semejanzas conocidos como

caracteres ancestrales o plesiomorficos que avanzan a medida la filogenia se construye con los

datos de las diferentes secuencias de especies evidenciando novedades evolutivas conocidas

como apomorfias que cuando se dan en un grupo en particular pasan a ser sinapomorfias es decir

novedades evolutivas dentro de un grupo particular (Lehtonen 2020) Se optoacute por enraizar con

55

estas dos especies con el objetivo de dar robustez al aacuterbol filogeneacutetico (Barriel y 1998) lo cual se

consiguioacute como se nota en los estadiacutesticos del aacuterbol filogeneacutetico

56

57

Conclusiones

Se rechaza la hipoacutetesis nula (H0) y se concluye que la identificacioacuten y caracterizacioacuten

molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo Colombia es diferente en 80 de sus geacuteneros y

especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos realizadas en especies de frailejoacuten

Por lo tanto los nuevos geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos encontrados en el frailejoacuten

plantean nuevos desafiacuteos respecto al cambio climaacutetico ya que tienen un rol vital en la

supervivencia de estas especies de alta montantildea como los frailejones debido a su relacioacuten

mutualista o patoacutegena maacutes aun en los paacuteramos que son altamente sensibles a los efectos del

cambio climaacutetico incluso tan sensibles como las zonas polares (Bradley et al 2006)

La mayoriacutea de especies encontradas en el presente estudio tienen potencial para ayudar a

combatir el estreacutes abioacutetico producido por el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales

Especiacuteficamente pueden ayudar a combatir el estreacutes bioacutetico producido por virus hongos

bacterias e insectos en un marco de cambio climaacutetico aumentos de temperatura cambios en la

concentracioacuten de CO2 cambios en la precipitacioacuten migraciones tempranas cambios en la

nubosidad disponibilidad hiacutedrica alteraciones en la estructura y composicioacuten de las especies

endeacutemicas del paacuteramo

58

59

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Anexos

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombia

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia

hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

74

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

Coordenadas Geograacuteficas

(Latitud)

De la Colecta del

Material Bioloacutegico total de 15

muestras (Longitud)

LAT N 4deg 37 5871717 LONG W 75deg 25

3292611

LAT N 4deg 37 5885220 LONG W 75deg 25

3271217

LAT N 4deg 37 5884485 LONG W 75deg 25

3312103

LAT N 4deg 36 5995487 LONG W 75deg 27

3045854

LAT N 4deg 37 6195784 LONG W 75deg 30

3292611

LAT N 4deg 40 159171 LONG W 75deg 26

380142

LAT N 4deg 40 363762 LONG W 75deg 26

209072

LAT N 4deg 40 399832 LONG W 75deg 27

173554

LAT N 4deg 40 383965 LONG W 75deg 27

464325

LAT N 4deg 39 486438 LONG W 75deg 27

173559

LAT N 4deg 40 56894 LONG W 75deg 26

568287

LAT N 4deg 40 159174 LONG W 75deg 27

190654

LAT N 4deg 40 125083 LONG W 75deg 26

345912

LAT N 4deg 40 116691 LONG W 75deg 27

208264

LAT N 4deg 40 314698 LONG W 75deg 27

140791

75

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un estereoscopio con el propoacutesito de seleccionar la

maacutes indicada y luego sembrar un cultivo puro a partir de ese micelio

76

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados las

copias se conservaron con glicerol a -80degC en un ultra congelador de Thermo Scientifictrade

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas

y enviadas

77

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicos de forma segura y esteacuteril propiedad de la Universidad del Quindiacuteo

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a la Universidad Ruhr de Bochum (Alemania)

78

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de parsimonia

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X en donde se

observa en amarillo la secuencia umlTCATTAuml la cual es una secuencia altamente conservada

que se usa para marcar el inicio de la misma en hongos endoacutefitos

79

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa JmoldelTest usados para generar el

aacuterbol de relaciones filogeneacuteticas a partir de la regioacuten ITS de los hongos endoacutefitos aislados

total de modelos evaluados 88

ID Nombre Particioacuten lnL P AIC detaAIC Peso Cumpeso Udelta

1 JC 0 100820157 138 204400314 1341348 0 1 -

2 JC+I 0 98912511 139 200605022 9618188 0 1 -

3 JC+G 0 95470113 139 193720225 2733392 0 1 -

4 JC+I+G 0 95467507 140 193735014 274818 0 1 -

5 F81 0 100658095 141 204136189 13149356 0 1 -

6 F81+I 0 98761481 142 200362962 9376128 0 1 -

7 F81+G 0 95314814 142 193469628 2482794 0 1 -

8 F81+I+G 0 95324364 143 193508729 2521895 0 1 -

9 K80 10010 99734495 139 20224899 11262157 0 1 -

10 K80+I 10010 97835191 140 198470382 7483549 0 1 -

11 K80+G 10010 94227821 140 191255643 268809 0 1 -

12 K80+I+G 10010 94209963 141 191239926 253092 0 1 -

13 HKY 10010 99648091 142 202136181 11149348 0 1 -

14 HKY+I 10010 97761512 143 198383024 7396191 0 1 -

15 HKY+G 10010 94170799 143 191201599 214765 0 1 -

16 HKY+I+G 10010 94118678 144 191117357 130523 600E-04 0999 -

17 TrNef 10020 99564653 140 201929306 10942472 0 1 -

18 TrNef+I 10020 97712623 141 198245245 7258412 0 1 -

19 TrNef+G 10020 94150977 141 191121955 135121 400E-04 09994 -

20 TrNef+I+G 10020 94132131 142 191104263 117429 00011 09959 -

21 TrN 10020 99563809 143 201987618 11000784 0 1 -

22 TrN+I 10020 97702964 144 198285929 7299095 0 1 -

23 TrN+G 10020 94094235 144 191068469 81635 00065 09719 -

24 TrN+I+G 10020 94101378 145 191102757 115923 00012 09948 -

25 TPM1 12210 99713879 140 202227759 11240925 0 1 -

26 TPM1+I 12210 97826641 141 198473282 7486449 0 1 -

27 TPM1+G 12210 94249837 141 191319674 33284 0 1 -

28 TPM1+I+G 12210 942022 142 1912444 257566 0 1 -

29 TPM1uf 12210 99663473 143 202186945 11200112 0 1 -

30 TPM1uf+I 12210 97879458 144 198638917 7652083 0 1 -

31 TPM1uf+G 12210 94137349 144 191154699 167865 100E-04 09999 -

32 TPM1uf+I+G 12210 94141897 145 191183794 196961 0 1 -

80

33 TPM2 10212 99722544 140 202245087 11258254 0 1 -

34 TPM2+I 10212 97828213 141 198476426 7489592 0 1 -

35 TPM2+G 10212 94185859 141 191191718 204885 0 1 -

36 TPM2+I+G 10212 94153667 142 191147335 160501 100E-04 09998 -

37 TPM2uf 10212 99648091 143 202156182 11169348 0 1 -

38 TPM2uf+I 10212 97757018 144 198394035 7407202 0 1 -

39 TPM2uf+G 10212 941052 144 1910904 103566 00022 09904 -

40 TPM2uf+I+G 10212 9408801 145 19107602 89187 00044 0982 -

41 TPM3 12012 99768005 140 20233601 11349176 0 1 -

42 TPM3+I 12012 97958099 141 198736198 7749364 0 1 -

43 TPM3+G 12012 94227963 141 191275926 289093 0 1 -

44 TPM3+I+G 12012 94323885 142 191487769 500936 0 1 -

45 TPM3uf 12012 99625421 143 202110843 11124009 0 1 -

46 TPM3uf+I 12012 97770469 144 198420939 7434105 0 1 -

47 TPM3uf+G 12012 94165576 144 191211152 224319 0 1 -

48 TPM3uf+I+G 12012 94150861 145 191201721 214888 0 1 -

49 TIM1ef 12230 99592239 141 202004478 11017644 0 1 -

50 TIM1ef+I 12230 97822787 142 198485574 749874 0 1 -

51 TIM1ef+G 12230 94121043 142 191082087 95253 00033 09853 -

52 TIM1ef+I+G 12230 94122386 143 191104772 117939 00011 09969 -

53 TIM1 12230 99518653 144 201917306 10930473 0 1 -

54 TIM1+I 12230 9781156 145 19852312 7536286 0 1 -

55 TIM1+G 12230 94105198 145 191110396 123562 800E-04 09977 -

56 TIM1+I+G 12230 94087158 146 191094317 107483 00018 09922 -

57 TIM2ef 10232 99550617 141 201921233 109344 0 1 -

58 TIM2ef+I 10232 97704602 142 198249204 726237 0 1 -

59 TIM2ef+G 10232 94093484 142 191026968 40135 00516 0852 -

60 TIM2ef+I+G 10232 94073864 143 191007729 20895 0135 07169 -

61 TIM2 10232 99530022 144 201940044 1095321 0 1 -

62 TIM2+I 10232 97820158 145 198540315 7553482 0 1 -

63 TIM2+G 10232 94058678 145 191017356 30523 00834 08004 -

64 TIM2+I+G 10232 94060837 146 191041674 54841 00247 09248 -

65 TIM3ef 12032 99546286 141 201912572 10925739 0 1 -

66 TIM3ef+I 12032 97713931 142 198267862 7281028 0 1 -

67 TIM3ef+G 12032 94129376 142 191098753 111919 00014 09936 -

68 TIM3ef+I+G 12032 94112005 143 191084009 97176 0003 09883 -

69 TIM3 12032 99514376 144 201908751 10921918 0 1 -

70 TIM3+I 12032 97700023 145 198300047 7313213 0 1 -

71 TIM3+G 12032 94115323 145 191130646 143812 300E-04 09997 -

72 TIM3+I+G 12032 94096941 146 191113882 127048 700E-04 09984 -

73 TVMef 12314 9970418 142 20224836 11261526 0 1 -

74 TVMef+I 12314 97940598 143 198741196 7754363 0 1 -

81

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE (AIC)

75 TVMef+G 12314 94159829 143 191179657 192824 0 09999 -

76 TVMef+I+G 12314 94160993 144 191201987 215153 0 1 -

77 TVM 12314 99615991 145 202131982 11145148 0 1 -

78 TVM+I 12314 97746676 146 198413353 7426519 0 1 -

79 TVM+G 12314 94075503 146 191071005 84171 00057 09776 -

80 TVM+I+G 12314 94052588 147 191045176 58342 00208 09456 -

81 SYM 12345 99543166 143 201946331 10959498 0 1 -

82 SYM+I 12345 97757103 144 198394207 7407373 0 1 -

83 SYM+G 12345 94083056 144 191046112 59278 00198 09654 -

84 SYM+I+G 12345 94050035 145 19100007 13236 0198 05819 -

85 GTR 12345 99529525 146 20197905 10992217 0 1 -

86 GTR+I 12345 97686178 147 198312356 7325522 0 1 -

87 GTR+G 12345 94044194 147 191028387 41553 00481 09001 -

88 GTR+I+G 12345 94013417 148 190986834 0 03839 03839 -

7

Con amor para mis padres Fernando Ivaacuten Aristizabal y mi madre Mariacutea Ligia

Ortiz

A Norberto Aristizabal y Natalia Aristizabal por creer en miacute

A mi hijo Joseacute David Aristizabal por representar las nuevas generaciones

A mi tutor Jhon Alexander Osorio por tenerme paciencia en este proceso de

aprendizaje y compartirme sus conocimientos

A Tatiana Tapias por darme su amor y llevarme por el camino de la virtud

siempre centrado

A la maestriacutea en Cambio Climaacutetico Sustentabilidad y Desarrollo por siempre

estar disponibles para miacute

A la Universidad Andina Simoacuten Boliacutevar por apoyar mi tesis de investigacioacuten

A la Repuacuteblica del Ecuador por abrirme sus puertas y darme un mejor futuro

8

9

Agradecimientos

Estos agradecimientos van dedicados para Ecuador que me brindoacute la oportunidad

poder estudiar una maestriacutea a mi tutor por aceptarme y acompantildearme en este proceso a

mi familia por creer en miacute y en los sacrificios que hice para irme a vivir a otro paiacutes solo y

sin dinero para poder umlsalir adelanteuml como decimos en Colombia a mi compantildeera

sentimental por siempre guiarme hacia el camino correcto disciplina compromiso y

entrega a la universidad Andina Simoacuten Boliacutevar por aceptarme en sus aulas de clase y

por ultimo a la Universidad del Quindiacuteo por abrirle la puerta a uno de sus egresados y

acogerlo de buena forma con sus instalaciones de laboratorio

Gracias y mil gracias a todos de corazoacuten sin duda esta experiencia cambio mi

vida en todos los sentidos

Desde hoy hasta el final que podriacutea llamarse infinito

10

11

Tabla de contenidos

Figuras mapas y tablashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13

Introduccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 15

Capiacutetulo primero Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

1 Antecedenteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

2 Justificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 25

3 Hipoacutetesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 26

4 Objetivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

41 Objetivo generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

42 Objetivos especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

Capiacutetulo segundo Materiales Meacutetodos y Resultadoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

1 Aacuterea de Estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

2 Colecta de material bioloacutegicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos

endoacutefitos)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32

5 Extraccioacuten de ADNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

7 Secuenciamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

8 Anaacutelisis Filogeneacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

Capiacutetulo Tercero Discusioacuten sobre los hongos endoacutefitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidadhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio

Climaacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42

Conclusioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 57

Obras citadashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 59

Anexoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 73

12

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphellip 73

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia 73

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphelliphellip74

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana 75

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un

estereoscopio 75

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 76

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas y

enviadas 76

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 75

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a Alemania a la Universidad Ruhr de

Bochum 77

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de

parsimoniahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 78

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X 78

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa

JmoldelTest 79

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE

(AIC) 81

13

Figuras mapas y tablas

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo

Colombiahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras

N necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefitohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y

abioacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en

medio de cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelialhelliphelliphellip 30

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la

teacutecnica de corte de hifa uacutenica helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de

cultivo Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12)

aislados de las hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana 31-32

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 10 Filograma obtenido a partir del anaacutelisis ML y MP del conjunto de datos ITS Aislados

de las hojas de frailejoacuten37

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip43

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e

Hypocreahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip46

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon48

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon

Biscogniauxia Nemania y Humiacutecolahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

14

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies

Massarina Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona

muestreadahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia 29-30

Tabla 2 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos

endoacutefitos en la especie Espeletia hartwegiana

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36

Tabla 3 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = presencia del genero

de hongo dentro de la especie de frailejoacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42-43

15

Introduccioacuten

Hay un libro abierto siempre para

todos los ojos la naturaleza

(Jean-Jacques Rousseau 1712-1778)

El cambio climaacutetico corresponde a un fenoacutemeno que afecta el planeta de manera natural

permitiendo mantener las condiciones climaacuteticas como la temperatura la precipitacioacuten entre

otras en un rango aceptable para la vida (Jimeacutenez 2010) Sin embargo dado el aumento de las

emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) principalmente asociado a las actividades

humanas y el alto consumo de combustibles foacutesiles los cambios en dichas condiciones han sido

alterados dando paso a un acelerado aumento de temperatura anual en las uacuteltimas deacutecadas con

precipitaciones y sequias maacutes frecuentes e intensas (IPCC 2020 5 Jimeacutenez 2010)

Acorde con el Panel Intergubernamental de Expertos en Cambio Climaacutetico (IPCC) para

fin de siglo el Cambio Climaacutetico se acrecentaraacute pronosticando un aumento de temperatura de 25

a 45 degC para el antildeo 2100 que tan solo para Colombia en los uacuteltimos 30 antildeos fue de 08degC

generando impactos notorios en las zonas de alta montantildea como los paacuteramos (Moreno y Palma

2016)

El cambio climaacutetico es un fenoacutemeno cuyos efectos alcanzaraacuten los paacuteramos los cuales son

ecosistemas de alta montantildea presente en elevaciones entre 3100 y 4700 m ubicados en el norte de

los Andes de Ameacuterica del Sur y el sur de Ameacuterica Central adyacente (Berdugo et al 2016) Estas

aacutereas se caracterizan por una vegetacioacuten principalmente endeacutemica compuesta por frailejones

matorrales y pastos (veacutease figura 1) (Garciacutea et al 2010)

Los ecosistemas de alta montantildea como los paacuteramos ofrecen diversos servicios

ambientales como la biodiversidad uacutenica que albergan los paisajes los suelos y su capacidad de

retener y almacenar agua (Morales et al 2019) Las formaciones vegetales juegan un papel

diferenciado en el mantenimiento de la humedad y las fuentes de agua en el ecosistema

presentando la capacidad de interceptar almacenar y regular los flujos hiacutedricos superficiales y

16

subterraacuteneos aportando los servicios de abastecimiento de agua para el 70 de la poblacioacuten de

Colombia (Vaacutesquez y Buitrago 2017)

Ademaacutes dada la caracteriacutestica de permanente humedad de su suelo la materia orgaacutenica

se descompone a menor velocidad logrando un efecto de retencioacuten y almacenamiento de carbono

(Anderson et al 2012) En Colombia se han realizado diferentes estudios sobre la distribucioacuten y

extensioacuten del ecosistema paramuno Rangel (2002 4) determinoacute que los paacuteramos colombianos

abarcaban aproximadamente el 26 de la superficie del paiacutes

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramos por Pedraza-Pentildealosa Betancur y Franco-Rosselli (2005)

En particular el paacuteramo Romerales se encuentra dentro del territorio adscrito a los

Parques Nacionales Naturales (PNN) especiacuteficamente el PNN de los Nevados en la cordillera

central colombiana hacia la zona norte del Departamento del Quindiacuteo con liacutemites fronterizos

entre los departamentos de Risaralda y Tolima Este paacuteramo es el hogar del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana el cual estaacute afrontando los efectos del cambio climaacutetico (veacutease mapa 1)

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona muestreada

17

Existe evidencia cientiacutefica concreta del aumento de temperatura en los Andes Tropicales

tambieacuten cambios significativos en los patrones de precipitacioacuten sumado a la disminucioacuten en la

incidencia del clima nublado lo que conduce a las plantas a mayor cantidad de horas expuestas a

la radiacioacuten solar (Ruiz et al 2009) Otro efecto grave que trae consigo el cambio climaacutetico es el

desplazamiento de especies en el gradiente altitudinal Con un aumento de 3degC se espera que las

especies se muevan ~600 m en buacutesqueda de su optimo teacutermico esto afectariacutea gravemente las

especies de paacuteramo como los frailejones Cuesta Camacho (2007)

Los frailejones son emblemaacuteticas plantas de paacuteramo y ecosistemas de alta montantildea

(MINAMBIENTE 2019) Pertenecen a la familia Asteraceae contiene cerca de 142 especies

agrupadas en ocho geacuteneros Carramboa Coespeletia Espeletia Espeletiopsis Libanothamnus

Paramiflos Ruilopezia y Tamania de estos los maacutes importantes y con mayor diversidad de

especies son Espeletia Espeletiopsis y Libanothamnus (Rivera y Torres 2001)

Poseen adaptaciones que les permite captar y retener grandes cantidades de agua de su

entorno permitiendo un balance ecosistemico (Farias 2013) La morfologiacutea singular del genero

Espeletia le permite acumular las hojas antiguas en forma de ldquoabrigordquo brindando proteccioacuten

contra las bajas temperaturas nocturnas de hasta 0degC Los fuertes vientos y la radiacioacuten solar los

cuales seraacuten cada vez maacutes intensos y frecuentes por causa del cambio climaacutetico (Cortes y

Sarmiento 2013 34) (veacutease figura 2)

Estas plantas son especies claves para la conservacioacuten de los paacuteramos y la lucha contra el

cambio climaacutetico debido a que ofrecen una gran variedad de servicios ecosisteacutemicos (Diacuteaz et al

2007) El paacuteramo es referente sin igual de fuente hiacutedrica ciudades como Bogotaacute y Quito obtienen

aproximadamente el 80 de su agua dulce de los paacuteramos (Buytaert et al 2006) Los frailejones

en su mayoriacutea endeacutemicos se han visto afectados por actividades humanas como la ganaderiacutea

extensiva agricultura (cultivos de papa y cebolla) mineriacutea de oro y carboacuten turismo no

controlado y quemas intencionales (Hofstede 2000) Esta situacioacuten podriacutea comprometer a

mediano y largo plazo la funcioacuten de captacioacuten regulacioacuten y suministro del agua para el consumo

18

en las ciudades colombianas ubicadas en las regiones de influencia de estos ecosistemas (Varela

2015)

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

No obstante en asociacioacuten con especies como el frailejoacuten de los Andes Tropicales

encontramos a los hongos cuyos roles en las interacciones bioloacutegicas son de vital importancia

Los hongos pueden ser endoacutefitos simbiontes mutualistas paraacutesitos y comensales y son capaces

de responder a las amenazas que plantea el cambio climaacutetico en cuanto a perturbaciones

ambientales aumento de temperatura y estreacutes hiacutedrico adaptaacutendose a la disponibilidad de recursos

modificando sus actividades enzimaacuteticas e incluso su genoma a lo largo del tiempo (Moreno et

al 2013)

Los hongos son clasificados seguacuten su forma de reproduccioacuten sea sexual o asexual en

donde se observan las diferencias estructurales internas entre los diferentes grupos tales como

sus esporas e hifas como lo indican Blackwell y Spatafora (2004) estos organismos estaacuten

divididos en cuatro grandes grupos los cuales son Ascomycota Basidiomycota

Chytridiomycota Zygomycota es justo en el grupo de los Ascomycota donde se encuentra gran

diversidad de hongos conocidos como ldquohongos endoacutefitosrdquo en donde su nombre ldquoendoacutefitordquo

significa ldquodentro de la plantardquo (endon dentro phyton planta)

19

Estos microorganismos fuacutengicos tienen la facilidad de pasar gran parte o todo su ciclo de

vida invadiendo los tejidos de su hospedero (planta) sin tener un efecto negativo evidente

(Leacuteveilleacute 1846 3 de Bary 1866 8) Por lo tanto el concepto de endoacutefito indica una asociacioacuten de

costo-beneficio pero de una forma mutualista entre el hongo y la planta hospedera permitiendo

la estadiacutea en sus tejidos vivos (Clay 1998 8) Los hongos endoacutefitos se han encontrado en todas

las plantas (algas musgos pastos plantas y vasculares) desde los bosques templados hasta los

bosques tropicales hallaacutendose una gran diversidad de plantas y en asociacioacuten gran diversidad de

hongos endoacutefitos (Saacutenchez et al 2010)

Se espera que los hongos endoacutefitos jueguen un papel cada vez maacutes importante potenciado

por el cambio climaacutetico en las enfermedades producidas en plantas como pudricioacuten radicular

mal blanco entre otras con los aumentos pronosticados de la temperatura y el estreacutes por sequiacutea

asociados al cambio climaacutetico (Desprez-Loustau et al 2006 Slippers y Wingfield 2007 6) Los

cambios en la cantidad de dioacutexido de carbono (CO2) y la disponibilidad de nitroacutegeno en el suelo

afectan de forma similar tanto a las plantas como a los hongos por ende las alteraciones

generadas por parte del cambio climaacutetico pueden causar desbalances en sus relaciones (Ies et al

2013)

Algunos estudios realizados en el antildeo 1898 donde se registraron los primeros hongos

endoacutefitos como el de Bary (1866) brindo la iniciativa de investigaciones que lograron explicar

los cuadros toxicoloacutegicos observados en animales los cuales se daban por el consumo de

semillas o en aacutereas de pastos (Poaceae) que posiblemente albergaban hongos Clavicipitaacuteceos

(familia del ergot) los cuales poseiacutean actividades enzimaacuteticas con micotoxinas

Por diversas situaciones no trascendioacute la investigacioacuten hasta que Bacon (1977) hizo

relacioacuten del hongo endoacutefito Neotyphodium coenophialum debido a una intoxicacioacuten del ganado

llamado ldquosiacutendrome de veranordquo cuando estos animales consumiacutean pastos de la especie Festuca

arundinacea (Poaceae) Funk en el antildeo 80 caracterizoacute la resistencia de las Poaceae que

albergaban hongos endoacutefitos que frecuentemente eran atacados por insectos (proteccioacuten contra

herbiacutevoros) (Saacutenchez et al 2010)

Compant y colaboradores (2010) mencionaron que tras experimentar en el laboratorio

con una gama de temperaturas en los hongos endoacutefitos aislados obtuvieron resultados variables

respecto al crecimiento es decir positivos y neutrales llegando a la conclusioacuten de que los

microorganismos asociados a las plantas son un factor importante que influye en la respuesta de

20

las plantas acorde a los cambios de temperatura lo que compromete las respuestas del frailejoacuten y

los hongos endoacutefitos frente al calentamiento global causado por el cambio climaacutetico

Con relacioacuten a los estudios realizados sobre hongos endoacutefitos en frailejones se han

encontrado al menos 100 especies con capacidades de inhibir hongos fitopatoacutegenos o herbivoriacutea

(Cabezas et al 2012)

Los geacuteneros de hongos endoacutefitos encontrados en anteriores estudios son Acremonium

Aspergillus Aureobasidium Colletotrichum Fusarium Gliocadium Nigrospora Paecilomyces

Penicillium Trichothecium Trichoderma y Sordaria (Pineda 2000 Programa Nacional para la

Evaluacioacuten del Estado y Afectacioacuten de los Frailejones en los Paacuteramos de Andes del Norte 2009)

Teniendo en cuenta que para Colombia hay poca informacioacuten sobre hongos endoacutefitos en

ecosistemas paramunos se hace fundamental la ampliacioacuten de maacutes informacioacuten referente al tema

debido a que solo existen estudios significativos en cafeacute leguminosas y rosas los cuales maacutes allaacute

de la identificacioacuten de geacuteneros de hongos endoacutefitos no incluyen el cambio climaacutetico y sus

posibles consecuencias (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016) En

teacuterminos filogeneacuteticos los hongos son el reino de la naturaleza maacutes cercano a los animales

(Hibbett et al 2018)

Las relaciones que posean las diferentes especies de endoacutefitos dentro de la especie de

frailejoacuten es de importancia conocerla mediante el uso de la filogenia molecular (Judd et al 2007)

mediante secuencias de ADN ARN o proteiacutenas (Cooke et al 2000) Dependiendo de la presencia

de especies agresivas de endoacutefitos como Nigrospora se puede tener un mejor conocimiento

sobre las consecuencias que trae consigo los impactos del cambio climaacutetico sobre estas plantas de

los Andes Tropicales (Foden et al 2009)

21

Capiacutetulo primero

Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitos

1 Antecedentes

Desde los estudios realizados por Leacuteveilleacute (1846) y Bary (1866) sobre hongos Endoacutefitos

en pastos de zonas templadas se ha logrado identificar que estos hongos son capaces de inducir

respuestas adaptativas a sus hospederos (Micotoxinas contra herbiacutevora adaptacioacuten a heladas o

climas extremos fijacioacuten de nutrientes) a cambio de alimento y hospedaje formando una relacioacuten

mutualista en la cual las dos especies involucradas son beneficiadas No obstante se ha reportado

que los hongos endoacutefitos ademaacutes de tener relaciones mutualistas con diferentes especies

vegetales se pueden tornar en especies patoacutegenas para su hospedero una vez la planta se

encuentra en condiciones desventajosas tornaacutendose asiacute el hongo endoacutefito en un hongo

fitopatoacutegeno (Herrera y Ulloa 1990 550)

Como se mencionoacute anteriormente los hongos endoacutefitos pueden pasar de un estado

mutualista a un estado de patogeacutenesis dada esta relacioacuten entre ambos organismos se producen

metabolitos secundarios potencialmente toacutexicos facilitando factores de virulencia dados por el

hongo endoacutefito como exoenzimas y metabolitos fitotoacutexicos a su vez la planta presenta defensas

tanto mecaacutenicas como bioquiacutemicas (Saacutenchez et al 2013 5)

Hasta la fecha los principales estudios de hongos endoacutefitos se han fijado en especies de

intereacutes econoacutemico y comercial tales como palma de aceite cafeacute leguminosas pastos de forrajeoacute

y diferentes tipos de rosas (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016)

Las especies modelo para el estudio de los hongos endoacutefitos han sido las gramiacuteneas

forrajeras en donde se han reportado especies de endoacutefitos asociados a los geacuteneros Lolium

Festuca y Brachiaria (Siegel et al 1987) no obstante Otero y Bayman (2009) han reportado un

creciente nuacutemero de estudios en orquiacutedeas epifitas tropicales relaciones con hongos micorrizicos

22

Actualmente existen escasos reportes de hongos endoacutefitos asociados a ecosistemas con

climas extremos (temperaturas extremas) como aacuterticos desiertos paacuteramos y zonas alpinas

especialmente para zonas de temperaturas friacuteas como lo son los paacuteramos (Lopera et al 2008

Leung et al 2011 Cabezas et al 2012 Miles et al 2012 Zhang y Yao 2015)

Investigadores como Lopera Leung y colaboradores (2011) han llegado a la conclusioacuten

de que los hongos endoacutefitos juegan un papel importante en las plantas a la hora de adaptarse a

ecosistemas de clima templado (Kivlin et al 2013 Zhang y Yao 2015)

En Colombia los trabajos con hongos endoacutefitos son pocos por ende trabajos como el de

Lopera y colaboradores (2008) con especies del genero Espeletia de los paacuteramos Colombianos

son pioneros ademaacutes del trabajo de Cabezas y colaboradores (2012 4) en el cual aislaron y

caracterizaron celulasas (enzimas descomponedores de la celulosa) extraiacutedas de hongos endoacutefitos

que se hallaban en especies de Espeletia posteriormente Lopera y Miles (2012) unieron

esfuerzos para continuar caracterizando la diversidad de hongos endoacutefitos en los paacuteramos andinos

colombianos enfocados en Espeletia con el objetivo de encontrar especies con potencial

biocontrolador

Existen trabajos tesis en los repositorios de diversas universidades de los antildeos 2014 y

2015 en los cuales se aborda el tema de los hongos endoacutefitos paacuteramos y especies de Espeletia

(frailejones) y de la familia Poaceae en donde se caracterizan las diversas especies de hongos

endoacutefitos por medio taxonomiacutea y biologiacutea molecular ademaacutes de buscar metabolitos secundarios

con fines medicinales o de biocontrol

Los trabajos en filogenia molecular de hongos endoacutefitos realizados en frailejones se han

visto enfocados maacutes hacia la buacutesqueda de la diversidad funcional en comunidades

microbioloacutegicas como por ejemplo el estudio realizado por Ruiz y colaboradores (2015) en

donde buscaron mediante el anaacutelisis molecular de raiacuteces necromasa hojas maduras y joacutevenes de

diferentes especies de Espeletia (veacutease figura 3) ubicada en los Andes neotroacutepicales

colombianos secuencias geneacuteticas de las regiones V5-V6 de la unidad 16S del rARN

23

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras N

necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefito Tomado de Ruiz y colaboradores (2015)

Este estudio analizoacute la composicioacuten de comunidades microbioanas y su diversidad

funcional en un ecosistema de alta montantildea en donde las temperaturas los rayos UV y la altura

juegan papeles determinantes como filtros ecoloacutegicos severos en donde solo pueden existir

especies que han desarrollado capacidades para adaptarse sobrevivir y colonizar dichas aacutereas

por ende cuando se analizaron las comunidades existentes dentro de estas especies de Espeletia

Encontraron que algunas especies halladas podriacutean tener roles importantes como

productores de metabolitos secundarios enzimas o incluso como bioremediadores y que las

comunidades microbianas eran diferentes tanto en sus hojas como en sus raiacuteces y en la

necromasa

A medida que las deacutecadas avanzan y la evidencia sobre el cambio climaacutetico se hace maacutes

robusta y evidente los estudios en los hongos endoacutefitos han tomado vital importancia al estar

asociados con cultivos de especies comestibles escases de agua y de tierras productivas sumado

a los efectos negativos que trae consigo el cambio climaacutetico para las diferentes plantaciones y

cosechas a nivel global

Es por eso que Lu Yan y colaboradores (2019) analizaron los efectos positivos que teniacutean

la colonizacioacuten de hongos endoacutefitos en las plantas en donde ratificaron que los hongos endoacutefitos

dentro la planta generan metabolitos antimicrobianos estimulan las respuestas inmunoloacutegicas y

compiten por espacio dentro de la planta con diferentes patoacutegenos incrementando asiacute la

resistencia contra herbiacutevoros y la resistencia al estreacutes salino (factores bioacuteticos)

Ademaacutes de ayudar a la planta contra el estreacutes abioacutetico causado principalmente por

factores climaacuteticos como la falta de agua (estreacutes hiacutedrico) las temperaturas extremas la

intensidad de los rayos UV y los metales pesados como la muestra la figura 4 debido a esto se

24

concluyoacute que las fitohormonas cumplen un papel importante en la colonizacioacuten de hongos

endoacutefitos dentro de la planta

Aun que se ha reportado que los hongos endoacutefitos se pueden usar como biocontroladores

diferentes estudios reportan que el uso de hongos endoacutefitos puede tener efectos adversos como

un retraso significativo en el crecimiento de la planta con el uso de la especie Cryptosporiopsis

sp (Terhonen et al 2016) Otro reporte indica la fecundidad y supervivencia de enemigos

naturales como paraacutesitos esto es debido a que los hongos endoacutefitos transfieren sus toxinas y

alcaloides cuando son ingeridos por paraacutesitos u otros enemigos naturales de las plantas (Lopez y

Sword 2015)

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y abioacutetico

Bajo estreacutes bioacutetico (herbiacutevoros y patoacutegenos) y abioacutetico (sequiacutea salinidad metales pesados y otros) (a) se

inducen respuestas de defensa de las plantas (b) los endoacutefitos producen metabolitos protectores y

modulan la viacutea de las fitohormonas para mejorar la inmunidad de las plantas (c) tomada de Lu yan y

colaboradores (2019 7)

25

2 Justificacioacuten

La presente investigacioacuten pretende identificar y caracterizar que especies de hongos

endoacutefitos estaacuten asociadas al frailejoacuten Espeletia hartwegiana y que posibles implicaciones podriacutea

tener que estas especies se encuentren dentro de esta especie de alta montantildea La importancia de

conocer esta informacioacuten reside en que los hongos endoacutefitos pueden beneficiar o perjudicar a la

adaptacioacuten y resistencia de especies vegetales en los distintos escenarios climaacuteticos propuestos

por la ciencia (IPCC 2020)

El calentamiento global podriacutea afectar el equilibrio de los hongos endoacutefitos en especies

vegetales generando desbalances en la planta o la peacuterdida de especies endoacutefitas de importancia

biotecnoloacutegica Por ejemplo se podriacutean perder especies endoacutefitas con potencial para control

bioloacutegico de plagas y enfermedades de plantas como productores de enzimas y metabolitos

secundarios degradacioacuten de plaacutesticos o biorremediacioacuten entre otros (Schulz et al 2002) Por

ello se hace fundamental estudiar los hongos endoacutefitos en ecosistemas de paacuteramo ya que en

Colombia y en los paacuteramos en general han sido poco estudiados y su efecto sobre las plantas de

alta montantildea podriacutea ser clave en el mantenimiento de sus poblaciones

26

3 Hipoacutetesis

H1 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute diferente en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo diferentes los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten tambieacuten seria

modificada

H0 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute similar en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo similares los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten continuariacutean

como se ha registrado con anterioridad

27

4 Objetivos

41 Objetivo general

Caracterizar la diversidad de hongos endoacutefitos presentes en los frailejones

de la especie Espeletia hartwegiana en el paacuteramo de Romerales tomando en cuenta su

relacioacuten con el cambio climaacutetico

42 Objetivos especiacuteficos

Identificar los hongos endoacutefitos asociados en Espeletia hartwegiana del

paacuteramo de Romerales

Hallar relaciones filogeneacuteticas entre las diferentes especies de hongos

Endoacutefitos encontradas en Espeletia hartwegiana

Advertir las repercusiones del cambio climaacutetico sobre Espeletia

hartwegiana en base a su diversidad de hongos endoacutefitos

28

29

Capiacutetulo segundo

Materiales Meacutetodos y Resultados

1 Aacuterea de Estudio

El trabajo se realizoacute en el paacuteramo de Romerales ubicado en la zona alta del municipio de

Salento Quindiacuteo (4deg39202N 75deg25506W) con una extensioacuten aproximada de 6794 ha (Cano

et al 2015)

2 Colecta de material bioloacutegico

La colecta del material bioloacutegico se realizoacute mediante muestreos aleatorios lo largo del

paacuteramo tomando coordenadas de cada punto de colecta (veacutease anexo 3) las hojas se colectaron

por medio de tijeras podadoras siendo empacadas cada una en bolsas Ziploc diferentes se

colectoacute un total de 15 hojas cada una correspondiente a una planta de frailejoacuten para un total de

15 plantas muestreadas de E hartwegiana

Adicionalmente las bolsas Ziploc fueron marcadas con los datos de colecta en campo y

transportadas a los laboratorios del Programa de Biologiacutea de la Universidad del Quindiacuteo para su

procesamiento

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetales

Las muestras obtenidas fueron lavadas con agua para eliminar el exceso de residuos se

cortaron 4 trozos de cada hoja con un tamantildeo aproximado de 05 a 10 cm (veacutease figura 5) luego

cada trozo de hoja se sometioacute a una esterilizacioacuten la cual se completoacute con algunas modificaciones

acorde al procedimiento descrito por (Osorio et al 2017) especiacutefico para el aislamiento de

30

hongos endoacutefitos que consiste en sumergir perioacutedicamente el material vegetal en etanol al 90

durante un minuto seguido de hipoclorito de sodio (NaClO) al 4 por un minuto continuando

con etanol al 70 durante un minuto y por uacuteltimo se lavaraacuten con agua destilada todo dentro de la

campana de flujo

Las cuatro secciones de hoja se transfirieron a una caja de Petri para un total de 15 cajas

de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA) (una caja de Petri por cada 4 cortes de hoja)

Posteriormente las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente (25degC aproximadamente)

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en medio de

cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelial caja de Petri de 20ml de capacidad

Pasadas 3 semanas se revisaron los cultivos fuacutengicos con el fin de revisar el crecimiento

del micelio y hacer un repique a un cultivo puro una vez maduros se procedioacute a utilizar la teacutecnica

de corte de hifa uacutenica (Osorio et al 2017) esta teacutecnica consistioacute en tomar la punta de la hifa con

ayuda de un estereoscopio y un bisturiacute de grado quiruacutergico agua destilada alcohol al 70 y un

mechero para mantener el bisturiacute esterilizado una vez identificada la hifa ideal para cultivar de

forma pura (veacutease figura 6) con el bisturiacute se procedioacute a cortar el agar PDA en forma de cuadro

con una medida aproximada de 3 miliacutemetros cuadrados

31

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la teacutecnica de

corte de hifa uacutenica

Se esperoacute entre 3 a 5 semanas a que crecieran los cultivos puros aislados de las hifas uacutenicas en

nuevas cajas de Petri con agar PDA

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos endoacutefitos)

Los hongos cultivados de forma pura consiguieron un crecimiento micelial significativo a partir

de los 15 diacuteas a temperatura ambiente como lo demuestra la figura 7 que contiene doce de los

cultivos maacutes representativos con su respectivos micelios aeacutereos desarrollados donde variacutean sus

colores formas y consistencias esto indicando que pertenecen a diferentes especies

2

1

3

32

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de cultivo

Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12) aislados de las

hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

5 Extraccioacuten de ADN

4

5

6

7

8

9

10

11

12

33

Una vez el micelio de los hongos se encontraba desarrollado en la cantidad necesaria se

procedioacute a extraer el ADN genoacutemico siguiendo el protocolo de extraccioacuten de Raeder y Broda

(1985) por medio de un barrido superficial del micelio evitando tomar el agar este micelio

posteriormente se colocoacute en tubos Eppendorf esteacuteriles de 2 ml y se pulverizoacute mediante el uso de

un asa microbioloacutegica y 1ml de buffer de extraccioacuten compuesto de Tris-HCL 1 M pH 78 EDTA

05 M Ph 8 SDS 10 wv NaCL y agua destilada para cada tubo a continuacioacuten se agregoacute 800

ul de etanol al 70 500 ul de fenol y se mezcloacute

Se adicionoacute 300 ul de cloroformo y se mezcloacute de nuevo de alliacute se llevoacute a la centrifuga a

10000 rpm por 60 minutos luego de centrifugar se forma un sobrenadante el cual es transferido

en su totalidad a un nuevo tuvo Eppendorf de 15 ml en el cual se agregaron 400 ul de cloroformo

y se llevoacute a la centrifuga a 10000 rpm por 10 minutos en donde nuevamente se forma un

sobrenadante aunque esta vez solo se toman 500 ul del tubo para ser transferidos otro tubo

Eppendorf de 15 ml ya en el nuevo tubo se adicionaron 50 ul de NaAC y se invirtioacute varias veces

para homogenizar la mezcla a continuacioacuten se guardoacute en el refrigerador a 4degC toda la noche

Al diacutea siguiente se tomaron las muestras en los tubos Eppendorf y se centrifugaron a

10000 rpm por 30 minutos (Formacioacuten del Pellet de ADN) cuando la centrifuga terminoacute se

procedioacute a remover el etanol ya sin etanol se agregoacute de nuevo 1 ml de etanol al 70 a cada tubo

y se centrifugoacute a 10000 rpm por 5 minutos en este paso se removioacute el etanol y se dejoacute secar el

pellet de ADN una vez el etanol se evaporoacute se re suspendioacute el pellet en 100 ul de agua grado

molecular o Sabax con 5 ul de RNAsa con el fin de evitar la presencia de moleacuteculas de ARN

posteriormente se incubaron a 37degC por 30 minutos y se guardaron para su envioacute a -20degC

(Raeder y Broda 1985)

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengica

Una vez se secuenciaron las muestras de ADN enviadas a la Universidad Ruhr de

Bochum Alemania se hizo el ensamblaje de las secuencias en contigs y scaffolds en el

programa CLC Main Workbench 8 (Nicola et al 2013) Como lo muestra la figura 8 donde se

muestran los pasos esenciales de una teacutecnica de Metagenoacutemica donde posteriormente se

analizaron con maacutes detalle mediante teacutecnicas filogeneacuteticas

34

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemico Fuente Thomas y colaboradores (2012)

7 Secuenciamiento

Se extrajoacute con eacutexito un total de 35 muestras de hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

Espeletia hartwegiana (veacutease figura 9) que posteriormente fueron secuenciadas por la

Universidad Ruhr de Bochum (Alemania) logrando un total de 70 secuencias incluyendo

aquellas obtenidas en Genk Bank

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de frailejoacuten

Espeletia hartwegiana

35

8 Anaacutelisis Filogeneacutetico

Se aislaron 35 secuencias basadas en la especie Espeletia hartwegiana fueron

comparadas posteriormente con 35 secuencias de especies publicados en GenBank

(httpblastncbinihgovblastcgi) se obtuvo un total de 70 secuencias Las secuencias de

consenso ITS 58S DNA obtenidas se usaron para realizar buacutesquedas BLAST en GenBank

usando BLASTn (Altschul et al 1990) con el fin de identificar mediante las secuencias aisladas

los geacuteneros o las especies maacutes cercanas La matriz de datos fue alineada en MAFFT v7 (Katoh y

Standley 2013) Se utilizaron las especies Coprinellus xanthothrix y Coprinellus domesticus

como grupos externos

Los anaacutelisis de las secuencias para construir los arboles filogeneacuteticos de Maacutexima

Parsimonia (MP) fueron realizados usando PAUP v40b10 (Swofford 2003) Para el anaacutelisis de

Maacutexima Verosimilitud o ML por sus siglas en ingleacutes (Maximum Likelihood) se utilizoacute

JmodelTest (Darriba et al 2012) con el cual se infirieron los criterios del modelo de sustitucioacuten

apropiado utilizando los criterios de informacioacuten de Akaike (AIC) (Akaike 1974)

Los anaacutelisis de ML se realizaron con el programa PhyML v 30 (Guindon y Gascuel

2003) teniendo en cuenta la proporcioacuten de sitios invariables Los valores de soporte de confianza

para los nodos se estimaron mediante 1000 anaacutelisis de arranque de replicacioacuten La alineacioacuten de

los datos de la secuencias de ITS para 70 aislamientos determinoacute quince geacuteneros siendo los

siguientes Annulohypoxylon Biscogniauxia Colletotrichum Crassiparies Cryptocoryneum

Cyphellophora Diaporthe Daldinia Humiacutecola Hypoxylon Hypocrea Nemania Nigrospora

Massarina y Trichoderma de los cuales se obtuvieron 11 clados principales (veacutease figura 10)

Con base en estos resultados todos los aislamientos se analizaron maacutes a fondo dentro de los

geacuteneros hasta llegar a especie (veacutease tabla 1)

36

Geacuteneros Especie Especie Especie Especie Especie Especie Especie

Annulohypoxylon A nitens A bahnphaden

gense

Biscogniauxia B petrensis

Colletotrichum C gloeosporioides

C gigasporum

Cyphellophora C

reptans

Crassiparies C quadrisporus

Cryptocoryneum C

longicondensatum

Daldinia D dennisii D

eschscholtzi

D

conceacutentri

ca

Diaporthe D

longicolla

D

foeniculina

D

anacardi

i

D

macada

miae

Humiacutecola H

fuscoatra

Hypoxylon H

trugodes

H

pulicicidum

Hypocrea H

koningii

Massarina M albocarnis

Nemania N

primolutea

Nigrospora N sacchari N rubi N sphaeric

a

N hainanen

sis

N oryzae

N gorlenko

ana

N aurantia

ca

Trichoderma T trixiae T

olivascens

T

paraviridescens

T

viridescens

T

samuelsii

T viride

Grupo Externo Coprinellus C

domesticus

C

xanthothrix

Tabla 1 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos endoacutefitos en la

especie Espeletia hartwegiana

37

38

Figura 10 Filograma consenso obtenido con el programa MEGA ndashX a partir del anaacutelisis ML y MP del

conjunto de datos ITS Aislados de las hojas de frailejoacuten Los coacutedigos en Verde son las secuencias que se

aislaron (aislados) en este estudio los coacutedigos y nombres en Negro son las secuencias encontradas por

identidad en GenBank Los valores de soporte de bootstrapgt 70 se indican cerca de los nodos como MP

ML = valores de soporte de bootstrap lt70

El nuacutemero de caracteres los modelos de sustitucioacuten usada asiacute como otros resultados

estadiacutesticos de las pruebas de Maacutexima Parsimonia y Maacutexima Verosimilitud generados a partir de

los anaacutelisis filogeneacuteticos de los conjuntos de datos se muestran en los anexos

39

Capiacutetulo Tercero

Discusioacuten sobre los hongos endofitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicas

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidad de Endoacutefitos

Tanto la temperatura la estacionalidad y los tipos de precipitacioacuten son factores de vital

importancia para la composicioacuten de las diferentes comunidades y la arquitectura vegetal Estos

factores limitan muchos de los procesos ecosisteacutemicos ya que existe una estrecha relacioacuten entre

las variaciones climaacuteticas y las variaciones dentro de los ecosistemas Por lo tanto se espera que

el cambio climaacutetico transforme los ecosistemas Andinos tal como los conocemos hoy (Colwell et

al 2008) modificando las relaciones mutualistas entre plantas y hospederos

Posiblemente la resiliencia y resistencia de muchos ecosistemas como el paacuteramo sean

superadas en este siglo por una combinacioacuten sin precedentes de disturbios tales como el cambio

climaacutetico perturbaciones asociadas a este (sequiacuteas fuegos invasioacuten de especies exoacuteticas

inundaciones) y otros factores como organismos oportunistas (hongos endoacutefitos) cambios en el

uso del suelo contaminacioacuten y sobreexplotacioacuten de recursos (IPCC 2020)

Considerando que el frailejoacuten Espeletia hartwegiana es una especie de alta montantildea

(paacuteramos) endeacutemica de la cordillera Central de los Andes (Schultz y Carl 1856) se encuentra

dentro de los ecosistemas andinos en donde a su vez se ha comprobado la existencia de los

hongos endoacutefitos es de tener en cuenta el papel de estos organismos endoacutefitos ya que los

paacuteramos son ecosistemas particularmente sensibles a los efectos adversos del cambio climaacutetico

en especial al calentamiento global al estar ubicados en los troacutepicos generando asiacute ventanas de

40

oportunidades para que los hongos endoacutefitos alteren su estado mutualista y pasen a ser

patogeacutenicos (Colwell et al 2008 7)

No obstante existe consenso en que las temperaturas aumentaraacuten especiacuteficamente a

grandes alturas y que la precipitacioacuten posiblemente se incrementaraacute en algunas zonas disminuiraacute

en otras y se produciraacute en patrones estacionales alterados con mayor intensidad y frecuencia

(Marengo et al 2009)

Los frailejones se ven en constante estreacutes por el uso del suelo dado en los paacuteramos como

es el caso del paacuteramo Romerales un paacuteramo que se ha visto afectado por las quemas y la

ganaderiacutea (Molinillo y Monasterio 2001) Esto aumenta asiacute las condiciones de estreacutes intriacutensecas a

las que estaacuten expuestas estas plantas de paacuteramo las cuales suministran valiosos bienes y servicios

ecosisteacutemicos como el abastecimiento continuo de agua para usos domeacutesticos agriacutecolas e

industriales (Buytaert et al 2006 4) servicios que se podriacutean ver en decrecimiento si las

ventanas de oportunidades se abren con maacutes frecuencia dando pie al cambio de estado de los

hongos endoacutefitos que existen dentro de los frailejones de la zona

En los paacuteramos de Chingaza Rabanal Guerrero Iguaque Merchaacuten y Sumapaz se han

realizado estudios de aislamientos de hongos en especies de frailejoacuten diferentes a la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana tales como Espeletia argentea Espeletia arbelaezii Espeletia

boyacensis Espeletia grandiflora Espeletia miradorensis y Espeletia uribei por ende se ha

reportado la presencia de hongos endoacutefitos y fitopatoacutegenos (Tabla 2) (Gaitan 2018 17)

Frailejones Espeletia

argentea

Espeletia

arbelaezii

Espeletia

boyacensis

Espeletia

grandiflora

Espeletia

miradorensis

Espeletia

uribei

Aspergillus X X X X

Annulohypoxylon X X X

Curvularia X X X

Epicoccum X X X

Fusarium X X X

41

Tabla 2 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = a presencia del genero de

hongo dentro de la especie de frailejoacuten

Los geacuteneros de hongos en rojo son los geacuteneros que se encontraron en comuacuten con los

geacuteneros hallados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana de un total de 15 geacuteneros 3

han sido reportados anteriormente en estudios similares ( 20 de geacuteneros identificados)

Dentro de un marco de cambio climaacutetico es importante la metodologiacutea de muestreo

como lo fue el formato de muestreo en puntos aleatorios realizado en el presente estudio se llevoacute

acabo principalmente por la homogeneidad de los frailejones en el paacuteramo como lo indica el

manual de meacutetodos baacutesicos de muestreo y anaacutelisis de ecologiacutea vegetal (BOLFOR 2000 9) donde

se menciona que el muestreo aleatorio se utiliza cuando se dispone de poca informacioacuten previa de

las caracteriacutesticas de las poblaciones a medirse en este caso la poblacioacuten a identificarse fueron

los hongos endoacutefitos que se hallaban dentro de las formaciones homogeacuteneas de los frailejones

No obstante el muestreo aleatorio tambieacuten presenta limitaciones a la hora de comparar los

hongos endoacutefitos a lo largo del gradiente altitudinal (muestreo aleatorio estratificado) dejando de

percibir informacioacuten proveniente de los distintos microclimas que se encuentran y de las

incidencias que podriacutean causar a la hora de identificar los geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten ademaacutes de posibles micro efectos del cambio climaacutetico a lo

largo del gradiente altitudinal (Caacutemara et al 2008)

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio Climaacutetico

Nigrospora X X X X X

Penicillium X X X

Pleospora X X X X

Trichoderma X X X X

42

Las teacutecnicas empleadas en este estudio para lograr aislar e identificar los hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana se hacen importantes dentro del cambio

climaacutetico debido a que el margen de error en la identificacioacuten molecular es reducido (Bakermans

et al 2014) Al ser reducido el margen de error se pudo conocer con mayor certeza que especies

y geacuteneros de hongos endoacutefitos se encuentra dentro de la planta

Al conocer sus identidades es posible conocer las capacidades que tienen cada una de

estas especies de hongos endoacutefitos de producir metabolitos secundarios de infiltrarse y proteger

los tejidos de la planta de condiciones bioacuteticas y abioacuteticas competir contra herbiacutevoros y

fitopatoacutegenos (Schulz et al 2002) Con sus capacidades reconocidas es posible vincular los

efectos del cambio climaacutetico como estreacutes hiacutedrico aumento de la temperatura migraciones

tempranas enfermedades emergentes aumentos de la precipitacioacuten y heladas severas con las

reacciones por parte de los hongos endoacutefitos Estas reacciones podriacutean desencadenar aumentos de

la patogenicidad en las poblaciones de frailejones debido a los constantes disturbios y estreacutes al

que se ve sometido la planta generando asiacute notables declives poblacionales (Mendoza 2010)

Las relaciones filogeneacuteticas entre las especies halladas toman relevancia debido a las

sinergias positivas o negativas que se pueden presentar dependiendo de las especies que se

encuentren asociadas dentro de la planta (Lamichhane y Venturi 2015) como por ejemplo

Nigrospora y Colletotrichum pueden activar una sinergia negativa aumentando la virulencia y

afectando la especie Espeletia hartwegiana

Las especies de hongos endoacutefitos se identificaron por medio de secuencias obtenidas de

las regiones ITS (regioacuten de espaciadores internos transcritos) las cuales son regiones altamente

conservadas con tasas de evolucioacuten muy lentas en el tiempo permitiendo hacer inferencias

filogeneacuteticas (Baldwin et al 1995 Hamby y Zimmer 1992) es por ello que se usaron para

generar las diferentes identificaciones de los hongos endoacutefitos logrando asiacute identificar al geacutenero

Nigrospora con un total de 7 especies N sacchari N rubi N sphaerica N hainanensis N

gorlenkoana N oryzae y N aurantiaca pertenecientes a la familia Apiosporaceae orden

Xylariales Divisioacuten Ascomicota (veacutease figura 11) (Wang et al 2017)

Dentro del marco del cambio climaacutetico Nigrospora se caracteriza por poseer una

distribucioacuten cosmopolita y una amplia gama de hueacutespedes como lo es en este caso la especie E

hartwegiana que habita en los Andes Tropicales que se veraacuten alterados por los efectos del

cambio climaacutetico este geacutenero se ha logrado aislar en su forma endoacutefita en tallos y hojas de

43

diversas plantas tambieacuten como saprofitos en detritos hojarasca y larvas muertas (Uzor et al

2015 1)

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

Los hongos endoacutefitos hallados en esta investigacioacuten se encontraron dentro de la especie

de frailejoacuten E hartwegiana la cual pertenece a los Andes Tropicales ubicados maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos Estos ecosistemas son sensibles a los efectos del cambio

climaacutetico por su altura su alto endemismo y su sensibilidad al efecto de borde Cuando las

especies lentildeosas empiecen a migrar a lo largo del gradiente altitudinal es posible que los

frailejones se encuentren con suelos agrestes en donde sus semillas no podraacuten fijarse y los efectos

adversos de hongos como Nigrospora N oryzae y N sphaerica seraacuten maacutes notables

aprovechando las ventanas de oportunidad que generen los desbalances climaacuteticos (Sharma et al

2013)

Los cambios en los patrones climaacuteticos potenciaran la especie N sphaerica dentro del

frailejoacuten la cual tiene la capacidad de causar tizoacuten foliar en la especie Camellia sinensis siendo

una planta de teacute perteneciente a la divisioacuten de las magnolifiotas como el geacutenero Espeletia (Liu et

al 2015) Nigrospora fue el geacutenero maacutes ampliamente aislado en las identificaciones generadas a

partir de las hojas de frailejoacuten esto se veriacutea explicado debido a que N sphaerica tiene un

mecanismo de descarga de esporas efectivo que puede proyectar a la fuerza sus esporas a una

distancia de hasta 2 cm en vertical y 68 cm en horizontal como lo demostroacute Webster (1952)

ademaacutes el estudio de Wu y colaboradores (2004) tambieacuten evidencioacute que las esporas de

44

Nigrospora son uno de los grupos maacutes dominantes en la atmoacutesfera y estaacuten asociadas con

tormentas de polvo

La gran capacidad colonizadora del geacutenero Nigrospora le permite adaptarse a las

condiciones climaacuteticas cambiantes con la estrategia de dispersioacuten de sus esporas logrando

distanciarse del frailejoacuten hospedero para encontrar nuevos hospederos producto de las

migraciones tempranas a lo largo del gradiente altitudinal (Riveros 2010)

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

por encima del 80 lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen menos

mutaciones en los nodos internos del aacuterbol basados en la distribucioacuten de probabilidad asignadas

a los posibles arboles resultantes dando lugar a una hipoacutetesis evolutiva maacutes confiable (Schmidt y

Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 es decir el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes

corto (menos cambios) y el cual se ajusta mejor a los datos (Swofford 1997)

Teniendo asiacute una inferencia filogeneacuteticamente robusta los geacuteneros Collectotrichum y

Nigrospora pertenecen a la Divisioacuten Ascomycota ambos geacuteneros son particularmente agresivos

con las plantas en especial la especie Colletotrichum gloeosporioides la cual es la fase asexual

de Glomerella cingulata (Raj et al 2013) Se caracteriza por tener un amplio rango de

hospederos entre ellos el frailejoacuten a los cuales les causa una enfermedad conocida pudricioacuten

amarga antracnosis o chancros siendo esta la necrosis de frutos flores nervios y tallos

(Gonzaacutelez et al 2006 4)

Uno de los primeros reportes de afectaciones a especies de frailejoacuten se obtuvo en el 2009

en el Parque Natural Nacional Chingaza Colombia en donde encontraron las especies de

frailejoacuten Espeletia grandiflora y Espeletia uribei afectadas debido a insectos y una especie de

hongo del genero Colletotrichum (Medina 2009- 9 Hartung y Burton 1981)

Por ende que estos dos geacuteneros de hongos se encuentren juntos podriacutea tener

implicaciones en el aumento de virulencia potenciado a su vez por los desbalances abioacuteticos

causados por el cambio climaacutetico como lo han mencionado Belisario y colaboradores (2002) es

posible que las afectaciones no sean producidas por un uacutenico hongo si no por un complejo de

varios generando sinergismos entre diferentes especies que solas no hariacutean dantildeo a la planta pero

juntas podriacutean ser causantes de enfermedad (Lamichhane y Venturi 2015 4) aun mas en un

45

marco de cambio climaacutetico que gradualmente aumenta sus efectos nocivos sobre los paacuteramos

aumentando la temperatura cambios en la precipitacioacuten heladas intensas cambios en la

nubosidad mayor exposicioacuten a la radiacioacuten solar teniendo por resultado un iacutendice de estreacutes

mayor en las plantas de paacuteramo generando ventanas de oportunidades para que los hongos

endoacutefitos modifiquen sus roles de protector a patoacutegeno

En frailejones tambieacuten se ha reportado la presencia de Nigrospora y Trichoderma por

Bonilla y Argenis (2005) maacutes especiacuteficamente en la especie Espeletia grandiflora la cual es una

especie que habita en los paacuteramos de Colombia Ecuador y Venezuela en conjunto con Espeletia

hartwegiana (Luteyn 1999 3) El hecho que existan estos dos geacuteneros presentes en los frailejones

advierte de un equilibrio entre hongos endoacutefitos que se puede romper bajo las tensiones del

cambiante clima maacutes aun en los sensibles paacuteramos alto andinos

En cuanto a N sacchari se tiene reporte que es un productor de metabolitos con una

notable actividad herbicida demostrado en plantas cultivadas en invernadero (Fukushima et al

1998 2) debido a que existe evidencia que sugiere que los hongos endoacutefitos han evolucionado

directamente de hongos patoacutegenos (Schulz et al 1999 4) sumado al estreacutes del cambio climaacutetico

en cualquier momento de extrema tensioacuten hiacutedrica caloacuterica o heladas en estos ecosistemas de alta

montantildea Estos anomaliacuteas ambientales podriacutea disparar mecanismos de accioacuten fitopatoacutegenos

dentro de los frailejones generando un declive notable en sus poblaciones y por ende un declive

de la cantidad recurso hiacutedrico aguas abajo y su regulacioacuten (Diacuteaz et al 2002 5)

Como se mencionoacute anteriormente los medios de propagacioacuten de estos hongos endoacutefitos

pueden ser por medio de esporas que estaacuten en el ambiente aunque tambieacuten los vectores que

juegan un rol clave en su dispersioacuten son los insectos ya que estos pueden transportar esporas o

partes del hongo en su cuerpo patas o aparato bucal (Eigenbrode et al 2018 5)

Considerando la dispersioacuten homogeacutenea de los frailejones dentro del paacuteramo la carga

esporas en el ambiente y la herbivoriacutea de insectos es probable que se puedan ver infectados la

mayoriacutea de individuos (Varela 2016) es por ello que en el futuro puede que las afectaciones en

frailejones no sean producidas por hongos fitopatoacutegenos si no por hongos endoacutefitos que tuvieron

la ventana de oportunidad gracias al cambio climaacutetico aumento de la temperatura aumento en

las concentraciones de CO2 y alteraciones de precipitacioacuten que pueden hacer susceptible la planta

al ataque de estos hongos (Chakraborty 2011 Elad y Pertot 2014)

46

Para que se genere la enfermedad esta depende de la interaccioacuten de tres o cuatro factores

1) hospedero susceptible 2) agente causal (virulento) 3) condiciones ambientales favorables y 4)

tiempo (Francl 2001 2) la falta de alguno de ellos no permite que el patoacutegeno produzca la

enfermedad en la planta debido a ello algunas especies de frailejoacuten pueden tener una o dos cepas

que puedan actuar como fitopatoacutegenos pero no estaacuten activas si no estaacute completa su asociacioacuten

con otro patoacutegeno u otro factor

Ademaacutes existe un estudio que evaluoacute el efecto de la temperatura sobre la capacidad de

Fusarium verticillioides para generar infeccioacuten en plantas de maiacutez se probaron bajo 3 escenarios

de temperatura como resultados obtuvieron que la enfermedad de este hongo se veiacutea potenciada

por el aumento de temperatura en temperaturas por encima de 35degC (Murillo et al 2008) este

estudio da soporte a la hipoacutetesis de que existen factores que influyen significativamente a la

infeccioacuten en la planta tal vez el paacuteramo difiacutecilmente alcance 35degC no obstante la mayoriacutea de

especies son sensibles a cambios de temperatura de hasta de 1degC en donde modifican su

comportamiento rutas metaboacutelicas interacciones ecoloacutegicas y por ende sus defensas se ven

alteradas

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e Hypocrea

El geacutenero Trichoderma con seis especies diferentes (veacutease figura 12) fue el segundo

geacutenero maacutes numeroso despueacutes de Nigrospora que contoacute con siete especies aunque las primeras

especies que se analizaron fueron especies que principalmente actuaban generando enfermedades

en las plantas en las que se encontraban ante disturbios el geacutenero Trichoderma pertenece a la

47

familia Hypocreaceae y se caracteriza por tener una gran capacidad biocontroladora sobre

fitopatoacutegenos como Fusarium oxysporum los cuales podriacutean llegar masivamente con las

migraciones tempranas de insectos y plantas lentildeosas (Miles et al 2012 7)

No solo actuacutean repeliendo patoacutegenos internos si no tambieacuten patoacutegenos externos como

insectos que desean consumir u aprovechar la planta ya que estos pueden secretar diferentes

metabolitos secundarios y enzimas que actuacutean inhibiendo su desarrollo (Boughalleb-M et al

2018 8)

Es bien conocido que el geacutenero Trichoderma produce amplio rango de sustancias

antibioacuteticas ademaacutes de poseer la caracteriacutestica de parasitar otros hongos (Howell 2002 6)

Debido a la competencia que generan las especies del genero Trichoderma por espacio y

nutrientes inhiben o degradan pectinasas y otras enzimas que son esenciales para que los hongos

fitopatoacutegenos como Botrytis cinerea penetre en la superficie de las hojas logrando proteger de

esta forma al frailejoacuten que se veraacute expuesto a nuevas amenazas microbioloacutegicas auspiciadas por

los cambios en los patrones climaacutetico (Zimand et al 1996)

Ademaacutes de la capacidad del Trichoderma sp para atacar o inhibir el crecimiento de

patoacutegenos de plantas directamente descubrimientos recientes indican que tambieacuten pueden inducir

resistencia sisteacutemica y localizada a una variedad de patoacutegenos de plantas tales como el frijol es

protegido por Trichoderma harzianum de especies fitopatoacutegenas como Colletotrichum

lindemuthianum Botrytis cineacuterea las cuales producen lesiones en las hojas de la planta (Harman

y Howell 2004) Incluso se descubrioacute que ciertas especies de Trichoderma tienen una influencia

sustancial en el buen crecimiento y desarrollo de las plantas sin y con condiciones de estreacutes

climaacutetico (Lorito 1998)

Como lo demostraron Bonilla y Argenis (2005) en su estudio llevado a cabo en el

frailejoacuten Espeletia grandiflora diferentes cepas pertenecientes a Trichoderma pueden proteger

esta especie de paacuteramo de organismos fitopatoacutegenos emergentes por el cambio climaacutetico por

ende si puede proteger a E grandiflora tambieacuten puede proteger la especie E hartwegiana lo

que le permitiraacute sobrellevar diferentes ataques fortuitos de patoacutegenos e insectos que nunca han

logrado alcanzar las altitudes de paacuteramo (3200 - 5000 m)

Cuando el cambio climaacutetico aumente la temperatura en 1degC o 2degC traeraacute consigo sus

efectos de modificacioacuten en cuanto a la estructura y composicioacuten de las especies de plantas que

48

existen en zonas altas para este escenario basado en los caacutelculos de Thuiller (2007) las especies

se habriacutean desplazado en el gradiente altitudinal aproximadamente 450 metros para el antildeo 2070

Las consecuencias de este desplazamiento serian uacutenicas debido a que gran cantidad de

insectos y patoacutegenos tendriacutean migraciones tempranas en el gradiente altitudinal en buacutesqueda de

su optimo teacutermico llevando a cabo un proceso conocido como Termofilizacioacuten (Cuesta et al

2019) es ahiacute donde entra en juego la proteccioacuten que le pueden brindar especies endoacutefitos como

las que pertenecen al geacutenero Trichoderma en el marco de cambio climaacutetico

En concordancia con las cepas de Trichoderma y el geacutenero Hypocrea que tambieacuten

pertenece a la familia Hypocreaceae se conocen maacutes de 700 secuencias de peptaiboles (peacuteptidos

bioloacutegicamente activos) de ambos geacuteneros donde algunos de eacutestos son ecoloacutegica y

comercialmente relevantes debido a su potencial antimicrobiano actividad enzimaacutetica uacutetil para

competir por espacio y alimento de los nuevos patoacutegenos emergentes procedentes de las

alteraciones climaacuteticas y las migraciones tempranas (Degenkolb et al 2008 6)

En cuanto al geacutenero Hypocrea tambieacuten se ha reportado actividad antimicrobiana y anti

fuacutengica contra Staphylococcus aureus y Fusarium oxysporum (Gogoi et al 2008 2) habitando

los geacuteneros Trichoderma e Hypocrea dentro de especies de frailejoacuten como E hartwegiana se

espera que puedan generar sinergias de proteccioacuten que las ayude a combatir los fuertes y

extremos eventos climaacuteticos

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

del 100 (veacutease figura 13) lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen

menos mutaciones en los nodos internos del aacuterbol por ende este aacuterbol contiene la menor

cantidad de mutaciones o cambios dentro sus nodos internos teniendo como resultado una

hipoacutetesis evolutiva confiable (Schmidt y Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 que

indica que el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes corto (menos cambios) y el cual se ajusta

mejor a los datos (Swofford 1997)

49

El geacutenero Annulohypoxylon es de importancia dentro del marco del cambio climaacutetico ya

que pertenece a la familia Xylariaceae y se caracteriza por poseer metabolitos secundarios

antitumorales-citotoacutexicos como la anuloescuamulina que ayudan a combatir el estreacutes abioacutetico

(Cheng et al 2012) estas cepas de hongos son principalmente saprofitos y oportunistas han sido

reportadas en hojas sanas y afectadas de frailejones en otros estudios (Gonzaacutelez 2012 Nonsoque

2012) siendo un geacutenero resiliente a las perturbaciones ambientales como los cambios en los

patrones climaacuteticos su relacioacuten como mutualista dentro del frailejoacuten se mantendraacute hasta que el

frailejoacuten se adapte o colapse ante el estreacutes abioacutetico

Aunque no se conocen como fitopatoacutegenos al contrario pueden actuar como mutualistas

no se descarta que puedan estar involucrados en el desarrollo de diferentes enfermedades en

plantas cuando las condiciones ecosistemicas se alteran a puntos extremos (Gonzalez et al 2017)

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon Biscogniauxia

Nemania y Humiacutecola

El geacutenero Daldinia posee unos valores de MPML correspondientes a 10094 con lo cual

se encuentra bien soportado estadiacutesticamente el geacutenero Daldinia se encuentra ubicado en la

familia Xylariaceae al igual que el geacutenero Hypoxylon Biscogniauxia y Nemania que en su

respectivo orden contienen un soporte estadiacutestico MPML de 10082 10099 y 100100 (veacutease

figura 14) los cuales pertenecen a la divisioacuten Ascomycota las cepas de Daldinia se caracterizan

principalmente por ser especies endoacutefitas teniendo la capacidad de estar dentro de su hueacutesped

mucho tiempo sin causarle dantildeo o al menos un dantildeo evidente por medio de su estado asexual

50

No obstante su estado se puede modificar cuando las condiciones externas se modifican

abruptamente en poco tiempo como es el caso de las alteraciones en la temperatura

precipitacioacuten y concentraciones de dioacutexido de carbono (CO2) auspiciados por el cambio

climaacutetico (Saacutenchez et al 2013)

Un estudio realizado por Prieto (2017) en la especie de frailejoacuten E grandiflora encontroacute

que la especie Daldinia eschscholtzii estaba asociado en el siacutentoma de clorosis (falta de clorofila

en las hojas) Tambieacuten se reportoacute que especies de Daldinia como Daldinia conceacutentrica tienen la

capacidad de controlar nematodos fitopatoacutegenos (Silva et al 2020 104) los cuales pueden invadir

y romper los tejidos de la planta dantildeando sus estructuras los nematodos tambieacuten seraacuten sujetos a

migraciones tempranas por el cambio climaacutetico que trae consigo presiones de seleccioacuten por ende

nuevas amenazas para los frailejones (Nakashima et al 2007)

Como hemos visto hasta este punto las especies de hongos endoacutefitos se muestran en

muchos casos como benefactores y protectores de las diferentes plantas en las que habitan

incluyendo diferentes especies de frailejones

Los hongos endoacutefitos protegen tanto de factores bioacuteticos como virus hongos

fitopatoacutegenos bacterias insectos y factores abioacuteticos como las intemperancias del clima no

obstante en su relacioacuten endoacutefita geacuteneros como Hypoxylon que pertenece igual que Daldinia a la

familia Xylariaceae pueden tener roles amenazadores en conjunto con el cambio climaacutetico

seguacuten Gonzales y colaboradores (2019) inocularon cepas pertenecientes al geacutenero Hypoxylon en

hojas de Theobroma cacao y encontraron que en 48 horas se comenzoacute a notar las marcas de

clorosis y deshidratacioacuten foliar esto demuestra que cepas de este geacutenero pueden tener efectos

fitopatoacutegenos ocasionando muerte descendente pudricioacuten del tronco negro y resinosis de ramas

de mezquite (De la Torre-Almaraacutez et al 2003 De la Torre-Almaraacutez et al 2009)

La presencia de este geacutenero dentro del frailejoacuten en un marco del cambio climaacutetico lo

convierte en una amenaza latente ya que las condiciones seraacuten cada vez maacutes agrestes en los

paacuteramos de los Andes Tropicales Puede favorecer el desarrollo de este geacutenero que tiene las

enzimas necesarias para producir la pudricioacuten del tronco negro entre otras enfermedades

relevantes

51

Tambieacuten las especies del geacutenero Hypoxylon se han reportado como endoacutefitos en tejidos de

plantas lentildeosas o herbaacuteceas (Petrini y Petrini 1985 3) asiacute como saprofitos o fitopatoacutegenos

deacutebiles en madera de aacuterboles de zonas templadas o tropicales (Miller 1961) como lo menciona

Miller (1961)

Los geacuteneros Biscogniauxia Nemania tambieacuten estaacuten dentro de la familia Xylariaceae y

Divisioacuten Ascomycota un aspecto interesante de las especies de Biscogniauxia es que son

paraacutesitos exclusivos de las angiospermas dicotiledoacuteneas en donde concluyeron que todas las

especies pertenecientes a este geacutenero son patoacutegenos umllevesuml que se aprovechan de situaciones de

sequiacutea y estreacutes hiacutedrico para aumentar su patogenicidad (Ju et al 1998)

La especie de frailejoacuten E hartwegiana es una Dicotiledoacutenea eso explica porque

podemos encontrar esta especie de hongo endoacutefito en el frailejoacuten del presente estudio siendo de

vital importancia denotar que las especies de Biscogniauxia se aprovechan especialmente de las

situacioacuten de sequiacutea y estreacutes hiacutedrico difiacutecilmente las especies de este geacutenero podriacutean afectar a los

frailejones debido a que se caracterizan por ser reguladores de los ciclos hiacutedricos el agua es el

recurso que maacutes tiende a existir en un paacuteramo por la estructura de sus suelos compuesta por

andosoles porosos y necromasa acumulada teniendo asiacute un alto iacutendice de retencioacuten hiacutedrica

(Hernandez y Muntildeoz 2015) de modo que el cambio climaacutetico no favorece al geacutenero

Biscogniauxia en su estado patogeacutenico dentro del ecosistema de paacuteramo

En cuanto al geacutenero Nemania Da Silva y colaboradores (2018) llevaron a cabo una

investigacioacuten en la cual identificaron cepas pertenecientes a los geacuteneros Colletotrichum

Phyllosticta Xylaria Nemania y Alternaria en la especie ornamental Pachystachys lutea en

donde las mismas cepas fueron ensayadas para inhibir el crecimiento de hongos fitopatoacutegenos

como Colletotrichum sp en donde encontraron que Nemania era capaz de inhibir por medio de la

secrecioacuten de distintas enzimas el crecimiento de dichas especies gracias a su actividad

enzimaacutetica el geacutenero Nemania puede compensar los desequilibrios causados por el cambio

climaacutetico en teacuterminos de hongos fitopatoacutegenos

Hay que tener en cuenta que los elementos que dan forma a las interacciones planta-

endoacutefito incluyen el modo de transmisioacuten el patroacuten de infeccioacuten la edad de la planta las

condiciones ambientales potenciadas por el cambio climaacutetico y los antecedentes geneacuteticos (Aly et

al 2011 6) Los frailejones de la especie E hartwegiana que se muestrearon para el estudio se

52

tomoacute las hojas sanas lo que indica que poseiacutean estas cepas de endoacutefitos en equilibrio siendo este

uno de los pocos reportes de este geacutenero en especies de alta montantildea en los Andes Tropicales

El geacutenero Humiacutecola se encuentra soportado por un MPML de 10076 siendo una

hipoacutetesis evolutiva considerable es el uacutenico de la figura 14 que no estaacute dentro de la familia

Xylariaceae ya que pertenece a la familia Chaetomiaceae aunque se halla en la divisioacuten

Ascomycota se podriacutea considerar a la especie Humiacutecola fuscoatra como una de las especies de

endoacutefitos maacutes umlinofensivasuml debido a trabajos de investigacioacuten reportados como el de Menzies y

colaboradores (1998) y el de Naik y colaboradores (2009)

Humiacutecola fuscoatra no se considera un peligro latente para la especie E hartwegiana ya

que existe en equilibrio con su entorno Estaacute comprobado por medio de caracterizaciones

quiacutemicas que Humiacutecola fuscoatra es un importante productor de moleacuteculas de estimacioacuten

medica como el resorciacuteclico y lactonas aacutecidas (Mejia et al 2014) Por lo tanto es una especie

prometedora con un reservorio de metabolitos secundarios de importancia medicinal e industrial

que de seguir los efectos nocivos del cambio climaacutetico en los Andes Tropicales maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos esta especie podriacutea desaparecer

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies Massarina

Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

Uno de los grupos mejores soportados en este cladograma es el grupo de Diaporthe en el

cual se encontraron cuatro especies siendo uno con maacutes abundancia de especies del estudio y que

posee un MPML de 10085 10089 y 10095 acorde a sus 3 nodos (veacutease figura 15) teniendo asiacute

una hipoacutetesis evolutiva confiable de estas relaciones las especies de Diaporthe pertenecen a la

familia Diaporthaceae de la divisioacuten Ascomycota y son especies de endoacutefitos que se distinguen

por inhibir el crecimiento de hongos patoacutegenos en el hospedero que se encuentren El estudio de

53

Da Silva y colaboradores (2018) mostroacute que cepas de Diaporthe sp Inhibieron el crecimiento de

Fusarium oxysporum y Colletotrichum sp hongos fitopatoacutegenos que aumentaran su presencia

aprovechando las alteraciones producidas por el cambio climaacutetico en los paacuteramos

Las especies de este geacutenero estaacuten en continuo cambio entre endoacutefitos y patoacutegenos

funcionando en la mayoriacutea de los casos en una relacioacuten mutualista en donde le brindan a la planta

mayor tolerancia a las sequias proteccioacuten de patoacutegenos y pestes caracteriacutestica uacutetil frente a los

retos ecoloacutegicos que plantea el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales (Hubbard et al 2014)

se conocen cerca de 800 especies de este geacutenero asociadas a una amplia gama de plantas

vasculares a nivel mundial (Rossman et al 2015)

Esto explica porque las especies de Diaporthe fueron una de las maacutes numerosas

encontradas en la especie de alta montantildea E hartwegiana teniendo en cuenta que esta especie

pasa raacutepidamente de un estado endoacutefito a un estado patogeacutenico y dada su faacutecil y alta distribucioacuten

representa un peligro en conjunto con el cambio climaacutetico para las especies de alta montantildea como

los frailejones y supone una amenaza para el balance hiacutedrico y ecosistemico en el futuro

El geacutenero Crassiparies de la familia Neohendersoniaceae y el geacutenero Massarina de la

familia Massarinaceae pertenecen al orden Pleosporales aunque se discute debido a las

similaridades morfoloacutegicas y genoacutemicas con Massarina si Crassiparies deberiacutea estar en la

familia Massarinaceae (Hyde et al 2013 4) Se tiene poca informacioacuten sobre la especie

Crassiparies quadrisporus por ende este puede ser uno de los primeros reportes de esta especie

en una especie de alta montantildea como lo es el frailejoacuten especiacuteficamente en la especie E

hartwegiana en un marco de cambio climaacutetico el geacutenero Crassiparies necesita mayores estudios

a nivel ecoloacutegico y microbioloacutegico para entender su papel dentro de esta crisis climaacutetica

Mientras tanto el geacutenero Massarina ha logrado ser aislado de agua dulce con el fin de

obtener fuentes de productos naturales bioloacutegicamente activos por medio de las investigaciones

quiacutemicas de Shearer (1999 2001) en una especie de Massarina obtuvieron como resultado el

aislamiento de tres nuevos sequiterpenoides y dos lactonas derivadas de policeacutetidos con nuevos

sistemas de anillos lo que indica que esta especie tambieacuten puede tener un rol importante

mediante la produccioacuten de enzimas y metabolitos secundarios en el marco de las invasiones

bioloacutegicas impulsadas por el cambio climaacutetico

54

El geacutenero Cryptocoryneum de la familia Cryptocoryneaceae existe poca informacioacuten de

sus mecanismos de accioacuten como endoacutefito o patoacutegeno maacutes aun en especies de los Andes

Tropicales este podriacutea ser uno de los primeros reportes sobre esta especie de hongo en una

especie de frailejoacuten especiacuteficamente E hartwegiana en el 2015 se reportoacute en Brasil el

descubrimiento de una nueva especie del genero Cryptocoryneum trataacutendose de Cryptocoryneum

parvulum hallada en las hojas de la especie Araucaria angustifolia (Gimnosperma) (Silva et al

2015 1) la informacioacuten sobre el geacutenero Cryptocoryneum en relacioacuten al cambio climaacutetico y sus

efectos dentro de especies de alta montantildea como el frailejoacuten auacuten son poco conocidas

Uno de los geacuteneros maacutes cercanos a los grupos externos del cladograma es Cyphellophora

perteneciente a la familia Cyphellophoraceae el cual posee un MPML de 10091 logrando una

hipoacutetesis evolutiva confiable Diversas especies de Cyphellophora han logrado ser aisladas de

infecciones superficiales de la piel o las untildeas en humanos y de materiales vegetales (Decock et

al 2003 Cheewangkoon et al 2009) Esto indica su amplia distribucioacuten y su capacidad para ser

patogeacutenica tanto en plantas como en animales maacutes aun en condiciones desfavorables para la

planta como son las condiciones de cambio climaacutetico

De la especie Cyphellophora reptans se tiene reporte que su morfologiacutea es muy similar a

la de una levadura por lo que es faacutecilmente confundida con una (Reacuteblovaacute et al 2013) Es posible

que este sea el uacutenico reporte de Cyphellophora reptans en las hojas de un frailejoacuten o especie de

alta montantildea que habite en los troacutepicos como E hartwegiana debido a ello sus mecanismos de

accioacuten en especies de paramo dentro de un marco de cambio climaacutetico es poco conocido Se

necesitan mayores estudios enfocados en esta especie para entender su ecologiacutea y dinamismo

ecoloacutegico respecto a los cambios en las variables ambientales

Se eligieron las especies Coprinellus domesticus y Coprinellus xanthothrix como grupos

externos con el fin de enraizar el aacuterbol debido a que pertenecen a la Divisioacuten Basidiomycota la

cual difiere en grado de la divisioacuten Ascomycota aunque conserva semejanzas conocidos como

caracteres ancestrales o plesiomorficos que avanzan a medida la filogenia se construye con los

datos de las diferentes secuencias de especies evidenciando novedades evolutivas conocidas

como apomorfias que cuando se dan en un grupo en particular pasan a ser sinapomorfias es decir

novedades evolutivas dentro de un grupo particular (Lehtonen 2020) Se optoacute por enraizar con

55

estas dos especies con el objetivo de dar robustez al aacuterbol filogeneacutetico (Barriel y 1998) lo cual se

consiguioacute como se nota en los estadiacutesticos del aacuterbol filogeneacutetico

56

57

Conclusiones

Se rechaza la hipoacutetesis nula (H0) y se concluye que la identificacioacuten y caracterizacioacuten

molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo Colombia es diferente en 80 de sus geacuteneros y

especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos realizadas en especies de frailejoacuten

Por lo tanto los nuevos geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos encontrados en el frailejoacuten

plantean nuevos desafiacuteos respecto al cambio climaacutetico ya que tienen un rol vital en la

supervivencia de estas especies de alta montantildea como los frailejones debido a su relacioacuten

mutualista o patoacutegena maacutes aun en los paacuteramos que son altamente sensibles a los efectos del

cambio climaacutetico incluso tan sensibles como las zonas polares (Bradley et al 2006)

La mayoriacutea de especies encontradas en el presente estudio tienen potencial para ayudar a

combatir el estreacutes abioacutetico producido por el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales

Especiacuteficamente pueden ayudar a combatir el estreacutes bioacutetico producido por virus hongos

bacterias e insectos en un marco de cambio climaacutetico aumentos de temperatura cambios en la

concentracioacuten de CO2 cambios en la precipitacioacuten migraciones tempranas cambios en la

nubosidad disponibilidad hiacutedrica alteraciones en la estructura y composicioacuten de las especies

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58

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Anexos

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombia

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia

hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

74

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

Coordenadas Geograacuteficas

(Latitud)

De la Colecta del

Material Bioloacutegico total de 15

muestras (Longitud)

LAT N 4deg 37 5871717 LONG W 75deg 25

3292611

LAT N 4deg 37 5885220 LONG W 75deg 25

3271217

LAT N 4deg 37 5884485 LONG W 75deg 25

3312103

LAT N 4deg 36 5995487 LONG W 75deg 27

3045854

LAT N 4deg 37 6195784 LONG W 75deg 30

3292611

LAT N 4deg 40 159171 LONG W 75deg 26

380142

LAT N 4deg 40 363762 LONG W 75deg 26

209072

LAT N 4deg 40 399832 LONG W 75deg 27

173554

LAT N 4deg 40 383965 LONG W 75deg 27

464325

LAT N 4deg 39 486438 LONG W 75deg 27

173559

LAT N 4deg 40 56894 LONG W 75deg 26

568287

LAT N 4deg 40 159174 LONG W 75deg 27

190654

LAT N 4deg 40 125083 LONG W 75deg 26

345912

LAT N 4deg 40 116691 LONG W 75deg 27

208264

LAT N 4deg 40 314698 LONG W 75deg 27

140791

75

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un estereoscopio con el propoacutesito de seleccionar la

maacutes indicada y luego sembrar un cultivo puro a partir de ese micelio

76

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados las

copias se conservaron con glicerol a -80degC en un ultra congelador de Thermo Scientifictrade

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas

y enviadas

77

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicos de forma segura y esteacuteril propiedad de la Universidad del Quindiacuteo

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a la Universidad Ruhr de Bochum (Alemania)

78

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de parsimonia

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X en donde se

observa en amarillo la secuencia umlTCATTAuml la cual es una secuencia altamente conservada

que se usa para marcar el inicio de la misma en hongos endoacutefitos

79

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa JmoldelTest usados para generar el

aacuterbol de relaciones filogeneacuteticas a partir de la regioacuten ITS de los hongos endoacutefitos aislados

total de modelos evaluados 88

ID Nombre Particioacuten lnL P AIC detaAIC Peso Cumpeso Udelta

1 JC 0 100820157 138 204400314 1341348 0 1 -

2 JC+I 0 98912511 139 200605022 9618188 0 1 -

3 JC+G 0 95470113 139 193720225 2733392 0 1 -

4 JC+I+G 0 95467507 140 193735014 274818 0 1 -

5 F81 0 100658095 141 204136189 13149356 0 1 -

6 F81+I 0 98761481 142 200362962 9376128 0 1 -

7 F81+G 0 95314814 142 193469628 2482794 0 1 -

8 F81+I+G 0 95324364 143 193508729 2521895 0 1 -

9 K80 10010 99734495 139 20224899 11262157 0 1 -

10 K80+I 10010 97835191 140 198470382 7483549 0 1 -

11 K80+G 10010 94227821 140 191255643 268809 0 1 -

12 K80+I+G 10010 94209963 141 191239926 253092 0 1 -

13 HKY 10010 99648091 142 202136181 11149348 0 1 -

14 HKY+I 10010 97761512 143 198383024 7396191 0 1 -

15 HKY+G 10010 94170799 143 191201599 214765 0 1 -

16 HKY+I+G 10010 94118678 144 191117357 130523 600E-04 0999 -

17 TrNef 10020 99564653 140 201929306 10942472 0 1 -

18 TrNef+I 10020 97712623 141 198245245 7258412 0 1 -

19 TrNef+G 10020 94150977 141 191121955 135121 400E-04 09994 -

20 TrNef+I+G 10020 94132131 142 191104263 117429 00011 09959 -

21 TrN 10020 99563809 143 201987618 11000784 0 1 -

22 TrN+I 10020 97702964 144 198285929 7299095 0 1 -

23 TrN+G 10020 94094235 144 191068469 81635 00065 09719 -

24 TrN+I+G 10020 94101378 145 191102757 115923 00012 09948 -

25 TPM1 12210 99713879 140 202227759 11240925 0 1 -

26 TPM1+I 12210 97826641 141 198473282 7486449 0 1 -

27 TPM1+G 12210 94249837 141 191319674 33284 0 1 -

28 TPM1+I+G 12210 942022 142 1912444 257566 0 1 -

29 TPM1uf 12210 99663473 143 202186945 11200112 0 1 -

30 TPM1uf+I 12210 97879458 144 198638917 7652083 0 1 -

31 TPM1uf+G 12210 94137349 144 191154699 167865 100E-04 09999 -

32 TPM1uf+I+G 12210 94141897 145 191183794 196961 0 1 -

80

33 TPM2 10212 99722544 140 202245087 11258254 0 1 -

34 TPM2+I 10212 97828213 141 198476426 7489592 0 1 -

35 TPM2+G 10212 94185859 141 191191718 204885 0 1 -

36 TPM2+I+G 10212 94153667 142 191147335 160501 100E-04 09998 -

37 TPM2uf 10212 99648091 143 202156182 11169348 0 1 -

38 TPM2uf+I 10212 97757018 144 198394035 7407202 0 1 -

39 TPM2uf+G 10212 941052 144 1910904 103566 00022 09904 -

40 TPM2uf+I+G 10212 9408801 145 19107602 89187 00044 0982 -

41 TPM3 12012 99768005 140 20233601 11349176 0 1 -

42 TPM3+I 12012 97958099 141 198736198 7749364 0 1 -

43 TPM3+G 12012 94227963 141 191275926 289093 0 1 -

44 TPM3+I+G 12012 94323885 142 191487769 500936 0 1 -

45 TPM3uf 12012 99625421 143 202110843 11124009 0 1 -

46 TPM3uf+I 12012 97770469 144 198420939 7434105 0 1 -

47 TPM3uf+G 12012 94165576 144 191211152 224319 0 1 -

48 TPM3uf+I+G 12012 94150861 145 191201721 214888 0 1 -

49 TIM1ef 12230 99592239 141 202004478 11017644 0 1 -

50 TIM1ef+I 12230 97822787 142 198485574 749874 0 1 -

51 TIM1ef+G 12230 94121043 142 191082087 95253 00033 09853 -

52 TIM1ef+I+G 12230 94122386 143 191104772 117939 00011 09969 -

53 TIM1 12230 99518653 144 201917306 10930473 0 1 -

54 TIM1+I 12230 9781156 145 19852312 7536286 0 1 -

55 TIM1+G 12230 94105198 145 191110396 123562 800E-04 09977 -

56 TIM1+I+G 12230 94087158 146 191094317 107483 00018 09922 -

57 TIM2ef 10232 99550617 141 201921233 109344 0 1 -

58 TIM2ef+I 10232 97704602 142 198249204 726237 0 1 -

59 TIM2ef+G 10232 94093484 142 191026968 40135 00516 0852 -

60 TIM2ef+I+G 10232 94073864 143 191007729 20895 0135 07169 -

61 TIM2 10232 99530022 144 201940044 1095321 0 1 -

62 TIM2+I 10232 97820158 145 198540315 7553482 0 1 -

63 TIM2+G 10232 94058678 145 191017356 30523 00834 08004 -

64 TIM2+I+G 10232 94060837 146 191041674 54841 00247 09248 -

65 TIM3ef 12032 99546286 141 201912572 10925739 0 1 -

66 TIM3ef+I 12032 97713931 142 198267862 7281028 0 1 -

67 TIM3ef+G 12032 94129376 142 191098753 111919 00014 09936 -

68 TIM3ef+I+G 12032 94112005 143 191084009 97176 0003 09883 -

69 TIM3 12032 99514376 144 201908751 10921918 0 1 -

70 TIM3+I 12032 97700023 145 198300047 7313213 0 1 -

71 TIM3+G 12032 94115323 145 191130646 143812 300E-04 09997 -

72 TIM3+I+G 12032 94096941 146 191113882 127048 700E-04 09984 -

73 TVMef 12314 9970418 142 20224836 11261526 0 1 -

74 TVMef+I 12314 97940598 143 198741196 7754363 0 1 -

81

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE (AIC)

75 TVMef+G 12314 94159829 143 191179657 192824 0 09999 -

76 TVMef+I+G 12314 94160993 144 191201987 215153 0 1 -

77 TVM 12314 99615991 145 202131982 11145148 0 1 -

78 TVM+I 12314 97746676 146 198413353 7426519 0 1 -

79 TVM+G 12314 94075503 146 191071005 84171 00057 09776 -

80 TVM+I+G 12314 94052588 147 191045176 58342 00208 09456 -

81 SYM 12345 99543166 143 201946331 10959498 0 1 -

82 SYM+I 12345 97757103 144 198394207 7407373 0 1 -

83 SYM+G 12345 94083056 144 191046112 59278 00198 09654 -

84 SYM+I+G 12345 94050035 145 19100007 13236 0198 05819 -

85 GTR 12345 99529525 146 20197905 10992217 0 1 -

86 GTR+I 12345 97686178 147 198312356 7325522 0 1 -

87 GTR+G 12345 94044194 147 191028387 41553 00481 09001 -

88 GTR+I+G 12345 94013417 148 190986834 0 03839 03839 -

8

9

Agradecimientos

Estos agradecimientos van dedicados para Ecuador que me brindoacute la oportunidad

poder estudiar una maestriacutea a mi tutor por aceptarme y acompantildearme en este proceso a

mi familia por creer en miacute y en los sacrificios que hice para irme a vivir a otro paiacutes solo y

sin dinero para poder umlsalir adelanteuml como decimos en Colombia a mi compantildeera

sentimental por siempre guiarme hacia el camino correcto disciplina compromiso y

entrega a la universidad Andina Simoacuten Boliacutevar por aceptarme en sus aulas de clase y

por ultimo a la Universidad del Quindiacuteo por abrirle la puerta a uno de sus egresados y

acogerlo de buena forma con sus instalaciones de laboratorio

Gracias y mil gracias a todos de corazoacuten sin duda esta experiencia cambio mi

vida en todos los sentidos

Desde hoy hasta el final que podriacutea llamarse infinito

10

11

Tabla de contenidos

Figuras mapas y tablashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13

Introduccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 15

Capiacutetulo primero Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

1 Antecedenteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

2 Justificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 25

3 Hipoacutetesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 26

4 Objetivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

41 Objetivo generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

42 Objetivos especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

Capiacutetulo segundo Materiales Meacutetodos y Resultadoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

1 Aacuterea de Estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

2 Colecta de material bioloacutegicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos

endoacutefitos)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32

5 Extraccioacuten de ADNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

7 Secuenciamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

8 Anaacutelisis Filogeneacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

Capiacutetulo Tercero Discusioacuten sobre los hongos endoacutefitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidadhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio

Climaacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42

Conclusioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 57

Obras citadashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 59

Anexoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 73

12

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphellip 73

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia 73

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphelliphellip74

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana 75

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un

estereoscopio 75

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 76

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas y

enviadas 76

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 75

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a Alemania a la Universidad Ruhr de

Bochum 77

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de

parsimoniahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 78

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X 78

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa

JmoldelTest 79

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE

(AIC) 81

13

Figuras mapas y tablas

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo

Colombiahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras

N necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefitohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y

abioacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en

medio de cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelialhelliphelliphellip 30

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la

teacutecnica de corte de hifa uacutenica helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de

cultivo Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12)

aislados de las hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana 31-32

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 10 Filograma obtenido a partir del anaacutelisis ML y MP del conjunto de datos ITS Aislados

de las hojas de frailejoacuten37

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip43

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e

Hypocreahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip46

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon48

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon

Biscogniauxia Nemania y Humiacutecolahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

14

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies

Massarina Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona

muestreadahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia 29-30

Tabla 2 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos

endoacutefitos en la especie Espeletia hartwegiana

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36

Tabla 3 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = presencia del genero

de hongo dentro de la especie de frailejoacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42-43

15

Introduccioacuten

Hay un libro abierto siempre para

todos los ojos la naturaleza

(Jean-Jacques Rousseau 1712-1778)

El cambio climaacutetico corresponde a un fenoacutemeno que afecta el planeta de manera natural

permitiendo mantener las condiciones climaacuteticas como la temperatura la precipitacioacuten entre

otras en un rango aceptable para la vida (Jimeacutenez 2010) Sin embargo dado el aumento de las

emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) principalmente asociado a las actividades

humanas y el alto consumo de combustibles foacutesiles los cambios en dichas condiciones han sido

alterados dando paso a un acelerado aumento de temperatura anual en las uacuteltimas deacutecadas con

precipitaciones y sequias maacutes frecuentes e intensas (IPCC 2020 5 Jimeacutenez 2010)

Acorde con el Panel Intergubernamental de Expertos en Cambio Climaacutetico (IPCC) para

fin de siglo el Cambio Climaacutetico se acrecentaraacute pronosticando un aumento de temperatura de 25

a 45 degC para el antildeo 2100 que tan solo para Colombia en los uacuteltimos 30 antildeos fue de 08degC

generando impactos notorios en las zonas de alta montantildea como los paacuteramos (Moreno y Palma

2016)

El cambio climaacutetico es un fenoacutemeno cuyos efectos alcanzaraacuten los paacuteramos los cuales son

ecosistemas de alta montantildea presente en elevaciones entre 3100 y 4700 m ubicados en el norte de

los Andes de Ameacuterica del Sur y el sur de Ameacuterica Central adyacente (Berdugo et al 2016) Estas

aacutereas se caracterizan por una vegetacioacuten principalmente endeacutemica compuesta por frailejones

matorrales y pastos (veacutease figura 1) (Garciacutea et al 2010)

Los ecosistemas de alta montantildea como los paacuteramos ofrecen diversos servicios

ambientales como la biodiversidad uacutenica que albergan los paisajes los suelos y su capacidad de

retener y almacenar agua (Morales et al 2019) Las formaciones vegetales juegan un papel

diferenciado en el mantenimiento de la humedad y las fuentes de agua en el ecosistema

presentando la capacidad de interceptar almacenar y regular los flujos hiacutedricos superficiales y

16

subterraacuteneos aportando los servicios de abastecimiento de agua para el 70 de la poblacioacuten de

Colombia (Vaacutesquez y Buitrago 2017)

Ademaacutes dada la caracteriacutestica de permanente humedad de su suelo la materia orgaacutenica

se descompone a menor velocidad logrando un efecto de retencioacuten y almacenamiento de carbono

(Anderson et al 2012) En Colombia se han realizado diferentes estudios sobre la distribucioacuten y

extensioacuten del ecosistema paramuno Rangel (2002 4) determinoacute que los paacuteramos colombianos

abarcaban aproximadamente el 26 de la superficie del paiacutes

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramos por Pedraza-Pentildealosa Betancur y Franco-Rosselli (2005)

En particular el paacuteramo Romerales se encuentra dentro del territorio adscrito a los

Parques Nacionales Naturales (PNN) especiacuteficamente el PNN de los Nevados en la cordillera

central colombiana hacia la zona norte del Departamento del Quindiacuteo con liacutemites fronterizos

entre los departamentos de Risaralda y Tolima Este paacuteramo es el hogar del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana el cual estaacute afrontando los efectos del cambio climaacutetico (veacutease mapa 1)

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona muestreada

17

Existe evidencia cientiacutefica concreta del aumento de temperatura en los Andes Tropicales

tambieacuten cambios significativos en los patrones de precipitacioacuten sumado a la disminucioacuten en la

incidencia del clima nublado lo que conduce a las plantas a mayor cantidad de horas expuestas a

la radiacioacuten solar (Ruiz et al 2009) Otro efecto grave que trae consigo el cambio climaacutetico es el

desplazamiento de especies en el gradiente altitudinal Con un aumento de 3degC se espera que las

especies se muevan ~600 m en buacutesqueda de su optimo teacutermico esto afectariacutea gravemente las

especies de paacuteramo como los frailejones Cuesta Camacho (2007)

Los frailejones son emblemaacuteticas plantas de paacuteramo y ecosistemas de alta montantildea

(MINAMBIENTE 2019) Pertenecen a la familia Asteraceae contiene cerca de 142 especies

agrupadas en ocho geacuteneros Carramboa Coespeletia Espeletia Espeletiopsis Libanothamnus

Paramiflos Ruilopezia y Tamania de estos los maacutes importantes y con mayor diversidad de

especies son Espeletia Espeletiopsis y Libanothamnus (Rivera y Torres 2001)

Poseen adaptaciones que les permite captar y retener grandes cantidades de agua de su

entorno permitiendo un balance ecosistemico (Farias 2013) La morfologiacutea singular del genero

Espeletia le permite acumular las hojas antiguas en forma de ldquoabrigordquo brindando proteccioacuten

contra las bajas temperaturas nocturnas de hasta 0degC Los fuertes vientos y la radiacioacuten solar los

cuales seraacuten cada vez maacutes intensos y frecuentes por causa del cambio climaacutetico (Cortes y

Sarmiento 2013 34) (veacutease figura 2)

Estas plantas son especies claves para la conservacioacuten de los paacuteramos y la lucha contra el

cambio climaacutetico debido a que ofrecen una gran variedad de servicios ecosisteacutemicos (Diacuteaz et al

2007) El paacuteramo es referente sin igual de fuente hiacutedrica ciudades como Bogotaacute y Quito obtienen

aproximadamente el 80 de su agua dulce de los paacuteramos (Buytaert et al 2006) Los frailejones

en su mayoriacutea endeacutemicos se han visto afectados por actividades humanas como la ganaderiacutea

extensiva agricultura (cultivos de papa y cebolla) mineriacutea de oro y carboacuten turismo no

controlado y quemas intencionales (Hofstede 2000) Esta situacioacuten podriacutea comprometer a

mediano y largo plazo la funcioacuten de captacioacuten regulacioacuten y suministro del agua para el consumo

18

en las ciudades colombianas ubicadas en las regiones de influencia de estos ecosistemas (Varela

2015)

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

No obstante en asociacioacuten con especies como el frailejoacuten de los Andes Tropicales

encontramos a los hongos cuyos roles en las interacciones bioloacutegicas son de vital importancia

Los hongos pueden ser endoacutefitos simbiontes mutualistas paraacutesitos y comensales y son capaces

de responder a las amenazas que plantea el cambio climaacutetico en cuanto a perturbaciones

ambientales aumento de temperatura y estreacutes hiacutedrico adaptaacutendose a la disponibilidad de recursos

modificando sus actividades enzimaacuteticas e incluso su genoma a lo largo del tiempo (Moreno et

al 2013)

Los hongos son clasificados seguacuten su forma de reproduccioacuten sea sexual o asexual en

donde se observan las diferencias estructurales internas entre los diferentes grupos tales como

sus esporas e hifas como lo indican Blackwell y Spatafora (2004) estos organismos estaacuten

divididos en cuatro grandes grupos los cuales son Ascomycota Basidiomycota

Chytridiomycota Zygomycota es justo en el grupo de los Ascomycota donde se encuentra gran

diversidad de hongos conocidos como ldquohongos endoacutefitosrdquo en donde su nombre ldquoendoacutefitordquo

significa ldquodentro de la plantardquo (endon dentro phyton planta)

19

Estos microorganismos fuacutengicos tienen la facilidad de pasar gran parte o todo su ciclo de

vida invadiendo los tejidos de su hospedero (planta) sin tener un efecto negativo evidente

(Leacuteveilleacute 1846 3 de Bary 1866 8) Por lo tanto el concepto de endoacutefito indica una asociacioacuten de

costo-beneficio pero de una forma mutualista entre el hongo y la planta hospedera permitiendo

la estadiacutea en sus tejidos vivos (Clay 1998 8) Los hongos endoacutefitos se han encontrado en todas

las plantas (algas musgos pastos plantas y vasculares) desde los bosques templados hasta los

bosques tropicales hallaacutendose una gran diversidad de plantas y en asociacioacuten gran diversidad de

hongos endoacutefitos (Saacutenchez et al 2010)

Se espera que los hongos endoacutefitos jueguen un papel cada vez maacutes importante potenciado

por el cambio climaacutetico en las enfermedades producidas en plantas como pudricioacuten radicular

mal blanco entre otras con los aumentos pronosticados de la temperatura y el estreacutes por sequiacutea

asociados al cambio climaacutetico (Desprez-Loustau et al 2006 Slippers y Wingfield 2007 6) Los

cambios en la cantidad de dioacutexido de carbono (CO2) y la disponibilidad de nitroacutegeno en el suelo

afectan de forma similar tanto a las plantas como a los hongos por ende las alteraciones

generadas por parte del cambio climaacutetico pueden causar desbalances en sus relaciones (Ies et al

2013)

Algunos estudios realizados en el antildeo 1898 donde se registraron los primeros hongos

endoacutefitos como el de Bary (1866) brindo la iniciativa de investigaciones que lograron explicar

los cuadros toxicoloacutegicos observados en animales los cuales se daban por el consumo de

semillas o en aacutereas de pastos (Poaceae) que posiblemente albergaban hongos Clavicipitaacuteceos

(familia del ergot) los cuales poseiacutean actividades enzimaacuteticas con micotoxinas

Por diversas situaciones no trascendioacute la investigacioacuten hasta que Bacon (1977) hizo

relacioacuten del hongo endoacutefito Neotyphodium coenophialum debido a una intoxicacioacuten del ganado

llamado ldquosiacutendrome de veranordquo cuando estos animales consumiacutean pastos de la especie Festuca

arundinacea (Poaceae) Funk en el antildeo 80 caracterizoacute la resistencia de las Poaceae que

albergaban hongos endoacutefitos que frecuentemente eran atacados por insectos (proteccioacuten contra

herbiacutevoros) (Saacutenchez et al 2010)

Compant y colaboradores (2010) mencionaron que tras experimentar en el laboratorio

con una gama de temperaturas en los hongos endoacutefitos aislados obtuvieron resultados variables

respecto al crecimiento es decir positivos y neutrales llegando a la conclusioacuten de que los

microorganismos asociados a las plantas son un factor importante que influye en la respuesta de

20

las plantas acorde a los cambios de temperatura lo que compromete las respuestas del frailejoacuten y

los hongos endoacutefitos frente al calentamiento global causado por el cambio climaacutetico

Con relacioacuten a los estudios realizados sobre hongos endoacutefitos en frailejones se han

encontrado al menos 100 especies con capacidades de inhibir hongos fitopatoacutegenos o herbivoriacutea

(Cabezas et al 2012)

Los geacuteneros de hongos endoacutefitos encontrados en anteriores estudios son Acremonium

Aspergillus Aureobasidium Colletotrichum Fusarium Gliocadium Nigrospora Paecilomyces

Penicillium Trichothecium Trichoderma y Sordaria (Pineda 2000 Programa Nacional para la

Evaluacioacuten del Estado y Afectacioacuten de los Frailejones en los Paacuteramos de Andes del Norte 2009)

Teniendo en cuenta que para Colombia hay poca informacioacuten sobre hongos endoacutefitos en

ecosistemas paramunos se hace fundamental la ampliacioacuten de maacutes informacioacuten referente al tema

debido a que solo existen estudios significativos en cafeacute leguminosas y rosas los cuales maacutes allaacute

de la identificacioacuten de geacuteneros de hongos endoacutefitos no incluyen el cambio climaacutetico y sus

posibles consecuencias (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016) En

teacuterminos filogeneacuteticos los hongos son el reino de la naturaleza maacutes cercano a los animales

(Hibbett et al 2018)

Las relaciones que posean las diferentes especies de endoacutefitos dentro de la especie de

frailejoacuten es de importancia conocerla mediante el uso de la filogenia molecular (Judd et al 2007)

mediante secuencias de ADN ARN o proteiacutenas (Cooke et al 2000) Dependiendo de la presencia

de especies agresivas de endoacutefitos como Nigrospora se puede tener un mejor conocimiento

sobre las consecuencias que trae consigo los impactos del cambio climaacutetico sobre estas plantas de

los Andes Tropicales (Foden et al 2009)

21

Capiacutetulo primero

Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitos

1 Antecedentes

Desde los estudios realizados por Leacuteveilleacute (1846) y Bary (1866) sobre hongos Endoacutefitos

en pastos de zonas templadas se ha logrado identificar que estos hongos son capaces de inducir

respuestas adaptativas a sus hospederos (Micotoxinas contra herbiacutevora adaptacioacuten a heladas o

climas extremos fijacioacuten de nutrientes) a cambio de alimento y hospedaje formando una relacioacuten

mutualista en la cual las dos especies involucradas son beneficiadas No obstante se ha reportado

que los hongos endoacutefitos ademaacutes de tener relaciones mutualistas con diferentes especies

vegetales se pueden tornar en especies patoacutegenas para su hospedero una vez la planta se

encuentra en condiciones desventajosas tornaacutendose asiacute el hongo endoacutefito en un hongo

fitopatoacutegeno (Herrera y Ulloa 1990 550)

Como se mencionoacute anteriormente los hongos endoacutefitos pueden pasar de un estado

mutualista a un estado de patogeacutenesis dada esta relacioacuten entre ambos organismos se producen

metabolitos secundarios potencialmente toacutexicos facilitando factores de virulencia dados por el

hongo endoacutefito como exoenzimas y metabolitos fitotoacutexicos a su vez la planta presenta defensas

tanto mecaacutenicas como bioquiacutemicas (Saacutenchez et al 2013 5)

Hasta la fecha los principales estudios de hongos endoacutefitos se han fijado en especies de

intereacutes econoacutemico y comercial tales como palma de aceite cafeacute leguminosas pastos de forrajeoacute

y diferentes tipos de rosas (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016)

Las especies modelo para el estudio de los hongos endoacutefitos han sido las gramiacuteneas

forrajeras en donde se han reportado especies de endoacutefitos asociados a los geacuteneros Lolium

Festuca y Brachiaria (Siegel et al 1987) no obstante Otero y Bayman (2009) han reportado un

creciente nuacutemero de estudios en orquiacutedeas epifitas tropicales relaciones con hongos micorrizicos

22

Actualmente existen escasos reportes de hongos endoacutefitos asociados a ecosistemas con

climas extremos (temperaturas extremas) como aacuterticos desiertos paacuteramos y zonas alpinas

especialmente para zonas de temperaturas friacuteas como lo son los paacuteramos (Lopera et al 2008

Leung et al 2011 Cabezas et al 2012 Miles et al 2012 Zhang y Yao 2015)

Investigadores como Lopera Leung y colaboradores (2011) han llegado a la conclusioacuten

de que los hongos endoacutefitos juegan un papel importante en las plantas a la hora de adaptarse a

ecosistemas de clima templado (Kivlin et al 2013 Zhang y Yao 2015)

En Colombia los trabajos con hongos endoacutefitos son pocos por ende trabajos como el de

Lopera y colaboradores (2008) con especies del genero Espeletia de los paacuteramos Colombianos

son pioneros ademaacutes del trabajo de Cabezas y colaboradores (2012 4) en el cual aislaron y

caracterizaron celulasas (enzimas descomponedores de la celulosa) extraiacutedas de hongos endoacutefitos

que se hallaban en especies de Espeletia posteriormente Lopera y Miles (2012) unieron

esfuerzos para continuar caracterizando la diversidad de hongos endoacutefitos en los paacuteramos andinos

colombianos enfocados en Espeletia con el objetivo de encontrar especies con potencial

biocontrolador

Existen trabajos tesis en los repositorios de diversas universidades de los antildeos 2014 y

2015 en los cuales se aborda el tema de los hongos endoacutefitos paacuteramos y especies de Espeletia

(frailejones) y de la familia Poaceae en donde se caracterizan las diversas especies de hongos

endoacutefitos por medio taxonomiacutea y biologiacutea molecular ademaacutes de buscar metabolitos secundarios

con fines medicinales o de biocontrol

Los trabajos en filogenia molecular de hongos endoacutefitos realizados en frailejones se han

visto enfocados maacutes hacia la buacutesqueda de la diversidad funcional en comunidades

microbioloacutegicas como por ejemplo el estudio realizado por Ruiz y colaboradores (2015) en

donde buscaron mediante el anaacutelisis molecular de raiacuteces necromasa hojas maduras y joacutevenes de

diferentes especies de Espeletia (veacutease figura 3) ubicada en los Andes neotroacutepicales

colombianos secuencias geneacuteticas de las regiones V5-V6 de la unidad 16S del rARN

23

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras N

necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefito Tomado de Ruiz y colaboradores (2015)

Este estudio analizoacute la composicioacuten de comunidades microbioanas y su diversidad

funcional en un ecosistema de alta montantildea en donde las temperaturas los rayos UV y la altura

juegan papeles determinantes como filtros ecoloacutegicos severos en donde solo pueden existir

especies que han desarrollado capacidades para adaptarse sobrevivir y colonizar dichas aacutereas

por ende cuando se analizaron las comunidades existentes dentro de estas especies de Espeletia

Encontraron que algunas especies halladas podriacutean tener roles importantes como

productores de metabolitos secundarios enzimas o incluso como bioremediadores y que las

comunidades microbianas eran diferentes tanto en sus hojas como en sus raiacuteces y en la

necromasa

A medida que las deacutecadas avanzan y la evidencia sobre el cambio climaacutetico se hace maacutes

robusta y evidente los estudios en los hongos endoacutefitos han tomado vital importancia al estar

asociados con cultivos de especies comestibles escases de agua y de tierras productivas sumado

a los efectos negativos que trae consigo el cambio climaacutetico para las diferentes plantaciones y

cosechas a nivel global

Es por eso que Lu Yan y colaboradores (2019) analizaron los efectos positivos que teniacutean

la colonizacioacuten de hongos endoacutefitos en las plantas en donde ratificaron que los hongos endoacutefitos

dentro la planta generan metabolitos antimicrobianos estimulan las respuestas inmunoloacutegicas y

compiten por espacio dentro de la planta con diferentes patoacutegenos incrementando asiacute la

resistencia contra herbiacutevoros y la resistencia al estreacutes salino (factores bioacuteticos)

Ademaacutes de ayudar a la planta contra el estreacutes abioacutetico causado principalmente por

factores climaacuteticos como la falta de agua (estreacutes hiacutedrico) las temperaturas extremas la

intensidad de los rayos UV y los metales pesados como la muestra la figura 4 debido a esto se

24

concluyoacute que las fitohormonas cumplen un papel importante en la colonizacioacuten de hongos

endoacutefitos dentro de la planta

Aun que se ha reportado que los hongos endoacutefitos se pueden usar como biocontroladores

diferentes estudios reportan que el uso de hongos endoacutefitos puede tener efectos adversos como

un retraso significativo en el crecimiento de la planta con el uso de la especie Cryptosporiopsis

sp (Terhonen et al 2016) Otro reporte indica la fecundidad y supervivencia de enemigos

naturales como paraacutesitos esto es debido a que los hongos endoacutefitos transfieren sus toxinas y

alcaloides cuando son ingeridos por paraacutesitos u otros enemigos naturales de las plantas (Lopez y

Sword 2015)

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y abioacutetico

Bajo estreacutes bioacutetico (herbiacutevoros y patoacutegenos) y abioacutetico (sequiacutea salinidad metales pesados y otros) (a) se

inducen respuestas de defensa de las plantas (b) los endoacutefitos producen metabolitos protectores y

modulan la viacutea de las fitohormonas para mejorar la inmunidad de las plantas (c) tomada de Lu yan y

colaboradores (2019 7)

25

2 Justificacioacuten

La presente investigacioacuten pretende identificar y caracterizar que especies de hongos

endoacutefitos estaacuten asociadas al frailejoacuten Espeletia hartwegiana y que posibles implicaciones podriacutea

tener que estas especies se encuentren dentro de esta especie de alta montantildea La importancia de

conocer esta informacioacuten reside en que los hongos endoacutefitos pueden beneficiar o perjudicar a la

adaptacioacuten y resistencia de especies vegetales en los distintos escenarios climaacuteticos propuestos

por la ciencia (IPCC 2020)

El calentamiento global podriacutea afectar el equilibrio de los hongos endoacutefitos en especies

vegetales generando desbalances en la planta o la peacuterdida de especies endoacutefitas de importancia

biotecnoloacutegica Por ejemplo se podriacutean perder especies endoacutefitas con potencial para control

bioloacutegico de plagas y enfermedades de plantas como productores de enzimas y metabolitos

secundarios degradacioacuten de plaacutesticos o biorremediacioacuten entre otros (Schulz et al 2002) Por

ello se hace fundamental estudiar los hongos endoacutefitos en ecosistemas de paacuteramo ya que en

Colombia y en los paacuteramos en general han sido poco estudiados y su efecto sobre las plantas de

alta montantildea podriacutea ser clave en el mantenimiento de sus poblaciones

26

3 Hipoacutetesis

H1 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute diferente en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo diferentes los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten tambieacuten seria

modificada

H0 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute similar en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo similares los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten continuariacutean

como se ha registrado con anterioridad

27

4 Objetivos

41 Objetivo general

Caracterizar la diversidad de hongos endoacutefitos presentes en los frailejones

de la especie Espeletia hartwegiana en el paacuteramo de Romerales tomando en cuenta su

relacioacuten con el cambio climaacutetico

42 Objetivos especiacuteficos

Identificar los hongos endoacutefitos asociados en Espeletia hartwegiana del

paacuteramo de Romerales

Hallar relaciones filogeneacuteticas entre las diferentes especies de hongos

Endoacutefitos encontradas en Espeletia hartwegiana

Advertir las repercusiones del cambio climaacutetico sobre Espeletia

hartwegiana en base a su diversidad de hongos endoacutefitos

28

29

Capiacutetulo segundo

Materiales Meacutetodos y Resultados

1 Aacuterea de Estudio

El trabajo se realizoacute en el paacuteramo de Romerales ubicado en la zona alta del municipio de

Salento Quindiacuteo (4deg39202N 75deg25506W) con una extensioacuten aproximada de 6794 ha (Cano

et al 2015)

2 Colecta de material bioloacutegico

La colecta del material bioloacutegico se realizoacute mediante muestreos aleatorios lo largo del

paacuteramo tomando coordenadas de cada punto de colecta (veacutease anexo 3) las hojas se colectaron

por medio de tijeras podadoras siendo empacadas cada una en bolsas Ziploc diferentes se

colectoacute un total de 15 hojas cada una correspondiente a una planta de frailejoacuten para un total de

15 plantas muestreadas de E hartwegiana

Adicionalmente las bolsas Ziploc fueron marcadas con los datos de colecta en campo y

transportadas a los laboratorios del Programa de Biologiacutea de la Universidad del Quindiacuteo para su

procesamiento

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetales

Las muestras obtenidas fueron lavadas con agua para eliminar el exceso de residuos se

cortaron 4 trozos de cada hoja con un tamantildeo aproximado de 05 a 10 cm (veacutease figura 5) luego

cada trozo de hoja se sometioacute a una esterilizacioacuten la cual se completoacute con algunas modificaciones

acorde al procedimiento descrito por (Osorio et al 2017) especiacutefico para el aislamiento de

30

hongos endoacutefitos que consiste en sumergir perioacutedicamente el material vegetal en etanol al 90

durante un minuto seguido de hipoclorito de sodio (NaClO) al 4 por un minuto continuando

con etanol al 70 durante un minuto y por uacuteltimo se lavaraacuten con agua destilada todo dentro de la

campana de flujo

Las cuatro secciones de hoja se transfirieron a una caja de Petri para un total de 15 cajas

de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA) (una caja de Petri por cada 4 cortes de hoja)

Posteriormente las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente (25degC aproximadamente)

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en medio de

cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelial caja de Petri de 20ml de capacidad

Pasadas 3 semanas se revisaron los cultivos fuacutengicos con el fin de revisar el crecimiento

del micelio y hacer un repique a un cultivo puro una vez maduros se procedioacute a utilizar la teacutecnica

de corte de hifa uacutenica (Osorio et al 2017) esta teacutecnica consistioacute en tomar la punta de la hifa con

ayuda de un estereoscopio y un bisturiacute de grado quiruacutergico agua destilada alcohol al 70 y un

mechero para mantener el bisturiacute esterilizado una vez identificada la hifa ideal para cultivar de

forma pura (veacutease figura 6) con el bisturiacute se procedioacute a cortar el agar PDA en forma de cuadro

con una medida aproximada de 3 miliacutemetros cuadrados

31

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la teacutecnica de

corte de hifa uacutenica

Se esperoacute entre 3 a 5 semanas a que crecieran los cultivos puros aislados de las hifas uacutenicas en

nuevas cajas de Petri con agar PDA

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos endoacutefitos)

Los hongos cultivados de forma pura consiguieron un crecimiento micelial significativo a partir

de los 15 diacuteas a temperatura ambiente como lo demuestra la figura 7 que contiene doce de los

cultivos maacutes representativos con su respectivos micelios aeacutereos desarrollados donde variacutean sus

colores formas y consistencias esto indicando que pertenecen a diferentes especies

2

1

3

32

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de cultivo

Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12) aislados de las

hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

5 Extraccioacuten de ADN

4

5

6

7

8

9

10

11

12

33

Una vez el micelio de los hongos se encontraba desarrollado en la cantidad necesaria se

procedioacute a extraer el ADN genoacutemico siguiendo el protocolo de extraccioacuten de Raeder y Broda

(1985) por medio de un barrido superficial del micelio evitando tomar el agar este micelio

posteriormente se colocoacute en tubos Eppendorf esteacuteriles de 2 ml y se pulverizoacute mediante el uso de

un asa microbioloacutegica y 1ml de buffer de extraccioacuten compuesto de Tris-HCL 1 M pH 78 EDTA

05 M Ph 8 SDS 10 wv NaCL y agua destilada para cada tubo a continuacioacuten se agregoacute 800

ul de etanol al 70 500 ul de fenol y se mezcloacute

Se adicionoacute 300 ul de cloroformo y se mezcloacute de nuevo de alliacute se llevoacute a la centrifuga a

10000 rpm por 60 minutos luego de centrifugar se forma un sobrenadante el cual es transferido

en su totalidad a un nuevo tuvo Eppendorf de 15 ml en el cual se agregaron 400 ul de cloroformo

y se llevoacute a la centrifuga a 10000 rpm por 10 minutos en donde nuevamente se forma un

sobrenadante aunque esta vez solo se toman 500 ul del tubo para ser transferidos otro tubo

Eppendorf de 15 ml ya en el nuevo tubo se adicionaron 50 ul de NaAC y se invirtioacute varias veces

para homogenizar la mezcla a continuacioacuten se guardoacute en el refrigerador a 4degC toda la noche

Al diacutea siguiente se tomaron las muestras en los tubos Eppendorf y se centrifugaron a

10000 rpm por 30 minutos (Formacioacuten del Pellet de ADN) cuando la centrifuga terminoacute se

procedioacute a remover el etanol ya sin etanol se agregoacute de nuevo 1 ml de etanol al 70 a cada tubo

y se centrifugoacute a 10000 rpm por 5 minutos en este paso se removioacute el etanol y se dejoacute secar el

pellet de ADN una vez el etanol se evaporoacute se re suspendioacute el pellet en 100 ul de agua grado

molecular o Sabax con 5 ul de RNAsa con el fin de evitar la presencia de moleacuteculas de ARN

posteriormente se incubaron a 37degC por 30 minutos y se guardaron para su envioacute a -20degC

(Raeder y Broda 1985)

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengica

Una vez se secuenciaron las muestras de ADN enviadas a la Universidad Ruhr de

Bochum Alemania se hizo el ensamblaje de las secuencias en contigs y scaffolds en el

programa CLC Main Workbench 8 (Nicola et al 2013) Como lo muestra la figura 8 donde se

muestran los pasos esenciales de una teacutecnica de Metagenoacutemica donde posteriormente se

analizaron con maacutes detalle mediante teacutecnicas filogeneacuteticas

34

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemico Fuente Thomas y colaboradores (2012)

7 Secuenciamiento

Se extrajoacute con eacutexito un total de 35 muestras de hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

Espeletia hartwegiana (veacutease figura 9) que posteriormente fueron secuenciadas por la

Universidad Ruhr de Bochum (Alemania) logrando un total de 70 secuencias incluyendo

aquellas obtenidas en Genk Bank

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de frailejoacuten

Espeletia hartwegiana

35

8 Anaacutelisis Filogeneacutetico

Se aislaron 35 secuencias basadas en la especie Espeletia hartwegiana fueron

comparadas posteriormente con 35 secuencias de especies publicados en GenBank

(httpblastncbinihgovblastcgi) se obtuvo un total de 70 secuencias Las secuencias de

consenso ITS 58S DNA obtenidas se usaron para realizar buacutesquedas BLAST en GenBank

usando BLASTn (Altschul et al 1990) con el fin de identificar mediante las secuencias aisladas

los geacuteneros o las especies maacutes cercanas La matriz de datos fue alineada en MAFFT v7 (Katoh y

Standley 2013) Se utilizaron las especies Coprinellus xanthothrix y Coprinellus domesticus

como grupos externos

Los anaacutelisis de las secuencias para construir los arboles filogeneacuteticos de Maacutexima

Parsimonia (MP) fueron realizados usando PAUP v40b10 (Swofford 2003) Para el anaacutelisis de

Maacutexima Verosimilitud o ML por sus siglas en ingleacutes (Maximum Likelihood) se utilizoacute

JmodelTest (Darriba et al 2012) con el cual se infirieron los criterios del modelo de sustitucioacuten

apropiado utilizando los criterios de informacioacuten de Akaike (AIC) (Akaike 1974)

Los anaacutelisis de ML se realizaron con el programa PhyML v 30 (Guindon y Gascuel

2003) teniendo en cuenta la proporcioacuten de sitios invariables Los valores de soporte de confianza

para los nodos se estimaron mediante 1000 anaacutelisis de arranque de replicacioacuten La alineacioacuten de

los datos de la secuencias de ITS para 70 aislamientos determinoacute quince geacuteneros siendo los

siguientes Annulohypoxylon Biscogniauxia Colletotrichum Crassiparies Cryptocoryneum

Cyphellophora Diaporthe Daldinia Humiacutecola Hypoxylon Hypocrea Nemania Nigrospora

Massarina y Trichoderma de los cuales se obtuvieron 11 clados principales (veacutease figura 10)

Con base en estos resultados todos los aislamientos se analizaron maacutes a fondo dentro de los

geacuteneros hasta llegar a especie (veacutease tabla 1)

36

Geacuteneros Especie Especie Especie Especie Especie Especie Especie

Annulohypoxylon A nitens A bahnphaden

gense

Biscogniauxia B petrensis

Colletotrichum C gloeosporioides

C gigasporum

Cyphellophora C

reptans

Crassiparies C quadrisporus

Cryptocoryneum C

longicondensatum

Daldinia D dennisii D

eschscholtzi

D

conceacutentri

ca

Diaporthe D

longicolla

D

foeniculina

D

anacardi

i

D

macada

miae

Humiacutecola H

fuscoatra

Hypoxylon H

trugodes

H

pulicicidum

Hypocrea H

koningii

Massarina M albocarnis

Nemania N

primolutea

Nigrospora N sacchari N rubi N sphaeric

a

N hainanen

sis

N oryzae

N gorlenko

ana

N aurantia

ca

Trichoderma T trixiae T

olivascens

T

paraviridescens

T

viridescens

T

samuelsii

T viride

Grupo Externo Coprinellus C

domesticus

C

xanthothrix

Tabla 1 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos endoacutefitos en la

especie Espeletia hartwegiana

37

38

Figura 10 Filograma consenso obtenido con el programa MEGA ndashX a partir del anaacutelisis ML y MP del

conjunto de datos ITS Aislados de las hojas de frailejoacuten Los coacutedigos en Verde son las secuencias que se

aislaron (aislados) en este estudio los coacutedigos y nombres en Negro son las secuencias encontradas por

identidad en GenBank Los valores de soporte de bootstrapgt 70 se indican cerca de los nodos como MP

ML = valores de soporte de bootstrap lt70

El nuacutemero de caracteres los modelos de sustitucioacuten usada asiacute como otros resultados

estadiacutesticos de las pruebas de Maacutexima Parsimonia y Maacutexima Verosimilitud generados a partir de

los anaacutelisis filogeneacuteticos de los conjuntos de datos se muestran en los anexos

39

Capiacutetulo Tercero

Discusioacuten sobre los hongos endofitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicas

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidad de Endoacutefitos

Tanto la temperatura la estacionalidad y los tipos de precipitacioacuten son factores de vital

importancia para la composicioacuten de las diferentes comunidades y la arquitectura vegetal Estos

factores limitan muchos de los procesos ecosisteacutemicos ya que existe una estrecha relacioacuten entre

las variaciones climaacuteticas y las variaciones dentro de los ecosistemas Por lo tanto se espera que

el cambio climaacutetico transforme los ecosistemas Andinos tal como los conocemos hoy (Colwell et

al 2008) modificando las relaciones mutualistas entre plantas y hospederos

Posiblemente la resiliencia y resistencia de muchos ecosistemas como el paacuteramo sean

superadas en este siglo por una combinacioacuten sin precedentes de disturbios tales como el cambio

climaacutetico perturbaciones asociadas a este (sequiacuteas fuegos invasioacuten de especies exoacuteticas

inundaciones) y otros factores como organismos oportunistas (hongos endoacutefitos) cambios en el

uso del suelo contaminacioacuten y sobreexplotacioacuten de recursos (IPCC 2020)

Considerando que el frailejoacuten Espeletia hartwegiana es una especie de alta montantildea

(paacuteramos) endeacutemica de la cordillera Central de los Andes (Schultz y Carl 1856) se encuentra

dentro de los ecosistemas andinos en donde a su vez se ha comprobado la existencia de los

hongos endoacutefitos es de tener en cuenta el papel de estos organismos endoacutefitos ya que los

paacuteramos son ecosistemas particularmente sensibles a los efectos adversos del cambio climaacutetico

en especial al calentamiento global al estar ubicados en los troacutepicos generando asiacute ventanas de

40

oportunidades para que los hongos endoacutefitos alteren su estado mutualista y pasen a ser

patogeacutenicos (Colwell et al 2008 7)

No obstante existe consenso en que las temperaturas aumentaraacuten especiacuteficamente a

grandes alturas y que la precipitacioacuten posiblemente se incrementaraacute en algunas zonas disminuiraacute

en otras y se produciraacute en patrones estacionales alterados con mayor intensidad y frecuencia

(Marengo et al 2009)

Los frailejones se ven en constante estreacutes por el uso del suelo dado en los paacuteramos como

es el caso del paacuteramo Romerales un paacuteramo que se ha visto afectado por las quemas y la

ganaderiacutea (Molinillo y Monasterio 2001) Esto aumenta asiacute las condiciones de estreacutes intriacutensecas a

las que estaacuten expuestas estas plantas de paacuteramo las cuales suministran valiosos bienes y servicios

ecosisteacutemicos como el abastecimiento continuo de agua para usos domeacutesticos agriacutecolas e

industriales (Buytaert et al 2006 4) servicios que se podriacutean ver en decrecimiento si las

ventanas de oportunidades se abren con maacutes frecuencia dando pie al cambio de estado de los

hongos endoacutefitos que existen dentro de los frailejones de la zona

En los paacuteramos de Chingaza Rabanal Guerrero Iguaque Merchaacuten y Sumapaz se han

realizado estudios de aislamientos de hongos en especies de frailejoacuten diferentes a la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana tales como Espeletia argentea Espeletia arbelaezii Espeletia

boyacensis Espeletia grandiflora Espeletia miradorensis y Espeletia uribei por ende se ha

reportado la presencia de hongos endoacutefitos y fitopatoacutegenos (Tabla 2) (Gaitan 2018 17)

Frailejones Espeletia

argentea

Espeletia

arbelaezii

Espeletia

boyacensis

Espeletia

grandiflora

Espeletia

miradorensis

Espeletia

uribei

Aspergillus X X X X

Annulohypoxylon X X X

Curvularia X X X

Epicoccum X X X

Fusarium X X X

41

Tabla 2 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = a presencia del genero de

hongo dentro de la especie de frailejoacuten

Los geacuteneros de hongos en rojo son los geacuteneros que se encontraron en comuacuten con los

geacuteneros hallados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana de un total de 15 geacuteneros 3

han sido reportados anteriormente en estudios similares ( 20 de geacuteneros identificados)

Dentro de un marco de cambio climaacutetico es importante la metodologiacutea de muestreo

como lo fue el formato de muestreo en puntos aleatorios realizado en el presente estudio se llevoacute

acabo principalmente por la homogeneidad de los frailejones en el paacuteramo como lo indica el

manual de meacutetodos baacutesicos de muestreo y anaacutelisis de ecologiacutea vegetal (BOLFOR 2000 9) donde

se menciona que el muestreo aleatorio se utiliza cuando se dispone de poca informacioacuten previa de

las caracteriacutesticas de las poblaciones a medirse en este caso la poblacioacuten a identificarse fueron

los hongos endoacutefitos que se hallaban dentro de las formaciones homogeacuteneas de los frailejones

No obstante el muestreo aleatorio tambieacuten presenta limitaciones a la hora de comparar los

hongos endoacutefitos a lo largo del gradiente altitudinal (muestreo aleatorio estratificado) dejando de

percibir informacioacuten proveniente de los distintos microclimas que se encuentran y de las

incidencias que podriacutean causar a la hora de identificar los geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten ademaacutes de posibles micro efectos del cambio climaacutetico a lo

largo del gradiente altitudinal (Caacutemara et al 2008)

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio Climaacutetico

Nigrospora X X X X X

Penicillium X X X

Pleospora X X X X

Trichoderma X X X X

42

Las teacutecnicas empleadas en este estudio para lograr aislar e identificar los hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana se hacen importantes dentro del cambio

climaacutetico debido a que el margen de error en la identificacioacuten molecular es reducido (Bakermans

et al 2014) Al ser reducido el margen de error se pudo conocer con mayor certeza que especies

y geacuteneros de hongos endoacutefitos se encuentra dentro de la planta

Al conocer sus identidades es posible conocer las capacidades que tienen cada una de

estas especies de hongos endoacutefitos de producir metabolitos secundarios de infiltrarse y proteger

los tejidos de la planta de condiciones bioacuteticas y abioacuteticas competir contra herbiacutevoros y

fitopatoacutegenos (Schulz et al 2002) Con sus capacidades reconocidas es posible vincular los

efectos del cambio climaacutetico como estreacutes hiacutedrico aumento de la temperatura migraciones

tempranas enfermedades emergentes aumentos de la precipitacioacuten y heladas severas con las

reacciones por parte de los hongos endoacutefitos Estas reacciones podriacutean desencadenar aumentos de

la patogenicidad en las poblaciones de frailejones debido a los constantes disturbios y estreacutes al

que se ve sometido la planta generando asiacute notables declives poblacionales (Mendoza 2010)

Las relaciones filogeneacuteticas entre las especies halladas toman relevancia debido a las

sinergias positivas o negativas que se pueden presentar dependiendo de las especies que se

encuentren asociadas dentro de la planta (Lamichhane y Venturi 2015) como por ejemplo

Nigrospora y Colletotrichum pueden activar una sinergia negativa aumentando la virulencia y

afectando la especie Espeletia hartwegiana

Las especies de hongos endoacutefitos se identificaron por medio de secuencias obtenidas de

las regiones ITS (regioacuten de espaciadores internos transcritos) las cuales son regiones altamente

conservadas con tasas de evolucioacuten muy lentas en el tiempo permitiendo hacer inferencias

filogeneacuteticas (Baldwin et al 1995 Hamby y Zimmer 1992) es por ello que se usaron para

generar las diferentes identificaciones de los hongos endoacutefitos logrando asiacute identificar al geacutenero

Nigrospora con un total de 7 especies N sacchari N rubi N sphaerica N hainanensis N

gorlenkoana N oryzae y N aurantiaca pertenecientes a la familia Apiosporaceae orden

Xylariales Divisioacuten Ascomicota (veacutease figura 11) (Wang et al 2017)

Dentro del marco del cambio climaacutetico Nigrospora se caracteriza por poseer una

distribucioacuten cosmopolita y una amplia gama de hueacutespedes como lo es en este caso la especie E

hartwegiana que habita en los Andes Tropicales que se veraacuten alterados por los efectos del

cambio climaacutetico este geacutenero se ha logrado aislar en su forma endoacutefita en tallos y hojas de

43

diversas plantas tambieacuten como saprofitos en detritos hojarasca y larvas muertas (Uzor et al

2015 1)

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

Los hongos endoacutefitos hallados en esta investigacioacuten se encontraron dentro de la especie

de frailejoacuten E hartwegiana la cual pertenece a los Andes Tropicales ubicados maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos Estos ecosistemas son sensibles a los efectos del cambio

climaacutetico por su altura su alto endemismo y su sensibilidad al efecto de borde Cuando las

especies lentildeosas empiecen a migrar a lo largo del gradiente altitudinal es posible que los

frailejones se encuentren con suelos agrestes en donde sus semillas no podraacuten fijarse y los efectos

adversos de hongos como Nigrospora N oryzae y N sphaerica seraacuten maacutes notables

aprovechando las ventanas de oportunidad que generen los desbalances climaacuteticos (Sharma et al

2013)

Los cambios en los patrones climaacuteticos potenciaran la especie N sphaerica dentro del

frailejoacuten la cual tiene la capacidad de causar tizoacuten foliar en la especie Camellia sinensis siendo

una planta de teacute perteneciente a la divisioacuten de las magnolifiotas como el geacutenero Espeletia (Liu et

al 2015) Nigrospora fue el geacutenero maacutes ampliamente aislado en las identificaciones generadas a

partir de las hojas de frailejoacuten esto se veriacutea explicado debido a que N sphaerica tiene un

mecanismo de descarga de esporas efectivo que puede proyectar a la fuerza sus esporas a una

distancia de hasta 2 cm en vertical y 68 cm en horizontal como lo demostroacute Webster (1952)

ademaacutes el estudio de Wu y colaboradores (2004) tambieacuten evidencioacute que las esporas de

44

Nigrospora son uno de los grupos maacutes dominantes en la atmoacutesfera y estaacuten asociadas con

tormentas de polvo

La gran capacidad colonizadora del geacutenero Nigrospora le permite adaptarse a las

condiciones climaacuteticas cambiantes con la estrategia de dispersioacuten de sus esporas logrando

distanciarse del frailejoacuten hospedero para encontrar nuevos hospederos producto de las

migraciones tempranas a lo largo del gradiente altitudinal (Riveros 2010)

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

por encima del 80 lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen menos

mutaciones en los nodos internos del aacuterbol basados en la distribucioacuten de probabilidad asignadas

a los posibles arboles resultantes dando lugar a una hipoacutetesis evolutiva maacutes confiable (Schmidt y

Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 es decir el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes

corto (menos cambios) y el cual se ajusta mejor a los datos (Swofford 1997)

Teniendo asiacute una inferencia filogeneacuteticamente robusta los geacuteneros Collectotrichum y

Nigrospora pertenecen a la Divisioacuten Ascomycota ambos geacuteneros son particularmente agresivos

con las plantas en especial la especie Colletotrichum gloeosporioides la cual es la fase asexual

de Glomerella cingulata (Raj et al 2013) Se caracteriza por tener un amplio rango de

hospederos entre ellos el frailejoacuten a los cuales les causa una enfermedad conocida pudricioacuten

amarga antracnosis o chancros siendo esta la necrosis de frutos flores nervios y tallos

(Gonzaacutelez et al 2006 4)

Uno de los primeros reportes de afectaciones a especies de frailejoacuten se obtuvo en el 2009

en el Parque Natural Nacional Chingaza Colombia en donde encontraron las especies de

frailejoacuten Espeletia grandiflora y Espeletia uribei afectadas debido a insectos y una especie de

hongo del genero Colletotrichum (Medina 2009- 9 Hartung y Burton 1981)

Por ende que estos dos geacuteneros de hongos se encuentren juntos podriacutea tener

implicaciones en el aumento de virulencia potenciado a su vez por los desbalances abioacuteticos

causados por el cambio climaacutetico como lo han mencionado Belisario y colaboradores (2002) es

posible que las afectaciones no sean producidas por un uacutenico hongo si no por un complejo de

varios generando sinergismos entre diferentes especies que solas no hariacutean dantildeo a la planta pero

juntas podriacutean ser causantes de enfermedad (Lamichhane y Venturi 2015 4) aun mas en un

45

marco de cambio climaacutetico que gradualmente aumenta sus efectos nocivos sobre los paacuteramos

aumentando la temperatura cambios en la precipitacioacuten heladas intensas cambios en la

nubosidad mayor exposicioacuten a la radiacioacuten solar teniendo por resultado un iacutendice de estreacutes

mayor en las plantas de paacuteramo generando ventanas de oportunidades para que los hongos

endoacutefitos modifiquen sus roles de protector a patoacutegeno

En frailejones tambieacuten se ha reportado la presencia de Nigrospora y Trichoderma por

Bonilla y Argenis (2005) maacutes especiacuteficamente en la especie Espeletia grandiflora la cual es una

especie que habita en los paacuteramos de Colombia Ecuador y Venezuela en conjunto con Espeletia

hartwegiana (Luteyn 1999 3) El hecho que existan estos dos geacuteneros presentes en los frailejones

advierte de un equilibrio entre hongos endoacutefitos que se puede romper bajo las tensiones del

cambiante clima maacutes aun en los sensibles paacuteramos alto andinos

En cuanto a N sacchari se tiene reporte que es un productor de metabolitos con una

notable actividad herbicida demostrado en plantas cultivadas en invernadero (Fukushima et al

1998 2) debido a que existe evidencia que sugiere que los hongos endoacutefitos han evolucionado

directamente de hongos patoacutegenos (Schulz et al 1999 4) sumado al estreacutes del cambio climaacutetico

en cualquier momento de extrema tensioacuten hiacutedrica caloacuterica o heladas en estos ecosistemas de alta

montantildea Estos anomaliacuteas ambientales podriacutea disparar mecanismos de accioacuten fitopatoacutegenos

dentro de los frailejones generando un declive notable en sus poblaciones y por ende un declive

de la cantidad recurso hiacutedrico aguas abajo y su regulacioacuten (Diacuteaz et al 2002 5)

Como se mencionoacute anteriormente los medios de propagacioacuten de estos hongos endoacutefitos

pueden ser por medio de esporas que estaacuten en el ambiente aunque tambieacuten los vectores que

juegan un rol clave en su dispersioacuten son los insectos ya que estos pueden transportar esporas o

partes del hongo en su cuerpo patas o aparato bucal (Eigenbrode et al 2018 5)

Considerando la dispersioacuten homogeacutenea de los frailejones dentro del paacuteramo la carga

esporas en el ambiente y la herbivoriacutea de insectos es probable que se puedan ver infectados la

mayoriacutea de individuos (Varela 2016) es por ello que en el futuro puede que las afectaciones en

frailejones no sean producidas por hongos fitopatoacutegenos si no por hongos endoacutefitos que tuvieron

la ventana de oportunidad gracias al cambio climaacutetico aumento de la temperatura aumento en

las concentraciones de CO2 y alteraciones de precipitacioacuten que pueden hacer susceptible la planta

al ataque de estos hongos (Chakraborty 2011 Elad y Pertot 2014)

46

Para que se genere la enfermedad esta depende de la interaccioacuten de tres o cuatro factores

1) hospedero susceptible 2) agente causal (virulento) 3) condiciones ambientales favorables y 4)

tiempo (Francl 2001 2) la falta de alguno de ellos no permite que el patoacutegeno produzca la

enfermedad en la planta debido a ello algunas especies de frailejoacuten pueden tener una o dos cepas

que puedan actuar como fitopatoacutegenos pero no estaacuten activas si no estaacute completa su asociacioacuten

con otro patoacutegeno u otro factor

Ademaacutes existe un estudio que evaluoacute el efecto de la temperatura sobre la capacidad de

Fusarium verticillioides para generar infeccioacuten en plantas de maiacutez se probaron bajo 3 escenarios

de temperatura como resultados obtuvieron que la enfermedad de este hongo se veiacutea potenciada

por el aumento de temperatura en temperaturas por encima de 35degC (Murillo et al 2008) este

estudio da soporte a la hipoacutetesis de que existen factores que influyen significativamente a la

infeccioacuten en la planta tal vez el paacuteramo difiacutecilmente alcance 35degC no obstante la mayoriacutea de

especies son sensibles a cambios de temperatura de hasta de 1degC en donde modifican su

comportamiento rutas metaboacutelicas interacciones ecoloacutegicas y por ende sus defensas se ven

alteradas

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e Hypocrea

El geacutenero Trichoderma con seis especies diferentes (veacutease figura 12) fue el segundo

geacutenero maacutes numeroso despueacutes de Nigrospora que contoacute con siete especies aunque las primeras

especies que se analizaron fueron especies que principalmente actuaban generando enfermedades

en las plantas en las que se encontraban ante disturbios el geacutenero Trichoderma pertenece a la

47

familia Hypocreaceae y se caracteriza por tener una gran capacidad biocontroladora sobre

fitopatoacutegenos como Fusarium oxysporum los cuales podriacutean llegar masivamente con las

migraciones tempranas de insectos y plantas lentildeosas (Miles et al 2012 7)

No solo actuacutean repeliendo patoacutegenos internos si no tambieacuten patoacutegenos externos como

insectos que desean consumir u aprovechar la planta ya que estos pueden secretar diferentes

metabolitos secundarios y enzimas que actuacutean inhibiendo su desarrollo (Boughalleb-M et al

2018 8)

Es bien conocido que el geacutenero Trichoderma produce amplio rango de sustancias

antibioacuteticas ademaacutes de poseer la caracteriacutestica de parasitar otros hongos (Howell 2002 6)

Debido a la competencia que generan las especies del genero Trichoderma por espacio y

nutrientes inhiben o degradan pectinasas y otras enzimas que son esenciales para que los hongos

fitopatoacutegenos como Botrytis cinerea penetre en la superficie de las hojas logrando proteger de

esta forma al frailejoacuten que se veraacute expuesto a nuevas amenazas microbioloacutegicas auspiciadas por

los cambios en los patrones climaacutetico (Zimand et al 1996)

Ademaacutes de la capacidad del Trichoderma sp para atacar o inhibir el crecimiento de

patoacutegenos de plantas directamente descubrimientos recientes indican que tambieacuten pueden inducir

resistencia sisteacutemica y localizada a una variedad de patoacutegenos de plantas tales como el frijol es

protegido por Trichoderma harzianum de especies fitopatoacutegenas como Colletotrichum

lindemuthianum Botrytis cineacuterea las cuales producen lesiones en las hojas de la planta (Harman

y Howell 2004) Incluso se descubrioacute que ciertas especies de Trichoderma tienen una influencia

sustancial en el buen crecimiento y desarrollo de las plantas sin y con condiciones de estreacutes

climaacutetico (Lorito 1998)

Como lo demostraron Bonilla y Argenis (2005) en su estudio llevado a cabo en el

frailejoacuten Espeletia grandiflora diferentes cepas pertenecientes a Trichoderma pueden proteger

esta especie de paacuteramo de organismos fitopatoacutegenos emergentes por el cambio climaacutetico por

ende si puede proteger a E grandiflora tambieacuten puede proteger la especie E hartwegiana lo

que le permitiraacute sobrellevar diferentes ataques fortuitos de patoacutegenos e insectos que nunca han

logrado alcanzar las altitudes de paacuteramo (3200 - 5000 m)

Cuando el cambio climaacutetico aumente la temperatura en 1degC o 2degC traeraacute consigo sus

efectos de modificacioacuten en cuanto a la estructura y composicioacuten de las especies de plantas que

48

existen en zonas altas para este escenario basado en los caacutelculos de Thuiller (2007) las especies

se habriacutean desplazado en el gradiente altitudinal aproximadamente 450 metros para el antildeo 2070

Las consecuencias de este desplazamiento serian uacutenicas debido a que gran cantidad de

insectos y patoacutegenos tendriacutean migraciones tempranas en el gradiente altitudinal en buacutesqueda de

su optimo teacutermico llevando a cabo un proceso conocido como Termofilizacioacuten (Cuesta et al

2019) es ahiacute donde entra en juego la proteccioacuten que le pueden brindar especies endoacutefitos como

las que pertenecen al geacutenero Trichoderma en el marco de cambio climaacutetico

En concordancia con las cepas de Trichoderma y el geacutenero Hypocrea que tambieacuten

pertenece a la familia Hypocreaceae se conocen maacutes de 700 secuencias de peptaiboles (peacuteptidos

bioloacutegicamente activos) de ambos geacuteneros donde algunos de eacutestos son ecoloacutegica y

comercialmente relevantes debido a su potencial antimicrobiano actividad enzimaacutetica uacutetil para

competir por espacio y alimento de los nuevos patoacutegenos emergentes procedentes de las

alteraciones climaacuteticas y las migraciones tempranas (Degenkolb et al 2008 6)

En cuanto al geacutenero Hypocrea tambieacuten se ha reportado actividad antimicrobiana y anti

fuacutengica contra Staphylococcus aureus y Fusarium oxysporum (Gogoi et al 2008 2) habitando

los geacuteneros Trichoderma e Hypocrea dentro de especies de frailejoacuten como E hartwegiana se

espera que puedan generar sinergias de proteccioacuten que las ayude a combatir los fuertes y

extremos eventos climaacuteticos

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

del 100 (veacutease figura 13) lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen

menos mutaciones en los nodos internos del aacuterbol por ende este aacuterbol contiene la menor

cantidad de mutaciones o cambios dentro sus nodos internos teniendo como resultado una

hipoacutetesis evolutiva confiable (Schmidt y Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 que

indica que el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes corto (menos cambios) y el cual se ajusta

mejor a los datos (Swofford 1997)

49

El geacutenero Annulohypoxylon es de importancia dentro del marco del cambio climaacutetico ya

que pertenece a la familia Xylariaceae y se caracteriza por poseer metabolitos secundarios

antitumorales-citotoacutexicos como la anuloescuamulina que ayudan a combatir el estreacutes abioacutetico

(Cheng et al 2012) estas cepas de hongos son principalmente saprofitos y oportunistas han sido

reportadas en hojas sanas y afectadas de frailejones en otros estudios (Gonzaacutelez 2012 Nonsoque

2012) siendo un geacutenero resiliente a las perturbaciones ambientales como los cambios en los

patrones climaacuteticos su relacioacuten como mutualista dentro del frailejoacuten se mantendraacute hasta que el

frailejoacuten se adapte o colapse ante el estreacutes abioacutetico

Aunque no se conocen como fitopatoacutegenos al contrario pueden actuar como mutualistas

no se descarta que puedan estar involucrados en el desarrollo de diferentes enfermedades en

plantas cuando las condiciones ecosistemicas se alteran a puntos extremos (Gonzalez et al 2017)

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon Biscogniauxia

Nemania y Humiacutecola

El geacutenero Daldinia posee unos valores de MPML correspondientes a 10094 con lo cual

se encuentra bien soportado estadiacutesticamente el geacutenero Daldinia se encuentra ubicado en la

familia Xylariaceae al igual que el geacutenero Hypoxylon Biscogniauxia y Nemania que en su

respectivo orden contienen un soporte estadiacutestico MPML de 10082 10099 y 100100 (veacutease

figura 14) los cuales pertenecen a la divisioacuten Ascomycota las cepas de Daldinia se caracterizan

principalmente por ser especies endoacutefitas teniendo la capacidad de estar dentro de su hueacutesped

mucho tiempo sin causarle dantildeo o al menos un dantildeo evidente por medio de su estado asexual

50

No obstante su estado se puede modificar cuando las condiciones externas se modifican

abruptamente en poco tiempo como es el caso de las alteraciones en la temperatura

precipitacioacuten y concentraciones de dioacutexido de carbono (CO2) auspiciados por el cambio

climaacutetico (Saacutenchez et al 2013)

Un estudio realizado por Prieto (2017) en la especie de frailejoacuten E grandiflora encontroacute

que la especie Daldinia eschscholtzii estaba asociado en el siacutentoma de clorosis (falta de clorofila

en las hojas) Tambieacuten se reportoacute que especies de Daldinia como Daldinia conceacutentrica tienen la

capacidad de controlar nematodos fitopatoacutegenos (Silva et al 2020 104) los cuales pueden invadir

y romper los tejidos de la planta dantildeando sus estructuras los nematodos tambieacuten seraacuten sujetos a

migraciones tempranas por el cambio climaacutetico que trae consigo presiones de seleccioacuten por ende

nuevas amenazas para los frailejones (Nakashima et al 2007)

Como hemos visto hasta este punto las especies de hongos endoacutefitos se muestran en

muchos casos como benefactores y protectores de las diferentes plantas en las que habitan

incluyendo diferentes especies de frailejones

Los hongos endoacutefitos protegen tanto de factores bioacuteticos como virus hongos

fitopatoacutegenos bacterias insectos y factores abioacuteticos como las intemperancias del clima no

obstante en su relacioacuten endoacutefita geacuteneros como Hypoxylon que pertenece igual que Daldinia a la

familia Xylariaceae pueden tener roles amenazadores en conjunto con el cambio climaacutetico

seguacuten Gonzales y colaboradores (2019) inocularon cepas pertenecientes al geacutenero Hypoxylon en

hojas de Theobroma cacao y encontraron que en 48 horas se comenzoacute a notar las marcas de

clorosis y deshidratacioacuten foliar esto demuestra que cepas de este geacutenero pueden tener efectos

fitopatoacutegenos ocasionando muerte descendente pudricioacuten del tronco negro y resinosis de ramas

de mezquite (De la Torre-Almaraacutez et al 2003 De la Torre-Almaraacutez et al 2009)

La presencia de este geacutenero dentro del frailejoacuten en un marco del cambio climaacutetico lo

convierte en una amenaza latente ya que las condiciones seraacuten cada vez maacutes agrestes en los

paacuteramos de los Andes Tropicales Puede favorecer el desarrollo de este geacutenero que tiene las

enzimas necesarias para producir la pudricioacuten del tronco negro entre otras enfermedades

relevantes

51

Tambieacuten las especies del geacutenero Hypoxylon se han reportado como endoacutefitos en tejidos de

plantas lentildeosas o herbaacuteceas (Petrini y Petrini 1985 3) asiacute como saprofitos o fitopatoacutegenos

deacutebiles en madera de aacuterboles de zonas templadas o tropicales (Miller 1961) como lo menciona

Miller (1961)

Los geacuteneros Biscogniauxia Nemania tambieacuten estaacuten dentro de la familia Xylariaceae y

Divisioacuten Ascomycota un aspecto interesante de las especies de Biscogniauxia es que son

paraacutesitos exclusivos de las angiospermas dicotiledoacuteneas en donde concluyeron que todas las

especies pertenecientes a este geacutenero son patoacutegenos umllevesuml que se aprovechan de situaciones de

sequiacutea y estreacutes hiacutedrico para aumentar su patogenicidad (Ju et al 1998)

La especie de frailejoacuten E hartwegiana es una Dicotiledoacutenea eso explica porque

podemos encontrar esta especie de hongo endoacutefito en el frailejoacuten del presente estudio siendo de

vital importancia denotar que las especies de Biscogniauxia se aprovechan especialmente de las

situacioacuten de sequiacutea y estreacutes hiacutedrico difiacutecilmente las especies de este geacutenero podriacutean afectar a los

frailejones debido a que se caracterizan por ser reguladores de los ciclos hiacutedricos el agua es el

recurso que maacutes tiende a existir en un paacuteramo por la estructura de sus suelos compuesta por

andosoles porosos y necromasa acumulada teniendo asiacute un alto iacutendice de retencioacuten hiacutedrica

(Hernandez y Muntildeoz 2015) de modo que el cambio climaacutetico no favorece al geacutenero

Biscogniauxia en su estado patogeacutenico dentro del ecosistema de paacuteramo

En cuanto al geacutenero Nemania Da Silva y colaboradores (2018) llevaron a cabo una

investigacioacuten en la cual identificaron cepas pertenecientes a los geacuteneros Colletotrichum

Phyllosticta Xylaria Nemania y Alternaria en la especie ornamental Pachystachys lutea en

donde las mismas cepas fueron ensayadas para inhibir el crecimiento de hongos fitopatoacutegenos

como Colletotrichum sp en donde encontraron que Nemania era capaz de inhibir por medio de la

secrecioacuten de distintas enzimas el crecimiento de dichas especies gracias a su actividad

enzimaacutetica el geacutenero Nemania puede compensar los desequilibrios causados por el cambio

climaacutetico en teacuterminos de hongos fitopatoacutegenos

Hay que tener en cuenta que los elementos que dan forma a las interacciones planta-

endoacutefito incluyen el modo de transmisioacuten el patroacuten de infeccioacuten la edad de la planta las

condiciones ambientales potenciadas por el cambio climaacutetico y los antecedentes geneacuteticos (Aly et

al 2011 6) Los frailejones de la especie E hartwegiana que se muestrearon para el estudio se

52

tomoacute las hojas sanas lo que indica que poseiacutean estas cepas de endoacutefitos en equilibrio siendo este

uno de los pocos reportes de este geacutenero en especies de alta montantildea en los Andes Tropicales

El geacutenero Humiacutecola se encuentra soportado por un MPML de 10076 siendo una

hipoacutetesis evolutiva considerable es el uacutenico de la figura 14 que no estaacute dentro de la familia

Xylariaceae ya que pertenece a la familia Chaetomiaceae aunque se halla en la divisioacuten

Ascomycota se podriacutea considerar a la especie Humiacutecola fuscoatra como una de las especies de

endoacutefitos maacutes umlinofensivasuml debido a trabajos de investigacioacuten reportados como el de Menzies y

colaboradores (1998) y el de Naik y colaboradores (2009)

Humiacutecola fuscoatra no se considera un peligro latente para la especie E hartwegiana ya

que existe en equilibrio con su entorno Estaacute comprobado por medio de caracterizaciones

quiacutemicas que Humiacutecola fuscoatra es un importante productor de moleacuteculas de estimacioacuten

medica como el resorciacuteclico y lactonas aacutecidas (Mejia et al 2014) Por lo tanto es una especie

prometedora con un reservorio de metabolitos secundarios de importancia medicinal e industrial

que de seguir los efectos nocivos del cambio climaacutetico en los Andes Tropicales maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos esta especie podriacutea desaparecer

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies Massarina

Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

Uno de los grupos mejores soportados en este cladograma es el grupo de Diaporthe en el

cual se encontraron cuatro especies siendo uno con maacutes abundancia de especies del estudio y que

posee un MPML de 10085 10089 y 10095 acorde a sus 3 nodos (veacutease figura 15) teniendo asiacute

una hipoacutetesis evolutiva confiable de estas relaciones las especies de Diaporthe pertenecen a la

familia Diaporthaceae de la divisioacuten Ascomycota y son especies de endoacutefitos que se distinguen

por inhibir el crecimiento de hongos patoacutegenos en el hospedero que se encuentren El estudio de

53

Da Silva y colaboradores (2018) mostroacute que cepas de Diaporthe sp Inhibieron el crecimiento de

Fusarium oxysporum y Colletotrichum sp hongos fitopatoacutegenos que aumentaran su presencia

aprovechando las alteraciones producidas por el cambio climaacutetico en los paacuteramos

Las especies de este geacutenero estaacuten en continuo cambio entre endoacutefitos y patoacutegenos

funcionando en la mayoriacutea de los casos en una relacioacuten mutualista en donde le brindan a la planta

mayor tolerancia a las sequias proteccioacuten de patoacutegenos y pestes caracteriacutestica uacutetil frente a los

retos ecoloacutegicos que plantea el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales (Hubbard et al 2014)

se conocen cerca de 800 especies de este geacutenero asociadas a una amplia gama de plantas

vasculares a nivel mundial (Rossman et al 2015)

Esto explica porque las especies de Diaporthe fueron una de las maacutes numerosas

encontradas en la especie de alta montantildea E hartwegiana teniendo en cuenta que esta especie

pasa raacutepidamente de un estado endoacutefito a un estado patogeacutenico y dada su faacutecil y alta distribucioacuten

representa un peligro en conjunto con el cambio climaacutetico para las especies de alta montantildea como

los frailejones y supone una amenaza para el balance hiacutedrico y ecosistemico en el futuro

El geacutenero Crassiparies de la familia Neohendersoniaceae y el geacutenero Massarina de la

familia Massarinaceae pertenecen al orden Pleosporales aunque se discute debido a las

similaridades morfoloacutegicas y genoacutemicas con Massarina si Crassiparies deberiacutea estar en la

familia Massarinaceae (Hyde et al 2013 4) Se tiene poca informacioacuten sobre la especie

Crassiparies quadrisporus por ende este puede ser uno de los primeros reportes de esta especie

en una especie de alta montantildea como lo es el frailejoacuten especiacuteficamente en la especie E

hartwegiana en un marco de cambio climaacutetico el geacutenero Crassiparies necesita mayores estudios

a nivel ecoloacutegico y microbioloacutegico para entender su papel dentro de esta crisis climaacutetica

Mientras tanto el geacutenero Massarina ha logrado ser aislado de agua dulce con el fin de

obtener fuentes de productos naturales bioloacutegicamente activos por medio de las investigaciones

quiacutemicas de Shearer (1999 2001) en una especie de Massarina obtuvieron como resultado el

aislamiento de tres nuevos sequiterpenoides y dos lactonas derivadas de policeacutetidos con nuevos

sistemas de anillos lo que indica que esta especie tambieacuten puede tener un rol importante

mediante la produccioacuten de enzimas y metabolitos secundarios en el marco de las invasiones

bioloacutegicas impulsadas por el cambio climaacutetico

54

El geacutenero Cryptocoryneum de la familia Cryptocoryneaceae existe poca informacioacuten de

sus mecanismos de accioacuten como endoacutefito o patoacutegeno maacutes aun en especies de los Andes

Tropicales este podriacutea ser uno de los primeros reportes sobre esta especie de hongo en una

especie de frailejoacuten especiacuteficamente E hartwegiana en el 2015 se reportoacute en Brasil el

descubrimiento de una nueva especie del genero Cryptocoryneum trataacutendose de Cryptocoryneum

parvulum hallada en las hojas de la especie Araucaria angustifolia (Gimnosperma) (Silva et al

2015 1) la informacioacuten sobre el geacutenero Cryptocoryneum en relacioacuten al cambio climaacutetico y sus

efectos dentro de especies de alta montantildea como el frailejoacuten auacuten son poco conocidas

Uno de los geacuteneros maacutes cercanos a los grupos externos del cladograma es Cyphellophora

perteneciente a la familia Cyphellophoraceae el cual posee un MPML de 10091 logrando una

hipoacutetesis evolutiva confiable Diversas especies de Cyphellophora han logrado ser aisladas de

infecciones superficiales de la piel o las untildeas en humanos y de materiales vegetales (Decock et

al 2003 Cheewangkoon et al 2009) Esto indica su amplia distribucioacuten y su capacidad para ser

patogeacutenica tanto en plantas como en animales maacutes aun en condiciones desfavorables para la

planta como son las condiciones de cambio climaacutetico

De la especie Cyphellophora reptans se tiene reporte que su morfologiacutea es muy similar a

la de una levadura por lo que es faacutecilmente confundida con una (Reacuteblovaacute et al 2013) Es posible

que este sea el uacutenico reporte de Cyphellophora reptans en las hojas de un frailejoacuten o especie de

alta montantildea que habite en los troacutepicos como E hartwegiana debido a ello sus mecanismos de

accioacuten en especies de paramo dentro de un marco de cambio climaacutetico es poco conocido Se

necesitan mayores estudios enfocados en esta especie para entender su ecologiacutea y dinamismo

ecoloacutegico respecto a los cambios en las variables ambientales

Se eligieron las especies Coprinellus domesticus y Coprinellus xanthothrix como grupos

externos con el fin de enraizar el aacuterbol debido a que pertenecen a la Divisioacuten Basidiomycota la

cual difiere en grado de la divisioacuten Ascomycota aunque conserva semejanzas conocidos como

caracteres ancestrales o plesiomorficos que avanzan a medida la filogenia se construye con los

datos de las diferentes secuencias de especies evidenciando novedades evolutivas conocidas

como apomorfias que cuando se dan en un grupo en particular pasan a ser sinapomorfias es decir

novedades evolutivas dentro de un grupo particular (Lehtonen 2020) Se optoacute por enraizar con

55

estas dos especies con el objetivo de dar robustez al aacuterbol filogeneacutetico (Barriel y 1998) lo cual se

consiguioacute como se nota en los estadiacutesticos del aacuterbol filogeneacutetico

56

57

Conclusiones

Se rechaza la hipoacutetesis nula (H0) y se concluye que la identificacioacuten y caracterizacioacuten

molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo Colombia es diferente en 80 de sus geacuteneros y

especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos realizadas en especies de frailejoacuten

Por lo tanto los nuevos geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos encontrados en el frailejoacuten

plantean nuevos desafiacuteos respecto al cambio climaacutetico ya que tienen un rol vital en la

supervivencia de estas especies de alta montantildea como los frailejones debido a su relacioacuten

mutualista o patoacutegena maacutes aun en los paacuteramos que son altamente sensibles a los efectos del

cambio climaacutetico incluso tan sensibles como las zonas polares (Bradley et al 2006)

La mayoriacutea de especies encontradas en el presente estudio tienen potencial para ayudar a

combatir el estreacutes abioacutetico producido por el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales

Especiacuteficamente pueden ayudar a combatir el estreacutes bioacutetico producido por virus hongos

bacterias e insectos en un marco de cambio climaacutetico aumentos de temperatura cambios en la

concentracioacuten de CO2 cambios en la precipitacioacuten migraciones tempranas cambios en la

nubosidad disponibilidad hiacutedrica alteraciones en la estructura y composicioacuten de las especies

endeacutemicas del paacuteramo

58

59

Obras citadas

Anderson EP Marengo JA Villalba R Halloy SR Young B Cordero D Gast F

Jaimes E y Ruiz D 2012 Consecuencias del cambio climaacutetico en los ecosistemas y

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Thomas T Gilbert J Meyer F 2012 laquoMetagenomics - a guide from sampling to data

analysisraquo Microbial Informatics and Experimentation 2 (1) 3 15 de noviembre

1011862042-5783-2-3

Thuiller Wilfried 2007 Biodiversity climate change and the ecologist Nature 448 550-552

12 de noviembre 101038448550a

Uzor PF Ebrahim W Osadebe PO 2015 Metabolites from Combretum dolichopetalum and its

associated endophytic fungus Nigrospora oryzae ndashevidence for a metabolic partnership

Fitoterapia 105 147ndash150

Varela A 2015 ldquoAnaacutelisis de la relacioacuten hongos patoacutegenos ndash afectacioacuten de frailejones en el

Parque Nacional Natural Chingazardquo Informe final actividades proyecto Bogotaacute DC

Colombia Pontificia Universidad Javeriana

mdashmdashmdash 2016 Aunar esfuerzos teacutecnicos y cientiacuteficos para desarrollar una investigacioacuten

participativa sobre el efecto de la transformacioacuten antroacutepica del paacuteramo en las

interacciones planta- insecto-hongo en los E argentea y E grandiflora)

Vaacutesquez Ceroacuten A Buitrago Castro A C 2017 El gran libro de los paacuteramos Instituto de

Investigacioacuten de Recursos Bioloacutegicos Alexander von Humboldt

Vega FE Simpkins A Aime CM Posada F Peterson SW Rehner SA Infante F Castillo A

Arnold E 2010 umlFungal endophyte diversity in coffee plants from Colombia Hawairsquoi

Mexico and Puerto Ricouml Fungal Ecology 3 (3) 122-138

72

Wang M y Liu Fang y Crous Pedro y Cai Lei 2017 Phylogenetic reassessment of Nigrospora

Ubiquitous endophytes plant and human pathogens Persoonia - Molecular Phylogeny

and Evolution of Fungi 39 11 de noviembre 103767persoonia20173906

Webster J 1952 Spore projection in the hyphomycete Nigrospora sphaerica New Phytologist

51 229ndash235

Wood S N 2001 umlmgcv GAMs and generalized ridge regression for R R newsuml 1 (2) 20-25

Wu PC Tsai JC Li FC 2004 Increased levels of ambient fungal spores in Taiwan are associated

with dust events from China Atmospheric Environment 38 4879ndash4886

Yan L Zhu J Zhao X Shi J Jiang C Shao D 2019 Beneficial effects of endophytic fungi

colonization on plants Appl Microbiol Biotechnol 103 (8) 3327-3340 12 de

noviembre 101007s00253-019-09713-2

Zimand G Elad Y amp Chet I 1996 Effect of Trichoderma harzianum on Botrytis cinerea

pathogenicity Phytopathology 86 1255ndash1260

Zhang T Yao YF 2015 Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in

the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific Plos One 10 (6)

73

Anexos

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombia

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia

hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

74

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

Coordenadas Geograacuteficas

(Latitud)

De la Colecta del

Material Bioloacutegico total de 15

muestras (Longitud)

LAT N 4deg 37 5871717 LONG W 75deg 25

3292611

LAT N 4deg 37 5885220 LONG W 75deg 25

3271217

LAT N 4deg 37 5884485 LONG W 75deg 25

3312103

LAT N 4deg 36 5995487 LONG W 75deg 27

3045854

LAT N 4deg 37 6195784 LONG W 75deg 30

3292611

LAT N 4deg 40 159171 LONG W 75deg 26

380142

LAT N 4deg 40 363762 LONG W 75deg 26

209072

LAT N 4deg 40 399832 LONG W 75deg 27

173554

LAT N 4deg 40 383965 LONG W 75deg 27

464325

LAT N 4deg 39 486438 LONG W 75deg 27

173559

LAT N 4deg 40 56894 LONG W 75deg 26

568287

LAT N 4deg 40 159174 LONG W 75deg 27

190654

LAT N 4deg 40 125083 LONG W 75deg 26

345912

LAT N 4deg 40 116691 LONG W 75deg 27

208264

LAT N 4deg 40 314698 LONG W 75deg 27

140791

75

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un estereoscopio con el propoacutesito de seleccionar la

maacutes indicada y luego sembrar un cultivo puro a partir de ese micelio

76

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados las

copias se conservaron con glicerol a -80degC en un ultra congelador de Thermo Scientifictrade

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas

y enviadas

77

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicos de forma segura y esteacuteril propiedad de la Universidad del Quindiacuteo

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a la Universidad Ruhr de Bochum (Alemania)

78

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de parsimonia

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X en donde se

observa en amarillo la secuencia umlTCATTAuml la cual es una secuencia altamente conservada

que se usa para marcar el inicio de la misma en hongos endoacutefitos

79

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa JmoldelTest usados para generar el

aacuterbol de relaciones filogeneacuteticas a partir de la regioacuten ITS de los hongos endoacutefitos aislados

total de modelos evaluados 88

ID Nombre Particioacuten lnL P AIC detaAIC Peso Cumpeso Udelta

1 JC 0 100820157 138 204400314 1341348 0 1 -

2 JC+I 0 98912511 139 200605022 9618188 0 1 -

3 JC+G 0 95470113 139 193720225 2733392 0 1 -

4 JC+I+G 0 95467507 140 193735014 274818 0 1 -

5 F81 0 100658095 141 204136189 13149356 0 1 -

6 F81+I 0 98761481 142 200362962 9376128 0 1 -

7 F81+G 0 95314814 142 193469628 2482794 0 1 -

8 F81+I+G 0 95324364 143 193508729 2521895 0 1 -

9 K80 10010 99734495 139 20224899 11262157 0 1 -

10 K80+I 10010 97835191 140 198470382 7483549 0 1 -

11 K80+G 10010 94227821 140 191255643 268809 0 1 -

12 K80+I+G 10010 94209963 141 191239926 253092 0 1 -

13 HKY 10010 99648091 142 202136181 11149348 0 1 -

14 HKY+I 10010 97761512 143 198383024 7396191 0 1 -

15 HKY+G 10010 94170799 143 191201599 214765 0 1 -

16 HKY+I+G 10010 94118678 144 191117357 130523 600E-04 0999 -

17 TrNef 10020 99564653 140 201929306 10942472 0 1 -

18 TrNef+I 10020 97712623 141 198245245 7258412 0 1 -

19 TrNef+G 10020 94150977 141 191121955 135121 400E-04 09994 -

20 TrNef+I+G 10020 94132131 142 191104263 117429 00011 09959 -

21 TrN 10020 99563809 143 201987618 11000784 0 1 -

22 TrN+I 10020 97702964 144 198285929 7299095 0 1 -

23 TrN+G 10020 94094235 144 191068469 81635 00065 09719 -

24 TrN+I+G 10020 94101378 145 191102757 115923 00012 09948 -

25 TPM1 12210 99713879 140 202227759 11240925 0 1 -

26 TPM1+I 12210 97826641 141 198473282 7486449 0 1 -

27 TPM1+G 12210 94249837 141 191319674 33284 0 1 -

28 TPM1+I+G 12210 942022 142 1912444 257566 0 1 -

29 TPM1uf 12210 99663473 143 202186945 11200112 0 1 -

30 TPM1uf+I 12210 97879458 144 198638917 7652083 0 1 -

31 TPM1uf+G 12210 94137349 144 191154699 167865 100E-04 09999 -

32 TPM1uf+I+G 12210 94141897 145 191183794 196961 0 1 -

80

33 TPM2 10212 99722544 140 202245087 11258254 0 1 -

34 TPM2+I 10212 97828213 141 198476426 7489592 0 1 -

35 TPM2+G 10212 94185859 141 191191718 204885 0 1 -

36 TPM2+I+G 10212 94153667 142 191147335 160501 100E-04 09998 -

37 TPM2uf 10212 99648091 143 202156182 11169348 0 1 -

38 TPM2uf+I 10212 97757018 144 198394035 7407202 0 1 -

39 TPM2uf+G 10212 941052 144 1910904 103566 00022 09904 -

40 TPM2uf+I+G 10212 9408801 145 19107602 89187 00044 0982 -

41 TPM3 12012 99768005 140 20233601 11349176 0 1 -

42 TPM3+I 12012 97958099 141 198736198 7749364 0 1 -

43 TPM3+G 12012 94227963 141 191275926 289093 0 1 -

44 TPM3+I+G 12012 94323885 142 191487769 500936 0 1 -

45 TPM3uf 12012 99625421 143 202110843 11124009 0 1 -

46 TPM3uf+I 12012 97770469 144 198420939 7434105 0 1 -

47 TPM3uf+G 12012 94165576 144 191211152 224319 0 1 -

48 TPM3uf+I+G 12012 94150861 145 191201721 214888 0 1 -

49 TIM1ef 12230 99592239 141 202004478 11017644 0 1 -

50 TIM1ef+I 12230 97822787 142 198485574 749874 0 1 -

51 TIM1ef+G 12230 94121043 142 191082087 95253 00033 09853 -

52 TIM1ef+I+G 12230 94122386 143 191104772 117939 00011 09969 -

53 TIM1 12230 99518653 144 201917306 10930473 0 1 -

54 TIM1+I 12230 9781156 145 19852312 7536286 0 1 -

55 TIM1+G 12230 94105198 145 191110396 123562 800E-04 09977 -

56 TIM1+I+G 12230 94087158 146 191094317 107483 00018 09922 -

57 TIM2ef 10232 99550617 141 201921233 109344 0 1 -

58 TIM2ef+I 10232 97704602 142 198249204 726237 0 1 -

59 TIM2ef+G 10232 94093484 142 191026968 40135 00516 0852 -

60 TIM2ef+I+G 10232 94073864 143 191007729 20895 0135 07169 -

61 TIM2 10232 99530022 144 201940044 1095321 0 1 -

62 TIM2+I 10232 97820158 145 198540315 7553482 0 1 -

63 TIM2+G 10232 94058678 145 191017356 30523 00834 08004 -

64 TIM2+I+G 10232 94060837 146 191041674 54841 00247 09248 -

65 TIM3ef 12032 99546286 141 201912572 10925739 0 1 -

66 TIM3ef+I 12032 97713931 142 198267862 7281028 0 1 -

67 TIM3ef+G 12032 94129376 142 191098753 111919 00014 09936 -

68 TIM3ef+I+G 12032 94112005 143 191084009 97176 0003 09883 -

69 TIM3 12032 99514376 144 201908751 10921918 0 1 -

70 TIM3+I 12032 97700023 145 198300047 7313213 0 1 -

71 TIM3+G 12032 94115323 145 191130646 143812 300E-04 09997 -

72 TIM3+I+G 12032 94096941 146 191113882 127048 700E-04 09984 -

73 TVMef 12314 9970418 142 20224836 11261526 0 1 -

74 TVMef+I 12314 97940598 143 198741196 7754363 0 1 -

81

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE (AIC)

75 TVMef+G 12314 94159829 143 191179657 192824 0 09999 -

76 TVMef+I+G 12314 94160993 144 191201987 215153 0 1 -

77 TVM 12314 99615991 145 202131982 11145148 0 1 -

78 TVM+I 12314 97746676 146 198413353 7426519 0 1 -

79 TVM+G 12314 94075503 146 191071005 84171 00057 09776 -

80 TVM+I+G 12314 94052588 147 191045176 58342 00208 09456 -

81 SYM 12345 99543166 143 201946331 10959498 0 1 -

82 SYM+I 12345 97757103 144 198394207 7407373 0 1 -

83 SYM+G 12345 94083056 144 191046112 59278 00198 09654 -

84 SYM+I+G 12345 94050035 145 19100007 13236 0198 05819 -

85 GTR 12345 99529525 146 20197905 10992217 0 1 -

86 GTR+I 12345 97686178 147 198312356 7325522 0 1 -

87 GTR+G 12345 94044194 147 191028387 41553 00481 09001 -

88 GTR+I+G 12345 94013417 148 190986834 0 03839 03839 -

9

Agradecimientos

Estos agradecimientos van dedicados para Ecuador que me brindoacute la oportunidad

poder estudiar una maestriacutea a mi tutor por aceptarme y acompantildearme en este proceso a

mi familia por creer en miacute y en los sacrificios que hice para irme a vivir a otro paiacutes solo y

sin dinero para poder umlsalir adelanteuml como decimos en Colombia a mi compantildeera

sentimental por siempre guiarme hacia el camino correcto disciplina compromiso y

entrega a la universidad Andina Simoacuten Boliacutevar por aceptarme en sus aulas de clase y

por ultimo a la Universidad del Quindiacuteo por abrirle la puerta a uno de sus egresados y

acogerlo de buena forma con sus instalaciones de laboratorio

Gracias y mil gracias a todos de corazoacuten sin duda esta experiencia cambio mi

vida en todos los sentidos

Desde hoy hasta el final que podriacutea llamarse infinito

10

11

Tabla de contenidos

Figuras mapas y tablashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13

Introduccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 15

Capiacutetulo primero Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

1 Antecedenteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

2 Justificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 25

3 Hipoacutetesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 26

4 Objetivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

41 Objetivo generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

42 Objetivos especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

Capiacutetulo segundo Materiales Meacutetodos y Resultadoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

1 Aacuterea de Estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

2 Colecta de material bioloacutegicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos

endoacutefitos)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32

5 Extraccioacuten de ADNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

7 Secuenciamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

8 Anaacutelisis Filogeneacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

Capiacutetulo Tercero Discusioacuten sobre los hongos endoacutefitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidadhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio

Climaacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42

Conclusioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 57

Obras citadashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 59

Anexoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 73

12

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphellip 73

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia 73

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphelliphellip74

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana 75

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un

estereoscopio 75

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 76

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas y

enviadas 76

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 75

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a Alemania a la Universidad Ruhr de

Bochum 77

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de

parsimoniahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 78

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X 78

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa

JmoldelTest 79

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE

(AIC) 81

13

Figuras mapas y tablas

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo

Colombiahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras

N necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefitohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y

abioacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en

medio de cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelialhelliphelliphellip 30

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la

teacutecnica de corte de hifa uacutenica helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de

cultivo Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12)

aislados de las hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana 31-32

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 10 Filograma obtenido a partir del anaacutelisis ML y MP del conjunto de datos ITS Aislados

de las hojas de frailejoacuten37

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip43

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e

Hypocreahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip46

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon48

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon

Biscogniauxia Nemania y Humiacutecolahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

14

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies

Massarina Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona

muestreadahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia 29-30

Tabla 2 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos

endoacutefitos en la especie Espeletia hartwegiana

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36

Tabla 3 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = presencia del genero

de hongo dentro de la especie de frailejoacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42-43

15

Introduccioacuten

Hay un libro abierto siempre para

todos los ojos la naturaleza

(Jean-Jacques Rousseau 1712-1778)

El cambio climaacutetico corresponde a un fenoacutemeno que afecta el planeta de manera natural

permitiendo mantener las condiciones climaacuteticas como la temperatura la precipitacioacuten entre

otras en un rango aceptable para la vida (Jimeacutenez 2010) Sin embargo dado el aumento de las

emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) principalmente asociado a las actividades

humanas y el alto consumo de combustibles foacutesiles los cambios en dichas condiciones han sido

alterados dando paso a un acelerado aumento de temperatura anual en las uacuteltimas deacutecadas con

precipitaciones y sequias maacutes frecuentes e intensas (IPCC 2020 5 Jimeacutenez 2010)

Acorde con el Panel Intergubernamental de Expertos en Cambio Climaacutetico (IPCC) para

fin de siglo el Cambio Climaacutetico se acrecentaraacute pronosticando un aumento de temperatura de 25

a 45 degC para el antildeo 2100 que tan solo para Colombia en los uacuteltimos 30 antildeos fue de 08degC

generando impactos notorios en las zonas de alta montantildea como los paacuteramos (Moreno y Palma

2016)

El cambio climaacutetico es un fenoacutemeno cuyos efectos alcanzaraacuten los paacuteramos los cuales son

ecosistemas de alta montantildea presente en elevaciones entre 3100 y 4700 m ubicados en el norte de

los Andes de Ameacuterica del Sur y el sur de Ameacuterica Central adyacente (Berdugo et al 2016) Estas

aacutereas se caracterizan por una vegetacioacuten principalmente endeacutemica compuesta por frailejones

matorrales y pastos (veacutease figura 1) (Garciacutea et al 2010)

Los ecosistemas de alta montantildea como los paacuteramos ofrecen diversos servicios

ambientales como la biodiversidad uacutenica que albergan los paisajes los suelos y su capacidad de

retener y almacenar agua (Morales et al 2019) Las formaciones vegetales juegan un papel

diferenciado en el mantenimiento de la humedad y las fuentes de agua en el ecosistema

presentando la capacidad de interceptar almacenar y regular los flujos hiacutedricos superficiales y

16

subterraacuteneos aportando los servicios de abastecimiento de agua para el 70 de la poblacioacuten de

Colombia (Vaacutesquez y Buitrago 2017)

Ademaacutes dada la caracteriacutestica de permanente humedad de su suelo la materia orgaacutenica

se descompone a menor velocidad logrando un efecto de retencioacuten y almacenamiento de carbono

(Anderson et al 2012) En Colombia se han realizado diferentes estudios sobre la distribucioacuten y

extensioacuten del ecosistema paramuno Rangel (2002 4) determinoacute que los paacuteramos colombianos

abarcaban aproximadamente el 26 de la superficie del paiacutes

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramos por Pedraza-Pentildealosa Betancur y Franco-Rosselli (2005)

En particular el paacuteramo Romerales se encuentra dentro del territorio adscrito a los

Parques Nacionales Naturales (PNN) especiacuteficamente el PNN de los Nevados en la cordillera

central colombiana hacia la zona norte del Departamento del Quindiacuteo con liacutemites fronterizos

entre los departamentos de Risaralda y Tolima Este paacuteramo es el hogar del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana el cual estaacute afrontando los efectos del cambio climaacutetico (veacutease mapa 1)

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona muestreada

17

Existe evidencia cientiacutefica concreta del aumento de temperatura en los Andes Tropicales

tambieacuten cambios significativos en los patrones de precipitacioacuten sumado a la disminucioacuten en la

incidencia del clima nublado lo que conduce a las plantas a mayor cantidad de horas expuestas a

la radiacioacuten solar (Ruiz et al 2009) Otro efecto grave que trae consigo el cambio climaacutetico es el

desplazamiento de especies en el gradiente altitudinal Con un aumento de 3degC se espera que las

especies se muevan ~600 m en buacutesqueda de su optimo teacutermico esto afectariacutea gravemente las

especies de paacuteramo como los frailejones Cuesta Camacho (2007)

Los frailejones son emblemaacuteticas plantas de paacuteramo y ecosistemas de alta montantildea

(MINAMBIENTE 2019) Pertenecen a la familia Asteraceae contiene cerca de 142 especies

agrupadas en ocho geacuteneros Carramboa Coespeletia Espeletia Espeletiopsis Libanothamnus

Paramiflos Ruilopezia y Tamania de estos los maacutes importantes y con mayor diversidad de

especies son Espeletia Espeletiopsis y Libanothamnus (Rivera y Torres 2001)

Poseen adaptaciones que les permite captar y retener grandes cantidades de agua de su

entorno permitiendo un balance ecosistemico (Farias 2013) La morfologiacutea singular del genero

Espeletia le permite acumular las hojas antiguas en forma de ldquoabrigordquo brindando proteccioacuten

contra las bajas temperaturas nocturnas de hasta 0degC Los fuertes vientos y la radiacioacuten solar los

cuales seraacuten cada vez maacutes intensos y frecuentes por causa del cambio climaacutetico (Cortes y

Sarmiento 2013 34) (veacutease figura 2)

Estas plantas son especies claves para la conservacioacuten de los paacuteramos y la lucha contra el

cambio climaacutetico debido a que ofrecen una gran variedad de servicios ecosisteacutemicos (Diacuteaz et al

2007) El paacuteramo es referente sin igual de fuente hiacutedrica ciudades como Bogotaacute y Quito obtienen

aproximadamente el 80 de su agua dulce de los paacuteramos (Buytaert et al 2006) Los frailejones

en su mayoriacutea endeacutemicos se han visto afectados por actividades humanas como la ganaderiacutea

extensiva agricultura (cultivos de papa y cebolla) mineriacutea de oro y carboacuten turismo no

controlado y quemas intencionales (Hofstede 2000) Esta situacioacuten podriacutea comprometer a

mediano y largo plazo la funcioacuten de captacioacuten regulacioacuten y suministro del agua para el consumo

18

en las ciudades colombianas ubicadas en las regiones de influencia de estos ecosistemas (Varela

2015)

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

No obstante en asociacioacuten con especies como el frailejoacuten de los Andes Tropicales

encontramos a los hongos cuyos roles en las interacciones bioloacutegicas son de vital importancia

Los hongos pueden ser endoacutefitos simbiontes mutualistas paraacutesitos y comensales y son capaces

de responder a las amenazas que plantea el cambio climaacutetico en cuanto a perturbaciones

ambientales aumento de temperatura y estreacutes hiacutedrico adaptaacutendose a la disponibilidad de recursos

modificando sus actividades enzimaacuteticas e incluso su genoma a lo largo del tiempo (Moreno et

al 2013)

Los hongos son clasificados seguacuten su forma de reproduccioacuten sea sexual o asexual en

donde se observan las diferencias estructurales internas entre los diferentes grupos tales como

sus esporas e hifas como lo indican Blackwell y Spatafora (2004) estos organismos estaacuten

divididos en cuatro grandes grupos los cuales son Ascomycota Basidiomycota

Chytridiomycota Zygomycota es justo en el grupo de los Ascomycota donde se encuentra gran

diversidad de hongos conocidos como ldquohongos endoacutefitosrdquo en donde su nombre ldquoendoacutefitordquo

significa ldquodentro de la plantardquo (endon dentro phyton planta)

19

Estos microorganismos fuacutengicos tienen la facilidad de pasar gran parte o todo su ciclo de

vida invadiendo los tejidos de su hospedero (planta) sin tener un efecto negativo evidente

(Leacuteveilleacute 1846 3 de Bary 1866 8) Por lo tanto el concepto de endoacutefito indica una asociacioacuten de

costo-beneficio pero de una forma mutualista entre el hongo y la planta hospedera permitiendo

la estadiacutea en sus tejidos vivos (Clay 1998 8) Los hongos endoacutefitos se han encontrado en todas

las plantas (algas musgos pastos plantas y vasculares) desde los bosques templados hasta los

bosques tropicales hallaacutendose una gran diversidad de plantas y en asociacioacuten gran diversidad de

hongos endoacutefitos (Saacutenchez et al 2010)

Se espera que los hongos endoacutefitos jueguen un papel cada vez maacutes importante potenciado

por el cambio climaacutetico en las enfermedades producidas en plantas como pudricioacuten radicular

mal blanco entre otras con los aumentos pronosticados de la temperatura y el estreacutes por sequiacutea

asociados al cambio climaacutetico (Desprez-Loustau et al 2006 Slippers y Wingfield 2007 6) Los

cambios en la cantidad de dioacutexido de carbono (CO2) y la disponibilidad de nitroacutegeno en el suelo

afectan de forma similar tanto a las plantas como a los hongos por ende las alteraciones

generadas por parte del cambio climaacutetico pueden causar desbalances en sus relaciones (Ies et al

2013)

Algunos estudios realizados en el antildeo 1898 donde se registraron los primeros hongos

endoacutefitos como el de Bary (1866) brindo la iniciativa de investigaciones que lograron explicar

los cuadros toxicoloacutegicos observados en animales los cuales se daban por el consumo de

semillas o en aacutereas de pastos (Poaceae) que posiblemente albergaban hongos Clavicipitaacuteceos

(familia del ergot) los cuales poseiacutean actividades enzimaacuteticas con micotoxinas

Por diversas situaciones no trascendioacute la investigacioacuten hasta que Bacon (1977) hizo

relacioacuten del hongo endoacutefito Neotyphodium coenophialum debido a una intoxicacioacuten del ganado

llamado ldquosiacutendrome de veranordquo cuando estos animales consumiacutean pastos de la especie Festuca

arundinacea (Poaceae) Funk en el antildeo 80 caracterizoacute la resistencia de las Poaceae que

albergaban hongos endoacutefitos que frecuentemente eran atacados por insectos (proteccioacuten contra

herbiacutevoros) (Saacutenchez et al 2010)

Compant y colaboradores (2010) mencionaron que tras experimentar en el laboratorio

con una gama de temperaturas en los hongos endoacutefitos aislados obtuvieron resultados variables

respecto al crecimiento es decir positivos y neutrales llegando a la conclusioacuten de que los

microorganismos asociados a las plantas son un factor importante que influye en la respuesta de

20

las plantas acorde a los cambios de temperatura lo que compromete las respuestas del frailejoacuten y

los hongos endoacutefitos frente al calentamiento global causado por el cambio climaacutetico

Con relacioacuten a los estudios realizados sobre hongos endoacutefitos en frailejones se han

encontrado al menos 100 especies con capacidades de inhibir hongos fitopatoacutegenos o herbivoriacutea

(Cabezas et al 2012)

Los geacuteneros de hongos endoacutefitos encontrados en anteriores estudios son Acremonium

Aspergillus Aureobasidium Colletotrichum Fusarium Gliocadium Nigrospora Paecilomyces

Penicillium Trichothecium Trichoderma y Sordaria (Pineda 2000 Programa Nacional para la

Evaluacioacuten del Estado y Afectacioacuten de los Frailejones en los Paacuteramos de Andes del Norte 2009)

Teniendo en cuenta que para Colombia hay poca informacioacuten sobre hongos endoacutefitos en

ecosistemas paramunos se hace fundamental la ampliacioacuten de maacutes informacioacuten referente al tema

debido a que solo existen estudios significativos en cafeacute leguminosas y rosas los cuales maacutes allaacute

de la identificacioacuten de geacuteneros de hongos endoacutefitos no incluyen el cambio climaacutetico y sus

posibles consecuencias (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016) En

teacuterminos filogeneacuteticos los hongos son el reino de la naturaleza maacutes cercano a los animales

(Hibbett et al 2018)

Las relaciones que posean las diferentes especies de endoacutefitos dentro de la especie de

frailejoacuten es de importancia conocerla mediante el uso de la filogenia molecular (Judd et al 2007)

mediante secuencias de ADN ARN o proteiacutenas (Cooke et al 2000) Dependiendo de la presencia

de especies agresivas de endoacutefitos como Nigrospora se puede tener un mejor conocimiento

sobre las consecuencias que trae consigo los impactos del cambio climaacutetico sobre estas plantas de

los Andes Tropicales (Foden et al 2009)

21

Capiacutetulo primero

Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitos

1 Antecedentes

Desde los estudios realizados por Leacuteveilleacute (1846) y Bary (1866) sobre hongos Endoacutefitos

en pastos de zonas templadas se ha logrado identificar que estos hongos son capaces de inducir

respuestas adaptativas a sus hospederos (Micotoxinas contra herbiacutevora adaptacioacuten a heladas o

climas extremos fijacioacuten de nutrientes) a cambio de alimento y hospedaje formando una relacioacuten

mutualista en la cual las dos especies involucradas son beneficiadas No obstante se ha reportado

que los hongos endoacutefitos ademaacutes de tener relaciones mutualistas con diferentes especies

vegetales se pueden tornar en especies patoacutegenas para su hospedero una vez la planta se

encuentra en condiciones desventajosas tornaacutendose asiacute el hongo endoacutefito en un hongo

fitopatoacutegeno (Herrera y Ulloa 1990 550)

Como se mencionoacute anteriormente los hongos endoacutefitos pueden pasar de un estado

mutualista a un estado de patogeacutenesis dada esta relacioacuten entre ambos organismos se producen

metabolitos secundarios potencialmente toacutexicos facilitando factores de virulencia dados por el

hongo endoacutefito como exoenzimas y metabolitos fitotoacutexicos a su vez la planta presenta defensas

tanto mecaacutenicas como bioquiacutemicas (Saacutenchez et al 2013 5)

Hasta la fecha los principales estudios de hongos endoacutefitos se han fijado en especies de

intereacutes econoacutemico y comercial tales como palma de aceite cafeacute leguminosas pastos de forrajeoacute

y diferentes tipos de rosas (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016)

Las especies modelo para el estudio de los hongos endoacutefitos han sido las gramiacuteneas

forrajeras en donde se han reportado especies de endoacutefitos asociados a los geacuteneros Lolium

Festuca y Brachiaria (Siegel et al 1987) no obstante Otero y Bayman (2009) han reportado un

creciente nuacutemero de estudios en orquiacutedeas epifitas tropicales relaciones con hongos micorrizicos

22

Actualmente existen escasos reportes de hongos endoacutefitos asociados a ecosistemas con

climas extremos (temperaturas extremas) como aacuterticos desiertos paacuteramos y zonas alpinas

especialmente para zonas de temperaturas friacuteas como lo son los paacuteramos (Lopera et al 2008

Leung et al 2011 Cabezas et al 2012 Miles et al 2012 Zhang y Yao 2015)

Investigadores como Lopera Leung y colaboradores (2011) han llegado a la conclusioacuten

de que los hongos endoacutefitos juegan un papel importante en las plantas a la hora de adaptarse a

ecosistemas de clima templado (Kivlin et al 2013 Zhang y Yao 2015)

En Colombia los trabajos con hongos endoacutefitos son pocos por ende trabajos como el de

Lopera y colaboradores (2008) con especies del genero Espeletia de los paacuteramos Colombianos

son pioneros ademaacutes del trabajo de Cabezas y colaboradores (2012 4) en el cual aislaron y

caracterizaron celulasas (enzimas descomponedores de la celulosa) extraiacutedas de hongos endoacutefitos

que se hallaban en especies de Espeletia posteriormente Lopera y Miles (2012) unieron

esfuerzos para continuar caracterizando la diversidad de hongos endoacutefitos en los paacuteramos andinos

colombianos enfocados en Espeletia con el objetivo de encontrar especies con potencial

biocontrolador

Existen trabajos tesis en los repositorios de diversas universidades de los antildeos 2014 y

2015 en los cuales se aborda el tema de los hongos endoacutefitos paacuteramos y especies de Espeletia

(frailejones) y de la familia Poaceae en donde se caracterizan las diversas especies de hongos

endoacutefitos por medio taxonomiacutea y biologiacutea molecular ademaacutes de buscar metabolitos secundarios

con fines medicinales o de biocontrol

Los trabajos en filogenia molecular de hongos endoacutefitos realizados en frailejones se han

visto enfocados maacutes hacia la buacutesqueda de la diversidad funcional en comunidades

microbioloacutegicas como por ejemplo el estudio realizado por Ruiz y colaboradores (2015) en

donde buscaron mediante el anaacutelisis molecular de raiacuteces necromasa hojas maduras y joacutevenes de

diferentes especies de Espeletia (veacutease figura 3) ubicada en los Andes neotroacutepicales

colombianos secuencias geneacuteticas de las regiones V5-V6 de la unidad 16S del rARN

23

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras N

necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefito Tomado de Ruiz y colaboradores (2015)

Este estudio analizoacute la composicioacuten de comunidades microbioanas y su diversidad

funcional en un ecosistema de alta montantildea en donde las temperaturas los rayos UV y la altura

juegan papeles determinantes como filtros ecoloacutegicos severos en donde solo pueden existir

especies que han desarrollado capacidades para adaptarse sobrevivir y colonizar dichas aacutereas

por ende cuando se analizaron las comunidades existentes dentro de estas especies de Espeletia

Encontraron que algunas especies halladas podriacutean tener roles importantes como

productores de metabolitos secundarios enzimas o incluso como bioremediadores y que las

comunidades microbianas eran diferentes tanto en sus hojas como en sus raiacuteces y en la

necromasa

A medida que las deacutecadas avanzan y la evidencia sobre el cambio climaacutetico se hace maacutes

robusta y evidente los estudios en los hongos endoacutefitos han tomado vital importancia al estar

asociados con cultivos de especies comestibles escases de agua y de tierras productivas sumado

a los efectos negativos que trae consigo el cambio climaacutetico para las diferentes plantaciones y

cosechas a nivel global

Es por eso que Lu Yan y colaboradores (2019) analizaron los efectos positivos que teniacutean

la colonizacioacuten de hongos endoacutefitos en las plantas en donde ratificaron que los hongos endoacutefitos

dentro la planta generan metabolitos antimicrobianos estimulan las respuestas inmunoloacutegicas y

compiten por espacio dentro de la planta con diferentes patoacutegenos incrementando asiacute la

resistencia contra herbiacutevoros y la resistencia al estreacutes salino (factores bioacuteticos)

Ademaacutes de ayudar a la planta contra el estreacutes abioacutetico causado principalmente por

factores climaacuteticos como la falta de agua (estreacutes hiacutedrico) las temperaturas extremas la

intensidad de los rayos UV y los metales pesados como la muestra la figura 4 debido a esto se

24

concluyoacute que las fitohormonas cumplen un papel importante en la colonizacioacuten de hongos

endoacutefitos dentro de la planta

Aun que se ha reportado que los hongos endoacutefitos se pueden usar como biocontroladores

diferentes estudios reportan que el uso de hongos endoacutefitos puede tener efectos adversos como

un retraso significativo en el crecimiento de la planta con el uso de la especie Cryptosporiopsis

sp (Terhonen et al 2016) Otro reporte indica la fecundidad y supervivencia de enemigos

naturales como paraacutesitos esto es debido a que los hongos endoacutefitos transfieren sus toxinas y

alcaloides cuando son ingeridos por paraacutesitos u otros enemigos naturales de las plantas (Lopez y

Sword 2015)

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y abioacutetico

Bajo estreacutes bioacutetico (herbiacutevoros y patoacutegenos) y abioacutetico (sequiacutea salinidad metales pesados y otros) (a) se

inducen respuestas de defensa de las plantas (b) los endoacutefitos producen metabolitos protectores y

modulan la viacutea de las fitohormonas para mejorar la inmunidad de las plantas (c) tomada de Lu yan y

colaboradores (2019 7)

25

2 Justificacioacuten

La presente investigacioacuten pretende identificar y caracterizar que especies de hongos

endoacutefitos estaacuten asociadas al frailejoacuten Espeletia hartwegiana y que posibles implicaciones podriacutea

tener que estas especies se encuentren dentro de esta especie de alta montantildea La importancia de

conocer esta informacioacuten reside en que los hongos endoacutefitos pueden beneficiar o perjudicar a la

adaptacioacuten y resistencia de especies vegetales en los distintos escenarios climaacuteticos propuestos

por la ciencia (IPCC 2020)

El calentamiento global podriacutea afectar el equilibrio de los hongos endoacutefitos en especies

vegetales generando desbalances en la planta o la peacuterdida de especies endoacutefitas de importancia

biotecnoloacutegica Por ejemplo se podriacutean perder especies endoacutefitas con potencial para control

bioloacutegico de plagas y enfermedades de plantas como productores de enzimas y metabolitos

secundarios degradacioacuten de plaacutesticos o biorremediacioacuten entre otros (Schulz et al 2002) Por

ello se hace fundamental estudiar los hongos endoacutefitos en ecosistemas de paacuteramo ya que en

Colombia y en los paacuteramos en general han sido poco estudiados y su efecto sobre las plantas de

alta montantildea podriacutea ser clave en el mantenimiento de sus poblaciones

26

3 Hipoacutetesis

H1 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute diferente en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo diferentes los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten tambieacuten seria

modificada

H0 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute similar en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo similares los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten continuariacutean

como se ha registrado con anterioridad

27

4 Objetivos

41 Objetivo general

Caracterizar la diversidad de hongos endoacutefitos presentes en los frailejones

de la especie Espeletia hartwegiana en el paacuteramo de Romerales tomando en cuenta su

relacioacuten con el cambio climaacutetico

42 Objetivos especiacuteficos

Identificar los hongos endoacutefitos asociados en Espeletia hartwegiana del

paacuteramo de Romerales

Hallar relaciones filogeneacuteticas entre las diferentes especies de hongos

Endoacutefitos encontradas en Espeletia hartwegiana

Advertir las repercusiones del cambio climaacutetico sobre Espeletia

hartwegiana en base a su diversidad de hongos endoacutefitos

28

29

Capiacutetulo segundo

Materiales Meacutetodos y Resultados

1 Aacuterea de Estudio

El trabajo se realizoacute en el paacuteramo de Romerales ubicado en la zona alta del municipio de

Salento Quindiacuteo (4deg39202N 75deg25506W) con una extensioacuten aproximada de 6794 ha (Cano

et al 2015)

2 Colecta de material bioloacutegico

La colecta del material bioloacutegico se realizoacute mediante muestreos aleatorios lo largo del

paacuteramo tomando coordenadas de cada punto de colecta (veacutease anexo 3) las hojas se colectaron

por medio de tijeras podadoras siendo empacadas cada una en bolsas Ziploc diferentes se

colectoacute un total de 15 hojas cada una correspondiente a una planta de frailejoacuten para un total de

15 plantas muestreadas de E hartwegiana

Adicionalmente las bolsas Ziploc fueron marcadas con los datos de colecta en campo y

transportadas a los laboratorios del Programa de Biologiacutea de la Universidad del Quindiacuteo para su

procesamiento

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetales

Las muestras obtenidas fueron lavadas con agua para eliminar el exceso de residuos se

cortaron 4 trozos de cada hoja con un tamantildeo aproximado de 05 a 10 cm (veacutease figura 5) luego

cada trozo de hoja se sometioacute a una esterilizacioacuten la cual se completoacute con algunas modificaciones

acorde al procedimiento descrito por (Osorio et al 2017) especiacutefico para el aislamiento de

30

hongos endoacutefitos que consiste en sumergir perioacutedicamente el material vegetal en etanol al 90

durante un minuto seguido de hipoclorito de sodio (NaClO) al 4 por un minuto continuando

con etanol al 70 durante un minuto y por uacuteltimo se lavaraacuten con agua destilada todo dentro de la

campana de flujo

Las cuatro secciones de hoja se transfirieron a una caja de Petri para un total de 15 cajas

de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA) (una caja de Petri por cada 4 cortes de hoja)

Posteriormente las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente (25degC aproximadamente)

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en medio de

cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelial caja de Petri de 20ml de capacidad

Pasadas 3 semanas se revisaron los cultivos fuacutengicos con el fin de revisar el crecimiento

del micelio y hacer un repique a un cultivo puro una vez maduros se procedioacute a utilizar la teacutecnica

de corte de hifa uacutenica (Osorio et al 2017) esta teacutecnica consistioacute en tomar la punta de la hifa con

ayuda de un estereoscopio y un bisturiacute de grado quiruacutergico agua destilada alcohol al 70 y un

mechero para mantener el bisturiacute esterilizado una vez identificada la hifa ideal para cultivar de

forma pura (veacutease figura 6) con el bisturiacute se procedioacute a cortar el agar PDA en forma de cuadro

con una medida aproximada de 3 miliacutemetros cuadrados

31

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la teacutecnica de

corte de hifa uacutenica

Se esperoacute entre 3 a 5 semanas a que crecieran los cultivos puros aislados de las hifas uacutenicas en

nuevas cajas de Petri con agar PDA

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos endoacutefitos)

Los hongos cultivados de forma pura consiguieron un crecimiento micelial significativo a partir

de los 15 diacuteas a temperatura ambiente como lo demuestra la figura 7 que contiene doce de los

cultivos maacutes representativos con su respectivos micelios aeacutereos desarrollados donde variacutean sus

colores formas y consistencias esto indicando que pertenecen a diferentes especies

2

1

3

32

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de cultivo

Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12) aislados de las

hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

5 Extraccioacuten de ADN

4

5

6

7

8

9

10

11

12

33

Una vez el micelio de los hongos se encontraba desarrollado en la cantidad necesaria se

procedioacute a extraer el ADN genoacutemico siguiendo el protocolo de extraccioacuten de Raeder y Broda

(1985) por medio de un barrido superficial del micelio evitando tomar el agar este micelio

posteriormente se colocoacute en tubos Eppendorf esteacuteriles de 2 ml y se pulverizoacute mediante el uso de

un asa microbioloacutegica y 1ml de buffer de extraccioacuten compuesto de Tris-HCL 1 M pH 78 EDTA

05 M Ph 8 SDS 10 wv NaCL y agua destilada para cada tubo a continuacioacuten se agregoacute 800

ul de etanol al 70 500 ul de fenol y se mezcloacute

Se adicionoacute 300 ul de cloroformo y se mezcloacute de nuevo de alliacute se llevoacute a la centrifuga a

10000 rpm por 60 minutos luego de centrifugar se forma un sobrenadante el cual es transferido

en su totalidad a un nuevo tuvo Eppendorf de 15 ml en el cual se agregaron 400 ul de cloroformo

y se llevoacute a la centrifuga a 10000 rpm por 10 minutos en donde nuevamente se forma un

sobrenadante aunque esta vez solo se toman 500 ul del tubo para ser transferidos otro tubo

Eppendorf de 15 ml ya en el nuevo tubo se adicionaron 50 ul de NaAC y se invirtioacute varias veces

para homogenizar la mezcla a continuacioacuten se guardoacute en el refrigerador a 4degC toda la noche

Al diacutea siguiente se tomaron las muestras en los tubos Eppendorf y se centrifugaron a

10000 rpm por 30 minutos (Formacioacuten del Pellet de ADN) cuando la centrifuga terminoacute se

procedioacute a remover el etanol ya sin etanol se agregoacute de nuevo 1 ml de etanol al 70 a cada tubo

y se centrifugoacute a 10000 rpm por 5 minutos en este paso se removioacute el etanol y se dejoacute secar el

pellet de ADN una vez el etanol se evaporoacute se re suspendioacute el pellet en 100 ul de agua grado

molecular o Sabax con 5 ul de RNAsa con el fin de evitar la presencia de moleacuteculas de ARN

posteriormente se incubaron a 37degC por 30 minutos y se guardaron para su envioacute a -20degC

(Raeder y Broda 1985)

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengica

Una vez se secuenciaron las muestras de ADN enviadas a la Universidad Ruhr de

Bochum Alemania se hizo el ensamblaje de las secuencias en contigs y scaffolds en el

programa CLC Main Workbench 8 (Nicola et al 2013) Como lo muestra la figura 8 donde se

muestran los pasos esenciales de una teacutecnica de Metagenoacutemica donde posteriormente se

analizaron con maacutes detalle mediante teacutecnicas filogeneacuteticas

34

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemico Fuente Thomas y colaboradores (2012)

7 Secuenciamiento

Se extrajoacute con eacutexito un total de 35 muestras de hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

Espeletia hartwegiana (veacutease figura 9) que posteriormente fueron secuenciadas por la

Universidad Ruhr de Bochum (Alemania) logrando un total de 70 secuencias incluyendo

aquellas obtenidas en Genk Bank

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de frailejoacuten

Espeletia hartwegiana

35

8 Anaacutelisis Filogeneacutetico

Se aislaron 35 secuencias basadas en la especie Espeletia hartwegiana fueron

comparadas posteriormente con 35 secuencias de especies publicados en GenBank

(httpblastncbinihgovblastcgi) se obtuvo un total de 70 secuencias Las secuencias de

consenso ITS 58S DNA obtenidas se usaron para realizar buacutesquedas BLAST en GenBank

usando BLASTn (Altschul et al 1990) con el fin de identificar mediante las secuencias aisladas

los geacuteneros o las especies maacutes cercanas La matriz de datos fue alineada en MAFFT v7 (Katoh y

Standley 2013) Se utilizaron las especies Coprinellus xanthothrix y Coprinellus domesticus

como grupos externos

Los anaacutelisis de las secuencias para construir los arboles filogeneacuteticos de Maacutexima

Parsimonia (MP) fueron realizados usando PAUP v40b10 (Swofford 2003) Para el anaacutelisis de

Maacutexima Verosimilitud o ML por sus siglas en ingleacutes (Maximum Likelihood) se utilizoacute

JmodelTest (Darriba et al 2012) con el cual se infirieron los criterios del modelo de sustitucioacuten

apropiado utilizando los criterios de informacioacuten de Akaike (AIC) (Akaike 1974)

Los anaacutelisis de ML se realizaron con el programa PhyML v 30 (Guindon y Gascuel

2003) teniendo en cuenta la proporcioacuten de sitios invariables Los valores de soporte de confianza

para los nodos se estimaron mediante 1000 anaacutelisis de arranque de replicacioacuten La alineacioacuten de

los datos de la secuencias de ITS para 70 aislamientos determinoacute quince geacuteneros siendo los

siguientes Annulohypoxylon Biscogniauxia Colletotrichum Crassiparies Cryptocoryneum

Cyphellophora Diaporthe Daldinia Humiacutecola Hypoxylon Hypocrea Nemania Nigrospora

Massarina y Trichoderma de los cuales se obtuvieron 11 clados principales (veacutease figura 10)

Con base en estos resultados todos los aislamientos se analizaron maacutes a fondo dentro de los

geacuteneros hasta llegar a especie (veacutease tabla 1)

36

Geacuteneros Especie Especie Especie Especie Especie Especie Especie

Annulohypoxylon A nitens A bahnphaden

gense

Biscogniauxia B petrensis

Colletotrichum C gloeosporioides

C gigasporum

Cyphellophora C

reptans

Crassiparies C quadrisporus

Cryptocoryneum C

longicondensatum

Daldinia D dennisii D

eschscholtzi

D

conceacutentri

ca

Diaporthe D

longicolla

D

foeniculina

D

anacardi

i

D

macada

miae

Humiacutecola H

fuscoatra

Hypoxylon H

trugodes

H

pulicicidum

Hypocrea H

koningii

Massarina M albocarnis

Nemania N

primolutea

Nigrospora N sacchari N rubi N sphaeric

a

N hainanen

sis

N oryzae

N gorlenko

ana

N aurantia

ca

Trichoderma T trixiae T

olivascens

T

paraviridescens

T

viridescens

T

samuelsii

T viride

Grupo Externo Coprinellus C

domesticus

C

xanthothrix

Tabla 1 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos endoacutefitos en la

especie Espeletia hartwegiana

37

38

Figura 10 Filograma consenso obtenido con el programa MEGA ndashX a partir del anaacutelisis ML y MP del

conjunto de datos ITS Aislados de las hojas de frailejoacuten Los coacutedigos en Verde son las secuencias que se

aislaron (aislados) en este estudio los coacutedigos y nombres en Negro son las secuencias encontradas por

identidad en GenBank Los valores de soporte de bootstrapgt 70 se indican cerca de los nodos como MP

ML = valores de soporte de bootstrap lt70

El nuacutemero de caracteres los modelos de sustitucioacuten usada asiacute como otros resultados

estadiacutesticos de las pruebas de Maacutexima Parsimonia y Maacutexima Verosimilitud generados a partir de

los anaacutelisis filogeneacuteticos de los conjuntos de datos se muestran en los anexos

39

Capiacutetulo Tercero

Discusioacuten sobre los hongos endofitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicas

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidad de Endoacutefitos

Tanto la temperatura la estacionalidad y los tipos de precipitacioacuten son factores de vital

importancia para la composicioacuten de las diferentes comunidades y la arquitectura vegetal Estos

factores limitan muchos de los procesos ecosisteacutemicos ya que existe una estrecha relacioacuten entre

las variaciones climaacuteticas y las variaciones dentro de los ecosistemas Por lo tanto se espera que

el cambio climaacutetico transforme los ecosistemas Andinos tal como los conocemos hoy (Colwell et

al 2008) modificando las relaciones mutualistas entre plantas y hospederos

Posiblemente la resiliencia y resistencia de muchos ecosistemas como el paacuteramo sean

superadas en este siglo por una combinacioacuten sin precedentes de disturbios tales como el cambio

climaacutetico perturbaciones asociadas a este (sequiacuteas fuegos invasioacuten de especies exoacuteticas

inundaciones) y otros factores como organismos oportunistas (hongos endoacutefitos) cambios en el

uso del suelo contaminacioacuten y sobreexplotacioacuten de recursos (IPCC 2020)

Considerando que el frailejoacuten Espeletia hartwegiana es una especie de alta montantildea

(paacuteramos) endeacutemica de la cordillera Central de los Andes (Schultz y Carl 1856) se encuentra

dentro de los ecosistemas andinos en donde a su vez se ha comprobado la existencia de los

hongos endoacutefitos es de tener en cuenta el papel de estos organismos endoacutefitos ya que los

paacuteramos son ecosistemas particularmente sensibles a los efectos adversos del cambio climaacutetico

en especial al calentamiento global al estar ubicados en los troacutepicos generando asiacute ventanas de

40

oportunidades para que los hongos endoacutefitos alteren su estado mutualista y pasen a ser

patogeacutenicos (Colwell et al 2008 7)

No obstante existe consenso en que las temperaturas aumentaraacuten especiacuteficamente a

grandes alturas y que la precipitacioacuten posiblemente se incrementaraacute en algunas zonas disminuiraacute

en otras y se produciraacute en patrones estacionales alterados con mayor intensidad y frecuencia

(Marengo et al 2009)

Los frailejones se ven en constante estreacutes por el uso del suelo dado en los paacuteramos como

es el caso del paacuteramo Romerales un paacuteramo que se ha visto afectado por las quemas y la

ganaderiacutea (Molinillo y Monasterio 2001) Esto aumenta asiacute las condiciones de estreacutes intriacutensecas a

las que estaacuten expuestas estas plantas de paacuteramo las cuales suministran valiosos bienes y servicios

ecosisteacutemicos como el abastecimiento continuo de agua para usos domeacutesticos agriacutecolas e

industriales (Buytaert et al 2006 4) servicios que se podriacutean ver en decrecimiento si las

ventanas de oportunidades se abren con maacutes frecuencia dando pie al cambio de estado de los

hongos endoacutefitos que existen dentro de los frailejones de la zona

En los paacuteramos de Chingaza Rabanal Guerrero Iguaque Merchaacuten y Sumapaz se han

realizado estudios de aislamientos de hongos en especies de frailejoacuten diferentes a la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana tales como Espeletia argentea Espeletia arbelaezii Espeletia

boyacensis Espeletia grandiflora Espeletia miradorensis y Espeletia uribei por ende se ha

reportado la presencia de hongos endoacutefitos y fitopatoacutegenos (Tabla 2) (Gaitan 2018 17)

Frailejones Espeletia

argentea

Espeletia

arbelaezii

Espeletia

boyacensis

Espeletia

grandiflora

Espeletia

miradorensis

Espeletia

uribei

Aspergillus X X X X

Annulohypoxylon X X X

Curvularia X X X

Epicoccum X X X

Fusarium X X X

41

Tabla 2 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = a presencia del genero de

hongo dentro de la especie de frailejoacuten

Los geacuteneros de hongos en rojo son los geacuteneros que se encontraron en comuacuten con los

geacuteneros hallados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana de un total de 15 geacuteneros 3

han sido reportados anteriormente en estudios similares ( 20 de geacuteneros identificados)

Dentro de un marco de cambio climaacutetico es importante la metodologiacutea de muestreo

como lo fue el formato de muestreo en puntos aleatorios realizado en el presente estudio se llevoacute

acabo principalmente por la homogeneidad de los frailejones en el paacuteramo como lo indica el

manual de meacutetodos baacutesicos de muestreo y anaacutelisis de ecologiacutea vegetal (BOLFOR 2000 9) donde

se menciona que el muestreo aleatorio se utiliza cuando se dispone de poca informacioacuten previa de

las caracteriacutesticas de las poblaciones a medirse en este caso la poblacioacuten a identificarse fueron

los hongos endoacutefitos que se hallaban dentro de las formaciones homogeacuteneas de los frailejones

No obstante el muestreo aleatorio tambieacuten presenta limitaciones a la hora de comparar los

hongos endoacutefitos a lo largo del gradiente altitudinal (muestreo aleatorio estratificado) dejando de

percibir informacioacuten proveniente de los distintos microclimas que se encuentran y de las

incidencias que podriacutean causar a la hora de identificar los geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten ademaacutes de posibles micro efectos del cambio climaacutetico a lo

largo del gradiente altitudinal (Caacutemara et al 2008)

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio Climaacutetico

Nigrospora X X X X X

Penicillium X X X

Pleospora X X X X

Trichoderma X X X X

42

Las teacutecnicas empleadas en este estudio para lograr aislar e identificar los hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana se hacen importantes dentro del cambio

climaacutetico debido a que el margen de error en la identificacioacuten molecular es reducido (Bakermans

et al 2014) Al ser reducido el margen de error se pudo conocer con mayor certeza que especies

y geacuteneros de hongos endoacutefitos se encuentra dentro de la planta

Al conocer sus identidades es posible conocer las capacidades que tienen cada una de

estas especies de hongos endoacutefitos de producir metabolitos secundarios de infiltrarse y proteger

los tejidos de la planta de condiciones bioacuteticas y abioacuteticas competir contra herbiacutevoros y

fitopatoacutegenos (Schulz et al 2002) Con sus capacidades reconocidas es posible vincular los

efectos del cambio climaacutetico como estreacutes hiacutedrico aumento de la temperatura migraciones

tempranas enfermedades emergentes aumentos de la precipitacioacuten y heladas severas con las

reacciones por parte de los hongos endoacutefitos Estas reacciones podriacutean desencadenar aumentos de

la patogenicidad en las poblaciones de frailejones debido a los constantes disturbios y estreacutes al

que se ve sometido la planta generando asiacute notables declives poblacionales (Mendoza 2010)

Las relaciones filogeneacuteticas entre las especies halladas toman relevancia debido a las

sinergias positivas o negativas que se pueden presentar dependiendo de las especies que se

encuentren asociadas dentro de la planta (Lamichhane y Venturi 2015) como por ejemplo

Nigrospora y Colletotrichum pueden activar una sinergia negativa aumentando la virulencia y

afectando la especie Espeletia hartwegiana

Las especies de hongos endoacutefitos se identificaron por medio de secuencias obtenidas de

las regiones ITS (regioacuten de espaciadores internos transcritos) las cuales son regiones altamente

conservadas con tasas de evolucioacuten muy lentas en el tiempo permitiendo hacer inferencias

filogeneacuteticas (Baldwin et al 1995 Hamby y Zimmer 1992) es por ello que se usaron para

generar las diferentes identificaciones de los hongos endoacutefitos logrando asiacute identificar al geacutenero

Nigrospora con un total de 7 especies N sacchari N rubi N sphaerica N hainanensis N

gorlenkoana N oryzae y N aurantiaca pertenecientes a la familia Apiosporaceae orden

Xylariales Divisioacuten Ascomicota (veacutease figura 11) (Wang et al 2017)

Dentro del marco del cambio climaacutetico Nigrospora se caracteriza por poseer una

distribucioacuten cosmopolita y una amplia gama de hueacutespedes como lo es en este caso la especie E

hartwegiana que habita en los Andes Tropicales que se veraacuten alterados por los efectos del

cambio climaacutetico este geacutenero se ha logrado aislar en su forma endoacutefita en tallos y hojas de

43

diversas plantas tambieacuten como saprofitos en detritos hojarasca y larvas muertas (Uzor et al

2015 1)

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

Los hongos endoacutefitos hallados en esta investigacioacuten se encontraron dentro de la especie

de frailejoacuten E hartwegiana la cual pertenece a los Andes Tropicales ubicados maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos Estos ecosistemas son sensibles a los efectos del cambio

climaacutetico por su altura su alto endemismo y su sensibilidad al efecto de borde Cuando las

especies lentildeosas empiecen a migrar a lo largo del gradiente altitudinal es posible que los

frailejones se encuentren con suelos agrestes en donde sus semillas no podraacuten fijarse y los efectos

adversos de hongos como Nigrospora N oryzae y N sphaerica seraacuten maacutes notables

aprovechando las ventanas de oportunidad que generen los desbalances climaacuteticos (Sharma et al

2013)

Los cambios en los patrones climaacuteticos potenciaran la especie N sphaerica dentro del

frailejoacuten la cual tiene la capacidad de causar tizoacuten foliar en la especie Camellia sinensis siendo

una planta de teacute perteneciente a la divisioacuten de las magnolifiotas como el geacutenero Espeletia (Liu et

al 2015) Nigrospora fue el geacutenero maacutes ampliamente aislado en las identificaciones generadas a

partir de las hojas de frailejoacuten esto se veriacutea explicado debido a que N sphaerica tiene un

mecanismo de descarga de esporas efectivo que puede proyectar a la fuerza sus esporas a una

distancia de hasta 2 cm en vertical y 68 cm en horizontal como lo demostroacute Webster (1952)

ademaacutes el estudio de Wu y colaboradores (2004) tambieacuten evidencioacute que las esporas de

44

Nigrospora son uno de los grupos maacutes dominantes en la atmoacutesfera y estaacuten asociadas con

tormentas de polvo

La gran capacidad colonizadora del geacutenero Nigrospora le permite adaptarse a las

condiciones climaacuteticas cambiantes con la estrategia de dispersioacuten de sus esporas logrando

distanciarse del frailejoacuten hospedero para encontrar nuevos hospederos producto de las

migraciones tempranas a lo largo del gradiente altitudinal (Riveros 2010)

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

por encima del 80 lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen menos

mutaciones en los nodos internos del aacuterbol basados en la distribucioacuten de probabilidad asignadas

a los posibles arboles resultantes dando lugar a una hipoacutetesis evolutiva maacutes confiable (Schmidt y

Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 es decir el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes

corto (menos cambios) y el cual se ajusta mejor a los datos (Swofford 1997)

Teniendo asiacute una inferencia filogeneacuteticamente robusta los geacuteneros Collectotrichum y

Nigrospora pertenecen a la Divisioacuten Ascomycota ambos geacuteneros son particularmente agresivos

con las plantas en especial la especie Colletotrichum gloeosporioides la cual es la fase asexual

de Glomerella cingulata (Raj et al 2013) Se caracteriza por tener un amplio rango de

hospederos entre ellos el frailejoacuten a los cuales les causa una enfermedad conocida pudricioacuten

amarga antracnosis o chancros siendo esta la necrosis de frutos flores nervios y tallos

(Gonzaacutelez et al 2006 4)

Uno de los primeros reportes de afectaciones a especies de frailejoacuten se obtuvo en el 2009

en el Parque Natural Nacional Chingaza Colombia en donde encontraron las especies de

frailejoacuten Espeletia grandiflora y Espeletia uribei afectadas debido a insectos y una especie de

hongo del genero Colletotrichum (Medina 2009- 9 Hartung y Burton 1981)

Por ende que estos dos geacuteneros de hongos se encuentren juntos podriacutea tener

implicaciones en el aumento de virulencia potenciado a su vez por los desbalances abioacuteticos

causados por el cambio climaacutetico como lo han mencionado Belisario y colaboradores (2002) es

posible que las afectaciones no sean producidas por un uacutenico hongo si no por un complejo de

varios generando sinergismos entre diferentes especies que solas no hariacutean dantildeo a la planta pero

juntas podriacutean ser causantes de enfermedad (Lamichhane y Venturi 2015 4) aun mas en un

45

marco de cambio climaacutetico que gradualmente aumenta sus efectos nocivos sobre los paacuteramos

aumentando la temperatura cambios en la precipitacioacuten heladas intensas cambios en la

nubosidad mayor exposicioacuten a la radiacioacuten solar teniendo por resultado un iacutendice de estreacutes

mayor en las plantas de paacuteramo generando ventanas de oportunidades para que los hongos

endoacutefitos modifiquen sus roles de protector a patoacutegeno

En frailejones tambieacuten se ha reportado la presencia de Nigrospora y Trichoderma por

Bonilla y Argenis (2005) maacutes especiacuteficamente en la especie Espeletia grandiflora la cual es una

especie que habita en los paacuteramos de Colombia Ecuador y Venezuela en conjunto con Espeletia

hartwegiana (Luteyn 1999 3) El hecho que existan estos dos geacuteneros presentes en los frailejones

advierte de un equilibrio entre hongos endoacutefitos que se puede romper bajo las tensiones del

cambiante clima maacutes aun en los sensibles paacuteramos alto andinos

En cuanto a N sacchari se tiene reporte que es un productor de metabolitos con una

notable actividad herbicida demostrado en plantas cultivadas en invernadero (Fukushima et al

1998 2) debido a que existe evidencia que sugiere que los hongos endoacutefitos han evolucionado

directamente de hongos patoacutegenos (Schulz et al 1999 4) sumado al estreacutes del cambio climaacutetico

en cualquier momento de extrema tensioacuten hiacutedrica caloacuterica o heladas en estos ecosistemas de alta

montantildea Estos anomaliacuteas ambientales podriacutea disparar mecanismos de accioacuten fitopatoacutegenos

dentro de los frailejones generando un declive notable en sus poblaciones y por ende un declive

de la cantidad recurso hiacutedrico aguas abajo y su regulacioacuten (Diacuteaz et al 2002 5)

Como se mencionoacute anteriormente los medios de propagacioacuten de estos hongos endoacutefitos

pueden ser por medio de esporas que estaacuten en el ambiente aunque tambieacuten los vectores que

juegan un rol clave en su dispersioacuten son los insectos ya que estos pueden transportar esporas o

partes del hongo en su cuerpo patas o aparato bucal (Eigenbrode et al 2018 5)

Considerando la dispersioacuten homogeacutenea de los frailejones dentro del paacuteramo la carga

esporas en el ambiente y la herbivoriacutea de insectos es probable que se puedan ver infectados la

mayoriacutea de individuos (Varela 2016) es por ello que en el futuro puede que las afectaciones en

frailejones no sean producidas por hongos fitopatoacutegenos si no por hongos endoacutefitos que tuvieron

la ventana de oportunidad gracias al cambio climaacutetico aumento de la temperatura aumento en

las concentraciones de CO2 y alteraciones de precipitacioacuten que pueden hacer susceptible la planta

al ataque de estos hongos (Chakraborty 2011 Elad y Pertot 2014)

46

Para que se genere la enfermedad esta depende de la interaccioacuten de tres o cuatro factores

1) hospedero susceptible 2) agente causal (virulento) 3) condiciones ambientales favorables y 4)

tiempo (Francl 2001 2) la falta de alguno de ellos no permite que el patoacutegeno produzca la

enfermedad en la planta debido a ello algunas especies de frailejoacuten pueden tener una o dos cepas

que puedan actuar como fitopatoacutegenos pero no estaacuten activas si no estaacute completa su asociacioacuten

con otro patoacutegeno u otro factor

Ademaacutes existe un estudio que evaluoacute el efecto de la temperatura sobre la capacidad de

Fusarium verticillioides para generar infeccioacuten en plantas de maiacutez se probaron bajo 3 escenarios

de temperatura como resultados obtuvieron que la enfermedad de este hongo se veiacutea potenciada

por el aumento de temperatura en temperaturas por encima de 35degC (Murillo et al 2008) este

estudio da soporte a la hipoacutetesis de que existen factores que influyen significativamente a la

infeccioacuten en la planta tal vez el paacuteramo difiacutecilmente alcance 35degC no obstante la mayoriacutea de

especies son sensibles a cambios de temperatura de hasta de 1degC en donde modifican su

comportamiento rutas metaboacutelicas interacciones ecoloacutegicas y por ende sus defensas se ven

alteradas

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e Hypocrea

El geacutenero Trichoderma con seis especies diferentes (veacutease figura 12) fue el segundo

geacutenero maacutes numeroso despueacutes de Nigrospora que contoacute con siete especies aunque las primeras

especies que se analizaron fueron especies que principalmente actuaban generando enfermedades

en las plantas en las que se encontraban ante disturbios el geacutenero Trichoderma pertenece a la

47

familia Hypocreaceae y se caracteriza por tener una gran capacidad biocontroladora sobre

fitopatoacutegenos como Fusarium oxysporum los cuales podriacutean llegar masivamente con las

migraciones tempranas de insectos y plantas lentildeosas (Miles et al 2012 7)

No solo actuacutean repeliendo patoacutegenos internos si no tambieacuten patoacutegenos externos como

insectos que desean consumir u aprovechar la planta ya que estos pueden secretar diferentes

metabolitos secundarios y enzimas que actuacutean inhibiendo su desarrollo (Boughalleb-M et al

2018 8)

Es bien conocido que el geacutenero Trichoderma produce amplio rango de sustancias

antibioacuteticas ademaacutes de poseer la caracteriacutestica de parasitar otros hongos (Howell 2002 6)

Debido a la competencia que generan las especies del genero Trichoderma por espacio y

nutrientes inhiben o degradan pectinasas y otras enzimas que son esenciales para que los hongos

fitopatoacutegenos como Botrytis cinerea penetre en la superficie de las hojas logrando proteger de

esta forma al frailejoacuten que se veraacute expuesto a nuevas amenazas microbioloacutegicas auspiciadas por

los cambios en los patrones climaacutetico (Zimand et al 1996)

Ademaacutes de la capacidad del Trichoderma sp para atacar o inhibir el crecimiento de

patoacutegenos de plantas directamente descubrimientos recientes indican que tambieacuten pueden inducir

resistencia sisteacutemica y localizada a una variedad de patoacutegenos de plantas tales como el frijol es

protegido por Trichoderma harzianum de especies fitopatoacutegenas como Colletotrichum

lindemuthianum Botrytis cineacuterea las cuales producen lesiones en las hojas de la planta (Harman

y Howell 2004) Incluso se descubrioacute que ciertas especies de Trichoderma tienen una influencia

sustancial en el buen crecimiento y desarrollo de las plantas sin y con condiciones de estreacutes

climaacutetico (Lorito 1998)

Como lo demostraron Bonilla y Argenis (2005) en su estudio llevado a cabo en el

frailejoacuten Espeletia grandiflora diferentes cepas pertenecientes a Trichoderma pueden proteger

esta especie de paacuteramo de organismos fitopatoacutegenos emergentes por el cambio climaacutetico por

ende si puede proteger a E grandiflora tambieacuten puede proteger la especie E hartwegiana lo

que le permitiraacute sobrellevar diferentes ataques fortuitos de patoacutegenos e insectos que nunca han

logrado alcanzar las altitudes de paacuteramo (3200 - 5000 m)

Cuando el cambio climaacutetico aumente la temperatura en 1degC o 2degC traeraacute consigo sus

efectos de modificacioacuten en cuanto a la estructura y composicioacuten de las especies de plantas que

48

existen en zonas altas para este escenario basado en los caacutelculos de Thuiller (2007) las especies

se habriacutean desplazado en el gradiente altitudinal aproximadamente 450 metros para el antildeo 2070

Las consecuencias de este desplazamiento serian uacutenicas debido a que gran cantidad de

insectos y patoacutegenos tendriacutean migraciones tempranas en el gradiente altitudinal en buacutesqueda de

su optimo teacutermico llevando a cabo un proceso conocido como Termofilizacioacuten (Cuesta et al

2019) es ahiacute donde entra en juego la proteccioacuten que le pueden brindar especies endoacutefitos como

las que pertenecen al geacutenero Trichoderma en el marco de cambio climaacutetico

En concordancia con las cepas de Trichoderma y el geacutenero Hypocrea que tambieacuten

pertenece a la familia Hypocreaceae se conocen maacutes de 700 secuencias de peptaiboles (peacuteptidos

bioloacutegicamente activos) de ambos geacuteneros donde algunos de eacutestos son ecoloacutegica y

comercialmente relevantes debido a su potencial antimicrobiano actividad enzimaacutetica uacutetil para

competir por espacio y alimento de los nuevos patoacutegenos emergentes procedentes de las

alteraciones climaacuteticas y las migraciones tempranas (Degenkolb et al 2008 6)

En cuanto al geacutenero Hypocrea tambieacuten se ha reportado actividad antimicrobiana y anti

fuacutengica contra Staphylococcus aureus y Fusarium oxysporum (Gogoi et al 2008 2) habitando

los geacuteneros Trichoderma e Hypocrea dentro de especies de frailejoacuten como E hartwegiana se

espera que puedan generar sinergias de proteccioacuten que las ayude a combatir los fuertes y

extremos eventos climaacuteticos

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

del 100 (veacutease figura 13) lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen

menos mutaciones en los nodos internos del aacuterbol por ende este aacuterbol contiene la menor

cantidad de mutaciones o cambios dentro sus nodos internos teniendo como resultado una

hipoacutetesis evolutiva confiable (Schmidt y Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 que

indica que el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes corto (menos cambios) y el cual se ajusta

mejor a los datos (Swofford 1997)

49

El geacutenero Annulohypoxylon es de importancia dentro del marco del cambio climaacutetico ya

que pertenece a la familia Xylariaceae y se caracteriza por poseer metabolitos secundarios

antitumorales-citotoacutexicos como la anuloescuamulina que ayudan a combatir el estreacutes abioacutetico

(Cheng et al 2012) estas cepas de hongos son principalmente saprofitos y oportunistas han sido

reportadas en hojas sanas y afectadas de frailejones en otros estudios (Gonzaacutelez 2012 Nonsoque

2012) siendo un geacutenero resiliente a las perturbaciones ambientales como los cambios en los

patrones climaacuteticos su relacioacuten como mutualista dentro del frailejoacuten se mantendraacute hasta que el

frailejoacuten se adapte o colapse ante el estreacutes abioacutetico

Aunque no se conocen como fitopatoacutegenos al contrario pueden actuar como mutualistas

no se descarta que puedan estar involucrados en el desarrollo de diferentes enfermedades en

plantas cuando las condiciones ecosistemicas se alteran a puntos extremos (Gonzalez et al 2017)

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon Biscogniauxia

Nemania y Humiacutecola

El geacutenero Daldinia posee unos valores de MPML correspondientes a 10094 con lo cual

se encuentra bien soportado estadiacutesticamente el geacutenero Daldinia se encuentra ubicado en la

familia Xylariaceae al igual que el geacutenero Hypoxylon Biscogniauxia y Nemania que en su

respectivo orden contienen un soporte estadiacutestico MPML de 10082 10099 y 100100 (veacutease

figura 14) los cuales pertenecen a la divisioacuten Ascomycota las cepas de Daldinia se caracterizan

principalmente por ser especies endoacutefitas teniendo la capacidad de estar dentro de su hueacutesped

mucho tiempo sin causarle dantildeo o al menos un dantildeo evidente por medio de su estado asexual

50

No obstante su estado se puede modificar cuando las condiciones externas se modifican

abruptamente en poco tiempo como es el caso de las alteraciones en la temperatura

precipitacioacuten y concentraciones de dioacutexido de carbono (CO2) auspiciados por el cambio

climaacutetico (Saacutenchez et al 2013)

Un estudio realizado por Prieto (2017) en la especie de frailejoacuten E grandiflora encontroacute

que la especie Daldinia eschscholtzii estaba asociado en el siacutentoma de clorosis (falta de clorofila

en las hojas) Tambieacuten se reportoacute que especies de Daldinia como Daldinia conceacutentrica tienen la

capacidad de controlar nematodos fitopatoacutegenos (Silva et al 2020 104) los cuales pueden invadir

y romper los tejidos de la planta dantildeando sus estructuras los nematodos tambieacuten seraacuten sujetos a

migraciones tempranas por el cambio climaacutetico que trae consigo presiones de seleccioacuten por ende

nuevas amenazas para los frailejones (Nakashima et al 2007)

Como hemos visto hasta este punto las especies de hongos endoacutefitos se muestran en

muchos casos como benefactores y protectores de las diferentes plantas en las que habitan

incluyendo diferentes especies de frailejones

Los hongos endoacutefitos protegen tanto de factores bioacuteticos como virus hongos

fitopatoacutegenos bacterias insectos y factores abioacuteticos como las intemperancias del clima no

obstante en su relacioacuten endoacutefita geacuteneros como Hypoxylon que pertenece igual que Daldinia a la

familia Xylariaceae pueden tener roles amenazadores en conjunto con el cambio climaacutetico

seguacuten Gonzales y colaboradores (2019) inocularon cepas pertenecientes al geacutenero Hypoxylon en

hojas de Theobroma cacao y encontraron que en 48 horas se comenzoacute a notar las marcas de

clorosis y deshidratacioacuten foliar esto demuestra que cepas de este geacutenero pueden tener efectos

fitopatoacutegenos ocasionando muerte descendente pudricioacuten del tronco negro y resinosis de ramas

de mezquite (De la Torre-Almaraacutez et al 2003 De la Torre-Almaraacutez et al 2009)

La presencia de este geacutenero dentro del frailejoacuten en un marco del cambio climaacutetico lo

convierte en una amenaza latente ya que las condiciones seraacuten cada vez maacutes agrestes en los

paacuteramos de los Andes Tropicales Puede favorecer el desarrollo de este geacutenero que tiene las

enzimas necesarias para producir la pudricioacuten del tronco negro entre otras enfermedades

relevantes

51

Tambieacuten las especies del geacutenero Hypoxylon se han reportado como endoacutefitos en tejidos de

plantas lentildeosas o herbaacuteceas (Petrini y Petrini 1985 3) asiacute como saprofitos o fitopatoacutegenos

deacutebiles en madera de aacuterboles de zonas templadas o tropicales (Miller 1961) como lo menciona

Miller (1961)

Los geacuteneros Biscogniauxia Nemania tambieacuten estaacuten dentro de la familia Xylariaceae y

Divisioacuten Ascomycota un aspecto interesante de las especies de Biscogniauxia es que son

paraacutesitos exclusivos de las angiospermas dicotiledoacuteneas en donde concluyeron que todas las

especies pertenecientes a este geacutenero son patoacutegenos umllevesuml que se aprovechan de situaciones de

sequiacutea y estreacutes hiacutedrico para aumentar su patogenicidad (Ju et al 1998)

La especie de frailejoacuten E hartwegiana es una Dicotiledoacutenea eso explica porque

podemos encontrar esta especie de hongo endoacutefito en el frailejoacuten del presente estudio siendo de

vital importancia denotar que las especies de Biscogniauxia se aprovechan especialmente de las

situacioacuten de sequiacutea y estreacutes hiacutedrico difiacutecilmente las especies de este geacutenero podriacutean afectar a los

frailejones debido a que se caracterizan por ser reguladores de los ciclos hiacutedricos el agua es el

recurso que maacutes tiende a existir en un paacuteramo por la estructura de sus suelos compuesta por

andosoles porosos y necromasa acumulada teniendo asiacute un alto iacutendice de retencioacuten hiacutedrica

(Hernandez y Muntildeoz 2015) de modo que el cambio climaacutetico no favorece al geacutenero

Biscogniauxia en su estado patogeacutenico dentro del ecosistema de paacuteramo

En cuanto al geacutenero Nemania Da Silva y colaboradores (2018) llevaron a cabo una

investigacioacuten en la cual identificaron cepas pertenecientes a los geacuteneros Colletotrichum

Phyllosticta Xylaria Nemania y Alternaria en la especie ornamental Pachystachys lutea en

donde las mismas cepas fueron ensayadas para inhibir el crecimiento de hongos fitopatoacutegenos

como Colletotrichum sp en donde encontraron que Nemania era capaz de inhibir por medio de la

secrecioacuten de distintas enzimas el crecimiento de dichas especies gracias a su actividad

enzimaacutetica el geacutenero Nemania puede compensar los desequilibrios causados por el cambio

climaacutetico en teacuterminos de hongos fitopatoacutegenos

Hay que tener en cuenta que los elementos que dan forma a las interacciones planta-

endoacutefito incluyen el modo de transmisioacuten el patroacuten de infeccioacuten la edad de la planta las

condiciones ambientales potenciadas por el cambio climaacutetico y los antecedentes geneacuteticos (Aly et

al 2011 6) Los frailejones de la especie E hartwegiana que se muestrearon para el estudio se

52

tomoacute las hojas sanas lo que indica que poseiacutean estas cepas de endoacutefitos en equilibrio siendo este

uno de los pocos reportes de este geacutenero en especies de alta montantildea en los Andes Tropicales

El geacutenero Humiacutecola se encuentra soportado por un MPML de 10076 siendo una

hipoacutetesis evolutiva considerable es el uacutenico de la figura 14 que no estaacute dentro de la familia

Xylariaceae ya que pertenece a la familia Chaetomiaceae aunque se halla en la divisioacuten

Ascomycota se podriacutea considerar a la especie Humiacutecola fuscoatra como una de las especies de

endoacutefitos maacutes umlinofensivasuml debido a trabajos de investigacioacuten reportados como el de Menzies y

colaboradores (1998) y el de Naik y colaboradores (2009)

Humiacutecola fuscoatra no se considera un peligro latente para la especie E hartwegiana ya

que existe en equilibrio con su entorno Estaacute comprobado por medio de caracterizaciones

quiacutemicas que Humiacutecola fuscoatra es un importante productor de moleacuteculas de estimacioacuten

medica como el resorciacuteclico y lactonas aacutecidas (Mejia et al 2014) Por lo tanto es una especie

prometedora con un reservorio de metabolitos secundarios de importancia medicinal e industrial

que de seguir los efectos nocivos del cambio climaacutetico en los Andes Tropicales maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos esta especie podriacutea desaparecer

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies Massarina

Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

Uno de los grupos mejores soportados en este cladograma es el grupo de Diaporthe en el

cual se encontraron cuatro especies siendo uno con maacutes abundancia de especies del estudio y que

posee un MPML de 10085 10089 y 10095 acorde a sus 3 nodos (veacutease figura 15) teniendo asiacute

una hipoacutetesis evolutiva confiable de estas relaciones las especies de Diaporthe pertenecen a la

familia Diaporthaceae de la divisioacuten Ascomycota y son especies de endoacutefitos que se distinguen

por inhibir el crecimiento de hongos patoacutegenos en el hospedero que se encuentren El estudio de

53

Da Silva y colaboradores (2018) mostroacute que cepas de Diaporthe sp Inhibieron el crecimiento de

Fusarium oxysporum y Colletotrichum sp hongos fitopatoacutegenos que aumentaran su presencia

aprovechando las alteraciones producidas por el cambio climaacutetico en los paacuteramos

Las especies de este geacutenero estaacuten en continuo cambio entre endoacutefitos y patoacutegenos

funcionando en la mayoriacutea de los casos en una relacioacuten mutualista en donde le brindan a la planta

mayor tolerancia a las sequias proteccioacuten de patoacutegenos y pestes caracteriacutestica uacutetil frente a los

retos ecoloacutegicos que plantea el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales (Hubbard et al 2014)

se conocen cerca de 800 especies de este geacutenero asociadas a una amplia gama de plantas

vasculares a nivel mundial (Rossman et al 2015)

Esto explica porque las especies de Diaporthe fueron una de las maacutes numerosas

encontradas en la especie de alta montantildea E hartwegiana teniendo en cuenta que esta especie

pasa raacutepidamente de un estado endoacutefito a un estado patogeacutenico y dada su faacutecil y alta distribucioacuten

representa un peligro en conjunto con el cambio climaacutetico para las especies de alta montantildea como

los frailejones y supone una amenaza para el balance hiacutedrico y ecosistemico en el futuro

El geacutenero Crassiparies de la familia Neohendersoniaceae y el geacutenero Massarina de la

familia Massarinaceae pertenecen al orden Pleosporales aunque se discute debido a las

similaridades morfoloacutegicas y genoacutemicas con Massarina si Crassiparies deberiacutea estar en la

familia Massarinaceae (Hyde et al 2013 4) Se tiene poca informacioacuten sobre la especie

Crassiparies quadrisporus por ende este puede ser uno de los primeros reportes de esta especie

en una especie de alta montantildea como lo es el frailejoacuten especiacuteficamente en la especie E

hartwegiana en un marco de cambio climaacutetico el geacutenero Crassiparies necesita mayores estudios

a nivel ecoloacutegico y microbioloacutegico para entender su papel dentro de esta crisis climaacutetica

Mientras tanto el geacutenero Massarina ha logrado ser aislado de agua dulce con el fin de

obtener fuentes de productos naturales bioloacutegicamente activos por medio de las investigaciones

quiacutemicas de Shearer (1999 2001) en una especie de Massarina obtuvieron como resultado el

aislamiento de tres nuevos sequiterpenoides y dos lactonas derivadas de policeacutetidos con nuevos

sistemas de anillos lo que indica que esta especie tambieacuten puede tener un rol importante

mediante la produccioacuten de enzimas y metabolitos secundarios en el marco de las invasiones

bioloacutegicas impulsadas por el cambio climaacutetico

54

El geacutenero Cryptocoryneum de la familia Cryptocoryneaceae existe poca informacioacuten de

sus mecanismos de accioacuten como endoacutefito o patoacutegeno maacutes aun en especies de los Andes

Tropicales este podriacutea ser uno de los primeros reportes sobre esta especie de hongo en una

especie de frailejoacuten especiacuteficamente E hartwegiana en el 2015 se reportoacute en Brasil el

descubrimiento de una nueva especie del genero Cryptocoryneum trataacutendose de Cryptocoryneum

parvulum hallada en las hojas de la especie Araucaria angustifolia (Gimnosperma) (Silva et al

2015 1) la informacioacuten sobre el geacutenero Cryptocoryneum en relacioacuten al cambio climaacutetico y sus

efectos dentro de especies de alta montantildea como el frailejoacuten auacuten son poco conocidas

Uno de los geacuteneros maacutes cercanos a los grupos externos del cladograma es Cyphellophora

perteneciente a la familia Cyphellophoraceae el cual posee un MPML de 10091 logrando una

hipoacutetesis evolutiva confiable Diversas especies de Cyphellophora han logrado ser aisladas de

infecciones superficiales de la piel o las untildeas en humanos y de materiales vegetales (Decock et

al 2003 Cheewangkoon et al 2009) Esto indica su amplia distribucioacuten y su capacidad para ser

patogeacutenica tanto en plantas como en animales maacutes aun en condiciones desfavorables para la

planta como son las condiciones de cambio climaacutetico

De la especie Cyphellophora reptans se tiene reporte que su morfologiacutea es muy similar a

la de una levadura por lo que es faacutecilmente confundida con una (Reacuteblovaacute et al 2013) Es posible

que este sea el uacutenico reporte de Cyphellophora reptans en las hojas de un frailejoacuten o especie de

alta montantildea que habite en los troacutepicos como E hartwegiana debido a ello sus mecanismos de

accioacuten en especies de paramo dentro de un marco de cambio climaacutetico es poco conocido Se

necesitan mayores estudios enfocados en esta especie para entender su ecologiacutea y dinamismo

ecoloacutegico respecto a los cambios en las variables ambientales

Se eligieron las especies Coprinellus domesticus y Coprinellus xanthothrix como grupos

externos con el fin de enraizar el aacuterbol debido a que pertenecen a la Divisioacuten Basidiomycota la

cual difiere en grado de la divisioacuten Ascomycota aunque conserva semejanzas conocidos como

caracteres ancestrales o plesiomorficos que avanzan a medida la filogenia se construye con los

datos de las diferentes secuencias de especies evidenciando novedades evolutivas conocidas

como apomorfias que cuando se dan en un grupo en particular pasan a ser sinapomorfias es decir

novedades evolutivas dentro de un grupo particular (Lehtonen 2020) Se optoacute por enraizar con

55

estas dos especies con el objetivo de dar robustez al aacuterbol filogeneacutetico (Barriel y 1998) lo cual se

consiguioacute como se nota en los estadiacutesticos del aacuterbol filogeneacutetico

56

57

Conclusiones

Se rechaza la hipoacutetesis nula (H0) y se concluye que la identificacioacuten y caracterizacioacuten

molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo Colombia es diferente en 80 de sus geacuteneros y

especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos realizadas en especies de frailejoacuten

Por lo tanto los nuevos geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos encontrados en el frailejoacuten

plantean nuevos desafiacuteos respecto al cambio climaacutetico ya que tienen un rol vital en la

supervivencia de estas especies de alta montantildea como los frailejones debido a su relacioacuten

mutualista o patoacutegena maacutes aun en los paacuteramos que son altamente sensibles a los efectos del

cambio climaacutetico incluso tan sensibles como las zonas polares (Bradley et al 2006)

La mayoriacutea de especies encontradas en el presente estudio tienen potencial para ayudar a

combatir el estreacutes abioacutetico producido por el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales

Especiacuteficamente pueden ayudar a combatir el estreacutes bioacutetico producido por virus hongos

bacterias e insectos en un marco de cambio climaacutetico aumentos de temperatura cambios en la

concentracioacuten de CO2 cambios en la precipitacioacuten migraciones tempranas cambios en la

nubosidad disponibilidad hiacutedrica alteraciones en la estructura y composicioacuten de las especies

endeacutemicas del paacuteramo

58

59

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Anexos

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombia

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia

hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

74

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

Coordenadas Geograacuteficas

(Latitud)

De la Colecta del

Material Bioloacutegico total de 15

muestras (Longitud)

LAT N 4deg 37 5871717 LONG W 75deg 25

3292611

LAT N 4deg 37 5885220 LONG W 75deg 25

3271217

LAT N 4deg 37 5884485 LONG W 75deg 25

3312103

LAT N 4deg 36 5995487 LONG W 75deg 27

3045854

LAT N 4deg 37 6195784 LONG W 75deg 30

3292611

LAT N 4deg 40 159171 LONG W 75deg 26

380142

LAT N 4deg 40 363762 LONG W 75deg 26

209072

LAT N 4deg 40 399832 LONG W 75deg 27

173554

LAT N 4deg 40 383965 LONG W 75deg 27

464325

LAT N 4deg 39 486438 LONG W 75deg 27

173559

LAT N 4deg 40 56894 LONG W 75deg 26

568287

LAT N 4deg 40 159174 LONG W 75deg 27

190654

LAT N 4deg 40 125083 LONG W 75deg 26

345912

LAT N 4deg 40 116691 LONG W 75deg 27

208264

LAT N 4deg 40 314698 LONG W 75deg 27

140791

75

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un estereoscopio con el propoacutesito de seleccionar la

maacutes indicada y luego sembrar un cultivo puro a partir de ese micelio

76

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados las

copias se conservaron con glicerol a -80degC en un ultra congelador de Thermo Scientifictrade

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas

y enviadas

77

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicos de forma segura y esteacuteril propiedad de la Universidad del Quindiacuteo

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a la Universidad Ruhr de Bochum (Alemania)

78

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de parsimonia

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X en donde se

observa en amarillo la secuencia umlTCATTAuml la cual es una secuencia altamente conservada

que se usa para marcar el inicio de la misma en hongos endoacutefitos

79

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa JmoldelTest usados para generar el

aacuterbol de relaciones filogeneacuteticas a partir de la regioacuten ITS de los hongos endoacutefitos aislados

total de modelos evaluados 88

ID Nombre Particioacuten lnL P AIC detaAIC Peso Cumpeso Udelta

1 JC 0 100820157 138 204400314 1341348 0 1 -

2 JC+I 0 98912511 139 200605022 9618188 0 1 -

3 JC+G 0 95470113 139 193720225 2733392 0 1 -

4 JC+I+G 0 95467507 140 193735014 274818 0 1 -

5 F81 0 100658095 141 204136189 13149356 0 1 -

6 F81+I 0 98761481 142 200362962 9376128 0 1 -

7 F81+G 0 95314814 142 193469628 2482794 0 1 -

8 F81+I+G 0 95324364 143 193508729 2521895 0 1 -

9 K80 10010 99734495 139 20224899 11262157 0 1 -

10 K80+I 10010 97835191 140 198470382 7483549 0 1 -

11 K80+G 10010 94227821 140 191255643 268809 0 1 -

12 K80+I+G 10010 94209963 141 191239926 253092 0 1 -

13 HKY 10010 99648091 142 202136181 11149348 0 1 -

14 HKY+I 10010 97761512 143 198383024 7396191 0 1 -

15 HKY+G 10010 94170799 143 191201599 214765 0 1 -

16 HKY+I+G 10010 94118678 144 191117357 130523 600E-04 0999 -

17 TrNef 10020 99564653 140 201929306 10942472 0 1 -

18 TrNef+I 10020 97712623 141 198245245 7258412 0 1 -

19 TrNef+G 10020 94150977 141 191121955 135121 400E-04 09994 -

20 TrNef+I+G 10020 94132131 142 191104263 117429 00011 09959 -

21 TrN 10020 99563809 143 201987618 11000784 0 1 -

22 TrN+I 10020 97702964 144 198285929 7299095 0 1 -

23 TrN+G 10020 94094235 144 191068469 81635 00065 09719 -

24 TrN+I+G 10020 94101378 145 191102757 115923 00012 09948 -

25 TPM1 12210 99713879 140 202227759 11240925 0 1 -

26 TPM1+I 12210 97826641 141 198473282 7486449 0 1 -

27 TPM1+G 12210 94249837 141 191319674 33284 0 1 -

28 TPM1+I+G 12210 942022 142 1912444 257566 0 1 -

29 TPM1uf 12210 99663473 143 202186945 11200112 0 1 -

30 TPM1uf+I 12210 97879458 144 198638917 7652083 0 1 -

31 TPM1uf+G 12210 94137349 144 191154699 167865 100E-04 09999 -

32 TPM1uf+I+G 12210 94141897 145 191183794 196961 0 1 -

80

33 TPM2 10212 99722544 140 202245087 11258254 0 1 -

34 TPM2+I 10212 97828213 141 198476426 7489592 0 1 -

35 TPM2+G 10212 94185859 141 191191718 204885 0 1 -

36 TPM2+I+G 10212 94153667 142 191147335 160501 100E-04 09998 -

37 TPM2uf 10212 99648091 143 202156182 11169348 0 1 -

38 TPM2uf+I 10212 97757018 144 198394035 7407202 0 1 -

39 TPM2uf+G 10212 941052 144 1910904 103566 00022 09904 -

40 TPM2uf+I+G 10212 9408801 145 19107602 89187 00044 0982 -

41 TPM3 12012 99768005 140 20233601 11349176 0 1 -

42 TPM3+I 12012 97958099 141 198736198 7749364 0 1 -

43 TPM3+G 12012 94227963 141 191275926 289093 0 1 -

44 TPM3+I+G 12012 94323885 142 191487769 500936 0 1 -

45 TPM3uf 12012 99625421 143 202110843 11124009 0 1 -

46 TPM3uf+I 12012 97770469 144 198420939 7434105 0 1 -

47 TPM3uf+G 12012 94165576 144 191211152 224319 0 1 -

48 TPM3uf+I+G 12012 94150861 145 191201721 214888 0 1 -

49 TIM1ef 12230 99592239 141 202004478 11017644 0 1 -

50 TIM1ef+I 12230 97822787 142 198485574 749874 0 1 -

51 TIM1ef+G 12230 94121043 142 191082087 95253 00033 09853 -

52 TIM1ef+I+G 12230 94122386 143 191104772 117939 00011 09969 -

53 TIM1 12230 99518653 144 201917306 10930473 0 1 -

54 TIM1+I 12230 9781156 145 19852312 7536286 0 1 -

55 TIM1+G 12230 94105198 145 191110396 123562 800E-04 09977 -

56 TIM1+I+G 12230 94087158 146 191094317 107483 00018 09922 -

57 TIM2ef 10232 99550617 141 201921233 109344 0 1 -

58 TIM2ef+I 10232 97704602 142 198249204 726237 0 1 -

59 TIM2ef+G 10232 94093484 142 191026968 40135 00516 0852 -

60 TIM2ef+I+G 10232 94073864 143 191007729 20895 0135 07169 -

61 TIM2 10232 99530022 144 201940044 1095321 0 1 -

62 TIM2+I 10232 97820158 145 198540315 7553482 0 1 -

63 TIM2+G 10232 94058678 145 191017356 30523 00834 08004 -

64 TIM2+I+G 10232 94060837 146 191041674 54841 00247 09248 -

65 TIM3ef 12032 99546286 141 201912572 10925739 0 1 -

66 TIM3ef+I 12032 97713931 142 198267862 7281028 0 1 -

67 TIM3ef+G 12032 94129376 142 191098753 111919 00014 09936 -

68 TIM3ef+I+G 12032 94112005 143 191084009 97176 0003 09883 -

69 TIM3 12032 99514376 144 201908751 10921918 0 1 -

70 TIM3+I 12032 97700023 145 198300047 7313213 0 1 -

71 TIM3+G 12032 94115323 145 191130646 143812 300E-04 09997 -

72 TIM3+I+G 12032 94096941 146 191113882 127048 700E-04 09984 -

73 TVMef 12314 9970418 142 20224836 11261526 0 1 -

74 TVMef+I 12314 97940598 143 198741196 7754363 0 1 -

81

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE (AIC)

75 TVMef+G 12314 94159829 143 191179657 192824 0 09999 -

76 TVMef+I+G 12314 94160993 144 191201987 215153 0 1 -

77 TVM 12314 99615991 145 202131982 11145148 0 1 -

78 TVM+I 12314 97746676 146 198413353 7426519 0 1 -

79 TVM+G 12314 94075503 146 191071005 84171 00057 09776 -

80 TVM+I+G 12314 94052588 147 191045176 58342 00208 09456 -

81 SYM 12345 99543166 143 201946331 10959498 0 1 -

82 SYM+I 12345 97757103 144 198394207 7407373 0 1 -

83 SYM+G 12345 94083056 144 191046112 59278 00198 09654 -

84 SYM+I+G 12345 94050035 145 19100007 13236 0198 05819 -

85 GTR 12345 99529525 146 20197905 10992217 0 1 -

86 GTR+I 12345 97686178 147 198312356 7325522 0 1 -

87 GTR+G 12345 94044194 147 191028387 41553 00481 09001 -

88 GTR+I+G 12345 94013417 148 190986834 0 03839 03839 -

10

11

Tabla de contenidos

Figuras mapas y tablashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13

Introduccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 15

Capiacutetulo primero Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

1 Antecedenteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

2 Justificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 25

3 Hipoacutetesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 26

4 Objetivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

41 Objetivo generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

42 Objetivos especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

Capiacutetulo segundo Materiales Meacutetodos y Resultadoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

1 Aacuterea de Estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

2 Colecta de material bioloacutegicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos

endoacutefitos)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32

5 Extraccioacuten de ADNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

7 Secuenciamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

8 Anaacutelisis Filogeneacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

Capiacutetulo Tercero Discusioacuten sobre los hongos endoacutefitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidadhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio

Climaacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42

Conclusioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 57

Obras citadashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 59

Anexoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 73

12

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphellip 73

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia 73

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphelliphellip74

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana 75

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un

estereoscopio 75

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 76

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas y

enviadas 76

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 75

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a Alemania a la Universidad Ruhr de

Bochum 77

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de

parsimoniahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 78

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X 78

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa

JmoldelTest 79

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE

(AIC) 81

13

Figuras mapas y tablas

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo

Colombiahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras

N necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefitohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y

abioacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en

medio de cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelialhelliphelliphellip 30

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la

teacutecnica de corte de hifa uacutenica helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de

cultivo Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12)

aislados de las hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana 31-32

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 10 Filograma obtenido a partir del anaacutelisis ML y MP del conjunto de datos ITS Aislados

de las hojas de frailejoacuten37

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip43

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e

Hypocreahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip46

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon48

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon

Biscogniauxia Nemania y Humiacutecolahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

14

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies

Massarina Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona

muestreadahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia 29-30

Tabla 2 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos

endoacutefitos en la especie Espeletia hartwegiana

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36

Tabla 3 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = presencia del genero

de hongo dentro de la especie de frailejoacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42-43

15

Introduccioacuten

Hay un libro abierto siempre para

todos los ojos la naturaleza

(Jean-Jacques Rousseau 1712-1778)

El cambio climaacutetico corresponde a un fenoacutemeno que afecta el planeta de manera natural

permitiendo mantener las condiciones climaacuteticas como la temperatura la precipitacioacuten entre

otras en un rango aceptable para la vida (Jimeacutenez 2010) Sin embargo dado el aumento de las

emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) principalmente asociado a las actividades

humanas y el alto consumo de combustibles foacutesiles los cambios en dichas condiciones han sido

alterados dando paso a un acelerado aumento de temperatura anual en las uacuteltimas deacutecadas con

precipitaciones y sequias maacutes frecuentes e intensas (IPCC 2020 5 Jimeacutenez 2010)

Acorde con el Panel Intergubernamental de Expertos en Cambio Climaacutetico (IPCC) para

fin de siglo el Cambio Climaacutetico se acrecentaraacute pronosticando un aumento de temperatura de 25

a 45 degC para el antildeo 2100 que tan solo para Colombia en los uacuteltimos 30 antildeos fue de 08degC

generando impactos notorios en las zonas de alta montantildea como los paacuteramos (Moreno y Palma

2016)

El cambio climaacutetico es un fenoacutemeno cuyos efectos alcanzaraacuten los paacuteramos los cuales son

ecosistemas de alta montantildea presente en elevaciones entre 3100 y 4700 m ubicados en el norte de

los Andes de Ameacuterica del Sur y el sur de Ameacuterica Central adyacente (Berdugo et al 2016) Estas

aacutereas se caracterizan por una vegetacioacuten principalmente endeacutemica compuesta por frailejones

matorrales y pastos (veacutease figura 1) (Garciacutea et al 2010)

Los ecosistemas de alta montantildea como los paacuteramos ofrecen diversos servicios

ambientales como la biodiversidad uacutenica que albergan los paisajes los suelos y su capacidad de

retener y almacenar agua (Morales et al 2019) Las formaciones vegetales juegan un papel

diferenciado en el mantenimiento de la humedad y las fuentes de agua en el ecosistema

presentando la capacidad de interceptar almacenar y regular los flujos hiacutedricos superficiales y

16

subterraacuteneos aportando los servicios de abastecimiento de agua para el 70 de la poblacioacuten de

Colombia (Vaacutesquez y Buitrago 2017)

Ademaacutes dada la caracteriacutestica de permanente humedad de su suelo la materia orgaacutenica

se descompone a menor velocidad logrando un efecto de retencioacuten y almacenamiento de carbono

(Anderson et al 2012) En Colombia se han realizado diferentes estudios sobre la distribucioacuten y

extensioacuten del ecosistema paramuno Rangel (2002 4) determinoacute que los paacuteramos colombianos

abarcaban aproximadamente el 26 de la superficie del paiacutes

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramos por Pedraza-Pentildealosa Betancur y Franco-Rosselli (2005)

En particular el paacuteramo Romerales se encuentra dentro del territorio adscrito a los

Parques Nacionales Naturales (PNN) especiacuteficamente el PNN de los Nevados en la cordillera

central colombiana hacia la zona norte del Departamento del Quindiacuteo con liacutemites fronterizos

entre los departamentos de Risaralda y Tolima Este paacuteramo es el hogar del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana el cual estaacute afrontando los efectos del cambio climaacutetico (veacutease mapa 1)

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona muestreada

17

Existe evidencia cientiacutefica concreta del aumento de temperatura en los Andes Tropicales

tambieacuten cambios significativos en los patrones de precipitacioacuten sumado a la disminucioacuten en la

incidencia del clima nublado lo que conduce a las plantas a mayor cantidad de horas expuestas a

la radiacioacuten solar (Ruiz et al 2009) Otro efecto grave que trae consigo el cambio climaacutetico es el

desplazamiento de especies en el gradiente altitudinal Con un aumento de 3degC se espera que las

especies se muevan ~600 m en buacutesqueda de su optimo teacutermico esto afectariacutea gravemente las

especies de paacuteramo como los frailejones Cuesta Camacho (2007)

Los frailejones son emblemaacuteticas plantas de paacuteramo y ecosistemas de alta montantildea

(MINAMBIENTE 2019) Pertenecen a la familia Asteraceae contiene cerca de 142 especies

agrupadas en ocho geacuteneros Carramboa Coespeletia Espeletia Espeletiopsis Libanothamnus

Paramiflos Ruilopezia y Tamania de estos los maacutes importantes y con mayor diversidad de

especies son Espeletia Espeletiopsis y Libanothamnus (Rivera y Torres 2001)

Poseen adaptaciones que les permite captar y retener grandes cantidades de agua de su

entorno permitiendo un balance ecosistemico (Farias 2013) La morfologiacutea singular del genero

Espeletia le permite acumular las hojas antiguas en forma de ldquoabrigordquo brindando proteccioacuten

contra las bajas temperaturas nocturnas de hasta 0degC Los fuertes vientos y la radiacioacuten solar los

cuales seraacuten cada vez maacutes intensos y frecuentes por causa del cambio climaacutetico (Cortes y

Sarmiento 2013 34) (veacutease figura 2)

Estas plantas son especies claves para la conservacioacuten de los paacuteramos y la lucha contra el

cambio climaacutetico debido a que ofrecen una gran variedad de servicios ecosisteacutemicos (Diacuteaz et al

2007) El paacuteramo es referente sin igual de fuente hiacutedrica ciudades como Bogotaacute y Quito obtienen

aproximadamente el 80 de su agua dulce de los paacuteramos (Buytaert et al 2006) Los frailejones

en su mayoriacutea endeacutemicos se han visto afectados por actividades humanas como la ganaderiacutea

extensiva agricultura (cultivos de papa y cebolla) mineriacutea de oro y carboacuten turismo no

controlado y quemas intencionales (Hofstede 2000) Esta situacioacuten podriacutea comprometer a

mediano y largo plazo la funcioacuten de captacioacuten regulacioacuten y suministro del agua para el consumo

18

en las ciudades colombianas ubicadas en las regiones de influencia de estos ecosistemas (Varela

2015)

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

No obstante en asociacioacuten con especies como el frailejoacuten de los Andes Tropicales

encontramos a los hongos cuyos roles en las interacciones bioloacutegicas son de vital importancia

Los hongos pueden ser endoacutefitos simbiontes mutualistas paraacutesitos y comensales y son capaces

de responder a las amenazas que plantea el cambio climaacutetico en cuanto a perturbaciones

ambientales aumento de temperatura y estreacutes hiacutedrico adaptaacutendose a la disponibilidad de recursos

modificando sus actividades enzimaacuteticas e incluso su genoma a lo largo del tiempo (Moreno et

al 2013)

Los hongos son clasificados seguacuten su forma de reproduccioacuten sea sexual o asexual en

donde se observan las diferencias estructurales internas entre los diferentes grupos tales como

sus esporas e hifas como lo indican Blackwell y Spatafora (2004) estos organismos estaacuten

divididos en cuatro grandes grupos los cuales son Ascomycota Basidiomycota

Chytridiomycota Zygomycota es justo en el grupo de los Ascomycota donde se encuentra gran

diversidad de hongos conocidos como ldquohongos endoacutefitosrdquo en donde su nombre ldquoendoacutefitordquo

significa ldquodentro de la plantardquo (endon dentro phyton planta)

19

Estos microorganismos fuacutengicos tienen la facilidad de pasar gran parte o todo su ciclo de

vida invadiendo los tejidos de su hospedero (planta) sin tener un efecto negativo evidente

(Leacuteveilleacute 1846 3 de Bary 1866 8) Por lo tanto el concepto de endoacutefito indica una asociacioacuten de

costo-beneficio pero de una forma mutualista entre el hongo y la planta hospedera permitiendo

la estadiacutea en sus tejidos vivos (Clay 1998 8) Los hongos endoacutefitos se han encontrado en todas

las plantas (algas musgos pastos plantas y vasculares) desde los bosques templados hasta los

bosques tropicales hallaacutendose una gran diversidad de plantas y en asociacioacuten gran diversidad de

hongos endoacutefitos (Saacutenchez et al 2010)

Se espera que los hongos endoacutefitos jueguen un papel cada vez maacutes importante potenciado

por el cambio climaacutetico en las enfermedades producidas en plantas como pudricioacuten radicular

mal blanco entre otras con los aumentos pronosticados de la temperatura y el estreacutes por sequiacutea

asociados al cambio climaacutetico (Desprez-Loustau et al 2006 Slippers y Wingfield 2007 6) Los

cambios en la cantidad de dioacutexido de carbono (CO2) y la disponibilidad de nitroacutegeno en el suelo

afectan de forma similar tanto a las plantas como a los hongos por ende las alteraciones

generadas por parte del cambio climaacutetico pueden causar desbalances en sus relaciones (Ies et al

2013)

Algunos estudios realizados en el antildeo 1898 donde se registraron los primeros hongos

endoacutefitos como el de Bary (1866) brindo la iniciativa de investigaciones que lograron explicar

los cuadros toxicoloacutegicos observados en animales los cuales se daban por el consumo de

semillas o en aacutereas de pastos (Poaceae) que posiblemente albergaban hongos Clavicipitaacuteceos

(familia del ergot) los cuales poseiacutean actividades enzimaacuteticas con micotoxinas

Por diversas situaciones no trascendioacute la investigacioacuten hasta que Bacon (1977) hizo

relacioacuten del hongo endoacutefito Neotyphodium coenophialum debido a una intoxicacioacuten del ganado

llamado ldquosiacutendrome de veranordquo cuando estos animales consumiacutean pastos de la especie Festuca

arundinacea (Poaceae) Funk en el antildeo 80 caracterizoacute la resistencia de las Poaceae que

albergaban hongos endoacutefitos que frecuentemente eran atacados por insectos (proteccioacuten contra

herbiacutevoros) (Saacutenchez et al 2010)

Compant y colaboradores (2010) mencionaron que tras experimentar en el laboratorio

con una gama de temperaturas en los hongos endoacutefitos aislados obtuvieron resultados variables

respecto al crecimiento es decir positivos y neutrales llegando a la conclusioacuten de que los

microorganismos asociados a las plantas son un factor importante que influye en la respuesta de

20

las plantas acorde a los cambios de temperatura lo que compromete las respuestas del frailejoacuten y

los hongos endoacutefitos frente al calentamiento global causado por el cambio climaacutetico

Con relacioacuten a los estudios realizados sobre hongos endoacutefitos en frailejones se han

encontrado al menos 100 especies con capacidades de inhibir hongos fitopatoacutegenos o herbivoriacutea

(Cabezas et al 2012)

Los geacuteneros de hongos endoacutefitos encontrados en anteriores estudios son Acremonium

Aspergillus Aureobasidium Colletotrichum Fusarium Gliocadium Nigrospora Paecilomyces

Penicillium Trichothecium Trichoderma y Sordaria (Pineda 2000 Programa Nacional para la

Evaluacioacuten del Estado y Afectacioacuten de los Frailejones en los Paacuteramos de Andes del Norte 2009)

Teniendo en cuenta que para Colombia hay poca informacioacuten sobre hongos endoacutefitos en

ecosistemas paramunos se hace fundamental la ampliacioacuten de maacutes informacioacuten referente al tema

debido a que solo existen estudios significativos en cafeacute leguminosas y rosas los cuales maacutes allaacute

de la identificacioacuten de geacuteneros de hongos endoacutefitos no incluyen el cambio climaacutetico y sus

posibles consecuencias (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016) En

teacuterminos filogeneacuteticos los hongos son el reino de la naturaleza maacutes cercano a los animales

(Hibbett et al 2018)

Las relaciones que posean las diferentes especies de endoacutefitos dentro de la especie de

frailejoacuten es de importancia conocerla mediante el uso de la filogenia molecular (Judd et al 2007)

mediante secuencias de ADN ARN o proteiacutenas (Cooke et al 2000) Dependiendo de la presencia

de especies agresivas de endoacutefitos como Nigrospora se puede tener un mejor conocimiento

sobre las consecuencias que trae consigo los impactos del cambio climaacutetico sobre estas plantas de

los Andes Tropicales (Foden et al 2009)

21

Capiacutetulo primero

Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitos

1 Antecedentes

Desde los estudios realizados por Leacuteveilleacute (1846) y Bary (1866) sobre hongos Endoacutefitos

en pastos de zonas templadas se ha logrado identificar que estos hongos son capaces de inducir

respuestas adaptativas a sus hospederos (Micotoxinas contra herbiacutevora adaptacioacuten a heladas o

climas extremos fijacioacuten de nutrientes) a cambio de alimento y hospedaje formando una relacioacuten

mutualista en la cual las dos especies involucradas son beneficiadas No obstante se ha reportado

que los hongos endoacutefitos ademaacutes de tener relaciones mutualistas con diferentes especies

vegetales se pueden tornar en especies patoacutegenas para su hospedero una vez la planta se

encuentra en condiciones desventajosas tornaacutendose asiacute el hongo endoacutefito en un hongo

fitopatoacutegeno (Herrera y Ulloa 1990 550)

Como se mencionoacute anteriormente los hongos endoacutefitos pueden pasar de un estado

mutualista a un estado de patogeacutenesis dada esta relacioacuten entre ambos organismos se producen

metabolitos secundarios potencialmente toacutexicos facilitando factores de virulencia dados por el

hongo endoacutefito como exoenzimas y metabolitos fitotoacutexicos a su vez la planta presenta defensas

tanto mecaacutenicas como bioquiacutemicas (Saacutenchez et al 2013 5)

Hasta la fecha los principales estudios de hongos endoacutefitos se han fijado en especies de

intereacutes econoacutemico y comercial tales como palma de aceite cafeacute leguminosas pastos de forrajeoacute

y diferentes tipos de rosas (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016)

Las especies modelo para el estudio de los hongos endoacutefitos han sido las gramiacuteneas

forrajeras en donde se han reportado especies de endoacutefitos asociados a los geacuteneros Lolium

Festuca y Brachiaria (Siegel et al 1987) no obstante Otero y Bayman (2009) han reportado un

creciente nuacutemero de estudios en orquiacutedeas epifitas tropicales relaciones con hongos micorrizicos

22

Actualmente existen escasos reportes de hongos endoacutefitos asociados a ecosistemas con

climas extremos (temperaturas extremas) como aacuterticos desiertos paacuteramos y zonas alpinas

especialmente para zonas de temperaturas friacuteas como lo son los paacuteramos (Lopera et al 2008

Leung et al 2011 Cabezas et al 2012 Miles et al 2012 Zhang y Yao 2015)

Investigadores como Lopera Leung y colaboradores (2011) han llegado a la conclusioacuten

de que los hongos endoacutefitos juegan un papel importante en las plantas a la hora de adaptarse a

ecosistemas de clima templado (Kivlin et al 2013 Zhang y Yao 2015)

En Colombia los trabajos con hongos endoacutefitos son pocos por ende trabajos como el de

Lopera y colaboradores (2008) con especies del genero Espeletia de los paacuteramos Colombianos

son pioneros ademaacutes del trabajo de Cabezas y colaboradores (2012 4) en el cual aislaron y

caracterizaron celulasas (enzimas descomponedores de la celulosa) extraiacutedas de hongos endoacutefitos

que se hallaban en especies de Espeletia posteriormente Lopera y Miles (2012) unieron

esfuerzos para continuar caracterizando la diversidad de hongos endoacutefitos en los paacuteramos andinos

colombianos enfocados en Espeletia con el objetivo de encontrar especies con potencial

biocontrolador

Existen trabajos tesis en los repositorios de diversas universidades de los antildeos 2014 y

2015 en los cuales se aborda el tema de los hongos endoacutefitos paacuteramos y especies de Espeletia

(frailejones) y de la familia Poaceae en donde se caracterizan las diversas especies de hongos

endoacutefitos por medio taxonomiacutea y biologiacutea molecular ademaacutes de buscar metabolitos secundarios

con fines medicinales o de biocontrol

Los trabajos en filogenia molecular de hongos endoacutefitos realizados en frailejones se han

visto enfocados maacutes hacia la buacutesqueda de la diversidad funcional en comunidades

microbioloacutegicas como por ejemplo el estudio realizado por Ruiz y colaboradores (2015) en

donde buscaron mediante el anaacutelisis molecular de raiacuteces necromasa hojas maduras y joacutevenes de

diferentes especies de Espeletia (veacutease figura 3) ubicada en los Andes neotroacutepicales

colombianos secuencias geneacuteticas de las regiones V5-V6 de la unidad 16S del rARN

23

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras N

necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefito Tomado de Ruiz y colaboradores (2015)

Este estudio analizoacute la composicioacuten de comunidades microbioanas y su diversidad

funcional en un ecosistema de alta montantildea en donde las temperaturas los rayos UV y la altura

juegan papeles determinantes como filtros ecoloacutegicos severos en donde solo pueden existir

especies que han desarrollado capacidades para adaptarse sobrevivir y colonizar dichas aacutereas

por ende cuando se analizaron las comunidades existentes dentro de estas especies de Espeletia

Encontraron que algunas especies halladas podriacutean tener roles importantes como

productores de metabolitos secundarios enzimas o incluso como bioremediadores y que las

comunidades microbianas eran diferentes tanto en sus hojas como en sus raiacuteces y en la

necromasa

A medida que las deacutecadas avanzan y la evidencia sobre el cambio climaacutetico se hace maacutes

robusta y evidente los estudios en los hongos endoacutefitos han tomado vital importancia al estar

asociados con cultivos de especies comestibles escases de agua y de tierras productivas sumado

a los efectos negativos que trae consigo el cambio climaacutetico para las diferentes plantaciones y

cosechas a nivel global

Es por eso que Lu Yan y colaboradores (2019) analizaron los efectos positivos que teniacutean

la colonizacioacuten de hongos endoacutefitos en las plantas en donde ratificaron que los hongos endoacutefitos

dentro la planta generan metabolitos antimicrobianos estimulan las respuestas inmunoloacutegicas y

compiten por espacio dentro de la planta con diferentes patoacutegenos incrementando asiacute la

resistencia contra herbiacutevoros y la resistencia al estreacutes salino (factores bioacuteticos)

Ademaacutes de ayudar a la planta contra el estreacutes abioacutetico causado principalmente por

factores climaacuteticos como la falta de agua (estreacutes hiacutedrico) las temperaturas extremas la

intensidad de los rayos UV y los metales pesados como la muestra la figura 4 debido a esto se

24

concluyoacute que las fitohormonas cumplen un papel importante en la colonizacioacuten de hongos

endoacutefitos dentro de la planta

Aun que se ha reportado que los hongos endoacutefitos se pueden usar como biocontroladores

diferentes estudios reportan que el uso de hongos endoacutefitos puede tener efectos adversos como

un retraso significativo en el crecimiento de la planta con el uso de la especie Cryptosporiopsis

sp (Terhonen et al 2016) Otro reporte indica la fecundidad y supervivencia de enemigos

naturales como paraacutesitos esto es debido a que los hongos endoacutefitos transfieren sus toxinas y

alcaloides cuando son ingeridos por paraacutesitos u otros enemigos naturales de las plantas (Lopez y

Sword 2015)

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y abioacutetico

Bajo estreacutes bioacutetico (herbiacutevoros y patoacutegenos) y abioacutetico (sequiacutea salinidad metales pesados y otros) (a) se

inducen respuestas de defensa de las plantas (b) los endoacutefitos producen metabolitos protectores y

modulan la viacutea de las fitohormonas para mejorar la inmunidad de las plantas (c) tomada de Lu yan y

colaboradores (2019 7)

25

2 Justificacioacuten

La presente investigacioacuten pretende identificar y caracterizar que especies de hongos

endoacutefitos estaacuten asociadas al frailejoacuten Espeletia hartwegiana y que posibles implicaciones podriacutea

tener que estas especies se encuentren dentro de esta especie de alta montantildea La importancia de

conocer esta informacioacuten reside en que los hongos endoacutefitos pueden beneficiar o perjudicar a la

adaptacioacuten y resistencia de especies vegetales en los distintos escenarios climaacuteticos propuestos

por la ciencia (IPCC 2020)

El calentamiento global podriacutea afectar el equilibrio de los hongos endoacutefitos en especies

vegetales generando desbalances en la planta o la peacuterdida de especies endoacutefitas de importancia

biotecnoloacutegica Por ejemplo se podriacutean perder especies endoacutefitas con potencial para control

bioloacutegico de plagas y enfermedades de plantas como productores de enzimas y metabolitos

secundarios degradacioacuten de plaacutesticos o biorremediacioacuten entre otros (Schulz et al 2002) Por

ello se hace fundamental estudiar los hongos endoacutefitos en ecosistemas de paacuteramo ya que en

Colombia y en los paacuteramos en general han sido poco estudiados y su efecto sobre las plantas de

alta montantildea podriacutea ser clave en el mantenimiento de sus poblaciones

26

3 Hipoacutetesis

H1 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute diferente en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo diferentes los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten tambieacuten seria

modificada

H0 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute similar en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo similares los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten continuariacutean

como se ha registrado con anterioridad

27

4 Objetivos

41 Objetivo general

Caracterizar la diversidad de hongos endoacutefitos presentes en los frailejones

de la especie Espeletia hartwegiana en el paacuteramo de Romerales tomando en cuenta su

relacioacuten con el cambio climaacutetico

42 Objetivos especiacuteficos

Identificar los hongos endoacutefitos asociados en Espeletia hartwegiana del

paacuteramo de Romerales

Hallar relaciones filogeneacuteticas entre las diferentes especies de hongos

Endoacutefitos encontradas en Espeletia hartwegiana

Advertir las repercusiones del cambio climaacutetico sobre Espeletia

hartwegiana en base a su diversidad de hongos endoacutefitos

28

29

Capiacutetulo segundo

Materiales Meacutetodos y Resultados

1 Aacuterea de Estudio

El trabajo se realizoacute en el paacuteramo de Romerales ubicado en la zona alta del municipio de

Salento Quindiacuteo (4deg39202N 75deg25506W) con una extensioacuten aproximada de 6794 ha (Cano

et al 2015)

2 Colecta de material bioloacutegico

La colecta del material bioloacutegico se realizoacute mediante muestreos aleatorios lo largo del

paacuteramo tomando coordenadas de cada punto de colecta (veacutease anexo 3) las hojas se colectaron

por medio de tijeras podadoras siendo empacadas cada una en bolsas Ziploc diferentes se

colectoacute un total de 15 hojas cada una correspondiente a una planta de frailejoacuten para un total de

15 plantas muestreadas de E hartwegiana

Adicionalmente las bolsas Ziploc fueron marcadas con los datos de colecta en campo y

transportadas a los laboratorios del Programa de Biologiacutea de la Universidad del Quindiacuteo para su

procesamiento

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetales

Las muestras obtenidas fueron lavadas con agua para eliminar el exceso de residuos se

cortaron 4 trozos de cada hoja con un tamantildeo aproximado de 05 a 10 cm (veacutease figura 5) luego

cada trozo de hoja se sometioacute a una esterilizacioacuten la cual se completoacute con algunas modificaciones

acorde al procedimiento descrito por (Osorio et al 2017) especiacutefico para el aislamiento de

30

hongos endoacutefitos que consiste en sumergir perioacutedicamente el material vegetal en etanol al 90

durante un minuto seguido de hipoclorito de sodio (NaClO) al 4 por un minuto continuando

con etanol al 70 durante un minuto y por uacuteltimo se lavaraacuten con agua destilada todo dentro de la

campana de flujo

Las cuatro secciones de hoja se transfirieron a una caja de Petri para un total de 15 cajas

de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA) (una caja de Petri por cada 4 cortes de hoja)

Posteriormente las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente (25degC aproximadamente)

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en medio de

cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelial caja de Petri de 20ml de capacidad

Pasadas 3 semanas se revisaron los cultivos fuacutengicos con el fin de revisar el crecimiento

del micelio y hacer un repique a un cultivo puro una vez maduros se procedioacute a utilizar la teacutecnica

de corte de hifa uacutenica (Osorio et al 2017) esta teacutecnica consistioacute en tomar la punta de la hifa con

ayuda de un estereoscopio y un bisturiacute de grado quiruacutergico agua destilada alcohol al 70 y un

mechero para mantener el bisturiacute esterilizado una vez identificada la hifa ideal para cultivar de

forma pura (veacutease figura 6) con el bisturiacute se procedioacute a cortar el agar PDA en forma de cuadro

con una medida aproximada de 3 miliacutemetros cuadrados

31

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la teacutecnica de

corte de hifa uacutenica

Se esperoacute entre 3 a 5 semanas a que crecieran los cultivos puros aislados de las hifas uacutenicas en

nuevas cajas de Petri con agar PDA

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos endoacutefitos)

Los hongos cultivados de forma pura consiguieron un crecimiento micelial significativo a partir

de los 15 diacuteas a temperatura ambiente como lo demuestra la figura 7 que contiene doce de los

cultivos maacutes representativos con su respectivos micelios aeacutereos desarrollados donde variacutean sus

colores formas y consistencias esto indicando que pertenecen a diferentes especies

2

1

3

32

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de cultivo

Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12) aislados de las

hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

5 Extraccioacuten de ADN

4

5

6

7

8

9

10

11

12

33

Una vez el micelio de los hongos se encontraba desarrollado en la cantidad necesaria se

procedioacute a extraer el ADN genoacutemico siguiendo el protocolo de extraccioacuten de Raeder y Broda

(1985) por medio de un barrido superficial del micelio evitando tomar el agar este micelio

posteriormente se colocoacute en tubos Eppendorf esteacuteriles de 2 ml y se pulverizoacute mediante el uso de

un asa microbioloacutegica y 1ml de buffer de extraccioacuten compuesto de Tris-HCL 1 M pH 78 EDTA

05 M Ph 8 SDS 10 wv NaCL y agua destilada para cada tubo a continuacioacuten se agregoacute 800

ul de etanol al 70 500 ul de fenol y se mezcloacute

Se adicionoacute 300 ul de cloroformo y se mezcloacute de nuevo de alliacute se llevoacute a la centrifuga a

10000 rpm por 60 minutos luego de centrifugar se forma un sobrenadante el cual es transferido

en su totalidad a un nuevo tuvo Eppendorf de 15 ml en el cual se agregaron 400 ul de cloroformo

y se llevoacute a la centrifuga a 10000 rpm por 10 minutos en donde nuevamente se forma un

sobrenadante aunque esta vez solo se toman 500 ul del tubo para ser transferidos otro tubo

Eppendorf de 15 ml ya en el nuevo tubo se adicionaron 50 ul de NaAC y se invirtioacute varias veces

para homogenizar la mezcla a continuacioacuten se guardoacute en el refrigerador a 4degC toda la noche

Al diacutea siguiente se tomaron las muestras en los tubos Eppendorf y se centrifugaron a

10000 rpm por 30 minutos (Formacioacuten del Pellet de ADN) cuando la centrifuga terminoacute se

procedioacute a remover el etanol ya sin etanol se agregoacute de nuevo 1 ml de etanol al 70 a cada tubo

y se centrifugoacute a 10000 rpm por 5 minutos en este paso se removioacute el etanol y se dejoacute secar el

pellet de ADN una vez el etanol se evaporoacute se re suspendioacute el pellet en 100 ul de agua grado

molecular o Sabax con 5 ul de RNAsa con el fin de evitar la presencia de moleacuteculas de ARN

posteriormente se incubaron a 37degC por 30 minutos y se guardaron para su envioacute a -20degC

(Raeder y Broda 1985)

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengica

Una vez se secuenciaron las muestras de ADN enviadas a la Universidad Ruhr de

Bochum Alemania se hizo el ensamblaje de las secuencias en contigs y scaffolds en el

programa CLC Main Workbench 8 (Nicola et al 2013) Como lo muestra la figura 8 donde se

muestran los pasos esenciales de una teacutecnica de Metagenoacutemica donde posteriormente se

analizaron con maacutes detalle mediante teacutecnicas filogeneacuteticas

34

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemico Fuente Thomas y colaboradores (2012)

7 Secuenciamiento

Se extrajoacute con eacutexito un total de 35 muestras de hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

Espeletia hartwegiana (veacutease figura 9) que posteriormente fueron secuenciadas por la

Universidad Ruhr de Bochum (Alemania) logrando un total de 70 secuencias incluyendo

aquellas obtenidas en Genk Bank

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de frailejoacuten

Espeletia hartwegiana

35

8 Anaacutelisis Filogeneacutetico

Se aislaron 35 secuencias basadas en la especie Espeletia hartwegiana fueron

comparadas posteriormente con 35 secuencias de especies publicados en GenBank

(httpblastncbinihgovblastcgi) se obtuvo un total de 70 secuencias Las secuencias de

consenso ITS 58S DNA obtenidas se usaron para realizar buacutesquedas BLAST en GenBank

usando BLASTn (Altschul et al 1990) con el fin de identificar mediante las secuencias aisladas

los geacuteneros o las especies maacutes cercanas La matriz de datos fue alineada en MAFFT v7 (Katoh y

Standley 2013) Se utilizaron las especies Coprinellus xanthothrix y Coprinellus domesticus

como grupos externos

Los anaacutelisis de las secuencias para construir los arboles filogeneacuteticos de Maacutexima

Parsimonia (MP) fueron realizados usando PAUP v40b10 (Swofford 2003) Para el anaacutelisis de

Maacutexima Verosimilitud o ML por sus siglas en ingleacutes (Maximum Likelihood) se utilizoacute

JmodelTest (Darriba et al 2012) con el cual se infirieron los criterios del modelo de sustitucioacuten

apropiado utilizando los criterios de informacioacuten de Akaike (AIC) (Akaike 1974)

Los anaacutelisis de ML se realizaron con el programa PhyML v 30 (Guindon y Gascuel

2003) teniendo en cuenta la proporcioacuten de sitios invariables Los valores de soporte de confianza

para los nodos se estimaron mediante 1000 anaacutelisis de arranque de replicacioacuten La alineacioacuten de

los datos de la secuencias de ITS para 70 aislamientos determinoacute quince geacuteneros siendo los

siguientes Annulohypoxylon Biscogniauxia Colletotrichum Crassiparies Cryptocoryneum

Cyphellophora Diaporthe Daldinia Humiacutecola Hypoxylon Hypocrea Nemania Nigrospora

Massarina y Trichoderma de los cuales se obtuvieron 11 clados principales (veacutease figura 10)

Con base en estos resultados todos los aislamientos se analizaron maacutes a fondo dentro de los

geacuteneros hasta llegar a especie (veacutease tabla 1)

36

Geacuteneros Especie Especie Especie Especie Especie Especie Especie

Annulohypoxylon A nitens A bahnphaden

gense

Biscogniauxia B petrensis

Colletotrichum C gloeosporioides

C gigasporum

Cyphellophora C

reptans

Crassiparies C quadrisporus

Cryptocoryneum C

longicondensatum

Daldinia D dennisii D

eschscholtzi

D

conceacutentri

ca

Diaporthe D

longicolla

D

foeniculina

D

anacardi

i

D

macada

miae

Humiacutecola H

fuscoatra

Hypoxylon H

trugodes

H

pulicicidum

Hypocrea H

koningii

Massarina M albocarnis

Nemania N

primolutea

Nigrospora N sacchari N rubi N sphaeric

a

N hainanen

sis

N oryzae

N gorlenko

ana

N aurantia

ca

Trichoderma T trixiae T

olivascens

T

paraviridescens

T

viridescens

T

samuelsii

T viride

Grupo Externo Coprinellus C

domesticus

C

xanthothrix

Tabla 1 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos endoacutefitos en la

especie Espeletia hartwegiana

37

38

Figura 10 Filograma consenso obtenido con el programa MEGA ndashX a partir del anaacutelisis ML y MP del

conjunto de datos ITS Aislados de las hojas de frailejoacuten Los coacutedigos en Verde son las secuencias que se

aislaron (aislados) en este estudio los coacutedigos y nombres en Negro son las secuencias encontradas por

identidad en GenBank Los valores de soporte de bootstrapgt 70 se indican cerca de los nodos como MP

ML = valores de soporte de bootstrap lt70

El nuacutemero de caracteres los modelos de sustitucioacuten usada asiacute como otros resultados

estadiacutesticos de las pruebas de Maacutexima Parsimonia y Maacutexima Verosimilitud generados a partir de

los anaacutelisis filogeneacuteticos de los conjuntos de datos se muestran en los anexos

39

Capiacutetulo Tercero

Discusioacuten sobre los hongos endofitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicas

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidad de Endoacutefitos

Tanto la temperatura la estacionalidad y los tipos de precipitacioacuten son factores de vital

importancia para la composicioacuten de las diferentes comunidades y la arquitectura vegetal Estos

factores limitan muchos de los procesos ecosisteacutemicos ya que existe una estrecha relacioacuten entre

las variaciones climaacuteticas y las variaciones dentro de los ecosistemas Por lo tanto se espera que

el cambio climaacutetico transforme los ecosistemas Andinos tal como los conocemos hoy (Colwell et

al 2008) modificando las relaciones mutualistas entre plantas y hospederos

Posiblemente la resiliencia y resistencia de muchos ecosistemas como el paacuteramo sean

superadas en este siglo por una combinacioacuten sin precedentes de disturbios tales como el cambio

climaacutetico perturbaciones asociadas a este (sequiacuteas fuegos invasioacuten de especies exoacuteticas

inundaciones) y otros factores como organismos oportunistas (hongos endoacutefitos) cambios en el

uso del suelo contaminacioacuten y sobreexplotacioacuten de recursos (IPCC 2020)

Considerando que el frailejoacuten Espeletia hartwegiana es una especie de alta montantildea

(paacuteramos) endeacutemica de la cordillera Central de los Andes (Schultz y Carl 1856) se encuentra

dentro de los ecosistemas andinos en donde a su vez se ha comprobado la existencia de los

hongos endoacutefitos es de tener en cuenta el papel de estos organismos endoacutefitos ya que los

paacuteramos son ecosistemas particularmente sensibles a los efectos adversos del cambio climaacutetico

en especial al calentamiento global al estar ubicados en los troacutepicos generando asiacute ventanas de

40

oportunidades para que los hongos endoacutefitos alteren su estado mutualista y pasen a ser

patogeacutenicos (Colwell et al 2008 7)

No obstante existe consenso en que las temperaturas aumentaraacuten especiacuteficamente a

grandes alturas y que la precipitacioacuten posiblemente se incrementaraacute en algunas zonas disminuiraacute

en otras y se produciraacute en patrones estacionales alterados con mayor intensidad y frecuencia

(Marengo et al 2009)

Los frailejones se ven en constante estreacutes por el uso del suelo dado en los paacuteramos como

es el caso del paacuteramo Romerales un paacuteramo que se ha visto afectado por las quemas y la

ganaderiacutea (Molinillo y Monasterio 2001) Esto aumenta asiacute las condiciones de estreacutes intriacutensecas a

las que estaacuten expuestas estas plantas de paacuteramo las cuales suministran valiosos bienes y servicios

ecosisteacutemicos como el abastecimiento continuo de agua para usos domeacutesticos agriacutecolas e

industriales (Buytaert et al 2006 4) servicios que se podriacutean ver en decrecimiento si las

ventanas de oportunidades se abren con maacutes frecuencia dando pie al cambio de estado de los

hongos endoacutefitos que existen dentro de los frailejones de la zona

En los paacuteramos de Chingaza Rabanal Guerrero Iguaque Merchaacuten y Sumapaz se han

realizado estudios de aislamientos de hongos en especies de frailejoacuten diferentes a la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana tales como Espeletia argentea Espeletia arbelaezii Espeletia

boyacensis Espeletia grandiflora Espeletia miradorensis y Espeletia uribei por ende se ha

reportado la presencia de hongos endoacutefitos y fitopatoacutegenos (Tabla 2) (Gaitan 2018 17)

Frailejones Espeletia

argentea

Espeletia

arbelaezii

Espeletia

boyacensis

Espeletia

grandiflora

Espeletia

miradorensis

Espeletia

uribei

Aspergillus X X X X

Annulohypoxylon X X X

Curvularia X X X

Epicoccum X X X

Fusarium X X X

41

Tabla 2 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = a presencia del genero de

hongo dentro de la especie de frailejoacuten

Los geacuteneros de hongos en rojo son los geacuteneros que se encontraron en comuacuten con los

geacuteneros hallados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana de un total de 15 geacuteneros 3

han sido reportados anteriormente en estudios similares ( 20 de geacuteneros identificados)

Dentro de un marco de cambio climaacutetico es importante la metodologiacutea de muestreo

como lo fue el formato de muestreo en puntos aleatorios realizado en el presente estudio se llevoacute

acabo principalmente por la homogeneidad de los frailejones en el paacuteramo como lo indica el

manual de meacutetodos baacutesicos de muestreo y anaacutelisis de ecologiacutea vegetal (BOLFOR 2000 9) donde

se menciona que el muestreo aleatorio se utiliza cuando se dispone de poca informacioacuten previa de

las caracteriacutesticas de las poblaciones a medirse en este caso la poblacioacuten a identificarse fueron

los hongos endoacutefitos que se hallaban dentro de las formaciones homogeacuteneas de los frailejones

No obstante el muestreo aleatorio tambieacuten presenta limitaciones a la hora de comparar los

hongos endoacutefitos a lo largo del gradiente altitudinal (muestreo aleatorio estratificado) dejando de

percibir informacioacuten proveniente de los distintos microclimas que se encuentran y de las

incidencias que podriacutean causar a la hora de identificar los geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten ademaacutes de posibles micro efectos del cambio climaacutetico a lo

largo del gradiente altitudinal (Caacutemara et al 2008)

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio Climaacutetico

Nigrospora X X X X X

Penicillium X X X

Pleospora X X X X

Trichoderma X X X X

42

Las teacutecnicas empleadas en este estudio para lograr aislar e identificar los hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana se hacen importantes dentro del cambio

climaacutetico debido a que el margen de error en la identificacioacuten molecular es reducido (Bakermans

et al 2014) Al ser reducido el margen de error se pudo conocer con mayor certeza que especies

y geacuteneros de hongos endoacutefitos se encuentra dentro de la planta

Al conocer sus identidades es posible conocer las capacidades que tienen cada una de

estas especies de hongos endoacutefitos de producir metabolitos secundarios de infiltrarse y proteger

los tejidos de la planta de condiciones bioacuteticas y abioacuteticas competir contra herbiacutevoros y

fitopatoacutegenos (Schulz et al 2002) Con sus capacidades reconocidas es posible vincular los

efectos del cambio climaacutetico como estreacutes hiacutedrico aumento de la temperatura migraciones

tempranas enfermedades emergentes aumentos de la precipitacioacuten y heladas severas con las

reacciones por parte de los hongos endoacutefitos Estas reacciones podriacutean desencadenar aumentos de

la patogenicidad en las poblaciones de frailejones debido a los constantes disturbios y estreacutes al

que se ve sometido la planta generando asiacute notables declives poblacionales (Mendoza 2010)

Las relaciones filogeneacuteticas entre las especies halladas toman relevancia debido a las

sinergias positivas o negativas que se pueden presentar dependiendo de las especies que se

encuentren asociadas dentro de la planta (Lamichhane y Venturi 2015) como por ejemplo

Nigrospora y Colletotrichum pueden activar una sinergia negativa aumentando la virulencia y

afectando la especie Espeletia hartwegiana

Las especies de hongos endoacutefitos se identificaron por medio de secuencias obtenidas de

las regiones ITS (regioacuten de espaciadores internos transcritos) las cuales son regiones altamente

conservadas con tasas de evolucioacuten muy lentas en el tiempo permitiendo hacer inferencias

filogeneacuteticas (Baldwin et al 1995 Hamby y Zimmer 1992) es por ello que se usaron para

generar las diferentes identificaciones de los hongos endoacutefitos logrando asiacute identificar al geacutenero

Nigrospora con un total de 7 especies N sacchari N rubi N sphaerica N hainanensis N

gorlenkoana N oryzae y N aurantiaca pertenecientes a la familia Apiosporaceae orden

Xylariales Divisioacuten Ascomicota (veacutease figura 11) (Wang et al 2017)

Dentro del marco del cambio climaacutetico Nigrospora se caracteriza por poseer una

distribucioacuten cosmopolita y una amplia gama de hueacutespedes como lo es en este caso la especie E

hartwegiana que habita en los Andes Tropicales que se veraacuten alterados por los efectos del

cambio climaacutetico este geacutenero se ha logrado aislar en su forma endoacutefita en tallos y hojas de

43

diversas plantas tambieacuten como saprofitos en detritos hojarasca y larvas muertas (Uzor et al

2015 1)

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

Los hongos endoacutefitos hallados en esta investigacioacuten se encontraron dentro de la especie

de frailejoacuten E hartwegiana la cual pertenece a los Andes Tropicales ubicados maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos Estos ecosistemas son sensibles a los efectos del cambio

climaacutetico por su altura su alto endemismo y su sensibilidad al efecto de borde Cuando las

especies lentildeosas empiecen a migrar a lo largo del gradiente altitudinal es posible que los

frailejones se encuentren con suelos agrestes en donde sus semillas no podraacuten fijarse y los efectos

adversos de hongos como Nigrospora N oryzae y N sphaerica seraacuten maacutes notables

aprovechando las ventanas de oportunidad que generen los desbalances climaacuteticos (Sharma et al

2013)

Los cambios en los patrones climaacuteticos potenciaran la especie N sphaerica dentro del

frailejoacuten la cual tiene la capacidad de causar tizoacuten foliar en la especie Camellia sinensis siendo

una planta de teacute perteneciente a la divisioacuten de las magnolifiotas como el geacutenero Espeletia (Liu et

al 2015) Nigrospora fue el geacutenero maacutes ampliamente aislado en las identificaciones generadas a

partir de las hojas de frailejoacuten esto se veriacutea explicado debido a que N sphaerica tiene un

mecanismo de descarga de esporas efectivo que puede proyectar a la fuerza sus esporas a una

distancia de hasta 2 cm en vertical y 68 cm en horizontal como lo demostroacute Webster (1952)

ademaacutes el estudio de Wu y colaboradores (2004) tambieacuten evidencioacute que las esporas de

44

Nigrospora son uno de los grupos maacutes dominantes en la atmoacutesfera y estaacuten asociadas con

tormentas de polvo

La gran capacidad colonizadora del geacutenero Nigrospora le permite adaptarse a las

condiciones climaacuteticas cambiantes con la estrategia de dispersioacuten de sus esporas logrando

distanciarse del frailejoacuten hospedero para encontrar nuevos hospederos producto de las

migraciones tempranas a lo largo del gradiente altitudinal (Riveros 2010)

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

por encima del 80 lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen menos

mutaciones en los nodos internos del aacuterbol basados en la distribucioacuten de probabilidad asignadas

a los posibles arboles resultantes dando lugar a una hipoacutetesis evolutiva maacutes confiable (Schmidt y

Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 es decir el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes

corto (menos cambios) y el cual se ajusta mejor a los datos (Swofford 1997)

Teniendo asiacute una inferencia filogeneacuteticamente robusta los geacuteneros Collectotrichum y

Nigrospora pertenecen a la Divisioacuten Ascomycota ambos geacuteneros son particularmente agresivos

con las plantas en especial la especie Colletotrichum gloeosporioides la cual es la fase asexual

de Glomerella cingulata (Raj et al 2013) Se caracteriza por tener un amplio rango de

hospederos entre ellos el frailejoacuten a los cuales les causa una enfermedad conocida pudricioacuten

amarga antracnosis o chancros siendo esta la necrosis de frutos flores nervios y tallos

(Gonzaacutelez et al 2006 4)

Uno de los primeros reportes de afectaciones a especies de frailejoacuten se obtuvo en el 2009

en el Parque Natural Nacional Chingaza Colombia en donde encontraron las especies de

frailejoacuten Espeletia grandiflora y Espeletia uribei afectadas debido a insectos y una especie de

hongo del genero Colletotrichum (Medina 2009- 9 Hartung y Burton 1981)

Por ende que estos dos geacuteneros de hongos se encuentren juntos podriacutea tener

implicaciones en el aumento de virulencia potenciado a su vez por los desbalances abioacuteticos

causados por el cambio climaacutetico como lo han mencionado Belisario y colaboradores (2002) es

posible que las afectaciones no sean producidas por un uacutenico hongo si no por un complejo de

varios generando sinergismos entre diferentes especies que solas no hariacutean dantildeo a la planta pero

juntas podriacutean ser causantes de enfermedad (Lamichhane y Venturi 2015 4) aun mas en un

45

marco de cambio climaacutetico que gradualmente aumenta sus efectos nocivos sobre los paacuteramos

aumentando la temperatura cambios en la precipitacioacuten heladas intensas cambios en la

nubosidad mayor exposicioacuten a la radiacioacuten solar teniendo por resultado un iacutendice de estreacutes

mayor en las plantas de paacuteramo generando ventanas de oportunidades para que los hongos

endoacutefitos modifiquen sus roles de protector a patoacutegeno

En frailejones tambieacuten se ha reportado la presencia de Nigrospora y Trichoderma por

Bonilla y Argenis (2005) maacutes especiacuteficamente en la especie Espeletia grandiflora la cual es una

especie que habita en los paacuteramos de Colombia Ecuador y Venezuela en conjunto con Espeletia

hartwegiana (Luteyn 1999 3) El hecho que existan estos dos geacuteneros presentes en los frailejones

advierte de un equilibrio entre hongos endoacutefitos que se puede romper bajo las tensiones del

cambiante clima maacutes aun en los sensibles paacuteramos alto andinos

En cuanto a N sacchari se tiene reporte que es un productor de metabolitos con una

notable actividad herbicida demostrado en plantas cultivadas en invernadero (Fukushima et al

1998 2) debido a que existe evidencia que sugiere que los hongos endoacutefitos han evolucionado

directamente de hongos patoacutegenos (Schulz et al 1999 4) sumado al estreacutes del cambio climaacutetico

en cualquier momento de extrema tensioacuten hiacutedrica caloacuterica o heladas en estos ecosistemas de alta

montantildea Estos anomaliacuteas ambientales podriacutea disparar mecanismos de accioacuten fitopatoacutegenos

dentro de los frailejones generando un declive notable en sus poblaciones y por ende un declive

de la cantidad recurso hiacutedrico aguas abajo y su regulacioacuten (Diacuteaz et al 2002 5)

Como se mencionoacute anteriormente los medios de propagacioacuten de estos hongos endoacutefitos

pueden ser por medio de esporas que estaacuten en el ambiente aunque tambieacuten los vectores que

juegan un rol clave en su dispersioacuten son los insectos ya que estos pueden transportar esporas o

partes del hongo en su cuerpo patas o aparato bucal (Eigenbrode et al 2018 5)

Considerando la dispersioacuten homogeacutenea de los frailejones dentro del paacuteramo la carga

esporas en el ambiente y la herbivoriacutea de insectos es probable que se puedan ver infectados la

mayoriacutea de individuos (Varela 2016) es por ello que en el futuro puede que las afectaciones en

frailejones no sean producidas por hongos fitopatoacutegenos si no por hongos endoacutefitos que tuvieron

la ventana de oportunidad gracias al cambio climaacutetico aumento de la temperatura aumento en

las concentraciones de CO2 y alteraciones de precipitacioacuten que pueden hacer susceptible la planta

al ataque de estos hongos (Chakraborty 2011 Elad y Pertot 2014)

46

Para que se genere la enfermedad esta depende de la interaccioacuten de tres o cuatro factores

1) hospedero susceptible 2) agente causal (virulento) 3) condiciones ambientales favorables y 4)

tiempo (Francl 2001 2) la falta de alguno de ellos no permite que el patoacutegeno produzca la

enfermedad en la planta debido a ello algunas especies de frailejoacuten pueden tener una o dos cepas

que puedan actuar como fitopatoacutegenos pero no estaacuten activas si no estaacute completa su asociacioacuten

con otro patoacutegeno u otro factor

Ademaacutes existe un estudio que evaluoacute el efecto de la temperatura sobre la capacidad de

Fusarium verticillioides para generar infeccioacuten en plantas de maiacutez se probaron bajo 3 escenarios

de temperatura como resultados obtuvieron que la enfermedad de este hongo se veiacutea potenciada

por el aumento de temperatura en temperaturas por encima de 35degC (Murillo et al 2008) este

estudio da soporte a la hipoacutetesis de que existen factores que influyen significativamente a la

infeccioacuten en la planta tal vez el paacuteramo difiacutecilmente alcance 35degC no obstante la mayoriacutea de

especies son sensibles a cambios de temperatura de hasta de 1degC en donde modifican su

comportamiento rutas metaboacutelicas interacciones ecoloacutegicas y por ende sus defensas se ven

alteradas

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e Hypocrea

El geacutenero Trichoderma con seis especies diferentes (veacutease figura 12) fue el segundo

geacutenero maacutes numeroso despueacutes de Nigrospora que contoacute con siete especies aunque las primeras

especies que se analizaron fueron especies que principalmente actuaban generando enfermedades

en las plantas en las que se encontraban ante disturbios el geacutenero Trichoderma pertenece a la

47

familia Hypocreaceae y se caracteriza por tener una gran capacidad biocontroladora sobre

fitopatoacutegenos como Fusarium oxysporum los cuales podriacutean llegar masivamente con las

migraciones tempranas de insectos y plantas lentildeosas (Miles et al 2012 7)

No solo actuacutean repeliendo patoacutegenos internos si no tambieacuten patoacutegenos externos como

insectos que desean consumir u aprovechar la planta ya que estos pueden secretar diferentes

metabolitos secundarios y enzimas que actuacutean inhibiendo su desarrollo (Boughalleb-M et al

2018 8)

Es bien conocido que el geacutenero Trichoderma produce amplio rango de sustancias

antibioacuteticas ademaacutes de poseer la caracteriacutestica de parasitar otros hongos (Howell 2002 6)

Debido a la competencia que generan las especies del genero Trichoderma por espacio y

nutrientes inhiben o degradan pectinasas y otras enzimas que son esenciales para que los hongos

fitopatoacutegenos como Botrytis cinerea penetre en la superficie de las hojas logrando proteger de

esta forma al frailejoacuten que se veraacute expuesto a nuevas amenazas microbioloacutegicas auspiciadas por

los cambios en los patrones climaacutetico (Zimand et al 1996)

Ademaacutes de la capacidad del Trichoderma sp para atacar o inhibir el crecimiento de

patoacutegenos de plantas directamente descubrimientos recientes indican que tambieacuten pueden inducir

resistencia sisteacutemica y localizada a una variedad de patoacutegenos de plantas tales como el frijol es

protegido por Trichoderma harzianum de especies fitopatoacutegenas como Colletotrichum

lindemuthianum Botrytis cineacuterea las cuales producen lesiones en las hojas de la planta (Harman

y Howell 2004) Incluso se descubrioacute que ciertas especies de Trichoderma tienen una influencia

sustancial en el buen crecimiento y desarrollo de las plantas sin y con condiciones de estreacutes

climaacutetico (Lorito 1998)

Como lo demostraron Bonilla y Argenis (2005) en su estudio llevado a cabo en el

frailejoacuten Espeletia grandiflora diferentes cepas pertenecientes a Trichoderma pueden proteger

esta especie de paacuteramo de organismos fitopatoacutegenos emergentes por el cambio climaacutetico por

ende si puede proteger a E grandiflora tambieacuten puede proteger la especie E hartwegiana lo

que le permitiraacute sobrellevar diferentes ataques fortuitos de patoacutegenos e insectos que nunca han

logrado alcanzar las altitudes de paacuteramo (3200 - 5000 m)

Cuando el cambio climaacutetico aumente la temperatura en 1degC o 2degC traeraacute consigo sus

efectos de modificacioacuten en cuanto a la estructura y composicioacuten de las especies de plantas que

48

existen en zonas altas para este escenario basado en los caacutelculos de Thuiller (2007) las especies

se habriacutean desplazado en el gradiente altitudinal aproximadamente 450 metros para el antildeo 2070

Las consecuencias de este desplazamiento serian uacutenicas debido a que gran cantidad de

insectos y patoacutegenos tendriacutean migraciones tempranas en el gradiente altitudinal en buacutesqueda de

su optimo teacutermico llevando a cabo un proceso conocido como Termofilizacioacuten (Cuesta et al

2019) es ahiacute donde entra en juego la proteccioacuten que le pueden brindar especies endoacutefitos como

las que pertenecen al geacutenero Trichoderma en el marco de cambio climaacutetico

En concordancia con las cepas de Trichoderma y el geacutenero Hypocrea que tambieacuten

pertenece a la familia Hypocreaceae se conocen maacutes de 700 secuencias de peptaiboles (peacuteptidos

bioloacutegicamente activos) de ambos geacuteneros donde algunos de eacutestos son ecoloacutegica y

comercialmente relevantes debido a su potencial antimicrobiano actividad enzimaacutetica uacutetil para

competir por espacio y alimento de los nuevos patoacutegenos emergentes procedentes de las

alteraciones climaacuteticas y las migraciones tempranas (Degenkolb et al 2008 6)

En cuanto al geacutenero Hypocrea tambieacuten se ha reportado actividad antimicrobiana y anti

fuacutengica contra Staphylococcus aureus y Fusarium oxysporum (Gogoi et al 2008 2) habitando

los geacuteneros Trichoderma e Hypocrea dentro de especies de frailejoacuten como E hartwegiana se

espera que puedan generar sinergias de proteccioacuten que las ayude a combatir los fuertes y

extremos eventos climaacuteticos

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

del 100 (veacutease figura 13) lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen

menos mutaciones en los nodos internos del aacuterbol por ende este aacuterbol contiene la menor

cantidad de mutaciones o cambios dentro sus nodos internos teniendo como resultado una

hipoacutetesis evolutiva confiable (Schmidt y Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 que

indica que el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes corto (menos cambios) y el cual se ajusta

mejor a los datos (Swofford 1997)

49

El geacutenero Annulohypoxylon es de importancia dentro del marco del cambio climaacutetico ya

que pertenece a la familia Xylariaceae y se caracteriza por poseer metabolitos secundarios

antitumorales-citotoacutexicos como la anuloescuamulina que ayudan a combatir el estreacutes abioacutetico

(Cheng et al 2012) estas cepas de hongos son principalmente saprofitos y oportunistas han sido

reportadas en hojas sanas y afectadas de frailejones en otros estudios (Gonzaacutelez 2012 Nonsoque

2012) siendo un geacutenero resiliente a las perturbaciones ambientales como los cambios en los

patrones climaacuteticos su relacioacuten como mutualista dentro del frailejoacuten se mantendraacute hasta que el

frailejoacuten se adapte o colapse ante el estreacutes abioacutetico

Aunque no se conocen como fitopatoacutegenos al contrario pueden actuar como mutualistas

no se descarta que puedan estar involucrados en el desarrollo de diferentes enfermedades en

plantas cuando las condiciones ecosistemicas se alteran a puntos extremos (Gonzalez et al 2017)

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon Biscogniauxia

Nemania y Humiacutecola

El geacutenero Daldinia posee unos valores de MPML correspondientes a 10094 con lo cual

se encuentra bien soportado estadiacutesticamente el geacutenero Daldinia se encuentra ubicado en la

familia Xylariaceae al igual que el geacutenero Hypoxylon Biscogniauxia y Nemania que en su

respectivo orden contienen un soporte estadiacutestico MPML de 10082 10099 y 100100 (veacutease

figura 14) los cuales pertenecen a la divisioacuten Ascomycota las cepas de Daldinia se caracterizan

principalmente por ser especies endoacutefitas teniendo la capacidad de estar dentro de su hueacutesped

mucho tiempo sin causarle dantildeo o al menos un dantildeo evidente por medio de su estado asexual

50

No obstante su estado se puede modificar cuando las condiciones externas se modifican

abruptamente en poco tiempo como es el caso de las alteraciones en la temperatura

precipitacioacuten y concentraciones de dioacutexido de carbono (CO2) auspiciados por el cambio

climaacutetico (Saacutenchez et al 2013)

Un estudio realizado por Prieto (2017) en la especie de frailejoacuten E grandiflora encontroacute

que la especie Daldinia eschscholtzii estaba asociado en el siacutentoma de clorosis (falta de clorofila

en las hojas) Tambieacuten se reportoacute que especies de Daldinia como Daldinia conceacutentrica tienen la

capacidad de controlar nematodos fitopatoacutegenos (Silva et al 2020 104) los cuales pueden invadir

y romper los tejidos de la planta dantildeando sus estructuras los nematodos tambieacuten seraacuten sujetos a

migraciones tempranas por el cambio climaacutetico que trae consigo presiones de seleccioacuten por ende

nuevas amenazas para los frailejones (Nakashima et al 2007)

Como hemos visto hasta este punto las especies de hongos endoacutefitos se muestran en

muchos casos como benefactores y protectores de las diferentes plantas en las que habitan

incluyendo diferentes especies de frailejones

Los hongos endoacutefitos protegen tanto de factores bioacuteticos como virus hongos

fitopatoacutegenos bacterias insectos y factores abioacuteticos como las intemperancias del clima no

obstante en su relacioacuten endoacutefita geacuteneros como Hypoxylon que pertenece igual que Daldinia a la

familia Xylariaceae pueden tener roles amenazadores en conjunto con el cambio climaacutetico

seguacuten Gonzales y colaboradores (2019) inocularon cepas pertenecientes al geacutenero Hypoxylon en

hojas de Theobroma cacao y encontraron que en 48 horas se comenzoacute a notar las marcas de

clorosis y deshidratacioacuten foliar esto demuestra que cepas de este geacutenero pueden tener efectos

fitopatoacutegenos ocasionando muerte descendente pudricioacuten del tronco negro y resinosis de ramas

de mezquite (De la Torre-Almaraacutez et al 2003 De la Torre-Almaraacutez et al 2009)

La presencia de este geacutenero dentro del frailejoacuten en un marco del cambio climaacutetico lo

convierte en una amenaza latente ya que las condiciones seraacuten cada vez maacutes agrestes en los

paacuteramos de los Andes Tropicales Puede favorecer el desarrollo de este geacutenero que tiene las

enzimas necesarias para producir la pudricioacuten del tronco negro entre otras enfermedades

relevantes

51

Tambieacuten las especies del geacutenero Hypoxylon se han reportado como endoacutefitos en tejidos de

plantas lentildeosas o herbaacuteceas (Petrini y Petrini 1985 3) asiacute como saprofitos o fitopatoacutegenos

deacutebiles en madera de aacuterboles de zonas templadas o tropicales (Miller 1961) como lo menciona

Miller (1961)

Los geacuteneros Biscogniauxia Nemania tambieacuten estaacuten dentro de la familia Xylariaceae y

Divisioacuten Ascomycota un aspecto interesante de las especies de Biscogniauxia es que son

paraacutesitos exclusivos de las angiospermas dicotiledoacuteneas en donde concluyeron que todas las

especies pertenecientes a este geacutenero son patoacutegenos umllevesuml que se aprovechan de situaciones de

sequiacutea y estreacutes hiacutedrico para aumentar su patogenicidad (Ju et al 1998)

La especie de frailejoacuten E hartwegiana es una Dicotiledoacutenea eso explica porque

podemos encontrar esta especie de hongo endoacutefito en el frailejoacuten del presente estudio siendo de

vital importancia denotar que las especies de Biscogniauxia se aprovechan especialmente de las

situacioacuten de sequiacutea y estreacutes hiacutedrico difiacutecilmente las especies de este geacutenero podriacutean afectar a los

frailejones debido a que se caracterizan por ser reguladores de los ciclos hiacutedricos el agua es el

recurso que maacutes tiende a existir en un paacuteramo por la estructura de sus suelos compuesta por

andosoles porosos y necromasa acumulada teniendo asiacute un alto iacutendice de retencioacuten hiacutedrica

(Hernandez y Muntildeoz 2015) de modo que el cambio climaacutetico no favorece al geacutenero

Biscogniauxia en su estado patogeacutenico dentro del ecosistema de paacuteramo

En cuanto al geacutenero Nemania Da Silva y colaboradores (2018) llevaron a cabo una

investigacioacuten en la cual identificaron cepas pertenecientes a los geacuteneros Colletotrichum

Phyllosticta Xylaria Nemania y Alternaria en la especie ornamental Pachystachys lutea en

donde las mismas cepas fueron ensayadas para inhibir el crecimiento de hongos fitopatoacutegenos

como Colletotrichum sp en donde encontraron que Nemania era capaz de inhibir por medio de la

secrecioacuten de distintas enzimas el crecimiento de dichas especies gracias a su actividad

enzimaacutetica el geacutenero Nemania puede compensar los desequilibrios causados por el cambio

climaacutetico en teacuterminos de hongos fitopatoacutegenos

Hay que tener en cuenta que los elementos que dan forma a las interacciones planta-

endoacutefito incluyen el modo de transmisioacuten el patroacuten de infeccioacuten la edad de la planta las

condiciones ambientales potenciadas por el cambio climaacutetico y los antecedentes geneacuteticos (Aly et

al 2011 6) Los frailejones de la especie E hartwegiana que se muestrearon para el estudio se

52

tomoacute las hojas sanas lo que indica que poseiacutean estas cepas de endoacutefitos en equilibrio siendo este

uno de los pocos reportes de este geacutenero en especies de alta montantildea en los Andes Tropicales

El geacutenero Humiacutecola se encuentra soportado por un MPML de 10076 siendo una

hipoacutetesis evolutiva considerable es el uacutenico de la figura 14 que no estaacute dentro de la familia

Xylariaceae ya que pertenece a la familia Chaetomiaceae aunque se halla en la divisioacuten

Ascomycota se podriacutea considerar a la especie Humiacutecola fuscoatra como una de las especies de

endoacutefitos maacutes umlinofensivasuml debido a trabajos de investigacioacuten reportados como el de Menzies y

colaboradores (1998) y el de Naik y colaboradores (2009)

Humiacutecola fuscoatra no se considera un peligro latente para la especie E hartwegiana ya

que existe en equilibrio con su entorno Estaacute comprobado por medio de caracterizaciones

quiacutemicas que Humiacutecola fuscoatra es un importante productor de moleacuteculas de estimacioacuten

medica como el resorciacuteclico y lactonas aacutecidas (Mejia et al 2014) Por lo tanto es una especie

prometedora con un reservorio de metabolitos secundarios de importancia medicinal e industrial

que de seguir los efectos nocivos del cambio climaacutetico en los Andes Tropicales maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos esta especie podriacutea desaparecer

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies Massarina

Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

Uno de los grupos mejores soportados en este cladograma es el grupo de Diaporthe en el

cual se encontraron cuatro especies siendo uno con maacutes abundancia de especies del estudio y que

posee un MPML de 10085 10089 y 10095 acorde a sus 3 nodos (veacutease figura 15) teniendo asiacute

una hipoacutetesis evolutiva confiable de estas relaciones las especies de Diaporthe pertenecen a la

familia Diaporthaceae de la divisioacuten Ascomycota y son especies de endoacutefitos que se distinguen

por inhibir el crecimiento de hongos patoacutegenos en el hospedero que se encuentren El estudio de

53

Da Silva y colaboradores (2018) mostroacute que cepas de Diaporthe sp Inhibieron el crecimiento de

Fusarium oxysporum y Colletotrichum sp hongos fitopatoacutegenos que aumentaran su presencia

aprovechando las alteraciones producidas por el cambio climaacutetico en los paacuteramos

Las especies de este geacutenero estaacuten en continuo cambio entre endoacutefitos y patoacutegenos

funcionando en la mayoriacutea de los casos en una relacioacuten mutualista en donde le brindan a la planta

mayor tolerancia a las sequias proteccioacuten de patoacutegenos y pestes caracteriacutestica uacutetil frente a los

retos ecoloacutegicos que plantea el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales (Hubbard et al 2014)

se conocen cerca de 800 especies de este geacutenero asociadas a una amplia gama de plantas

vasculares a nivel mundial (Rossman et al 2015)

Esto explica porque las especies de Diaporthe fueron una de las maacutes numerosas

encontradas en la especie de alta montantildea E hartwegiana teniendo en cuenta que esta especie

pasa raacutepidamente de un estado endoacutefito a un estado patogeacutenico y dada su faacutecil y alta distribucioacuten

representa un peligro en conjunto con el cambio climaacutetico para las especies de alta montantildea como

los frailejones y supone una amenaza para el balance hiacutedrico y ecosistemico en el futuro

El geacutenero Crassiparies de la familia Neohendersoniaceae y el geacutenero Massarina de la

familia Massarinaceae pertenecen al orden Pleosporales aunque se discute debido a las

similaridades morfoloacutegicas y genoacutemicas con Massarina si Crassiparies deberiacutea estar en la

familia Massarinaceae (Hyde et al 2013 4) Se tiene poca informacioacuten sobre la especie

Crassiparies quadrisporus por ende este puede ser uno de los primeros reportes de esta especie

en una especie de alta montantildea como lo es el frailejoacuten especiacuteficamente en la especie E

hartwegiana en un marco de cambio climaacutetico el geacutenero Crassiparies necesita mayores estudios

a nivel ecoloacutegico y microbioloacutegico para entender su papel dentro de esta crisis climaacutetica

Mientras tanto el geacutenero Massarina ha logrado ser aislado de agua dulce con el fin de

obtener fuentes de productos naturales bioloacutegicamente activos por medio de las investigaciones

quiacutemicas de Shearer (1999 2001) en una especie de Massarina obtuvieron como resultado el

aislamiento de tres nuevos sequiterpenoides y dos lactonas derivadas de policeacutetidos con nuevos

sistemas de anillos lo que indica que esta especie tambieacuten puede tener un rol importante

mediante la produccioacuten de enzimas y metabolitos secundarios en el marco de las invasiones

bioloacutegicas impulsadas por el cambio climaacutetico

54

El geacutenero Cryptocoryneum de la familia Cryptocoryneaceae existe poca informacioacuten de

sus mecanismos de accioacuten como endoacutefito o patoacutegeno maacutes aun en especies de los Andes

Tropicales este podriacutea ser uno de los primeros reportes sobre esta especie de hongo en una

especie de frailejoacuten especiacuteficamente E hartwegiana en el 2015 se reportoacute en Brasil el

descubrimiento de una nueva especie del genero Cryptocoryneum trataacutendose de Cryptocoryneum

parvulum hallada en las hojas de la especie Araucaria angustifolia (Gimnosperma) (Silva et al

2015 1) la informacioacuten sobre el geacutenero Cryptocoryneum en relacioacuten al cambio climaacutetico y sus

efectos dentro de especies de alta montantildea como el frailejoacuten auacuten son poco conocidas

Uno de los geacuteneros maacutes cercanos a los grupos externos del cladograma es Cyphellophora

perteneciente a la familia Cyphellophoraceae el cual posee un MPML de 10091 logrando una

hipoacutetesis evolutiva confiable Diversas especies de Cyphellophora han logrado ser aisladas de

infecciones superficiales de la piel o las untildeas en humanos y de materiales vegetales (Decock et

al 2003 Cheewangkoon et al 2009) Esto indica su amplia distribucioacuten y su capacidad para ser

patogeacutenica tanto en plantas como en animales maacutes aun en condiciones desfavorables para la

planta como son las condiciones de cambio climaacutetico

De la especie Cyphellophora reptans se tiene reporte que su morfologiacutea es muy similar a

la de una levadura por lo que es faacutecilmente confundida con una (Reacuteblovaacute et al 2013) Es posible

que este sea el uacutenico reporte de Cyphellophora reptans en las hojas de un frailejoacuten o especie de

alta montantildea que habite en los troacutepicos como E hartwegiana debido a ello sus mecanismos de

accioacuten en especies de paramo dentro de un marco de cambio climaacutetico es poco conocido Se

necesitan mayores estudios enfocados en esta especie para entender su ecologiacutea y dinamismo

ecoloacutegico respecto a los cambios en las variables ambientales

Se eligieron las especies Coprinellus domesticus y Coprinellus xanthothrix como grupos

externos con el fin de enraizar el aacuterbol debido a que pertenecen a la Divisioacuten Basidiomycota la

cual difiere en grado de la divisioacuten Ascomycota aunque conserva semejanzas conocidos como

caracteres ancestrales o plesiomorficos que avanzan a medida la filogenia se construye con los

datos de las diferentes secuencias de especies evidenciando novedades evolutivas conocidas

como apomorfias que cuando se dan en un grupo en particular pasan a ser sinapomorfias es decir

novedades evolutivas dentro de un grupo particular (Lehtonen 2020) Se optoacute por enraizar con

55

estas dos especies con el objetivo de dar robustez al aacuterbol filogeneacutetico (Barriel y 1998) lo cual se

consiguioacute como se nota en los estadiacutesticos del aacuterbol filogeneacutetico

56

57

Conclusiones

Se rechaza la hipoacutetesis nula (H0) y se concluye que la identificacioacuten y caracterizacioacuten

molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo Colombia es diferente en 80 de sus geacuteneros y

especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos realizadas en especies de frailejoacuten

Por lo tanto los nuevos geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos encontrados en el frailejoacuten

plantean nuevos desafiacuteos respecto al cambio climaacutetico ya que tienen un rol vital en la

supervivencia de estas especies de alta montantildea como los frailejones debido a su relacioacuten

mutualista o patoacutegena maacutes aun en los paacuteramos que son altamente sensibles a los efectos del

cambio climaacutetico incluso tan sensibles como las zonas polares (Bradley et al 2006)

La mayoriacutea de especies encontradas en el presente estudio tienen potencial para ayudar a

combatir el estreacutes abioacutetico producido por el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales

Especiacuteficamente pueden ayudar a combatir el estreacutes bioacutetico producido por virus hongos

bacterias e insectos en un marco de cambio climaacutetico aumentos de temperatura cambios en la

concentracioacuten de CO2 cambios en la precipitacioacuten migraciones tempranas cambios en la

nubosidad disponibilidad hiacutedrica alteraciones en la estructura y composicioacuten de las especies

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Anexos

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombia

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia

hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

74

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

Coordenadas Geograacuteficas

(Latitud)

De la Colecta del

Material Bioloacutegico total de 15

muestras (Longitud)

LAT N 4deg 37 5871717 LONG W 75deg 25

3292611

LAT N 4deg 37 5885220 LONG W 75deg 25

3271217

LAT N 4deg 37 5884485 LONG W 75deg 25

3312103

LAT N 4deg 36 5995487 LONG W 75deg 27

3045854

LAT N 4deg 37 6195784 LONG W 75deg 30

3292611

LAT N 4deg 40 159171 LONG W 75deg 26

380142

LAT N 4deg 40 363762 LONG W 75deg 26

209072

LAT N 4deg 40 399832 LONG W 75deg 27

173554

LAT N 4deg 40 383965 LONG W 75deg 27

464325

LAT N 4deg 39 486438 LONG W 75deg 27

173559

LAT N 4deg 40 56894 LONG W 75deg 26

568287

LAT N 4deg 40 159174 LONG W 75deg 27

190654

LAT N 4deg 40 125083 LONG W 75deg 26

345912

LAT N 4deg 40 116691 LONG W 75deg 27

208264

LAT N 4deg 40 314698 LONG W 75deg 27

140791

75

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un estereoscopio con el propoacutesito de seleccionar la

maacutes indicada y luego sembrar un cultivo puro a partir de ese micelio

76

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados las

copias se conservaron con glicerol a -80degC en un ultra congelador de Thermo Scientifictrade

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas

y enviadas

77

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicos de forma segura y esteacuteril propiedad de la Universidad del Quindiacuteo

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a la Universidad Ruhr de Bochum (Alemania)

78

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de parsimonia

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X en donde se

observa en amarillo la secuencia umlTCATTAuml la cual es una secuencia altamente conservada

que se usa para marcar el inicio de la misma en hongos endoacutefitos

79

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa JmoldelTest usados para generar el

aacuterbol de relaciones filogeneacuteticas a partir de la regioacuten ITS de los hongos endoacutefitos aislados

total de modelos evaluados 88

ID Nombre Particioacuten lnL P AIC detaAIC Peso Cumpeso Udelta

1 JC 0 100820157 138 204400314 1341348 0 1 -

2 JC+I 0 98912511 139 200605022 9618188 0 1 -

3 JC+G 0 95470113 139 193720225 2733392 0 1 -

4 JC+I+G 0 95467507 140 193735014 274818 0 1 -

5 F81 0 100658095 141 204136189 13149356 0 1 -

6 F81+I 0 98761481 142 200362962 9376128 0 1 -

7 F81+G 0 95314814 142 193469628 2482794 0 1 -

8 F81+I+G 0 95324364 143 193508729 2521895 0 1 -

9 K80 10010 99734495 139 20224899 11262157 0 1 -

10 K80+I 10010 97835191 140 198470382 7483549 0 1 -

11 K80+G 10010 94227821 140 191255643 268809 0 1 -

12 K80+I+G 10010 94209963 141 191239926 253092 0 1 -

13 HKY 10010 99648091 142 202136181 11149348 0 1 -

14 HKY+I 10010 97761512 143 198383024 7396191 0 1 -

15 HKY+G 10010 94170799 143 191201599 214765 0 1 -

16 HKY+I+G 10010 94118678 144 191117357 130523 600E-04 0999 -

17 TrNef 10020 99564653 140 201929306 10942472 0 1 -

18 TrNef+I 10020 97712623 141 198245245 7258412 0 1 -

19 TrNef+G 10020 94150977 141 191121955 135121 400E-04 09994 -

20 TrNef+I+G 10020 94132131 142 191104263 117429 00011 09959 -

21 TrN 10020 99563809 143 201987618 11000784 0 1 -

22 TrN+I 10020 97702964 144 198285929 7299095 0 1 -

23 TrN+G 10020 94094235 144 191068469 81635 00065 09719 -

24 TrN+I+G 10020 94101378 145 191102757 115923 00012 09948 -

25 TPM1 12210 99713879 140 202227759 11240925 0 1 -

26 TPM1+I 12210 97826641 141 198473282 7486449 0 1 -

27 TPM1+G 12210 94249837 141 191319674 33284 0 1 -

28 TPM1+I+G 12210 942022 142 1912444 257566 0 1 -

29 TPM1uf 12210 99663473 143 202186945 11200112 0 1 -

30 TPM1uf+I 12210 97879458 144 198638917 7652083 0 1 -

31 TPM1uf+G 12210 94137349 144 191154699 167865 100E-04 09999 -

32 TPM1uf+I+G 12210 94141897 145 191183794 196961 0 1 -

80

33 TPM2 10212 99722544 140 202245087 11258254 0 1 -

34 TPM2+I 10212 97828213 141 198476426 7489592 0 1 -

35 TPM2+G 10212 94185859 141 191191718 204885 0 1 -

36 TPM2+I+G 10212 94153667 142 191147335 160501 100E-04 09998 -

37 TPM2uf 10212 99648091 143 202156182 11169348 0 1 -

38 TPM2uf+I 10212 97757018 144 198394035 7407202 0 1 -

39 TPM2uf+G 10212 941052 144 1910904 103566 00022 09904 -

40 TPM2uf+I+G 10212 9408801 145 19107602 89187 00044 0982 -

41 TPM3 12012 99768005 140 20233601 11349176 0 1 -

42 TPM3+I 12012 97958099 141 198736198 7749364 0 1 -

43 TPM3+G 12012 94227963 141 191275926 289093 0 1 -

44 TPM3+I+G 12012 94323885 142 191487769 500936 0 1 -

45 TPM3uf 12012 99625421 143 202110843 11124009 0 1 -

46 TPM3uf+I 12012 97770469 144 198420939 7434105 0 1 -

47 TPM3uf+G 12012 94165576 144 191211152 224319 0 1 -

48 TPM3uf+I+G 12012 94150861 145 191201721 214888 0 1 -

49 TIM1ef 12230 99592239 141 202004478 11017644 0 1 -

50 TIM1ef+I 12230 97822787 142 198485574 749874 0 1 -

51 TIM1ef+G 12230 94121043 142 191082087 95253 00033 09853 -

52 TIM1ef+I+G 12230 94122386 143 191104772 117939 00011 09969 -

53 TIM1 12230 99518653 144 201917306 10930473 0 1 -

54 TIM1+I 12230 9781156 145 19852312 7536286 0 1 -

55 TIM1+G 12230 94105198 145 191110396 123562 800E-04 09977 -

56 TIM1+I+G 12230 94087158 146 191094317 107483 00018 09922 -

57 TIM2ef 10232 99550617 141 201921233 109344 0 1 -

58 TIM2ef+I 10232 97704602 142 198249204 726237 0 1 -

59 TIM2ef+G 10232 94093484 142 191026968 40135 00516 0852 -

60 TIM2ef+I+G 10232 94073864 143 191007729 20895 0135 07169 -

61 TIM2 10232 99530022 144 201940044 1095321 0 1 -

62 TIM2+I 10232 97820158 145 198540315 7553482 0 1 -

63 TIM2+G 10232 94058678 145 191017356 30523 00834 08004 -

64 TIM2+I+G 10232 94060837 146 191041674 54841 00247 09248 -

65 TIM3ef 12032 99546286 141 201912572 10925739 0 1 -

66 TIM3ef+I 12032 97713931 142 198267862 7281028 0 1 -

67 TIM3ef+G 12032 94129376 142 191098753 111919 00014 09936 -

68 TIM3ef+I+G 12032 94112005 143 191084009 97176 0003 09883 -

69 TIM3 12032 99514376 144 201908751 10921918 0 1 -

70 TIM3+I 12032 97700023 145 198300047 7313213 0 1 -

71 TIM3+G 12032 94115323 145 191130646 143812 300E-04 09997 -

72 TIM3+I+G 12032 94096941 146 191113882 127048 700E-04 09984 -

73 TVMef 12314 9970418 142 20224836 11261526 0 1 -

74 TVMef+I 12314 97940598 143 198741196 7754363 0 1 -

81

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE (AIC)

75 TVMef+G 12314 94159829 143 191179657 192824 0 09999 -

76 TVMef+I+G 12314 94160993 144 191201987 215153 0 1 -

77 TVM 12314 99615991 145 202131982 11145148 0 1 -

78 TVM+I 12314 97746676 146 198413353 7426519 0 1 -

79 TVM+G 12314 94075503 146 191071005 84171 00057 09776 -

80 TVM+I+G 12314 94052588 147 191045176 58342 00208 09456 -

81 SYM 12345 99543166 143 201946331 10959498 0 1 -

82 SYM+I 12345 97757103 144 198394207 7407373 0 1 -

83 SYM+G 12345 94083056 144 191046112 59278 00198 09654 -

84 SYM+I+G 12345 94050035 145 19100007 13236 0198 05819 -

85 GTR 12345 99529525 146 20197905 10992217 0 1 -

86 GTR+I 12345 97686178 147 198312356 7325522 0 1 -

87 GTR+G 12345 94044194 147 191028387 41553 00481 09001 -

88 GTR+I+G 12345 94013417 148 190986834 0 03839 03839 -

11

Tabla de contenidos

Figuras mapas y tablashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13

Introduccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 15

Capiacutetulo primero Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

1 Antecedenteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21

2 Justificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 25

3 Hipoacutetesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 26

4 Objetivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

41 Objetivo generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

42 Objetivos especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27

Capiacutetulo segundo Materiales Meacutetodos y Resultadoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

1 Aacuterea de Estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

2 Colecta de material bioloacutegicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos

endoacutefitos)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32

5 Extraccioacuten de ADNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

7 Secuenciamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

8 Anaacutelisis Filogeneacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35

Capiacutetulo Tercero Discusioacuten sobre los hongos endoacutefitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidadhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio

Climaacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42

Conclusioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 57

Obras citadashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 59

Anexoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 73

12

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphellip 73

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia 73

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphelliphellip74

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana 75

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un

estereoscopio 75

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 76

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas y

enviadas 76

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 75

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a Alemania a la Universidad Ruhr de

Bochum 77

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de

parsimoniahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 78

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X 78

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa

JmoldelTest 79

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE

(AIC) 81

13

Figuras mapas y tablas

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo

Colombiahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras

N necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefitohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y

abioacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en

medio de cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelialhelliphelliphellip 30

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la

teacutecnica de corte de hifa uacutenica helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de

cultivo Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12)

aislados de las hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana 31-32

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 10 Filograma obtenido a partir del anaacutelisis ML y MP del conjunto de datos ITS Aislados

de las hojas de frailejoacuten37

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip43

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e

Hypocreahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip46

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon48

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon

Biscogniauxia Nemania y Humiacutecolahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

14

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies

Massarina Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona

muestreadahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia 29-30

Tabla 2 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos

endoacutefitos en la especie Espeletia hartwegiana

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36

Tabla 3 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = presencia del genero

de hongo dentro de la especie de frailejoacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42-43

15

Introduccioacuten

Hay un libro abierto siempre para

todos los ojos la naturaleza

(Jean-Jacques Rousseau 1712-1778)

El cambio climaacutetico corresponde a un fenoacutemeno que afecta el planeta de manera natural

permitiendo mantener las condiciones climaacuteticas como la temperatura la precipitacioacuten entre

otras en un rango aceptable para la vida (Jimeacutenez 2010) Sin embargo dado el aumento de las

emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) principalmente asociado a las actividades

humanas y el alto consumo de combustibles foacutesiles los cambios en dichas condiciones han sido

alterados dando paso a un acelerado aumento de temperatura anual en las uacuteltimas deacutecadas con

precipitaciones y sequias maacutes frecuentes e intensas (IPCC 2020 5 Jimeacutenez 2010)

Acorde con el Panel Intergubernamental de Expertos en Cambio Climaacutetico (IPCC) para

fin de siglo el Cambio Climaacutetico se acrecentaraacute pronosticando un aumento de temperatura de 25

a 45 degC para el antildeo 2100 que tan solo para Colombia en los uacuteltimos 30 antildeos fue de 08degC

generando impactos notorios en las zonas de alta montantildea como los paacuteramos (Moreno y Palma

2016)

El cambio climaacutetico es un fenoacutemeno cuyos efectos alcanzaraacuten los paacuteramos los cuales son

ecosistemas de alta montantildea presente en elevaciones entre 3100 y 4700 m ubicados en el norte de

los Andes de Ameacuterica del Sur y el sur de Ameacuterica Central adyacente (Berdugo et al 2016) Estas

aacutereas se caracterizan por una vegetacioacuten principalmente endeacutemica compuesta por frailejones

matorrales y pastos (veacutease figura 1) (Garciacutea et al 2010)

Los ecosistemas de alta montantildea como los paacuteramos ofrecen diversos servicios

ambientales como la biodiversidad uacutenica que albergan los paisajes los suelos y su capacidad de

retener y almacenar agua (Morales et al 2019) Las formaciones vegetales juegan un papel

diferenciado en el mantenimiento de la humedad y las fuentes de agua en el ecosistema

presentando la capacidad de interceptar almacenar y regular los flujos hiacutedricos superficiales y

16

subterraacuteneos aportando los servicios de abastecimiento de agua para el 70 de la poblacioacuten de

Colombia (Vaacutesquez y Buitrago 2017)

Ademaacutes dada la caracteriacutestica de permanente humedad de su suelo la materia orgaacutenica

se descompone a menor velocidad logrando un efecto de retencioacuten y almacenamiento de carbono

(Anderson et al 2012) En Colombia se han realizado diferentes estudios sobre la distribucioacuten y

extensioacuten del ecosistema paramuno Rangel (2002 4) determinoacute que los paacuteramos colombianos

abarcaban aproximadamente el 26 de la superficie del paiacutes

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramos por Pedraza-Pentildealosa Betancur y Franco-Rosselli (2005)

En particular el paacuteramo Romerales se encuentra dentro del territorio adscrito a los

Parques Nacionales Naturales (PNN) especiacuteficamente el PNN de los Nevados en la cordillera

central colombiana hacia la zona norte del Departamento del Quindiacuteo con liacutemites fronterizos

entre los departamentos de Risaralda y Tolima Este paacuteramo es el hogar del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana el cual estaacute afrontando los efectos del cambio climaacutetico (veacutease mapa 1)

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona muestreada

17

Existe evidencia cientiacutefica concreta del aumento de temperatura en los Andes Tropicales

tambieacuten cambios significativos en los patrones de precipitacioacuten sumado a la disminucioacuten en la

incidencia del clima nublado lo que conduce a las plantas a mayor cantidad de horas expuestas a

la radiacioacuten solar (Ruiz et al 2009) Otro efecto grave que trae consigo el cambio climaacutetico es el

desplazamiento de especies en el gradiente altitudinal Con un aumento de 3degC se espera que las

especies se muevan ~600 m en buacutesqueda de su optimo teacutermico esto afectariacutea gravemente las

especies de paacuteramo como los frailejones Cuesta Camacho (2007)

Los frailejones son emblemaacuteticas plantas de paacuteramo y ecosistemas de alta montantildea

(MINAMBIENTE 2019) Pertenecen a la familia Asteraceae contiene cerca de 142 especies

agrupadas en ocho geacuteneros Carramboa Coespeletia Espeletia Espeletiopsis Libanothamnus

Paramiflos Ruilopezia y Tamania de estos los maacutes importantes y con mayor diversidad de

especies son Espeletia Espeletiopsis y Libanothamnus (Rivera y Torres 2001)

Poseen adaptaciones que les permite captar y retener grandes cantidades de agua de su

entorno permitiendo un balance ecosistemico (Farias 2013) La morfologiacutea singular del genero

Espeletia le permite acumular las hojas antiguas en forma de ldquoabrigordquo brindando proteccioacuten

contra las bajas temperaturas nocturnas de hasta 0degC Los fuertes vientos y la radiacioacuten solar los

cuales seraacuten cada vez maacutes intensos y frecuentes por causa del cambio climaacutetico (Cortes y

Sarmiento 2013 34) (veacutease figura 2)

Estas plantas son especies claves para la conservacioacuten de los paacuteramos y la lucha contra el

cambio climaacutetico debido a que ofrecen una gran variedad de servicios ecosisteacutemicos (Diacuteaz et al

2007) El paacuteramo es referente sin igual de fuente hiacutedrica ciudades como Bogotaacute y Quito obtienen

aproximadamente el 80 de su agua dulce de los paacuteramos (Buytaert et al 2006) Los frailejones

en su mayoriacutea endeacutemicos se han visto afectados por actividades humanas como la ganaderiacutea

extensiva agricultura (cultivos de papa y cebolla) mineriacutea de oro y carboacuten turismo no

controlado y quemas intencionales (Hofstede 2000) Esta situacioacuten podriacutea comprometer a

mediano y largo plazo la funcioacuten de captacioacuten regulacioacuten y suministro del agua para el consumo

18

en las ciudades colombianas ubicadas en las regiones de influencia de estos ecosistemas (Varela

2015)

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

No obstante en asociacioacuten con especies como el frailejoacuten de los Andes Tropicales

encontramos a los hongos cuyos roles en las interacciones bioloacutegicas son de vital importancia

Los hongos pueden ser endoacutefitos simbiontes mutualistas paraacutesitos y comensales y son capaces

de responder a las amenazas que plantea el cambio climaacutetico en cuanto a perturbaciones

ambientales aumento de temperatura y estreacutes hiacutedrico adaptaacutendose a la disponibilidad de recursos

modificando sus actividades enzimaacuteticas e incluso su genoma a lo largo del tiempo (Moreno et

al 2013)

Los hongos son clasificados seguacuten su forma de reproduccioacuten sea sexual o asexual en

donde se observan las diferencias estructurales internas entre los diferentes grupos tales como

sus esporas e hifas como lo indican Blackwell y Spatafora (2004) estos organismos estaacuten

divididos en cuatro grandes grupos los cuales son Ascomycota Basidiomycota

Chytridiomycota Zygomycota es justo en el grupo de los Ascomycota donde se encuentra gran

diversidad de hongos conocidos como ldquohongos endoacutefitosrdquo en donde su nombre ldquoendoacutefitordquo

significa ldquodentro de la plantardquo (endon dentro phyton planta)

19

Estos microorganismos fuacutengicos tienen la facilidad de pasar gran parte o todo su ciclo de

vida invadiendo los tejidos de su hospedero (planta) sin tener un efecto negativo evidente

(Leacuteveilleacute 1846 3 de Bary 1866 8) Por lo tanto el concepto de endoacutefito indica una asociacioacuten de

costo-beneficio pero de una forma mutualista entre el hongo y la planta hospedera permitiendo

la estadiacutea en sus tejidos vivos (Clay 1998 8) Los hongos endoacutefitos se han encontrado en todas

las plantas (algas musgos pastos plantas y vasculares) desde los bosques templados hasta los

bosques tropicales hallaacutendose una gran diversidad de plantas y en asociacioacuten gran diversidad de

hongos endoacutefitos (Saacutenchez et al 2010)

Se espera que los hongos endoacutefitos jueguen un papel cada vez maacutes importante potenciado

por el cambio climaacutetico en las enfermedades producidas en plantas como pudricioacuten radicular

mal blanco entre otras con los aumentos pronosticados de la temperatura y el estreacutes por sequiacutea

asociados al cambio climaacutetico (Desprez-Loustau et al 2006 Slippers y Wingfield 2007 6) Los

cambios en la cantidad de dioacutexido de carbono (CO2) y la disponibilidad de nitroacutegeno en el suelo

afectan de forma similar tanto a las plantas como a los hongos por ende las alteraciones

generadas por parte del cambio climaacutetico pueden causar desbalances en sus relaciones (Ies et al

2013)

Algunos estudios realizados en el antildeo 1898 donde se registraron los primeros hongos

endoacutefitos como el de Bary (1866) brindo la iniciativa de investigaciones que lograron explicar

los cuadros toxicoloacutegicos observados en animales los cuales se daban por el consumo de

semillas o en aacutereas de pastos (Poaceae) que posiblemente albergaban hongos Clavicipitaacuteceos

(familia del ergot) los cuales poseiacutean actividades enzimaacuteticas con micotoxinas

Por diversas situaciones no trascendioacute la investigacioacuten hasta que Bacon (1977) hizo

relacioacuten del hongo endoacutefito Neotyphodium coenophialum debido a una intoxicacioacuten del ganado

llamado ldquosiacutendrome de veranordquo cuando estos animales consumiacutean pastos de la especie Festuca

arundinacea (Poaceae) Funk en el antildeo 80 caracterizoacute la resistencia de las Poaceae que

albergaban hongos endoacutefitos que frecuentemente eran atacados por insectos (proteccioacuten contra

herbiacutevoros) (Saacutenchez et al 2010)

Compant y colaboradores (2010) mencionaron que tras experimentar en el laboratorio

con una gama de temperaturas en los hongos endoacutefitos aislados obtuvieron resultados variables

respecto al crecimiento es decir positivos y neutrales llegando a la conclusioacuten de que los

microorganismos asociados a las plantas son un factor importante que influye en la respuesta de

20

las plantas acorde a los cambios de temperatura lo que compromete las respuestas del frailejoacuten y

los hongos endoacutefitos frente al calentamiento global causado por el cambio climaacutetico

Con relacioacuten a los estudios realizados sobre hongos endoacutefitos en frailejones se han

encontrado al menos 100 especies con capacidades de inhibir hongos fitopatoacutegenos o herbivoriacutea

(Cabezas et al 2012)

Los geacuteneros de hongos endoacutefitos encontrados en anteriores estudios son Acremonium

Aspergillus Aureobasidium Colletotrichum Fusarium Gliocadium Nigrospora Paecilomyces

Penicillium Trichothecium Trichoderma y Sordaria (Pineda 2000 Programa Nacional para la

Evaluacioacuten del Estado y Afectacioacuten de los Frailejones en los Paacuteramos de Andes del Norte 2009)

Teniendo en cuenta que para Colombia hay poca informacioacuten sobre hongos endoacutefitos en

ecosistemas paramunos se hace fundamental la ampliacioacuten de maacutes informacioacuten referente al tema

debido a que solo existen estudios significativos en cafeacute leguminosas y rosas los cuales maacutes allaacute

de la identificacioacuten de geacuteneros de hongos endoacutefitos no incluyen el cambio climaacutetico y sus

posibles consecuencias (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016) En

teacuterminos filogeneacuteticos los hongos son el reino de la naturaleza maacutes cercano a los animales

(Hibbett et al 2018)

Las relaciones que posean las diferentes especies de endoacutefitos dentro de la especie de

frailejoacuten es de importancia conocerla mediante el uso de la filogenia molecular (Judd et al 2007)

mediante secuencias de ADN ARN o proteiacutenas (Cooke et al 2000) Dependiendo de la presencia

de especies agresivas de endoacutefitos como Nigrospora se puede tener un mejor conocimiento

sobre las consecuencias que trae consigo los impactos del cambio climaacutetico sobre estas plantas de

los Andes Tropicales (Foden et al 2009)

21

Capiacutetulo primero

Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitos

1 Antecedentes

Desde los estudios realizados por Leacuteveilleacute (1846) y Bary (1866) sobre hongos Endoacutefitos

en pastos de zonas templadas se ha logrado identificar que estos hongos son capaces de inducir

respuestas adaptativas a sus hospederos (Micotoxinas contra herbiacutevora adaptacioacuten a heladas o

climas extremos fijacioacuten de nutrientes) a cambio de alimento y hospedaje formando una relacioacuten

mutualista en la cual las dos especies involucradas son beneficiadas No obstante se ha reportado

que los hongos endoacutefitos ademaacutes de tener relaciones mutualistas con diferentes especies

vegetales se pueden tornar en especies patoacutegenas para su hospedero una vez la planta se

encuentra en condiciones desventajosas tornaacutendose asiacute el hongo endoacutefito en un hongo

fitopatoacutegeno (Herrera y Ulloa 1990 550)

Como se mencionoacute anteriormente los hongos endoacutefitos pueden pasar de un estado

mutualista a un estado de patogeacutenesis dada esta relacioacuten entre ambos organismos se producen

metabolitos secundarios potencialmente toacutexicos facilitando factores de virulencia dados por el

hongo endoacutefito como exoenzimas y metabolitos fitotoacutexicos a su vez la planta presenta defensas

tanto mecaacutenicas como bioquiacutemicas (Saacutenchez et al 2013 5)

Hasta la fecha los principales estudios de hongos endoacutefitos se han fijado en especies de

intereacutes econoacutemico y comercial tales como palma de aceite cafeacute leguminosas pastos de forrajeoacute

y diferentes tipos de rosas (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016)

Las especies modelo para el estudio de los hongos endoacutefitos han sido las gramiacuteneas

forrajeras en donde se han reportado especies de endoacutefitos asociados a los geacuteneros Lolium

Festuca y Brachiaria (Siegel et al 1987) no obstante Otero y Bayman (2009) han reportado un

creciente nuacutemero de estudios en orquiacutedeas epifitas tropicales relaciones con hongos micorrizicos

22

Actualmente existen escasos reportes de hongos endoacutefitos asociados a ecosistemas con

climas extremos (temperaturas extremas) como aacuterticos desiertos paacuteramos y zonas alpinas

especialmente para zonas de temperaturas friacuteas como lo son los paacuteramos (Lopera et al 2008

Leung et al 2011 Cabezas et al 2012 Miles et al 2012 Zhang y Yao 2015)

Investigadores como Lopera Leung y colaboradores (2011) han llegado a la conclusioacuten

de que los hongos endoacutefitos juegan un papel importante en las plantas a la hora de adaptarse a

ecosistemas de clima templado (Kivlin et al 2013 Zhang y Yao 2015)

En Colombia los trabajos con hongos endoacutefitos son pocos por ende trabajos como el de

Lopera y colaboradores (2008) con especies del genero Espeletia de los paacuteramos Colombianos

son pioneros ademaacutes del trabajo de Cabezas y colaboradores (2012 4) en el cual aislaron y

caracterizaron celulasas (enzimas descomponedores de la celulosa) extraiacutedas de hongos endoacutefitos

que se hallaban en especies de Espeletia posteriormente Lopera y Miles (2012) unieron

esfuerzos para continuar caracterizando la diversidad de hongos endoacutefitos en los paacuteramos andinos

colombianos enfocados en Espeletia con el objetivo de encontrar especies con potencial

biocontrolador

Existen trabajos tesis en los repositorios de diversas universidades de los antildeos 2014 y

2015 en los cuales se aborda el tema de los hongos endoacutefitos paacuteramos y especies de Espeletia

(frailejones) y de la familia Poaceae en donde se caracterizan las diversas especies de hongos

endoacutefitos por medio taxonomiacutea y biologiacutea molecular ademaacutes de buscar metabolitos secundarios

con fines medicinales o de biocontrol

Los trabajos en filogenia molecular de hongos endoacutefitos realizados en frailejones se han

visto enfocados maacutes hacia la buacutesqueda de la diversidad funcional en comunidades

microbioloacutegicas como por ejemplo el estudio realizado por Ruiz y colaboradores (2015) en

donde buscaron mediante el anaacutelisis molecular de raiacuteces necromasa hojas maduras y joacutevenes de

diferentes especies de Espeletia (veacutease figura 3) ubicada en los Andes neotroacutepicales

colombianos secuencias geneacuteticas de las regiones V5-V6 de la unidad 16S del rARN

23

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras N

necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefito Tomado de Ruiz y colaboradores (2015)

Este estudio analizoacute la composicioacuten de comunidades microbioanas y su diversidad

funcional en un ecosistema de alta montantildea en donde las temperaturas los rayos UV y la altura

juegan papeles determinantes como filtros ecoloacutegicos severos en donde solo pueden existir

especies que han desarrollado capacidades para adaptarse sobrevivir y colonizar dichas aacutereas

por ende cuando se analizaron las comunidades existentes dentro de estas especies de Espeletia

Encontraron que algunas especies halladas podriacutean tener roles importantes como

productores de metabolitos secundarios enzimas o incluso como bioremediadores y que las

comunidades microbianas eran diferentes tanto en sus hojas como en sus raiacuteces y en la

necromasa

A medida que las deacutecadas avanzan y la evidencia sobre el cambio climaacutetico se hace maacutes

robusta y evidente los estudios en los hongos endoacutefitos han tomado vital importancia al estar

asociados con cultivos de especies comestibles escases de agua y de tierras productivas sumado

a los efectos negativos que trae consigo el cambio climaacutetico para las diferentes plantaciones y

cosechas a nivel global

Es por eso que Lu Yan y colaboradores (2019) analizaron los efectos positivos que teniacutean

la colonizacioacuten de hongos endoacutefitos en las plantas en donde ratificaron que los hongos endoacutefitos

dentro la planta generan metabolitos antimicrobianos estimulan las respuestas inmunoloacutegicas y

compiten por espacio dentro de la planta con diferentes patoacutegenos incrementando asiacute la

resistencia contra herbiacutevoros y la resistencia al estreacutes salino (factores bioacuteticos)

Ademaacutes de ayudar a la planta contra el estreacutes abioacutetico causado principalmente por

factores climaacuteticos como la falta de agua (estreacutes hiacutedrico) las temperaturas extremas la

intensidad de los rayos UV y los metales pesados como la muestra la figura 4 debido a esto se

24

concluyoacute que las fitohormonas cumplen un papel importante en la colonizacioacuten de hongos

endoacutefitos dentro de la planta

Aun que se ha reportado que los hongos endoacutefitos se pueden usar como biocontroladores

diferentes estudios reportan que el uso de hongos endoacutefitos puede tener efectos adversos como

un retraso significativo en el crecimiento de la planta con el uso de la especie Cryptosporiopsis

sp (Terhonen et al 2016) Otro reporte indica la fecundidad y supervivencia de enemigos

naturales como paraacutesitos esto es debido a que los hongos endoacutefitos transfieren sus toxinas y

alcaloides cuando son ingeridos por paraacutesitos u otros enemigos naturales de las plantas (Lopez y

Sword 2015)

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y abioacutetico

Bajo estreacutes bioacutetico (herbiacutevoros y patoacutegenos) y abioacutetico (sequiacutea salinidad metales pesados y otros) (a) se

inducen respuestas de defensa de las plantas (b) los endoacutefitos producen metabolitos protectores y

modulan la viacutea de las fitohormonas para mejorar la inmunidad de las plantas (c) tomada de Lu yan y

colaboradores (2019 7)

25

2 Justificacioacuten

La presente investigacioacuten pretende identificar y caracterizar que especies de hongos

endoacutefitos estaacuten asociadas al frailejoacuten Espeletia hartwegiana y que posibles implicaciones podriacutea

tener que estas especies se encuentren dentro de esta especie de alta montantildea La importancia de

conocer esta informacioacuten reside en que los hongos endoacutefitos pueden beneficiar o perjudicar a la

adaptacioacuten y resistencia de especies vegetales en los distintos escenarios climaacuteticos propuestos

por la ciencia (IPCC 2020)

El calentamiento global podriacutea afectar el equilibrio de los hongos endoacutefitos en especies

vegetales generando desbalances en la planta o la peacuterdida de especies endoacutefitas de importancia

biotecnoloacutegica Por ejemplo se podriacutean perder especies endoacutefitas con potencial para control

bioloacutegico de plagas y enfermedades de plantas como productores de enzimas y metabolitos

secundarios degradacioacuten de plaacutesticos o biorremediacioacuten entre otros (Schulz et al 2002) Por

ello se hace fundamental estudiar los hongos endoacutefitos en ecosistemas de paacuteramo ya que en

Colombia y en los paacuteramos en general han sido poco estudiados y su efecto sobre las plantas de

alta montantildea podriacutea ser clave en el mantenimiento de sus poblaciones

26

3 Hipoacutetesis

H1 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute diferente en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo diferentes los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten tambieacuten seria

modificada

H0 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute similar en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo similares los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten continuariacutean

como se ha registrado con anterioridad

27

4 Objetivos

41 Objetivo general

Caracterizar la diversidad de hongos endoacutefitos presentes en los frailejones

de la especie Espeletia hartwegiana en el paacuteramo de Romerales tomando en cuenta su

relacioacuten con el cambio climaacutetico

42 Objetivos especiacuteficos

Identificar los hongos endoacutefitos asociados en Espeletia hartwegiana del

paacuteramo de Romerales

Hallar relaciones filogeneacuteticas entre las diferentes especies de hongos

Endoacutefitos encontradas en Espeletia hartwegiana

Advertir las repercusiones del cambio climaacutetico sobre Espeletia

hartwegiana en base a su diversidad de hongos endoacutefitos

28

29

Capiacutetulo segundo

Materiales Meacutetodos y Resultados

1 Aacuterea de Estudio

El trabajo se realizoacute en el paacuteramo de Romerales ubicado en la zona alta del municipio de

Salento Quindiacuteo (4deg39202N 75deg25506W) con una extensioacuten aproximada de 6794 ha (Cano

et al 2015)

2 Colecta de material bioloacutegico

La colecta del material bioloacutegico se realizoacute mediante muestreos aleatorios lo largo del

paacuteramo tomando coordenadas de cada punto de colecta (veacutease anexo 3) las hojas se colectaron

por medio de tijeras podadoras siendo empacadas cada una en bolsas Ziploc diferentes se

colectoacute un total de 15 hojas cada una correspondiente a una planta de frailejoacuten para un total de

15 plantas muestreadas de E hartwegiana

Adicionalmente las bolsas Ziploc fueron marcadas con los datos de colecta en campo y

transportadas a los laboratorios del Programa de Biologiacutea de la Universidad del Quindiacuteo para su

procesamiento

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetales

Las muestras obtenidas fueron lavadas con agua para eliminar el exceso de residuos se

cortaron 4 trozos de cada hoja con un tamantildeo aproximado de 05 a 10 cm (veacutease figura 5) luego

cada trozo de hoja se sometioacute a una esterilizacioacuten la cual se completoacute con algunas modificaciones

acorde al procedimiento descrito por (Osorio et al 2017) especiacutefico para el aislamiento de

30

hongos endoacutefitos que consiste en sumergir perioacutedicamente el material vegetal en etanol al 90

durante un minuto seguido de hipoclorito de sodio (NaClO) al 4 por un minuto continuando

con etanol al 70 durante un minuto y por uacuteltimo se lavaraacuten con agua destilada todo dentro de la

campana de flujo

Las cuatro secciones de hoja se transfirieron a una caja de Petri para un total de 15 cajas

de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA) (una caja de Petri por cada 4 cortes de hoja)

Posteriormente las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente (25degC aproximadamente)

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en medio de

cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelial caja de Petri de 20ml de capacidad

Pasadas 3 semanas se revisaron los cultivos fuacutengicos con el fin de revisar el crecimiento

del micelio y hacer un repique a un cultivo puro una vez maduros se procedioacute a utilizar la teacutecnica

de corte de hifa uacutenica (Osorio et al 2017) esta teacutecnica consistioacute en tomar la punta de la hifa con

ayuda de un estereoscopio y un bisturiacute de grado quiruacutergico agua destilada alcohol al 70 y un

mechero para mantener el bisturiacute esterilizado una vez identificada la hifa ideal para cultivar de

forma pura (veacutease figura 6) con el bisturiacute se procedioacute a cortar el agar PDA en forma de cuadro

con una medida aproximada de 3 miliacutemetros cuadrados

31

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la teacutecnica de

corte de hifa uacutenica

Se esperoacute entre 3 a 5 semanas a que crecieran los cultivos puros aislados de las hifas uacutenicas en

nuevas cajas de Petri con agar PDA

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos endoacutefitos)

Los hongos cultivados de forma pura consiguieron un crecimiento micelial significativo a partir

de los 15 diacuteas a temperatura ambiente como lo demuestra la figura 7 que contiene doce de los

cultivos maacutes representativos con su respectivos micelios aeacutereos desarrollados donde variacutean sus

colores formas y consistencias esto indicando que pertenecen a diferentes especies

2

1

3

32

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de cultivo

Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12) aislados de las

hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

5 Extraccioacuten de ADN

4

5

6

7

8

9

10

11

12

33

Una vez el micelio de los hongos se encontraba desarrollado en la cantidad necesaria se

procedioacute a extraer el ADN genoacutemico siguiendo el protocolo de extraccioacuten de Raeder y Broda

(1985) por medio de un barrido superficial del micelio evitando tomar el agar este micelio

posteriormente se colocoacute en tubos Eppendorf esteacuteriles de 2 ml y se pulverizoacute mediante el uso de

un asa microbioloacutegica y 1ml de buffer de extraccioacuten compuesto de Tris-HCL 1 M pH 78 EDTA

05 M Ph 8 SDS 10 wv NaCL y agua destilada para cada tubo a continuacioacuten se agregoacute 800

ul de etanol al 70 500 ul de fenol y se mezcloacute

Se adicionoacute 300 ul de cloroformo y se mezcloacute de nuevo de alliacute se llevoacute a la centrifuga a

10000 rpm por 60 minutos luego de centrifugar se forma un sobrenadante el cual es transferido

en su totalidad a un nuevo tuvo Eppendorf de 15 ml en el cual se agregaron 400 ul de cloroformo

y se llevoacute a la centrifuga a 10000 rpm por 10 minutos en donde nuevamente se forma un

sobrenadante aunque esta vez solo se toman 500 ul del tubo para ser transferidos otro tubo

Eppendorf de 15 ml ya en el nuevo tubo se adicionaron 50 ul de NaAC y se invirtioacute varias veces

para homogenizar la mezcla a continuacioacuten se guardoacute en el refrigerador a 4degC toda la noche

Al diacutea siguiente se tomaron las muestras en los tubos Eppendorf y se centrifugaron a

10000 rpm por 30 minutos (Formacioacuten del Pellet de ADN) cuando la centrifuga terminoacute se

procedioacute a remover el etanol ya sin etanol se agregoacute de nuevo 1 ml de etanol al 70 a cada tubo

y se centrifugoacute a 10000 rpm por 5 minutos en este paso se removioacute el etanol y se dejoacute secar el

pellet de ADN una vez el etanol se evaporoacute se re suspendioacute el pellet en 100 ul de agua grado

molecular o Sabax con 5 ul de RNAsa con el fin de evitar la presencia de moleacuteculas de ARN

posteriormente se incubaron a 37degC por 30 minutos y se guardaron para su envioacute a -20degC

(Raeder y Broda 1985)

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengica

Una vez se secuenciaron las muestras de ADN enviadas a la Universidad Ruhr de

Bochum Alemania se hizo el ensamblaje de las secuencias en contigs y scaffolds en el

programa CLC Main Workbench 8 (Nicola et al 2013) Como lo muestra la figura 8 donde se

muestran los pasos esenciales de una teacutecnica de Metagenoacutemica donde posteriormente se

analizaron con maacutes detalle mediante teacutecnicas filogeneacuteticas

34

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemico Fuente Thomas y colaboradores (2012)

7 Secuenciamiento

Se extrajoacute con eacutexito un total de 35 muestras de hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

Espeletia hartwegiana (veacutease figura 9) que posteriormente fueron secuenciadas por la

Universidad Ruhr de Bochum (Alemania) logrando un total de 70 secuencias incluyendo

aquellas obtenidas en Genk Bank

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de frailejoacuten

Espeletia hartwegiana

35

8 Anaacutelisis Filogeneacutetico

Se aislaron 35 secuencias basadas en la especie Espeletia hartwegiana fueron

comparadas posteriormente con 35 secuencias de especies publicados en GenBank

(httpblastncbinihgovblastcgi) se obtuvo un total de 70 secuencias Las secuencias de

consenso ITS 58S DNA obtenidas se usaron para realizar buacutesquedas BLAST en GenBank

usando BLASTn (Altschul et al 1990) con el fin de identificar mediante las secuencias aisladas

los geacuteneros o las especies maacutes cercanas La matriz de datos fue alineada en MAFFT v7 (Katoh y

Standley 2013) Se utilizaron las especies Coprinellus xanthothrix y Coprinellus domesticus

como grupos externos

Los anaacutelisis de las secuencias para construir los arboles filogeneacuteticos de Maacutexima

Parsimonia (MP) fueron realizados usando PAUP v40b10 (Swofford 2003) Para el anaacutelisis de

Maacutexima Verosimilitud o ML por sus siglas en ingleacutes (Maximum Likelihood) se utilizoacute

JmodelTest (Darriba et al 2012) con el cual se infirieron los criterios del modelo de sustitucioacuten

apropiado utilizando los criterios de informacioacuten de Akaike (AIC) (Akaike 1974)

Los anaacutelisis de ML se realizaron con el programa PhyML v 30 (Guindon y Gascuel

2003) teniendo en cuenta la proporcioacuten de sitios invariables Los valores de soporte de confianza

para los nodos se estimaron mediante 1000 anaacutelisis de arranque de replicacioacuten La alineacioacuten de

los datos de la secuencias de ITS para 70 aislamientos determinoacute quince geacuteneros siendo los

siguientes Annulohypoxylon Biscogniauxia Colletotrichum Crassiparies Cryptocoryneum

Cyphellophora Diaporthe Daldinia Humiacutecola Hypoxylon Hypocrea Nemania Nigrospora

Massarina y Trichoderma de los cuales se obtuvieron 11 clados principales (veacutease figura 10)

Con base en estos resultados todos los aislamientos se analizaron maacutes a fondo dentro de los

geacuteneros hasta llegar a especie (veacutease tabla 1)

36

Geacuteneros Especie Especie Especie Especie Especie Especie Especie

Annulohypoxylon A nitens A bahnphaden

gense

Biscogniauxia B petrensis

Colletotrichum C gloeosporioides

C gigasporum

Cyphellophora C

reptans

Crassiparies C quadrisporus

Cryptocoryneum C

longicondensatum

Daldinia D dennisii D

eschscholtzi

D

conceacutentri

ca

Diaporthe D

longicolla

D

foeniculina

D

anacardi

i

D

macada

miae

Humiacutecola H

fuscoatra

Hypoxylon H

trugodes

H

pulicicidum

Hypocrea H

koningii

Massarina M albocarnis

Nemania N

primolutea

Nigrospora N sacchari N rubi N sphaeric

a

N hainanen

sis

N oryzae

N gorlenko

ana

N aurantia

ca

Trichoderma T trixiae T

olivascens

T

paraviridescens

T

viridescens

T

samuelsii

T viride

Grupo Externo Coprinellus C

domesticus

C

xanthothrix

Tabla 1 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos endoacutefitos en la

especie Espeletia hartwegiana

37

38

Figura 10 Filograma consenso obtenido con el programa MEGA ndashX a partir del anaacutelisis ML y MP del

conjunto de datos ITS Aislados de las hojas de frailejoacuten Los coacutedigos en Verde son las secuencias que se

aislaron (aislados) en este estudio los coacutedigos y nombres en Negro son las secuencias encontradas por

identidad en GenBank Los valores de soporte de bootstrapgt 70 se indican cerca de los nodos como MP

ML = valores de soporte de bootstrap lt70

El nuacutemero de caracteres los modelos de sustitucioacuten usada asiacute como otros resultados

estadiacutesticos de las pruebas de Maacutexima Parsimonia y Maacutexima Verosimilitud generados a partir de

los anaacutelisis filogeneacuteticos de los conjuntos de datos se muestran en los anexos

39

Capiacutetulo Tercero

Discusioacuten sobre los hongos endofitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicas

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidad de Endoacutefitos

Tanto la temperatura la estacionalidad y los tipos de precipitacioacuten son factores de vital

importancia para la composicioacuten de las diferentes comunidades y la arquitectura vegetal Estos

factores limitan muchos de los procesos ecosisteacutemicos ya que existe una estrecha relacioacuten entre

las variaciones climaacuteticas y las variaciones dentro de los ecosistemas Por lo tanto se espera que

el cambio climaacutetico transforme los ecosistemas Andinos tal como los conocemos hoy (Colwell et

al 2008) modificando las relaciones mutualistas entre plantas y hospederos

Posiblemente la resiliencia y resistencia de muchos ecosistemas como el paacuteramo sean

superadas en este siglo por una combinacioacuten sin precedentes de disturbios tales como el cambio

climaacutetico perturbaciones asociadas a este (sequiacuteas fuegos invasioacuten de especies exoacuteticas

inundaciones) y otros factores como organismos oportunistas (hongos endoacutefitos) cambios en el

uso del suelo contaminacioacuten y sobreexplotacioacuten de recursos (IPCC 2020)

Considerando que el frailejoacuten Espeletia hartwegiana es una especie de alta montantildea

(paacuteramos) endeacutemica de la cordillera Central de los Andes (Schultz y Carl 1856) se encuentra

dentro de los ecosistemas andinos en donde a su vez se ha comprobado la existencia de los

hongos endoacutefitos es de tener en cuenta el papel de estos organismos endoacutefitos ya que los

paacuteramos son ecosistemas particularmente sensibles a los efectos adversos del cambio climaacutetico

en especial al calentamiento global al estar ubicados en los troacutepicos generando asiacute ventanas de

40

oportunidades para que los hongos endoacutefitos alteren su estado mutualista y pasen a ser

patogeacutenicos (Colwell et al 2008 7)

No obstante existe consenso en que las temperaturas aumentaraacuten especiacuteficamente a

grandes alturas y que la precipitacioacuten posiblemente se incrementaraacute en algunas zonas disminuiraacute

en otras y se produciraacute en patrones estacionales alterados con mayor intensidad y frecuencia

(Marengo et al 2009)

Los frailejones se ven en constante estreacutes por el uso del suelo dado en los paacuteramos como

es el caso del paacuteramo Romerales un paacuteramo que se ha visto afectado por las quemas y la

ganaderiacutea (Molinillo y Monasterio 2001) Esto aumenta asiacute las condiciones de estreacutes intriacutensecas a

las que estaacuten expuestas estas plantas de paacuteramo las cuales suministran valiosos bienes y servicios

ecosisteacutemicos como el abastecimiento continuo de agua para usos domeacutesticos agriacutecolas e

industriales (Buytaert et al 2006 4) servicios que se podriacutean ver en decrecimiento si las

ventanas de oportunidades se abren con maacutes frecuencia dando pie al cambio de estado de los

hongos endoacutefitos que existen dentro de los frailejones de la zona

En los paacuteramos de Chingaza Rabanal Guerrero Iguaque Merchaacuten y Sumapaz se han

realizado estudios de aislamientos de hongos en especies de frailejoacuten diferentes a la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana tales como Espeletia argentea Espeletia arbelaezii Espeletia

boyacensis Espeletia grandiflora Espeletia miradorensis y Espeletia uribei por ende se ha

reportado la presencia de hongos endoacutefitos y fitopatoacutegenos (Tabla 2) (Gaitan 2018 17)

Frailejones Espeletia

argentea

Espeletia

arbelaezii

Espeletia

boyacensis

Espeletia

grandiflora

Espeletia

miradorensis

Espeletia

uribei

Aspergillus X X X X

Annulohypoxylon X X X

Curvularia X X X

Epicoccum X X X

Fusarium X X X

41

Tabla 2 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = a presencia del genero de

hongo dentro de la especie de frailejoacuten

Los geacuteneros de hongos en rojo son los geacuteneros que se encontraron en comuacuten con los

geacuteneros hallados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana de un total de 15 geacuteneros 3

han sido reportados anteriormente en estudios similares ( 20 de geacuteneros identificados)

Dentro de un marco de cambio climaacutetico es importante la metodologiacutea de muestreo

como lo fue el formato de muestreo en puntos aleatorios realizado en el presente estudio se llevoacute

acabo principalmente por la homogeneidad de los frailejones en el paacuteramo como lo indica el

manual de meacutetodos baacutesicos de muestreo y anaacutelisis de ecologiacutea vegetal (BOLFOR 2000 9) donde

se menciona que el muestreo aleatorio se utiliza cuando se dispone de poca informacioacuten previa de

las caracteriacutesticas de las poblaciones a medirse en este caso la poblacioacuten a identificarse fueron

los hongos endoacutefitos que se hallaban dentro de las formaciones homogeacuteneas de los frailejones

No obstante el muestreo aleatorio tambieacuten presenta limitaciones a la hora de comparar los

hongos endoacutefitos a lo largo del gradiente altitudinal (muestreo aleatorio estratificado) dejando de

percibir informacioacuten proveniente de los distintos microclimas que se encuentran y de las

incidencias que podriacutean causar a la hora de identificar los geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten ademaacutes de posibles micro efectos del cambio climaacutetico a lo

largo del gradiente altitudinal (Caacutemara et al 2008)

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio Climaacutetico

Nigrospora X X X X X

Penicillium X X X

Pleospora X X X X

Trichoderma X X X X

42

Las teacutecnicas empleadas en este estudio para lograr aislar e identificar los hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana se hacen importantes dentro del cambio

climaacutetico debido a que el margen de error en la identificacioacuten molecular es reducido (Bakermans

et al 2014) Al ser reducido el margen de error se pudo conocer con mayor certeza que especies

y geacuteneros de hongos endoacutefitos se encuentra dentro de la planta

Al conocer sus identidades es posible conocer las capacidades que tienen cada una de

estas especies de hongos endoacutefitos de producir metabolitos secundarios de infiltrarse y proteger

los tejidos de la planta de condiciones bioacuteticas y abioacuteticas competir contra herbiacutevoros y

fitopatoacutegenos (Schulz et al 2002) Con sus capacidades reconocidas es posible vincular los

efectos del cambio climaacutetico como estreacutes hiacutedrico aumento de la temperatura migraciones

tempranas enfermedades emergentes aumentos de la precipitacioacuten y heladas severas con las

reacciones por parte de los hongos endoacutefitos Estas reacciones podriacutean desencadenar aumentos de

la patogenicidad en las poblaciones de frailejones debido a los constantes disturbios y estreacutes al

que se ve sometido la planta generando asiacute notables declives poblacionales (Mendoza 2010)

Las relaciones filogeneacuteticas entre las especies halladas toman relevancia debido a las

sinergias positivas o negativas que se pueden presentar dependiendo de las especies que se

encuentren asociadas dentro de la planta (Lamichhane y Venturi 2015) como por ejemplo

Nigrospora y Colletotrichum pueden activar una sinergia negativa aumentando la virulencia y

afectando la especie Espeletia hartwegiana

Las especies de hongos endoacutefitos se identificaron por medio de secuencias obtenidas de

las regiones ITS (regioacuten de espaciadores internos transcritos) las cuales son regiones altamente

conservadas con tasas de evolucioacuten muy lentas en el tiempo permitiendo hacer inferencias

filogeneacuteticas (Baldwin et al 1995 Hamby y Zimmer 1992) es por ello que se usaron para

generar las diferentes identificaciones de los hongos endoacutefitos logrando asiacute identificar al geacutenero

Nigrospora con un total de 7 especies N sacchari N rubi N sphaerica N hainanensis N

gorlenkoana N oryzae y N aurantiaca pertenecientes a la familia Apiosporaceae orden

Xylariales Divisioacuten Ascomicota (veacutease figura 11) (Wang et al 2017)

Dentro del marco del cambio climaacutetico Nigrospora se caracteriza por poseer una

distribucioacuten cosmopolita y una amplia gama de hueacutespedes como lo es en este caso la especie E

hartwegiana que habita en los Andes Tropicales que se veraacuten alterados por los efectos del

cambio climaacutetico este geacutenero se ha logrado aislar en su forma endoacutefita en tallos y hojas de

43

diversas plantas tambieacuten como saprofitos en detritos hojarasca y larvas muertas (Uzor et al

2015 1)

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

Los hongos endoacutefitos hallados en esta investigacioacuten se encontraron dentro de la especie

de frailejoacuten E hartwegiana la cual pertenece a los Andes Tropicales ubicados maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos Estos ecosistemas son sensibles a los efectos del cambio

climaacutetico por su altura su alto endemismo y su sensibilidad al efecto de borde Cuando las

especies lentildeosas empiecen a migrar a lo largo del gradiente altitudinal es posible que los

frailejones se encuentren con suelos agrestes en donde sus semillas no podraacuten fijarse y los efectos

adversos de hongos como Nigrospora N oryzae y N sphaerica seraacuten maacutes notables

aprovechando las ventanas de oportunidad que generen los desbalances climaacuteticos (Sharma et al

2013)

Los cambios en los patrones climaacuteticos potenciaran la especie N sphaerica dentro del

frailejoacuten la cual tiene la capacidad de causar tizoacuten foliar en la especie Camellia sinensis siendo

una planta de teacute perteneciente a la divisioacuten de las magnolifiotas como el geacutenero Espeletia (Liu et

al 2015) Nigrospora fue el geacutenero maacutes ampliamente aislado en las identificaciones generadas a

partir de las hojas de frailejoacuten esto se veriacutea explicado debido a que N sphaerica tiene un

mecanismo de descarga de esporas efectivo que puede proyectar a la fuerza sus esporas a una

distancia de hasta 2 cm en vertical y 68 cm en horizontal como lo demostroacute Webster (1952)

ademaacutes el estudio de Wu y colaboradores (2004) tambieacuten evidencioacute que las esporas de

44

Nigrospora son uno de los grupos maacutes dominantes en la atmoacutesfera y estaacuten asociadas con

tormentas de polvo

La gran capacidad colonizadora del geacutenero Nigrospora le permite adaptarse a las

condiciones climaacuteticas cambiantes con la estrategia de dispersioacuten de sus esporas logrando

distanciarse del frailejoacuten hospedero para encontrar nuevos hospederos producto de las

migraciones tempranas a lo largo del gradiente altitudinal (Riveros 2010)

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

por encima del 80 lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen menos

mutaciones en los nodos internos del aacuterbol basados en la distribucioacuten de probabilidad asignadas

a los posibles arboles resultantes dando lugar a una hipoacutetesis evolutiva maacutes confiable (Schmidt y

Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 es decir el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes

corto (menos cambios) y el cual se ajusta mejor a los datos (Swofford 1997)

Teniendo asiacute una inferencia filogeneacuteticamente robusta los geacuteneros Collectotrichum y

Nigrospora pertenecen a la Divisioacuten Ascomycota ambos geacuteneros son particularmente agresivos

con las plantas en especial la especie Colletotrichum gloeosporioides la cual es la fase asexual

de Glomerella cingulata (Raj et al 2013) Se caracteriza por tener un amplio rango de

hospederos entre ellos el frailejoacuten a los cuales les causa una enfermedad conocida pudricioacuten

amarga antracnosis o chancros siendo esta la necrosis de frutos flores nervios y tallos

(Gonzaacutelez et al 2006 4)

Uno de los primeros reportes de afectaciones a especies de frailejoacuten se obtuvo en el 2009

en el Parque Natural Nacional Chingaza Colombia en donde encontraron las especies de

frailejoacuten Espeletia grandiflora y Espeletia uribei afectadas debido a insectos y una especie de

hongo del genero Colletotrichum (Medina 2009- 9 Hartung y Burton 1981)

Por ende que estos dos geacuteneros de hongos se encuentren juntos podriacutea tener

implicaciones en el aumento de virulencia potenciado a su vez por los desbalances abioacuteticos

causados por el cambio climaacutetico como lo han mencionado Belisario y colaboradores (2002) es

posible que las afectaciones no sean producidas por un uacutenico hongo si no por un complejo de

varios generando sinergismos entre diferentes especies que solas no hariacutean dantildeo a la planta pero

juntas podriacutean ser causantes de enfermedad (Lamichhane y Venturi 2015 4) aun mas en un

45

marco de cambio climaacutetico que gradualmente aumenta sus efectos nocivos sobre los paacuteramos

aumentando la temperatura cambios en la precipitacioacuten heladas intensas cambios en la

nubosidad mayor exposicioacuten a la radiacioacuten solar teniendo por resultado un iacutendice de estreacutes

mayor en las plantas de paacuteramo generando ventanas de oportunidades para que los hongos

endoacutefitos modifiquen sus roles de protector a patoacutegeno

En frailejones tambieacuten se ha reportado la presencia de Nigrospora y Trichoderma por

Bonilla y Argenis (2005) maacutes especiacuteficamente en la especie Espeletia grandiflora la cual es una

especie que habita en los paacuteramos de Colombia Ecuador y Venezuela en conjunto con Espeletia

hartwegiana (Luteyn 1999 3) El hecho que existan estos dos geacuteneros presentes en los frailejones

advierte de un equilibrio entre hongos endoacutefitos que se puede romper bajo las tensiones del

cambiante clima maacutes aun en los sensibles paacuteramos alto andinos

En cuanto a N sacchari se tiene reporte que es un productor de metabolitos con una

notable actividad herbicida demostrado en plantas cultivadas en invernadero (Fukushima et al

1998 2) debido a que existe evidencia que sugiere que los hongos endoacutefitos han evolucionado

directamente de hongos patoacutegenos (Schulz et al 1999 4) sumado al estreacutes del cambio climaacutetico

en cualquier momento de extrema tensioacuten hiacutedrica caloacuterica o heladas en estos ecosistemas de alta

montantildea Estos anomaliacuteas ambientales podriacutea disparar mecanismos de accioacuten fitopatoacutegenos

dentro de los frailejones generando un declive notable en sus poblaciones y por ende un declive

de la cantidad recurso hiacutedrico aguas abajo y su regulacioacuten (Diacuteaz et al 2002 5)

Como se mencionoacute anteriormente los medios de propagacioacuten de estos hongos endoacutefitos

pueden ser por medio de esporas que estaacuten en el ambiente aunque tambieacuten los vectores que

juegan un rol clave en su dispersioacuten son los insectos ya que estos pueden transportar esporas o

partes del hongo en su cuerpo patas o aparato bucal (Eigenbrode et al 2018 5)

Considerando la dispersioacuten homogeacutenea de los frailejones dentro del paacuteramo la carga

esporas en el ambiente y la herbivoriacutea de insectos es probable que se puedan ver infectados la

mayoriacutea de individuos (Varela 2016) es por ello que en el futuro puede que las afectaciones en

frailejones no sean producidas por hongos fitopatoacutegenos si no por hongos endoacutefitos que tuvieron

la ventana de oportunidad gracias al cambio climaacutetico aumento de la temperatura aumento en

las concentraciones de CO2 y alteraciones de precipitacioacuten que pueden hacer susceptible la planta

al ataque de estos hongos (Chakraborty 2011 Elad y Pertot 2014)

46

Para que se genere la enfermedad esta depende de la interaccioacuten de tres o cuatro factores

1) hospedero susceptible 2) agente causal (virulento) 3) condiciones ambientales favorables y 4)

tiempo (Francl 2001 2) la falta de alguno de ellos no permite que el patoacutegeno produzca la

enfermedad en la planta debido a ello algunas especies de frailejoacuten pueden tener una o dos cepas

que puedan actuar como fitopatoacutegenos pero no estaacuten activas si no estaacute completa su asociacioacuten

con otro patoacutegeno u otro factor

Ademaacutes existe un estudio que evaluoacute el efecto de la temperatura sobre la capacidad de

Fusarium verticillioides para generar infeccioacuten en plantas de maiacutez se probaron bajo 3 escenarios

de temperatura como resultados obtuvieron que la enfermedad de este hongo se veiacutea potenciada

por el aumento de temperatura en temperaturas por encima de 35degC (Murillo et al 2008) este

estudio da soporte a la hipoacutetesis de que existen factores que influyen significativamente a la

infeccioacuten en la planta tal vez el paacuteramo difiacutecilmente alcance 35degC no obstante la mayoriacutea de

especies son sensibles a cambios de temperatura de hasta de 1degC en donde modifican su

comportamiento rutas metaboacutelicas interacciones ecoloacutegicas y por ende sus defensas se ven

alteradas

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e Hypocrea

El geacutenero Trichoderma con seis especies diferentes (veacutease figura 12) fue el segundo

geacutenero maacutes numeroso despueacutes de Nigrospora que contoacute con siete especies aunque las primeras

especies que se analizaron fueron especies que principalmente actuaban generando enfermedades

en las plantas en las que se encontraban ante disturbios el geacutenero Trichoderma pertenece a la

47

familia Hypocreaceae y se caracteriza por tener una gran capacidad biocontroladora sobre

fitopatoacutegenos como Fusarium oxysporum los cuales podriacutean llegar masivamente con las

migraciones tempranas de insectos y plantas lentildeosas (Miles et al 2012 7)

No solo actuacutean repeliendo patoacutegenos internos si no tambieacuten patoacutegenos externos como

insectos que desean consumir u aprovechar la planta ya que estos pueden secretar diferentes

metabolitos secundarios y enzimas que actuacutean inhibiendo su desarrollo (Boughalleb-M et al

2018 8)

Es bien conocido que el geacutenero Trichoderma produce amplio rango de sustancias

antibioacuteticas ademaacutes de poseer la caracteriacutestica de parasitar otros hongos (Howell 2002 6)

Debido a la competencia que generan las especies del genero Trichoderma por espacio y

nutrientes inhiben o degradan pectinasas y otras enzimas que son esenciales para que los hongos

fitopatoacutegenos como Botrytis cinerea penetre en la superficie de las hojas logrando proteger de

esta forma al frailejoacuten que se veraacute expuesto a nuevas amenazas microbioloacutegicas auspiciadas por

los cambios en los patrones climaacutetico (Zimand et al 1996)

Ademaacutes de la capacidad del Trichoderma sp para atacar o inhibir el crecimiento de

patoacutegenos de plantas directamente descubrimientos recientes indican que tambieacuten pueden inducir

resistencia sisteacutemica y localizada a una variedad de patoacutegenos de plantas tales como el frijol es

protegido por Trichoderma harzianum de especies fitopatoacutegenas como Colletotrichum

lindemuthianum Botrytis cineacuterea las cuales producen lesiones en las hojas de la planta (Harman

y Howell 2004) Incluso se descubrioacute que ciertas especies de Trichoderma tienen una influencia

sustancial en el buen crecimiento y desarrollo de las plantas sin y con condiciones de estreacutes

climaacutetico (Lorito 1998)

Como lo demostraron Bonilla y Argenis (2005) en su estudio llevado a cabo en el

frailejoacuten Espeletia grandiflora diferentes cepas pertenecientes a Trichoderma pueden proteger

esta especie de paacuteramo de organismos fitopatoacutegenos emergentes por el cambio climaacutetico por

ende si puede proteger a E grandiflora tambieacuten puede proteger la especie E hartwegiana lo

que le permitiraacute sobrellevar diferentes ataques fortuitos de patoacutegenos e insectos que nunca han

logrado alcanzar las altitudes de paacuteramo (3200 - 5000 m)

Cuando el cambio climaacutetico aumente la temperatura en 1degC o 2degC traeraacute consigo sus

efectos de modificacioacuten en cuanto a la estructura y composicioacuten de las especies de plantas que

48

existen en zonas altas para este escenario basado en los caacutelculos de Thuiller (2007) las especies

se habriacutean desplazado en el gradiente altitudinal aproximadamente 450 metros para el antildeo 2070

Las consecuencias de este desplazamiento serian uacutenicas debido a que gran cantidad de

insectos y patoacutegenos tendriacutean migraciones tempranas en el gradiente altitudinal en buacutesqueda de

su optimo teacutermico llevando a cabo un proceso conocido como Termofilizacioacuten (Cuesta et al

2019) es ahiacute donde entra en juego la proteccioacuten que le pueden brindar especies endoacutefitos como

las que pertenecen al geacutenero Trichoderma en el marco de cambio climaacutetico

En concordancia con las cepas de Trichoderma y el geacutenero Hypocrea que tambieacuten

pertenece a la familia Hypocreaceae se conocen maacutes de 700 secuencias de peptaiboles (peacuteptidos

bioloacutegicamente activos) de ambos geacuteneros donde algunos de eacutestos son ecoloacutegica y

comercialmente relevantes debido a su potencial antimicrobiano actividad enzimaacutetica uacutetil para

competir por espacio y alimento de los nuevos patoacutegenos emergentes procedentes de las

alteraciones climaacuteticas y las migraciones tempranas (Degenkolb et al 2008 6)

En cuanto al geacutenero Hypocrea tambieacuten se ha reportado actividad antimicrobiana y anti

fuacutengica contra Staphylococcus aureus y Fusarium oxysporum (Gogoi et al 2008 2) habitando

los geacuteneros Trichoderma e Hypocrea dentro de especies de frailejoacuten como E hartwegiana se

espera que puedan generar sinergias de proteccioacuten que las ayude a combatir los fuertes y

extremos eventos climaacuteticos

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

del 100 (veacutease figura 13) lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen

menos mutaciones en los nodos internos del aacuterbol por ende este aacuterbol contiene la menor

cantidad de mutaciones o cambios dentro sus nodos internos teniendo como resultado una

hipoacutetesis evolutiva confiable (Schmidt y Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 que

indica que el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes corto (menos cambios) y el cual se ajusta

mejor a los datos (Swofford 1997)

49

El geacutenero Annulohypoxylon es de importancia dentro del marco del cambio climaacutetico ya

que pertenece a la familia Xylariaceae y se caracteriza por poseer metabolitos secundarios

antitumorales-citotoacutexicos como la anuloescuamulina que ayudan a combatir el estreacutes abioacutetico

(Cheng et al 2012) estas cepas de hongos son principalmente saprofitos y oportunistas han sido

reportadas en hojas sanas y afectadas de frailejones en otros estudios (Gonzaacutelez 2012 Nonsoque

2012) siendo un geacutenero resiliente a las perturbaciones ambientales como los cambios en los

patrones climaacuteticos su relacioacuten como mutualista dentro del frailejoacuten se mantendraacute hasta que el

frailejoacuten se adapte o colapse ante el estreacutes abioacutetico

Aunque no se conocen como fitopatoacutegenos al contrario pueden actuar como mutualistas

no se descarta que puedan estar involucrados en el desarrollo de diferentes enfermedades en

plantas cuando las condiciones ecosistemicas se alteran a puntos extremos (Gonzalez et al 2017)

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon Biscogniauxia

Nemania y Humiacutecola

El geacutenero Daldinia posee unos valores de MPML correspondientes a 10094 con lo cual

se encuentra bien soportado estadiacutesticamente el geacutenero Daldinia se encuentra ubicado en la

familia Xylariaceae al igual que el geacutenero Hypoxylon Biscogniauxia y Nemania que en su

respectivo orden contienen un soporte estadiacutestico MPML de 10082 10099 y 100100 (veacutease

figura 14) los cuales pertenecen a la divisioacuten Ascomycota las cepas de Daldinia se caracterizan

principalmente por ser especies endoacutefitas teniendo la capacidad de estar dentro de su hueacutesped

mucho tiempo sin causarle dantildeo o al menos un dantildeo evidente por medio de su estado asexual

50

No obstante su estado se puede modificar cuando las condiciones externas se modifican

abruptamente en poco tiempo como es el caso de las alteraciones en la temperatura

precipitacioacuten y concentraciones de dioacutexido de carbono (CO2) auspiciados por el cambio

climaacutetico (Saacutenchez et al 2013)

Un estudio realizado por Prieto (2017) en la especie de frailejoacuten E grandiflora encontroacute

que la especie Daldinia eschscholtzii estaba asociado en el siacutentoma de clorosis (falta de clorofila

en las hojas) Tambieacuten se reportoacute que especies de Daldinia como Daldinia conceacutentrica tienen la

capacidad de controlar nematodos fitopatoacutegenos (Silva et al 2020 104) los cuales pueden invadir

y romper los tejidos de la planta dantildeando sus estructuras los nematodos tambieacuten seraacuten sujetos a

migraciones tempranas por el cambio climaacutetico que trae consigo presiones de seleccioacuten por ende

nuevas amenazas para los frailejones (Nakashima et al 2007)

Como hemos visto hasta este punto las especies de hongos endoacutefitos se muestran en

muchos casos como benefactores y protectores de las diferentes plantas en las que habitan

incluyendo diferentes especies de frailejones

Los hongos endoacutefitos protegen tanto de factores bioacuteticos como virus hongos

fitopatoacutegenos bacterias insectos y factores abioacuteticos como las intemperancias del clima no

obstante en su relacioacuten endoacutefita geacuteneros como Hypoxylon que pertenece igual que Daldinia a la

familia Xylariaceae pueden tener roles amenazadores en conjunto con el cambio climaacutetico

seguacuten Gonzales y colaboradores (2019) inocularon cepas pertenecientes al geacutenero Hypoxylon en

hojas de Theobroma cacao y encontraron que en 48 horas se comenzoacute a notar las marcas de

clorosis y deshidratacioacuten foliar esto demuestra que cepas de este geacutenero pueden tener efectos

fitopatoacutegenos ocasionando muerte descendente pudricioacuten del tronco negro y resinosis de ramas

de mezquite (De la Torre-Almaraacutez et al 2003 De la Torre-Almaraacutez et al 2009)

La presencia de este geacutenero dentro del frailejoacuten en un marco del cambio climaacutetico lo

convierte en una amenaza latente ya que las condiciones seraacuten cada vez maacutes agrestes en los

paacuteramos de los Andes Tropicales Puede favorecer el desarrollo de este geacutenero que tiene las

enzimas necesarias para producir la pudricioacuten del tronco negro entre otras enfermedades

relevantes

51

Tambieacuten las especies del geacutenero Hypoxylon se han reportado como endoacutefitos en tejidos de

plantas lentildeosas o herbaacuteceas (Petrini y Petrini 1985 3) asiacute como saprofitos o fitopatoacutegenos

deacutebiles en madera de aacuterboles de zonas templadas o tropicales (Miller 1961) como lo menciona

Miller (1961)

Los geacuteneros Biscogniauxia Nemania tambieacuten estaacuten dentro de la familia Xylariaceae y

Divisioacuten Ascomycota un aspecto interesante de las especies de Biscogniauxia es que son

paraacutesitos exclusivos de las angiospermas dicotiledoacuteneas en donde concluyeron que todas las

especies pertenecientes a este geacutenero son patoacutegenos umllevesuml que se aprovechan de situaciones de

sequiacutea y estreacutes hiacutedrico para aumentar su patogenicidad (Ju et al 1998)

La especie de frailejoacuten E hartwegiana es una Dicotiledoacutenea eso explica porque

podemos encontrar esta especie de hongo endoacutefito en el frailejoacuten del presente estudio siendo de

vital importancia denotar que las especies de Biscogniauxia se aprovechan especialmente de las

situacioacuten de sequiacutea y estreacutes hiacutedrico difiacutecilmente las especies de este geacutenero podriacutean afectar a los

frailejones debido a que se caracterizan por ser reguladores de los ciclos hiacutedricos el agua es el

recurso que maacutes tiende a existir en un paacuteramo por la estructura de sus suelos compuesta por

andosoles porosos y necromasa acumulada teniendo asiacute un alto iacutendice de retencioacuten hiacutedrica

(Hernandez y Muntildeoz 2015) de modo que el cambio climaacutetico no favorece al geacutenero

Biscogniauxia en su estado patogeacutenico dentro del ecosistema de paacuteramo

En cuanto al geacutenero Nemania Da Silva y colaboradores (2018) llevaron a cabo una

investigacioacuten en la cual identificaron cepas pertenecientes a los geacuteneros Colletotrichum

Phyllosticta Xylaria Nemania y Alternaria en la especie ornamental Pachystachys lutea en

donde las mismas cepas fueron ensayadas para inhibir el crecimiento de hongos fitopatoacutegenos

como Colletotrichum sp en donde encontraron que Nemania era capaz de inhibir por medio de la

secrecioacuten de distintas enzimas el crecimiento de dichas especies gracias a su actividad

enzimaacutetica el geacutenero Nemania puede compensar los desequilibrios causados por el cambio

climaacutetico en teacuterminos de hongos fitopatoacutegenos

Hay que tener en cuenta que los elementos que dan forma a las interacciones planta-

endoacutefito incluyen el modo de transmisioacuten el patroacuten de infeccioacuten la edad de la planta las

condiciones ambientales potenciadas por el cambio climaacutetico y los antecedentes geneacuteticos (Aly et

al 2011 6) Los frailejones de la especie E hartwegiana que se muestrearon para el estudio se

52

tomoacute las hojas sanas lo que indica que poseiacutean estas cepas de endoacutefitos en equilibrio siendo este

uno de los pocos reportes de este geacutenero en especies de alta montantildea en los Andes Tropicales

El geacutenero Humiacutecola se encuentra soportado por un MPML de 10076 siendo una

hipoacutetesis evolutiva considerable es el uacutenico de la figura 14 que no estaacute dentro de la familia

Xylariaceae ya que pertenece a la familia Chaetomiaceae aunque se halla en la divisioacuten

Ascomycota se podriacutea considerar a la especie Humiacutecola fuscoatra como una de las especies de

endoacutefitos maacutes umlinofensivasuml debido a trabajos de investigacioacuten reportados como el de Menzies y

colaboradores (1998) y el de Naik y colaboradores (2009)

Humiacutecola fuscoatra no se considera un peligro latente para la especie E hartwegiana ya

que existe en equilibrio con su entorno Estaacute comprobado por medio de caracterizaciones

quiacutemicas que Humiacutecola fuscoatra es un importante productor de moleacuteculas de estimacioacuten

medica como el resorciacuteclico y lactonas aacutecidas (Mejia et al 2014) Por lo tanto es una especie

prometedora con un reservorio de metabolitos secundarios de importancia medicinal e industrial

que de seguir los efectos nocivos del cambio climaacutetico en los Andes Tropicales maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos esta especie podriacutea desaparecer

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies Massarina

Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

Uno de los grupos mejores soportados en este cladograma es el grupo de Diaporthe en el

cual se encontraron cuatro especies siendo uno con maacutes abundancia de especies del estudio y que

posee un MPML de 10085 10089 y 10095 acorde a sus 3 nodos (veacutease figura 15) teniendo asiacute

una hipoacutetesis evolutiva confiable de estas relaciones las especies de Diaporthe pertenecen a la

familia Diaporthaceae de la divisioacuten Ascomycota y son especies de endoacutefitos que se distinguen

por inhibir el crecimiento de hongos patoacutegenos en el hospedero que se encuentren El estudio de

53

Da Silva y colaboradores (2018) mostroacute que cepas de Diaporthe sp Inhibieron el crecimiento de

Fusarium oxysporum y Colletotrichum sp hongos fitopatoacutegenos que aumentaran su presencia

aprovechando las alteraciones producidas por el cambio climaacutetico en los paacuteramos

Las especies de este geacutenero estaacuten en continuo cambio entre endoacutefitos y patoacutegenos

funcionando en la mayoriacutea de los casos en una relacioacuten mutualista en donde le brindan a la planta

mayor tolerancia a las sequias proteccioacuten de patoacutegenos y pestes caracteriacutestica uacutetil frente a los

retos ecoloacutegicos que plantea el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales (Hubbard et al 2014)

se conocen cerca de 800 especies de este geacutenero asociadas a una amplia gama de plantas

vasculares a nivel mundial (Rossman et al 2015)

Esto explica porque las especies de Diaporthe fueron una de las maacutes numerosas

encontradas en la especie de alta montantildea E hartwegiana teniendo en cuenta que esta especie

pasa raacutepidamente de un estado endoacutefito a un estado patogeacutenico y dada su faacutecil y alta distribucioacuten

representa un peligro en conjunto con el cambio climaacutetico para las especies de alta montantildea como

los frailejones y supone una amenaza para el balance hiacutedrico y ecosistemico en el futuro

El geacutenero Crassiparies de la familia Neohendersoniaceae y el geacutenero Massarina de la

familia Massarinaceae pertenecen al orden Pleosporales aunque se discute debido a las

similaridades morfoloacutegicas y genoacutemicas con Massarina si Crassiparies deberiacutea estar en la

familia Massarinaceae (Hyde et al 2013 4) Se tiene poca informacioacuten sobre la especie

Crassiparies quadrisporus por ende este puede ser uno de los primeros reportes de esta especie

en una especie de alta montantildea como lo es el frailejoacuten especiacuteficamente en la especie E

hartwegiana en un marco de cambio climaacutetico el geacutenero Crassiparies necesita mayores estudios

a nivel ecoloacutegico y microbioloacutegico para entender su papel dentro de esta crisis climaacutetica

Mientras tanto el geacutenero Massarina ha logrado ser aislado de agua dulce con el fin de

obtener fuentes de productos naturales bioloacutegicamente activos por medio de las investigaciones

quiacutemicas de Shearer (1999 2001) en una especie de Massarina obtuvieron como resultado el

aislamiento de tres nuevos sequiterpenoides y dos lactonas derivadas de policeacutetidos con nuevos

sistemas de anillos lo que indica que esta especie tambieacuten puede tener un rol importante

mediante la produccioacuten de enzimas y metabolitos secundarios en el marco de las invasiones

bioloacutegicas impulsadas por el cambio climaacutetico

54

El geacutenero Cryptocoryneum de la familia Cryptocoryneaceae existe poca informacioacuten de

sus mecanismos de accioacuten como endoacutefito o patoacutegeno maacutes aun en especies de los Andes

Tropicales este podriacutea ser uno de los primeros reportes sobre esta especie de hongo en una

especie de frailejoacuten especiacuteficamente E hartwegiana en el 2015 se reportoacute en Brasil el

descubrimiento de una nueva especie del genero Cryptocoryneum trataacutendose de Cryptocoryneum

parvulum hallada en las hojas de la especie Araucaria angustifolia (Gimnosperma) (Silva et al

2015 1) la informacioacuten sobre el geacutenero Cryptocoryneum en relacioacuten al cambio climaacutetico y sus

efectos dentro de especies de alta montantildea como el frailejoacuten auacuten son poco conocidas

Uno de los geacuteneros maacutes cercanos a los grupos externos del cladograma es Cyphellophora

perteneciente a la familia Cyphellophoraceae el cual posee un MPML de 10091 logrando una

hipoacutetesis evolutiva confiable Diversas especies de Cyphellophora han logrado ser aisladas de

infecciones superficiales de la piel o las untildeas en humanos y de materiales vegetales (Decock et

al 2003 Cheewangkoon et al 2009) Esto indica su amplia distribucioacuten y su capacidad para ser

patogeacutenica tanto en plantas como en animales maacutes aun en condiciones desfavorables para la

planta como son las condiciones de cambio climaacutetico

De la especie Cyphellophora reptans se tiene reporte que su morfologiacutea es muy similar a

la de una levadura por lo que es faacutecilmente confundida con una (Reacuteblovaacute et al 2013) Es posible

que este sea el uacutenico reporte de Cyphellophora reptans en las hojas de un frailejoacuten o especie de

alta montantildea que habite en los troacutepicos como E hartwegiana debido a ello sus mecanismos de

accioacuten en especies de paramo dentro de un marco de cambio climaacutetico es poco conocido Se

necesitan mayores estudios enfocados en esta especie para entender su ecologiacutea y dinamismo

ecoloacutegico respecto a los cambios en las variables ambientales

Se eligieron las especies Coprinellus domesticus y Coprinellus xanthothrix como grupos

externos con el fin de enraizar el aacuterbol debido a que pertenecen a la Divisioacuten Basidiomycota la

cual difiere en grado de la divisioacuten Ascomycota aunque conserva semejanzas conocidos como

caracteres ancestrales o plesiomorficos que avanzan a medida la filogenia se construye con los

datos de las diferentes secuencias de especies evidenciando novedades evolutivas conocidas

como apomorfias que cuando se dan en un grupo en particular pasan a ser sinapomorfias es decir

novedades evolutivas dentro de un grupo particular (Lehtonen 2020) Se optoacute por enraizar con

55

estas dos especies con el objetivo de dar robustez al aacuterbol filogeneacutetico (Barriel y 1998) lo cual se

consiguioacute como se nota en los estadiacutesticos del aacuterbol filogeneacutetico

56

57

Conclusiones

Se rechaza la hipoacutetesis nula (H0) y se concluye que la identificacioacuten y caracterizacioacuten

molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo Colombia es diferente en 80 de sus geacuteneros y

especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos realizadas en especies de frailejoacuten

Por lo tanto los nuevos geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos encontrados en el frailejoacuten

plantean nuevos desafiacuteos respecto al cambio climaacutetico ya que tienen un rol vital en la

supervivencia de estas especies de alta montantildea como los frailejones debido a su relacioacuten

mutualista o patoacutegena maacutes aun en los paacuteramos que son altamente sensibles a los efectos del

cambio climaacutetico incluso tan sensibles como las zonas polares (Bradley et al 2006)

La mayoriacutea de especies encontradas en el presente estudio tienen potencial para ayudar a

combatir el estreacutes abioacutetico producido por el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales

Especiacuteficamente pueden ayudar a combatir el estreacutes bioacutetico producido por virus hongos

bacterias e insectos en un marco de cambio climaacutetico aumentos de temperatura cambios en la

concentracioacuten de CO2 cambios en la precipitacioacuten migraciones tempranas cambios en la

nubosidad disponibilidad hiacutedrica alteraciones en la estructura y composicioacuten de las especies

endeacutemicas del paacuteramo

58

59

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Anexos

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombia

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia

hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

74

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

Coordenadas Geograacuteficas

(Latitud)

De la Colecta del

Material Bioloacutegico total de 15

muestras (Longitud)

LAT N 4deg 37 5871717 LONG W 75deg 25

3292611

LAT N 4deg 37 5885220 LONG W 75deg 25

3271217

LAT N 4deg 37 5884485 LONG W 75deg 25

3312103

LAT N 4deg 36 5995487 LONG W 75deg 27

3045854

LAT N 4deg 37 6195784 LONG W 75deg 30

3292611

LAT N 4deg 40 159171 LONG W 75deg 26

380142

LAT N 4deg 40 363762 LONG W 75deg 26

209072

LAT N 4deg 40 399832 LONG W 75deg 27

173554

LAT N 4deg 40 383965 LONG W 75deg 27

464325

LAT N 4deg 39 486438 LONG W 75deg 27

173559

LAT N 4deg 40 56894 LONG W 75deg 26

568287

LAT N 4deg 40 159174 LONG W 75deg 27

190654

LAT N 4deg 40 125083 LONG W 75deg 26

345912

LAT N 4deg 40 116691 LONG W 75deg 27

208264

LAT N 4deg 40 314698 LONG W 75deg 27

140791

75

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un estereoscopio con el propoacutesito de seleccionar la

maacutes indicada y luego sembrar un cultivo puro a partir de ese micelio

76

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados las

copias se conservaron con glicerol a -80degC en un ultra congelador de Thermo Scientifictrade

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas

y enviadas

77

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicos de forma segura y esteacuteril propiedad de la Universidad del Quindiacuteo

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a la Universidad Ruhr de Bochum (Alemania)

78

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de parsimonia

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X en donde se

observa en amarillo la secuencia umlTCATTAuml la cual es una secuencia altamente conservada

que se usa para marcar el inicio de la misma en hongos endoacutefitos

79

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa JmoldelTest usados para generar el

aacuterbol de relaciones filogeneacuteticas a partir de la regioacuten ITS de los hongos endoacutefitos aislados

total de modelos evaluados 88

ID Nombre Particioacuten lnL P AIC detaAIC Peso Cumpeso Udelta

1 JC 0 100820157 138 204400314 1341348 0 1 -

2 JC+I 0 98912511 139 200605022 9618188 0 1 -

3 JC+G 0 95470113 139 193720225 2733392 0 1 -

4 JC+I+G 0 95467507 140 193735014 274818 0 1 -

5 F81 0 100658095 141 204136189 13149356 0 1 -

6 F81+I 0 98761481 142 200362962 9376128 0 1 -

7 F81+G 0 95314814 142 193469628 2482794 0 1 -

8 F81+I+G 0 95324364 143 193508729 2521895 0 1 -

9 K80 10010 99734495 139 20224899 11262157 0 1 -

10 K80+I 10010 97835191 140 198470382 7483549 0 1 -

11 K80+G 10010 94227821 140 191255643 268809 0 1 -

12 K80+I+G 10010 94209963 141 191239926 253092 0 1 -

13 HKY 10010 99648091 142 202136181 11149348 0 1 -

14 HKY+I 10010 97761512 143 198383024 7396191 0 1 -

15 HKY+G 10010 94170799 143 191201599 214765 0 1 -

16 HKY+I+G 10010 94118678 144 191117357 130523 600E-04 0999 -

17 TrNef 10020 99564653 140 201929306 10942472 0 1 -

18 TrNef+I 10020 97712623 141 198245245 7258412 0 1 -

19 TrNef+G 10020 94150977 141 191121955 135121 400E-04 09994 -

20 TrNef+I+G 10020 94132131 142 191104263 117429 00011 09959 -

21 TrN 10020 99563809 143 201987618 11000784 0 1 -

22 TrN+I 10020 97702964 144 198285929 7299095 0 1 -

23 TrN+G 10020 94094235 144 191068469 81635 00065 09719 -

24 TrN+I+G 10020 94101378 145 191102757 115923 00012 09948 -

25 TPM1 12210 99713879 140 202227759 11240925 0 1 -

26 TPM1+I 12210 97826641 141 198473282 7486449 0 1 -

27 TPM1+G 12210 94249837 141 191319674 33284 0 1 -

28 TPM1+I+G 12210 942022 142 1912444 257566 0 1 -

29 TPM1uf 12210 99663473 143 202186945 11200112 0 1 -

30 TPM1uf+I 12210 97879458 144 198638917 7652083 0 1 -

31 TPM1uf+G 12210 94137349 144 191154699 167865 100E-04 09999 -

32 TPM1uf+I+G 12210 94141897 145 191183794 196961 0 1 -

80

33 TPM2 10212 99722544 140 202245087 11258254 0 1 -

34 TPM2+I 10212 97828213 141 198476426 7489592 0 1 -

35 TPM2+G 10212 94185859 141 191191718 204885 0 1 -

36 TPM2+I+G 10212 94153667 142 191147335 160501 100E-04 09998 -

37 TPM2uf 10212 99648091 143 202156182 11169348 0 1 -

38 TPM2uf+I 10212 97757018 144 198394035 7407202 0 1 -

39 TPM2uf+G 10212 941052 144 1910904 103566 00022 09904 -

40 TPM2uf+I+G 10212 9408801 145 19107602 89187 00044 0982 -

41 TPM3 12012 99768005 140 20233601 11349176 0 1 -

42 TPM3+I 12012 97958099 141 198736198 7749364 0 1 -

43 TPM3+G 12012 94227963 141 191275926 289093 0 1 -

44 TPM3+I+G 12012 94323885 142 191487769 500936 0 1 -

45 TPM3uf 12012 99625421 143 202110843 11124009 0 1 -

46 TPM3uf+I 12012 97770469 144 198420939 7434105 0 1 -

47 TPM3uf+G 12012 94165576 144 191211152 224319 0 1 -

48 TPM3uf+I+G 12012 94150861 145 191201721 214888 0 1 -

49 TIM1ef 12230 99592239 141 202004478 11017644 0 1 -

50 TIM1ef+I 12230 97822787 142 198485574 749874 0 1 -

51 TIM1ef+G 12230 94121043 142 191082087 95253 00033 09853 -

52 TIM1ef+I+G 12230 94122386 143 191104772 117939 00011 09969 -

53 TIM1 12230 99518653 144 201917306 10930473 0 1 -

54 TIM1+I 12230 9781156 145 19852312 7536286 0 1 -

55 TIM1+G 12230 94105198 145 191110396 123562 800E-04 09977 -

56 TIM1+I+G 12230 94087158 146 191094317 107483 00018 09922 -

57 TIM2ef 10232 99550617 141 201921233 109344 0 1 -

58 TIM2ef+I 10232 97704602 142 198249204 726237 0 1 -

59 TIM2ef+G 10232 94093484 142 191026968 40135 00516 0852 -

60 TIM2ef+I+G 10232 94073864 143 191007729 20895 0135 07169 -

61 TIM2 10232 99530022 144 201940044 1095321 0 1 -

62 TIM2+I 10232 97820158 145 198540315 7553482 0 1 -

63 TIM2+G 10232 94058678 145 191017356 30523 00834 08004 -

64 TIM2+I+G 10232 94060837 146 191041674 54841 00247 09248 -

65 TIM3ef 12032 99546286 141 201912572 10925739 0 1 -

66 TIM3ef+I 12032 97713931 142 198267862 7281028 0 1 -

67 TIM3ef+G 12032 94129376 142 191098753 111919 00014 09936 -

68 TIM3ef+I+G 12032 94112005 143 191084009 97176 0003 09883 -

69 TIM3 12032 99514376 144 201908751 10921918 0 1 -

70 TIM3+I 12032 97700023 145 198300047 7313213 0 1 -

71 TIM3+G 12032 94115323 145 191130646 143812 300E-04 09997 -

72 TIM3+I+G 12032 94096941 146 191113882 127048 700E-04 09984 -

73 TVMef 12314 9970418 142 20224836 11261526 0 1 -

74 TVMef+I 12314 97940598 143 198741196 7754363 0 1 -

81

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE (AIC)

75 TVMef+G 12314 94159829 143 191179657 192824 0 09999 -

76 TVMef+I+G 12314 94160993 144 191201987 215153 0 1 -

77 TVM 12314 99615991 145 202131982 11145148 0 1 -

78 TVM+I 12314 97746676 146 198413353 7426519 0 1 -

79 TVM+G 12314 94075503 146 191071005 84171 00057 09776 -

80 TVM+I+G 12314 94052588 147 191045176 58342 00208 09456 -

81 SYM 12345 99543166 143 201946331 10959498 0 1 -

82 SYM+I 12345 97757103 144 198394207 7407373 0 1 -

83 SYM+G 12345 94083056 144 191046112 59278 00198 09654 -

84 SYM+I+G 12345 94050035 145 19100007 13236 0198 05819 -

85 GTR 12345 99529525 146 20197905 10992217 0 1 -

86 GTR+I 12345 97686178 147 198312356 7325522 0 1 -

87 GTR+G 12345 94044194 147 191028387 41553 00481 09001 -

88 GTR+I+G 12345 94013417 148 190986834 0 03839 03839 -

12

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphellip 73

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia 73

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombiahelliphelliphelliphellip74

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana 75

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un

estereoscopio 75

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 76

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas y

enviadas 76

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 75

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a Alemania a la Universidad Ruhr de

Bochum 77

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de

parsimoniahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 78

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X 78

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa

JmoldelTest 79

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE

(AIC) 81

13

Figuras mapas y tablas

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo

Colombiahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras

N necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefitohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y

abioacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en

medio de cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelialhelliphelliphellip 30

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la

teacutecnica de corte de hifa uacutenica helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de

cultivo Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12)

aislados de las hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana 31-32

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 10 Filograma obtenido a partir del anaacutelisis ML y MP del conjunto de datos ITS Aislados

de las hojas de frailejoacuten37

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip43

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e

Hypocreahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip46

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon48

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon

Biscogniauxia Nemania y Humiacutecolahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

14

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies

Massarina Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona

muestreadahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia 29-30

Tabla 2 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos

endoacutefitos en la especie Espeletia hartwegiana

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36

Tabla 3 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = presencia del genero

de hongo dentro de la especie de frailejoacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42-43

15

Introduccioacuten

Hay un libro abierto siempre para

todos los ojos la naturaleza

(Jean-Jacques Rousseau 1712-1778)

El cambio climaacutetico corresponde a un fenoacutemeno que afecta el planeta de manera natural

permitiendo mantener las condiciones climaacuteticas como la temperatura la precipitacioacuten entre

otras en un rango aceptable para la vida (Jimeacutenez 2010) Sin embargo dado el aumento de las

emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) principalmente asociado a las actividades

humanas y el alto consumo de combustibles foacutesiles los cambios en dichas condiciones han sido

alterados dando paso a un acelerado aumento de temperatura anual en las uacuteltimas deacutecadas con

precipitaciones y sequias maacutes frecuentes e intensas (IPCC 2020 5 Jimeacutenez 2010)

Acorde con el Panel Intergubernamental de Expertos en Cambio Climaacutetico (IPCC) para

fin de siglo el Cambio Climaacutetico se acrecentaraacute pronosticando un aumento de temperatura de 25

a 45 degC para el antildeo 2100 que tan solo para Colombia en los uacuteltimos 30 antildeos fue de 08degC

generando impactos notorios en las zonas de alta montantildea como los paacuteramos (Moreno y Palma

2016)

El cambio climaacutetico es un fenoacutemeno cuyos efectos alcanzaraacuten los paacuteramos los cuales son

ecosistemas de alta montantildea presente en elevaciones entre 3100 y 4700 m ubicados en el norte de

los Andes de Ameacuterica del Sur y el sur de Ameacuterica Central adyacente (Berdugo et al 2016) Estas

aacutereas se caracterizan por una vegetacioacuten principalmente endeacutemica compuesta por frailejones

matorrales y pastos (veacutease figura 1) (Garciacutea et al 2010)

Los ecosistemas de alta montantildea como los paacuteramos ofrecen diversos servicios

ambientales como la biodiversidad uacutenica que albergan los paisajes los suelos y su capacidad de

retener y almacenar agua (Morales et al 2019) Las formaciones vegetales juegan un papel

diferenciado en el mantenimiento de la humedad y las fuentes de agua en el ecosistema

presentando la capacidad de interceptar almacenar y regular los flujos hiacutedricos superficiales y

16

subterraacuteneos aportando los servicios de abastecimiento de agua para el 70 de la poblacioacuten de

Colombia (Vaacutesquez y Buitrago 2017)

Ademaacutes dada la caracteriacutestica de permanente humedad de su suelo la materia orgaacutenica

se descompone a menor velocidad logrando un efecto de retencioacuten y almacenamiento de carbono

(Anderson et al 2012) En Colombia se han realizado diferentes estudios sobre la distribucioacuten y

extensioacuten del ecosistema paramuno Rangel (2002 4) determinoacute que los paacuteramos colombianos

abarcaban aproximadamente el 26 de la superficie del paiacutes

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramos por Pedraza-Pentildealosa Betancur y Franco-Rosselli (2005)

En particular el paacuteramo Romerales se encuentra dentro del territorio adscrito a los

Parques Nacionales Naturales (PNN) especiacuteficamente el PNN de los Nevados en la cordillera

central colombiana hacia la zona norte del Departamento del Quindiacuteo con liacutemites fronterizos

entre los departamentos de Risaralda y Tolima Este paacuteramo es el hogar del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana el cual estaacute afrontando los efectos del cambio climaacutetico (veacutease mapa 1)

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona muestreada

17

Existe evidencia cientiacutefica concreta del aumento de temperatura en los Andes Tropicales

tambieacuten cambios significativos en los patrones de precipitacioacuten sumado a la disminucioacuten en la

incidencia del clima nublado lo que conduce a las plantas a mayor cantidad de horas expuestas a

la radiacioacuten solar (Ruiz et al 2009) Otro efecto grave que trae consigo el cambio climaacutetico es el

desplazamiento de especies en el gradiente altitudinal Con un aumento de 3degC se espera que las

especies se muevan ~600 m en buacutesqueda de su optimo teacutermico esto afectariacutea gravemente las

especies de paacuteramo como los frailejones Cuesta Camacho (2007)

Los frailejones son emblemaacuteticas plantas de paacuteramo y ecosistemas de alta montantildea

(MINAMBIENTE 2019) Pertenecen a la familia Asteraceae contiene cerca de 142 especies

agrupadas en ocho geacuteneros Carramboa Coespeletia Espeletia Espeletiopsis Libanothamnus

Paramiflos Ruilopezia y Tamania de estos los maacutes importantes y con mayor diversidad de

especies son Espeletia Espeletiopsis y Libanothamnus (Rivera y Torres 2001)

Poseen adaptaciones que les permite captar y retener grandes cantidades de agua de su

entorno permitiendo un balance ecosistemico (Farias 2013) La morfologiacutea singular del genero

Espeletia le permite acumular las hojas antiguas en forma de ldquoabrigordquo brindando proteccioacuten

contra las bajas temperaturas nocturnas de hasta 0degC Los fuertes vientos y la radiacioacuten solar los

cuales seraacuten cada vez maacutes intensos y frecuentes por causa del cambio climaacutetico (Cortes y

Sarmiento 2013 34) (veacutease figura 2)

Estas plantas son especies claves para la conservacioacuten de los paacuteramos y la lucha contra el

cambio climaacutetico debido a que ofrecen una gran variedad de servicios ecosisteacutemicos (Diacuteaz et al

2007) El paacuteramo es referente sin igual de fuente hiacutedrica ciudades como Bogotaacute y Quito obtienen

aproximadamente el 80 de su agua dulce de los paacuteramos (Buytaert et al 2006) Los frailejones

en su mayoriacutea endeacutemicos se han visto afectados por actividades humanas como la ganaderiacutea

extensiva agricultura (cultivos de papa y cebolla) mineriacutea de oro y carboacuten turismo no

controlado y quemas intencionales (Hofstede 2000) Esta situacioacuten podriacutea comprometer a

mediano y largo plazo la funcioacuten de captacioacuten regulacioacuten y suministro del agua para el consumo

18

en las ciudades colombianas ubicadas en las regiones de influencia de estos ecosistemas (Varela

2015)

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

No obstante en asociacioacuten con especies como el frailejoacuten de los Andes Tropicales

encontramos a los hongos cuyos roles en las interacciones bioloacutegicas son de vital importancia

Los hongos pueden ser endoacutefitos simbiontes mutualistas paraacutesitos y comensales y son capaces

de responder a las amenazas que plantea el cambio climaacutetico en cuanto a perturbaciones

ambientales aumento de temperatura y estreacutes hiacutedrico adaptaacutendose a la disponibilidad de recursos

modificando sus actividades enzimaacuteticas e incluso su genoma a lo largo del tiempo (Moreno et

al 2013)

Los hongos son clasificados seguacuten su forma de reproduccioacuten sea sexual o asexual en

donde se observan las diferencias estructurales internas entre los diferentes grupos tales como

sus esporas e hifas como lo indican Blackwell y Spatafora (2004) estos organismos estaacuten

divididos en cuatro grandes grupos los cuales son Ascomycota Basidiomycota

Chytridiomycota Zygomycota es justo en el grupo de los Ascomycota donde se encuentra gran

diversidad de hongos conocidos como ldquohongos endoacutefitosrdquo en donde su nombre ldquoendoacutefitordquo

significa ldquodentro de la plantardquo (endon dentro phyton planta)

19

Estos microorganismos fuacutengicos tienen la facilidad de pasar gran parte o todo su ciclo de

vida invadiendo los tejidos de su hospedero (planta) sin tener un efecto negativo evidente

(Leacuteveilleacute 1846 3 de Bary 1866 8) Por lo tanto el concepto de endoacutefito indica una asociacioacuten de

costo-beneficio pero de una forma mutualista entre el hongo y la planta hospedera permitiendo

la estadiacutea en sus tejidos vivos (Clay 1998 8) Los hongos endoacutefitos se han encontrado en todas

las plantas (algas musgos pastos plantas y vasculares) desde los bosques templados hasta los

bosques tropicales hallaacutendose una gran diversidad de plantas y en asociacioacuten gran diversidad de

hongos endoacutefitos (Saacutenchez et al 2010)

Se espera que los hongos endoacutefitos jueguen un papel cada vez maacutes importante potenciado

por el cambio climaacutetico en las enfermedades producidas en plantas como pudricioacuten radicular

mal blanco entre otras con los aumentos pronosticados de la temperatura y el estreacutes por sequiacutea

asociados al cambio climaacutetico (Desprez-Loustau et al 2006 Slippers y Wingfield 2007 6) Los

cambios en la cantidad de dioacutexido de carbono (CO2) y la disponibilidad de nitroacutegeno en el suelo

afectan de forma similar tanto a las plantas como a los hongos por ende las alteraciones

generadas por parte del cambio climaacutetico pueden causar desbalances en sus relaciones (Ies et al

2013)

Algunos estudios realizados en el antildeo 1898 donde se registraron los primeros hongos

endoacutefitos como el de Bary (1866) brindo la iniciativa de investigaciones que lograron explicar

los cuadros toxicoloacutegicos observados en animales los cuales se daban por el consumo de

semillas o en aacutereas de pastos (Poaceae) que posiblemente albergaban hongos Clavicipitaacuteceos

(familia del ergot) los cuales poseiacutean actividades enzimaacuteticas con micotoxinas

Por diversas situaciones no trascendioacute la investigacioacuten hasta que Bacon (1977) hizo

relacioacuten del hongo endoacutefito Neotyphodium coenophialum debido a una intoxicacioacuten del ganado

llamado ldquosiacutendrome de veranordquo cuando estos animales consumiacutean pastos de la especie Festuca

arundinacea (Poaceae) Funk en el antildeo 80 caracterizoacute la resistencia de las Poaceae que

albergaban hongos endoacutefitos que frecuentemente eran atacados por insectos (proteccioacuten contra

herbiacutevoros) (Saacutenchez et al 2010)

Compant y colaboradores (2010) mencionaron que tras experimentar en el laboratorio

con una gama de temperaturas en los hongos endoacutefitos aislados obtuvieron resultados variables

respecto al crecimiento es decir positivos y neutrales llegando a la conclusioacuten de que los

microorganismos asociados a las plantas son un factor importante que influye en la respuesta de

20

las plantas acorde a los cambios de temperatura lo que compromete las respuestas del frailejoacuten y

los hongos endoacutefitos frente al calentamiento global causado por el cambio climaacutetico

Con relacioacuten a los estudios realizados sobre hongos endoacutefitos en frailejones se han

encontrado al menos 100 especies con capacidades de inhibir hongos fitopatoacutegenos o herbivoriacutea

(Cabezas et al 2012)

Los geacuteneros de hongos endoacutefitos encontrados en anteriores estudios son Acremonium

Aspergillus Aureobasidium Colletotrichum Fusarium Gliocadium Nigrospora Paecilomyces

Penicillium Trichothecium Trichoderma y Sordaria (Pineda 2000 Programa Nacional para la

Evaluacioacuten del Estado y Afectacioacuten de los Frailejones en los Paacuteramos de Andes del Norte 2009)

Teniendo en cuenta que para Colombia hay poca informacioacuten sobre hongos endoacutefitos en

ecosistemas paramunos se hace fundamental la ampliacioacuten de maacutes informacioacuten referente al tema

debido a que solo existen estudios significativos en cafeacute leguminosas y rosas los cuales maacutes allaacute

de la identificacioacuten de geacuteneros de hongos endoacutefitos no incluyen el cambio climaacutetico y sus

posibles consecuencias (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016) En

teacuterminos filogeneacuteticos los hongos son el reino de la naturaleza maacutes cercano a los animales

(Hibbett et al 2018)

Las relaciones que posean las diferentes especies de endoacutefitos dentro de la especie de

frailejoacuten es de importancia conocerla mediante el uso de la filogenia molecular (Judd et al 2007)

mediante secuencias de ADN ARN o proteiacutenas (Cooke et al 2000) Dependiendo de la presencia

de especies agresivas de endoacutefitos como Nigrospora se puede tener un mejor conocimiento

sobre las consecuencias que trae consigo los impactos del cambio climaacutetico sobre estas plantas de

los Andes Tropicales (Foden et al 2009)

21

Capiacutetulo primero

Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitos

1 Antecedentes

Desde los estudios realizados por Leacuteveilleacute (1846) y Bary (1866) sobre hongos Endoacutefitos

en pastos de zonas templadas se ha logrado identificar que estos hongos son capaces de inducir

respuestas adaptativas a sus hospederos (Micotoxinas contra herbiacutevora adaptacioacuten a heladas o

climas extremos fijacioacuten de nutrientes) a cambio de alimento y hospedaje formando una relacioacuten

mutualista en la cual las dos especies involucradas son beneficiadas No obstante se ha reportado

que los hongos endoacutefitos ademaacutes de tener relaciones mutualistas con diferentes especies

vegetales se pueden tornar en especies patoacutegenas para su hospedero una vez la planta se

encuentra en condiciones desventajosas tornaacutendose asiacute el hongo endoacutefito en un hongo

fitopatoacutegeno (Herrera y Ulloa 1990 550)

Como se mencionoacute anteriormente los hongos endoacutefitos pueden pasar de un estado

mutualista a un estado de patogeacutenesis dada esta relacioacuten entre ambos organismos se producen

metabolitos secundarios potencialmente toacutexicos facilitando factores de virulencia dados por el

hongo endoacutefito como exoenzimas y metabolitos fitotoacutexicos a su vez la planta presenta defensas

tanto mecaacutenicas como bioquiacutemicas (Saacutenchez et al 2013 5)

Hasta la fecha los principales estudios de hongos endoacutefitos se han fijado en especies de

intereacutes econoacutemico y comercial tales como palma de aceite cafeacute leguminosas pastos de forrajeoacute

y diferentes tipos de rosas (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016)

Las especies modelo para el estudio de los hongos endoacutefitos han sido las gramiacuteneas

forrajeras en donde se han reportado especies de endoacutefitos asociados a los geacuteneros Lolium

Festuca y Brachiaria (Siegel et al 1987) no obstante Otero y Bayman (2009) han reportado un

creciente nuacutemero de estudios en orquiacutedeas epifitas tropicales relaciones con hongos micorrizicos

22

Actualmente existen escasos reportes de hongos endoacutefitos asociados a ecosistemas con

climas extremos (temperaturas extremas) como aacuterticos desiertos paacuteramos y zonas alpinas

especialmente para zonas de temperaturas friacuteas como lo son los paacuteramos (Lopera et al 2008

Leung et al 2011 Cabezas et al 2012 Miles et al 2012 Zhang y Yao 2015)

Investigadores como Lopera Leung y colaboradores (2011) han llegado a la conclusioacuten

de que los hongos endoacutefitos juegan un papel importante en las plantas a la hora de adaptarse a

ecosistemas de clima templado (Kivlin et al 2013 Zhang y Yao 2015)

En Colombia los trabajos con hongos endoacutefitos son pocos por ende trabajos como el de

Lopera y colaboradores (2008) con especies del genero Espeletia de los paacuteramos Colombianos

son pioneros ademaacutes del trabajo de Cabezas y colaboradores (2012 4) en el cual aislaron y

caracterizaron celulasas (enzimas descomponedores de la celulosa) extraiacutedas de hongos endoacutefitos

que se hallaban en especies de Espeletia posteriormente Lopera y Miles (2012) unieron

esfuerzos para continuar caracterizando la diversidad de hongos endoacutefitos en los paacuteramos andinos

colombianos enfocados en Espeletia con el objetivo de encontrar especies con potencial

biocontrolador

Existen trabajos tesis en los repositorios de diversas universidades de los antildeos 2014 y

2015 en los cuales se aborda el tema de los hongos endoacutefitos paacuteramos y especies de Espeletia

(frailejones) y de la familia Poaceae en donde se caracterizan las diversas especies de hongos

endoacutefitos por medio taxonomiacutea y biologiacutea molecular ademaacutes de buscar metabolitos secundarios

con fines medicinales o de biocontrol

Los trabajos en filogenia molecular de hongos endoacutefitos realizados en frailejones se han

visto enfocados maacutes hacia la buacutesqueda de la diversidad funcional en comunidades

microbioloacutegicas como por ejemplo el estudio realizado por Ruiz y colaboradores (2015) en

donde buscaron mediante el anaacutelisis molecular de raiacuteces necromasa hojas maduras y joacutevenes de

diferentes especies de Espeletia (veacutease figura 3) ubicada en los Andes neotroacutepicales

colombianos secuencias geneacuteticas de las regiones V5-V6 de la unidad 16S del rARN

23

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras N

necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefito Tomado de Ruiz y colaboradores (2015)

Este estudio analizoacute la composicioacuten de comunidades microbioanas y su diversidad

funcional en un ecosistema de alta montantildea en donde las temperaturas los rayos UV y la altura

juegan papeles determinantes como filtros ecoloacutegicos severos en donde solo pueden existir

especies que han desarrollado capacidades para adaptarse sobrevivir y colonizar dichas aacutereas

por ende cuando se analizaron las comunidades existentes dentro de estas especies de Espeletia

Encontraron que algunas especies halladas podriacutean tener roles importantes como

productores de metabolitos secundarios enzimas o incluso como bioremediadores y que las

comunidades microbianas eran diferentes tanto en sus hojas como en sus raiacuteces y en la

necromasa

A medida que las deacutecadas avanzan y la evidencia sobre el cambio climaacutetico se hace maacutes

robusta y evidente los estudios en los hongos endoacutefitos han tomado vital importancia al estar

asociados con cultivos de especies comestibles escases de agua y de tierras productivas sumado

a los efectos negativos que trae consigo el cambio climaacutetico para las diferentes plantaciones y

cosechas a nivel global

Es por eso que Lu Yan y colaboradores (2019) analizaron los efectos positivos que teniacutean

la colonizacioacuten de hongos endoacutefitos en las plantas en donde ratificaron que los hongos endoacutefitos

dentro la planta generan metabolitos antimicrobianos estimulan las respuestas inmunoloacutegicas y

compiten por espacio dentro de la planta con diferentes patoacutegenos incrementando asiacute la

resistencia contra herbiacutevoros y la resistencia al estreacutes salino (factores bioacuteticos)

Ademaacutes de ayudar a la planta contra el estreacutes abioacutetico causado principalmente por

factores climaacuteticos como la falta de agua (estreacutes hiacutedrico) las temperaturas extremas la

intensidad de los rayos UV y los metales pesados como la muestra la figura 4 debido a esto se

24

concluyoacute que las fitohormonas cumplen un papel importante en la colonizacioacuten de hongos

endoacutefitos dentro de la planta

Aun que se ha reportado que los hongos endoacutefitos se pueden usar como biocontroladores

diferentes estudios reportan que el uso de hongos endoacutefitos puede tener efectos adversos como

un retraso significativo en el crecimiento de la planta con el uso de la especie Cryptosporiopsis

sp (Terhonen et al 2016) Otro reporte indica la fecundidad y supervivencia de enemigos

naturales como paraacutesitos esto es debido a que los hongos endoacutefitos transfieren sus toxinas y

alcaloides cuando son ingeridos por paraacutesitos u otros enemigos naturales de las plantas (Lopez y

Sword 2015)

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y abioacutetico

Bajo estreacutes bioacutetico (herbiacutevoros y patoacutegenos) y abioacutetico (sequiacutea salinidad metales pesados y otros) (a) se

inducen respuestas de defensa de las plantas (b) los endoacutefitos producen metabolitos protectores y

modulan la viacutea de las fitohormonas para mejorar la inmunidad de las plantas (c) tomada de Lu yan y

colaboradores (2019 7)

25

2 Justificacioacuten

La presente investigacioacuten pretende identificar y caracterizar que especies de hongos

endoacutefitos estaacuten asociadas al frailejoacuten Espeletia hartwegiana y que posibles implicaciones podriacutea

tener que estas especies se encuentren dentro de esta especie de alta montantildea La importancia de

conocer esta informacioacuten reside en que los hongos endoacutefitos pueden beneficiar o perjudicar a la

adaptacioacuten y resistencia de especies vegetales en los distintos escenarios climaacuteticos propuestos

por la ciencia (IPCC 2020)

El calentamiento global podriacutea afectar el equilibrio de los hongos endoacutefitos en especies

vegetales generando desbalances en la planta o la peacuterdida de especies endoacutefitas de importancia

biotecnoloacutegica Por ejemplo se podriacutean perder especies endoacutefitas con potencial para control

bioloacutegico de plagas y enfermedades de plantas como productores de enzimas y metabolitos

secundarios degradacioacuten de plaacutesticos o biorremediacioacuten entre otros (Schulz et al 2002) Por

ello se hace fundamental estudiar los hongos endoacutefitos en ecosistemas de paacuteramo ya que en

Colombia y en los paacuteramos en general han sido poco estudiados y su efecto sobre las plantas de

alta montantildea podriacutea ser clave en el mantenimiento de sus poblaciones

26

3 Hipoacutetesis

H1 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute diferente en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo diferentes los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten tambieacuten seria

modificada

H0 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute similar en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo similares los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten continuariacutean

como se ha registrado con anterioridad

27

4 Objetivos

41 Objetivo general

Caracterizar la diversidad de hongos endoacutefitos presentes en los frailejones

de la especie Espeletia hartwegiana en el paacuteramo de Romerales tomando en cuenta su

relacioacuten con el cambio climaacutetico

42 Objetivos especiacuteficos

Identificar los hongos endoacutefitos asociados en Espeletia hartwegiana del

paacuteramo de Romerales

Hallar relaciones filogeneacuteticas entre las diferentes especies de hongos

Endoacutefitos encontradas en Espeletia hartwegiana

Advertir las repercusiones del cambio climaacutetico sobre Espeletia

hartwegiana en base a su diversidad de hongos endoacutefitos

28

29

Capiacutetulo segundo

Materiales Meacutetodos y Resultados

1 Aacuterea de Estudio

El trabajo se realizoacute en el paacuteramo de Romerales ubicado en la zona alta del municipio de

Salento Quindiacuteo (4deg39202N 75deg25506W) con una extensioacuten aproximada de 6794 ha (Cano

et al 2015)

2 Colecta de material bioloacutegico

La colecta del material bioloacutegico se realizoacute mediante muestreos aleatorios lo largo del

paacuteramo tomando coordenadas de cada punto de colecta (veacutease anexo 3) las hojas se colectaron

por medio de tijeras podadoras siendo empacadas cada una en bolsas Ziploc diferentes se

colectoacute un total de 15 hojas cada una correspondiente a una planta de frailejoacuten para un total de

15 plantas muestreadas de E hartwegiana

Adicionalmente las bolsas Ziploc fueron marcadas con los datos de colecta en campo y

transportadas a los laboratorios del Programa de Biologiacutea de la Universidad del Quindiacuteo para su

procesamiento

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetales

Las muestras obtenidas fueron lavadas con agua para eliminar el exceso de residuos se

cortaron 4 trozos de cada hoja con un tamantildeo aproximado de 05 a 10 cm (veacutease figura 5) luego

cada trozo de hoja se sometioacute a una esterilizacioacuten la cual se completoacute con algunas modificaciones

acorde al procedimiento descrito por (Osorio et al 2017) especiacutefico para el aislamiento de

30

hongos endoacutefitos que consiste en sumergir perioacutedicamente el material vegetal en etanol al 90

durante un minuto seguido de hipoclorito de sodio (NaClO) al 4 por un minuto continuando

con etanol al 70 durante un minuto y por uacuteltimo se lavaraacuten con agua destilada todo dentro de la

campana de flujo

Las cuatro secciones de hoja se transfirieron a una caja de Petri para un total de 15 cajas

de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA) (una caja de Petri por cada 4 cortes de hoja)

Posteriormente las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente (25degC aproximadamente)

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en medio de

cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelial caja de Petri de 20ml de capacidad

Pasadas 3 semanas se revisaron los cultivos fuacutengicos con el fin de revisar el crecimiento

del micelio y hacer un repique a un cultivo puro una vez maduros se procedioacute a utilizar la teacutecnica

de corte de hifa uacutenica (Osorio et al 2017) esta teacutecnica consistioacute en tomar la punta de la hifa con

ayuda de un estereoscopio y un bisturiacute de grado quiruacutergico agua destilada alcohol al 70 y un

mechero para mantener el bisturiacute esterilizado una vez identificada la hifa ideal para cultivar de

forma pura (veacutease figura 6) con el bisturiacute se procedioacute a cortar el agar PDA en forma de cuadro

con una medida aproximada de 3 miliacutemetros cuadrados

31

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la teacutecnica de

corte de hifa uacutenica

Se esperoacute entre 3 a 5 semanas a que crecieran los cultivos puros aislados de las hifas uacutenicas en

nuevas cajas de Petri con agar PDA

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos endoacutefitos)

Los hongos cultivados de forma pura consiguieron un crecimiento micelial significativo a partir

de los 15 diacuteas a temperatura ambiente como lo demuestra la figura 7 que contiene doce de los

cultivos maacutes representativos con su respectivos micelios aeacutereos desarrollados donde variacutean sus

colores formas y consistencias esto indicando que pertenecen a diferentes especies

2

1

3

32

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de cultivo

Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12) aislados de las

hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

5 Extraccioacuten de ADN

4

5

6

7

8

9

10

11

12

33

Una vez el micelio de los hongos se encontraba desarrollado en la cantidad necesaria se

procedioacute a extraer el ADN genoacutemico siguiendo el protocolo de extraccioacuten de Raeder y Broda

(1985) por medio de un barrido superficial del micelio evitando tomar el agar este micelio

posteriormente se colocoacute en tubos Eppendorf esteacuteriles de 2 ml y se pulverizoacute mediante el uso de

un asa microbioloacutegica y 1ml de buffer de extraccioacuten compuesto de Tris-HCL 1 M pH 78 EDTA

05 M Ph 8 SDS 10 wv NaCL y agua destilada para cada tubo a continuacioacuten se agregoacute 800

ul de etanol al 70 500 ul de fenol y se mezcloacute

Se adicionoacute 300 ul de cloroformo y se mezcloacute de nuevo de alliacute se llevoacute a la centrifuga a

10000 rpm por 60 minutos luego de centrifugar se forma un sobrenadante el cual es transferido

en su totalidad a un nuevo tuvo Eppendorf de 15 ml en el cual se agregaron 400 ul de cloroformo

y se llevoacute a la centrifuga a 10000 rpm por 10 minutos en donde nuevamente se forma un

sobrenadante aunque esta vez solo se toman 500 ul del tubo para ser transferidos otro tubo

Eppendorf de 15 ml ya en el nuevo tubo se adicionaron 50 ul de NaAC y se invirtioacute varias veces

para homogenizar la mezcla a continuacioacuten se guardoacute en el refrigerador a 4degC toda la noche

Al diacutea siguiente se tomaron las muestras en los tubos Eppendorf y se centrifugaron a

10000 rpm por 30 minutos (Formacioacuten del Pellet de ADN) cuando la centrifuga terminoacute se

procedioacute a remover el etanol ya sin etanol se agregoacute de nuevo 1 ml de etanol al 70 a cada tubo

y se centrifugoacute a 10000 rpm por 5 minutos en este paso se removioacute el etanol y se dejoacute secar el

pellet de ADN una vez el etanol se evaporoacute se re suspendioacute el pellet en 100 ul de agua grado

molecular o Sabax con 5 ul de RNAsa con el fin de evitar la presencia de moleacuteculas de ARN

posteriormente se incubaron a 37degC por 30 minutos y se guardaron para su envioacute a -20degC

(Raeder y Broda 1985)

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengica

Una vez se secuenciaron las muestras de ADN enviadas a la Universidad Ruhr de

Bochum Alemania se hizo el ensamblaje de las secuencias en contigs y scaffolds en el

programa CLC Main Workbench 8 (Nicola et al 2013) Como lo muestra la figura 8 donde se

muestran los pasos esenciales de una teacutecnica de Metagenoacutemica donde posteriormente se

analizaron con maacutes detalle mediante teacutecnicas filogeneacuteticas

34

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemico Fuente Thomas y colaboradores (2012)

7 Secuenciamiento

Se extrajoacute con eacutexito un total de 35 muestras de hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

Espeletia hartwegiana (veacutease figura 9) que posteriormente fueron secuenciadas por la

Universidad Ruhr de Bochum (Alemania) logrando un total de 70 secuencias incluyendo

aquellas obtenidas en Genk Bank

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de frailejoacuten

Espeletia hartwegiana

35

8 Anaacutelisis Filogeneacutetico

Se aislaron 35 secuencias basadas en la especie Espeletia hartwegiana fueron

comparadas posteriormente con 35 secuencias de especies publicados en GenBank

(httpblastncbinihgovblastcgi) se obtuvo un total de 70 secuencias Las secuencias de

consenso ITS 58S DNA obtenidas se usaron para realizar buacutesquedas BLAST en GenBank

usando BLASTn (Altschul et al 1990) con el fin de identificar mediante las secuencias aisladas

los geacuteneros o las especies maacutes cercanas La matriz de datos fue alineada en MAFFT v7 (Katoh y

Standley 2013) Se utilizaron las especies Coprinellus xanthothrix y Coprinellus domesticus

como grupos externos

Los anaacutelisis de las secuencias para construir los arboles filogeneacuteticos de Maacutexima

Parsimonia (MP) fueron realizados usando PAUP v40b10 (Swofford 2003) Para el anaacutelisis de

Maacutexima Verosimilitud o ML por sus siglas en ingleacutes (Maximum Likelihood) se utilizoacute

JmodelTest (Darriba et al 2012) con el cual se infirieron los criterios del modelo de sustitucioacuten

apropiado utilizando los criterios de informacioacuten de Akaike (AIC) (Akaike 1974)

Los anaacutelisis de ML se realizaron con el programa PhyML v 30 (Guindon y Gascuel

2003) teniendo en cuenta la proporcioacuten de sitios invariables Los valores de soporte de confianza

para los nodos se estimaron mediante 1000 anaacutelisis de arranque de replicacioacuten La alineacioacuten de

los datos de la secuencias de ITS para 70 aislamientos determinoacute quince geacuteneros siendo los

siguientes Annulohypoxylon Biscogniauxia Colletotrichum Crassiparies Cryptocoryneum

Cyphellophora Diaporthe Daldinia Humiacutecola Hypoxylon Hypocrea Nemania Nigrospora

Massarina y Trichoderma de los cuales se obtuvieron 11 clados principales (veacutease figura 10)

Con base en estos resultados todos los aislamientos se analizaron maacutes a fondo dentro de los

geacuteneros hasta llegar a especie (veacutease tabla 1)

36

Geacuteneros Especie Especie Especie Especie Especie Especie Especie

Annulohypoxylon A nitens A bahnphaden

gense

Biscogniauxia B petrensis

Colletotrichum C gloeosporioides

C gigasporum

Cyphellophora C

reptans

Crassiparies C quadrisporus

Cryptocoryneum C

longicondensatum

Daldinia D dennisii D

eschscholtzi

D

conceacutentri

ca

Diaporthe D

longicolla

D

foeniculina

D

anacardi

i

D

macada

miae

Humiacutecola H

fuscoatra

Hypoxylon H

trugodes

H

pulicicidum

Hypocrea H

koningii

Massarina M albocarnis

Nemania N

primolutea

Nigrospora N sacchari N rubi N sphaeric

a

N hainanen

sis

N oryzae

N gorlenko

ana

N aurantia

ca

Trichoderma T trixiae T

olivascens

T

paraviridescens

T

viridescens

T

samuelsii

T viride

Grupo Externo Coprinellus C

domesticus

C

xanthothrix

Tabla 1 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos endoacutefitos en la

especie Espeletia hartwegiana

37

38

Figura 10 Filograma consenso obtenido con el programa MEGA ndashX a partir del anaacutelisis ML y MP del

conjunto de datos ITS Aislados de las hojas de frailejoacuten Los coacutedigos en Verde son las secuencias que se

aislaron (aislados) en este estudio los coacutedigos y nombres en Negro son las secuencias encontradas por

identidad en GenBank Los valores de soporte de bootstrapgt 70 se indican cerca de los nodos como MP

ML = valores de soporte de bootstrap lt70

El nuacutemero de caracteres los modelos de sustitucioacuten usada asiacute como otros resultados

estadiacutesticos de las pruebas de Maacutexima Parsimonia y Maacutexima Verosimilitud generados a partir de

los anaacutelisis filogeneacuteticos de los conjuntos de datos se muestran en los anexos

39

Capiacutetulo Tercero

Discusioacuten sobre los hongos endofitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicas

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidad de Endoacutefitos

Tanto la temperatura la estacionalidad y los tipos de precipitacioacuten son factores de vital

importancia para la composicioacuten de las diferentes comunidades y la arquitectura vegetal Estos

factores limitan muchos de los procesos ecosisteacutemicos ya que existe una estrecha relacioacuten entre

las variaciones climaacuteticas y las variaciones dentro de los ecosistemas Por lo tanto se espera que

el cambio climaacutetico transforme los ecosistemas Andinos tal como los conocemos hoy (Colwell et

al 2008) modificando las relaciones mutualistas entre plantas y hospederos

Posiblemente la resiliencia y resistencia de muchos ecosistemas como el paacuteramo sean

superadas en este siglo por una combinacioacuten sin precedentes de disturbios tales como el cambio

climaacutetico perturbaciones asociadas a este (sequiacuteas fuegos invasioacuten de especies exoacuteticas

inundaciones) y otros factores como organismos oportunistas (hongos endoacutefitos) cambios en el

uso del suelo contaminacioacuten y sobreexplotacioacuten de recursos (IPCC 2020)

Considerando que el frailejoacuten Espeletia hartwegiana es una especie de alta montantildea

(paacuteramos) endeacutemica de la cordillera Central de los Andes (Schultz y Carl 1856) se encuentra

dentro de los ecosistemas andinos en donde a su vez se ha comprobado la existencia de los

hongos endoacutefitos es de tener en cuenta el papel de estos organismos endoacutefitos ya que los

paacuteramos son ecosistemas particularmente sensibles a los efectos adversos del cambio climaacutetico

en especial al calentamiento global al estar ubicados en los troacutepicos generando asiacute ventanas de

40

oportunidades para que los hongos endoacutefitos alteren su estado mutualista y pasen a ser

patogeacutenicos (Colwell et al 2008 7)

No obstante existe consenso en que las temperaturas aumentaraacuten especiacuteficamente a

grandes alturas y que la precipitacioacuten posiblemente se incrementaraacute en algunas zonas disminuiraacute

en otras y se produciraacute en patrones estacionales alterados con mayor intensidad y frecuencia

(Marengo et al 2009)

Los frailejones se ven en constante estreacutes por el uso del suelo dado en los paacuteramos como

es el caso del paacuteramo Romerales un paacuteramo que se ha visto afectado por las quemas y la

ganaderiacutea (Molinillo y Monasterio 2001) Esto aumenta asiacute las condiciones de estreacutes intriacutensecas a

las que estaacuten expuestas estas plantas de paacuteramo las cuales suministran valiosos bienes y servicios

ecosisteacutemicos como el abastecimiento continuo de agua para usos domeacutesticos agriacutecolas e

industriales (Buytaert et al 2006 4) servicios que se podriacutean ver en decrecimiento si las

ventanas de oportunidades se abren con maacutes frecuencia dando pie al cambio de estado de los

hongos endoacutefitos que existen dentro de los frailejones de la zona

En los paacuteramos de Chingaza Rabanal Guerrero Iguaque Merchaacuten y Sumapaz se han

realizado estudios de aislamientos de hongos en especies de frailejoacuten diferentes a la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana tales como Espeletia argentea Espeletia arbelaezii Espeletia

boyacensis Espeletia grandiflora Espeletia miradorensis y Espeletia uribei por ende se ha

reportado la presencia de hongos endoacutefitos y fitopatoacutegenos (Tabla 2) (Gaitan 2018 17)

Frailejones Espeletia

argentea

Espeletia

arbelaezii

Espeletia

boyacensis

Espeletia

grandiflora

Espeletia

miradorensis

Espeletia

uribei

Aspergillus X X X X

Annulohypoxylon X X X

Curvularia X X X

Epicoccum X X X

Fusarium X X X

41

Tabla 2 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = a presencia del genero de

hongo dentro de la especie de frailejoacuten

Los geacuteneros de hongos en rojo son los geacuteneros que se encontraron en comuacuten con los

geacuteneros hallados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana de un total de 15 geacuteneros 3

han sido reportados anteriormente en estudios similares ( 20 de geacuteneros identificados)

Dentro de un marco de cambio climaacutetico es importante la metodologiacutea de muestreo

como lo fue el formato de muestreo en puntos aleatorios realizado en el presente estudio se llevoacute

acabo principalmente por la homogeneidad de los frailejones en el paacuteramo como lo indica el

manual de meacutetodos baacutesicos de muestreo y anaacutelisis de ecologiacutea vegetal (BOLFOR 2000 9) donde

se menciona que el muestreo aleatorio se utiliza cuando se dispone de poca informacioacuten previa de

las caracteriacutesticas de las poblaciones a medirse en este caso la poblacioacuten a identificarse fueron

los hongos endoacutefitos que se hallaban dentro de las formaciones homogeacuteneas de los frailejones

No obstante el muestreo aleatorio tambieacuten presenta limitaciones a la hora de comparar los

hongos endoacutefitos a lo largo del gradiente altitudinal (muestreo aleatorio estratificado) dejando de

percibir informacioacuten proveniente de los distintos microclimas que se encuentran y de las

incidencias que podriacutean causar a la hora de identificar los geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten ademaacutes de posibles micro efectos del cambio climaacutetico a lo

largo del gradiente altitudinal (Caacutemara et al 2008)

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio Climaacutetico

Nigrospora X X X X X

Penicillium X X X

Pleospora X X X X

Trichoderma X X X X

42

Las teacutecnicas empleadas en este estudio para lograr aislar e identificar los hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana se hacen importantes dentro del cambio

climaacutetico debido a que el margen de error en la identificacioacuten molecular es reducido (Bakermans

et al 2014) Al ser reducido el margen de error se pudo conocer con mayor certeza que especies

y geacuteneros de hongos endoacutefitos se encuentra dentro de la planta

Al conocer sus identidades es posible conocer las capacidades que tienen cada una de

estas especies de hongos endoacutefitos de producir metabolitos secundarios de infiltrarse y proteger

los tejidos de la planta de condiciones bioacuteticas y abioacuteticas competir contra herbiacutevoros y

fitopatoacutegenos (Schulz et al 2002) Con sus capacidades reconocidas es posible vincular los

efectos del cambio climaacutetico como estreacutes hiacutedrico aumento de la temperatura migraciones

tempranas enfermedades emergentes aumentos de la precipitacioacuten y heladas severas con las

reacciones por parte de los hongos endoacutefitos Estas reacciones podriacutean desencadenar aumentos de

la patogenicidad en las poblaciones de frailejones debido a los constantes disturbios y estreacutes al

que se ve sometido la planta generando asiacute notables declives poblacionales (Mendoza 2010)

Las relaciones filogeneacuteticas entre las especies halladas toman relevancia debido a las

sinergias positivas o negativas que se pueden presentar dependiendo de las especies que se

encuentren asociadas dentro de la planta (Lamichhane y Venturi 2015) como por ejemplo

Nigrospora y Colletotrichum pueden activar una sinergia negativa aumentando la virulencia y

afectando la especie Espeletia hartwegiana

Las especies de hongos endoacutefitos se identificaron por medio de secuencias obtenidas de

las regiones ITS (regioacuten de espaciadores internos transcritos) las cuales son regiones altamente

conservadas con tasas de evolucioacuten muy lentas en el tiempo permitiendo hacer inferencias

filogeneacuteticas (Baldwin et al 1995 Hamby y Zimmer 1992) es por ello que se usaron para

generar las diferentes identificaciones de los hongos endoacutefitos logrando asiacute identificar al geacutenero

Nigrospora con un total de 7 especies N sacchari N rubi N sphaerica N hainanensis N

gorlenkoana N oryzae y N aurantiaca pertenecientes a la familia Apiosporaceae orden

Xylariales Divisioacuten Ascomicota (veacutease figura 11) (Wang et al 2017)

Dentro del marco del cambio climaacutetico Nigrospora se caracteriza por poseer una

distribucioacuten cosmopolita y una amplia gama de hueacutespedes como lo es en este caso la especie E

hartwegiana que habita en los Andes Tropicales que se veraacuten alterados por los efectos del

cambio climaacutetico este geacutenero se ha logrado aislar en su forma endoacutefita en tallos y hojas de

43

diversas plantas tambieacuten como saprofitos en detritos hojarasca y larvas muertas (Uzor et al

2015 1)

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

Los hongos endoacutefitos hallados en esta investigacioacuten se encontraron dentro de la especie

de frailejoacuten E hartwegiana la cual pertenece a los Andes Tropicales ubicados maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos Estos ecosistemas son sensibles a los efectos del cambio

climaacutetico por su altura su alto endemismo y su sensibilidad al efecto de borde Cuando las

especies lentildeosas empiecen a migrar a lo largo del gradiente altitudinal es posible que los

frailejones se encuentren con suelos agrestes en donde sus semillas no podraacuten fijarse y los efectos

adversos de hongos como Nigrospora N oryzae y N sphaerica seraacuten maacutes notables

aprovechando las ventanas de oportunidad que generen los desbalances climaacuteticos (Sharma et al

2013)

Los cambios en los patrones climaacuteticos potenciaran la especie N sphaerica dentro del

frailejoacuten la cual tiene la capacidad de causar tizoacuten foliar en la especie Camellia sinensis siendo

una planta de teacute perteneciente a la divisioacuten de las magnolifiotas como el geacutenero Espeletia (Liu et

al 2015) Nigrospora fue el geacutenero maacutes ampliamente aislado en las identificaciones generadas a

partir de las hojas de frailejoacuten esto se veriacutea explicado debido a que N sphaerica tiene un

mecanismo de descarga de esporas efectivo que puede proyectar a la fuerza sus esporas a una

distancia de hasta 2 cm en vertical y 68 cm en horizontal como lo demostroacute Webster (1952)

ademaacutes el estudio de Wu y colaboradores (2004) tambieacuten evidencioacute que las esporas de

44

Nigrospora son uno de los grupos maacutes dominantes en la atmoacutesfera y estaacuten asociadas con

tormentas de polvo

La gran capacidad colonizadora del geacutenero Nigrospora le permite adaptarse a las

condiciones climaacuteticas cambiantes con la estrategia de dispersioacuten de sus esporas logrando

distanciarse del frailejoacuten hospedero para encontrar nuevos hospederos producto de las

migraciones tempranas a lo largo del gradiente altitudinal (Riveros 2010)

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

por encima del 80 lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen menos

mutaciones en los nodos internos del aacuterbol basados en la distribucioacuten de probabilidad asignadas

a los posibles arboles resultantes dando lugar a una hipoacutetesis evolutiva maacutes confiable (Schmidt y

Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 es decir el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes

corto (menos cambios) y el cual se ajusta mejor a los datos (Swofford 1997)

Teniendo asiacute una inferencia filogeneacuteticamente robusta los geacuteneros Collectotrichum y

Nigrospora pertenecen a la Divisioacuten Ascomycota ambos geacuteneros son particularmente agresivos

con las plantas en especial la especie Colletotrichum gloeosporioides la cual es la fase asexual

de Glomerella cingulata (Raj et al 2013) Se caracteriza por tener un amplio rango de

hospederos entre ellos el frailejoacuten a los cuales les causa una enfermedad conocida pudricioacuten

amarga antracnosis o chancros siendo esta la necrosis de frutos flores nervios y tallos

(Gonzaacutelez et al 2006 4)

Uno de los primeros reportes de afectaciones a especies de frailejoacuten se obtuvo en el 2009

en el Parque Natural Nacional Chingaza Colombia en donde encontraron las especies de

frailejoacuten Espeletia grandiflora y Espeletia uribei afectadas debido a insectos y una especie de

hongo del genero Colletotrichum (Medina 2009- 9 Hartung y Burton 1981)

Por ende que estos dos geacuteneros de hongos se encuentren juntos podriacutea tener

implicaciones en el aumento de virulencia potenciado a su vez por los desbalances abioacuteticos

causados por el cambio climaacutetico como lo han mencionado Belisario y colaboradores (2002) es

posible que las afectaciones no sean producidas por un uacutenico hongo si no por un complejo de

varios generando sinergismos entre diferentes especies que solas no hariacutean dantildeo a la planta pero

juntas podriacutean ser causantes de enfermedad (Lamichhane y Venturi 2015 4) aun mas en un

45

marco de cambio climaacutetico que gradualmente aumenta sus efectos nocivos sobre los paacuteramos

aumentando la temperatura cambios en la precipitacioacuten heladas intensas cambios en la

nubosidad mayor exposicioacuten a la radiacioacuten solar teniendo por resultado un iacutendice de estreacutes

mayor en las plantas de paacuteramo generando ventanas de oportunidades para que los hongos

endoacutefitos modifiquen sus roles de protector a patoacutegeno

En frailejones tambieacuten se ha reportado la presencia de Nigrospora y Trichoderma por

Bonilla y Argenis (2005) maacutes especiacuteficamente en la especie Espeletia grandiflora la cual es una

especie que habita en los paacuteramos de Colombia Ecuador y Venezuela en conjunto con Espeletia

hartwegiana (Luteyn 1999 3) El hecho que existan estos dos geacuteneros presentes en los frailejones

advierte de un equilibrio entre hongos endoacutefitos que se puede romper bajo las tensiones del

cambiante clima maacutes aun en los sensibles paacuteramos alto andinos

En cuanto a N sacchari se tiene reporte que es un productor de metabolitos con una

notable actividad herbicida demostrado en plantas cultivadas en invernadero (Fukushima et al

1998 2) debido a que existe evidencia que sugiere que los hongos endoacutefitos han evolucionado

directamente de hongos patoacutegenos (Schulz et al 1999 4) sumado al estreacutes del cambio climaacutetico

en cualquier momento de extrema tensioacuten hiacutedrica caloacuterica o heladas en estos ecosistemas de alta

montantildea Estos anomaliacuteas ambientales podriacutea disparar mecanismos de accioacuten fitopatoacutegenos

dentro de los frailejones generando un declive notable en sus poblaciones y por ende un declive

de la cantidad recurso hiacutedrico aguas abajo y su regulacioacuten (Diacuteaz et al 2002 5)

Como se mencionoacute anteriormente los medios de propagacioacuten de estos hongos endoacutefitos

pueden ser por medio de esporas que estaacuten en el ambiente aunque tambieacuten los vectores que

juegan un rol clave en su dispersioacuten son los insectos ya que estos pueden transportar esporas o

partes del hongo en su cuerpo patas o aparato bucal (Eigenbrode et al 2018 5)

Considerando la dispersioacuten homogeacutenea de los frailejones dentro del paacuteramo la carga

esporas en el ambiente y la herbivoriacutea de insectos es probable que se puedan ver infectados la

mayoriacutea de individuos (Varela 2016) es por ello que en el futuro puede que las afectaciones en

frailejones no sean producidas por hongos fitopatoacutegenos si no por hongos endoacutefitos que tuvieron

la ventana de oportunidad gracias al cambio climaacutetico aumento de la temperatura aumento en

las concentraciones de CO2 y alteraciones de precipitacioacuten que pueden hacer susceptible la planta

al ataque de estos hongos (Chakraborty 2011 Elad y Pertot 2014)

46

Para que se genere la enfermedad esta depende de la interaccioacuten de tres o cuatro factores

1) hospedero susceptible 2) agente causal (virulento) 3) condiciones ambientales favorables y 4)

tiempo (Francl 2001 2) la falta de alguno de ellos no permite que el patoacutegeno produzca la

enfermedad en la planta debido a ello algunas especies de frailejoacuten pueden tener una o dos cepas

que puedan actuar como fitopatoacutegenos pero no estaacuten activas si no estaacute completa su asociacioacuten

con otro patoacutegeno u otro factor

Ademaacutes existe un estudio que evaluoacute el efecto de la temperatura sobre la capacidad de

Fusarium verticillioides para generar infeccioacuten en plantas de maiacutez se probaron bajo 3 escenarios

de temperatura como resultados obtuvieron que la enfermedad de este hongo se veiacutea potenciada

por el aumento de temperatura en temperaturas por encima de 35degC (Murillo et al 2008) este

estudio da soporte a la hipoacutetesis de que existen factores que influyen significativamente a la

infeccioacuten en la planta tal vez el paacuteramo difiacutecilmente alcance 35degC no obstante la mayoriacutea de

especies son sensibles a cambios de temperatura de hasta de 1degC en donde modifican su

comportamiento rutas metaboacutelicas interacciones ecoloacutegicas y por ende sus defensas se ven

alteradas

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e Hypocrea

El geacutenero Trichoderma con seis especies diferentes (veacutease figura 12) fue el segundo

geacutenero maacutes numeroso despueacutes de Nigrospora que contoacute con siete especies aunque las primeras

especies que se analizaron fueron especies que principalmente actuaban generando enfermedades

en las plantas en las que se encontraban ante disturbios el geacutenero Trichoderma pertenece a la

47

familia Hypocreaceae y se caracteriza por tener una gran capacidad biocontroladora sobre

fitopatoacutegenos como Fusarium oxysporum los cuales podriacutean llegar masivamente con las

migraciones tempranas de insectos y plantas lentildeosas (Miles et al 2012 7)

No solo actuacutean repeliendo patoacutegenos internos si no tambieacuten patoacutegenos externos como

insectos que desean consumir u aprovechar la planta ya que estos pueden secretar diferentes

metabolitos secundarios y enzimas que actuacutean inhibiendo su desarrollo (Boughalleb-M et al

2018 8)

Es bien conocido que el geacutenero Trichoderma produce amplio rango de sustancias

antibioacuteticas ademaacutes de poseer la caracteriacutestica de parasitar otros hongos (Howell 2002 6)

Debido a la competencia que generan las especies del genero Trichoderma por espacio y

nutrientes inhiben o degradan pectinasas y otras enzimas que son esenciales para que los hongos

fitopatoacutegenos como Botrytis cinerea penetre en la superficie de las hojas logrando proteger de

esta forma al frailejoacuten que se veraacute expuesto a nuevas amenazas microbioloacutegicas auspiciadas por

los cambios en los patrones climaacutetico (Zimand et al 1996)

Ademaacutes de la capacidad del Trichoderma sp para atacar o inhibir el crecimiento de

patoacutegenos de plantas directamente descubrimientos recientes indican que tambieacuten pueden inducir

resistencia sisteacutemica y localizada a una variedad de patoacutegenos de plantas tales como el frijol es

protegido por Trichoderma harzianum de especies fitopatoacutegenas como Colletotrichum

lindemuthianum Botrytis cineacuterea las cuales producen lesiones en las hojas de la planta (Harman

y Howell 2004) Incluso se descubrioacute que ciertas especies de Trichoderma tienen una influencia

sustancial en el buen crecimiento y desarrollo de las plantas sin y con condiciones de estreacutes

climaacutetico (Lorito 1998)

Como lo demostraron Bonilla y Argenis (2005) en su estudio llevado a cabo en el

frailejoacuten Espeletia grandiflora diferentes cepas pertenecientes a Trichoderma pueden proteger

esta especie de paacuteramo de organismos fitopatoacutegenos emergentes por el cambio climaacutetico por

ende si puede proteger a E grandiflora tambieacuten puede proteger la especie E hartwegiana lo

que le permitiraacute sobrellevar diferentes ataques fortuitos de patoacutegenos e insectos que nunca han

logrado alcanzar las altitudes de paacuteramo (3200 - 5000 m)

Cuando el cambio climaacutetico aumente la temperatura en 1degC o 2degC traeraacute consigo sus

efectos de modificacioacuten en cuanto a la estructura y composicioacuten de las especies de plantas que

48

existen en zonas altas para este escenario basado en los caacutelculos de Thuiller (2007) las especies

se habriacutean desplazado en el gradiente altitudinal aproximadamente 450 metros para el antildeo 2070

Las consecuencias de este desplazamiento serian uacutenicas debido a que gran cantidad de

insectos y patoacutegenos tendriacutean migraciones tempranas en el gradiente altitudinal en buacutesqueda de

su optimo teacutermico llevando a cabo un proceso conocido como Termofilizacioacuten (Cuesta et al

2019) es ahiacute donde entra en juego la proteccioacuten que le pueden brindar especies endoacutefitos como

las que pertenecen al geacutenero Trichoderma en el marco de cambio climaacutetico

En concordancia con las cepas de Trichoderma y el geacutenero Hypocrea que tambieacuten

pertenece a la familia Hypocreaceae se conocen maacutes de 700 secuencias de peptaiboles (peacuteptidos

bioloacutegicamente activos) de ambos geacuteneros donde algunos de eacutestos son ecoloacutegica y

comercialmente relevantes debido a su potencial antimicrobiano actividad enzimaacutetica uacutetil para

competir por espacio y alimento de los nuevos patoacutegenos emergentes procedentes de las

alteraciones climaacuteticas y las migraciones tempranas (Degenkolb et al 2008 6)

En cuanto al geacutenero Hypocrea tambieacuten se ha reportado actividad antimicrobiana y anti

fuacutengica contra Staphylococcus aureus y Fusarium oxysporum (Gogoi et al 2008 2) habitando

los geacuteneros Trichoderma e Hypocrea dentro de especies de frailejoacuten como E hartwegiana se

espera que puedan generar sinergias de proteccioacuten que las ayude a combatir los fuertes y

extremos eventos climaacuteticos

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

del 100 (veacutease figura 13) lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen

menos mutaciones en los nodos internos del aacuterbol por ende este aacuterbol contiene la menor

cantidad de mutaciones o cambios dentro sus nodos internos teniendo como resultado una

hipoacutetesis evolutiva confiable (Schmidt y Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 que

indica que el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes corto (menos cambios) y el cual se ajusta

mejor a los datos (Swofford 1997)

49

El geacutenero Annulohypoxylon es de importancia dentro del marco del cambio climaacutetico ya

que pertenece a la familia Xylariaceae y se caracteriza por poseer metabolitos secundarios

antitumorales-citotoacutexicos como la anuloescuamulina que ayudan a combatir el estreacutes abioacutetico

(Cheng et al 2012) estas cepas de hongos son principalmente saprofitos y oportunistas han sido

reportadas en hojas sanas y afectadas de frailejones en otros estudios (Gonzaacutelez 2012 Nonsoque

2012) siendo un geacutenero resiliente a las perturbaciones ambientales como los cambios en los

patrones climaacuteticos su relacioacuten como mutualista dentro del frailejoacuten se mantendraacute hasta que el

frailejoacuten se adapte o colapse ante el estreacutes abioacutetico

Aunque no se conocen como fitopatoacutegenos al contrario pueden actuar como mutualistas

no se descarta que puedan estar involucrados en el desarrollo de diferentes enfermedades en

plantas cuando las condiciones ecosistemicas se alteran a puntos extremos (Gonzalez et al 2017)

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon Biscogniauxia

Nemania y Humiacutecola

El geacutenero Daldinia posee unos valores de MPML correspondientes a 10094 con lo cual

se encuentra bien soportado estadiacutesticamente el geacutenero Daldinia se encuentra ubicado en la

familia Xylariaceae al igual que el geacutenero Hypoxylon Biscogniauxia y Nemania que en su

respectivo orden contienen un soporte estadiacutestico MPML de 10082 10099 y 100100 (veacutease

figura 14) los cuales pertenecen a la divisioacuten Ascomycota las cepas de Daldinia se caracterizan

principalmente por ser especies endoacutefitas teniendo la capacidad de estar dentro de su hueacutesped

mucho tiempo sin causarle dantildeo o al menos un dantildeo evidente por medio de su estado asexual

50

No obstante su estado se puede modificar cuando las condiciones externas se modifican

abruptamente en poco tiempo como es el caso de las alteraciones en la temperatura

precipitacioacuten y concentraciones de dioacutexido de carbono (CO2) auspiciados por el cambio

climaacutetico (Saacutenchez et al 2013)

Un estudio realizado por Prieto (2017) en la especie de frailejoacuten E grandiflora encontroacute

que la especie Daldinia eschscholtzii estaba asociado en el siacutentoma de clorosis (falta de clorofila

en las hojas) Tambieacuten se reportoacute que especies de Daldinia como Daldinia conceacutentrica tienen la

capacidad de controlar nematodos fitopatoacutegenos (Silva et al 2020 104) los cuales pueden invadir

y romper los tejidos de la planta dantildeando sus estructuras los nematodos tambieacuten seraacuten sujetos a

migraciones tempranas por el cambio climaacutetico que trae consigo presiones de seleccioacuten por ende

nuevas amenazas para los frailejones (Nakashima et al 2007)

Como hemos visto hasta este punto las especies de hongos endoacutefitos se muestran en

muchos casos como benefactores y protectores de las diferentes plantas en las que habitan

incluyendo diferentes especies de frailejones

Los hongos endoacutefitos protegen tanto de factores bioacuteticos como virus hongos

fitopatoacutegenos bacterias insectos y factores abioacuteticos como las intemperancias del clima no

obstante en su relacioacuten endoacutefita geacuteneros como Hypoxylon que pertenece igual que Daldinia a la

familia Xylariaceae pueden tener roles amenazadores en conjunto con el cambio climaacutetico

seguacuten Gonzales y colaboradores (2019) inocularon cepas pertenecientes al geacutenero Hypoxylon en

hojas de Theobroma cacao y encontraron que en 48 horas se comenzoacute a notar las marcas de

clorosis y deshidratacioacuten foliar esto demuestra que cepas de este geacutenero pueden tener efectos

fitopatoacutegenos ocasionando muerte descendente pudricioacuten del tronco negro y resinosis de ramas

de mezquite (De la Torre-Almaraacutez et al 2003 De la Torre-Almaraacutez et al 2009)

La presencia de este geacutenero dentro del frailejoacuten en un marco del cambio climaacutetico lo

convierte en una amenaza latente ya que las condiciones seraacuten cada vez maacutes agrestes en los

paacuteramos de los Andes Tropicales Puede favorecer el desarrollo de este geacutenero que tiene las

enzimas necesarias para producir la pudricioacuten del tronco negro entre otras enfermedades

relevantes

51

Tambieacuten las especies del geacutenero Hypoxylon se han reportado como endoacutefitos en tejidos de

plantas lentildeosas o herbaacuteceas (Petrini y Petrini 1985 3) asiacute como saprofitos o fitopatoacutegenos

deacutebiles en madera de aacuterboles de zonas templadas o tropicales (Miller 1961) como lo menciona

Miller (1961)

Los geacuteneros Biscogniauxia Nemania tambieacuten estaacuten dentro de la familia Xylariaceae y

Divisioacuten Ascomycota un aspecto interesante de las especies de Biscogniauxia es que son

paraacutesitos exclusivos de las angiospermas dicotiledoacuteneas en donde concluyeron que todas las

especies pertenecientes a este geacutenero son patoacutegenos umllevesuml que se aprovechan de situaciones de

sequiacutea y estreacutes hiacutedrico para aumentar su patogenicidad (Ju et al 1998)

La especie de frailejoacuten E hartwegiana es una Dicotiledoacutenea eso explica porque

podemos encontrar esta especie de hongo endoacutefito en el frailejoacuten del presente estudio siendo de

vital importancia denotar que las especies de Biscogniauxia se aprovechan especialmente de las

situacioacuten de sequiacutea y estreacutes hiacutedrico difiacutecilmente las especies de este geacutenero podriacutean afectar a los

frailejones debido a que se caracterizan por ser reguladores de los ciclos hiacutedricos el agua es el

recurso que maacutes tiende a existir en un paacuteramo por la estructura de sus suelos compuesta por

andosoles porosos y necromasa acumulada teniendo asiacute un alto iacutendice de retencioacuten hiacutedrica

(Hernandez y Muntildeoz 2015) de modo que el cambio climaacutetico no favorece al geacutenero

Biscogniauxia en su estado patogeacutenico dentro del ecosistema de paacuteramo

En cuanto al geacutenero Nemania Da Silva y colaboradores (2018) llevaron a cabo una

investigacioacuten en la cual identificaron cepas pertenecientes a los geacuteneros Colletotrichum

Phyllosticta Xylaria Nemania y Alternaria en la especie ornamental Pachystachys lutea en

donde las mismas cepas fueron ensayadas para inhibir el crecimiento de hongos fitopatoacutegenos

como Colletotrichum sp en donde encontraron que Nemania era capaz de inhibir por medio de la

secrecioacuten de distintas enzimas el crecimiento de dichas especies gracias a su actividad

enzimaacutetica el geacutenero Nemania puede compensar los desequilibrios causados por el cambio

climaacutetico en teacuterminos de hongos fitopatoacutegenos

Hay que tener en cuenta que los elementos que dan forma a las interacciones planta-

endoacutefito incluyen el modo de transmisioacuten el patroacuten de infeccioacuten la edad de la planta las

condiciones ambientales potenciadas por el cambio climaacutetico y los antecedentes geneacuteticos (Aly et

al 2011 6) Los frailejones de la especie E hartwegiana que se muestrearon para el estudio se

52

tomoacute las hojas sanas lo que indica que poseiacutean estas cepas de endoacutefitos en equilibrio siendo este

uno de los pocos reportes de este geacutenero en especies de alta montantildea en los Andes Tropicales

El geacutenero Humiacutecola se encuentra soportado por un MPML de 10076 siendo una

hipoacutetesis evolutiva considerable es el uacutenico de la figura 14 que no estaacute dentro de la familia

Xylariaceae ya que pertenece a la familia Chaetomiaceae aunque se halla en la divisioacuten

Ascomycota se podriacutea considerar a la especie Humiacutecola fuscoatra como una de las especies de

endoacutefitos maacutes umlinofensivasuml debido a trabajos de investigacioacuten reportados como el de Menzies y

colaboradores (1998) y el de Naik y colaboradores (2009)

Humiacutecola fuscoatra no se considera un peligro latente para la especie E hartwegiana ya

que existe en equilibrio con su entorno Estaacute comprobado por medio de caracterizaciones

quiacutemicas que Humiacutecola fuscoatra es un importante productor de moleacuteculas de estimacioacuten

medica como el resorciacuteclico y lactonas aacutecidas (Mejia et al 2014) Por lo tanto es una especie

prometedora con un reservorio de metabolitos secundarios de importancia medicinal e industrial

que de seguir los efectos nocivos del cambio climaacutetico en los Andes Tropicales maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos esta especie podriacutea desaparecer

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies Massarina

Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

Uno de los grupos mejores soportados en este cladograma es el grupo de Diaporthe en el

cual se encontraron cuatro especies siendo uno con maacutes abundancia de especies del estudio y que

posee un MPML de 10085 10089 y 10095 acorde a sus 3 nodos (veacutease figura 15) teniendo asiacute

una hipoacutetesis evolutiva confiable de estas relaciones las especies de Diaporthe pertenecen a la

familia Diaporthaceae de la divisioacuten Ascomycota y son especies de endoacutefitos que se distinguen

por inhibir el crecimiento de hongos patoacutegenos en el hospedero que se encuentren El estudio de

53

Da Silva y colaboradores (2018) mostroacute que cepas de Diaporthe sp Inhibieron el crecimiento de

Fusarium oxysporum y Colletotrichum sp hongos fitopatoacutegenos que aumentaran su presencia

aprovechando las alteraciones producidas por el cambio climaacutetico en los paacuteramos

Las especies de este geacutenero estaacuten en continuo cambio entre endoacutefitos y patoacutegenos

funcionando en la mayoriacutea de los casos en una relacioacuten mutualista en donde le brindan a la planta

mayor tolerancia a las sequias proteccioacuten de patoacutegenos y pestes caracteriacutestica uacutetil frente a los

retos ecoloacutegicos que plantea el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales (Hubbard et al 2014)

se conocen cerca de 800 especies de este geacutenero asociadas a una amplia gama de plantas

vasculares a nivel mundial (Rossman et al 2015)

Esto explica porque las especies de Diaporthe fueron una de las maacutes numerosas

encontradas en la especie de alta montantildea E hartwegiana teniendo en cuenta que esta especie

pasa raacutepidamente de un estado endoacutefito a un estado patogeacutenico y dada su faacutecil y alta distribucioacuten

representa un peligro en conjunto con el cambio climaacutetico para las especies de alta montantildea como

los frailejones y supone una amenaza para el balance hiacutedrico y ecosistemico en el futuro

El geacutenero Crassiparies de la familia Neohendersoniaceae y el geacutenero Massarina de la

familia Massarinaceae pertenecen al orden Pleosporales aunque se discute debido a las

similaridades morfoloacutegicas y genoacutemicas con Massarina si Crassiparies deberiacutea estar en la

familia Massarinaceae (Hyde et al 2013 4) Se tiene poca informacioacuten sobre la especie

Crassiparies quadrisporus por ende este puede ser uno de los primeros reportes de esta especie

en una especie de alta montantildea como lo es el frailejoacuten especiacuteficamente en la especie E

hartwegiana en un marco de cambio climaacutetico el geacutenero Crassiparies necesita mayores estudios

a nivel ecoloacutegico y microbioloacutegico para entender su papel dentro de esta crisis climaacutetica

Mientras tanto el geacutenero Massarina ha logrado ser aislado de agua dulce con el fin de

obtener fuentes de productos naturales bioloacutegicamente activos por medio de las investigaciones

quiacutemicas de Shearer (1999 2001) en una especie de Massarina obtuvieron como resultado el

aislamiento de tres nuevos sequiterpenoides y dos lactonas derivadas de policeacutetidos con nuevos

sistemas de anillos lo que indica que esta especie tambieacuten puede tener un rol importante

mediante la produccioacuten de enzimas y metabolitos secundarios en el marco de las invasiones

bioloacutegicas impulsadas por el cambio climaacutetico

54

El geacutenero Cryptocoryneum de la familia Cryptocoryneaceae existe poca informacioacuten de

sus mecanismos de accioacuten como endoacutefito o patoacutegeno maacutes aun en especies de los Andes

Tropicales este podriacutea ser uno de los primeros reportes sobre esta especie de hongo en una

especie de frailejoacuten especiacuteficamente E hartwegiana en el 2015 se reportoacute en Brasil el

descubrimiento de una nueva especie del genero Cryptocoryneum trataacutendose de Cryptocoryneum

parvulum hallada en las hojas de la especie Araucaria angustifolia (Gimnosperma) (Silva et al

2015 1) la informacioacuten sobre el geacutenero Cryptocoryneum en relacioacuten al cambio climaacutetico y sus

efectos dentro de especies de alta montantildea como el frailejoacuten auacuten son poco conocidas

Uno de los geacuteneros maacutes cercanos a los grupos externos del cladograma es Cyphellophora

perteneciente a la familia Cyphellophoraceae el cual posee un MPML de 10091 logrando una

hipoacutetesis evolutiva confiable Diversas especies de Cyphellophora han logrado ser aisladas de

infecciones superficiales de la piel o las untildeas en humanos y de materiales vegetales (Decock et

al 2003 Cheewangkoon et al 2009) Esto indica su amplia distribucioacuten y su capacidad para ser

patogeacutenica tanto en plantas como en animales maacutes aun en condiciones desfavorables para la

planta como son las condiciones de cambio climaacutetico

De la especie Cyphellophora reptans se tiene reporte que su morfologiacutea es muy similar a

la de una levadura por lo que es faacutecilmente confundida con una (Reacuteblovaacute et al 2013) Es posible

que este sea el uacutenico reporte de Cyphellophora reptans en las hojas de un frailejoacuten o especie de

alta montantildea que habite en los troacutepicos como E hartwegiana debido a ello sus mecanismos de

accioacuten en especies de paramo dentro de un marco de cambio climaacutetico es poco conocido Se

necesitan mayores estudios enfocados en esta especie para entender su ecologiacutea y dinamismo

ecoloacutegico respecto a los cambios en las variables ambientales

Se eligieron las especies Coprinellus domesticus y Coprinellus xanthothrix como grupos

externos con el fin de enraizar el aacuterbol debido a que pertenecen a la Divisioacuten Basidiomycota la

cual difiere en grado de la divisioacuten Ascomycota aunque conserva semejanzas conocidos como

caracteres ancestrales o plesiomorficos que avanzan a medida la filogenia se construye con los

datos de las diferentes secuencias de especies evidenciando novedades evolutivas conocidas

como apomorfias que cuando se dan en un grupo en particular pasan a ser sinapomorfias es decir

novedades evolutivas dentro de un grupo particular (Lehtonen 2020) Se optoacute por enraizar con

55

estas dos especies con el objetivo de dar robustez al aacuterbol filogeneacutetico (Barriel y 1998) lo cual se

consiguioacute como se nota en los estadiacutesticos del aacuterbol filogeneacutetico

56

57

Conclusiones

Se rechaza la hipoacutetesis nula (H0) y se concluye que la identificacioacuten y caracterizacioacuten

molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo Colombia es diferente en 80 de sus geacuteneros y

especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos realizadas en especies de frailejoacuten

Por lo tanto los nuevos geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos encontrados en el frailejoacuten

plantean nuevos desafiacuteos respecto al cambio climaacutetico ya que tienen un rol vital en la

supervivencia de estas especies de alta montantildea como los frailejones debido a su relacioacuten

mutualista o patoacutegena maacutes aun en los paacuteramos que son altamente sensibles a los efectos del

cambio climaacutetico incluso tan sensibles como las zonas polares (Bradley et al 2006)

La mayoriacutea de especies encontradas en el presente estudio tienen potencial para ayudar a

combatir el estreacutes abioacutetico producido por el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales

Especiacuteficamente pueden ayudar a combatir el estreacutes bioacutetico producido por virus hongos

bacterias e insectos en un marco de cambio climaacutetico aumentos de temperatura cambios en la

concentracioacuten de CO2 cambios en la precipitacioacuten migraciones tempranas cambios en la

nubosidad disponibilidad hiacutedrica alteraciones en la estructura y composicioacuten de las especies

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Anexos

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombia

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia

hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

74

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

Coordenadas Geograacuteficas

(Latitud)

De la Colecta del

Material Bioloacutegico total de 15

muestras (Longitud)

LAT N 4deg 37 5871717 LONG W 75deg 25

3292611

LAT N 4deg 37 5885220 LONG W 75deg 25

3271217

LAT N 4deg 37 5884485 LONG W 75deg 25

3312103

LAT N 4deg 36 5995487 LONG W 75deg 27

3045854

LAT N 4deg 37 6195784 LONG W 75deg 30

3292611

LAT N 4deg 40 159171 LONG W 75deg 26

380142

LAT N 4deg 40 363762 LONG W 75deg 26

209072

LAT N 4deg 40 399832 LONG W 75deg 27

173554

LAT N 4deg 40 383965 LONG W 75deg 27

464325

LAT N 4deg 39 486438 LONG W 75deg 27

173559

LAT N 4deg 40 56894 LONG W 75deg 26

568287

LAT N 4deg 40 159174 LONG W 75deg 27

190654

LAT N 4deg 40 125083 LONG W 75deg 26

345912

LAT N 4deg 40 116691 LONG W 75deg 27

208264

LAT N 4deg 40 314698 LONG W 75deg 27

140791

75

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un estereoscopio con el propoacutesito de seleccionar la

maacutes indicada y luego sembrar un cultivo puro a partir de ese micelio

76

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados las

copias se conservaron con glicerol a -80degC en un ultra congelador de Thermo Scientifictrade

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas

y enviadas

77

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicos de forma segura y esteacuteril propiedad de la Universidad del Quindiacuteo

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a la Universidad Ruhr de Bochum (Alemania)

78

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de parsimonia

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X en donde se

observa en amarillo la secuencia umlTCATTAuml la cual es una secuencia altamente conservada

que se usa para marcar el inicio de la misma en hongos endoacutefitos

79

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa JmoldelTest usados para generar el

aacuterbol de relaciones filogeneacuteticas a partir de la regioacuten ITS de los hongos endoacutefitos aislados

total de modelos evaluados 88

ID Nombre Particioacuten lnL P AIC detaAIC Peso Cumpeso Udelta

1 JC 0 100820157 138 204400314 1341348 0 1 -

2 JC+I 0 98912511 139 200605022 9618188 0 1 -

3 JC+G 0 95470113 139 193720225 2733392 0 1 -

4 JC+I+G 0 95467507 140 193735014 274818 0 1 -

5 F81 0 100658095 141 204136189 13149356 0 1 -

6 F81+I 0 98761481 142 200362962 9376128 0 1 -

7 F81+G 0 95314814 142 193469628 2482794 0 1 -

8 F81+I+G 0 95324364 143 193508729 2521895 0 1 -

9 K80 10010 99734495 139 20224899 11262157 0 1 -

10 K80+I 10010 97835191 140 198470382 7483549 0 1 -

11 K80+G 10010 94227821 140 191255643 268809 0 1 -

12 K80+I+G 10010 94209963 141 191239926 253092 0 1 -

13 HKY 10010 99648091 142 202136181 11149348 0 1 -

14 HKY+I 10010 97761512 143 198383024 7396191 0 1 -

15 HKY+G 10010 94170799 143 191201599 214765 0 1 -

16 HKY+I+G 10010 94118678 144 191117357 130523 600E-04 0999 -

17 TrNef 10020 99564653 140 201929306 10942472 0 1 -

18 TrNef+I 10020 97712623 141 198245245 7258412 0 1 -

19 TrNef+G 10020 94150977 141 191121955 135121 400E-04 09994 -

20 TrNef+I+G 10020 94132131 142 191104263 117429 00011 09959 -

21 TrN 10020 99563809 143 201987618 11000784 0 1 -

22 TrN+I 10020 97702964 144 198285929 7299095 0 1 -

23 TrN+G 10020 94094235 144 191068469 81635 00065 09719 -

24 TrN+I+G 10020 94101378 145 191102757 115923 00012 09948 -

25 TPM1 12210 99713879 140 202227759 11240925 0 1 -

26 TPM1+I 12210 97826641 141 198473282 7486449 0 1 -

27 TPM1+G 12210 94249837 141 191319674 33284 0 1 -

28 TPM1+I+G 12210 942022 142 1912444 257566 0 1 -

29 TPM1uf 12210 99663473 143 202186945 11200112 0 1 -

30 TPM1uf+I 12210 97879458 144 198638917 7652083 0 1 -

31 TPM1uf+G 12210 94137349 144 191154699 167865 100E-04 09999 -

32 TPM1uf+I+G 12210 94141897 145 191183794 196961 0 1 -

80

33 TPM2 10212 99722544 140 202245087 11258254 0 1 -

34 TPM2+I 10212 97828213 141 198476426 7489592 0 1 -

35 TPM2+G 10212 94185859 141 191191718 204885 0 1 -

36 TPM2+I+G 10212 94153667 142 191147335 160501 100E-04 09998 -

37 TPM2uf 10212 99648091 143 202156182 11169348 0 1 -

38 TPM2uf+I 10212 97757018 144 198394035 7407202 0 1 -

39 TPM2uf+G 10212 941052 144 1910904 103566 00022 09904 -

40 TPM2uf+I+G 10212 9408801 145 19107602 89187 00044 0982 -

41 TPM3 12012 99768005 140 20233601 11349176 0 1 -

42 TPM3+I 12012 97958099 141 198736198 7749364 0 1 -

43 TPM3+G 12012 94227963 141 191275926 289093 0 1 -

44 TPM3+I+G 12012 94323885 142 191487769 500936 0 1 -

45 TPM3uf 12012 99625421 143 202110843 11124009 0 1 -

46 TPM3uf+I 12012 97770469 144 198420939 7434105 0 1 -

47 TPM3uf+G 12012 94165576 144 191211152 224319 0 1 -

48 TPM3uf+I+G 12012 94150861 145 191201721 214888 0 1 -

49 TIM1ef 12230 99592239 141 202004478 11017644 0 1 -

50 TIM1ef+I 12230 97822787 142 198485574 749874 0 1 -

51 TIM1ef+G 12230 94121043 142 191082087 95253 00033 09853 -

52 TIM1ef+I+G 12230 94122386 143 191104772 117939 00011 09969 -

53 TIM1 12230 99518653 144 201917306 10930473 0 1 -

54 TIM1+I 12230 9781156 145 19852312 7536286 0 1 -

55 TIM1+G 12230 94105198 145 191110396 123562 800E-04 09977 -

56 TIM1+I+G 12230 94087158 146 191094317 107483 00018 09922 -

57 TIM2ef 10232 99550617 141 201921233 109344 0 1 -

58 TIM2ef+I 10232 97704602 142 198249204 726237 0 1 -

59 TIM2ef+G 10232 94093484 142 191026968 40135 00516 0852 -

60 TIM2ef+I+G 10232 94073864 143 191007729 20895 0135 07169 -

61 TIM2 10232 99530022 144 201940044 1095321 0 1 -

62 TIM2+I 10232 97820158 145 198540315 7553482 0 1 -

63 TIM2+G 10232 94058678 145 191017356 30523 00834 08004 -

64 TIM2+I+G 10232 94060837 146 191041674 54841 00247 09248 -

65 TIM3ef 12032 99546286 141 201912572 10925739 0 1 -

66 TIM3ef+I 12032 97713931 142 198267862 7281028 0 1 -

67 TIM3ef+G 12032 94129376 142 191098753 111919 00014 09936 -

68 TIM3ef+I+G 12032 94112005 143 191084009 97176 0003 09883 -

69 TIM3 12032 99514376 144 201908751 10921918 0 1 -

70 TIM3+I 12032 97700023 145 198300047 7313213 0 1 -

71 TIM3+G 12032 94115323 145 191130646 143812 300E-04 09997 -

72 TIM3+I+G 12032 94096941 146 191113882 127048 700E-04 09984 -

73 TVMef 12314 9970418 142 20224836 11261526 0 1 -

74 TVMef+I 12314 97940598 143 198741196 7754363 0 1 -

81

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE (AIC)

75 TVMef+G 12314 94159829 143 191179657 192824 0 09999 -

76 TVMef+I+G 12314 94160993 144 191201987 215153 0 1 -

77 TVM 12314 99615991 145 202131982 11145148 0 1 -

78 TVM+I 12314 97746676 146 198413353 7426519 0 1 -

79 TVM+G 12314 94075503 146 191071005 84171 00057 09776 -

80 TVM+I+G 12314 94052588 147 191045176 58342 00208 09456 -

81 SYM 12345 99543166 143 201946331 10959498 0 1 -

82 SYM+I 12345 97757103 144 198394207 7407373 0 1 -

83 SYM+G 12345 94083056 144 191046112 59278 00198 09654 -

84 SYM+I+G 12345 94050035 145 19100007 13236 0198 05819 -

85 GTR 12345 99529525 146 20197905 10992217 0 1 -

86 GTR+I 12345 97686178 147 198312356 7325522 0 1 -

87 GTR+G 12345 94044194 147 191028387 41553 00481 09001 -

88 GTR+I+G 12345 94013417 148 190986834 0 03839 03839 -

13

Figuras mapas y tablas

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo

Colombiahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip18

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras

N necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefitohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y

abioacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en

medio de cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelialhelliphelliphellip 30

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la

teacutecnica de corte de hifa uacutenica helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 31

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de

cultivo Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12)

aislados de las hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana 31-32

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemicohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34

Figura 10 Filograma obtenido a partir del anaacutelisis ML y MP del conjunto de datos ITS Aislados

de las hojas de frailejoacuten37

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip43

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e

Hypocreahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip46

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon48

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon

Biscogniauxia Nemania y Humiacutecolahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip49

14

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies

Massarina Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona

muestreadahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia 29-30

Tabla 2 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos

endoacutefitos en la especie Espeletia hartwegiana

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36

Tabla 3 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = presencia del genero

de hongo dentro de la especie de frailejoacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42-43

15

Introduccioacuten

Hay un libro abierto siempre para

todos los ojos la naturaleza

(Jean-Jacques Rousseau 1712-1778)

El cambio climaacutetico corresponde a un fenoacutemeno que afecta el planeta de manera natural

permitiendo mantener las condiciones climaacuteticas como la temperatura la precipitacioacuten entre

otras en un rango aceptable para la vida (Jimeacutenez 2010) Sin embargo dado el aumento de las

emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) principalmente asociado a las actividades

humanas y el alto consumo de combustibles foacutesiles los cambios en dichas condiciones han sido

alterados dando paso a un acelerado aumento de temperatura anual en las uacuteltimas deacutecadas con

precipitaciones y sequias maacutes frecuentes e intensas (IPCC 2020 5 Jimeacutenez 2010)

Acorde con el Panel Intergubernamental de Expertos en Cambio Climaacutetico (IPCC) para

fin de siglo el Cambio Climaacutetico se acrecentaraacute pronosticando un aumento de temperatura de 25

a 45 degC para el antildeo 2100 que tan solo para Colombia en los uacuteltimos 30 antildeos fue de 08degC

generando impactos notorios en las zonas de alta montantildea como los paacuteramos (Moreno y Palma

2016)

El cambio climaacutetico es un fenoacutemeno cuyos efectos alcanzaraacuten los paacuteramos los cuales son

ecosistemas de alta montantildea presente en elevaciones entre 3100 y 4700 m ubicados en el norte de

los Andes de Ameacuterica del Sur y el sur de Ameacuterica Central adyacente (Berdugo et al 2016) Estas

aacutereas se caracterizan por una vegetacioacuten principalmente endeacutemica compuesta por frailejones

matorrales y pastos (veacutease figura 1) (Garciacutea et al 2010)

Los ecosistemas de alta montantildea como los paacuteramos ofrecen diversos servicios

ambientales como la biodiversidad uacutenica que albergan los paisajes los suelos y su capacidad de

retener y almacenar agua (Morales et al 2019) Las formaciones vegetales juegan un papel

diferenciado en el mantenimiento de la humedad y las fuentes de agua en el ecosistema

presentando la capacidad de interceptar almacenar y regular los flujos hiacutedricos superficiales y

16

subterraacuteneos aportando los servicios de abastecimiento de agua para el 70 de la poblacioacuten de

Colombia (Vaacutesquez y Buitrago 2017)

Ademaacutes dada la caracteriacutestica de permanente humedad de su suelo la materia orgaacutenica

se descompone a menor velocidad logrando un efecto de retencioacuten y almacenamiento de carbono

(Anderson et al 2012) En Colombia se han realizado diferentes estudios sobre la distribucioacuten y

extensioacuten del ecosistema paramuno Rangel (2002 4) determinoacute que los paacuteramos colombianos

abarcaban aproximadamente el 26 de la superficie del paiacutes

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramos por Pedraza-Pentildealosa Betancur y Franco-Rosselli (2005)

En particular el paacuteramo Romerales se encuentra dentro del territorio adscrito a los

Parques Nacionales Naturales (PNN) especiacuteficamente el PNN de los Nevados en la cordillera

central colombiana hacia la zona norte del Departamento del Quindiacuteo con liacutemites fronterizos

entre los departamentos de Risaralda y Tolima Este paacuteramo es el hogar del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana el cual estaacute afrontando los efectos del cambio climaacutetico (veacutease mapa 1)

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona muestreada

17

Existe evidencia cientiacutefica concreta del aumento de temperatura en los Andes Tropicales

tambieacuten cambios significativos en los patrones de precipitacioacuten sumado a la disminucioacuten en la

incidencia del clima nublado lo que conduce a las plantas a mayor cantidad de horas expuestas a

la radiacioacuten solar (Ruiz et al 2009) Otro efecto grave que trae consigo el cambio climaacutetico es el

desplazamiento de especies en el gradiente altitudinal Con un aumento de 3degC se espera que las

especies se muevan ~600 m en buacutesqueda de su optimo teacutermico esto afectariacutea gravemente las

especies de paacuteramo como los frailejones Cuesta Camacho (2007)

Los frailejones son emblemaacuteticas plantas de paacuteramo y ecosistemas de alta montantildea

(MINAMBIENTE 2019) Pertenecen a la familia Asteraceae contiene cerca de 142 especies

agrupadas en ocho geacuteneros Carramboa Coespeletia Espeletia Espeletiopsis Libanothamnus

Paramiflos Ruilopezia y Tamania de estos los maacutes importantes y con mayor diversidad de

especies son Espeletia Espeletiopsis y Libanothamnus (Rivera y Torres 2001)

Poseen adaptaciones que les permite captar y retener grandes cantidades de agua de su

entorno permitiendo un balance ecosistemico (Farias 2013) La morfologiacutea singular del genero

Espeletia le permite acumular las hojas antiguas en forma de ldquoabrigordquo brindando proteccioacuten

contra las bajas temperaturas nocturnas de hasta 0degC Los fuertes vientos y la radiacioacuten solar los

cuales seraacuten cada vez maacutes intensos y frecuentes por causa del cambio climaacutetico (Cortes y

Sarmiento 2013 34) (veacutease figura 2)

Estas plantas son especies claves para la conservacioacuten de los paacuteramos y la lucha contra el

cambio climaacutetico debido a que ofrecen una gran variedad de servicios ecosisteacutemicos (Diacuteaz et al

2007) El paacuteramo es referente sin igual de fuente hiacutedrica ciudades como Bogotaacute y Quito obtienen

aproximadamente el 80 de su agua dulce de los paacuteramos (Buytaert et al 2006) Los frailejones

en su mayoriacutea endeacutemicos se han visto afectados por actividades humanas como la ganaderiacutea

extensiva agricultura (cultivos de papa y cebolla) mineriacutea de oro y carboacuten turismo no

controlado y quemas intencionales (Hofstede 2000) Esta situacioacuten podriacutea comprometer a

mediano y largo plazo la funcioacuten de captacioacuten regulacioacuten y suministro del agua para el consumo

18

en las ciudades colombianas ubicadas en las regiones de influencia de estos ecosistemas (Varela

2015)

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

No obstante en asociacioacuten con especies como el frailejoacuten de los Andes Tropicales

encontramos a los hongos cuyos roles en las interacciones bioloacutegicas son de vital importancia

Los hongos pueden ser endoacutefitos simbiontes mutualistas paraacutesitos y comensales y son capaces

de responder a las amenazas que plantea el cambio climaacutetico en cuanto a perturbaciones

ambientales aumento de temperatura y estreacutes hiacutedrico adaptaacutendose a la disponibilidad de recursos

modificando sus actividades enzimaacuteticas e incluso su genoma a lo largo del tiempo (Moreno et

al 2013)

Los hongos son clasificados seguacuten su forma de reproduccioacuten sea sexual o asexual en

donde se observan las diferencias estructurales internas entre los diferentes grupos tales como

sus esporas e hifas como lo indican Blackwell y Spatafora (2004) estos organismos estaacuten

divididos en cuatro grandes grupos los cuales son Ascomycota Basidiomycota

Chytridiomycota Zygomycota es justo en el grupo de los Ascomycota donde se encuentra gran

diversidad de hongos conocidos como ldquohongos endoacutefitosrdquo en donde su nombre ldquoendoacutefitordquo

significa ldquodentro de la plantardquo (endon dentro phyton planta)

19

Estos microorganismos fuacutengicos tienen la facilidad de pasar gran parte o todo su ciclo de

vida invadiendo los tejidos de su hospedero (planta) sin tener un efecto negativo evidente

(Leacuteveilleacute 1846 3 de Bary 1866 8) Por lo tanto el concepto de endoacutefito indica una asociacioacuten de

costo-beneficio pero de una forma mutualista entre el hongo y la planta hospedera permitiendo

la estadiacutea en sus tejidos vivos (Clay 1998 8) Los hongos endoacutefitos se han encontrado en todas

las plantas (algas musgos pastos plantas y vasculares) desde los bosques templados hasta los

bosques tropicales hallaacutendose una gran diversidad de plantas y en asociacioacuten gran diversidad de

hongos endoacutefitos (Saacutenchez et al 2010)

Se espera que los hongos endoacutefitos jueguen un papel cada vez maacutes importante potenciado

por el cambio climaacutetico en las enfermedades producidas en plantas como pudricioacuten radicular

mal blanco entre otras con los aumentos pronosticados de la temperatura y el estreacutes por sequiacutea

asociados al cambio climaacutetico (Desprez-Loustau et al 2006 Slippers y Wingfield 2007 6) Los

cambios en la cantidad de dioacutexido de carbono (CO2) y la disponibilidad de nitroacutegeno en el suelo

afectan de forma similar tanto a las plantas como a los hongos por ende las alteraciones

generadas por parte del cambio climaacutetico pueden causar desbalances en sus relaciones (Ies et al

2013)

Algunos estudios realizados en el antildeo 1898 donde se registraron los primeros hongos

endoacutefitos como el de Bary (1866) brindo la iniciativa de investigaciones que lograron explicar

los cuadros toxicoloacutegicos observados en animales los cuales se daban por el consumo de

semillas o en aacutereas de pastos (Poaceae) que posiblemente albergaban hongos Clavicipitaacuteceos

(familia del ergot) los cuales poseiacutean actividades enzimaacuteticas con micotoxinas

Por diversas situaciones no trascendioacute la investigacioacuten hasta que Bacon (1977) hizo

relacioacuten del hongo endoacutefito Neotyphodium coenophialum debido a una intoxicacioacuten del ganado

llamado ldquosiacutendrome de veranordquo cuando estos animales consumiacutean pastos de la especie Festuca

arundinacea (Poaceae) Funk en el antildeo 80 caracterizoacute la resistencia de las Poaceae que

albergaban hongos endoacutefitos que frecuentemente eran atacados por insectos (proteccioacuten contra

herbiacutevoros) (Saacutenchez et al 2010)

Compant y colaboradores (2010) mencionaron que tras experimentar en el laboratorio

con una gama de temperaturas en los hongos endoacutefitos aislados obtuvieron resultados variables

respecto al crecimiento es decir positivos y neutrales llegando a la conclusioacuten de que los

microorganismos asociados a las plantas son un factor importante que influye en la respuesta de

20

las plantas acorde a los cambios de temperatura lo que compromete las respuestas del frailejoacuten y

los hongos endoacutefitos frente al calentamiento global causado por el cambio climaacutetico

Con relacioacuten a los estudios realizados sobre hongos endoacutefitos en frailejones se han

encontrado al menos 100 especies con capacidades de inhibir hongos fitopatoacutegenos o herbivoriacutea

(Cabezas et al 2012)

Los geacuteneros de hongos endoacutefitos encontrados en anteriores estudios son Acremonium

Aspergillus Aureobasidium Colletotrichum Fusarium Gliocadium Nigrospora Paecilomyces

Penicillium Trichothecium Trichoderma y Sordaria (Pineda 2000 Programa Nacional para la

Evaluacioacuten del Estado y Afectacioacuten de los Frailejones en los Paacuteramos de Andes del Norte 2009)

Teniendo en cuenta que para Colombia hay poca informacioacuten sobre hongos endoacutefitos en

ecosistemas paramunos se hace fundamental la ampliacioacuten de maacutes informacioacuten referente al tema

debido a que solo existen estudios significativos en cafeacute leguminosas y rosas los cuales maacutes allaacute

de la identificacioacuten de geacuteneros de hongos endoacutefitos no incluyen el cambio climaacutetico y sus

posibles consecuencias (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016) En

teacuterminos filogeneacuteticos los hongos son el reino de la naturaleza maacutes cercano a los animales

(Hibbett et al 2018)

Las relaciones que posean las diferentes especies de endoacutefitos dentro de la especie de

frailejoacuten es de importancia conocerla mediante el uso de la filogenia molecular (Judd et al 2007)

mediante secuencias de ADN ARN o proteiacutenas (Cooke et al 2000) Dependiendo de la presencia

de especies agresivas de endoacutefitos como Nigrospora se puede tener un mejor conocimiento

sobre las consecuencias que trae consigo los impactos del cambio climaacutetico sobre estas plantas de

los Andes Tropicales (Foden et al 2009)

21

Capiacutetulo primero

Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitos

1 Antecedentes

Desde los estudios realizados por Leacuteveilleacute (1846) y Bary (1866) sobre hongos Endoacutefitos

en pastos de zonas templadas se ha logrado identificar que estos hongos son capaces de inducir

respuestas adaptativas a sus hospederos (Micotoxinas contra herbiacutevora adaptacioacuten a heladas o

climas extremos fijacioacuten de nutrientes) a cambio de alimento y hospedaje formando una relacioacuten

mutualista en la cual las dos especies involucradas son beneficiadas No obstante se ha reportado

que los hongos endoacutefitos ademaacutes de tener relaciones mutualistas con diferentes especies

vegetales se pueden tornar en especies patoacutegenas para su hospedero una vez la planta se

encuentra en condiciones desventajosas tornaacutendose asiacute el hongo endoacutefito en un hongo

fitopatoacutegeno (Herrera y Ulloa 1990 550)

Como se mencionoacute anteriormente los hongos endoacutefitos pueden pasar de un estado

mutualista a un estado de patogeacutenesis dada esta relacioacuten entre ambos organismos se producen

metabolitos secundarios potencialmente toacutexicos facilitando factores de virulencia dados por el

hongo endoacutefito como exoenzimas y metabolitos fitotoacutexicos a su vez la planta presenta defensas

tanto mecaacutenicas como bioquiacutemicas (Saacutenchez et al 2013 5)

Hasta la fecha los principales estudios de hongos endoacutefitos se han fijado en especies de

intereacutes econoacutemico y comercial tales como palma de aceite cafeacute leguminosas pastos de forrajeoacute

y diferentes tipos de rosas (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016)

Las especies modelo para el estudio de los hongos endoacutefitos han sido las gramiacuteneas

forrajeras en donde se han reportado especies de endoacutefitos asociados a los geacuteneros Lolium

Festuca y Brachiaria (Siegel et al 1987) no obstante Otero y Bayman (2009) han reportado un

creciente nuacutemero de estudios en orquiacutedeas epifitas tropicales relaciones con hongos micorrizicos

22

Actualmente existen escasos reportes de hongos endoacutefitos asociados a ecosistemas con

climas extremos (temperaturas extremas) como aacuterticos desiertos paacuteramos y zonas alpinas

especialmente para zonas de temperaturas friacuteas como lo son los paacuteramos (Lopera et al 2008

Leung et al 2011 Cabezas et al 2012 Miles et al 2012 Zhang y Yao 2015)

Investigadores como Lopera Leung y colaboradores (2011) han llegado a la conclusioacuten

de que los hongos endoacutefitos juegan un papel importante en las plantas a la hora de adaptarse a

ecosistemas de clima templado (Kivlin et al 2013 Zhang y Yao 2015)

En Colombia los trabajos con hongos endoacutefitos son pocos por ende trabajos como el de

Lopera y colaboradores (2008) con especies del genero Espeletia de los paacuteramos Colombianos

son pioneros ademaacutes del trabajo de Cabezas y colaboradores (2012 4) en el cual aislaron y

caracterizaron celulasas (enzimas descomponedores de la celulosa) extraiacutedas de hongos endoacutefitos

que se hallaban en especies de Espeletia posteriormente Lopera y Miles (2012) unieron

esfuerzos para continuar caracterizando la diversidad de hongos endoacutefitos en los paacuteramos andinos

colombianos enfocados en Espeletia con el objetivo de encontrar especies con potencial

biocontrolador

Existen trabajos tesis en los repositorios de diversas universidades de los antildeos 2014 y

2015 en los cuales se aborda el tema de los hongos endoacutefitos paacuteramos y especies de Espeletia

(frailejones) y de la familia Poaceae en donde se caracterizan las diversas especies de hongos

endoacutefitos por medio taxonomiacutea y biologiacutea molecular ademaacutes de buscar metabolitos secundarios

con fines medicinales o de biocontrol

Los trabajos en filogenia molecular de hongos endoacutefitos realizados en frailejones se han

visto enfocados maacutes hacia la buacutesqueda de la diversidad funcional en comunidades

microbioloacutegicas como por ejemplo el estudio realizado por Ruiz y colaboradores (2015) en

donde buscaron mediante el anaacutelisis molecular de raiacuteces necromasa hojas maduras y joacutevenes de

diferentes especies de Espeletia (veacutease figura 3) ubicada en los Andes neotroacutepicales

colombianos secuencias geneacuteticas de las regiones V5-V6 de la unidad 16S del rARN

23

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras N

necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefito Tomado de Ruiz y colaboradores (2015)

Este estudio analizoacute la composicioacuten de comunidades microbioanas y su diversidad

funcional en un ecosistema de alta montantildea en donde las temperaturas los rayos UV y la altura

juegan papeles determinantes como filtros ecoloacutegicos severos en donde solo pueden existir

especies que han desarrollado capacidades para adaptarse sobrevivir y colonizar dichas aacutereas

por ende cuando se analizaron las comunidades existentes dentro de estas especies de Espeletia

Encontraron que algunas especies halladas podriacutean tener roles importantes como

productores de metabolitos secundarios enzimas o incluso como bioremediadores y que las

comunidades microbianas eran diferentes tanto en sus hojas como en sus raiacuteces y en la

necromasa

A medida que las deacutecadas avanzan y la evidencia sobre el cambio climaacutetico se hace maacutes

robusta y evidente los estudios en los hongos endoacutefitos han tomado vital importancia al estar

asociados con cultivos de especies comestibles escases de agua y de tierras productivas sumado

a los efectos negativos que trae consigo el cambio climaacutetico para las diferentes plantaciones y

cosechas a nivel global

Es por eso que Lu Yan y colaboradores (2019) analizaron los efectos positivos que teniacutean

la colonizacioacuten de hongos endoacutefitos en las plantas en donde ratificaron que los hongos endoacutefitos

dentro la planta generan metabolitos antimicrobianos estimulan las respuestas inmunoloacutegicas y

compiten por espacio dentro de la planta con diferentes patoacutegenos incrementando asiacute la

resistencia contra herbiacutevoros y la resistencia al estreacutes salino (factores bioacuteticos)

Ademaacutes de ayudar a la planta contra el estreacutes abioacutetico causado principalmente por

factores climaacuteticos como la falta de agua (estreacutes hiacutedrico) las temperaturas extremas la

intensidad de los rayos UV y los metales pesados como la muestra la figura 4 debido a esto se

24

concluyoacute que las fitohormonas cumplen un papel importante en la colonizacioacuten de hongos

endoacutefitos dentro de la planta

Aun que se ha reportado que los hongos endoacutefitos se pueden usar como biocontroladores

diferentes estudios reportan que el uso de hongos endoacutefitos puede tener efectos adversos como

un retraso significativo en el crecimiento de la planta con el uso de la especie Cryptosporiopsis

sp (Terhonen et al 2016) Otro reporte indica la fecundidad y supervivencia de enemigos

naturales como paraacutesitos esto es debido a que los hongos endoacutefitos transfieren sus toxinas y

alcaloides cuando son ingeridos por paraacutesitos u otros enemigos naturales de las plantas (Lopez y

Sword 2015)

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y abioacutetico

Bajo estreacutes bioacutetico (herbiacutevoros y patoacutegenos) y abioacutetico (sequiacutea salinidad metales pesados y otros) (a) se

inducen respuestas de defensa de las plantas (b) los endoacutefitos producen metabolitos protectores y

modulan la viacutea de las fitohormonas para mejorar la inmunidad de las plantas (c) tomada de Lu yan y

colaboradores (2019 7)

25

2 Justificacioacuten

La presente investigacioacuten pretende identificar y caracterizar que especies de hongos

endoacutefitos estaacuten asociadas al frailejoacuten Espeletia hartwegiana y que posibles implicaciones podriacutea

tener que estas especies se encuentren dentro de esta especie de alta montantildea La importancia de

conocer esta informacioacuten reside en que los hongos endoacutefitos pueden beneficiar o perjudicar a la

adaptacioacuten y resistencia de especies vegetales en los distintos escenarios climaacuteticos propuestos

por la ciencia (IPCC 2020)

El calentamiento global podriacutea afectar el equilibrio de los hongos endoacutefitos en especies

vegetales generando desbalances en la planta o la peacuterdida de especies endoacutefitas de importancia

biotecnoloacutegica Por ejemplo se podriacutean perder especies endoacutefitas con potencial para control

bioloacutegico de plagas y enfermedades de plantas como productores de enzimas y metabolitos

secundarios degradacioacuten de plaacutesticos o biorremediacioacuten entre otros (Schulz et al 2002) Por

ello se hace fundamental estudiar los hongos endoacutefitos en ecosistemas de paacuteramo ya que en

Colombia y en los paacuteramos en general han sido poco estudiados y su efecto sobre las plantas de

alta montantildea podriacutea ser clave en el mantenimiento de sus poblaciones

26

3 Hipoacutetesis

H1 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute diferente en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo diferentes los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten tambieacuten seria

modificada

H0 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute similar en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo similares los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten continuariacutean

como se ha registrado con anterioridad

27

4 Objetivos

41 Objetivo general

Caracterizar la diversidad de hongos endoacutefitos presentes en los frailejones

de la especie Espeletia hartwegiana en el paacuteramo de Romerales tomando en cuenta su

relacioacuten con el cambio climaacutetico

42 Objetivos especiacuteficos

Identificar los hongos endoacutefitos asociados en Espeletia hartwegiana del

paacuteramo de Romerales

Hallar relaciones filogeneacuteticas entre las diferentes especies de hongos

Endoacutefitos encontradas en Espeletia hartwegiana

Advertir las repercusiones del cambio climaacutetico sobre Espeletia

hartwegiana en base a su diversidad de hongos endoacutefitos

28

29

Capiacutetulo segundo

Materiales Meacutetodos y Resultados

1 Aacuterea de Estudio

El trabajo se realizoacute en el paacuteramo de Romerales ubicado en la zona alta del municipio de

Salento Quindiacuteo (4deg39202N 75deg25506W) con una extensioacuten aproximada de 6794 ha (Cano

et al 2015)

2 Colecta de material bioloacutegico

La colecta del material bioloacutegico se realizoacute mediante muestreos aleatorios lo largo del

paacuteramo tomando coordenadas de cada punto de colecta (veacutease anexo 3) las hojas se colectaron

por medio de tijeras podadoras siendo empacadas cada una en bolsas Ziploc diferentes se

colectoacute un total de 15 hojas cada una correspondiente a una planta de frailejoacuten para un total de

15 plantas muestreadas de E hartwegiana

Adicionalmente las bolsas Ziploc fueron marcadas con los datos de colecta en campo y

transportadas a los laboratorios del Programa de Biologiacutea de la Universidad del Quindiacuteo para su

procesamiento

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetales

Las muestras obtenidas fueron lavadas con agua para eliminar el exceso de residuos se

cortaron 4 trozos de cada hoja con un tamantildeo aproximado de 05 a 10 cm (veacutease figura 5) luego

cada trozo de hoja se sometioacute a una esterilizacioacuten la cual se completoacute con algunas modificaciones

acorde al procedimiento descrito por (Osorio et al 2017) especiacutefico para el aislamiento de

30

hongos endoacutefitos que consiste en sumergir perioacutedicamente el material vegetal en etanol al 90

durante un minuto seguido de hipoclorito de sodio (NaClO) al 4 por un minuto continuando

con etanol al 70 durante un minuto y por uacuteltimo se lavaraacuten con agua destilada todo dentro de la

campana de flujo

Las cuatro secciones de hoja se transfirieron a una caja de Petri para un total de 15 cajas

de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA) (una caja de Petri por cada 4 cortes de hoja)

Posteriormente las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente (25degC aproximadamente)

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en medio de

cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelial caja de Petri de 20ml de capacidad

Pasadas 3 semanas se revisaron los cultivos fuacutengicos con el fin de revisar el crecimiento

del micelio y hacer un repique a un cultivo puro una vez maduros se procedioacute a utilizar la teacutecnica

de corte de hifa uacutenica (Osorio et al 2017) esta teacutecnica consistioacute en tomar la punta de la hifa con

ayuda de un estereoscopio y un bisturiacute de grado quiruacutergico agua destilada alcohol al 70 y un

mechero para mantener el bisturiacute esterilizado una vez identificada la hifa ideal para cultivar de

forma pura (veacutease figura 6) con el bisturiacute se procedioacute a cortar el agar PDA en forma de cuadro

con una medida aproximada de 3 miliacutemetros cuadrados

31

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la teacutecnica de

corte de hifa uacutenica

Se esperoacute entre 3 a 5 semanas a que crecieran los cultivos puros aislados de las hifas uacutenicas en

nuevas cajas de Petri con agar PDA

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos endoacutefitos)

Los hongos cultivados de forma pura consiguieron un crecimiento micelial significativo a partir

de los 15 diacuteas a temperatura ambiente como lo demuestra la figura 7 que contiene doce de los

cultivos maacutes representativos con su respectivos micelios aeacutereos desarrollados donde variacutean sus

colores formas y consistencias esto indicando que pertenecen a diferentes especies

2

1

3

32

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de cultivo

Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12) aislados de las

hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

5 Extraccioacuten de ADN

4

5

6

7

8

9

10

11

12

33

Una vez el micelio de los hongos se encontraba desarrollado en la cantidad necesaria se

procedioacute a extraer el ADN genoacutemico siguiendo el protocolo de extraccioacuten de Raeder y Broda

(1985) por medio de un barrido superficial del micelio evitando tomar el agar este micelio

posteriormente se colocoacute en tubos Eppendorf esteacuteriles de 2 ml y se pulverizoacute mediante el uso de

un asa microbioloacutegica y 1ml de buffer de extraccioacuten compuesto de Tris-HCL 1 M pH 78 EDTA

05 M Ph 8 SDS 10 wv NaCL y agua destilada para cada tubo a continuacioacuten se agregoacute 800

ul de etanol al 70 500 ul de fenol y se mezcloacute

Se adicionoacute 300 ul de cloroformo y se mezcloacute de nuevo de alliacute se llevoacute a la centrifuga a

10000 rpm por 60 minutos luego de centrifugar se forma un sobrenadante el cual es transferido

en su totalidad a un nuevo tuvo Eppendorf de 15 ml en el cual se agregaron 400 ul de cloroformo

y se llevoacute a la centrifuga a 10000 rpm por 10 minutos en donde nuevamente se forma un

sobrenadante aunque esta vez solo se toman 500 ul del tubo para ser transferidos otro tubo

Eppendorf de 15 ml ya en el nuevo tubo se adicionaron 50 ul de NaAC y se invirtioacute varias veces

para homogenizar la mezcla a continuacioacuten se guardoacute en el refrigerador a 4degC toda la noche

Al diacutea siguiente se tomaron las muestras en los tubos Eppendorf y se centrifugaron a

10000 rpm por 30 minutos (Formacioacuten del Pellet de ADN) cuando la centrifuga terminoacute se

procedioacute a remover el etanol ya sin etanol se agregoacute de nuevo 1 ml de etanol al 70 a cada tubo

y se centrifugoacute a 10000 rpm por 5 minutos en este paso se removioacute el etanol y se dejoacute secar el

pellet de ADN una vez el etanol se evaporoacute se re suspendioacute el pellet en 100 ul de agua grado

molecular o Sabax con 5 ul de RNAsa con el fin de evitar la presencia de moleacuteculas de ARN

posteriormente se incubaron a 37degC por 30 minutos y se guardaron para su envioacute a -20degC

(Raeder y Broda 1985)

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengica

Una vez se secuenciaron las muestras de ADN enviadas a la Universidad Ruhr de

Bochum Alemania se hizo el ensamblaje de las secuencias en contigs y scaffolds en el

programa CLC Main Workbench 8 (Nicola et al 2013) Como lo muestra la figura 8 donde se

muestran los pasos esenciales de una teacutecnica de Metagenoacutemica donde posteriormente se

analizaron con maacutes detalle mediante teacutecnicas filogeneacuteticas

34

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemico Fuente Thomas y colaboradores (2012)

7 Secuenciamiento

Se extrajoacute con eacutexito un total de 35 muestras de hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

Espeletia hartwegiana (veacutease figura 9) que posteriormente fueron secuenciadas por la

Universidad Ruhr de Bochum (Alemania) logrando un total de 70 secuencias incluyendo

aquellas obtenidas en Genk Bank

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de frailejoacuten

Espeletia hartwegiana

35

8 Anaacutelisis Filogeneacutetico

Se aislaron 35 secuencias basadas en la especie Espeletia hartwegiana fueron

comparadas posteriormente con 35 secuencias de especies publicados en GenBank

(httpblastncbinihgovblastcgi) se obtuvo un total de 70 secuencias Las secuencias de

consenso ITS 58S DNA obtenidas se usaron para realizar buacutesquedas BLAST en GenBank

usando BLASTn (Altschul et al 1990) con el fin de identificar mediante las secuencias aisladas

los geacuteneros o las especies maacutes cercanas La matriz de datos fue alineada en MAFFT v7 (Katoh y

Standley 2013) Se utilizaron las especies Coprinellus xanthothrix y Coprinellus domesticus

como grupos externos

Los anaacutelisis de las secuencias para construir los arboles filogeneacuteticos de Maacutexima

Parsimonia (MP) fueron realizados usando PAUP v40b10 (Swofford 2003) Para el anaacutelisis de

Maacutexima Verosimilitud o ML por sus siglas en ingleacutes (Maximum Likelihood) se utilizoacute

JmodelTest (Darriba et al 2012) con el cual se infirieron los criterios del modelo de sustitucioacuten

apropiado utilizando los criterios de informacioacuten de Akaike (AIC) (Akaike 1974)

Los anaacutelisis de ML se realizaron con el programa PhyML v 30 (Guindon y Gascuel

2003) teniendo en cuenta la proporcioacuten de sitios invariables Los valores de soporte de confianza

para los nodos se estimaron mediante 1000 anaacutelisis de arranque de replicacioacuten La alineacioacuten de

los datos de la secuencias de ITS para 70 aislamientos determinoacute quince geacuteneros siendo los

siguientes Annulohypoxylon Biscogniauxia Colletotrichum Crassiparies Cryptocoryneum

Cyphellophora Diaporthe Daldinia Humiacutecola Hypoxylon Hypocrea Nemania Nigrospora

Massarina y Trichoderma de los cuales se obtuvieron 11 clados principales (veacutease figura 10)

Con base en estos resultados todos los aislamientos se analizaron maacutes a fondo dentro de los

geacuteneros hasta llegar a especie (veacutease tabla 1)

36

Geacuteneros Especie Especie Especie Especie Especie Especie Especie

Annulohypoxylon A nitens A bahnphaden

gense

Biscogniauxia B petrensis

Colletotrichum C gloeosporioides

C gigasporum

Cyphellophora C

reptans

Crassiparies C quadrisporus

Cryptocoryneum C

longicondensatum

Daldinia D dennisii D

eschscholtzi

D

conceacutentri

ca

Diaporthe D

longicolla

D

foeniculina

D

anacardi

i

D

macada

miae

Humiacutecola H

fuscoatra

Hypoxylon H

trugodes

H

pulicicidum

Hypocrea H

koningii

Massarina M albocarnis

Nemania N

primolutea

Nigrospora N sacchari N rubi N sphaeric

a

N hainanen

sis

N oryzae

N gorlenko

ana

N aurantia

ca

Trichoderma T trixiae T

olivascens

T

paraviridescens

T

viridescens

T

samuelsii

T viride

Grupo Externo Coprinellus C

domesticus

C

xanthothrix

Tabla 1 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos endoacutefitos en la

especie Espeletia hartwegiana

37

38

Figura 10 Filograma consenso obtenido con el programa MEGA ndashX a partir del anaacutelisis ML y MP del

conjunto de datos ITS Aislados de las hojas de frailejoacuten Los coacutedigos en Verde son las secuencias que se

aislaron (aislados) en este estudio los coacutedigos y nombres en Negro son las secuencias encontradas por

identidad en GenBank Los valores de soporte de bootstrapgt 70 se indican cerca de los nodos como MP

ML = valores de soporte de bootstrap lt70

El nuacutemero de caracteres los modelos de sustitucioacuten usada asiacute como otros resultados

estadiacutesticos de las pruebas de Maacutexima Parsimonia y Maacutexima Verosimilitud generados a partir de

los anaacutelisis filogeneacuteticos de los conjuntos de datos se muestran en los anexos

39

Capiacutetulo Tercero

Discusioacuten sobre los hongos endofitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicas

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidad de Endoacutefitos

Tanto la temperatura la estacionalidad y los tipos de precipitacioacuten son factores de vital

importancia para la composicioacuten de las diferentes comunidades y la arquitectura vegetal Estos

factores limitan muchos de los procesos ecosisteacutemicos ya que existe una estrecha relacioacuten entre

las variaciones climaacuteticas y las variaciones dentro de los ecosistemas Por lo tanto se espera que

el cambio climaacutetico transforme los ecosistemas Andinos tal como los conocemos hoy (Colwell et

al 2008) modificando las relaciones mutualistas entre plantas y hospederos

Posiblemente la resiliencia y resistencia de muchos ecosistemas como el paacuteramo sean

superadas en este siglo por una combinacioacuten sin precedentes de disturbios tales como el cambio

climaacutetico perturbaciones asociadas a este (sequiacuteas fuegos invasioacuten de especies exoacuteticas

inundaciones) y otros factores como organismos oportunistas (hongos endoacutefitos) cambios en el

uso del suelo contaminacioacuten y sobreexplotacioacuten de recursos (IPCC 2020)

Considerando que el frailejoacuten Espeletia hartwegiana es una especie de alta montantildea

(paacuteramos) endeacutemica de la cordillera Central de los Andes (Schultz y Carl 1856) se encuentra

dentro de los ecosistemas andinos en donde a su vez se ha comprobado la existencia de los

hongos endoacutefitos es de tener en cuenta el papel de estos organismos endoacutefitos ya que los

paacuteramos son ecosistemas particularmente sensibles a los efectos adversos del cambio climaacutetico

en especial al calentamiento global al estar ubicados en los troacutepicos generando asiacute ventanas de

40

oportunidades para que los hongos endoacutefitos alteren su estado mutualista y pasen a ser

patogeacutenicos (Colwell et al 2008 7)

No obstante existe consenso en que las temperaturas aumentaraacuten especiacuteficamente a

grandes alturas y que la precipitacioacuten posiblemente se incrementaraacute en algunas zonas disminuiraacute

en otras y se produciraacute en patrones estacionales alterados con mayor intensidad y frecuencia

(Marengo et al 2009)

Los frailejones se ven en constante estreacutes por el uso del suelo dado en los paacuteramos como

es el caso del paacuteramo Romerales un paacuteramo que se ha visto afectado por las quemas y la

ganaderiacutea (Molinillo y Monasterio 2001) Esto aumenta asiacute las condiciones de estreacutes intriacutensecas a

las que estaacuten expuestas estas plantas de paacuteramo las cuales suministran valiosos bienes y servicios

ecosisteacutemicos como el abastecimiento continuo de agua para usos domeacutesticos agriacutecolas e

industriales (Buytaert et al 2006 4) servicios que se podriacutean ver en decrecimiento si las

ventanas de oportunidades se abren con maacutes frecuencia dando pie al cambio de estado de los

hongos endoacutefitos que existen dentro de los frailejones de la zona

En los paacuteramos de Chingaza Rabanal Guerrero Iguaque Merchaacuten y Sumapaz se han

realizado estudios de aislamientos de hongos en especies de frailejoacuten diferentes a la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana tales como Espeletia argentea Espeletia arbelaezii Espeletia

boyacensis Espeletia grandiflora Espeletia miradorensis y Espeletia uribei por ende se ha

reportado la presencia de hongos endoacutefitos y fitopatoacutegenos (Tabla 2) (Gaitan 2018 17)

Frailejones Espeletia

argentea

Espeletia

arbelaezii

Espeletia

boyacensis

Espeletia

grandiflora

Espeletia

miradorensis

Espeletia

uribei

Aspergillus X X X X

Annulohypoxylon X X X

Curvularia X X X

Epicoccum X X X

Fusarium X X X

41

Tabla 2 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = a presencia del genero de

hongo dentro de la especie de frailejoacuten

Los geacuteneros de hongos en rojo son los geacuteneros que se encontraron en comuacuten con los

geacuteneros hallados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana de un total de 15 geacuteneros 3

han sido reportados anteriormente en estudios similares ( 20 de geacuteneros identificados)

Dentro de un marco de cambio climaacutetico es importante la metodologiacutea de muestreo

como lo fue el formato de muestreo en puntos aleatorios realizado en el presente estudio se llevoacute

acabo principalmente por la homogeneidad de los frailejones en el paacuteramo como lo indica el

manual de meacutetodos baacutesicos de muestreo y anaacutelisis de ecologiacutea vegetal (BOLFOR 2000 9) donde

se menciona que el muestreo aleatorio se utiliza cuando se dispone de poca informacioacuten previa de

las caracteriacutesticas de las poblaciones a medirse en este caso la poblacioacuten a identificarse fueron

los hongos endoacutefitos que se hallaban dentro de las formaciones homogeacuteneas de los frailejones

No obstante el muestreo aleatorio tambieacuten presenta limitaciones a la hora de comparar los

hongos endoacutefitos a lo largo del gradiente altitudinal (muestreo aleatorio estratificado) dejando de

percibir informacioacuten proveniente de los distintos microclimas que se encuentran y de las

incidencias que podriacutean causar a la hora de identificar los geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten ademaacutes de posibles micro efectos del cambio climaacutetico a lo

largo del gradiente altitudinal (Caacutemara et al 2008)

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio Climaacutetico

Nigrospora X X X X X

Penicillium X X X

Pleospora X X X X

Trichoderma X X X X

42

Las teacutecnicas empleadas en este estudio para lograr aislar e identificar los hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana se hacen importantes dentro del cambio

climaacutetico debido a que el margen de error en la identificacioacuten molecular es reducido (Bakermans

et al 2014) Al ser reducido el margen de error se pudo conocer con mayor certeza que especies

y geacuteneros de hongos endoacutefitos se encuentra dentro de la planta

Al conocer sus identidades es posible conocer las capacidades que tienen cada una de

estas especies de hongos endoacutefitos de producir metabolitos secundarios de infiltrarse y proteger

los tejidos de la planta de condiciones bioacuteticas y abioacuteticas competir contra herbiacutevoros y

fitopatoacutegenos (Schulz et al 2002) Con sus capacidades reconocidas es posible vincular los

efectos del cambio climaacutetico como estreacutes hiacutedrico aumento de la temperatura migraciones

tempranas enfermedades emergentes aumentos de la precipitacioacuten y heladas severas con las

reacciones por parte de los hongos endoacutefitos Estas reacciones podriacutean desencadenar aumentos de

la patogenicidad en las poblaciones de frailejones debido a los constantes disturbios y estreacutes al

que se ve sometido la planta generando asiacute notables declives poblacionales (Mendoza 2010)

Las relaciones filogeneacuteticas entre las especies halladas toman relevancia debido a las

sinergias positivas o negativas que se pueden presentar dependiendo de las especies que se

encuentren asociadas dentro de la planta (Lamichhane y Venturi 2015) como por ejemplo

Nigrospora y Colletotrichum pueden activar una sinergia negativa aumentando la virulencia y

afectando la especie Espeletia hartwegiana

Las especies de hongos endoacutefitos se identificaron por medio de secuencias obtenidas de

las regiones ITS (regioacuten de espaciadores internos transcritos) las cuales son regiones altamente

conservadas con tasas de evolucioacuten muy lentas en el tiempo permitiendo hacer inferencias

filogeneacuteticas (Baldwin et al 1995 Hamby y Zimmer 1992) es por ello que se usaron para

generar las diferentes identificaciones de los hongos endoacutefitos logrando asiacute identificar al geacutenero

Nigrospora con un total de 7 especies N sacchari N rubi N sphaerica N hainanensis N

gorlenkoana N oryzae y N aurantiaca pertenecientes a la familia Apiosporaceae orden

Xylariales Divisioacuten Ascomicota (veacutease figura 11) (Wang et al 2017)

Dentro del marco del cambio climaacutetico Nigrospora se caracteriza por poseer una

distribucioacuten cosmopolita y una amplia gama de hueacutespedes como lo es en este caso la especie E

hartwegiana que habita en los Andes Tropicales que se veraacuten alterados por los efectos del

cambio climaacutetico este geacutenero se ha logrado aislar en su forma endoacutefita en tallos y hojas de

43

diversas plantas tambieacuten como saprofitos en detritos hojarasca y larvas muertas (Uzor et al

2015 1)

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

Los hongos endoacutefitos hallados en esta investigacioacuten se encontraron dentro de la especie

de frailejoacuten E hartwegiana la cual pertenece a los Andes Tropicales ubicados maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos Estos ecosistemas son sensibles a los efectos del cambio

climaacutetico por su altura su alto endemismo y su sensibilidad al efecto de borde Cuando las

especies lentildeosas empiecen a migrar a lo largo del gradiente altitudinal es posible que los

frailejones se encuentren con suelos agrestes en donde sus semillas no podraacuten fijarse y los efectos

adversos de hongos como Nigrospora N oryzae y N sphaerica seraacuten maacutes notables

aprovechando las ventanas de oportunidad que generen los desbalances climaacuteticos (Sharma et al

2013)

Los cambios en los patrones climaacuteticos potenciaran la especie N sphaerica dentro del

frailejoacuten la cual tiene la capacidad de causar tizoacuten foliar en la especie Camellia sinensis siendo

una planta de teacute perteneciente a la divisioacuten de las magnolifiotas como el geacutenero Espeletia (Liu et

al 2015) Nigrospora fue el geacutenero maacutes ampliamente aislado en las identificaciones generadas a

partir de las hojas de frailejoacuten esto se veriacutea explicado debido a que N sphaerica tiene un

mecanismo de descarga de esporas efectivo que puede proyectar a la fuerza sus esporas a una

distancia de hasta 2 cm en vertical y 68 cm en horizontal como lo demostroacute Webster (1952)

ademaacutes el estudio de Wu y colaboradores (2004) tambieacuten evidencioacute que las esporas de

44

Nigrospora son uno de los grupos maacutes dominantes en la atmoacutesfera y estaacuten asociadas con

tormentas de polvo

La gran capacidad colonizadora del geacutenero Nigrospora le permite adaptarse a las

condiciones climaacuteticas cambiantes con la estrategia de dispersioacuten de sus esporas logrando

distanciarse del frailejoacuten hospedero para encontrar nuevos hospederos producto de las

migraciones tempranas a lo largo del gradiente altitudinal (Riveros 2010)

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

por encima del 80 lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen menos

mutaciones en los nodos internos del aacuterbol basados en la distribucioacuten de probabilidad asignadas

a los posibles arboles resultantes dando lugar a una hipoacutetesis evolutiva maacutes confiable (Schmidt y

Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 es decir el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes

corto (menos cambios) y el cual se ajusta mejor a los datos (Swofford 1997)

Teniendo asiacute una inferencia filogeneacuteticamente robusta los geacuteneros Collectotrichum y

Nigrospora pertenecen a la Divisioacuten Ascomycota ambos geacuteneros son particularmente agresivos

con las plantas en especial la especie Colletotrichum gloeosporioides la cual es la fase asexual

de Glomerella cingulata (Raj et al 2013) Se caracteriza por tener un amplio rango de

hospederos entre ellos el frailejoacuten a los cuales les causa una enfermedad conocida pudricioacuten

amarga antracnosis o chancros siendo esta la necrosis de frutos flores nervios y tallos

(Gonzaacutelez et al 2006 4)

Uno de los primeros reportes de afectaciones a especies de frailejoacuten se obtuvo en el 2009

en el Parque Natural Nacional Chingaza Colombia en donde encontraron las especies de

frailejoacuten Espeletia grandiflora y Espeletia uribei afectadas debido a insectos y una especie de

hongo del genero Colletotrichum (Medina 2009- 9 Hartung y Burton 1981)

Por ende que estos dos geacuteneros de hongos se encuentren juntos podriacutea tener

implicaciones en el aumento de virulencia potenciado a su vez por los desbalances abioacuteticos

causados por el cambio climaacutetico como lo han mencionado Belisario y colaboradores (2002) es

posible que las afectaciones no sean producidas por un uacutenico hongo si no por un complejo de

varios generando sinergismos entre diferentes especies que solas no hariacutean dantildeo a la planta pero

juntas podriacutean ser causantes de enfermedad (Lamichhane y Venturi 2015 4) aun mas en un

45

marco de cambio climaacutetico que gradualmente aumenta sus efectos nocivos sobre los paacuteramos

aumentando la temperatura cambios en la precipitacioacuten heladas intensas cambios en la

nubosidad mayor exposicioacuten a la radiacioacuten solar teniendo por resultado un iacutendice de estreacutes

mayor en las plantas de paacuteramo generando ventanas de oportunidades para que los hongos

endoacutefitos modifiquen sus roles de protector a patoacutegeno

En frailejones tambieacuten se ha reportado la presencia de Nigrospora y Trichoderma por

Bonilla y Argenis (2005) maacutes especiacuteficamente en la especie Espeletia grandiflora la cual es una

especie que habita en los paacuteramos de Colombia Ecuador y Venezuela en conjunto con Espeletia

hartwegiana (Luteyn 1999 3) El hecho que existan estos dos geacuteneros presentes en los frailejones

advierte de un equilibrio entre hongos endoacutefitos que se puede romper bajo las tensiones del

cambiante clima maacutes aun en los sensibles paacuteramos alto andinos

En cuanto a N sacchari se tiene reporte que es un productor de metabolitos con una

notable actividad herbicida demostrado en plantas cultivadas en invernadero (Fukushima et al

1998 2) debido a que existe evidencia que sugiere que los hongos endoacutefitos han evolucionado

directamente de hongos patoacutegenos (Schulz et al 1999 4) sumado al estreacutes del cambio climaacutetico

en cualquier momento de extrema tensioacuten hiacutedrica caloacuterica o heladas en estos ecosistemas de alta

montantildea Estos anomaliacuteas ambientales podriacutea disparar mecanismos de accioacuten fitopatoacutegenos

dentro de los frailejones generando un declive notable en sus poblaciones y por ende un declive

de la cantidad recurso hiacutedrico aguas abajo y su regulacioacuten (Diacuteaz et al 2002 5)

Como se mencionoacute anteriormente los medios de propagacioacuten de estos hongos endoacutefitos

pueden ser por medio de esporas que estaacuten en el ambiente aunque tambieacuten los vectores que

juegan un rol clave en su dispersioacuten son los insectos ya que estos pueden transportar esporas o

partes del hongo en su cuerpo patas o aparato bucal (Eigenbrode et al 2018 5)

Considerando la dispersioacuten homogeacutenea de los frailejones dentro del paacuteramo la carga

esporas en el ambiente y la herbivoriacutea de insectos es probable que se puedan ver infectados la

mayoriacutea de individuos (Varela 2016) es por ello que en el futuro puede que las afectaciones en

frailejones no sean producidas por hongos fitopatoacutegenos si no por hongos endoacutefitos que tuvieron

la ventana de oportunidad gracias al cambio climaacutetico aumento de la temperatura aumento en

las concentraciones de CO2 y alteraciones de precipitacioacuten que pueden hacer susceptible la planta

al ataque de estos hongos (Chakraborty 2011 Elad y Pertot 2014)

46

Para que se genere la enfermedad esta depende de la interaccioacuten de tres o cuatro factores

1) hospedero susceptible 2) agente causal (virulento) 3) condiciones ambientales favorables y 4)

tiempo (Francl 2001 2) la falta de alguno de ellos no permite que el patoacutegeno produzca la

enfermedad en la planta debido a ello algunas especies de frailejoacuten pueden tener una o dos cepas

que puedan actuar como fitopatoacutegenos pero no estaacuten activas si no estaacute completa su asociacioacuten

con otro patoacutegeno u otro factor

Ademaacutes existe un estudio que evaluoacute el efecto de la temperatura sobre la capacidad de

Fusarium verticillioides para generar infeccioacuten en plantas de maiacutez se probaron bajo 3 escenarios

de temperatura como resultados obtuvieron que la enfermedad de este hongo se veiacutea potenciada

por el aumento de temperatura en temperaturas por encima de 35degC (Murillo et al 2008) este

estudio da soporte a la hipoacutetesis de que existen factores que influyen significativamente a la

infeccioacuten en la planta tal vez el paacuteramo difiacutecilmente alcance 35degC no obstante la mayoriacutea de

especies son sensibles a cambios de temperatura de hasta de 1degC en donde modifican su

comportamiento rutas metaboacutelicas interacciones ecoloacutegicas y por ende sus defensas se ven

alteradas

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e Hypocrea

El geacutenero Trichoderma con seis especies diferentes (veacutease figura 12) fue el segundo

geacutenero maacutes numeroso despueacutes de Nigrospora que contoacute con siete especies aunque las primeras

especies que se analizaron fueron especies que principalmente actuaban generando enfermedades

en las plantas en las que se encontraban ante disturbios el geacutenero Trichoderma pertenece a la

47

familia Hypocreaceae y se caracteriza por tener una gran capacidad biocontroladora sobre

fitopatoacutegenos como Fusarium oxysporum los cuales podriacutean llegar masivamente con las

migraciones tempranas de insectos y plantas lentildeosas (Miles et al 2012 7)

No solo actuacutean repeliendo patoacutegenos internos si no tambieacuten patoacutegenos externos como

insectos que desean consumir u aprovechar la planta ya que estos pueden secretar diferentes

metabolitos secundarios y enzimas que actuacutean inhibiendo su desarrollo (Boughalleb-M et al

2018 8)

Es bien conocido que el geacutenero Trichoderma produce amplio rango de sustancias

antibioacuteticas ademaacutes de poseer la caracteriacutestica de parasitar otros hongos (Howell 2002 6)

Debido a la competencia que generan las especies del genero Trichoderma por espacio y

nutrientes inhiben o degradan pectinasas y otras enzimas que son esenciales para que los hongos

fitopatoacutegenos como Botrytis cinerea penetre en la superficie de las hojas logrando proteger de

esta forma al frailejoacuten que se veraacute expuesto a nuevas amenazas microbioloacutegicas auspiciadas por

los cambios en los patrones climaacutetico (Zimand et al 1996)

Ademaacutes de la capacidad del Trichoderma sp para atacar o inhibir el crecimiento de

patoacutegenos de plantas directamente descubrimientos recientes indican que tambieacuten pueden inducir

resistencia sisteacutemica y localizada a una variedad de patoacutegenos de plantas tales como el frijol es

protegido por Trichoderma harzianum de especies fitopatoacutegenas como Colletotrichum

lindemuthianum Botrytis cineacuterea las cuales producen lesiones en las hojas de la planta (Harman

y Howell 2004) Incluso se descubrioacute que ciertas especies de Trichoderma tienen una influencia

sustancial en el buen crecimiento y desarrollo de las plantas sin y con condiciones de estreacutes

climaacutetico (Lorito 1998)

Como lo demostraron Bonilla y Argenis (2005) en su estudio llevado a cabo en el

frailejoacuten Espeletia grandiflora diferentes cepas pertenecientes a Trichoderma pueden proteger

esta especie de paacuteramo de organismos fitopatoacutegenos emergentes por el cambio climaacutetico por

ende si puede proteger a E grandiflora tambieacuten puede proteger la especie E hartwegiana lo

que le permitiraacute sobrellevar diferentes ataques fortuitos de patoacutegenos e insectos que nunca han

logrado alcanzar las altitudes de paacuteramo (3200 - 5000 m)

Cuando el cambio climaacutetico aumente la temperatura en 1degC o 2degC traeraacute consigo sus

efectos de modificacioacuten en cuanto a la estructura y composicioacuten de las especies de plantas que

48

existen en zonas altas para este escenario basado en los caacutelculos de Thuiller (2007) las especies

se habriacutean desplazado en el gradiente altitudinal aproximadamente 450 metros para el antildeo 2070

Las consecuencias de este desplazamiento serian uacutenicas debido a que gran cantidad de

insectos y patoacutegenos tendriacutean migraciones tempranas en el gradiente altitudinal en buacutesqueda de

su optimo teacutermico llevando a cabo un proceso conocido como Termofilizacioacuten (Cuesta et al

2019) es ahiacute donde entra en juego la proteccioacuten que le pueden brindar especies endoacutefitos como

las que pertenecen al geacutenero Trichoderma en el marco de cambio climaacutetico

En concordancia con las cepas de Trichoderma y el geacutenero Hypocrea que tambieacuten

pertenece a la familia Hypocreaceae se conocen maacutes de 700 secuencias de peptaiboles (peacuteptidos

bioloacutegicamente activos) de ambos geacuteneros donde algunos de eacutestos son ecoloacutegica y

comercialmente relevantes debido a su potencial antimicrobiano actividad enzimaacutetica uacutetil para

competir por espacio y alimento de los nuevos patoacutegenos emergentes procedentes de las

alteraciones climaacuteticas y las migraciones tempranas (Degenkolb et al 2008 6)

En cuanto al geacutenero Hypocrea tambieacuten se ha reportado actividad antimicrobiana y anti

fuacutengica contra Staphylococcus aureus y Fusarium oxysporum (Gogoi et al 2008 2) habitando

los geacuteneros Trichoderma e Hypocrea dentro de especies de frailejoacuten como E hartwegiana se

espera que puedan generar sinergias de proteccioacuten que las ayude a combatir los fuertes y

extremos eventos climaacuteticos

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

del 100 (veacutease figura 13) lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen

menos mutaciones en los nodos internos del aacuterbol por ende este aacuterbol contiene la menor

cantidad de mutaciones o cambios dentro sus nodos internos teniendo como resultado una

hipoacutetesis evolutiva confiable (Schmidt y Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 que

indica que el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes corto (menos cambios) y el cual se ajusta

mejor a los datos (Swofford 1997)

49

El geacutenero Annulohypoxylon es de importancia dentro del marco del cambio climaacutetico ya

que pertenece a la familia Xylariaceae y se caracteriza por poseer metabolitos secundarios

antitumorales-citotoacutexicos como la anuloescuamulina que ayudan a combatir el estreacutes abioacutetico

(Cheng et al 2012) estas cepas de hongos son principalmente saprofitos y oportunistas han sido

reportadas en hojas sanas y afectadas de frailejones en otros estudios (Gonzaacutelez 2012 Nonsoque

2012) siendo un geacutenero resiliente a las perturbaciones ambientales como los cambios en los

patrones climaacuteticos su relacioacuten como mutualista dentro del frailejoacuten se mantendraacute hasta que el

frailejoacuten se adapte o colapse ante el estreacutes abioacutetico

Aunque no se conocen como fitopatoacutegenos al contrario pueden actuar como mutualistas

no se descarta que puedan estar involucrados en el desarrollo de diferentes enfermedades en

plantas cuando las condiciones ecosistemicas se alteran a puntos extremos (Gonzalez et al 2017)

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon Biscogniauxia

Nemania y Humiacutecola

El geacutenero Daldinia posee unos valores de MPML correspondientes a 10094 con lo cual

se encuentra bien soportado estadiacutesticamente el geacutenero Daldinia se encuentra ubicado en la

familia Xylariaceae al igual que el geacutenero Hypoxylon Biscogniauxia y Nemania que en su

respectivo orden contienen un soporte estadiacutestico MPML de 10082 10099 y 100100 (veacutease

figura 14) los cuales pertenecen a la divisioacuten Ascomycota las cepas de Daldinia se caracterizan

principalmente por ser especies endoacutefitas teniendo la capacidad de estar dentro de su hueacutesped

mucho tiempo sin causarle dantildeo o al menos un dantildeo evidente por medio de su estado asexual

50

No obstante su estado se puede modificar cuando las condiciones externas se modifican

abruptamente en poco tiempo como es el caso de las alteraciones en la temperatura

precipitacioacuten y concentraciones de dioacutexido de carbono (CO2) auspiciados por el cambio

climaacutetico (Saacutenchez et al 2013)

Un estudio realizado por Prieto (2017) en la especie de frailejoacuten E grandiflora encontroacute

que la especie Daldinia eschscholtzii estaba asociado en el siacutentoma de clorosis (falta de clorofila

en las hojas) Tambieacuten se reportoacute que especies de Daldinia como Daldinia conceacutentrica tienen la

capacidad de controlar nematodos fitopatoacutegenos (Silva et al 2020 104) los cuales pueden invadir

y romper los tejidos de la planta dantildeando sus estructuras los nematodos tambieacuten seraacuten sujetos a

migraciones tempranas por el cambio climaacutetico que trae consigo presiones de seleccioacuten por ende

nuevas amenazas para los frailejones (Nakashima et al 2007)

Como hemos visto hasta este punto las especies de hongos endoacutefitos se muestran en

muchos casos como benefactores y protectores de las diferentes plantas en las que habitan

incluyendo diferentes especies de frailejones

Los hongos endoacutefitos protegen tanto de factores bioacuteticos como virus hongos

fitopatoacutegenos bacterias insectos y factores abioacuteticos como las intemperancias del clima no

obstante en su relacioacuten endoacutefita geacuteneros como Hypoxylon que pertenece igual que Daldinia a la

familia Xylariaceae pueden tener roles amenazadores en conjunto con el cambio climaacutetico

seguacuten Gonzales y colaboradores (2019) inocularon cepas pertenecientes al geacutenero Hypoxylon en

hojas de Theobroma cacao y encontraron que en 48 horas se comenzoacute a notar las marcas de

clorosis y deshidratacioacuten foliar esto demuestra que cepas de este geacutenero pueden tener efectos

fitopatoacutegenos ocasionando muerte descendente pudricioacuten del tronco negro y resinosis de ramas

de mezquite (De la Torre-Almaraacutez et al 2003 De la Torre-Almaraacutez et al 2009)

La presencia de este geacutenero dentro del frailejoacuten en un marco del cambio climaacutetico lo

convierte en una amenaza latente ya que las condiciones seraacuten cada vez maacutes agrestes en los

paacuteramos de los Andes Tropicales Puede favorecer el desarrollo de este geacutenero que tiene las

enzimas necesarias para producir la pudricioacuten del tronco negro entre otras enfermedades

relevantes

51

Tambieacuten las especies del geacutenero Hypoxylon se han reportado como endoacutefitos en tejidos de

plantas lentildeosas o herbaacuteceas (Petrini y Petrini 1985 3) asiacute como saprofitos o fitopatoacutegenos

deacutebiles en madera de aacuterboles de zonas templadas o tropicales (Miller 1961) como lo menciona

Miller (1961)

Los geacuteneros Biscogniauxia Nemania tambieacuten estaacuten dentro de la familia Xylariaceae y

Divisioacuten Ascomycota un aspecto interesante de las especies de Biscogniauxia es que son

paraacutesitos exclusivos de las angiospermas dicotiledoacuteneas en donde concluyeron que todas las

especies pertenecientes a este geacutenero son patoacutegenos umllevesuml que se aprovechan de situaciones de

sequiacutea y estreacutes hiacutedrico para aumentar su patogenicidad (Ju et al 1998)

La especie de frailejoacuten E hartwegiana es una Dicotiledoacutenea eso explica porque

podemos encontrar esta especie de hongo endoacutefito en el frailejoacuten del presente estudio siendo de

vital importancia denotar que las especies de Biscogniauxia se aprovechan especialmente de las

situacioacuten de sequiacutea y estreacutes hiacutedrico difiacutecilmente las especies de este geacutenero podriacutean afectar a los

frailejones debido a que se caracterizan por ser reguladores de los ciclos hiacutedricos el agua es el

recurso que maacutes tiende a existir en un paacuteramo por la estructura de sus suelos compuesta por

andosoles porosos y necromasa acumulada teniendo asiacute un alto iacutendice de retencioacuten hiacutedrica

(Hernandez y Muntildeoz 2015) de modo que el cambio climaacutetico no favorece al geacutenero

Biscogniauxia en su estado patogeacutenico dentro del ecosistema de paacuteramo

En cuanto al geacutenero Nemania Da Silva y colaboradores (2018) llevaron a cabo una

investigacioacuten en la cual identificaron cepas pertenecientes a los geacuteneros Colletotrichum

Phyllosticta Xylaria Nemania y Alternaria en la especie ornamental Pachystachys lutea en

donde las mismas cepas fueron ensayadas para inhibir el crecimiento de hongos fitopatoacutegenos

como Colletotrichum sp en donde encontraron que Nemania era capaz de inhibir por medio de la

secrecioacuten de distintas enzimas el crecimiento de dichas especies gracias a su actividad

enzimaacutetica el geacutenero Nemania puede compensar los desequilibrios causados por el cambio

climaacutetico en teacuterminos de hongos fitopatoacutegenos

Hay que tener en cuenta que los elementos que dan forma a las interacciones planta-

endoacutefito incluyen el modo de transmisioacuten el patroacuten de infeccioacuten la edad de la planta las

condiciones ambientales potenciadas por el cambio climaacutetico y los antecedentes geneacuteticos (Aly et

al 2011 6) Los frailejones de la especie E hartwegiana que se muestrearon para el estudio se

52

tomoacute las hojas sanas lo que indica que poseiacutean estas cepas de endoacutefitos en equilibrio siendo este

uno de los pocos reportes de este geacutenero en especies de alta montantildea en los Andes Tropicales

El geacutenero Humiacutecola se encuentra soportado por un MPML de 10076 siendo una

hipoacutetesis evolutiva considerable es el uacutenico de la figura 14 que no estaacute dentro de la familia

Xylariaceae ya que pertenece a la familia Chaetomiaceae aunque se halla en la divisioacuten

Ascomycota se podriacutea considerar a la especie Humiacutecola fuscoatra como una de las especies de

endoacutefitos maacutes umlinofensivasuml debido a trabajos de investigacioacuten reportados como el de Menzies y

colaboradores (1998) y el de Naik y colaboradores (2009)

Humiacutecola fuscoatra no se considera un peligro latente para la especie E hartwegiana ya

que existe en equilibrio con su entorno Estaacute comprobado por medio de caracterizaciones

quiacutemicas que Humiacutecola fuscoatra es un importante productor de moleacuteculas de estimacioacuten

medica como el resorciacuteclico y lactonas aacutecidas (Mejia et al 2014) Por lo tanto es una especie

prometedora con un reservorio de metabolitos secundarios de importancia medicinal e industrial

que de seguir los efectos nocivos del cambio climaacutetico en los Andes Tropicales maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos esta especie podriacutea desaparecer

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies Massarina

Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

Uno de los grupos mejores soportados en este cladograma es el grupo de Diaporthe en el

cual se encontraron cuatro especies siendo uno con maacutes abundancia de especies del estudio y que

posee un MPML de 10085 10089 y 10095 acorde a sus 3 nodos (veacutease figura 15) teniendo asiacute

una hipoacutetesis evolutiva confiable de estas relaciones las especies de Diaporthe pertenecen a la

familia Diaporthaceae de la divisioacuten Ascomycota y son especies de endoacutefitos que se distinguen

por inhibir el crecimiento de hongos patoacutegenos en el hospedero que se encuentren El estudio de

53

Da Silva y colaboradores (2018) mostroacute que cepas de Diaporthe sp Inhibieron el crecimiento de

Fusarium oxysporum y Colletotrichum sp hongos fitopatoacutegenos que aumentaran su presencia

aprovechando las alteraciones producidas por el cambio climaacutetico en los paacuteramos

Las especies de este geacutenero estaacuten en continuo cambio entre endoacutefitos y patoacutegenos

funcionando en la mayoriacutea de los casos en una relacioacuten mutualista en donde le brindan a la planta

mayor tolerancia a las sequias proteccioacuten de patoacutegenos y pestes caracteriacutestica uacutetil frente a los

retos ecoloacutegicos que plantea el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales (Hubbard et al 2014)

se conocen cerca de 800 especies de este geacutenero asociadas a una amplia gama de plantas

vasculares a nivel mundial (Rossman et al 2015)

Esto explica porque las especies de Diaporthe fueron una de las maacutes numerosas

encontradas en la especie de alta montantildea E hartwegiana teniendo en cuenta que esta especie

pasa raacutepidamente de un estado endoacutefito a un estado patogeacutenico y dada su faacutecil y alta distribucioacuten

representa un peligro en conjunto con el cambio climaacutetico para las especies de alta montantildea como

los frailejones y supone una amenaza para el balance hiacutedrico y ecosistemico en el futuro

El geacutenero Crassiparies de la familia Neohendersoniaceae y el geacutenero Massarina de la

familia Massarinaceae pertenecen al orden Pleosporales aunque se discute debido a las

similaridades morfoloacutegicas y genoacutemicas con Massarina si Crassiparies deberiacutea estar en la

familia Massarinaceae (Hyde et al 2013 4) Se tiene poca informacioacuten sobre la especie

Crassiparies quadrisporus por ende este puede ser uno de los primeros reportes de esta especie

en una especie de alta montantildea como lo es el frailejoacuten especiacuteficamente en la especie E

hartwegiana en un marco de cambio climaacutetico el geacutenero Crassiparies necesita mayores estudios

a nivel ecoloacutegico y microbioloacutegico para entender su papel dentro de esta crisis climaacutetica

Mientras tanto el geacutenero Massarina ha logrado ser aislado de agua dulce con el fin de

obtener fuentes de productos naturales bioloacutegicamente activos por medio de las investigaciones

quiacutemicas de Shearer (1999 2001) en una especie de Massarina obtuvieron como resultado el

aislamiento de tres nuevos sequiterpenoides y dos lactonas derivadas de policeacutetidos con nuevos

sistemas de anillos lo que indica que esta especie tambieacuten puede tener un rol importante

mediante la produccioacuten de enzimas y metabolitos secundarios en el marco de las invasiones

bioloacutegicas impulsadas por el cambio climaacutetico

54

El geacutenero Cryptocoryneum de la familia Cryptocoryneaceae existe poca informacioacuten de

sus mecanismos de accioacuten como endoacutefito o patoacutegeno maacutes aun en especies de los Andes

Tropicales este podriacutea ser uno de los primeros reportes sobre esta especie de hongo en una

especie de frailejoacuten especiacuteficamente E hartwegiana en el 2015 se reportoacute en Brasil el

descubrimiento de una nueva especie del genero Cryptocoryneum trataacutendose de Cryptocoryneum

parvulum hallada en las hojas de la especie Araucaria angustifolia (Gimnosperma) (Silva et al

2015 1) la informacioacuten sobre el geacutenero Cryptocoryneum en relacioacuten al cambio climaacutetico y sus

efectos dentro de especies de alta montantildea como el frailejoacuten auacuten son poco conocidas

Uno de los geacuteneros maacutes cercanos a los grupos externos del cladograma es Cyphellophora

perteneciente a la familia Cyphellophoraceae el cual posee un MPML de 10091 logrando una

hipoacutetesis evolutiva confiable Diversas especies de Cyphellophora han logrado ser aisladas de

infecciones superficiales de la piel o las untildeas en humanos y de materiales vegetales (Decock et

al 2003 Cheewangkoon et al 2009) Esto indica su amplia distribucioacuten y su capacidad para ser

patogeacutenica tanto en plantas como en animales maacutes aun en condiciones desfavorables para la

planta como son las condiciones de cambio climaacutetico

De la especie Cyphellophora reptans se tiene reporte que su morfologiacutea es muy similar a

la de una levadura por lo que es faacutecilmente confundida con una (Reacuteblovaacute et al 2013) Es posible

que este sea el uacutenico reporte de Cyphellophora reptans en las hojas de un frailejoacuten o especie de

alta montantildea que habite en los troacutepicos como E hartwegiana debido a ello sus mecanismos de

accioacuten en especies de paramo dentro de un marco de cambio climaacutetico es poco conocido Se

necesitan mayores estudios enfocados en esta especie para entender su ecologiacutea y dinamismo

ecoloacutegico respecto a los cambios en las variables ambientales

Se eligieron las especies Coprinellus domesticus y Coprinellus xanthothrix como grupos

externos con el fin de enraizar el aacuterbol debido a que pertenecen a la Divisioacuten Basidiomycota la

cual difiere en grado de la divisioacuten Ascomycota aunque conserva semejanzas conocidos como

caracteres ancestrales o plesiomorficos que avanzan a medida la filogenia se construye con los

datos de las diferentes secuencias de especies evidenciando novedades evolutivas conocidas

como apomorfias que cuando se dan en un grupo en particular pasan a ser sinapomorfias es decir

novedades evolutivas dentro de un grupo particular (Lehtonen 2020) Se optoacute por enraizar con

55

estas dos especies con el objetivo de dar robustez al aacuterbol filogeneacutetico (Barriel y 1998) lo cual se

consiguioacute como se nota en los estadiacutesticos del aacuterbol filogeneacutetico

56

57

Conclusiones

Se rechaza la hipoacutetesis nula (H0) y se concluye que la identificacioacuten y caracterizacioacuten

molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo Colombia es diferente en 80 de sus geacuteneros y

especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos realizadas en especies de frailejoacuten

Por lo tanto los nuevos geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos encontrados en el frailejoacuten

plantean nuevos desafiacuteos respecto al cambio climaacutetico ya que tienen un rol vital en la

supervivencia de estas especies de alta montantildea como los frailejones debido a su relacioacuten

mutualista o patoacutegena maacutes aun en los paacuteramos que son altamente sensibles a los efectos del

cambio climaacutetico incluso tan sensibles como las zonas polares (Bradley et al 2006)

La mayoriacutea de especies encontradas en el presente estudio tienen potencial para ayudar a

combatir el estreacutes abioacutetico producido por el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales

Especiacuteficamente pueden ayudar a combatir el estreacutes bioacutetico producido por virus hongos

bacterias e insectos en un marco de cambio climaacutetico aumentos de temperatura cambios en la

concentracioacuten de CO2 cambios en la precipitacioacuten migraciones tempranas cambios en la

nubosidad disponibilidad hiacutedrica alteraciones en la estructura y composicioacuten de las especies

endeacutemicas del paacuteramo

58

59

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Anexos

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombia

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia

hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

74

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

Coordenadas Geograacuteficas

(Latitud)

De la Colecta del

Material Bioloacutegico total de 15

muestras (Longitud)

LAT N 4deg 37 5871717 LONG W 75deg 25

3292611

LAT N 4deg 37 5885220 LONG W 75deg 25

3271217

LAT N 4deg 37 5884485 LONG W 75deg 25

3312103

LAT N 4deg 36 5995487 LONG W 75deg 27

3045854

LAT N 4deg 37 6195784 LONG W 75deg 30

3292611

LAT N 4deg 40 159171 LONG W 75deg 26

380142

LAT N 4deg 40 363762 LONG W 75deg 26

209072

LAT N 4deg 40 399832 LONG W 75deg 27

173554

LAT N 4deg 40 383965 LONG W 75deg 27

464325

LAT N 4deg 39 486438 LONG W 75deg 27

173559

LAT N 4deg 40 56894 LONG W 75deg 26

568287

LAT N 4deg 40 159174 LONG W 75deg 27

190654

LAT N 4deg 40 125083 LONG W 75deg 26

345912

LAT N 4deg 40 116691 LONG W 75deg 27

208264

LAT N 4deg 40 314698 LONG W 75deg 27

140791

75

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un estereoscopio con el propoacutesito de seleccionar la

maacutes indicada y luego sembrar un cultivo puro a partir de ese micelio

76

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados las

copias se conservaron con glicerol a -80degC en un ultra congelador de Thermo Scientifictrade

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas

y enviadas

77

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicos de forma segura y esteacuteril propiedad de la Universidad del Quindiacuteo

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a la Universidad Ruhr de Bochum (Alemania)

78

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de parsimonia

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X en donde se

observa en amarillo la secuencia umlTCATTAuml la cual es una secuencia altamente conservada

que se usa para marcar el inicio de la misma en hongos endoacutefitos

79

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa JmoldelTest usados para generar el

aacuterbol de relaciones filogeneacuteticas a partir de la regioacuten ITS de los hongos endoacutefitos aislados

total de modelos evaluados 88

ID Nombre Particioacuten lnL P AIC detaAIC Peso Cumpeso Udelta

1 JC 0 100820157 138 204400314 1341348 0 1 -

2 JC+I 0 98912511 139 200605022 9618188 0 1 -

3 JC+G 0 95470113 139 193720225 2733392 0 1 -

4 JC+I+G 0 95467507 140 193735014 274818 0 1 -

5 F81 0 100658095 141 204136189 13149356 0 1 -

6 F81+I 0 98761481 142 200362962 9376128 0 1 -

7 F81+G 0 95314814 142 193469628 2482794 0 1 -

8 F81+I+G 0 95324364 143 193508729 2521895 0 1 -

9 K80 10010 99734495 139 20224899 11262157 0 1 -

10 K80+I 10010 97835191 140 198470382 7483549 0 1 -

11 K80+G 10010 94227821 140 191255643 268809 0 1 -

12 K80+I+G 10010 94209963 141 191239926 253092 0 1 -

13 HKY 10010 99648091 142 202136181 11149348 0 1 -

14 HKY+I 10010 97761512 143 198383024 7396191 0 1 -

15 HKY+G 10010 94170799 143 191201599 214765 0 1 -

16 HKY+I+G 10010 94118678 144 191117357 130523 600E-04 0999 -

17 TrNef 10020 99564653 140 201929306 10942472 0 1 -

18 TrNef+I 10020 97712623 141 198245245 7258412 0 1 -

19 TrNef+G 10020 94150977 141 191121955 135121 400E-04 09994 -

20 TrNef+I+G 10020 94132131 142 191104263 117429 00011 09959 -

21 TrN 10020 99563809 143 201987618 11000784 0 1 -

22 TrN+I 10020 97702964 144 198285929 7299095 0 1 -

23 TrN+G 10020 94094235 144 191068469 81635 00065 09719 -

24 TrN+I+G 10020 94101378 145 191102757 115923 00012 09948 -

25 TPM1 12210 99713879 140 202227759 11240925 0 1 -

26 TPM1+I 12210 97826641 141 198473282 7486449 0 1 -

27 TPM1+G 12210 94249837 141 191319674 33284 0 1 -

28 TPM1+I+G 12210 942022 142 1912444 257566 0 1 -

29 TPM1uf 12210 99663473 143 202186945 11200112 0 1 -

30 TPM1uf+I 12210 97879458 144 198638917 7652083 0 1 -

31 TPM1uf+G 12210 94137349 144 191154699 167865 100E-04 09999 -

32 TPM1uf+I+G 12210 94141897 145 191183794 196961 0 1 -

80

33 TPM2 10212 99722544 140 202245087 11258254 0 1 -

34 TPM2+I 10212 97828213 141 198476426 7489592 0 1 -

35 TPM2+G 10212 94185859 141 191191718 204885 0 1 -

36 TPM2+I+G 10212 94153667 142 191147335 160501 100E-04 09998 -

37 TPM2uf 10212 99648091 143 202156182 11169348 0 1 -

38 TPM2uf+I 10212 97757018 144 198394035 7407202 0 1 -

39 TPM2uf+G 10212 941052 144 1910904 103566 00022 09904 -

40 TPM2uf+I+G 10212 9408801 145 19107602 89187 00044 0982 -

41 TPM3 12012 99768005 140 20233601 11349176 0 1 -

42 TPM3+I 12012 97958099 141 198736198 7749364 0 1 -

43 TPM3+G 12012 94227963 141 191275926 289093 0 1 -

44 TPM3+I+G 12012 94323885 142 191487769 500936 0 1 -

45 TPM3uf 12012 99625421 143 202110843 11124009 0 1 -

46 TPM3uf+I 12012 97770469 144 198420939 7434105 0 1 -

47 TPM3uf+G 12012 94165576 144 191211152 224319 0 1 -

48 TPM3uf+I+G 12012 94150861 145 191201721 214888 0 1 -

49 TIM1ef 12230 99592239 141 202004478 11017644 0 1 -

50 TIM1ef+I 12230 97822787 142 198485574 749874 0 1 -

51 TIM1ef+G 12230 94121043 142 191082087 95253 00033 09853 -

52 TIM1ef+I+G 12230 94122386 143 191104772 117939 00011 09969 -

53 TIM1 12230 99518653 144 201917306 10930473 0 1 -

54 TIM1+I 12230 9781156 145 19852312 7536286 0 1 -

55 TIM1+G 12230 94105198 145 191110396 123562 800E-04 09977 -

56 TIM1+I+G 12230 94087158 146 191094317 107483 00018 09922 -

57 TIM2ef 10232 99550617 141 201921233 109344 0 1 -

58 TIM2ef+I 10232 97704602 142 198249204 726237 0 1 -

59 TIM2ef+G 10232 94093484 142 191026968 40135 00516 0852 -

60 TIM2ef+I+G 10232 94073864 143 191007729 20895 0135 07169 -

61 TIM2 10232 99530022 144 201940044 1095321 0 1 -

62 TIM2+I 10232 97820158 145 198540315 7553482 0 1 -

63 TIM2+G 10232 94058678 145 191017356 30523 00834 08004 -

64 TIM2+I+G 10232 94060837 146 191041674 54841 00247 09248 -

65 TIM3ef 12032 99546286 141 201912572 10925739 0 1 -

66 TIM3ef+I 12032 97713931 142 198267862 7281028 0 1 -

67 TIM3ef+G 12032 94129376 142 191098753 111919 00014 09936 -

68 TIM3ef+I+G 12032 94112005 143 191084009 97176 0003 09883 -

69 TIM3 12032 99514376 144 201908751 10921918 0 1 -

70 TIM3+I 12032 97700023 145 198300047 7313213 0 1 -

71 TIM3+G 12032 94115323 145 191130646 143812 300E-04 09997 -

72 TIM3+I+G 12032 94096941 146 191113882 127048 700E-04 09984 -

73 TVMef 12314 9970418 142 20224836 11261526 0 1 -

74 TVMef+I 12314 97940598 143 198741196 7754363 0 1 -

81

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE (AIC)

75 TVMef+G 12314 94159829 143 191179657 192824 0 09999 -

76 TVMef+I+G 12314 94160993 144 191201987 215153 0 1 -

77 TVM 12314 99615991 145 202131982 11145148 0 1 -

78 TVM+I 12314 97746676 146 198413353 7426519 0 1 -

79 TVM+G 12314 94075503 146 191071005 84171 00057 09776 -

80 TVM+I+G 12314 94052588 147 191045176 58342 00208 09456 -

81 SYM 12345 99543166 143 201946331 10959498 0 1 -

82 SYM+I 12345 97757103 144 198394207 7407373 0 1 -

83 SYM+G 12345 94083056 144 191046112 59278 00198 09654 -

84 SYM+I+G 12345 94050035 145 19100007 13236 0198 05819 -

85 GTR 12345 99529525 146 20197905 10992217 0 1 -

86 GTR+I 12345 97686178 147 198312356 7325522 0 1 -

87 GTR+G 12345 94044194 147 191028387 41553 00481 09001 -

88 GTR+I+G 12345 94013417 148 190986834 0 03839 03839 -

14

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies

Massarina Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip52

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona

muestreadahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia 29-30

Tabla 2 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos

endoacutefitos en la especie Espeletia hartwegiana

helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36

Tabla 3 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = presencia del genero

de hongo dentro de la especie de frailejoacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42-43

15

Introduccioacuten

Hay un libro abierto siempre para

todos los ojos la naturaleza

(Jean-Jacques Rousseau 1712-1778)

El cambio climaacutetico corresponde a un fenoacutemeno que afecta el planeta de manera natural

permitiendo mantener las condiciones climaacuteticas como la temperatura la precipitacioacuten entre

otras en un rango aceptable para la vida (Jimeacutenez 2010) Sin embargo dado el aumento de las

emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) principalmente asociado a las actividades

humanas y el alto consumo de combustibles foacutesiles los cambios en dichas condiciones han sido

alterados dando paso a un acelerado aumento de temperatura anual en las uacuteltimas deacutecadas con

precipitaciones y sequias maacutes frecuentes e intensas (IPCC 2020 5 Jimeacutenez 2010)

Acorde con el Panel Intergubernamental de Expertos en Cambio Climaacutetico (IPCC) para

fin de siglo el Cambio Climaacutetico se acrecentaraacute pronosticando un aumento de temperatura de 25

a 45 degC para el antildeo 2100 que tan solo para Colombia en los uacuteltimos 30 antildeos fue de 08degC

generando impactos notorios en las zonas de alta montantildea como los paacuteramos (Moreno y Palma

2016)

El cambio climaacutetico es un fenoacutemeno cuyos efectos alcanzaraacuten los paacuteramos los cuales son

ecosistemas de alta montantildea presente en elevaciones entre 3100 y 4700 m ubicados en el norte de

los Andes de Ameacuterica del Sur y el sur de Ameacuterica Central adyacente (Berdugo et al 2016) Estas

aacutereas se caracterizan por una vegetacioacuten principalmente endeacutemica compuesta por frailejones

matorrales y pastos (veacutease figura 1) (Garciacutea et al 2010)

Los ecosistemas de alta montantildea como los paacuteramos ofrecen diversos servicios

ambientales como la biodiversidad uacutenica que albergan los paisajes los suelos y su capacidad de

retener y almacenar agua (Morales et al 2019) Las formaciones vegetales juegan un papel

diferenciado en el mantenimiento de la humedad y las fuentes de agua en el ecosistema

presentando la capacidad de interceptar almacenar y regular los flujos hiacutedricos superficiales y

16

subterraacuteneos aportando los servicios de abastecimiento de agua para el 70 de la poblacioacuten de

Colombia (Vaacutesquez y Buitrago 2017)

Ademaacutes dada la caracteriacutestica de permanente humedad de su suelo la materia orgaacutenica

se descompone a menor velocidad logrando un efecto de retencioacuten y almacenamiento de carbono

(Anderson et al 2012) En Colombia se han realizado diferentes estudios sobre la distribucioacuten y

extensioacuten del ecosistema paramuno Rangel (2002 4) determinoacute que los paacuteramos colombianos

abarcaban aproximadamente el 26 de la superficie del paiacutes

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramos por Pedraza-Pentildealosa Betancur y Franco-Rosselli (2005)

En particular el paacuteramo Romerales se encuentra dentro del territorio adscrito a los

Parques Nacionales Naturales (PNN) especiacuteficamente el PNN de los Nevados en la cordillera

central colombiana hacia la zona norte del Departamento del Quindiacuteo con liacutemites fronterizos

entre los departamentos de Risaralda y Tolima Este paacuteramo es el hogar del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana el cual estaacute afrontando los efectos del cambio climaacutetico (veacutease mapa 1)

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona muestreada

17

Existe evidencia cientiacutefica concreta del aumento de temperatura en los Andes Tropicales

tambieacuten cambios significativos en los patrones de precipitacioacuten sumado a la disminucioacuten en la

incidencia del clima nublado lo que conduce a las plantas a mayor cantidad de horas expuestas a

la radiacioacuten solar (Ruiz et al 2009) Otro efecto grave que trae consigo el cambio climaacutetico es el

desplazamiento de especies en el gradiente altitudinal Con un aumento de 3degC se espera que las

especies se muevan ~600 m en buacutesqueda de su optimo teacutermico esto afectariacutea gravemente las

especies de paacuteramo como los frailejones Cuesta Camacho (2007)

Los frailejones son emblemaacuteticas plantas de paacuteramo y ecosistemas de alta montantildea

(MINAMBIENTE 2019) Pertenecen a la familia Asteraceae contiene cerca de 142 especies

agrupadas en ocho geacuteneros Carramboa Coespeletia Espeletia Espeletiopsis Libanothamnus

Paramiflos Ruilopezia y Tamania de estos los maacutes importantes y con mayor diversidad de

especies son Espeletia Espeletiopsis y Libanothamnus (Rivera y Torres 2001)

Poseen adaptaciones que les permite captar y retener grandes cantidades de agua de su

entorno permitiendo un balance ecosistemico (Farias 2013) La morfologiacutea singular del genero

Espeletia le permite acumular las hojas antiguas en forma de ldquoabrigordquo brindando proteccioacuten

contra las bajas temperaturas nocturnas de hasta 0degC Los fuertes vientos y la radiacioacuten solar los

cuales seraacuten cada vez maacutes intensos y frecuentes por causa del cambio climaacutetico (Cortes y

Sarmiento 2013 34) (veacutease figura 2)

Estas plantas son especies claves para la conservacioacuten de los paacuteramos y la lucha contra el

cambio climaacutetico debido a que ofrecen una gran variedad de servicios ecosisteacutemicos (Diacuteaz et al

2007) El paacuteramo es referente sin igual de fuente hiacutedrica ciudades como Bogotaacute y Quito obtienen

aproximadamente el 80 de su agua dulce de los paacuteramos (Buytaert et al 2006) Los frailejones

en su mayoriacutea endeacutemicos se han visto afectados por actividades humanas como la ganaderiacutea

extensiva agricultura (cultivos de papa y cebolla) mineriacutea de oro y carboacuten turismo no

controlado y quemas intencionales (Hofstede 2000) Esta situacioacuten podriacutea comprometer a

mediano y largo plazo la funcioacuten de captacioacuten regulacioacuten y suministro del agua para el consumo

18

en las ciudades colombianas ubicadas en las regiones de influencia de estos ecosistemas (Varela

2015)

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

No obstante en asociacioacuten con especies como el frailejoacuten de los Andes Tropicales

encontramos a los hongos cuyos roles en las interacciones bioloacutegicas son de vital importancia

Los hongos pueden ser endoacutefitos simbiontes mutualistas paraacutesitos y comensales y son capaces

de responder a las amenazas que plantea el cambio climaacutetico en cuanto a perturbaciones

ambientales aumento de temperatura y estreacutes hiacutedrico adaptaacutendose a la disponibilidad de recursos

modificando sus actividades enzimaacuteticas e incluso su genoma a lo largo del tiempo (Moreno et

al 2013)

Los hongos son clasificados seguacuten su forma de reproduccioacuten sea sexual o asexual en

donde se observan las diferencias estructurales internas entre los diferentes grupos tales como

sus esporas e hifas como lo indican Blackwell y Spatafora (2004) estos organismos estaacuten

divididos en cuatro grandes grupos los cuales son Ascomycota Basidiomycota

Chytridiomycota Zygomycota es justo en el grupo de los Ascomycota donde se encuentra gran

diversidad de hongos conocidos como ldquohongos endoacutefitosrdquo en donde su nombre ldquoendoacutefitordquo

significa ldquodentro de la plantardquo (endon dentro phyton planta)

19

Estos microorganismos fuacutengicos tienen la facilidad de pasar gran parte o todo su ciclo de

vida invadiendo los tejidos de su hospedero (planta) sin tener un efecto negativo evidente

(Leacuteveilleacute 1846 3 de Bary 1866 8) Por lo tanto el concepto de endoacutefito indica una asociacioacuten de

costo-beneficio pero de una forma mutualista entre el hongo y la planta hospedera permitiendo

la estadiacutea en sus tejidos vivos (Clay 1998 8) Los hongos endoacutefitos se han encontrado en todas

las plantas (algas musgos pastos plantas y vasculares) desde los bosques templados hasta los

bosques tropicales hallaacutendose una gran diversidad de plantas y en asociacioacuten gran diversidad de

hongos endoacutefitos (Saacutenchez et al 2010)

Se espera que los hongos endoacutefitos jueguen un papel cada vez maacutes importante potenciado

por el cambio climaacutetico en las enfermedades producidas en plantas como pudricioacuten radicular

mal blanco entre otras con los aumentos pronosticados de la temperatura y el estreacutes por sequiacutea

asociados al cambio climaacutetico (Desprez-Loustau et al 2006 Slippers y Wingfield 2007 6) Los

cambios en la cantidad de dioacutexido de carbono (CO2) y la disponibilidad de nitroacutegeno en el suelo

afectan de forma similar tanto a las plantas como a los hongos por ende las alteraciones

generadas por parte del cambio climaacutetico pueden causar desbalances en sus relaciones (Ies et al

2013)

Algunos estudios realizados en el antildeo 1898 donde se registraron los primeros hongos

endoacutefitos como el de Bary (1866) brindo la iniciativa de investigaciones que lograron explicar

los cuadros toxicoloacutegicos observados en animales los cuales se daban por el consumo de

semillas o en aacutereas de pastos (Poaceae) que posiblemente albergaban hongos Clavicipitaacuteceos

(familia del ergot) los cuales poseiacutean actividades enzimaacuteticas con micotoxinas

Por diversas situaciones no trascendioacute la investigacioacuten hasta que Bacon (1977) hizo

relacioacuten del hongo endoacutefito Neotyphodium coenophialum debido a una intoxicacioacuten del ganado

llamado ldquosiacutendrome de veranordquo cuando estos animales consumiacutean pastos de la especie Festuca

arundinacea (Poaceae) Funk en el antildeo 80 caracterizoacute la resistencia de las Poaceae que

albergaban hongos endoacutefitos que frecuentemente eran atacados por insectos (proteccioacuten contra

herbiacutevoros) (Saacutenchez et al 2010)

Compant y colaboradores (2010) mencionaron que tras experimentar en el laboratorio

con una gama de temperaturas en los hongos endoacutefitos aislados obtuvieron resultados variables

respecto al crecimiento es decir positivos y neutrales llegando a la conclusioacuten de que los

microorganismos asociados a las plantas son un factor importante que influye en la respuesta de

20

las plantas acorde a los cambios de temperatura lo que compromete las respuestas del frailejoacuten y

los hongos endoacutefitos frente al calentamiento global causado por el cambio climaacutetico

Con relacioacuten a los estudios realizados sobre hongos endoacutefitos en frailejones se han

encontrado al menos 100 especies con capacidades de inhibir hongos fitopatoacutegenos o herbivoriacutea

(Cabezas et al 2012)

Los geacuteneros de hongos endoacutefitos encontrados en anteriores estudios son Acremonium

Aspergillus Aureobasidium Colletotrichum Fusarium Gliocadium Nigrospora Paecilomyces

Penicillium Trichothecium Trichoderma y Sordaria (Pineda 2000 Programa Nacional para la

Evaluacioacuten del Estado y Afectacioacuten de los Frailejones en los Paacuteramos de Andes del Norte 2009)

Teniendo en cuenta que para Colombia hay poca informacioacuten sobre hongos endoacutefitos en

ecosistemas paramunos se hace fundamental la ampliacioacuten de maacutes informacioacuten referente al tema

debido a que solo existen estudios significativos en cafeacute leguminosas y rosas los cuales maacutes allaacute

de la identificacioacuten de geacuteneros de hongos endoacutefitos no incluyen el cambio climaacutetico y sus

posibles consecuencias (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016) En

teacuterminos filogeneacuteticos los hongos son el reino de la naturaleza maacutes cercano a los animales

(Hibbett et al 2018)

Las relaciones que posean las diferentes especies de endoacutefitos dentro de la especie de

frailejoacuten es de importancia conocerla mediante el uso de la filogenia molecular (Judd et al 2007)

mediante secuencias de ADN ARN o proteiacutenas (Cooke et al 2000) Dependiendo de la presencia

de especies agresivas de endoacutefitos como Nigrospora se puede tener un mejor conocimiento

sobre las consecuencias que trae consigo los impactos del cambio climaacutetico sobre estas plantas de

los Andes Tropicales (Foden et al 2009)

21

Capiacutetulo primero

Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitos

1 Antecedentes

Desde los estudios realizados por Leacuteveilleacute (1846) y Bary (1866) sobre hongos Endoacutefitos

en pastos de zonas templadas se ha logrado identificar que estos hongos son capaces de inducir

respuestas adaptativas a sus hospederos (Micotoxinas contra herbiacutevora adaptacioacuten a heladas o

climas extremos fijacioacuten de nutrientes) a cambio de alimento y hospedaje formando una relacioacuten

mutualista en la cual las dos especies involucradas son beneficiadas No obstante se ha reportado

que los hongos endoacutefitos ademaacutes de tener relaciones mutualistas con diferentes especies

vegetales se pueden tornar en especies patoacutegenas para su hospedero una vez la planta se

encuentra en condiciones desventajosas tornaacutendose asiacute el hongo endoacutefito en un hongo

fitopatoacutegeno (Herrera y Ulloa 1990 550)

Como se mencionoacute anteriormente los hongos endoacutefitos pueden pasar de un estado

mutualista a un estado de patogeacutenesis dada esta relacioacuten entre ambos organismos se producen

metabolitos secundarios potencialmente toacutexicos facilitando factores de virulencia dados por el

hongo endoacutefito como exoenzimas y metabolitos fitotoacutexicos a su vez la planta presenta defensas

tanto mecaacutenicas como bioquiacutemicas (Saacutenchez et al 2013 5)

Hasta la fecha los principales estudios de hongos endoacutefitos se han fijado en especies de

intereacutes econoacutemico y comercial tales como palma de aceite cafeacute leguminosas pastos de forrajeoacute

y diferentes tipos de rosas (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016)

Las especies modelo para el estudio de los hongos endoacutefitos han sido las gramiacuteneas

forrajeras en donde se han reportado especies de endoacutefitos asociados a los geacuteneros Lolium

Festuca y Brachiaria (Siegel et al 1987) no obstante Otero y Bayman (2009) han reportado un

creciente nuacutemero de estudios en orquiacutedeas epifitas tropicales relaciones con hongos micorrizicos

22

Actualmente existen escasos reportes de hongos endoacutefitos asociados a ecosistemas con

climas extremos (temperaturas extremas) como aacuterticos desiertos paacuteramos y zonas alpinas

especialmente para zonas de temperaturas friacuteas como lo son los paacuteramos (Lopera et al 2008

Leung et al 2011 Cabezas et al 2012 Miles et al 2012 Zhang y Yao 2015)

Investigadores como Lopera Leung y colaboradores (2011) han llegado a la conclusioacuten

de que los hongos endoacutefitos juegan un papel importante en las plantas a la hora de adaptarse a

ecosistemas de clima templado (Kivlin et al 2013 Zhang y Yao 2015)

En Colombia los trabajos con hongos endoacutefitos son pocos por ende trabajos como el de

Lopera y colaboradores (2008) con especies del genero Espeletia de los paacuteramos Colombianos

son pioneros ademaacutes del trabajo de Cabezas y colaboradores (2012 4) en el cual aislaron y

caracterizaron celulasas (enzimas descomponedores de la celulosa) extraiacutedas de hongos endoacutefitos

que se hallaban en especies de Espeletia posteriormente Lopera y Miles (2012) unieron

esfuerzos para continuar caracterizando la diversidad de hongos endoacutefitos en los paacuteramos andinos

colombianos enfocados en Espeletia con el objetivo de encontrar especies con potencial

biocontrolador

Existen trabajos tesis en los repositorios de diversas universidades de los antildeos 2014 y

2015 en los cuales se aborda el tema de los hongos endoacutefitos paacuteramos y especies de Espeletia

(frailejones) y de la familia Poaceae en donde se caracterizan las diversas especies de hongos

endoacutefitos por medio taxonomiacutea y biologiacutea molecular ademaacutes de buscar metabolitos secundarios

con fines medicinales o de biocontrol

Los trabajos en filogenia molecular de hongos endoacutefitos realizados en frailejones se han

visto enfocados maacutes hacia la buacutesqueda de la diversidad funcional en comunidades

microbioloacutegicas como por ejemplo el estudio realizado por Ruiz y colaboradores (2015) en

donde buscaron mediante el anaacutelisis molecular de raiacuteces necromasa hojas maduras y joacutevenes de

diferentes especies de Espeletia (veacutease figura 3) ubicada en los Andes neotroacutepicales

colombianos secuencias geneacuteticas de las regiones V5-V6 de la unidad 16S del rARN

23

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras N

necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefito Tomado de Ruiz y colaboradores (2015)

Este estudio analizoacute la composicioacuten de comunidades microbioanas y su diversidad

funcional en un ecosistema de alta montantildea en donde las temperaturas los rayos UV y la altura

juegan papeles determinantes como filtros ecoloacutegicos severos en donde solo pueden existir

especies que han desarrollado capacidades para adaptarse sobrevivir y colonizar dichas aacutereas

por ende cuando se analizaron las comunidades existentes dentro de estas especies de Espeletia

Encontraron que algunas especies halladas podriacutean tener roles importantes como

productores de metabolitos secundarios enzimas o incluso como bioremediadores y que las

comunidades microbianas eran diferentes tanto en sus hojas como en sus raiacuteces y en la

necromasa

A medida que las deacutecadas avanzan y la evidencia sobre el cambio climaacutetico se hace maacutes

robusta y evidente los estudios en los hongos endoacutefitos han tomado vital importancia al estar

asociados con cultivos de especies comestibles escases de agua y de tierras productivas sumado

a los efectos negativos que trae consigo el cambio climaacutetico para las diferentes plantaciones y

cosechas a nivel global

Es por eso que Lu Yan y colaboradores (2019) analizaron los efectos positivos que teniacutean

la colonizacioacuten de hongos endoacutefitos en las plantas en donde ratificaron que los hongos endoacutefitos

dentro la planta generan metabolitos antimicrobianos estimulan las respuestas inmunoloacutegicas y

compiten por espacio dentro de la planta con diferentes patoacutegenos incrementando asiacute la

resistencia contra herbiacutevoros y la resistencia al estreacutes salino (factores bioacuteticos)

Ademaacutes de ayudar a la planta contra el estreacutes abioacutetico causado principalmente por

factores climaacuteticos como la falta de agua (estreacutes hiacutedrico) las temperaturas extremas la

intensidad de los rayos UV y los metales pesados como la muestra la figura 4 debido a esto se

24

concluyoacute que las fitohormonas cumplen un papel importante en la colonizacioacuten de hongos

endoacutefitos dentro de la planta

Aun que se ha reportado que los hongos endoacutefitos se pueden usar como biocontroladores

diferentes estudios reportan que el uso de hongos endoacutefitos puede tener efectos adversos como

un retraso significativo en el crecimiento de la planta con el uso de la especie Cryptosporiopsis

sp (Terhonen et al 2016) Otro reporte indica la fecundidad y supervivencia de enemigos

naturales como paraacutesitos esto es debido a que los hongos endoacutefitos transfieren sus toxinas y

alcaloides cuando son ingeridos por paraacutesitos u otros enemigos naturales de las plantas (Lopez y

Sword 2015)

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y abioacutetico

Bajo estreacutes bioacutetico (herbiacutevoros y patoacutegenos) y abioacutetico (sequiacutea salinidad metales pesados y otros) (a) se

inducen respuestas de defensa de las plantas (b) los endoacutefitos producen metabolitos protectores y

modulan la viacutea de las fitohormonas para mejorar la inmunidad de las plantas (c) tomada de Lu yan y

colaboradores (2019 7)

25

2 Justificacioacuten

La presente investigacioacuten pretende identificar y caracterizar que especies de hongos

endoacutefitos estaacuten asociadas al frailejoacuten Espeletia hartwegiana y que posibles implicaciones podriacutea

tener que estas especies se encuentren dentro de esta especie de alta montantildea La importancia de

conocer esta informacioacuten reside en que los hongos endoacutefitos pueden beneficiar o perjudicar a la

adaptacioacuten y resistencia de especies vegetales en los distintos escenarios climaacuteticos propuestos

por la ciencia (IPCC 2020)

El calentamiento global podriacutea afectar el equilibrio de los hongos endoacutefitos en especies

vegetales generando desbalances en la planta o la peacuterdida de especies endoacutefitas de importancia

biotecnoloacutegica Por ejemplo se podriacutean perder especies endoacutefitas con potencial para control

bioloacutegico de plagas y enfermedades de plantas como productores de enzimas y metabolitos

secundarios degradacioacuten de plaacutesticos o biorremediacioacuten entre otros (Schulz et al 2002) Por

ello se hace fundamental estudiar los hongos endoacutefitos en ecosistemas de paacuteramo ya que en

Colombia y en los paacuteramos en general han sido poco estudiados y su efecto sobre las plantas de

alta montantildea podriacutea ser clave en el mantenimiento de sus poblaciones

26

3 Hipoacutetesis

H1 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute diferente en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo diferentes los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten tambieacuten seria

modificada

H0 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute similar en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo similares los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten continuariacutean

como se ha registrado con anterioridad

27

4 Objetivos

41 Objetivo general

Caracterizar la diversidad de hongos endoacutefitos presentes en los frailejones

de la especie Espeletia hartwegiana en el paacuteramo de Romerales tomando en cuenta su

relacioacuten con el cambio climaacutetico

42 Objetivos especiacuteficos

Identificar los hongos endoacutefitos asociados en Espeletia hartwegiana del

paacuteramo de Romerales

Hallar relaciones filogeneacuteticas entre las diferentes especies de hongos

Endoacutefitos encontradas en Espeletia hartwegiana

Advertir las repercusiones del cambio climaacutetico sobre Espeletia

hartwegiana en base a su diversidad de hongos endoacutefitos

28

29

Capiacutetulo segundo

Materiales Meacutetodos y Resultados

1 Aacuterea de Estudio

El trabajo se realizoacute en el paacuteramo de Romerales ubicado en la zona alta del municipio de

Salento Quindiacuteo (4deg39202N 75deg25506W) con una extensioacuten aproximada de 6794 ha (Cano

et al 2015)

2 Colecta de material bioloacutegico

La colecta del material bioloacutegico se realizoacute mediante muestreos aleatorios lo largo del

paacuteramo tomando coordenadas de cada punto de colecta (veacutease anexo 3) las hojas se colectaron

por medio de tijeras podadoras siendo empacadas cada una en bolsas Ziploc diferentes se

colectoacute un total de 15 hojas cada una correspondiente a una planta de frailejoacuten para un total de

15 plantas muestreadas de E hartwegiana

Adicionalmente las bolsas Ziploc fueron marcadas con los datos de colecta en campo y

transportadas a los laboratorios del Programa de Biologiacutea de la Universidad del Quindiacuteo para su

procesamiento

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetales

Las muestras obtenidas fueron lavadas con agua para eliminar el exceso de residuos se

cortaron 4 trozos de cada hoja con un tamantildeo aproximado de 05 a 10 cm (veacutease figura 5) luego

cada trozo de hoja se sometioacute a una esterilizacioacuten la cual se completoacute con algunas modificaciones

acorde al procedimiento descrito por (Osorio et al 2017) especiacutefico para el aislamiento de

30

hongos endoacutefitos que consiste en sumergir perioacutedicamente el material vegetal en etanol al 90

durante un minuto seguido de hipoclorito de sodio (NaClO) al 4 por un minuto continuando

con etanol al 70 durante un minuto y por uacuteltimo se lavaraacuten con agua destilada todo dentro de la

campana de flujo

Las cuatro secciones de hoja se transfirieron a una caja de Petri para un total de 15 cajas

de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA) (una caja de Petri por cada 4 cortes de hoja)

Posteriormente las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente (25degC aproximadamente)

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en medio de

cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelial caja de Petri de 20ml de capacidad

Pasadas 3 semanas se revisaron los cultivos fuacutengicos con el fin de revisar el crecimiento

del micelio y hacer un repique a un cultivo puro una vez maduros se procedioacute a utilizar la teacutecnica

de corte de hifa uacutenica (Osorio et al 2017) esta teacutecnica consistioacute en tomar la punta de la hifa con

ayuda de un estereoscopio y un bisturiacute de grado quiruacutergico agua destilada alcohol al 70 y un

mechero para mantener el bisturiacute esterilizado una vez identificada la hifa ideal para cultivar de

forma pura (veacutease figura 6) con el bisturiacute se procedioacute a cortar el agar PDA en forma de cuadro

con una medida aproximada de 3 miliacutemetros cuadrados

31

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la teacutecnica de

corte de hifa uacutenica

Se esperoacute entre 3 a 5 semanas a que crecieran los cultivos puros aislados de las hifas uacutenicas en

nuevas cajas de Petri con agar PDA

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos endoacutefitos)

Los hongos cultivados de forma pura consiguieron un crecimiento micelial significativo a partir

de los 15 diacuteas a temperatura ambiente como lo demuestra la figura 7 que contiene doce de los

cultivos maacutes representativos con su respectivos micelios aeacutereos desarrollados donde variacutean sus

colores formas y consistencias esto indicando que pertenecen a diferentes especies

2

1

3

32

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de cultivo

Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12) aislados de las

hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

5 Extraccioacuten de ADN

4

5

6

7

8

9

10

11

12

33

Una vez el micelio de los hongos se encontraba desarrollado en la cantidad necesaria se

procedioacute a extraer el ADN genoacutemico siguiendo el protocolo de extraccioacuten de Raeder y Broda

(1985) por medio de un barrido superficial del micelio evitando tomar el agar este micelio

posteriormente se colocoacute en tubos Eppendorf esteacuteriles de 2 ml y se pulverizoacute mediante el uso de

un asa microbioloacutegica y 1ml de buffer de extraccioacuten compuesto de Tris-HCL 1 M pH 78 EDTA

05 M Ph 8 SDS 10 wv NaCL y agua destilada para cada tubo a continuacioacuten se agregoacute 800

ul de etanol al 70 500 ul de fenol y se mezcloacute

Se adicionoacute 300 ul de cloroformo y se mezcloacute de nuevo de alliacute se llevoacute a la centrifuga a

10000 rpm por 60 minutos luego de centrifugar se forma un sobrenadante el cual es transferido

en su totalidad a un nuevo tuvo Eppendorf de 15 ml en el cual se agregaron 400 ul de cloroformo

y se llevoacute a la centrifuga a 10000 rpm por 10 minutos en donde nuevamente se forma un

sobrenadante aunque esta vez solo se toman 500 ul del tubo para ser transferidos otro tubo

Eppendorf de 15 ml ya en el nuevo tubo se adicionaron 50 ul de NaAC y se invirtioacute varias veces

para homogenizar la mezcla a continuacioacuten se guardoacute en el refrigerador a 4degC toda la noche

Al diacutea siguiente se tomaron las muestras en los tubos Eppendorf y se centrifugaron a

10000 rpm por 30 minutos (Formacioacuten del Pellet de ADN) cuando la centrifuga terminoacute se

procedioacute a remover el etanol ya sin etanol se agregoacute de nuevo 1 ml de etanol al 70 a cada tubo

y se centrifugoacute a 10000 rpm por 5 minutos en este paso se removioacute el etanol y se dejoacute secar el

pellet de ADN una vez el etanol se evaporoacute se re suspendioacute el pellet en 100 ul de agua grado

molecular o Sabax con 5 ul de RNAsa con el fin de evitar la presencia de moleacuteculas de ARN

posteriormente se incubaron a 37degC por 30 minutos y se guardaron para su envioacute a -20degC

(Raeder y Broda 1985)

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengica

Una vez se secuenciaron las muestras de ADN enviadas a la Universidad Ruhr de

Bochum Alemania se hizo el ensamblaje de las secuencias en contigs y scaffolds en el

programa CLC Main Workbench 8 (Nicola et al 2013) Como lo muestra la figura 8 donde se

muestran los pasos esenciales de una teacutecnica de Metagenoacutemica donde posteriormente se

analizaron con maacutes detalle mediante teacutecnicas filogeneacuteticas

34

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemico Fuente Thomas y colaboradores (2012)

7 Secuenciamiento

Se extrajoacute con eacutexito un total de 35 muestras de hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

Espeletia hartwegiana (veacutease figura 9) que posteriormente fueron secuenciadas por la

Universidad Ruhr de Bochum (Alemania) logrando un total de 70 secuencias incluyendo

aquellas obtenidas en Genk Bank

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de frailejoacuten

Espeletia hartwegiana

35

8 Anaacutelisis Filogeneacutetico

Se aislaron 35 secuencias basadas en la especie Espeletia hartwegiana fueron

comparadas posteriormente con 35 secuencias de especies publicados en GenBank

(httpblastncbinihgovblastcgi) se obtuvo un total de 70 secuencias Las secuencias de

consenso ITS 58S DNA obtenidas se usaron para realizar buacutesquedas BLAST en GenBank

usando BLASTn (Altschul et al 1990) con el fin de identificar mediante las secuencias aisladas

los geacuteneros o las especies maacutes cercanas La matriz de datos fue alineada en MAFFT v7 (Katoh y

Standley 2013) Se utilizaron las especies Coprinellus xanthothrix y Coprinellus domesticus

como grupos externos

Los anaacutelisis de las secuencias para construir los arboles filogeneacuteticos de Maacutexima

Parsimonia (MP) fueron realizados usando PAUP v40b10 (Swofford 2003) Para el anaacutelisis de

Maacutexima Verosimilitud o ML por sus siglas en ingleacutes (Maximum Likelihood) se utilizoacute

JmodelTest (Darriba et al 2012) con el cual se infirieron los criterios del modelo de sustitucioacuten

apropiado utilizando los criterios de informacioacuten de Akaike (AIC) (Akaike 1974)

Los anaacutelisis de ML se realizaron con el programa PhyML v 30 (Guindon y Gascuel

2003) teniendo en cuenta la proporcioacuten de sitios invariables Los valores de soporte de confianza

para los nodos se estimaron mediante 1000 anaacutelisis de arranque de replicacioacuten La alineacioacuten de

los datos de la secuencias de ITS para 70 aislamientos determinoacute quince geacuteneros siendo los

siguientes Annulohypoxylon Biscogniauxia Colletotrichum Crassiparies Cryptocoryneum

Cyphellophora Diaporthe Daldinia Humiacutecola Hypoxylon Hypocrea Nemania Nigrospora

Massarina y Trichoderma de los cuales se obtuvieron 11 clados principales (veacutease figura 10)

Con base en estos resultados todos los aislamientos se analizaron maacutes a fondo dentro de los

geacuteneros hasta llegar a especie (veacutease tabla 1)

36

Geacuteneros Especie Especie Especie Especie Especie Especie Especie

Annulohypoxylon A nitens A bahnphaden

gense

Biscogniauxia B petrensis

Colletotrichum C gloeosporioides

C gigasporum

Cyphellophora C

reptans

Crassiparies C quadrisporus

Cryptocoryneum C

longicondensatum

Daldinia D dennisii D

eschscholtzi

D

conceacutentri

ca

Diaporthe D

longicolla

D

foeniculina

D

anacardi

i

D

macada

miae

Humiacutecola H

fuscoatra

Hypoxylon H

trugodes

H

pulicicidum

Hypocrea H

koningii

Massarina M albocarnis

Nemania N

primolutea

Nigrospora N sacchari N rubi N sphaeric

a

N hainanen

sis

N oryzae

N gorlenko

ana

N aurantia

ca

Trichoderma T trixiae T

olivascens

T

paraviridescens

T

viridescens

T

samuelsii

T viride

Grupo Externo Coprinellus C

domesticus

C

xanthothrix

Tabla 1 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos endoacutefitos en la

especie Espeletia hartwegiana

37

38

Figura 10 Filograma consenso obtenido con el programa MEGA ndashX a partir del anaacutelisis ML y MP del

conjunto de datos ITS Aislados de las hojas de frailejoacuten Los coacutedigos en Verde son las secuencias que se

aislaron (aislados) en este estudio los coacutedigos y nombres en Negro son las secuencias encontradas por

identidad en GenBank Los valores de soporte de bootstrapgt 70 se indican cerca de los nodos como MP

ML = valores de soporte de bootstrap lt70

El nuacutemero de caracteres los modelos de sustitucioacuten usada asiacute como otros resultados

estadiacutesticos de las pruebas de Maacutexima Parsimonia y Maacutexima Verosimilitud generados a partir de

los anaacutelisis filogeneacuteticos de los conjuntos de datos se muestran en los anexos

39

Capiacutetulo Tercero

Discusioacuten sobre los hongos endofitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicas

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidad de Endoacutefitos

Tanto la temperatura la estacionalidad y los tipos de precipitacioacuten son factores de vital

importancia para la composicioacuten de las diferentes comunidades y la arquitectura vegetal Estos

factores limitan muchos de los procesos ecosisteacutemicos ya que existe una estrecha relacioacuten entre

las variaciones climaacuteticas y las variaciones dentro de los ecosistemas Por lo tanto se espera que

el cambio climaacutetico transforme los ecosistemas Andinos tal como los conocemos hoy (Colwell et

al 2008) modificando las relaciones mutualistas entre plantas y hospederos

Posiblemente la resiliencia y resistencia de muchos ecosistemas como el paacuteramo sean

superadas en este siglo por una combinacioacuten sin precedentes de disturbios tales como el cambio

climaacutetico perturbaciones asociadas a este (sequiacuteas fuegos invasioacuten de especies exoacuteticas

inundaciones) y otros factores como organismos oportunistas (hongos endoacutefitos) cambios en el

uso del suelo contaminacioacuten y sobreexplotacioacuten de recursos (IPCC 2020)

Considerando que el frailejoacuten Espeletia hartwegiana es una especie de alta montantildea

(paacuteramos) endeacutemica de la cordillera Central de los Andes (Schultz y Carl 1856) se encuentra

dentro de los ecosistemas andinos en donde a su vez se ha comprobado la existencia de los

hongos endoacutefitos es de tener en cuenta el papel de estos organismos endoacutefitos ya que los

paacuteramos son ecosistemas particularmente sensibles a los efectos adversos del cambio climaacutetico

en especial al calentamiento global al estar ubicados en los troacutepicos generando asiacute ventanas de

40

oportunidades para que los hongos endoacutefitos alteren su estado mutualista y pasen a ser

patogeacutenicos (Colwell et al 2008 7)

No obstante existe consenso en que las temperaturas aumentaraacuten especiacuteficamente a

grandes alturas y que la precipitacioacuten posiblemente se incrementaraacute en algunas zonas disminuiraacute

en otras y se produciraacute en patrones estacionales alterados con mayor intensidad y frecuencia

(Marengo et al 2009)

Los frailejones se ven en constante estreacutes por el uso del suelo dado en los paacuteramos como

es el caso del paacuteramo Romerales un paacuteramo que se ha visto afectado por las quemas y la

ganaderiacutea (Molinillo y Monasterio 2001) Esto aumenta asiacute las condiciones de estreacutes intriacutensecas a

las que estaacuten expuestas estas plantas de paacuteramo las cuales suministran valiosos bienes y servicios

ecosisteacutemicos como el abastecimiento continuo de agua para usos domeacutesticos agriacutecolas e

industriales (Buytaert et al 2006 4) servicios que se podriacutean ver en decrecimiento si las

ventanas de oportunidades se abren con maacutes frecuencia dando pie al cambio de estado de los

hongos endoacutefitos que existen dentro de los frailejones de la zona

En los paacuteramos de Chingaza Rabanal Guerrero Iguaque Merchaacuten y Sumapaz se han

realizado estudios de aislamientos de hongos en especies de frailejoacuten diferentes a la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana tales como Espeletia argentea Espeletia arbelaezii Espeletia

boyacensis Espeletia grandiflora Espeletia miradorensis y Espeletia uribei por ende se ha

reportado la presencia de hongos endoacutefitos y fitopatoacutegenos (Tabla 2) (Gaitan 2018 17)

Frailejones Espeletia

argentea

Espeletia

arbelaezii

Espeletia

boyacensis

Espeletia

grandiflora

Espeletia

miradorensis

Espeletia

uribei

Aspergillus X X X X

Annulohypoxylon X X X

Curvularia X X X

Epicoccum X X X

Fusarium X X X

41

Tabla 2 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = a presencia del genero de

hongo dentro de la especie de frailejoacuten

Los geacuteneros de hongos en rojo son los geacuteneros que se encontraron en comuacuten con los

geacuteneros hallados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana de un total de 15 geacuteneros 3

han sido reportados anteriormente en estudios similares ( 20 de geacuteneros identificados)

Dentro de un marco de cambio climaacutetico es importante la metodologiacutea de muestreo

como lo fue el formato de muestreo en puntos aleatorios realizado en el presente estudio se llevoacute

acabo principalmente por la homogeneidad de los frailejones en el paacuteramo como lo indica el

manual de meacutetodos baacutesicos de muestreo y anaacutelisis de ecologiacutea vegetal (BOLFOR 2000 9) donde

se menciona que el muestreo aleatorio se utiliza cuando se dispone de poca informacioacuten previa de

las caracteriacutesticas de las poblaciones a medirse en este caso la poblacioacuten a identificarse fueron

los hongos endoacutefitos que se hallaban dentro de las formaciones homogeacuteneas de los frailejones

No obstante el muestreo aleatorio tambieacuten presenta limitaciones a la hora de comparar los

hongos endoacutefitos a lo largo del gradiente altitudinal (muestreo aleatorio estratificado) dejando de

percibir informacioacuten proveniente de los distintos microclimas que se encuentran y de las

incidencias que podriacutean causar a la hora de identificar los geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten ademaacutes de posibles micro efectos del cambio climaacutetico a lo

largo del gradiente altitudinal (Caacutemara et al 2008)

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio Climaacutetico

Nigrospora X X X X X

Penicillium X X X

Pleospora X X X X

Trichoderma X X X X

42

Las teacutecnicas empleadas en este estudio para lograr aislar e identificar los hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana se hacen importantes dentro del cambio

climaacutetico debido a que el margen de error en la identificacioacuten molecular es reducido (Bakermans

et al 2014) Al ser reducido el margen de error se pudo conocer con mayor certeza que especies

y geacuteneros de hongos endoacutefitos se encuentra dentro de la planta

Al conocer sus identidades es posible conocer las capacidades que tienen cada una de

estas especies de hongos endoacutefitos de producir metabolitos secundarios de infiltrarse y proteger

los tejidos de la planta de condiciones bioacuteticas y abioacuteticas competir contra herbiacutevoros y

fitopatoacutegenos (Schulz et al 2002) Con sus capacidades reconocidas es posible vincular los

efectos del cambio climaacutetico como estreacutes hiacutedrico aumento de la temperatura migraciones

tempranas enfermedades emergentes aumentos de la precipitacioacuten y heladas severas con las

reacciones por parte de los hongos endoacutefitos Estas reacciones podriacutean desencadenar aumentos de

la patogenicidad en las poblaciones de frailejones debido a los constantes disturbios y estreacutes al

que se ve sometido la planta generando asiacute notables declives poblacionales (Mendoza 2010)

Las relaciones filogeneacuteticas entre las especies halladas toman relevancia debido a las

sinergias positivas o negativas que se pueden presentar dependiendo de las especies que se

encuentren asociadas dentro de la planta (Lamichhane y Venturi 2015) como por ejemplo

Nigrospora y Colletotrichum pueden activar una sinergia negativa aumentando la virulencia y

afectando la especie Espeletia hartwegiana

Las especies de hongos endoacutefitos se identificaron por medio de secuencias obtenidas de

las regiones ITS (regioacuten de espaciadores internos transcritos) las cuales son regiones altamente

conservadas con tasas de evolucioacuten muy lentas en el tiempo permitiendo hacer inferencias

filogeneacuteticas (Baldwin et al 1995 Hamby y Zimmer 1992) es por ello que se usaron para

generar las diferentes identificaciones de los hongos endoacutefitos logrando asiacute identificar al geacutenero

Nigrospora con un total de 7 especies N sacchari N rubi N sphaerica N hainanensis N

gorlenkoana N oryzae y N aurantiaca pertenecientes a la familia Apiosporaceae orden

Xylariales Divisioacuten Ascomicota (veacutease figura 11) (Wang et al 2017)

Dentro del marco del cambio climaacutetico Nigrospora se caracteriza por poseer una

distribucioacuten cosmopolita y una amplia gama de hueacutespedes como lo es en este caso la especie E

hartwegiana que habita en los Andes Tropicales que se veraacuten alterados por los efectos del

cambio climaacutetico este geacutenero se ha logrado aislar en su forma endoacutefita en tallos y hojas de

43

diversas plantas tambieacuten como saprofitos en detritos hojarasca y larvas muertas (Uzor et al

2015 1)

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

Los hongos endoacutefitos hallados en esta investigacioacuten se encontraron dentro de la especie

de frailejoacuten E hartwegiana la cual pertenece a los Andes Tropicales ubicados maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos Estos ecosistemas son sensibles a los efectos del cambio

climaacutetico por su altura su alto endemismo y su sensibilidad al efecto de borde Cuando las

especies lentildeosas empiecen a migrar a lo largo del gradiente altitudinal es posible que los

frailejones se encuentren con suelos agrestes en donde sus semillas no podraacuten fijarse y los efectos

adversos de hongos como Nigrospora N oryzae y N sphaerica seraacuten maacutes notables

aprovechando las ventanas de oportunidad que generen los desbalances climaacuteticos (Sharma et al

2013)

Los cambios en los patrones climaacuteticos potenciaran la especie N sphaerica dentro del

frailejoacuten la cual tiene la capacidad de causar tizoacuten foliar en la especie Camellia sinensis siendo

una planta de teacute perteneciente a la divisioacuten de las magnolifiotas como el geacutenero Espeletia (Liu et

al 2015) Nigrospora fue el geacutenero maacutes ampliamente aislado en las identificaciones generadas a

partir de las hojas de frailejoacuten esto se veriacutea explicado debido a que N sphaerica tiene un

mecanismo de descarga de esporas efectivo que puede proyectar a la fuerza sus esporas a una

distancia de hasta 2 cm en vertical y 68 cm en horizontal como lo demostroacute Webster (1952)

ademaacutes el estudio de Wu y colaboradores (2004) tambieacuten evidencioacute que las esporas de

44

Nigrospora son uno de los grupos maacutes dominantes en la atmoacutesfera y estaacuten asociadas con

tormentas de polvo

La gran capacidad colonizadora del geacutenero Nigrospora le permite adaptarse a las

condiciones climaacuteticas cambiantes con la estrategia de dispersioacuten de sus esporas logrando

distanciarse del frailejoacuten hospedero para encontrar nuevos hospederos producto de las

migraciones tempranas a lo largo del gradiente altitudinal (Riveros 2010)

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

por encima del 80 lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen menos

mutaciones en los nodos internos del aacuterbol basados en la distribucioacuten de probabilidad asignadas

a los posibles arboles resultantes dando lugar a una hipoacutetesis evolutiva maacutes confiable (Schmidt y

Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 es decir el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes

corto (menos cambios) y el cual se ajusta mejor a los datos (Swofford 1997)

Teniendo asiacute una inferencia filogeneacuteticamente robusta los geacuteneros Collectotrichum y

Nigrospora pertenecen a la Divisioacuten Ascomycota ambos geacuteneros son particularmente agresivos

con las plantas en especial la especie Colletotrichum gloeosporioides la cual es la fase asexual

de Glomerella cingulata (Raj et al 2013) Se caracteriza por tener un amplio rango de

hospederos entre ellos el frailejoacuten a los cuales les causa una enfermedad conocida pudricioacuten

amarga antracnosis o chancros siendo esta la necrosis de frutos flores nervios y tallos

(Gonzaacutelez et al 2006 4)

Uno de los primeros reportes de afectaciones a especies de frailejoacuten se obtuvo en el 2009

en el Parque Natural Nacional Chingaza Colombia en donde encontraron las especies de

frailejoacuten Espeletia grandiflora y Espeletia uribei afectadas debido a insectos y una especie de

hongo del genero Colletotrichum (Medina 2009- 9 Hartung y Burton 1981)

Por ende que estos dos geacuteneros de hongos se encuentren juntos podriacutea tener

implicaciones en el aumento de virulencia potenciado a su vez por los desbalances abioacuteticos

causados por el cambio climaacutetico como lo han mencionado Belisario y colaboradores (2002) es

posible que las afectaciones no sean producidas por un uacutenico hongo si no por un complejo de

varios generando sinergismos entre diferentes especies que solas no hariacutean dantildeo a la planta pero

juntas podriacutean ser causantes de enfermedad (Lamichhane y Venturi 2015 4) aun mas en un

45

marco de cambio climaacutetico que gradualmente aumenta sus efectos nocivos sobre los paacuteramos

aumentando la temperatura cambios en la precipitacioacuten heladas intensas cambios en la

nubosidad mayor exposicioacuten a la radiacioacuten solar teniendo por resultado un iacutendice de estreacutes

mayor en las plantas de paacuteramo generando ventanas de oportunidades para que los hongos

endoacutefitos modifiquen sus roles de protector a patoacutegeno

En frailejones tambieacuten se ha reportado la presencia de Nigrospora y Trichoderma por

Bonilla y Argenis (2005) maacutes especiacuteficamente en la especie Espeletia grandiflora la cual es una

especie que habita en los paacuteramos de Colombia Ecuador y Venezuela en conjunto con Espeletia

hartwegiana (Luteyn 1999 3) El hecho que existan estos dos geacuteneros presentes en los frailejones

advierte de un equilibrio entre hongos endoacutefitos que se puede romper bajo las tensiones del

cambiante clima maacutes aun en los sensibles paacuteramos alto andinos

En cuanto a N sacchari se tiene reporte que es un productor de metabolitos con una

notable actividad herbicida demostrado en plantas cultivadas en invernadero (Fukushima et al

1998 2) debido a que existe evidencia que sugiere que los hongos endoacutefitos han evolucionado

directamente de hongos patoacutegenos (Schulz et al 1999 4) sumado al estreacutes del cambio climaacutetico

en cualquier momento de extrema tensioacuten hiacutedrica caloacuterica o heladas en estos ecosistemas de alta

montantildea Estos anomaliacuteas ambientales podriacutea disparar mecanismos de accioacuten fitopatoacutegenos

dentro de los frailejones generando un declive notable en sus poblaciones y por ende un declive

de la cantidad recurso hiacutedrico aguas abajo y su regulacioacuten (Diacuteaz et al 2002 5)

Como se mencionoacute anteriormente los medios de propagacioacuten de estos hongos endoacutefitos

pueden ser por medio de esporas que estaacuten en el ambiente aunque tambieacuten los vectores que

juegan un rol clave en su dispersioacuten son los insectos ya que estos pueden transportar esporas o

partes del hongo en su cuerpo patas o aparato bucal (Eigenbrode et al 2018 5)

Considerando la dispersioacuten homogeacutenea de los frailejones dentro del paacuteramo la carga

esporas en el ambiente y la herbivoriacutea de insectos es probable que se puedan ver infectados la

mayoriacutea de individuos (Varela 2016) es por ello que en el futuro puede que las afectaciones en

frailejones no sean producidas por hongos fitopatoacutegenos si no por hongos endoacutefitos que tuvieron

la ventana de oportunidad gracias al cambio climaacutetico aumento de la temperatura aumento en

las concentraciones de CO2 y alteraciones de precipitacioacuten que pueden hacer susceptible la planta

al ataque de estos hongos (Chakraborty 2011 Elad y Pertot 2014)

46

Para que se genere la enfermedad esta depende de la interaccioacuten de tres o cuatro factores

1) hospedero susceptible 2) agente causal (virulento) 3) condiciones ambientales favorables y 4)

tiempo (Francl 2001 2) la falta de alguno de ellos no permite que el patoacutegeno produzca la

enfermedad en la planta debido a ello algunas especies de frailejoacuten pueden tener una o dos cepas

que puedan actuar como fitopatoacutegenos pero no estaacuten activas si no estaacute completa su asociacioacuten

con otro patoacutegeno u otro factor

Ademaacutes existe un estudio que evaluoacute el efecto de la temperatura sobre la capacidad de

Fusarium verticillioides para generar infeccioacuten en plantas de maiacutez se probaron bajo 3 escenarios

de temperatura como resultados obtuvieron que la enfermedad de este hongo se veiacutea potenciada

por el aumento de temperatura en temperaturas por encima de 35degC (Murillo et al 2008) este

estudio da soporte a la hipoacutetesis de que existen factores que influyen significativamente a la

infeccioacuten en la planta tal vez el paacuteramo difiacutecilmente alcance 35degC no obstante la mayoriacutea de

especies son sensibles a cambios de temperatura de hasta de 1degC en donde modifican su

comportamiento rutas metaboacutelicas interacciones ecoloacutegicas y por ende sus defensas se ven

alteradas

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e Hypocrea

El geacutenero Trichoderma con seis especies diferentes (veacutease figura 12) fue el segundo

geacutenero maacutes numeroso despueacutes de Nigrospora que contoacute con siete especies aunque las primeras

especies que se analizaron fueron especies que principalmente actuaban generando enfermedades

en las plantas en las que se encontraban ante disturbios el geacutenero Trichoderma pertenece a la

47

familia Hypocreaceae y se caracteriza por tener una gran capacidad biocontroladora sobre

fitopatoacutegenos como Fusarium oxysporum los cuales podriacutean llegar masivamente con las

migraciones tempranas de insectos y plantas lentildeosas (Miles et al 2012 7)

No solo actuacutean repeliendo patoacutegenos internos si no tambieacuten patoacutegenos externos como

insectos que desean consumir u aprovechar la planta ya que estos pueden secretar diferentes

metabolitos secundarios y enzimas que actuacutean inhibiendo su desarrollo (Boughalleb-M et al

2018 8)

Es bien conocido que el geacutenero Trichoderma produce amplio rango de sustancias

antibioacuteticas ademaacutes de poseer la caracteriacutestica de parasitar otros hongos (Howell 2002 6)

Debido a la competencia que generan las especies del genero Trichoderma por espacio y

nutrientes inhiben o degradan pectinasas y otras enzimas que son esenciales para que los hongos

fitopatoacutegenos como Botrytis cinerea penetre en la superficie de las hojas logrando proteger de

esta forma al frailejoacuten que se veraacute expuesto a nuevas amenazas microbioloacutegicas auspiciadas por

los cambios en los patrones climaacutetico (Zimand et al 1996)

Ademaacutes de la capacidad del Trichoderma sp para atacar o inhibir el crecimiento de

patoacutegenos de plantas directamente descubrimientos recientes indican que tambieacuten pueden inducir

resistencia sisteacutemica y localizada a una variedad de patoacutegenos de plantas tales como el frijol es

protegido por Trichoderma harzianum de especies fitopatoacutegenas como Colletotrichum

lindemuthianum Botrytis cineacuterea las cuales producen lesiones en las hojas de la planta (Harman

y Howell 2004) Incluso se descubrioacute que ciertas especies de Trichoderma tienen una influencia

sustancial en el buen crecimiento y desarrollo de las plantas sin y con condiciones de estreacutes

climaacutetico (Lorito 1998)

Como lo demostraron Bonilla y Argenis (2005) en su estudio llevado a cabo en el

frailejoacuten Espeletia grandiflora diferentes cepas pertenecientes a Trichoderma pueden proteger

esta especie de paacuteramo de organismos fitopatoacutegenos emergentes por el cambio climaacutetico por

ende si puede proteger a E grandiflora tambieacuten puede proteger la especie E hartwegiana lo

que le permitiraacute sobrellevar diferentes ataques fortuitos de patoacutegenos e insectos que nunca han

logrado alcanzar las altitudes de paacuteramo (3200 - 5000 m)

Cuando el cambio climaacutetico aumente la temperatura en 1degC o 2degC traeraacute consigo sus

efectos de modificacioacuten en cuanto a la estructura y composicioacuten de las especies de plantas que

48

existen en zonas altas para este escenario basado en los caacutelculos de Thuiller (2007) las especies

se habriacutean desplazado en el gradiente altitudinal aproximadamente 450 metros para el antildeo 2070

Las consecuencias de este desplazamiento serian uacutenicas debido a que gran cantidad de

insectos y patoacutegenos tendriacutean migraciones tempranas en el gradiente altitudinal en buacutesqueda de

su optimo teacutermico llevando a cabo un proceso conocido como Termofilizacioacuten (Cuesta et al

2019) es ahiacute donde entra en juego la proteccioacuten que le pueden brindar especies endoacutefitos como

las que pertenecen al geacutenero Trichoderma en el marco de cambio climaacutetico

En concordancia con las cepas de Trichoderma y el geacutenero Hypocrea que tambieacuten

pertenece a la familia Hypocreaceae se conocen maacutes de 700 secuencias de peptaiboles (peacuteptidos

bioloacutegicamente activos) de ambos geacuteneros donde algunos de eacutestos son ecoloacutegica y

comercialmente relevantes debido a su potencial antimicrobiano actividad enzimaacutetica uacutetil para

competir por espacio y alimento de los nuevos patoacutegenos emergentes procedentes de las

alteraciones climaacuteticas y las migraciones tempranas (Degenkolb et al 2008 6)

En cuanto al geacutenero Hypocrea tambieacuten se ha reportado actividad antimicrobiana y anti

fuacutengica contra Staphylococcus aureus y Fusarium oxysporum (Gogoi et al 2008 2) habitando

los geacuteneros Trichoderma e Hypocrea dentro de especies de frailejoacuten como E hartwegiana se

espera que puedan generar sinergias de proteccioacuten que las ayude a combatir los fuertes y

extremos eventos climaacuteticos

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

del 100 (veacutease figura 13) lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen

menos mutaciones en los nodos internos del aacuterbol por ende este aacuterbol contiene la menor

cantidad de mutaciones o cambios dentro sus nodos internos teniendo como resultado una

hipoacutetesis evolutiva confiable (Schmidt y Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 que

indica que el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes corto (menos cambios) y el cual se ajusta

mejor a los datos (Swofford 1997)

49

El geacutenero Annulohypoxylon es de importancia dentro del marco del cambio climaacutetico ya

que pertenece a la familia Xylariaceae y se caracteriza por poseer metabolitos secundarios

antitumorales-citotoacutexicos como la anuloescuamulina que ayudan a combatir el estreacutes abioacutetico

(Cheng et al 2012) estas cepas de hongos son principalmente saprofitos y oportunistas han sido

reportadas en hojas sanas y afectadas de frailejones en otros estudios (Gonzaacutelez 2012 Nonsoque

2012) siendo un geacutenero resiliente a las perturbaciones ambientales como los cambios en los

patrones climaacuteticos su relacioacuten como mutualista dentro del frailejoacuten se mantendraacute hasta que el

frailejoacuten se adapte o colapse ante el estreacutes abioacutetico

Aunque no se conocen como fitopatoacutegenos al contrario pueden actuar como mutualistas

no se descarta que puedan estar involucrados en el desarrollo de diferentes enfermedades en

plantas cuando las condiciones ecosistemicas se alteran a puntos extremos (Gonzalez et al 2017)

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon Biscogniauxia

Nemania y Humiacutecola

El geacutenero Daldinia posee unos valores de MPML correspondientes a 10094 con lo cual

se encuentra bien soportado estadiacutesticamente el geacutenero Daldinia se encuentra ubicado en la

familia Xylariaceae al igual que el geacutenero Hypoxylon Biscogniauxia y Nemania que en su

respectivo orden contienen un soporte estadiacutestico MPML de 10082 10099 y 100100 (veacutease

figura 14) los cuales pertenecen a la divisioacuten Ascomycota las cepas de Daldinia se caracterizan

principalmente por ser especies endoacutefitas teniendo la capacidad de estar dentro de su hueacutesped

mucho tiempo sin causarle dantildeo o al menos un dantildeo evidente por medio de su estado asexual

50

No obstante su estado se puede modificar cuando las condiciones externas se modifican

abruptamente en poco tiempo como es el caso de las alteraciones en la temperatura

precipitacioacuten y concentraciones de dioacutexido de carbono (CO2) auspiciados por el cambio

climaacutetico (Saacutenchez et al 2013)

Un estudio realizado por Prieto (2017) en la especie de frailejoacuten E grandiflora encontroacute

que la especie Daldinia eschscholtzii estaba asociado en el siacutentoma de clorosis (falta de clorofila

en las hojas) Tambieacuten se reportoacute que especies de Daldinia como Daldinia conceacutentrica tienen la

capacidad de controlar nematodos fitopatoacutegenos (Silva et al 2020 104) los cuales pueden invadir

y romper los tejidos de la planta dantildeando sus estructuras los nematodos tambieacuten seraacuten sujetos a

migraciones tempranas por el cambio climaacutetico que trae consigo presiones de seleccioacuten por ende

nuevas amenazas para los frailejones (Nakashima et al 2007)

Como hemos visto hasta este punto las especies de hongos endoacutefitos se muestran en

muchos casos como benefactores y protectores de las diferentes plantas en las que habitan

incluyendo diferentes especies de frailejones

Los hongos endoacutefitos protegen tanto de factores bioacuteticos como virus hongos

fitopatoacutegenos bacterias insectos y factores abioacuteticos como las intemperancias del clima no

obstante en su relacioacuten endoacutefita geacuteneros como Hypoxylon que pertenece igual que Daldinia a la

familia Xylariaceae pueden tener roles amenazadores en conjunto con el cambio climaacutetico

seguacuten Gonzales y colaboradores (2019) inocularon cepas pertenecientes al geacutenero Hypoxylon en

hojas de Theobroma cacao y encontraron que en 48 horas se comenzoacute a notar las marcas de

clorosis y deshidratacioacuten foliar esto demuestra que cepas de este geacutenero pueden tener efectos

fitopatoacutegenos ocasionando muerte descendente pudricioacuten del tronco negro y resinosis de ramas

de mezquite (De la Torre-Almaraacutez et al 2003 De la Torre-Almaraacutez et al 2009)

La presencia de este geacutenero dentro del frailejoacuten en un marco del cambio climaacutetico lo

convierte en una amenaza latente ya que las condiciones seraacuten cada vez maacutes agrestes en los

paacuteramos de los Andes Tropicales Puede favorecer el desarrollo de este geacutenero que tiene las

enzimas necesarias para producir la pudricioacuten del tronco negro entre otras enfermedades

relevantes

51

Tambieacuten las especies del geacutenero Hypoxylon se han reportado como endoacutefitos en tejidos de

plantas lentildeosas o herbaacuteceas (Petrini y Petrini 1985 3) asiacute como saprofitos o fitopatoacutegenos

deacutebiles en madera de aacuterboles de zonas templadas o tropicales (Miller 1961) como lo menciona

Miller (1961)

Los geacuteneros Biscogniauxia Nemania tambieacuten estaacuten dentro de la familia Xylariaceae y

Divisioacuten Ascomycota un aspecto interesante de las especies de Biscogniauxia es que son

paraacutesitos exclusivos de las angiospermas dicotiledoacuteneas en donde concluyeron que todas las

especies pertenecientes a este geacutenero son patoacutegenos umllevesuml que se aprovechan de situaciones de

sequiacutea y estreacutes hiacutedrico para aumentar su patogenicidad (Ju et al 1998)

La especie de frailejoacuten E hartwegiana es una Dicotiledoacutenea eso explica porque

podemos encontrar esta especie de hongo endoacutefito en el frailejoacuten del presente estudio siendo de

vital importancia denotar que las especies de Biscogniauxia se aprovechan especialmente de las

situacioacuten de sequiacutea y estreacutes hiacutedrico difiacutecilmente las especies de este geacutenero podriacutean afectar a los

frailejones debido a que se caracterizan por ser reguladores de los ciclos hiacutedricos el agua es el

recurso que maacutes tiende a existir en un paacuteramo por la estructura de sus suelos compuesta por

andosoles porosos y necromasa acumulada teniendo asiacute un alto iacutendice de retencioacuten hiacutedrica

(Hernandez y Muntildeoz 2015) de modo que el cambio climaacutetico no favorece al geacutenero

Biscogniauxia en su estado patogeacutenico dentro del ecosistema de paacuteramo

En cuanto al geacutenero Nemania Da Silva y colaboradores (2018) llevaron a cabo una

investigacioacuten en la cual identificaron cepas pertenecientes a los geacuteneros Colletotrichum

Phyllosticta Xylaria Nemania y Alternaria en la especie ornamental Pachystachys lutea en

donde las mismas cepas fueron ensayadas para inhibir el crecimiento de hongos fitopatoacutegenos

como Colletotrichum sp en donde encontraron que Nemania era capaz de inhibir por medio de la

secrecioacuten de distintas enzimas el crecimiento de dichas especies gracias a su actividad

enzimaacutetica el geacutenero Nemania puede compensar los desequilibrios causados por el cambio

climaacutetico en teacuterminos de hongos fitopatoacutegenos

Hay que tener en cuenta que los elementos que dan forma a las interacciones planta-

endoacutefito incluyen el modo de transmisioacuten el patroacuten de infeccioacuten la edad de la planta las

condiciones ambientales potenciadas por el cambio climaacutetico y los antecedentes geneacuteticos (Aly et

al 2011 6) Los frailejones de la especie E hartwegiana que se muestrearon para el estudio se

52

tomoacute las hojas sanas lo que indica que poseiacutean estas cepas de endoacutefitos en equilibrio siendo este

uno de los pocos reportes de este geacutenero en especies de alta montantildea en los Andes Tropicales

El geacutenero Humiacutecola se encuentra soportado por un MPML de 10076 siendo una

hipoacutetesis evolutiva considerable es el uacutenico de la figura 14 que no estaacute dentro de la familia

Xylariaceae ya que pertenece a la familia Chaetomiaceae aunque se halla en la divisioacuten

Ascomycota se podriacutea considerar a la especie Humiacutecola fuscoatra como una de las especies de

endoacutefitos maacutes umlinofensivasuml debido a trabajos de investigacioacuten reportados como el de Menzies y

colaboradores (1998) y el de Naik y colaboradores (2009)

Humiacutecola fuscoatra no se considera un peligro latente para la especie E hartwegiana ya

que existe en equilibrio con su entorno Estaacute comprobado por medio de caracterizaciones

quiacutemicas que Humiacutecola fuscoatra es un importante productor de moleacuteculas de estimacioacuten

medica como el resorciacuteclico y lactonas aacutecidas (Mejia et al 2014) Por lo tanto es una especie

prometedora con un reservorio de metabolitos secundarios de importancia medicinal e industrial

que de seguir los efectos nocivos del cambio climaacutetico en los Andes Tropicales maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos esta especie podriacutea desaparecer

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies Massarina

Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

Uno de los grupos mejores soportados en este cladograma es el grupo de Diaporthe en el

cual se encontraron cuatro especies siendo uno con maacutes abundancia de especies del estudio y que

posee un MPML de 10085 10089 y 10095 acorde a sus 3 nodos (veacutease figura 15) teniendo asiacute

una hipoacutetesis evolutiva confiable de estas relaciones las especies de Diaporthe pertenecen a la

familia Diaporthaceae de la divisioacuten Ascomycota y son especies de endoacutefitos que se distinguen

por inhibir el crecimiento de hongos patoacutegenos en el hospedero que se encuentren El estudio de

53

Da Silva y colaboradores (2018) mostroacute que cepas de Diaporthe sp Inhibieron el crecimiento de

Fusarium oxysporum y Colletotrichum sp hongos fitopatoacutegenos que aumentaran su presencia

aprovechando las alteraciones producidas por el cambio climaacutetico en los paacuteramos

Las especies de este geacutenero estaacuten en continuo cambio entre endoacutefitos y patoacutegenos

funcionando en la mayoriacutea de los casos en una relacioacuten mutualista en donde le brindan a la planta

mayor tolerancia a las sequias proteccioacuten de patoacutegenos y pestes caracteriacutestica uacutetil frente a los

retos ecoloacutegicos que plantea el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales (Hubbard et al 2014)

se conocen cerca de 800 especies de este geacutenero asociadas a una amplia gama de plantas

vasculares a nivel mundial (Rossman et al 2015)

Esto explica porque las especies de Diaporthe fueron una de las maacutes numerosas

encontradas en la especie de alta montantildea E hartwegiana teniendo en cuenta que esta especie

pasa raacutepidamente de un estado endoacutefito a un estado patogeacutenico y dada su faacutecil y alta distribucioacuten

representa un peligro en conjunto con el cambio climaacutetico para las especies de alta montantildea como

los frailejones y supone una amenaza para el balance hiacutedrico y ecosistemico en el futuro

El geacutenero Crassiparies de la familia Neohendersoniaceae y el geacutenero Massarina de la

familia Massarinaceae pertenecen al orden Pleosporales aunque se discute debido a las

similaridades morfoloacutegicas y genoacutemicas con Massarina si Crassiparies deberiacutea estar en la

familia Massarinaceae (Hyde et al 2013 4) Se tiene poca informacioacuten sobre la especie

Crassiparies quadrisporus por ende este puede ser uno de los primeros reportes de esta especie

en una especie de alta montantildea como lo es el frailejoacuten especiacuteficamente en la especie E

hartwegiana en un marco de cambio climaacutetico el geacutenero Crassiparies necesita mayores estudios

a nivel ecoloacutegico y microbioloacutegico para entender su papel dentro de esta crisis climaacutetica

Mientras tanto el geacutenero Massarina ha logrado ser aislado de agua dulce con el fin de

obtener fuentes de productos naturales bioloacutegicamente activos por medio de las investigaciones

quiacutemicas de Shearer (1999 2001) en una especie de Massarina obtuvieron como resultado el

aislamiento de tres nuevos sequiterpenoides y dos lactonas derivadas de policeacutetidos con nuevos

sistemas de anillos lo que indica que esta especie tambieacuten puede tener un rol importante

mediante la produccioacuten de enzimas y metabolitos secundarios en el marco de las invasiones

bioloacutegicas impulsadas por el cambio climaacutetico

54

El geacutenero Cryptocoryneum de la familia Cryptocoryneaceae existe poca informacioacuten de

sus mecanismos de accioacuten como endoacutefito o patoacutegeno maacutes aun en especies de los Andes

Tropicales este podriacutea ser uno de los primeros reportes sobre esta especie de hongo en una

especie de frailejoacuten especiacuteficamente E hartwegiana en el 2015 se reportoacute en Brasil el

descubrimiento de una nueva especie del genero Cryptocoryneum trataacutendose de Cryptocoryneum

parvulum hallada en las hojas de la especie Araucaria angustifolia (Gimnosperma) (Silva et al

2015 1) la informacioacuten sobre el geacutenero Cryptocoryneum en relacioacuten al cambio climaacutetico y sus

efectos dentro de especies de alta montantildea como el frailejoacuten auacuten son poco conocidas

Uno de los geacuteneros maacutes cercanos a los grupos externos del cladograma es Cyphellophora

perteneciente a la familia Cyphellophoraceae el cual posee un MPML de 10091 logrando una

hipoacutetesis evolutiva confiable Diversas especies de Cyphellophora han logrado ser aisladas de

infecciones superficiales de la piel o las untildeas en humanos y de materiales vegetales (Decock et

al 2003 Cheewangkoon et al 2009) Esto indica su amplia distribucioacuten y su capacidad para ser

patogeacutenica tanto en plantas como en animales maacutes aun en condiciones desfavorables para la

planta como son las condiciones de cambio climaacutetico

De la especie Cyphellophora reptans se tiene reporte que su morfologiacutea es muy similar a

la de una levadura por lo que es faacutecilmente confundida con una (Reacuteblovaacute et al 2013) Es posible

que este sea el uacutenico reporte de Cyphellophora reptans en las hojas de un frailejoacuten o especie de

alta montantildea que habite en los troacutepicos como E hartwegiana debido a ello sus mecanismos de

accioacuten en especies de paramo dentro de un marco de cambio climaacutetico es poco conocido Se

necesitan mayores estudios enfocados en esta especie para entender su ecologiacutea y dinamismo

ecoloacutegico respecto a los cambios en las variables ambientales

Se eligieron las especies Coprinellus domesticus y Coprinellus xanthothrix como grupos

externos con el fin de enraizar el aacuterbol debido a que pertenecen a la Divisioacuten Basidiomycota la

cual difiere en grado de la divisioacuten Ascomycota aunque conserva semejanzas conocidos como

caracteres ancestrales o plesiomorficos que avanzan a medida la filogenia se construye con los

datos de las diferentes secuencias de especies evidenciando novedades evolutivas conocidas

como apomorfias que cuando se dan en un grupo en particular pasan a ser sinapomorfias es decir

novedades evolutivas dentro de un grupo particular (Lehtonen 2020) Se optoacute por enraizar con

55

estas dos especies con el objetivo de dar robustez al aacuterbol filogeneacutetico (Barriel y 1998) lo cual se

consiguioacute como se nota en los estadiacutesticos del aacuterbol filogeneacutetico

56

57

Conclusiones

Se rechaza la hipoacutetesis nula (H0) y se concluye que la identificacioacuten y caracterizacioacuten

molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo Colombia es diferente en 80 de sus geacuteneros y

especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos realizadas en especies de frailejoacuten

Por lo tanto los nuevos geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos encontrados en el frailejoacuten

plantean nuevos desafiacuteos respecto al cambio climaacutetico ya que tienen un rol vital en la

supervivencia de estas especies de alta montantildea como los frailejones debido a su relacioacuten

mutualista o patoacutegena maacutes aun en los paacuteramos que son altamente sensibles a los efectos del

cambio climaacutetico incluso tan sensibles como las zonas polares (Bradley et al 2006)

La mayoriacutea de especies encontradas en el presente estudio tienen potencial para ayudar a

combatir el estreacutes abioacutetico producido por el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales

Especiacuteficamente pueden ayudar a combatir el estreacutes bioacutetico producido por virus hongos

bacterias e insectos en un marco de cambio climaacutetico aumentos de temperatura cambios en la

concentracioacuten de CO2 cambios en la precipitacioacuten migraciones tempranas cambios en la

nubosidad disponibilidad hiacutedrica alteraciones en la estructura y composicioacuten de las especies

endeacutemicas del paacuteramo

58

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Thomas T Gilbert J Meyer F 2012 laquoMetagenomics - a guide from sampling to data

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Thuiller Wilfried 2007 Biodiversity climate change and the ecologist Nature 448 550-552

12 de noviembre 101038448550a

Uzor PF Ebrahim W Osadebe PO 2015 Metabolites from Combretum dolichopetalum and its

associated endophytic fungus Nigrospora oryzae ndashevidence for a metabolic partnership

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Varela A 2015 ldquoAnaacutelisis de la relacioacuten hongos patoacutegenos ndash afectacioacuten de frailejones en el

Parque Nacional Natural Chingazardquo Informe final actividades proyecto Bogotaacute DC

Colombia Pontificia Universidad Javeriana

mdashmdashmdash 2016 Aunar esfuerzos teacutecnicos y cientiacuteficos para desarrollar una investigacioacuten

participativa sobre el efecto de la transformacioacuten antroacutepica del paacuteramo en las

interacciones planta- insecto-hongo en los E argentea y E grandiflora)

Vaacutesquez Ceroacuten A Buitrago Castro A C 2017 El gran libro de los paacuteramos Instituto de

Investigacioacuten de Recursos Bioloacutegicos Alexander von Humboldt

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Wood S N 2001 umlmgcv GAMs and generalized ridge regression for R R newsuml 1 (2) 20-25

Wu PC Tsai JC Li FC 2004 Increased levels of ambient fungal spores in Taiwan are associated

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Yan L Zhu J Zhao X Shi J Jiang C Shao D 2019 Beneficial effects of endophytic fungi

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Zhang T Yao YF 2015 Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in

the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific Plos One 10 (6)

73

Anexos

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombia

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia

hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

74

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

Coordenadas Geograacuteficas

(Latitud)

De la Colecta del

Material Bioloacutegico total de 15

muestras (Longitud)

LAT N 4deg 37 5871717 LONG W 75deg 25

3292611

LAT N 4deg 37 5885220 LONG W 75deg 25

3271217

LAT N 4deg 37 5884485 LONG W 75deg 25

3312103

LAT N 4deg 36 5995487 LONG W 75deg 27

3045854

LAT N 4deg 37 6195784 LONG W 75deg 30

3292611

LAT N 4deg 40 159171 LONG W 75deg 26

380142

LAT N 4deg 40 363762 LONG W 75deg 26

209072

LAT N 4deg 40 399832 LONG W 75deg 27

173554

LAT N 4deg 40 383965 LONG W 75deg 27

464325

LAT N 4deg 39 486438 LONG W 75deg 27

173559

LAT N 4deg 40 56894 LONG W 75deg 26

568287

LAT N 4deg 40 159174 LONG W 75deg 27

190654

LAT N 4deg 40 125083 LONG W 75deg 26

345912

LAT N 4deg 40 116691 LONG W 75deg 27

208264

LAT N 4deg 40 314698 LONG W 75deg 27

140791

75

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un estereoscopio con el propoacutesito de seleccionar la

maacutes indicada y luego sembrar un cultivo puro a partir de ese micelio

76

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados las

copias se conservaron con glicerol a -80degC en un ultra congelador de Thermo Scientifictrade

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas

y enviadas

77

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicos de forma segura y esteacuteril propiedad de la Universidad del Quindiacuteo

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a la Universidad Ruhr de Bochum (Alemania)

78

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de parsimonia

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X en donde se

observa en amarillo la secuencia umlTCATTAuml la cual es una secuencia altamente conservada

que se usa para marcar el inicio de la misma en hongos endoacutefitos

79

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa JmoldelTest usados para generar el

aacuterbol de relaciones filogeneacuteticas a partir de la regioacuten ITS de los hongos endoacutefitos aislados

total de modelos evaluados 88

ID Nombre Particioacuten lnL P AIC detaAIC Peso Cumpeso Udelta

1 JC 0 100820157 138 204400314 1341348 0 1 -

2 JC+I 0 98912511 139 200605022 9618188 0 1 -

3 JC+G 0 95470113 139 193720225 2733392 0 1 -

4 JC+I+G 0 95467507 140 193735014 274818 0 1 -

5 F81 0 100658095 141 204136189 13149356 0 1 -

6 F81+I 0 98761481 142 200362962 9376128 0 1 -

7 F81+G 0 95314814 142 193469628 2482794 0 1 -

8 F81+I+G 0 95324364 143 193508729 2521895 0 1 -

9 K80 10010 99734495 139 20224899 11262157 0 1 -

10 K80+I 10010 97835191 140 198470382 7483549 0 1 -

11 K80+G 10010 94227821 140 191255643 268809 0 1 -

12 K80+I+G 10010 94209963 141 191239926 253092 0 1 -

13 HKY 10010 99648091 142 202136181 11149348 0 1 -

14 HKY+I 10010 97761512 143 198383024 7396191 0 1 -

15 HKY+G 10010 94170799 143 191201599 214765 0 1 -

16 HKY+I+G 10010 94118678 144 191117357 130523 600E-04 0999 -

17 TrNef 10020 99564653 140 201929306 10942472 0 1 -

18 TrNef+I 10020 97712623 141 198245245 7258412 0 1 -

19 TrNef+G 10020 94150977 141 191121955 135121 400E-04 09994 -

20 TrNef+I+G 10020 94132131 142 191104263 117429 00011 09959 -

21 TrN 10020 99563809 143 201987618 11000784 0 1 -

22 TrN+I 10020 97702964 144 198285929 7299095 0 1 -

23 TrN+G 10020 94094235 144 191068469 81635 00065 09719 -

24 TrN+I+G 10020 94101378 145 191102757 115923 00012 09948 -

25 TPM1 12210 99713879 140 202227759 11240925 0 1 -

26 TPM1+I 12210 97826641 141 198473282 7486449 0 1 -

27 TPM1+G 12210 94249837 141 191319674 33284 0 1 -

28 TPM1+I+G 12210 942022 142 1912444 257566 0 1 -

29 TPM1uf 12210 99663473 143 202186945 11200112 0 1 -

30 TPM1uf+I 12210 97879458 144 198638917 7652083 0 1 -

31 TPM1uf+G 12210 94137349 144 191154699 167865 100E-04 09999 -

32 TPM1uf+I+G 12210 94141897 145 191183794 196961 0 1 -

80

33 TPM2 10212 99722544 140 202245087 11258254 0 1 -

34 TPM2+I 10212 97828213 141 198476426 7489592 0 1 -

35 TPM2+G 10212 94185859 141 191191718 204885 0 1 -

36 TPM2+I+G 10212 94153667 142 191147335 160501 100E-04 09998 -

37 TPM2uf 10212 99648091 143 202156182 11169348 0 1 -

38 TPM2uf+I 10212 97757018 144 198394035 7407202 0 1 -

39 TPM2uf+G 10212 941052 144 1910904 103566 00022 09904 -

40 TPM2uf+I+G 10212 9408801 145 19107602 89187 00044 0982 -

41 TPM3 12012 99768005 140 20233601 11349176 0 1 -

42 TPM3+I 12012 97958099 141 198736198 7749364 0 1 -

43 TPM3+G 12012 94227963 141 191275926 289093 0 1 -

44 TPM3+I+G 12012 94323885 142 191487769 500936 0 1 -

45 TPM3uf 12012 99625421 143 202110843 11124009 0 1 -

46 TPM3uf+I 12012 97770469 144 198420939 7434105 0 1 -

47 TPM3uf+G 12012 94165576 144 191211152 224319 0 1 -

48 TPM3uf+I+G 12012 94150861 145 191201721 214888 0 1 -

49 TIM1ef 12230 99592239 141 202004478 11017644 0 1 -

50 TIM1ef+I 12230 97822787 142 198485574 749874 0 1 -

51 TIM1ef+G 12230 94121043 142 191082087 95253 00033 09853 -

52 TIM1ef+I+G 12230 94122386 143 191104772 117939 00011 09969 -

53 TIM1 12230 99518653 144 201917306 10930473 0 1 -

54 TIM1+I 12230 9781156 145 19852312 7536286 0 1 -

55 TIM1+G 12230 94105198 145 191110396 123562 800E-04 09977 -

56 TIM1+I+G 12230 94087158 146 191094317 107483 00018 09922 -

57 TIM2ef 10232 99550617 141 201921233 109344 0 1 -

58 TIM2ef+I 10232 97704602 142 198249204 726237 0 1 -

59 TIM2ef+G 10232 94093484 142 191026968 40135 00516 0852 -

60 TIM2ef+I+G 10232 94073864 143 191007729 20895 0135 07169 -

61 TIM2 10232 99530022 144 201940044 1095321 0 1 -

62 TIM2+I 10232 97820158 145 198540315 7553482 0 1 -

63 TIM2+G 10232 94058678 145 191017356 30523 00834 08004 -

64 TIM2+I+G 10232 94060837 146 191041674 54841 00247 09248 -

65 TIM3ef 12032 99546286 141 201912572 10925739 0 1 -

66 TIM3ef+I 12032 97713931 142 198267862 7281028 0 1 -

67 TIM3ef+G 12032 94129376 142 191098753 111919 00014 09936 -

68 TIM3ef+I+G 12032 94112005 143 191084009 97176 0003 09883 -

69 TIM3 12032 99514376 144 201908751 10921918 0 1 -

70 TIM3+I 12032 97700023 145 198300047 7313213 0 1 -

71 TIM3+G 12032 94115323 145 191130646 143812 300E-04 09997 -

72 TIM3+I+G 12032 94096941 146 191113882 127048 700E-04 09984 -

73 TVMef 12314 9970418 142 20224836 11261526 0 1 -

74 TVMef+I 12314 97940598 143 198741196 7754363 0 1 -

81

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE (AIC)

75 TVMef+G 12314 94159829 143 191179657 192824 0 09999 -

76 TVMef+I+G 12314 94160993 144 191201987 215153 0 1 -

77 TVM 12314 99615991 145 202131982 11145148 0 1 -

78 TVM+I 12314 97746676 146 198413353 7426519 0 1 -

79 TVM+G 12314 94075503 146 191071005 84171 00057 09776 -

80 TVM+I+G 12314 94052588 147 191045176 58342 00208 09456 -

81 SYM 12345 99543166 143 201946331 10959498 0 1 -

82 SYM+I 12345 97757103 144 198394207 7407373 0 1 -

83 SYM+G 12345 94083056 144 191046112 59278 00198 09654 -

84 SYM+I+G 12345 94050035 145 19100007 13236 0198 05819 -

85 GTR 12345 99529525 146 20197905 10992217 0 1 -

86 GTR+I 12345 97686178 147 198312356 7325522 0 1 -

87 GTR+G 12345 94044194 147 191028387 41553 00481 09001 -

88 GTR+I+G 12345 94013417 148 190986834 0 03839 03839 -

15

Introduccioacuten

Hay un libro abierto siempre para

todos los ojos la naturaleza

(Jean-Jacques Rousseau 1712-1778)

El cambio climaacutetico corresponde a un fenoacutemeno que afecta el planeta de manera natural

permitiendo mantener las condiciones climaacuteticas como la temperatura la precipitacioacuten entre

otras en un rango aceptable para la vida (Jimeacutenez 2010) Sin embargo dado el aumento de las

emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) principalmente asociado a las actividades

humanas y el alto consumo de combustibles foacutesiles los cambios en dichas condiciones han sido

alterados dando paso a un acelerado aumento de temperatura anual en las uacuteltimas deacutecadas con

precipitaciones y sequias maacutes frecuentes e intensas (IPCC 2020 5 Jimeacutenez 2010)

Acorde con el Panel Intergubernamental de Expertos en Cambio Climaacutetico (IPCC) para

fin de siglo el Cambio Climaacutetico se acrecentaraacute pronosticando un aumento de temperatura de 25

a 45 degC para el antildeo 2100 que tan solo para Colombia en los uacuteltimos 30 antildeos fue de 08degC

generando impactos notorios en las zonas de alta montantildea como los paacuteramos (Moreno y Palma

2016)

El cambio climaacutetico es un fenoacutemeno cuyos efectos alcanzaraacuten los paacuteramos los cuales son

ecosistemas de alta montantildea presente en elevaciones entre 3100 y 4700 m ubicados en el norte de

los Andes de Ameacuterica del Sur y el sur de Ameacuterica Central adyacente (Berdugo et al 2016) Estas

aacutereas se caracterizan por una vegetacioacuten principalmente endeacutemica compuesta por frailejones

matorrales y pastos (veacutease figura 1) (Garciacutea et al 2010)

Los ecosistemas de alta montantildea como los paacuteramos ofrecen diversos servicios

ambientales como la biodiversidad uacutenica que albergan los paisajes los suelos y su capacidad de

retener y almacenar agua (Morales et al 2019) Las formaciones vegetales juegan un papel

diferenciado en el mantenimiento de la humedad y las fuentes de agua en el ecosistema

presentando la capacidad de interceptar almacenar y regular los flujos hiacutedricos superficiales y

16

subterraacuteneos aportando los servicios de abastecimiento de agua para el 70 de la poblacioacuten de

Colombia (Vaacutesquez y Buitrago 2017)

Ademaacutes dada la caracteriacutestica de permanente humedad de su suelo la materia orgaacutenica

se descompone a menor velocidad logrando un efecto de retencioacuten y almacenamiento de carbono

(Anderson et al 2012) En Colombia se han realizado diferentes estudios sobre la distribucioacuten y

extensioacuten del ecosistema paramuno Rangel (2002 4) determinoacute que los paacuteramos colombianos

abarcaban aproximadamente el 26 de la superficie del paiacutes

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramos por Pedraza-Pentildealosa Betancur y Franco-Rosselli (2005)

En particular el paacuteramo Romerales se encuentra dentro del territorio adscrito a los

Parques Nacionales Naturales (PNN) especiacuteficamente el PNN de los Nevados en la cordillera

central colombiana hacia la zona norte del Departamento del Quindiacuteo con liacutemites fronterizos

entre los departamentos de Risaralda y Tolima Este paacuteramo es el hogar del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana el cual estaacute afrontando los efectos del cambio climaacutetico (veacutease mapa 1)

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona muestreada

17

Existe evidencia cientiacutefica concreta del aumento de temperatura en los Andes Tropicales

tambieacuten cambios significativos en los patrones de precipitacioacuten sumado a la disminucioacuten en la

incidencia del clima nublado lo que conduce a las plantas a mayor cantidad de horas expuestas a

la radiacioacuten solar (Ruiz et al 2009) Otro efecto grave que trae consigo el cambio climaacutetico es el

desplazamiento de especies en el gradiente altitudinal Con un aumento de 3degC se espera que las

especies se muevan ~600 m en buacutesqueda de su optimo teacutermico esto afectariacutea gravemente las

especies de paacuteramo como los frailejones Cuesta Camacho (2007)

Los frailejones son emblemaacuteticas plantas de paacuteramo y ecosistemas de alta montantildea

(MINAMBIENTE 2019) Pertenecen a la familia Asteraceae contiene cerca de 142 especies

agrupadas en ocho geacuteneros Carramboa Coespeletia Espeletia Espeletiopsis Libanothamnus

Paramiflos Ruilopezia y Tamania de estos los maacutes importantes y con mayor diversidad de

especies son Espeletia Espeletiopsis y Libanothamnus (Rivera y Torres 2001)

Poseen adaptaciones que les permite captar y retener grandes cantidades de agua de su

entorno permitiendo un balance ecosistemico (Farias 2013) La morfologiacutea singular del genero

Espeletia le permite acumular las hojas antiguas en forma de ldquoabrigordquo brindando proteccioacuten

contra las bajas temperaturas nocturnas de hasta 0degC Los fuertes vientos y la radiacioacuten solar los

cuales seraacuten cada vez maacutes intensos y frecuentes por causa del cambio climaacutetico (Cortes y

Sarmiento 2013 34) (veacutease figura 2)

Estas plantas son especies claves para la conservacioacuten de los paacuteramos y la lucha contra el

cambio climaacutetico debido a que ofrecen una gran variedad de servicios ecosisteacutemicos (Diacuteaz et al

2007) El paacuteramo es referente sin igual de fuente hiacutedrica ciudades como Bogotaacute y Quito obtienen

aproximadamente el 80 de su agua dulce de los paacuteramos (Buytaert et al 2006) Los frailejones

en su mayoriacutea endeacutemicos se han visto afectados por actividades humanas como la ganaderiacutea

extensiva agricultura (cultivos de papa y cebolla) mineriacutea de oro y carboacuten turismo no

controlado y quemas intencionales (Hofstede 2000) Esta situacioacuten podriacutea comprometer a

mediano y largo plazo la funcioacuten de captacioacuten regulacioacuten y suministro del agua para el consumo

18

en las ciudades colombianas ubicadas en las regiones de influencia de estos ecosistemas (Varela

2015)

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

No obstante en asociacioacuten con especies como el frailejoacuten de los Andes Tropicales

encontramos a los hongos cuyos roles en las interacciones bioloacutegicas son de vital importancia

Los hongos pueden ser endoacutefitos simbiontes mutualistas paraacutesitos y comensales y son capaces

de responder a las amenazas que plantea el cambio climaacutetico en cuanto a perturbaciones

ambientales aumento de temperatura y estreacutes hiacutedrico adaptaacutendose a la disponibilidad de recursos

modificando sus actividades enzimaacuteticas e incluso su genoma a lo largo del tiempo (Moreno et

al 2013)

Los hongos son clasificados seguacuten su forma de reproduccioacuten sea sexual o asexual en

donde se observan las diferencias estructurales internas entre los diferentes grupos tales como

sus esporas e hifas como lo indican Blackwell y Spatafora (2004) estos organismos estaacuten

divididos en cuatro grandes grupos los cuales son Ascomycota Basidiomycota

Chytridiomycota Zygomycota es justo en el grupo de los Ascomycota donde se encuentra gran

diversidad de hongos conocidos como ldquohongos endoacutefitosrdquo en donde su nombre ldquoendoacutefitordquo

significa ldquodentro de la plantardquo (endon dentro phyton planta)

19

Estos microorganismos fuacutengicos tienen la facilidad de pasar gran parte o todo su ciclo de

vida invadiendo los tejidos de su hospedero (planta) sin tener un efecto negativo evidente

(Leacuteveilleacute 1846 3 de Bary 1866 8) Por lo tanto el concepto de endoacutefito indica una asociacioacuten de

costo-beneficio pero de una forma mutualista entre el hongo y la planta hospedera permitiendo

la estadiacutea en sus tejidos vivos (Clay 1998 8) Los hongos endoacutefitos se han encontrado en todas

las plantas (algas musgos pastos plantas y vasculares) desde los bosques templados hasta los

bosques tropicales hallaacutendose una gran diversidad de plantas y en asociacioacuten gran diversidad de

hongos endoacutefitos (Saacutenchez et al 2010)

Se espera que los hongos endoacutefitos jueguen un papel cada vez maacutes importante potenciado

por el cambio climaacutetico en las enfermedades producidas en plantas como pudricioacuten radicular

mal blanco entre otras con los aumentos pronosticados de la temperatura y el estreacutes por sequiacutea

asociados al cambio climaacutetico (Desprez-Loustau et al 2006 Slippers y Wingfield 2007 6) Los

cambios en la cantidad de dioacutexido de carbono (CO2) y la disponibilidad de nitroacutegeno en el suelo

afectan de forma similar tanto a las plantas como a los hongos por ende las alteraciones

generadas por parte del cambio climaacutetico pueden causar desbalances en sus relaciones (Ies et al

2013)

Algunos estudios realizados en el antildeo 1898 donde se registraron los primeros hongos

endoacutefitos como el de Bary (1866) brindo la iniciativa de investigaciones que lograron explicar

los cuadros toxicoloacutegicos observados en animales los cuales se daban por el consumo de

semillas o en aacutereas de pastos (Poaceae) que posiblemente albergaban hongos Clavicipitaacuteceos

(familia del ergot) los cuales poseiacutean actividades enzimaacuteticas con micotoxinas

Por diversas situaciones no trascendioacute la investigacioacuten hasta que Bacon (1977) hizo

relacioacuten del hongo endoacutefito Neotyphodium coenophialum debido a una intoxicacioacuten del ganado

llamado ldquosiacutendrome de veranordquo cuando estos animales consumiacutean pastos de la especie Festuca

arundinacea (Poaceae) Funk en el antildeo 80 caracterizoacute la resistencia de las Poaceae que

albergaban hongos endoacutefitos que frecuentemente eran atacados por insectos (proteccioacuten contra

herbiacutevoros) (Saacutenchez et al 2010)

Compant y colaboradores (2010) mencionaron que tras experimentar en el laboratorio

con una gama de temperaturas en los hongos endoacutefitos aislados obtuvieron resultados variables

respecto al crecimiento es decir positivos y neutrales llegando a la conclusioacuten de que los

microorganismos asociados a las plantas son un factor importante que influye en la respuesta de

20

las plantas acorde a los cambios de temperatura lo que compromete las respuestas del frailejoacuten y

los hongos endoacutefitos frente al calentamiento global causado por el cambio climaacutetico

Con relacioacuten a los estudios realizados sobre hongos endoacutefitos en frailejones se han

encontrado al menos 100 especies con capacidades de inhibir hongos fitopatoacutegenos o herbivoriacutea

(Cabezas et al 2012)

Los geacuteneros de hongos endoacutefitos encontrados en anteriores estudios son Acremonium

Aspergillus Aureobasidium Colletotrichum Fusarium Gliocadium Nigrospora Paecilomyces

Penicillium Trichothecium Trichoderma y Sordaria (Pineda 2000 Programa Nacional para la

Evaluacioacuten del Estado y Afectacioacuten de los Frailejones en los Paacuteramos de Andes del Norte 2009)

Teniendo en cuenta que para Colombia hay poca informacioacuten sobre hongos endoacutefitos en

ecosistemas paramunos se hace fundamental la ampliacioacuten de maacutes informacioacuten referente al tema

debido a que solo existen estudios significativos en cafeacute leguminosas y rosas los cuales maacutes allaacute

de la identificacioacuten de geacuteneros de hongos endoacutefitos no incluyen el cambio climaacutetico y sus

posibles consecuencias (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016) En

teacuterminos filogeneacuteticos los hongos son el reino de la naturaleza maacutes cercano a los animales

(Hibbett et al 2018)

Las relaciones que posean las diferentes especies de endoacutefitos dentro de la especie de

frailejoacuten es de importancia conocerla mediante el uso de la filogenia molecular (Judd et al 2007)

mediante secuencias de ADN ARN o proteiacutenas (Cooke et al 2000) Dependiendo de la presencia

de especies agresivas de endoacutefitos como Nigrospora se puede tener un mejor conocimiento

sobre las consecuencias que trae consigo los impactos del cambio climaacutetico sobre estas plantas de

los Andes Tropicales (Foden et al 2009)

21

Capiacutetulo primero

Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitos

1 Antecedentes

Desde los estudios realizados por Leacuteveilleacute (1846) y Bary (1866) sobre hongos Endoacutefitos

en pastos de zonas templadas se ha logrado identificar que estos hongos son capaces de inducir

respuestas adaptativas a sus hospederos (Micotoxinas contra herbiacutevora adaptacioacuten a heladas o

climas extremos fijacioacuten de nutrientes) a cambio de alimento y hospedaje formando una relacioacuten

mutualista en la cual las dos especies involucradas son beneficiadas No obstante se ha reportado

que los hongos endoacutefitos ademaacutes de tener relaciones mutualistas con diferentes especies

vegetales se pueden tornar en especies patoacutegenas para su hospedero una vez la planta se

encuentra en condiciones desventajosas tornaacutendose asiacute el hongo endoacutefito en un hongo

fitopatoacutegeno (Herrera y Ulloa 1990 550)

Como se mencionoacute anteriormente los hongos endoacutefitos pueden pasar de un estado

mutualista a un estado de patogeacutenesis dada esta relacioacuten entre ambos organismos se producen

metabolitos secundarios potencialmente toacutexicos facilitando factores de virulencia dados por el

hongo endoacutefito como exoenzimas y metabolitos fitotoacutexicos a su vez la planta presenta defensas

tanto mecaacutenicas como bioquiacutemicas (Saacutenchez et al 2013 5)

Hasta la fecha los principales estudios de hongos endoacutefitos se han fijado en especies de

intereacutes econoacutemico y comercial tales como palma de aceite cafeacute leguminosas pastos de forrajeoacute

y diferentes tipos de rosas (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016)

Las especies modelo para el estudio de los hongos endoacutefitos han sido las gramiacuteneas

forrajeras en donde se han reportado especies de endoacutefitos asociados a los geacuteneros Lolium

Festuca y Brachiaria (Siegel et al 1987) no obstante Otero y Bayman (2009) han reportado un

creciente nuacutemero de estudios en orquiacutedeas epifitas tropicales relaciones con hongos micorrizicos

22

Actualmente existen escasos reportes de hongos endoacutefitos asociados a ecosistemas con

climas extremos (temperaturas extremas) como aacuterticos desiertos paacuteramos y zonas alpinas

especialmente para zonas de temperaturas friacuteas como lo son los paacuteramos (Lopera et al 2008

Leung et al 2011 Cabezas et al 2012 Miles et al 2012 Zhang y Yao 2015)

Investigadores como Lopera Leung y colaboradores (2011) han llegado a la conclusioacuten

de que los hongos endoacutefitos juegan un papel importante en las plantas a la hora de adaptarse a

ecosistemas de clima templado (Kivlin et al 2013 Zhang y Yao 2015)

En Colombia los trabajos con hongos endoacutefitos son pocos por ende trabajos como el de

Lopera y colaboradores (2008) con especies del genero Espeletia de los paacuteramos Colombianos

son pioneros ademaacutes del trabajo de Cabezas y colaboradores (2012 4) en el cual aislaron y

caracterizaron celulasas (enzimas descomponedores de la celulosa) extraiacutedas de hongos endoacutefitos

que se hallaban en especies de Espeletia posteriormente Lopera y Miles (2012) unieron

esfuerzos para continuar caracterizando la diversidad de hongos endoacutefitos en los paacuteramos andinos

colombianos enfocados en Espeletia con el objetivo de encontrar especies con potencial

biocontrolador

Existen trabajos tesis en los repositorios de diversas universidades de los antildeos 2014 y

2015 en los cuales se aborda el tema de los hongos endoacutefitos paacuteramos y especies de Espeletia

(frailejones) y de la familia Poaceae en donde se caracterizan las diversas especies de hongos

endoacutefitos por medio taxonomiacutea y biologiacutea molecular ademaacutes de buscar metabolitos secundarios

con fines medicinales o de biocontrol

Los trabajos en filogenia molecular de hongos endoacutefitos realizados en frailejones se han

visto enfocados maacutes hacia la buacutesqueda de la diversidad funcional en comunidades

microbioloacutegicas como por ejemplo el estudio realizado por Ruiz y colaboradores (2015) en

donde buscaron mediante el anaacutelisis molecular de raiacuteces necromasa hojas maduras y joacutevenes de

diferentes especies de Espeletia (veacutease figura 3) ubicada en los Andes neotroacutepicales

colombianos secuencias geneacuteticas de las regiones V5-V6 de la unidad 16S del rARN

23

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras N

necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefito Tomado de Ruiz y colaboradores (2015)

Este estudio analizoacute la composicioacuten de comunidades microbioanas y su diversidad

funcional en un ecosistema de alta montantildea en donde las temperaturas los rayos UV y la altura

juegan papeles determinantes como filtros ecoloacutegicos severos en donde solo pueden existir

especies que han desarrollado capacidades para adaptarse sobrevivir y colonizar dichas aacutereas

por ende cuando se analizaron las comunidades existentes dentro de estas especies de Espeletia

Encontraron que algunas especies halladas podriacutean tener roles importantes como

productores de metabolitos secundarios enzimas o incluso como bioremediadores y que las

comunidades microbianas eran diferentes tanto en sus hojas como en sus raiacuteces y en la

necromasa

A medida que las deacutecadas avanzan y la evidencia sobre el cambio climaacutetico se hace maacutes

robusta y evidente los estudios en los hongos endoacutefitos han tomado vital importancia al estar

asociados con cultivos de especies comestibles escases de agua y de tierras productivas sumado

a los efectos negativos que trae consigo el cambio climaacutetico para las diferentes plantaciones y

cosechas a nivel global

Es por eso que Lu Yan y colaboradores (2019) analizaron los efectos positivos que teniacutean

la colonizacioacuten de hongos endoacutefitos en las plantas en donde ratificaron que los hongos endoacutefitos

dentro la planta generan metabolitos antimicrobianos estimulan las respuestas inmunoloacutegicas y

compiten por espacio dentro de la planta con diferentes patoacutegenos incrementando asiacute la

resistencia contra herbiacutevoros y la resistencia al estreacutes salino (factores bioacuteticos)

Ademaacutes de ayudar a la planta contra el estreacutes abioacutetico causado principalmente por

factores climaacuteticos como la falta de agua (estreacutes hiacutedrico) las temperaturas extremas la

intensidad de los rayos UV y los metales pesados como la muestra la figura 4 debido a esto se

24

concluyoacute que las fitohormonas cumplen un papel importante en la colonizacioacuten de hongos

endoacutefitos dentro de la planta

Aun que se ha reportado que los hongos endoacutefitos se pueden usar como biocontroladores

diferentes estudios reportan que el uso de hongos endoacutefitos puede tener efectos adversos como

un retraso significativo en el crecimiento de la planta con el uso de la especie Cryptosporiopsis

sp (Terhonen et al 2016) Otro reporte indica la fecundidad y supervivencia de enemigos

naturales como paraacutesitos esto es debido a que los hongos endoacutefitos transfieren sus toxinas y

alcaloides cuando son ingeridos por paraacutesitos u otros enemigos naturales de las plantas (Lopez y

Sword 2015)

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y abioacutetico

Bajo estreacutes bioacutetico (herbiacutevoros y patoacutegenos) y abioacutetico (sequiacutea salinidad metales pesados y otros) (a) se

inducen respuestas de defensa de las plantas (b) los endoacutefitos producen metabolitos protectores y

modulan la viacutea de las fitohormonas para mejorar la inmunidad de las plantas (c) tomada de Lu yan y

colaboradores (2019 7)

25

2 Justificacioacuten

La presente investigacioacuten pretende identificar y caracterizar que especies de hongos

endoacutefitos estaacuten asociadas al frailejoacuten Espeletia hartwegiana y que posibles implicaciones podriacutea

tener que estas especies se encuentren dentro de esta especie de alta montantildea La importancia de

conocer esta informacioacuten reside en que los hongos endoacutefitos pueden beneficiar o perjudicar a la

adaptacioacuten y resistencia de especies vegetales en los distintos escenarios climaacuteticos propuestos

por la ciencia (IPCC 2020)

El calentamiento global podriacutea afectar el equilibrio de los hongos endoacutefitos en especies

vegetales generando desbalances en la planta o la peacuterdida de especies endoacutefitas de importancia

biotecnoloacutegica Por ejemplo se podriacutean perder especies endoacutefitas con potencial para control

bioloacutegico de plagas y enfermedades de plantas como productores de enzimas y metabolitos

secundarios degradacioacuten de plaacutesticos o biorremediacioacuten entre otros (Schulz et al 2002) Por

ello se hace fundamental estudiar los hongos endoacutefitos en ecosistemas de paacuteramo ya que en

Colombia y en los paacuteramos en general han sido poco estudiados y su efecto sobre las plantas de

alta montantildea podriacutea ser clave en el mantenimiento de sus poblaciones

26

3 Hipoacutetesis

H1 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute diferente en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo diferentes los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten tambieacuten seria

modificada

H0 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute similar en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo similares los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten continuariacutean

como se ha registrado con anterioridad

27

4 Objetivos

41 Objetivo general

Caracterizar la diversidad de hongos endoacutefitos presentes en los frailejones

de la especie Espeletia hartwegiana en el paacuteramo de Romerales tomando en cuenta su

relacioacuten con el cambio climaacutetico

42 Objetivos especiacuteficos

Identificar los hongos endoacutefitos asociados en Espeletia hartwegiana del

paacuteramo de Romerales

Hallar relaciones filogeneacuteticas entre las diferentes especies de hongos

Endoacutefitos encontradas en Espeletia hartwegiana

Advertir las repercusiones del cambio climaacutetico sobre Espeletia

hartwegiana en base a su diversidad de hongos endoacutefitos

28

29

Capiacutetulo segundo

Materiales Meacutetodos y Resultados

1 Aacuterea de Estudio

El trabajo se realizoacute en el paacuteramo de Romerales ubicado en la zona alta del municipio de

Salento Quindiacuteo (4deg39202N 75deg25506W) con una extensioacuten aproximada de 6794 ha (Cano

et al 2015)

2 Colecta de material bioloacutegico

La colecta del material bioloacutegico se realizoacute mediante muestreos aleatorios lo largo del

paacuteramo tomando coordenadas de cada punto de colecta (veacutease anexo 3) las hojas se colectaron

por medio de tijeras podadoras siendo empacadas cada una en bolsas Ziploc diferentes se

colectoacute un total de 15 hojas cada una correspondiente a una planta de frailejoacuten para un total de

15 plantas muestreadas de E hartwegiana

Adicionalmente las bolsas Ziploc fueron marcadas con los datos de colecta en campo y

transportadas a los laboratorios del Programa de Biologiacutea de la Universidad del Quindiacuteo para su

procesamiento

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetales

Las muestras obtenidas fueron lavadas con agua para eliminar el exceso de residuos se

cortaron 4 trozos de cada hoja con un tamantildeo aproximado de 05 a 10 cm (veacutease figura 5) luego

cada trozo de hoja se sometioacute a una esterilizacioacuten la cual se completoacute con algunas modificaciones

acorde al procedimiento descrito por (Osorio et al 2017) especiacutefico para el aislamiento de

30

hongos endoacutefitos que consiste en sumergir perioacutedicamente el material vegetal en etanol al 90

durante un minuto seguido de hipoclorito de sodio (NaClO) al 4 por un minuto continuando

con etanol al 70 durante un minuto y por uacuteltimo se lavaraacuten con agua destilada todo dentro de la

campana de flujo

Las cuatro secciones de hoja se transfirieron a una caja de Petri para un total de 15 cajas

de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA) (una caja de Petri por cada 4 cortes de hoja)

Posteriormente las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente (25degC aproximadamente)

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en medio de

cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelial caja de Petri de 20ml de capacidad

Pasadas 3 semanas se revisaron los cultivos fuacutengicos con el fin de revisar el crecimiento

del micelio y hacer un repique a un cultivo puro una vez maduros se procedioacute a utilizar la teacutecnica

de corte de hifa uacutenica (Osorio et al 2017) esta teacutecnica consistioacute en tomar la punta de la hifa con

ayuda de un estereoscopio y un bisturiacute de grado quiruacutergico agua destilada alcohol al 70 y un

mechero para mantener el bisturiacute esterilizado una vez identificada la hifa ideal para cultivar de

forma pura (veacutease figura 6) con el bisturiacute se procedioacute a cortar el agar PDA en forma de cuadro

con una medida aproximada de 3 miliacutemetros cuadrados

31

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la teacutecnica de

corte de hifa uacutenica

Se esperoacute entre 3 a 5 semanas a que crecieran los cultivos puros aislados de las hifas uacutenicas en

nuevas cajas de Petri con agar PDA

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos endoacutefitos)

Los hongos cultivados de forma pura consiguieron un crecimiento micelial significativo a partir

de los 15 diacuteas a temperatura ambiente como lo demuestra la figura 7 que contiene doce de los

cultivos maacutes representativos con su respectivos micelios aeacutereos desarrollados donde variacutean sus

colores formas y consistencias esto indicando que pertenecen a diferentes especies

2

1

3

32

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de cultivo

Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12) aislados de las

hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

5 Extraccioacuten de ADN

4

5

6

7

8

9

10

11

12

33

Una vez el micelio de los hongos se encontraba desarrollado en la cantidad necesaria se

procedioacute a extraer el ADN genoacutemico siguiendo el protocolo de extraccioacuten de Raeder y Broda

(1985) por medio de un barrido superficial del micelio evitando tomar el agar este micelio

posteriormente se colocoacute en tubos Eppendorf esteacuteriles de 2 ml y se pulverizoacute mediante el uso de

un asa microbioloacutegica y 1ml de buffer de extraccioacuten compuesto de Tris-HCL 1 M pH 78 EDTA

05 M Ph 8 SDS 10 wv NaCL y agua destilada para cada tubo a continuacioacuten se agregoacute 800

ul de etanol al 70 500 ul de fenol y se mezcloacute

Se adicionoacute 300 ul de cloroformo y se mezcloacute de nuevo de alliacute se llevoacute a la centrifuga a

10000 rpm por 60 minutos luego de centrifugar se forma un sobrenadante el cual es transferido

en su totalidad a un nuevo tuvo Eppendorf de 15 ml en el cual se agregaron 400 ul de cloroformo

y se llevoacute a la centrifuga a 10000 rpm por 10 minutos en donde nuevamente se forma un

sobrenadante aunque esta vez solo se toman 500 ul del tubo para ser transferidos otro tubo

Eppendorf de 15 ml ya en el nuevo tubo se adicionaron 50 ul de NaAC y se invirtioacute varias veces

para homogenizar la mezcla a continuacioacuten se guardoacute en el refrigerador a 4degC toda la noche

Al diacutea siguiente se tomaron las muestras en los tubos Eppendorf y se centrifugaron a

10000 rpm por 30 minutos (Formacioacuten del Pellet de ADN) cuando la centrifuga terminoacute se

procedioacute a remover el etanol ya sin etanol se agregoacute de nuevo 1 ml de etanol al 70 a cada tubo

y se centrifugoacute a 10000 rpm por 5 minutos en este paso se removioacute el etanol y se dejoacute secar el

pellet de ADN una vez el etanol se evaporoacute se re suspendioacute el pellet en 100 ul de agua grado

molecular o Sabax con 5 ul de RNAsa con el fin de evitar la presencia de moleacuteculas de ARN

posteriormente se incubaron a 37degC por 30 minutos y se guardaron para su envioacute a -20degC

(Raeder y Broda 1985)

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengica

Una vez se secuenciaron las muestras de ADN enviadas a la Universidad Ruhr de

Bochum Alemania se hizo el ensamblaje de las secuencias en contigs y scaffolds en el

programa CLC Main Workbench 8 (Nicola et al 2013) Como lo muestra la figura 8 donde se

muestran los pasos esenciales de una teacutecnica de Metagenoacutemica donde posteriormente se

analizaron con maacutes detalle mediante teacutecnicas filogeneacuteticas

34

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemico Fuente Thomas y colaboradores (2012)

7 Secuenciamiento

Se extrajoacute con eacutexito un total de 35 muestras de hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

Espeletia hartwegiana (veacutease figura 9) que posteriormente fueron secuenciadas por la

Universidad Ruhr de Bochum (Alemania) logrando un total de 70 secuencias incluyendo

aquellas obtenidas en Genk Bank

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de frailejoacuten

Espeletia hartwegiana

35

8 Anaacutelisis Filogeneacutetico

Se aislaron 35 secuencias basadas en la especie Espeletia hartwegiana fueron

comparadas posteriormente con 35 secuencias de especies publicados en GenBank

(httpblastncbinihgovblastcgi) se obtuvo un total de 70 secuencias Las secuencias de

consenso ITS 58S DNA obtenidas se usaron para realizar buacutesquedas BLAST en GenBank

usando BLASTn (Altschul et al 1990) con el fin de identificar mediante las secuencias aisladas

los geacuteneros o las especies maacutes cercanas La matriz de datos fue alineada en MAFFT v7 (Katoh y

Standley 2013) Se utilizaron las especies Coprinellus xanthothrix y Coprinellus domesticus

como grupos externos

Los anaacutelisis de las secuencias para construir los arboles filogeneacuteticos de Maacutexima

Parsimonia (MP) fueron realizados usando PAUP v40b10 (Swofford 2003) Para el anaacutelisis de

Maacutexima Verosimilitud o ML por sus siglas en ingleacutes (Maximum Likelihood) se utilizoacute

JmodelTest (Darriba et al 2012) con el cual se infirieron los criterios del modelo de sustitucioacuten

apropiado utilizando los criterios de informacioacuten de Akaike (AIC) (Akaike 1974)

Los anaacutelisis de ML se realizaron con el programa PhyML v 30 (Guindon y Gascuel

2003) teniendo en cuenta la proporcioacuten de sitios invariables Los valores de soporte de confianza

para los nodos se estimaron mediante 1000 anaacutelisis de arranque de replicacioacuten La alineacioacuten de

los datos de la secuencias de ITS para 70 aislamientos determinoacute quince geacuteneros siendo los

siguientes Annulohypoxylon Biscogniauxia Colletotrichum Crassiparies Cryptocoryneum

Cyphellophora Diaporthe Daldinia Humiacutecola Hypoxylon Hypocrea Nemania Nigrospora

Massarina y Trichoderma de los cuales se obtuvieron 11 clados principales (veacutease figura 10)

Con base en estos resultados todos los aislamientos se analizaron maacutes a fondo dentro de los

geacuteneros hasta llegar a especie (veacutease tabla 1)

36

Geacuteneros Especie Especie Especie Especie Especie Especie Especie

Annulohypoxylon A nitens A bahnphaden

gense

Biscogniauxia B petrensis

Colletotrichum C gloeosporioides

C gigasporum

Cyphellophora C

reptans

Crassiparies C quadrisporus

Cryptocoryneum C

longicondensatum

Daldinia D dennisii D

eschscholtzi

D

conceacutentri

ca

Diaporthe D

longicolla

D

foeniculina

D

anacardi

i

D

macada

miae

Humiacutecola H

fuscoatra

Hypoxylon H

trugodes

H

pulicicidum

Hypocrea H

koningii

Massarina M albocarnis

Nemania N

primolutea

Nigrospora N sacchari N rubi N sphaeric

a

N hainanen

sis

N oryzae

N gorlenko

ana

N aurantia

ca

Trichoderma T trixiae T

olivascens

T

paraviridescens

T

viridescens

T

samuelsii

T viride

Grupo Externo Coprinellus C

domesticus

C

xanthothrix

Tabla 1 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos endoacutefitos en la

especie Espeletia hartwegiana

37

38

Figura 10 Filograma consenso obtenido con el programa MEGA ndashX a partir del anaacutelisis ML y MP del

conjunto de datos ITS Aislados de las hojas de frailejoacuten Los coacutedigos en Verde son las secuencias que se

aislaron (aislados) en este estudio los coacutedigos y nombres en Negro son las secuencias encontradas por

identidad en GenBank Los valores de soporte de bootstrapgt 70 se indican cerca de los nodos como MP

ML = valores de soporte de bootstrap lt70

El nuacutemero de caracteres los modelos de sustitucioacuten usada asiacute como otros resultados

estadiacutesticos de las pruebas de Maacutexima Parsimonia y Maacutexima Verosimilitud generados a partir de

los anaacutelisis filogeneacuteticos de los conjuntos de datos se muestran en los anexos

39

Capiacutetulo Tercero

Discusioacuten sobre los hongos endofitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicas

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidad de Endoacutefitos

Tanto la temperatura la estacionalidad y los tipos de precipitacioacuten son factores de vital

importancia para la composicioacuten de las diferentes comunidades y la arquitectura vegetal Estos

factores limitan muchos de los procesos ecosisteacutemicos ya que existe una estrecha relacioacuten entre

las variaciones climaacuteticas y las variaciones dentro de los ecosistemas Por lo tanto se espera que

el cambio climaacutetico transforme los ecosistemas Andinos tal como los conocemos hoy (Colwell et

al 2008) modificando las relaciones mutualistas entre plantas y hospederos

Posiblemente la resiliencia y resistencia de muchos ecosistemas como el paacuteramo sean

superadas en este siglo por una combinacioacuten sin precedentes de disturbios tales como el cambio

climaacutetico perturbaciones asociadas a este (sequiacuteas fuegos invasioacuten de especies exoacuteticas

inundaciones) y otros factores como organismos oportunistas (hongos endoacutefitos) cambios en el

uso del suelo contaminacioacuten y sobreexplotacioacuten de recursos (IPCC 2020)

Considerando que el frailejoacuten Espeletia hartwegiana es una especie de alta montantildea

(paacuteramos) endeacutemica de la cordillera Central de los Andes (Schultz y Carl 1856) se encuentra

dentro de los ecosistemas andinos en donde a su vez se ha comprobado la existencia de los

hongos endoacutefitos es de tener en cuenta el papel de estos organismos endoacutefitos ya que los

paacuteramos son ecosistemas particularmente sensibles a los efectos adversos del cambio climaacutetico

en especial al calentamiento global al estar ubicados en los troacutepicos generando asiacute ventanas de

40

oportunidades para que los hongos endoacutefitos alteren su estado mutualista y pasen a ser

patogeacutenicos (Colwell et al 2008 7)

No obstante existe consenso en que las temperaturas aumentaraacuten especiacuteficamente a

grandes alturas y que la precipitacioacuten posiblemente se incrementaraacute en algunas zonas disminuiraacute

en otras y se produciraacute en patrones estacionales alterados con mayor intensidad y frecuencia

(Marengo et al 2009)

Los frailejones se ven en constante estreacutes por el uso del suelo dado en los paacuteramos como

es el caso del paacuteramo Romerales un paacuteramo que se ha visto afectado por las quemas y la

ganaderiacutea (Molinillo y Monasterio 2001) Esto aumenta asiacute las condiciones de estreacutes intriacutensecas a

las que estaacuten expuestas estas plantas de paacuteramo las cuales suministran valiosos bienes y servicios

ecosisteacutemicos como el abastecimiento continuo de agua para usos domeacutesticos agriacutecolas e

industriales (Buytaert et al 2006 4) servicios que se podriacutean ver en decrecimiento si las

ventanas de oportunidades se abren con maacutes frecuencia dando pie al cambio de estado de los

hongos endoacutefitos que existen dentro de los frailejones de la zona

En los paacuteramos de Chingaza Rabanal Guerrero Iguaque Merchaacuten y Sumapaz se han

realizado estudios de aislamientos de hongos en especies de frailejoacuten diferentes a la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana tales como Espeletia argentea Espeletia arbelaezii Espeletia

boyacensis Espeletia grandiflora Espeletia miradorensis y Espeletia uribei por ende se ha

reportado la presencia de hongos endoacutefitos y fitopatoacutegenos (Tabla 2) (Gaitan 2018 17)

Frailejones Espeletia

argentea

Espeletia

arbelaezii

Espeletia

boyacensis

Espeletia

grandiflora

Espeletia

miradorensis

Espeletia

uribei

Aspergillus X X X X

Annulohypoxylon X X X

Curvularia X X X

Epicoccum X X X

Fusarium X X X

41

Tabla 2 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = a presencia del genero de

hongo dentro de la especie de frailejoacuten

Los geacuteneros de hongos en rojo son los geacuteneros que se encontraron en comuacuten con los

geacuteneros hallados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana de un total de 15 geacuteneros 3

han sido reportados anteriormente en estudios similares ( 20 de geacuteneros identificados)

Dentro de un marco de cambio climaacutetico es importante la metodologiacutea de muestreo

como lo fue el formato de muestreo en puntos aleatorios realizado en el presente estudio se llevoacute

acabo principalmente por la homogeneidad de los frailejones en el paacuteramo como lo indica el

manual de meacutetodos baacutesicos de muestreo y anaacutelisis de ecologiacutea vegetal (BOLFOR 2000 9) donde

se menciona que el muestreo aleatorio se utiliza cuando se dispone de poca informacioacuten previa de

las caracteriacutesticas de las poblaciones a medirse en este caso la poblacioacuten a identificarse fueron

los hongos endoacutefitos que se hallaban dentro de las formaciones homogeacuteneas de los frailejones

No obstante el muestreo aleatorio tambieacuten presenta limitaciones a la hora de comparar los

hongos endoacutefitos a lo largo del gradiente altitudinal (muestreo aleatorio estratificado) dejando de

percibir informacioacuten proveniente de los distintos microclimas que se encuentran y de las

incidencias que podriacutean causar a la hora de identificar los geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten ademaacutes de posibles micro efectos del cambio climaacutetico a lo

largo del gradiente altitudinal (Caacutemara et al 2008)

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio Climaacutetico

Nigrospora X X X X X

Penicillium X X X

Pleospora X X X X

Trichoderma X X X X

42

Las teacutecnicas empleadas en este estudio para lograr aislar e identificar los hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana se hacen importantes dentro del cambio

climaacutetico debido a que el margen de error en la identificacioacuten molecular es reducido (Bakermans

et al 2014) Al ser reducido el margen de error se pudo conocer con mayor certeza que especies

y geacuteneros de hongos endoacutefitos se encuentra dentro de la planta

Al conocer sus identidades es posible conocer las capacidades que tienen cada una de

estas especies de hongos endoacutefitos de producir metabolitos secundarios de infiltrarse y proteger

los tejidos de la planta de condiciones bioacuteticas y abioacuteticas competir contra herbiacutevoros y

fitopatoacutegenos (Schulz et al 2002) Con sus capacidades reconocidas es posible vincular los

efectos del cambio climaacutetico como estreacutes hiacutedrico aumento de la temperatura migraciones

tempranas enfermedades emergentes aumentos de la precipitacioacuten y heladas severas con las

reacciones por parte de los hongos endoacutefitos Estas reacciones podriacutean desencadenar aumentos de

la patogenicidad en las poblaciones de frailejones debido a los constantes disturbios y estreacutes al

que se ve sometido la planta generando asiacute notables declives poblacionales (Mendoza 2010)

Las relaciones filogeneacuteticas entre las especies halladas toman relevancia debido a las

sinergias positivas o negativas que se pueden presentar dependiendo de las especies que se

encuentren asociadas dentro de la planta (Lamichhane y Venturi 2015) como por ejemplo

Nigrospora y Colletotrichum pueden activar una sinergia negativa aumentando la virulencia y

afectando la especie Espeletia hartwegiana

Las especies de hongos endoacutefitos se identificaron por medio de secuencias obtenidas de

las regiones ITS (regioacuten de espaciadores internos transcritos) las cuales son regiones altamente

conservadas con tasas de evolucioacuten muy lentas en el tiempo permitiendo hacer inferencias

filogeneacuteticas (Baldwin et al 1995 Hamby y Zimmer 1992) es por ello que se usaron para

generar las diferentes identificaciones de los hongos endoacutefitos logrando asiacute identificar al geacutenero

Nigrospora con un total de 7 especies N sacchari N rubi N sphaerica N hainanensis N

gorlenkoana N oryzae y N aurantiaca pertenecientes a la familia Apiosporaceae orden

Xylariales Divisioacuten Ascomicota (veacutease figura 11) (Wang et al 2017)

Dentro del marco del cambio climaacutetico Nigrospora se caracteriza por poseer una

distribucioacuten cosmopolita y una amplia gama de hueacutespedes como lo es en este caso la especie E

hartwegiana que habita en los Andes Tropicales que se veraacuten alterados por los efectos del

cambio climaacutetico este geacutenero se ha logrado aislar en su forma endoacutefita en tallos y hojas de

43

diversas plantas tambieacuten como saprofitos en detritos hojarasca y larvas muertas (Uzor et al

2015 1)

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

Los hongos endoacutefitos hallados en esta investigacioacuten se encontraron dentro de la especie

de frailejoacuten E hartwegiana la cual pertenece a los Andes Tropicales ubicados maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos Estos ecosistemas son sensibles a los efectos del cambio

climaacutetico por su altura su alto endemismo y su sensibilidad al efecto de borde Cuando las

especies lentildeosas empiecen a migrar a lo largo del gradiente altitudinal es posible que los

frailejones se encuentren con suelos agrestes en donde sus semillas no podraacuten fijarse y los efectos

adversos de hongos como Nigrospora N oryzae y N sphaerica seraacuten maacutes notables

aprovechando las ventanas de oportunidad que generen los desbalances climaacuteticos (Sharma et al

2013)

Los cambios en los patrones climaacuteticos potenciaran la especie N sphaerica dentro del

frailejoacuten la cual tiene la capacidad de causar tizoacuten foliar en la especie Camellia sinensis siendo

una planta de teacute perteneciente a la divisioacuten de las magnolifiotas como el geacutenero Espeletia (Liu et

al 2015) Nigrospora fue el geacutenero maacutes ampliamente aislado en las identificaciones generadas a

partir de las hojas de frailejoacuten esto se veriacutea explicado debido a que N sphaerica tiene un

mecanismo de descarga de esporas efectivo que puede proyectar a la fuerza sus esporas a una

distancia de hasta 2 cm en vertical y 68 cm en horizontal como lo demostroacute Webster (1952)

ademaacutes el estudio de Wu y colaboradores (2004) tambieacuten evidencioacute que las esporas de

44

Nigrospora son uno de los grupos maacutes dominantes en la atmoacutesfera y estaacuten asociadas con

tormentas de polvo

La gran capacidad colonizadora del geacutenero Nigrospora le permite adaptarse a las

condiciones climaacuteticas cambiantes con la estrategia de dispersioacuten de sus esporas logrando

distanciarse del frailejoacuten hospedero para encontrar nuevos hospederos producto de las

migraciones tempranas a lo largo del gradiente altitudinal (Riveros 2010)

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

por encima del 80 lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen menos

mutaciones en los nodos internos del aacuterbol basados en la distribucioacuten de probabilidad asignadas

a los posibles arboles resultantes dando lugar a una hipoacutetesis evolutiva maacutes confiable (Schmidt y

Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 es decir el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes

corto (menos cambios) y el cual se ajusta mejor a los datos (Swofford 1997)

Teniendo asiacute una inferencia filogeneacuteticamente robusta los geacuteneros Collectotrichum y

Nigrospora pertenecen a la Divisioacuten Ascomycota ambos geacuteneros son particularmente agresivos

con las plantas en especial la especie Colletotrichum gloeosporioides la cual es la fase asexual

de Glomerella cingulata (Raj et al 2013) Se caracteriza por tener un amplio rango de

hospederos entre ellos el frailejoacuten a los cuales les causa una enfermedad conocida pudricioacuten

amarga antracnosis o chancros siendo esta la necrosis de frutos flores nervios y tallos

(Gonzaacutelez et al 2006 4)

Uno de los primeros reportes de afectaciones a especies de frailejoacuten se obtuvo en el 2009

en el Parque Natural Nacional Chingaza Colombia en donde encontraron las especies de

frailejoacuten Espeletia grandiflora y Espeletia uribei afectadas debido a insectos y una especie de

hongo del genero Colletotrichum (Medina 2009- 9 Hartung y Burton 1981)

Por ende que estos dos geacuteneros de hongos se encuentren juntos podriacutea tener

implicaciones en el aumento de virulencia potenciado a su vez por los desbalances abioacuteticos

causados por el cambio climaacutetico como lo han mencionado Belisario y colaboradores (2002) es

posible que las afectaciones no sean producidas por un uacutenico hongo si no por un complejo de

varios generando sinergismos entre diferentes especies que solas no hariacutean dantildeo a la planta pero

juntas podriacutean ser causantes de enfermedad (Lamichhane y Venturi 2015 4) aun mas en un

45

marco de cambio climaacutetico que gradualmente aumenta sus efectos nocivos sobre los paacuteramos

aumentando la temperatura cambios en la precipitacioacuten heladas intensas cambios en la

nubosidad mayor exposicioacuten a la radiacioacuten solar teniendo por resultado un iacutendice de estreacutes

mayor en las plantas de paacuteramo generando ventanas de oportunidades para que los hongos

endoacutefitos modifiquen sus roles de protector a patoacutegeno

En frailejones tambieacuten se ha reportado la presencia de Nigrospora y Trichoderma por

Bonilla y Argenis (2005) maacutes especiacuteficamente en la especie Espeletia grandiflora la cual es una

especie que habita en los paacuteramos de Colombia Ecuador y Venezuela en conjunto con Espeletia

hartwegiana (Luteyn 1999 3) El hecho que existan estos dos geacuteneros presentes en los frailejones

advierte de un equilibrio entre hongos endoacutefitos que se puede romper bajo las tensiones del

cambiante clima maacutes aun en los sensibles paacuteramos alto andinos

En cuanto a N sacchari se tiene reporte que es un productor de metabolitos con una

notable actividad herbicida demostrado en plantas cultivadas en invernadero (Fukushima et al

1998 2) debido a que existe evidencia que sugiere que los hongos endoacutefitos han evolucionado

directamente de hongos patoacutegenos (Schulz et al 1999 4) sumado al estreacutes del cambio climaacutetico

en cualquier momento de extrema tensioacuten hiacutedrica caloacuterica o heladas en estos ecosistemas de alta

montantildea Estos anomaliacuteas ambientales podriacutea disparar mecanismos de accioacuten fitopatoacutegenos

dentro de los frailejones generando un declive notable en sus poblaciones y por ende un declive

de la cantidad recurso hiacutedrico aguas abajo y su regulacioacuten (Diacuteaz et al 2002 5)

Como se mencionoacute anteriormente los medios de propagacioacuten de estos hongos endoacutefitos

pueden ser por medio de esporas que estaacuten en el ambiente aunque tambieacuten los vectores que

juegan un rol clave en su dispersioacuten son los insectos ya que estos pueden transportar esporas o

partes del hongo en su cuerpo patas o aparato bucal (Eigenbrode et al 2018 5)

Considerando la dispersioacuten homogeacutenea de los frailejones dentro del paacuteramo la carga

esporas en el ambiente y la herbivoriacutea de insectos es probable que se puedan ver infectados la

mayoriacutea de individuos (Varela 2016) es por ello que en el futuro puede que las afectaciones en

frailejones no sean producidas por hongos fitopatoacutegenos si no por hongos endoacutefitos que tuvieron

la ventana de oportunidad gracias al cambio climaacutetico aumento de la temperatura aumento en

las concentraciones de CO2 y alteraciones de precipitacioacuten que pueden hacer susceptible la planta

al ataque de estos hongos (Chakraborty 2011 Elad y Pertot 2014)

46

Para que se genere la enfermedad esta depende de la interaccioacuten de tres o cuatro factores

1) hospedero susceptible 2) agente causal (virulento) 3) condiciones ambientales favorables y 4)

tiempo (Francl 2001 2) la falta de alguno de ellos no permite que el patoacutegeno produzca la

enfermedad en la planta debido a ello algunas especies de frailejoacuten pueden tener una o dos cepas

que puedan actuar como fitopatoacutegenos pero no estaacuten activas si no estaacute completa su asociacioacuten

con otro patoacutegeno u otro factor

Ademaacutes existe un estudio que evaluoacute el efecto de la temperatura sobre la capacidad de

Fusarium verticillioides para generar infeccioacuten en plantas de maiacutez se probaron bajo 3 escenarios

de temperatura como resultados obtuvieron que la enfermedad de este hongo se veiacutea potenciada

por el aumento de temperatura en temperaturas por encima de 35degC (Murillo et al 2008) este

estudio da soporte a la hipoacutetesis de que existen factores que influyen significativamente a la

infeccioacuten en la planta tal vez el paacuteramo difiacutecilmente alcance 35degC no obstante la mayoriacutea de

especies son sensibles a cambios de temperatura de hasta de 1degC en donde modifican su

comportamiento rutas metaboacutelicas interacciones ecoloacutegicas y por ende sus defensas se ven

alteradas

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e Hypocrea

El geacutenero Trichoderma con seis especies diferentes (veacutease figura 12) fue el segundo

geacutenero maacutes numeroso despueacutes de Nigrospora que contoacute con siete especies aunque las primeras

especies que se analizaron fueron especies que principalmente actuaban generando enfermedades

en las plantas en las que se encontraban ante disturbios el geacutenero Trichoderma pertenece a la

47

familia Hypocreaceae y se caracteriza por tener una gran capacidad biocontroladora sobre

fitopatoacutegenos como Fusarium oxysporum los cuales podriacutean llegar masivamente con las

migraciones tempranas de insectos y plantas lentildeosas (Miles et al 2012 7)

No solo actuacutean repeliendo patoacutegenos internos si no tambieacuten patoacutegenos externos como

insectos que desean consumir u aprovechar la planta ya que estos pueden secretar diferentes

metabolitos secundarios y enzimas que actuacutean inhibiendo su desarrollo (Boughalleb-M et al

2018 8)

Es bien conocido que el geacutenero Trichoderma produce amplio rango de sustancias

antibioacuteticas ademaacutes de poseer la caracteriacutestica de parasitar otros hongos (Howell 2002 6)

Debido a la competencia que generan las especies del genero Trichoderma por espacio y

nutrientes inhiben o degradan pectinasas y otras enzimas que son esenciales para que los hongos

fitopatoacutegenos como Botrytis cinerea penetre en la superficie de las hojas logrando proteger de

esta forma al frailejoacuten que se veraacute expuesto a nuevas amenazas microbioloacutegicas auspiciadas por

los cambios en los patrones climaacutetico (Zimand et al 1996)

Ademaacutes de la capacidad del Trichoderma sp para atacar o inhibir el crecimiento de

patoacutegenos de plantas directamente descubrimientos recientes indican que tambieacuten pueden inducir

resistencia sisteacutemica y localizada a una variedad de patoacutegenos de plantas tales como el frijol es

protegido por Trichoderma harzianum de especies fitopatoacutegenas como Colletotrichum

lindemuthianum Botrytis cineacuterea las cuales producen lesiones en las hojas de la planta (Harman

y Howell 2004) Incluso se descubrioacute que ciertas especies de Trichoderma tienen una influencia

sustancial en el buen crecimiento y desarrollo de las plantas sin y con condiciones de estreacutes

climaacutetico (Lorito 1998)

Como lo demostraron Bonilla y Argenis (2005) en su estudio llevado a cabo en el

frailejoacuten Espeletia grandiflora diferentes cepas pertenecientes a Trichoderma pueden proteger

esta especie de paacuteramo de organismos fitopatoacutegenos emergentes por el cambio climaacutetico por

ende si puede proteger a E grandiflora tambieacuten puede proteger la especie E hartwegiana lo

que le permitiraacute sobrellevar diferentes ataques fortuitos de patoacutegenos e insectos que nunca han

logrado alcanzar las altitudes de paacuteramo (3200 - 5000 m)

Cuando el cambio climaacutetico aumente la temperatura en 1degC o 2degC traeraacute consigo sus

efectos de modificacioacuten en cuanto a la estructura y composicioacuten de las especies de plantas que

48

existen en zonas altas para este escenario basado en los caacutelculos de Thuiller (2007) las especies

se habriacutean desplazado en el gradiente altitudinal aproximadamente 450 metros para el antildeo 2070

Las consecuencias de este desplazamiento serian uacutenicas debido a que gran cantidad de

insectos y patoacutegenos tendriacutean migraciones tempranas en el gradiente altitudinal en buacutesqueda de

su optimo teacutermico llevando a cabo un proceso conocido como Termofilizacioacuten (Cuesta et al

2019) es ahiacute donde entra en juego la proteccioacuten que le pueden brindar especies endoacutefitos como

las que pertenecen al geacutenero Trichoderma en el marco de cambio climaacutetico

En concordancia con las cepas de Trichoderma y el geacutenero Hypocrea que tambieacuten

pertenece a la familia Hypocreaceae se conocen maacutes de 700 secuencias de peptaiboles (peacuteptidos

bioloacutegicamente activos) de ambos geacuteneros donde algunos de eacutestos son ecoloacutegica y

comercialmente relevantes debido a su potencial antimicrobiano actividad enzimaacutetica uacutetil para

competir por espacio y alimento de los nuevos patoacutegenos emergentes procedentes de las

alteraciones climaacuteticas y las migraciones tempranas (Degenkolb et al 2008 6)

En cuanto al geacutenero Hypocrea tambieacuten se ha reportado actividad antimicrobiana y anti

fuacutengica contra Staphylococcus aureus y Fusarium oxysporum (Gogoi et al 2008 2) habitando

los geacuteneros Trichoderma e Hypocrea dentro de especies de frailejoacuten como E hartwegiana se

espera que puedan generar sinergias de proteccioacuten que las ayude a combatir los fuertes y

extremos eventos climaacuteticos

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

del 100 (veacutease figura 13) lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen

menos mutaciones en los nodos internos del aacuterbol por ende este aacuterbol contiene la menor

cantidad de mutaciones o cambios dentro sus nodos internos teniendo como resultado una

hipoacutetesis evolutiva confiable (Schmidt y Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 que

indica que el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes corto (menos cambios) y el cual se ajusta

mejor a los datos (Swofford 1997)

49

El geacutenero Annulohypoxylon es de importancia dentro del marco del cambio climaacutetico ya

que pertenece a la familia Xylariaceae y se caracteriza por poseer metabolitos secundarios

antitumorales-citotoacutexicos como la anuloescuamulina que ayudan a combatir el estreacutes abioacutetico

(Cheng et al 2012) estas cepas de hongos son principalmente saprofitos y oportunistas han sido

reportadas en hojas sanas y afectadas de frailejones en otros estudios (Gonzaacutelez 2012 Nonsoque

2012) siendo un geacutenero resiliente a las perturbaciones ambientales como los cambios en los

patrones climaacuteticos su relacioacuten como mutualista dentro del frailejoacuten se mantendraacute hasta que el

frailejoacuten se adapte o colapse ante el estreacutes abioacutetico

Aunque no se conocen como fitopatoacutegenos al contrario pueden actuar como mutualistas

no se descarta que puedan estar involucrados en el desarrollo de diferentes enfermedades en

plantas cuando las condiciones ecosistemicas se alteran a puntos extremos (Gonzalez et al 2017)

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon Biscogniauxia

Nemania y Humiacutecola

El geacutenero Daldinia posee unos valores de MPML correspondientes a 10094 con lo cual

se encuentra bien soportado estadiacutesticamente el geacutenero Daldinia se encuentra ubicado en la

familia Xylariaceae al igual que el geacutenero Hypoxylon Biscogniauxia y Nemania que en su

respectivo orden contienen un soporte estadiacutestico MPML de 10082 10099 y 100100 (veacutease

figura 14) los cuales pertenecen a la divisioacuten Ascomycota las cepas de Daldinia se caracterizan

principalmente por ser especies endoacutefitas teniendo la capacidad de estar dentro de su hueacutesped

mucho tiempo sin causarle dantildeo o al menos un dantildeo evidente por medio de su estado asexual

50

No obstante su estado se puede modificar cuando las condiciones externas se modifican

abruptamente en poco tiempo como es el caso de las alteraciones en la temperatura

precipitacioacuten y concentraciones de dioacutexido de carbono (CO2) auspiciados por el cambio

climaacutetico (Saacutenchez et al 2013)

Un estudio realizado por Prieto (2017) en la especie de frailejoacuten E grandiflora encontroacute

que la especie Daldinia eschscholtzii estaba asociado en el siacutentoma de clorosis (falta de clorofila

en las hojas) Tambieacuten se reportoacute que especies de Daldinia como Daldinia conceacutentrica tienen la

capacidad de controlar nematodos fitopatoacutegenos (Silva et al 2020 104) los cuales pueden invadir

y romper los tejidos de la planta dantildeando sus estructuras los nematodos tambieacuten seraacuten sujetos a

migraciones tempranas por el cambio climaacutetico que trae consigo presiones de seleccioacuten por ende

nuevas amenazas para los frailejones (Nakashima et al 2007)

Como hemos visto hasta este punto las especies de hongos endoacutefitos se muestran en

muchos casos como benefactores y protectores de las diferentes plantas en las que habitan

incluyendo diferentes especies de frailejones

Los hongos endoacutefitos protegen tanto de factores bioacuteticos como virus hongos

fitopatoacutegenos bacterias insectos y factores abioacuteticos como las intemperancias del clima no

obstante en su relacioacuten endoacutefita geacuteneros como Hypoxylon que pertenece igual que Daldinia a la

familia Xylariaceae pueden tener roles amenazadores en conjunto con el cambio climaacutetico

seguacuten Gonzales y colaboradores (2019) inocularon cepas pertenecientes al geacutenero Hypoxylon en

hojas de Theobroma cacao y encontraron que en 48 horas se comenzoacute a notar las marcas de

clorosis y deshidratacioacuten foliar esto demuestra que cepas de este geacutenero pueden tener efectos

fitopatoacutegenos ocasionando muerte descendente pudricioacuten del tronco negro y resinosis de ramas

de mezquite (De la Torre-Almaraacutez et al 2003 De la Torre-Almaraacutez et al 2009)

La presencia de este geacutenero dentro del frailejoacuten en un marco del cambio climaacutetico lo

convierte en una amenaza latente ya que las condiciones seraacuten cada vez maacutes agrestes en los

paacuteramos de los Andes Tropicales Puede favorecer el desarrollo de este geacutenero que tiene las

enzimas necesarias para producir la pudricioacuten del tronco negro entre otras enfermedades

relevantes

51

Tambieacuten las especies del geacutenero Hypoxylon se han reportado como endoacutefitos en tejidos de

plantas lentildeosas o herbaacuteceas (Petrini y Petrini 1985 3) asiacute como saprofitos o fitopatoacutegenos

deacutebiles en madera de aacuterboles de zonas templadas o tropicales (Miller 1961) como lo menciona

Miller (1961)

Los geacuteneros Biscogniauxia Nemania tambieacuten estaacuten dentro de la familia Xylariaceae y

Divisioacuten Ascomycota un aspecto interesante de las especies de Biscogniauxia es que son

paraacutesitos exclusivos de las angiospermas dicotiledoacuteneas en donde concluyeron que todas las

especies pertenecientes a este geacutenero son patoacutegenos umllevesuml que se aprovechan de situaciones de

sequiacutea y estreacutes hiacutedrico para aumentar su patogenicidad (Ju et al 1998)

La especie de frailejoacuten E hartwegiana es una Dicotiledoacutenea eso explica porque

podemos encontrar esta especie de hongo endoacutefito en el frailejoacuten del presente estudio siendo de

vital importancia denotar que las especies de Biscogniauxia se aprovechan especialmente de las

situacioacuten de sequiacutea y estreacutes hiacutedrico difiacutecilmente las especies de este geacutenero podriacutean afectar a los

frailejones debido a que se caracterizan por ser reguladores de los ciclos hiacutedricos el agua es el

recurso que maacutes tiende a existir en un paacuteramo por la estructura de sus suelos compuesta por

andosoles porosos y necromasa acumulada teniendo asiacute un alto iacutendice de retencioacuten hiacutedrica

(Hernandez y Muntildeoz 2015) de modo que el cambio climaacutetico no favorece al geacutenero

Biscogniauxia en su estado patogeacutenico dentro del ecosistema de paacuteramo

En cuanto al geacutenero Nemania Da Silva y colaboradores (2018) llevaron a cabo una

investigacioacuten en la cual identificaron cepas pertenecientes a los geacuteneros Colletotrichum

Phyllosticta Xylaria Nemania y Alternaria en la especie ornamental Pachystachys lutea en

donde las mismas cepas fueron ensayadas para inhibir el crecimiento de hongos fitopatoacutegenos

como Colletotrichum sp en donde encontraron que Nemania era capaz de inhibir por medio de la

secrecioacuten de distintas enzimas el crecimiento de dichas especies gracias a su actividad

enzimaacutetica el geacutenero Nemania puede compensar los desequilibrios causados por el cambio

climaacutetico en teacuterminos de hongos fitopatoacutegenos

Hay que tener en cuenta que los elementos que dan forma a las interacciones planta-

endoacutefito incluyen el modo de transmisioacuten el patroacuten de infeccioacuten la edad de la planta las

condiciones ambientales potenciadas por el cambio climaacutetico y los antecedentes geneacuteticos (Aly et

al 2011 6) Los frailejones de la especie E hartwegiana que se muestrearon para el estudio se

52

tomoacute las hojas sanas lo que indica que poseiacutean estas cepas de endoacutefitos en equilibrio siendo este

uno de los pocos reportes de este geacutenero en especies de alta montantildea en los Andes Tropicales

El geacutenero Humiacutecola se encuentra soportado por un MPML de 10076 siendo una

hipoacutetesis evolutiva considerable es el uacutenico de la figura 14 que no estaacute dentro de la familia

Xylariaceae ya que pertenece a la familia Chaetomiaceae aunque se halla en la divisioacuten

Ascomycota se podriacutea considerar a la especie Humiacutecola fuscoatra como una de las especies de

endoacutefitos maacutes umlinofensivasuml debido a trabajos de investigacioacuten reportados como el de Menzies y

colaboradores (1998) y el de Naik y colaboradores (2009)

Humiacutecola fuscoatra no se considera un peligro latente para la especie E hartwegiana ya

que existe en equilibrio con su entorno Estaacute comprobado por medio de caracterizaciones

quiacutemicas que Humiacutecola fuscoatra es un importante productor de moleacuteculas de estimacioacuten

medica como el resorciacuteclico y lactonas aacutecidas (Mejia et al 2014) Por lo tanto es una especie

prometedora con un reservorio de metabolitos secundarios de importancia medicinal e industrial

que de seguir los efectos nocivos del cambio climaacutetico en los Andes Tropicales maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos esta especie podriacutea desaparecer

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies Massarina

Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

Uno de los grupos mejores soportados en este cladograma es el grupo de Diaporthe en el

cual se encontraron cuatro especies siendo uno con maacutes abundancia de especies del estudio y que

posee un MPML de 10085 10089 y 10095 acorde a sus 3 nodos (veacutease figura 15) teniendo asiacute

una hipoacutetesis evolutiva confiable de estas relaciones las especies de Diaporthe pertenecen a la

familia Diaporthaceae de la divisioacuten Ascomycota y son especies de endoacutefitos que se distinguen

por inhibir el crecimiento de hongos patoacutegenos en el hospedero que se encuentren El estudio de

53

Da Silva y colaboradores (2018) mostroacute que cepas de Diaporthe sp Inhibieron el crecimiento de

Fusarium oxysporum y Colletotrichum sp hongos fitopatoacutegenos que aumentaran su presencia

aprovechando las alteraciones producidas por el cambio climaacutetico en los paacuteramos

Las especies de este geacutenero estaacuten en continuo cambio entre endoacutefitos y patoacutegenos

funcionando en la mayoriacutea de los casos en una relacioacuten mutualista en donde le brindan a la planta

mayor tolerancia a las sequias proteccioacuten de patoacutegenos y pestes caracteriacutestica uacutetil frente a los

retos ecoloacutegicos que plantea el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales (Hubbard et al 2014)

se conocen cerca de 800 especies de este geacutenero asociadas a una amplia gama de plantas

vasculares a nivel mundial (Rossman et al 2015)

Esto explica porque las especies de Diaporthe fueron una de las maacutes numerosas

encontradas en la especie de alta montantildea E hartwegiana teniendo en cuenta que esta especie

pasa raacutepidamente de un estado endoacutefito a un estado patogeacutenico y dada su faacutecil y alta distribucioacuten

representa un peligro en conjunto con el cambio climaacutetico para las especies de alta montantildea como

los frailejones y supone una amenaza para el balance hiacutedrico y ecosistemico en el futuro

El geacutenero Crassiparies de la familia Neohendersoniaceae y el geacutenero Massarina de la

familia Massarinaceae pertenecen al orden Pleosporales aunque se discute debido a las

similaridades morfoloacutegicas y genoacutemicas con Massarina si Crassiparies deberiacutea estar en la

familia Massarinaceae (Hyde et al 2013 4) Se tiene poca informacioacuten sobre la especie

Crassiparies quadrisporus por ende este puede ser uno de los primeros reportes de esta especie

en una especie de alta montantildea como lo es el frailejoacuten especiacuteficamente en la especie E

hartwegiana en un marco de cambio climaacutetico el geacutenero Crassiparies necesita mayores estudios

a nivel ecoloacutegico y microbioloacutegico para entender su papel dentro de esta crisis climaacutetica

Mientras tanto el geacutenero Massarina ha logrado ser aislado de agua dulce con el fin de

obtener fuentes de productos naturales bioloacutegicamente activos por medio de las investigaciones

quiacutemicas de Shearer (1999 2001) en una especie de Massarina obtuvieron como resultado el

aislamiento de tres nuevos sequiterpenoides y dos lactonas derivadas de policeacutetidos con nuevos

sistemas de anillos lo que indica que esta especie tambieacuten puede tener un rol importante

mediante la produccioacuten de enzimas y metabolitos secundarios en el marco de las invasiones

bioloacutegicas impulsadas por el cambio climaacutetico

54

El geacutenero Cryptocoryneum de la familia Cryptocoryneaceae existe poca informacioacuten de

sus mecanismos de accioacuten como endoacutefito o patoacutegeno maacutes aun en especies de los Andes

Tropicales este podriacutea ser uno de los primeros reportes sobre esta especie de hongo en una

especie de frailejoacuten especiacuteficamente E hartwegiana en el 2015 se reportoacute en Brasil el

descubrimiento de una nueva especie del genero Cryptocoryneum trataacutendose de Cryptocoryneum

parvulum hallada en las hojas de la especie Araucaria angustifolia (Gimnosperma) (Silva et al

2015 1) la informacioacuten sobre el geacutenero Cryptocoryneum en relacioacuten al cambio climaacutetico y sus

efectos dentro de especies de alta montantildea como el frailejoacuten auacuten son poco conocidas

Uno de los geacuteneros maacutes cercanos a los grupos externos del cladograma es Cyphellophora

perteneciente a la familia Cyphellophoraceae el cual posee un MPML de 10091 logrando una

hipoacutetesis evolutiva confiable Diversas especies de Cyphellophora han logrado ser aisladas de

infecciones superficiales de la piel o las untildeas en humanos y de materiales vegetales (Decock et

al 2003 Cheewangkoon et al 2009) Esto indica su amplia distribucioacuten y su capacidad para ser

patogeacutenica tanto en plantas como en animales maacutes aun en condiciones desfavorables para la

planta como son las condiciones de cambio climaacutetico

De la especie Cyphellophora reptans se tiene reporte que su morfologiacutea es muy similar a

la de una levadura por lo que es faacutecilmente confundida con una (Reacuteblovaacute et al 2013) Es posible

que este sea el uacutenico reporte de Cyphellophora reptans en las hojas de un frailejoacuten o especie de

alta montantildea que habite en los troacutepicos como E hartwegiana debido a ello sus mecanismos de

accioacuten en especies de paramo dentro de un marco de cambio climaacutetico es poco conocido Se

necesitan mayores estudios enfocados en esta especie para entender su ecologiacutea y dinamismo

ecoloacutegico respecto a los cambios en las variables ambientales

Se eligieron las especies Coprinellus domesticus y Coprinellus xanthothrix como grupos

externos con el fin de enraizar el aacuterbol debido a que pertenecen a la Divisioacuten Basidiomycota la

cual difiere en grado de la divisioacuten Ascomycota aunque conserva semejanzas conocidos como

caracteres ancestrales o plesiomorficos que avanzan a medida la filogenia se construye con los

datos de las diferentes secuencias de especies evidenciando novedades evolutivas conocidas

como apomorfias que cuando se dan en un grupo en particular pasan a ser sinapomorfias es decir

novedades evolutivas dentro de un grupo particular (Lehtonen 2020) Se optoacute por enraizar con

55

estas dos especies con el objetivo de dar robustez al aacuterbol filogeneacutetico (Barriel y 1998) lo cual se

consiguioacute como se nota en los estadiacutesticos del aacuterbol filogeneacutetico

56

57

Conclusiones

Se rechaza la hipoacutetesis nula (H0) y se concluye que la identificacioacuten y caracterizacioacuten

molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo Colombia es diferente en 80 de sus geacuteneros y

especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos realizadas en especies de frailejoacuten

Por lo tanto los nuevos geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos encontrados en el frailejoacuten

plantean nuevos desafiacuteos respecto al cambio climaacutetico ya que tienen un rol vital en la

supervivencia de estas especies de alta montantildea como los frailejones debido a su relacioacuten

mutualista o patoacutegena maacutes aun en los paacuteramos que son altamente sensibles a los efectos del

cambio climaacutetico incluso tan sensibles como las zonas polares (Bradley et al 2006)

La mayoriacutea de especies encontradas en el presente estudio tienen potencial para ayudar a

combatir el estreacutes abioacutetico producido por el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales

Especiacuteficamente pueden ayudar a combatir el estreacutes bioacutetico producido por virus hongos

bacterias e insectos en un marco de cambio climaacutetico aumentos de temperatura cambios en la

concentracioacuten de CO2 cambios en la precipitacioacuten migraciones tempranas cambios en la

nubosidad disponibilidad hiacutedrica alteraciones en la estructura y composicioacuten de las especies

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Anexos

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombia

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia

hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

74

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

Coordenadas Geograacuteficas

(Latitud)

De la Colecta del

Material Bioloacutegico total de 15

muestras (Longitud)

LAT N 4deg 37 5871717 LONG W 75deg 25

3292611

LAT N 4deg 37 5885220 LONG W 75deg 25

3271217

LAT N 4deg 37 5884485 LONG W 75deg 25

3312103

LAT N 4deg 36 5995487 LONG W 75deg 27

3045854

LAT N 4deg 37 6195784 LONG W 75deg 30

3292611

LAT N 4deg 40 159171 LONG W 75deg 26

380142

LAT N 4deg 40 363762 LONG W 75deg 26

209072

LAT N 4deg 40 399832 LONG W 75deg 27

173554

LAT N 4deg 40 383965 LONG W 75deg 27

464325

LAT N 4deg 39 486438 LONG W 75deg 27

173559

LAT N 4deg 40 56894 LONG W 75deg 26

568287

LAT N 4deg 40 159174 LONG W 75deg 27

190654

LAT N 4deg 40 125083 LONG W 75deg 26

345912

LAT N 4deg 40 116691 LONG W 75deg 27

208264

LAT N 4deg 40 314698 LONG W 75deg 27

140791

75

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un estereoscopio con el propoacutesito de seleccionar la

maacutes indicada y luego sembrar un cultivo puro a partir de ese micelio

76

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados las

copias se conservaron con glicerol a -80degC en un ultra congelador de Thermo Scientifictrade

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas

y enviadas

77

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicos de forma segura y esteacuteril propiedad de la Universidad del Quindiacuteo

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a la Universidad Ruhr de Bochum (Alemania)

78

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de parsimonia

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X en donde se

observa en amarillo la secuencia umlTCATTAuml la cual es una secuencia altamente conservada

que se usa para marcar el inicio de la misma en hongos endoacutefitos

79

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa JmoldelTest usados para generar el

aacuterbol de relaciones filogeneacuteticas a partir de la regioacuten ITS de los hongos endoacutefitos aislados

total de modelos evaluados 88

ID Nombre Particioacuten lnL P AIC detaAIC Peso Cumpeso Udelta

1 JC 0 100820157 138 204400314 1341348 0 1 -

2 JC+I 0 98912511 139 200605022 9618188 0 1 -

3 JC+G 0 95470113 139 193720225 2733392 0 1 -

4 JC+I+G 0 95467507 140 193735014 274818 0 1 -

5 F81 0 100658095 141 204136189 13149356 0 1 -

6 F81+I 0 98761481 142 200362962 9376128 0 1 -

7 F81+G 0 95314814 142 193469628 2482794 0 1 -

8 F81+I+G 0 95324364 143 193508729 2521895 0 1 -

9 K80 10010 99734495 139 20224899 11262157 0 1 -

10 K80+I 10010 97835191 140 198470382 7483549 0 1 -

11 K80+G 10010 94227821 140 191255643 268809 0 1 -

12 K80+I+G 10010 94209963 141 191239926 253092 0 1 -

13 HKY 10010 99648091 142 202136181 11149348 0 1 -

14 HKY+I 10010 97761512 143 198383024 7396191 0 1 -

15 HKY+G 10010 94170799 143 191201599 214765 0 1 -

16 HKY+I+G 10010 94118678 144 191117357 130523 600E-04 0999 -

17 TrNef 10020 99564653 140 201929306 10942472 0 1 -

18 TrNef+I 10020 97712623 141 198245245 7258412 0 1 -

19 TrNef+G 10020 94150977 141 191121955 135121 400E-04 09994 -

20 TrNef+I+G 10020 94132131 142 191104263 117429 00011 09959 -

21 TrN 10020 99563809 143 201987618 11000784 0 1 -

22 TrN+I 10020 97702964 144 198285929 7299095 0 1 -

23 TrN+G 10020 94094235 144 191068469 81635 00065 09719 -

24 TrN+I+G 10020 94101378 145 191102757 115923 00012 09948 -

25 TPM1 12210 99713879 140 202227759 11240925 0 1 -

26 TPM1+I 12210 97826641 141 198473282 7486449 0 1 -

27 TPM1+G 12210 94249837 141 191319674 33284 0 1 -

28 TPM1+I+G 12210 942022 142 1912444 257566 0 1 -

29 TPM1uf 12210 99663473 143 202186945 11200112 0 1 -

30 TPM1uf+I 12210 97879458 144 198638917 7652083 0 1 -

31 TPM1uf+G 12210 94137349 144 191154699 167865 100E-04 09999 -

32 TPM1uf+I+G 12210 94141897 145 191183794 196961 0 1 -

80

33 TPM2 10212 99722544 140 202245087 11258254 0 1 -

34 TPM2+I 10212 97828213 141 198476426 7489592 0 1 -

35 TPM2+G 10212 94185859 141 191191718 204885 0 1 -

36 TPM2+I+G 10212 94153667 142 191147335 160501 100E-04 09998 -

37 TPM2uf 10212 99648091 143 202156182 11169348 0 1 -

38 TPM2uf+I 10212 97757018 144 198394035 7407202 0 1 -

39 TPM2uf+G 10212 941052 144 1910904 103566 00022 09904 -

40 TPM2uf+I+G 10212 9408801 145 19107602 89187 00044 0982 -

41 TPM3 12012 99768005 140 20233601 11349176 0 1 -

42 TPM3+I 12012 97958099 141 198736198 7749364 0 1 -

43 TPM3+G 12012 94227963 141 191275926 289093 0 1 -

44 TPM3+I+G 12012 94323885 142 191487769 500936 0 1 -

45 TPM3uf 12012 99625421 143 202110843 11124009 0 1 -

46 TPM3uf+I 12012 97770469 144 198420939 7434105 0 1 -

47 TPM3uf+G 12012 94165576 144 191211152 224319 0 1 -

48 TPM3uf+I+G 12012 94150861 145 191201721 214888 0 1 -

49 TIM1ef 12230 99592239 141 202004478 11017644 0 1 -

50 TIM1ef+I 12230 97822787 142 198485574 749874 0 1 -

51 TIM1ef+G 12230 94121043 142 191082087 95253 00033 09853 -

52 TIM1ef+I+G 12230 94122386 143 191104772 117939 00011 09969 -

53 TIM1 12230 99518653 144 201917306 10930473 0 1 -

54 TIM1+I 12230 9781156 145 19852312 7536286 0 1 -

55 TIM1+G 12230 94105198 145 191110396 123562 800E-04 09977 -

56 TIM1+I+G 12230 94087158 146 191094317 107483 00018 09922 -

57 TIM2ef 10232 99550617 141 201921233 109344 0 1 -

58 TIM2ef+I 10232 97704602 142 198249204 726237 0 1 -

59 TIM2ef+G 10232 94093484 142 191026968 40135 00516 0852 -

60 TIM2ef+I+G 10232 94073864 143 191007729 20895 0135 07169 -

61 TIM2 10232 99530022 144 201940044 1095321 0 1 -

62 TIM2+I 10232 97820158 145 198540315 7553482 0 1 -

63 TIM2+G 10232 94058678 145 191017356 30523 00834 08004 -

64 TIM2+I+G 10232 94060837 146 191041674 54841 00247 09248 -

65 TIM3ef 12032 99546286 141 201912572 10925739 0 1 -

66 TIM3ef+I 12032 97713931 142 198267862 7281028 0 1 -

67 TIM3ef+G 12032 94129376 142 191098753 111919 00014 09936 -

68 TIM3ef+I+G 12032 94112005 143 191084009 97176 0003 09883 -

69 TIM3 12032 99514376 144 201908751 10921918 0 1 -

70 TIM3+I 12032 97700023 145 198300047 7313213 0 1 -

71 TIM3+G 12032 94115323 145 191130646 143812 300E-04 09997 -

72 TIM3+I+G 12032 94096941 146 191113882 127048 700E-04 09984 -

73 TVMef 12314 9970418 142 20224836 11261526 0 1 -

74 TVMef+I 12314 97940598 143 198741196 7754363 0 1 -

81

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE (AIC)

75 TVMef+G 12314 94159829 143 191179657 192824 0 09999 -

76 TVMef+I+G 12314 94160993 144 191201987 215153 0 1 -

77 TVM 12314 99615991 145 202131982 11145148 0 1 -

78 TVM+I 12314 97746676 146 198413353 7426519 0 1 -

79 TVM+G 12314 94075503 146 191071005 84171 00057 09776 -

80 TVM+I+G 12314 94052588 147 191045176 58342 00208 09456 -

81 SYM 12345 99543166 143 201946331 10959498 0 1 -

82 SYM+I 12345 97757103 144 198394207 7407373 0 1 -

83 SYM+G 12345 94083056 144 191046112 59278 00198 09654 -

84 SYM+I+G 12345 94050035 145 19100007 13236 0198 05819 -

85 GTR 12345 99529525 146 20197905 10992217 0 1 -

86 GTR+I 12345 97686178 147 198312356 7325522 0 1 -

87 GTR+G 12345 94044194 147 191028387 41553 00481 09001 -

88 GTR+I+G 12345 94013417 148 190986834 0 03839 03839 -

16

subterraacuteneos aportando los servicios de abastecimiento de agua para el 70 de la poblacioacuten de

Colombia (Vaacutesquez y Buitrago 2017)

Ademaacutes dada la caracteriacutestica de permanente humedad de su suelo la materia orgaacutenica

se descompone a menor velocidad logrando un efecto de retencioacuten y almacenamiento de carbono

(Anderson et al 2012) En Colombia se han realizado diferentes estudios sobre la distribucioacuten y

extensioacuten del ecosistema paramuno Rangel (2002 4) determinoacute que los paacuteramos colombianos

abarcaban aproximadamente el 26 de la superficie del paiacutes

Figura 1 Tipos de vegetacioacuten en los paacuteramos por Pedraza-Pentildealosa Betancur y Franco-Rosselli (2005)

En particular el paacuteramo Romerales se encuentra dentro del territorio adscrito a los

Parques Nacionales Naturales (PNN) especiacuteficamente el PNN de los Nevados en la cordillera

central colombiana hacia la zona norte del Departamento del Quindiacuteo con liacutemites fronterizos

entre los departamentos de Risaralda y Tolima Este paacuteramo es el hogar del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana el cual estaacute afrontando los efectos del cambio climaacutetico (veacutease mapa 1)

Mapa 1 Parque Nacional Natural los Nevados ubicacioacuten paacuteramo Romerales zona muestreada

17

Existe evidencia cientiacutefica concreta del aumento de temperatura en los Andes Tropicales

tambieacuten cambios significativos en los patrones de precipitacioacuten sumado a la disminucioacuten en la

incidencia del clima nublado lo que conduce a las plantas a mayor cantidad de horas expuestas a

la radiacioacuten solar (Ruiz et al 2009) Otro efecto grave que trae consigo el cambio climaacutetico es el

desplazamiento de especies en el gradiente altitudinal Con un aumento de 3degC se espera que las

especies se muevan ~600 m en buacutesqueda de su optimo teacutermico esto afectariacutea gravemente las

especies de paacuteramo como los frailejones Cuesta Camacho (2007)

Los frailejones son emblemaacuteticas plantas de paacuteramo y ecosistemas de alta montantildea

(MINAMBIENTE 2019) Pertenecen a la familia Asteraceae contiene cerca de 142 especies

agrupadas en ocho geacuteneros Carramboa Coespeletia Espeletia Espeletiopsis Libanothamnus

Paramiflos Ruilopezia y Tamania de estos los maacutes importantes y con mayor diversidad de

especies son Espeletia Espeletiopsis y Libanothamnus (Rivera y Torres 2001)

Poseen adaptaciones que les permite captar y retener grandes cantidades de agua de su

entorno permitiendo un balance ecosistemico (Farias 2013) La morfologiacutea singular del genero

Espeletia le permite acumular las hojas antiguas en forma de ldquoabrigordquo brindando proteccioacuten

contra las bajas temperaturas nocturnas de hasta 0degC Los fuertes vientos y la radiacioacuten solar los

cuales seraacuten cada vez maacutes intensos y frecuentes por causa del cambio climaacutetico (Cortes y

Sarmiento 2013 34) (veacutease figura 2)

Estas plantas son especies claves para la conservacioacuten de los paacuteramos y la lucha contra el

cambio climaacutetico debido a que ofrecen una gran variedad de servicios ecosisteacutemicos (Diacuteaz et al

2007) El paacuteramo es referente sin igual de fuente hiacutedrica ciudades como Bogotaacute y Quito obtienen

aproximadamente el 80 de su agua dulce de los paacuteramos (Buytaert et al 2006) Los frailejones

en su mayoriacutea endeacutemicos se han visto afectados por actividades humanas como la ganaderiacutea

extensiva agricultura (cultivos de papa y cebolla) mineriacutea de oro y carboacuten turismo no

controlado y quemas intencionales (Hofstede 2000) Esta situacioacuten podriacutea comprometer a

mediano y largo plazo la funcioacuten de captacioacuten regulacioacuten y suministro del agua para el consumo

18

en las ciudades colombianas ubicadas en las regiones de influencia de estos ecosistemas (Varela

2015)

Figura 2 Fotografiacutea de la especie Espeletia hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

No obstante en asociacioacuten con especies como el frailejoacuten de los Andes Tropicales

encontramos a los hongos cuyos roles en las interacciones bioloacutegicas son de vital importancia

Los hongos pueden ser endoacutefitos simbiontes mutualistas paraacutesitos y comensales y son capaces

de responder a las amenazas que plantea el cambio climaacutetico en cuanto a perturbaciones

ambientales aumento de temperatura y estreacutes hiacutedrico adaptaacutendose a la disponibilidad de recursos

modificando sus actividades enzimaacuteticas e incluso su genoma a lo largo del tiempo (Moreno et

al 2013)

Los hongos son clasificados seguacuten su forma de reproduccioacuten sea sexual o asexual en

donde se observan las diferencias estructurales internas entre los diferentes grupos tales como

sus esporas e hifas como lo indican Blackwell y Spatafora (2004) estos organismos estaacuten

divididos en cuatro grandes grupos los cuales son Ascomycota Basidiomycota

Chytridiomycota Zygomycota es justo en el grupo de los Ascomycota donde se encuentra gran

diversidad de hongos conocidos como ldquohongos endoacutefitosrdquo en donde su nombre ldquoendoacutefitordquo

significa ldquodentro de la plantardquo (endon dentro phyton planta)

19

Estos microorganismos fuacutengicos tienen la facilidad de pasar gran parte o todo su ciclo de

vida invadiendo los tejidos de su hospedero (planta) sin tener un efecto negativo evidente

(Leacuteveilleacute 1846 3 de Bary 1866 8) Por lo tanto el concepto de endoacutefito indica una asociacioacuten de

costo-beneficio pero de una forma mutualista entre el hongo y la planta hospedera permitiendo

la estadiacutea en sus tejidos vivos (Clay 1998 8) Los hongos endoacutefitos se han encontrado en todas

las plantas (algas musgos pastos plantas y vasculares) desde los bosques templados hasta los

bosques tropicales hallaacutendose una gran diversidad de plantas y en asociacioacuten gran diversidad de

hongos endoacutefitos (Saacutenchez et al 2010)

Se espera que los hongos endoacutefitos jueguen un papel cada vez maacutes importante potenciado

por el cambio climaacutetico en las enfermedades producidas en plantas como pudricioacuten radicular

mal blanco entre otras con los aumentos pronosticados de la temperatura y el estreacutes por sequiacutea

asociados al cambio climaacutetico (Desprez-Loustau et al 2006 Slippers y Wingfield 2007 6) Los

cambios en la cantidad de dioacutexido de carbono (CO2) y la disponibilidad de nitroacutegeno en el suelo

afectan de forma similar tanto a las plantas como a los hongos por ende las alteraciones

generadas por parte del cambio climaacutetico pueden causar desbalances en sus relaciones (Ies et al

2013)

Algunos estudios realizados en el antildeo 1898 donde se registraron los primeros hongos

endoacutefitos como el de Bary (1866) brindo la iniciativa de investigaciones que lograron explicar

los cuadros toxicoloacutegicos observados en animales los cuales se daban por el consumo de

semillas o en aacutereas de pastos (Poaceae) que posiblemente albergaban hongos Clavicipitaacuteceos

(familia del ergot) los cuales poseiacutean actividades enzimaacuteticas con micotoxinas

Por diversas situaciones no trascendioacute la investigacioacuten hasta que Bacon (1977) hizo

relacioacuten del hongo endoacutefito Neotyphodium coenophialum debido a una intoxicacioacuten del ganado

llamado ldquosiacutendrome de veranordquo cuando estos animales consumiacutean pastos de la especie Festuca

arundinacea (Poaceae) Funk en el antildeo 80 caracterizoacute la resistencia de las Poaceae que

albergaban hongos endoacutefitos que frecuentemente eran atacados por insectos (proteccioacuten contra

herbiacutevoros) (Saacutenchez et al 2010)

Compant y colaboradores (2010) mencionaron que tras experimentar en el laboratorio

con una gama de temperaturas en los hongos endoacutefitos aislados obtuvieron resultados variables

respecto al crecimiento es decir positivos y neutrales llegando a la conclusioacuten de que los

microorganismos asociados a las plantas son un factor importante que influye en la respuesta de

20

las plantas acorde a los cambios de temperatura lo que compromete las respuestas del frailejoacuten y

los hongos endoacutefitos frente al calentamiento global causado por el cambio climaacutetico

Con relacioacuten a los estudios realizados sobre hongos endoacutefitos en frailejones se han

encontrado al menos 100 especies con capacidades de inhibir hongos fitopatoacutegenos o herbivoriacutea

(Cabezas et al 2012)

Los geacuteneros de hongos endoacutefitos encontrados en anteriores estudios son Acremonium

Aspergillus Aureobasidium Colletotrichum Fusarium Gliocadium Nigrospora Paecilomyces

Penicillium Trichothecium Trichoderma y Sordaria (Pineda 2000 Programa Nacional para la

Evaluacioacuten del Estado y Afectacioacuten de los Frailejones en los Paacuteramos de Andes del Norte 2009)

Teniendo en cuenta que para Colombia hay poca informacioacuten sobre hongos endoacutefitos en

ecosistemas paramunos se hace fundamental la ampliacioacuten de maacutes informacioacuten referente al tema

debido a que solo existen estudios significativos en cafeacute leguminosas y rosas los cuales maacutes allaacute

de la identificacioacuten de geacuteneros de hongos endoacutefitos no incluyen el cambio climaacutetico y sus

posibles consecuencias (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016) En

teacuterminos filogeneacuteticos los hongos son el reino de la naturaleza maacutes cercano a los animales

(Hibbett et al 2018)

Las relaciones que posean las diferentes especies de endoacutefitos dentro de la especie de

frailejoacuten es de importancia conocerla mediante el uso de la filogenia molecular (Judd et al 2007)

mediante secuencias de ADN ARN o proteiacutenas (Cooke et al 2000) Dependiendo de la presencia

de especies agresivas de endoacutefitos como Nigrospora se puede tener un mejor conocimiento

sobre las consecuencias que trae consigo los impactos del cambio climaacutetico sobre estas plantas de

los Andes Tropicales (Foden et al 2009)

21

Capiacutetulo primero

Cambio Climaacutetico Frailejones y Hongos Endoacutefitos

1 Antecedentes

Desde los estudios realizados por Leacuteveilleacute (1846) y Bary (1866) sobre hongos Endoacutefitos

en pastos de zonas templadas se ha logrado identificar que estos hongos son capaces de inducir

respuestas adaptativas a sus hospederos (Micotoxinas contra herbiacutevora adaptacioacuten a heladas o

climas extremos fijacioacuten de nutrientes) a cambio de alimento y hospedaje formando una relacioacuten

mutualista en la cual las dos especies involucradas son beneficiadas No obstante se ha reportado

que los hongos endoacutefitos ademaacutes de tener relaciones mutualistas con diferentes especies

vegetales se pueden tornar en especies patoacutegenas para su hospedero una vez la planta se

encuentra en condiciones desventajosas tornaacutendose asiacute el hongo endoacutefito en un hongo

fitopatoacutegeno (Herrera y Ulloa 1990 550)

Como se mencionoacute anteriormente los hongos endoacutefitos pueden pasar de un estado

mutualista a un estado de patogeacutenesis dada esta relacioacuten entre ambos organismos se producen

metabolitos secundarios potencialmente toacutexicos facilitando factores de virulencia dados por el

hongo endoacutefito como exoenzimas y metabolitos fitotoacutexicos a su vez la planta presenta defensas

tanto mecaacutenicas como bioquiacutemicas (Saacutenchez et al 2013 5)

Hasta la fecha los principales estudios de hongos endoacutefitos se han fijado en especies de

intereacutes econoacutemico y comercial tales como palma de aceite cafeacute leguminosas pastos de forrajeoacute

y diferentes tipos de rosas (Salgado y Cepero 2005 Vega et al 2010 Parsa et al 2016)

Las especies modelo para el estudio de los hongos endoacutefitos han sido las gramiacuteneas

forrajeras en donde se han reportado especies de endoacutefitos asociados a los geacuteneros Lolium

Festuca y Brachiaria (Siegel et al 1987) no obstante Otero y Bayman (2009) han reportado un

creciente nuacutemero de estudios en orquiacutedeas epifitas tropicales relaciones con hongos micorrizicos

22

Actualmente existen escasos reportes de hongos endoacutefitos asociados a ecosistemas con

climas extremos (temperaturas extremas) como aacuterticos desiertos paacuteramos y zonas alpinas

especialmente para zonas de temperaturas friacuteas como lo son los paacuteramos (Lopera et al 2008

Leung et al 2011 Cabezas et al 2012 Miles et al 2012 Zhang y Yao 2015)

Investigadores como Lopera Leung y colaboradores (2011) han llegado a la conclusioacuten

de que los hongos endoacutefitos juegan un papel importante en las plantas a la hora de adaptarse a

ecosistemas de clima templado (Kivlin et al 2013 Zhang y Yao 2015)

En Colombia los trabajos con hongos endoacutefitos son pocos por ende trabajos como el de

Lopera y colaboradores (2008) con especies del genero Espeletia de los paacuteramos Colombianos

son pioneros ademaacutes del trabajo de Cabezas y colaboradores (2012 4) en el cual aislaron y

caracterizaron celulasas (enzimas descomponedores de la celulosa) extraiacutedas de hongos endoacutefitos

que se hallaban en especies de Espeletia posteriormente Lopera y Miles (2012) unieron

esfuerzos para continuar caracterizando la diversidad de hongos endoacutefitos en los paacuteramos andinos

colombianos enfocados en Espeletia con el objetivo de encontrar especies con potencial

biocontrolador

Existen trabajos tesis en los repositorios de diversas universidades de los antildeos 2014 y

2015 en los cuales se aborda el tema de los hongos endoacutefitos paacuteramos y especies de Espeletia

(frailejones) y de la familia Poaceae en donde se caracterizan las diversas especies de hongos

endoacutefitos por medio taxonomiacutea y biologiacutea molecular ademaacutes de buscar metabolitos secundarios

con fines medicinales o de biocontrol

Los trabajos en filogenia molecular de hongos endoacutefitos realizados en frailejones se han

visto enfocados maacutes hacia la buacutesqueda de la diversidad funcional en comunidades

microbioloacutegicas como por ejemplo el estudio realizado por Ruiz y colaboradores (2015) en

donde buscaron mediante el anaacutelisis molecular de raiacuteces necromasa hojas maduras y joacutevenes de

diferentes especies de Espeletia (veacutease figura 3) ubicada en los Andes neotroacutepicales

colombianos secuencias geneacuteticas de las regiones V5-V6 de la unidad 16S del rARN

23

Figura 3 Distribucioacuten muestral por individuo recolectado Y hojas joacutevenes M hojas maduras N

necromasa R raiacuteces EP epiacutefita DE endoacutefito Tomado de Ruiz y colaboradores (2015)

Este estudio analizoacute la composicioacuten de comunidades microbioanas y su diversidad

funcional en un ecosistema de alta montantildea en donde las temperaturas los rayos UV y la altura

juegan papeles determinantes como filtros ecoloacutegicos severos en donde solo pueden existir

especies que han desarrollado capacidades para adaptarse sobrevivir y colonizar dichas aacutereas

por ende cuando se analizaron las comunidades existentes dentro de estas especies de Espeletia

Encontraron que algunas especies halladas podriacutean tener roles importantes como

productores de metabolitos secundarios enzimas o incluso como bioremediadores y que las

comunidades microbianas eran diferentes tanto en sus hojas como en sus raiacuteces y en la

necromasa

A medida que las deacutecadas avanzan y la evidencia sobre el cambio climaacutetico se hace maacutes

robusta y evidente los estudios en los hongos endoacutefitos han tomado vital importancia al estar

asociados con cultivos de especies comestibles escases de agua y de tierras productivas sumado

a los efectos negativos que trae consigo el cambio climaacutetico para las diferentes plantaciones y

cosechas a nivel global

Es por eso que Lu Yan y colaboradores (2019) analizaron los efectos positivos que teniacutean

la colonizacioacuten de hongos endoacutefitos en las plantas en donde ratificaron que los hongos endoacutefitos

dentro la planta generan metabolitos antimicrobianos estimulan las respuestas inmunoloacutegicas y

compiten por espacio dentro de la planta con diferentes patoacutegenos incrementando asiacute la

resistencia contra herbiacutevoros y la resistencia al estreacutes salino (factores bioacuteticos)

Ademaacutes de ayudar a la planta contra el estreacutes abioacutetico causado principalmente por

factores climaacuteticos como la falta de agua (estreacutes hiacutedrico) las temperaturas extremas la

intensidad de los rayos UV y los metales pesados como la muestra la figura 4 debido a esto se

24

concluyoacute que las fitohormonas cumplen un papel importante en la colonizacioacuten de hongos

endoacutefitos dentro de la planta

Aun que se ha reportado que los hongos endoacutefitos se pueden usar como biocontroladores

diferentes estudios reportan que el uso de hongos endoacutefitos puede tener efectos adversos como

un retraso significativo en el crecimiento de la planta con el uso de la especie Cryptosporiopsis

sp (Terhonen et al 2016) Otro reporte indica la fecundidad y supervivencia de enemigos

naturales como paraacutesitos esto es debido a que los hongos endoacutefitos transfieren sus toxinas y

alcaloides cuando son ingeridos por paraacutesitos u otros enemigos naturales de las plantas (Lopez y

Sword 2015)

Figura 4 La colonizacioacuten endoacutefita modula las defensas de las plantas contra el estreacutes bioacutetico y abioacutetico

Bajo estreacutes bioacutetico (herbiacutevoros y patoacutegenos) y abioacutetico (sequiacutea salinidad metales pesados y otros) (a) se

inducen respuestas de defensa de las plantas (b) los endoacutefitos producen metabolitos protectores y

modulan la viacutea de las fitohormonas para mejorar la inmunidad de las plantas (c) tomada de Lu yan y

colaboradores (2019 7)

25

2 Justificacioacuten

La presente investigacioacuten pretende identificar y caracterizar que especies de hongos

endoacutefitos estaacuten asociadas al frailejoacuten Espeletia hartwegiana y que posibles implicaciones podriacutea

tener que estas especies se encuentren dentro de esta especie de alta montantildea La importancia de

conocer esta informacioacuten reside en que los hongos endoacutefitos pueden beneficiar o perjudicar a la

adaptacioacuten y resistencia de especies vegetales en los distintos escenarios climaacuteticos propuestos

por la ciencia (IPCC 2020)

El calentamiento global podriacutea afectar el equilibrio de los hongos endoacutefitos en especies

vegetales generando desbalances en la planta o la peacuterdida de especies endoacutefitas de importancia

biotecnoloacutegica Por ejemplo se podriacutean perder especies endoacutefitas con potencial para control

bioloacutegico de plagas y enfermedades de plantas como productores de enzimas y metabolitos

secundarios degradacioacuten de plaacutesticos o biorremediacioacuten entre otros (Schulz et al 2002) Por

ello se hace fundamental estudiar los hongos endoacutefitos en ecosistemas de paacuteramo ya que en

Colombia y en los paacuteramos en general han sido poco estudiados y su efecto sobre las plantas de

alta montantildea podriacutea ser clave en el mantenimiento de sus poblaciones

26

3 Hipoacutetesis

H1 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute diferente en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo diferentes los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten tambieacuten seria

modificada

H0 La identificacioacuten y caracterizacioacuten molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en

la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo

Colombia seraacute similar en geacuteneros y especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos

realizadas en especies de frailejoacuten siendo similares los geacuteneros y especies encontrados en

Espeletia hartwegiana las consecuencias del cambio climaacutetico sobre el frailejoacuten continuariacutean

como se ha registrado con anterioridad

27

4 Objetivos

41 Objetivo general

Caracterizar la diversidad de hongos endoacutefitos presentes en los frailejones

de la especie Espeletia hartwegiana en el paacuteramo de Romerales tomando en cuenta su

relacioacuten con el cambio climaacutetico

42 Objetivos especiacuteficos

Identificar los hongos endoacutefitos asociados en Espeletia hartwegiana del

paacuteramo de Romerales

Hallar relaciones filogeneacuteticas entre las diferentes especies de hongos

Endoacutefitos encontradas en Espeletia hartwegiana

Advertir las repercusiones del cambio climaacutetico sobre Espeletia

hartwegiana en base a su diversidad de hongos endoacutefitos

28

29

Capiacutetulo segundo

Materiales Meacutetodos y Resultados

1 Aacuterea de Estudio

El trabajo se realizoacute en el paacuteramo de Romerales ubicado en la zona alta del municipio de

Salento Quindiacuteo (4deg39202N 75deg25506W) con una extensioacuten aproximada de 6794 ha (Cano

et al 2015)

2 Colecta de material bioloacutegico

La colecta del material bioloacutegico se realizoacute mediante muestreos aleatorios lo largo del

paacuteramo tomando coordenadas de cada punto de colecta (veacutease anexo 3) las hojas se colectaron

por medio de tijeras podadoras siendo empacadas cada una en bolsas Ziploc diferentes se

colectoacute un total de 15 hojas cada una correspondiente a una planta de frailejoacuten para un total de

15 plantas muestreadas de E hartwegiana

Adicionalmente las bolsas Ziploc fueron marcadas con los datos de colecta en campo y

transportadas a los laboratorios del Programa de Biologiacutea de la Universidad del Quindiacuteo para su

procesamiento

Tabla 1 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten Espeletia

hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

3 Aislamientos fuacutengicos a partir de muestras vegetales

Las muestras obtenidas fueron lavadas con agua para eliminar el exceso de residuos se

cortaron 4 trozos de cada hoja con un tamantildeo aproximado de 05 a 10 cm (veacutease figura 5) luego

cada trozo de hoja se sometioacute a una esterilizacioacuten la cual se completoacute con algunas modificaciones

acorde al procedimiento descrito por (Osorio et al 2017) especiacutefico para el aislamiento de

30

hongos endoacutefitos que consiste en sumergir perioacutedicamente el material vegetal en etanol al 90

durante un minuto seguido de hipoclorito de sodio (NaClO) al 4 por un minuto continuando

con etanol al 70 durante un minuto y por uacuteltimo se lavaraacuten con agua destilada todo dentro de la

campana de flujo

Las cuatro secciones de hoja se transfirieron a una caja de Petri para un total de 15 cajas

de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA) (una caja de Petri por cada 4 cortes de hoja)

Posteriormente las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente (25degC aproximadamente)

Figura 5 Cortes de las hojas de frailejoacuten Espeletia hartwegiana esterilizadas y sembradas en medio de

cultivo Agar papa Dextrosa primera semana de crecimiento micelial caja de Petri de 20ml de capacidad

Pasadas 3 semanas se revisaron los cultivos fuacutengicos con el fin de revisar el crecimiento

del micelio y hacer un repique a un cultivo puro una vez maduros se procedioacute a utilizar la teacutecnica

de corte de hifa uacutenica (Osorio et al 2017) esta teacutecnica consistioacute en tomar la punta de la hifa con

ayuda de un estereoscopio y un bisturiacute de grado quiruacutergico agua destilada alcohol al 70 y un

mechero para mantener el bisturiacute esterilizado una vez identificada la hifa ideal para cultivar de

forma pura (veacutease figura 6) con el bisturiacute se procedioacute a cortar el agar PDA en forma de cuadro

con una medida aproximada de 3 miliacutemetros cuadrados

31

Figura 6 Hifa uacutenica observada desde el estereoscopio lista para ser cortada por medio de la teacutecnica de

corte de hifa uacutenica

Se esperoacute entre 3 a 5 semanas a que crecieran los cultivos puros aislados de las hifas uacutenicas en

nuevas cajas de Petri con agar PDA

4 Crecimiento de cultivos microbioloacutegicos (Hongos endoacutefitos)

Los hongos cultivados de forma pura consiguieron un crecimiento micelial significativo a partir

de los 15 diacuteas a temperatura ambiente como lo demuestra la figura 7 que contiene doce de los

cultivos maacutes representativos con su respectivos micelios aeacutereos desarrollados donde variacutean sus

colores formas y consistencias esto indicando que pertenecen a diferentes especies

2

1

3

32

Figura 7 Ejemplos de las diferencias morfoloacutegicas en micelios generados por los medios de cultivo

Axeacutenicos (Puros) de hongos endoacutefitos en agar PDA (1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12) aislados de las

hojas de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

5 Extraccioacuten de ADN

4

5

6

7

8

9

10

11

12

33

Una vez el micelio de los hongos se encontraba desarrollado en la cantidad necesaria se

procedioacute a extraer el ADN genoacutemico siguiendo el protocolo de extraccioacuten de Raeder y Broda

(1985) por medio de un barrido superficial del micelio evitando tomar el agar este micelio

posteriormente se colocoacute en tubos Eppendorf esteacuteriles de 2 ml y se pulverizoacute mediante el uso de

un asa microbioloacutegica y 1ml de buffer de extraccioacuten compuesto de Tris-HCL 1 M pH 78 EDTA

05 M Ph 8 SDS 10 wv NaCL y agua destilada para cada tubo a continuacioacuten se agregoacute 800

ul de etanol al 70 500 ul de fenol y se mezcloacute

Se adicionoacute 300 ul de cloroformo y se mezcloacute de nuevo de alliacute se llevoacute a la centrifuga a

10000 rpm por 60 minutos luego de centrifugar se forma un sobrenadante el cual es transferido

en su totalidad a un nuevo tuvo Eppendorf de 15 ml en el cual se agregaron 400 ul de cloroformo

y se llevoacute a la centrifuga a 10000 rpm por 10 minutos en donde nuevamente se forma un

sobrenadante aunque esta vez solo se toman 500 ul del tubo para ser transferidos otro tubo

Eppendorf de 15 ml ya en el nuevo tubo se adicionaron 50 ul de NaAC y se invirtioacute varias veces

para homogenizar la mezcla a continuacioacuten se guardoacute en el refrigerador a 4degC toda la noche

Al diacutea siguiente se tomaron las muestras en los tubos Eppendorf y se centrifugaron a

10000 rpm por 30 minutos (Formacioacuten del Pellet de ADN) cuando la centrifuga terminoacute se

procedioacute a remover el etanol ya sin etanol se agregoacute de nuevo 1 ml de etanol al 70 a cada tubo

y se centrifugoacute a 10000 rpm por 5 minutos en este paso se removioacute el etanol y se dejoacute secar el

pellet de ADN una vez el etanol se evaporoacute se re suspendioacute el pellet en 100 ul de agua grado

molecular o Sabax con 5 ul de RNAsa con el fin de evitar la presencia de moleacuteculas de ARN

posteriormente se incubaron a 37degC por 30 minutos y se guardaron para su envioacute a -20degC

(Raeder y Broda 1985)

6 Bioinformaacutetica-Metagenoacutemica Fuacutengica

Una vez se secuenciaron las muestras de ADN enviadas a la Universidad Ruhr de

Bochum Alemania se hizo el ensamblaje de las secuencias en contigs y scaffolds en el

programa CLC Main Workbench 8 (Nicola et al 2013) Como lo muestra la figura 8 donde se

muestran los pasos esenciales de una teacutecnica de Metagenoacutemica donde posteriormente se

analizaron con maacutes detalle mediante teacutecnicas filogeneacuteticas

34

Figura 8 Pasos esenciales de un proyecto metagenoacutemico Fuente Thomas y colaboradores (2012)

7 Secuenciamiento

Se extrajoacute con eacutexito un total de 35 muestras de hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

Espeletia hartwegiana (veacutease figura 9) que posteriormente fueron secuenciadas por la

Universidad Ruhr de Bochum (Alemania) logrando un total de 70 secuencias incluyendo

aquellas obtenidas en Genk Bank

Figura 9 ADN extraiacutedo de cultivos puros de hongos endoacutefitos aislados de hojas de la especie de frailejoacuten

Espeletia hartwegiana

35

8 Anaacutelisis Filogeneacutetico

Se aislaron 35 secuencias basadas en la especie Espeletia hartwegiana fueron

comparadas posteriormente con 35 secuencias de especies publicados en GenBank

(httpblastncbinihgovblastcgi) se obtuvo un total de 70 secuencias Las secuencias de

consenso ITS 58S DNA obtenidas se usaron para realizar buacutesquedas BLAST en GenBank

usando BLASTn (Altschul et al 1990) con el fin de identificar mediante las secuencias aisladas

los geacuteneros o las especies maacutes cercanas La matriz de datos fue alineada en MAFFT v7 (Katoh y

Standley 2013) Se utilizaron las especies Coprinellus xanthothrix y Coprinellus domesticus

como grupos externos

Los anaacutelisis de las secuencias para construir los arboles filogeneacuteticos de Maacutexima

Parsimonia (MP) fueron realizados usando PAUP v40b10 (Swofford 2003) Para el anaacutelisis de

Maacutexima Verosimilitud o ML por sus siglas en ingleacutes (Maximum Likelihood) se utilizoacute

JmodelTest (Darriba et al 2012) con el cual se infirieron los criterios del modelo de sustitucioacuten

apropiado utilizando los criterios de informacioacuten de Akaike (AIC) (Akaike 1974)

Los anaacutelisis de ML se realizaron con el programa PhyML v 30 (Guindon y Gascuel

2003) teniendo en cuenta la proporcioacuten de sitios invariables Los valores de soporte de confianza

para los nodos se estimaron mediante 1000 anaacutelisis de arranque de replicacioacuten La alineacioacuten de

los datos de la secuencias de ITS para 70 aislamientos determinoacute quince geacuteneros siendo los

siguientes Annulohypoxylon Biscogniauxia Colletotrichum Crassiparies Cryptocoryneum

Cyphellophora Diaporthe Daldinia Humiacutecola Hypoxylon Hypocrea Nemania Nigrospora

Massarina y Trichoderma de los cuales se obtuvieron 11 clados principales (veacutease figura 10)

Con base en estos resultados todos los aislamientos se analizaron maacutes a fondo dentro de los

geacuteneros hasta llegar a especie (veacutease tabla 1)

36

Geacuteneros Especie Especie Especie Especie Especie Especie Especie

Annulohypoxylon A nitens A bahnphaden

gense

Biscogniauxia B petrensis

Colletotrichum C gloeosporioides

C gigasporum

Cyphellophora C

reptans

Crassiparies C quadrisporus

Cryptocoryneum C

longicondensatum

Daldinia D dennisii D

eschscholtzi

D

conceacutentri

ca

Diaporthe D

longicolla

D

foeniculina

D

anacardi

i

D

macada

miae

Humiacutecola H

fuscoatra

Hypoxylon H

trugodes

H

pulicicidum

Hypocrea H

koningii

Massarina M albocarnis

Nemania N

primolutea

Nigrospora N sacchari N rubi N sphaeric

a

N hainanen

sis

N oryzae

N gorlenko

ana

N aurantia

ca

Trichoderma T trixiae T

olivascens

T

paraviridescens

T

viridescens

T

samuelsii

T viride

Grupo Externo Coprinellus C

domesticus

C

xanthothrix

Tabla 1 Geacuteneros y especies encontrados en los aislamientos e identificaciones de hongos endoacutefitos en la

especie Espeletia hartwegiana

37

38

Figura 10 Filograma consenso obtenido con el programa MEGA ndashX a partir del anaacutelisis ML y MP del

conjunto de datos ITS Aislados de las hojas de frailejoacuten Los coacutedigos en Verde son las secuencias que se

aislaron (aislados) en este estudio los coacutedigos y nombres en Negro son las secuencias encontradas por

identidad en GenBank Los valores de soporte de bootstrapgt 70 se indican cerca de los nodos como MP

ML = valores de soporte de bootstrap lt70

El nuacutemero de caracteres los modelos de sustitucioacuten usada asiacute como otros resultados

estadiacutesticos de las pruebas de Maacutexima Parsimonia y Maacutexima Verosimilitud generados a partir de

los anaacutelisis filogeneacuteticos de los conjuntos de datos se muestran en los anexos

39

Capiacutetulo Tercero

Discusioacuten sobre los hongos endofitos encontrados y sus implicaciones

ecoloacutegicas

1 Cambio Climaacutetico y Biodiversidad de Endoacutefitos

Tanto la temperatura la estacionalidad y los tipos de precipitacioacuten son factores de vital

importancia para la composicioacuten de las diferentes comunidades y la arquitectura vegetal Estos

factores limitan muchos de los procesos ecosisteacutemicos ya que existe una estrecha relacioacuten entre

las variaciones climaacuteticas y las variaciones dentro de los ecosistemas Por lo tanto se espera que

el cambio climaacutetico transforme los ecosistemas Andinos tal como los conocemos hoy (Colwell et

al 2008) modificando las relaciones mutualistas entre plantas y hospederos

Posiblemente la resiliencia y resistencia de muchos ecosistemas como el paacuteramo sean

superadas en este siglo por una combinacioacuten sin precedentes de disturbios tales como el cambio

climaacutetico perturbaciones asociadas a este (sequiacuteas fuegos invasioacuten de especies exoacuteticas

inundaciones) y otros factores como organismos oportunistas (hongos endoacutefitos) cambios en el

uso del suelo contaminacioacuten y sobreexplotacioacuten de recursos (IPCC 2020)

Considerando que el frailejoacuten Espeletia hartwegiana es una especie de alta montantildea

(paacuteramos) endeacutemica de la cordillera Central de los Andes (Schultz y Carl 1856) se encuentra

dentro de los ecosistemas andinos en donde a su vez se ha comprobado la existencia de los

hongos endoacutefitos es de tener en cuenta el papel de estos organismos endoacutefitos ya que los

paacuteramos son ecosistemas particularmente sensibles a los efectos adversos del cambio climaacutetico

en especial al calentamiento global al estar ubicados en los troacutepicos generando asiacute ventanas de

40

oportunidades para que los hongos endoacutefitos alteren su estado mutualista y pasen a ser

patogeacutenicos (Colwell et al 2008 7)

No obstante existe consenso en que las temperaturas aumentaraacuten especiacuteficamente a

grandes alturas y que la precipitacioacuten posiblemente se incrementaraacute en algunas zonas disminuiraacute

en otras y se produciraacute en patrones estacionales alterados con mayor intensidad y frecuencia

(Marengo et al 2009)

Los frailejones se ven en constante estreacutes por el uso del suelo dado en los paacuteramos como

es el caso del paacuteramo Romerales un paacuteramo que se ha visto afectado por las quemas y la

ganaderiacutea (Molinillo y Monasterio 2001) Esto aumenta asiacute las condiciones de estreacutes intriacutensecas a

las que estaacuten expuestas estas plantas de paacuteramo las cuales suministran valiosos bienes y servicios

ecosisteacutemicos como el abastecimiento continuo de agua para usos domeacutesticos agriacutecolas e

industriales (Buytaert et al 2006 4) servicios que se podriacutean ver en decrecimiento si las

ventanas de oportunidades se abren con maacutes frecuencia dando pie al cambio de estado de los

hongos endoacutefitos que existen dentro de los frailejones de la zona

En los paacuteramos de Chingaza Rabanal Guerrero Iguaque Merchaacuten y Sumapaz se han

realizado estudios de aislamientos de hongos en especies de frailejoacuten diferentes a la especie de

frailejoacuten Espeletia hartwegiana tales como Espeletia argentea Espeletia arbelaezii Espeletia

boyacensis Espeletia grandiflora Espeletia miradorensis y Espeletia uribei por ende se ha

reportado la presencia de hongos endoacutefitos y fitopatoacutegenos (Tabla 2) (Gaitan 2018 17)

Frailejones Espeletia

argentea

Espeletia

arbelaezii

Espeletia

boyacensis

Espeletia

grandiflora

Espeletia

miradorensis

Espeletia

uribei

Aspergillus X X X X

Annulohypoxylon X X X

Curvularia X X X

Epicoccum X X X

Fusarium X X X

41

Tabla 2 Geacuteneros de hongos encontrados en otras especies de frailejoacuten X = a presencia del genero de

hongo dentro de la especie de frailejoacuten

Los geacuteneros de hongos en rojo son los geacuteneros que se encontraron en comuacuten con los

geacuteneros hallados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana de un total de 15 geacuteneros 3

han sido reportados anteriormente en estudios similares ( 20 de geacuteneros identificados)

Dentro de un marco de cambio climaacutetico es importante la metodologiacutea de muestreo

como lo fue el formato de muestreo en puntos aleatorios realizado en el presente estudio se llevoacute

acabo principalmente por la homogeneidad de los frailejones en el paacuteramo como lo indica el

manual de meacutetodos baacutesicos de muestreo y anaacutelisis de ecologiacutea vegetal (BOLFOR 2000 9) donde

se menciona que el muestreo aleatorio se utiliza cuando se dispone de poca informacioacuten previa de

las caracteriacutesticas de las poblaciones a medirse en este caso la poblacioacuten a identificarse fueron

los hongos endoacutefitos que se hallaban dentro de las formaciones homogeacuteneas de los frailejones

No obstante el muestreo aleatorio tambieacuten presenta limitaciones a la hora de comparar los

hongos endoacutefitos a lo largo del gradiente altitudinal (muestreo aleatorio estratificado) dejando de

percibir informacioacuten proveniente de los distintos microclimas que se encuentran y de las

incidencias que podriacutean causar a la hora de identificar los geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten ademaacutes de posibles micro efectos del cambio climaacutetico a lo

largo del gradiente altitudinal (Caacutemara et al 2008)

2 Identificacioacuten y Filogenia de Hongos Endoacutefitos en el Marco del Cambio Climaacutetico

Nigrospora X X X X X

Penicillium X X X

Pleospora X X X X

Trichoderma X X X X

42

Las teacutecnicas empleadas en este estudio para lograr aislar e identificar los hongos endoacutefitos

dentro de la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana se hacen importantes dentro del cambio

climaacutetico debido a que el margen de error en la identificacioacuten molecular es reducido (Bakermans

et al 2014) Al ser reducido el margen de error se pudo conocer con mayor certeza que especies

y geacuteneros de hongos endoacutefitos se encuentra dentro de la planta

Al conocer sus identidades es posible conocer las capacidades que tienen cada una de

estas especies de hongos endoacutefitos de producir metabolitos secundarios de infiltrarse y proteger

los tejidos de la planta de condiciones bioacuteticas y abioacuteticas competir contra herbiacutevoros y

fitopatoacutegenos (Schulz et al 2002) Con sus capacidades reconocidas es posible vincular los

efectos del cambio climaacutetico como estreacutes hiacutedrico aumento de la temperatura migraciones

tempranas enfermedades emergentes aumentos de la precipitacioacuten y heladas severas con las

reacciones por parte de los hongos endoacutefitos Estas reacciones podriacutean desencadenar aumentos de

la patogenicidad en las poblaciones de frailejones debido a los constantes disturbios y estreacutes al

que se ve sometido la planta generando asiacute notables declives poblacionales (Mendoza 2010)

Las relaciones filogeneacuteticas entre las especies halladas toman relevancia debido a las

sinergias positivas o negativas que se pueden presentar dependiendo de las especies que se

encuentren asociadas dentro de la planta (Lamichhane y Venturi 2015) como por ejemplo

Nigrospora y Colletotrichum pueden activar una sinergia negativa aumentando la virulencia y

afectando la especie Espeletia hartwegiana

Las especies de hongos endoacutefitos se identificaron por medio de secuencias obtenidas de

las regiones ITS (regioacuten de espaciadores internos transcritos) las cuales son regiones altamente

conservadas con tasas de evolucioacuten muy lentas en el tiempo permitiendo hacer inferencias

filogeneacuteticas (Baldwin et al 1995 Hamby y Zimmer 1992) es por ello que se usaron para

generar las diferentes identificaciones de los hongos endoacutefitos logrando asiacute identificar al geacutenero

Nigrospora con un total de 7 especies N sacchari N rubi N sphaerica N hainanensis N

gorlenkoana N oryzae y N aurantiaca pertenecientes a la familia Apiosporaceae orden

Xylariales Divisioacuten Ascomicota (veacutease figura 11) (Wang et al 2017)

Dentro del marco del cambio climaacutetico Nigrospora se caracteriza por poseer una

distribucioacuten cosmopolita y una amplia gama de hueacutespedes como lo es en este caso la especie E

hartwegiana que habita en los Andes Tropicales que se veraacuten alterados por los efectos del

cambio climaacutetico este geacutenero se ha logrado aislar en su forma endoacutefita en tallos y hojas de

43

diversas plantas tambieacuten como saprofitos en detritos hojarasca y larvas muertas (Uzor et al

2015 1)

Figura 11 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Nigrospora y Collectotrichum

Los hongos endoacutefitos hallados en esta investigacioacuten se encontraron dentro de la especie

de frailejoacuten E hartwegiana la cual pertenece a los Andes Tropicales ubicados maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos Estos ecosistemas son sensibles a los efectos del cambio

climaacutetico por su altura su alto endemismo y su sensibilidad al efecto de borde Cuando las

especies lentildeosas empiecen a migrar a lo largo del gradiente altitudinal es posible que los

frailejones se encuentren con suelos agrestes en donde sus semillas no podraacuten fijarse y los efectos

adversos de hongos como Nigrospora N oryzae y N sphaerica seraacuten maacutes notables

aprovechando las ventanas de oportunidad que generen los desbalances climaacuteticos (Sharma et al

2013)

Los cambios en los patrones climaacuteticos potenciaran la especie N sphaerica dentro del

frailejoacuten la cual tiene la capacidad de causar tizoacuten foliar en la especie Camellia sinensis siendo

una planta de teacute perteneciente a la divisioacuten de las magnolifiotas como el geacutenero Espeletia (Liu et

al 2015) Nigrospora fue el geacutenero maacutes ampliamente aislado en las identificaciones generadas a

partir de las hojas de frailejoacuten esto se veriacutea explicado debido a que N sphaerica tiene un

mecanismo de descarga de esporas efectivo que puede proyectar a la fuerza sus esporas a una

distancia de hasta 2 cm en vertical y 68 cm en horizontal como lo demostroacute Webster (1952)

ademaacutes el estudio de Wu y colaboradores (2004) tambieacuten evidencioacute que las esporas de

44

Nigrospora son uno de los grupos maacutes dominantes en la atmoacutesfera y estaacuten asociadas con

tormentas de polvo

La gran capacidad colonizadora del geacutenero Nigrospora le permite adaptarse a las

condiciones climaacuteticas cambiantes con la estrategia de dispersioacuten de sus esporas logrando

distanciarse del frailejoacuten hospedero para encontrar nuevos hospederos producto de las

migraciones tempranas a lo largo del gradiente altitudinal (Riveros 2010)

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

por encima del 80 lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen menos

mutaciones en los nodos internos del aacuterbol basados en la distribucioacuten de probabilidad asignadas

a los posibles arboles resultantes dando lugar a una hipoacutetesis evolutiva maacutes confiable (Schmidt y

Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 es decir el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes

corto (menos cambios) y el cual se ajusta mejor a los datos (Swofford 1997)

Teniendo asiacute una inferencia filogeneacuteticamente robusta los geacuteneros Collectotrichum y

Nigrospora pertenecen a la Divisioacuten Ascomycota ambos geacuteneros son particularmente agresivos

con las plantas en especial la especie Colletotrichum gloeosporioides la cual es la fase asexual

de Glomerella cingulata (Raj et al 2013) Se caracteriza por tener un amplio rango de

hospederos entre ellos el frailejoacuten a los cuales les causa una enfermedad conocida pudricioacuten

amarga antracnosis o chancros siendo esta la necrosis de frutos flores nervios y tallos

(Gonzaacutelez et al 2006 4)

Uno de los primeros reportes de afectaciones a especies de frailejoacuten se obtuvo en el 2009

en el Parque Natural Nacional Chingaza Colombia en donde encontraron las especies de

frailejoacuten Espeletia grandiflora y Espeletia uribei afectadas debido a insectos y una especie de

hongo del genero Colletotrichum (Medina 2009- 9 Hartung y Burton 1981)

Por ende que estos dos geacuteneros de hongos se encuentren juntos podriacutea tener

implicaciones en el aumento de virulencia potenciado a su vez por los desbalances abioacuteticos

causados por el cambio climaacutetico como lo han mencionado Belisario y colaboradores (2002) es

posible que las afectaciones no sean producidas por un uacutenico hongo si no por un complejo de

varios generando sinergismos entre diferentes especies que solas no hariacutean dantildeo a la planta pero

juntas podriacutean ser causantes de enfermedad (Lamichhane y Venturi 2015 4) aun mas en un

45

marco de cambio climaacutetico que gradualmente aumenta sus efectos nocivos sobre los paacuteramos

aumentando la temperatura cambios en la precipitacioacuten heladas intensas cambios en la

nubosidad mayor exposicioacuten a la radiacioacuten solar teniendo por resultado un iacutendice de estreacutes

mayor en las plantas de paacuteramo generando ventanas de oportunidades para que los hongos

endoacutefitos modifiquen sus roles de protector a patoacutegeno

En frailejones tambieacuten se ha reportado la presencia de Nigrospora y Trichoderma por

Bonilla y Argenis (2005) maacutes especiacuteficamente en la especie Espeletia grandiflora la cual es una

especie que habita en los paacuteramos de Colombia Ecuador y Venezuela en conjunto con Espeletia

hartwegiana (Luteyn 1999 3) El hecho que existan estos dos geacuteneros presentes en los frailejones

advierte de un equilibrio entre hongos endoacutefitos que se puede romper bajo las tensiones del

cambiante clima maacutes aun en los sensibles paacuteramos alto andinos

En cuanto a N sacchari se tiene reporte que es un productor de metabolitos con una

notable actividad herbicida demostrado en plantas cultivadas en invernadero (Fukushima et al

1998 2) debido a que existe evidencia que sugiere que los hongos endoacutefitos han evolucionado

directamente de hongos patoacutegenos (Schulz et al 1999 4) sumado al estreacutes del cambio climaacutetico

en cualquier momento de extrema tensioacuten hiacutedrica caloacuterica o heladas en estos ecosistemas de alta

montantildea Estos anomaliacuteas ambientales podriacutea disparar mecanismos de accioacuten fitopatoacutegenos

dentro de los frailejones generando un declive notable en sus poblaciones y por ende un declive

de la cantidad recurso hiacutedrico aguas abajo y su regulacioacuten (Diacuteaz et al 2002 5)

Como se mencionoacute anteriormente los medios de propagacioacuten de estos hongos endoacutefitos

pueden ser por medio de esporas que estaacuten en el ambiente aunque tambieacuten los vectores que

juegan un rol clave en su dispersioacuten son los insectos ya que estos pueden transportar esporas o

partes del hongo en su cuerpo patas o aparato bucal (Eigenbrode et al 2018 5)

Considerando la dispersioacuten homogeacutenea de los frailejones dentro del paacuteramo la carga

esporas en el ambiente y la herbivoriacutea de insectos es probable que se puedan ver infectados la

mayoriacutea de individuos (Varela 2016) es por ello que en el futuro puede que las afectaciones en

frailejones no sean producidas por hongos fitopatoacutegenos si no por hongos endoacutefitos que tuvieron

la ventana de oportunidad gracias al cambio climaacutetico aumento de la temperatura aumento en

las concentraciones de CO2 y alteraciones de precipitacioacuten que pueden hacer susceptible la planta

al ataque de estos hongos (Chakraborty 2011 Elad y Pertot 2014)

46

Para que se genere la enfermedad esta depende de la interaccioacuten de tres o cuatro factores

1) hospedero susceptible 2) agente causal (virulento) 3) condiciones ambientales favorables y 4)

tiempo (Francl 2001 2) la falta de alguno de ellos no permite que el patoacutegeno produzca la

enfermedad en la planta debido a ello algunas especies de frailejoacuten pueden tener una o dos cepas

que puedan actuar como fitopatoacutegenos pero no estaacuten activas si no estaacute completa su asociacioacuten

con otro patoacutegeno u otro factor

Ademaacutes existe un estudio que evaluoacute el efecto de la temperatura sobre la capacidad de

Fusarium verticillioides para generar infeccioacuten en plantas de maiacutez se probaron bajo 3 escenarios

de temperatura como resultados obtuvieron que la enfermedad de este hongo se veiacutea potenciada

por el aumento de temperatura en temperaturas por encima de 35degC (Murillo et al 2008) este

estudio da soporte a la hipoacutetesis de que existen factores que influyen significativamente a la

infeccioacuten en la planta tal vez el paacuteramo difiacutecilmente alcance 35degC no obstante la mayoriacutea de

especies son sensibles a cambios de temperatura de hasta de 1degC en donde modifican su

comportamiento rutas metaboacutelicas interacciones ecoloacutegicas y por ende sus defensas se ven

alteradas

Figura 12 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Trichoderma e Hypocrea

El geacutenero Trichoderma con seis especies diferentes (veacutease figura 12) fue el segundo

geacutenero maacutes numeroso despueacutes de Nigrospora que contoacute con siete especies aunque las primeras

especies que se analizaron fueron especies que principalmente actuaban generando enfermedades

en las plantas en las que se encontraban ante disturbios el geacutenero Trichoderma pertenece a la

47

familia Hypocreaceae y se caracteriza por tener una gran capacidad biocontroladora sobre

fitopatoacutegenos como Fusarium oxysporum los cuales podriacutean llegar masivamente con las

migraciones tempranas de insectos y plantas lentildeosas (Miles et al 2012 7)

No solo actuacutean repeliendo patoacutegenos internos si no tambieacuten patoacutegenos externos como

insectos que desean consumir u aprovechar la planta ya que estos pueden secretar diferentes

metabolitos secundarios y enzimas que actuacutean inhibiendo su desarrollo (Boughalleb-M et al

2018 8)

Es bien conocido que el geacutenero Trichoderma produce amplio rango de sustancias

antibioacuteticas ademaacutes de poseer la caracteriacutestica de parasitar otros hongos (Howell 2002 6)

Debido a la competencia que generan las especies del genero Trichoderma por espacio y

nutrientes inhiben o degradan pectinasas y otras enzimas que son esenciales para que los hongos

fitopatoacutegenos como Botrytis cinerea penetre en la superficie de las hojas logrando proteger de

esta forma al frailejoacuten que se veraacute expuesto a nuevas amenazas microbioloacutegicas auspiciadas por

los cambios en los patrones climaacutetico (Zimand et al 1996)

Ademaacutes de la capacidad del Trichoderma sp para atacar o inhibir el crecimiento de

patoacutegenos de plantas directamente descubrimientos recientes indican que tambieacuten pueden inducir

resistencia sisteacutemica y localizada a una variedad de patoacutegenos de plantas tales como el frijol es

protegido por Trichoderma harzianum de especies fitopatoacutegenas como Colletotrichum

lindemuthianum Botrytis cineacuterea las cuales producen lesiones en las hojas de la planta (Harman

y Howell 2004) Incluso se descubrioacute que ciertas especies de Trichoderma tienen una influencia

sustancial en el buen crecimiento y desarrollo de las plantas sin y con condiciones de estreacutes

climaacutetico (Lorito 1998)

Como lo demostraron Bonilla y Argenis (2005) en su estudio llevado a cabo en el

frailejoacuten Espeletia grandiflora diferentes cepas pertenecientes a Trichoderma pueden proteger

esta especie de paacuteramo de organismos fitopatoacutegenos emergentes por el cambio climaacutetico por

ende si puede proteger a E grandiflora tambieacuten puede proteger la especie E hartwegiana lo

que le permitiraacute sobrellevar diferentes ataques fortuitos de patoacutegenos e insectos que nunca han

logrado alcanzar las altitudes de paacuteramo (3200 - 5000 m)

Cuando el cambio climaacutetico aumente la temperatura en 1degC o 2degC traeraacute consigo sus

efectos de modificacioacuten en cuanto a la estructura y composicioacuten de las especies de plantas que

48

existen en zonas altas para este escenario basado en los caacutelculos de Thuiller (2007) las especies

se habriacutean desplazado en el gradiente altitudinal aproximadamente 450 metros para el antildeo 2070

Las consecuencias de este desplazamiento serian uacutenicas debido a que gran cantidad de

insectos y patoacutegenos tendriacutean migraciones tempranas en el gradiente altitudinal en buacutesqueda de

su optimo teacutermico llevando a cabo un proceso conocido como Termofilizacioacuten (Cuesta et al

2019) es ahiacute donde entra en juego la proteccioacuten que le pueden brindar especies endoacutefitos como

las que pertenecen al geacutenero Trichoderma en el marco de cambio climaacutetico

En concordancia con las cepas de Trichoderma y el geacutenero Hypocrea que tambieacuten

pertenece a la familia Hypocreaceae se conocen maacutes de 700 secuencias de peptaiboles (peacuteptidos

bioloacutegicamente activos) de ambos geacuteneros donde algunos de eacutestos son ecoloacutegica y

comercialmente relevantes debido a su potencial antimicrobiano actividad enzimaacutetica uacutetil para

competir por espacio y alimento de los nuevos patoacutegenos emergentes procedentes de las

alteraciones climaacuteticas y las migraciones tempranas (Degenkolb et al 2008 6)

En cuanto al geacutenero Hypocrea tambieacuten se ha reportado actividad antimicrobiana y anti

fuacutengica contra Staphylococcus aureus y Fusarium oxysporum (Gogoi et al 2008 2) habitando

los geacuteneros Trichoderma e Hypocrea dentro de especies de frailejoacuten como E hartwegiana se

espera que puedan generar sinergias de proteccioacuten que las ayude a combatir los fuertes y

extremos eventos climaacuteticos

Figura 13 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Annulohypoxylon

Este cladograma se encuentra soportado por valores estadiacutesticos de Maacutexima Verosimilitud

del 100 (veacutease figura 13) lo que indica que entre maacutes verosiacutemil (maacutes cercano a 100) existen

menos mutaciones en los nodos internos del aacuterbol por ende este aacuterbol contiene la menor

cantidad de mutaciones o cambios dentro sus nodos internos teniendo como resultado una

hipoacutetesis evolutiva confiable (Schmidt y Haeseler 2009) y con una parsimonia del 100 que

indica que el cladograma obtenido es el aacuterbol maacutes corto (menos cambios) y el cual se ajusta

mejor a los datos (Swofford 1997)

49

El geacutenero Annulohypoxylon es de importancia dentro del marco del cambio climaacutetico ya

que pertenece a la familia Xylariaceae y se caracteriza por poseer metabolitos secundarios

antitumorales-citotoacutexicos como la anuloescuamulina que ayudan a combatir el estreacutes abioacutetico

(Cheng et al 2012) estas cepas de hongos son principalmente saprofitos y oportunistas han sido

reportadas en hojas sanas y afectadas de frailejones en otros estudios (Gonzaacutelez 2012 Nonsoque

2012) siendo un geacutenero resiliente a las perturbaciones ambientales como los cambios en los

patrones climaacuteticos su relacioacuten como mutualista dentro del frailejoacuten se mantendraacute hasta que el

frailejoacuten se adapte o colapse ante el estreacutes abioacutetico

Aunque no se conocen como fitopatoacutegenos al contrario pueden actuar como mutualistas

no se descarta que puedan estar involucrados en el desarrollo de diferentes enfermedades en

plantas cuando las condiciones ecosistemicas se alteran a puntos extremos (Gonzalez et al 2017)

Figura 14 Cladograma de las relaciones filogeneacuteticas del genero Daldinia Hypoxylon Biscogniauxia

Nemania y Humiacutecola

El geacutenero Daldinia posee unos valores de MPML correspondientes a 10094 con lo cual

se encuentra bien soportado estadiacutesticamente el geacutenero Daldinia se encuentra ubicado en la

familia Xylariaceae al igual que el geacutenero Hypoxylon Biscogniauxia y Nemania que en su

respectivo orden contienen un soporte estadiacutestico MPML de 10082 10099 y 100100 (veacutease

figura 14) los cuales pertenecen a la divisioacuten Ascomycota las cepas de Daldinia se caracterizan

principalmente por ser especies endoacutefitas teniendo la capacidad de estar dentro de su hueacutesped

mucho tiempo sin causarle dantildeo o al menos un dantildeo evidente por medio de su estado asexual

50

No obstante su estado se puede modificar cuando las condiciones externas se modifican

abruptamente en poco tiempo como es el caso de las alteraciones en la temperatura

precipitacioacuten y concentraciones de dioacutexido de carbono (CO2) auspiciados por el cambio

climaacutetico (Saacutenchez et al 2013)

Un estudio realizado por Prieto (2017) en la especie de frailejoacuten E grandiflora encontroacute

que la especie Daldinia eschscholtzii estaba asociado en el siacutentoma de clorosis (falta de clorofila

en las hojas) Tambieacuten se reportoacute que especies de Daldinia como Daldinia conceacutentrica tienen la

capacidad de controlar nematodos fitopatoacutegenos (Silva et al 2020 104) los cuales pueden invadir

y romper los tejidos de la planta dantildeando sus estructuras los nematodos tambieacuten seraacuten sujetos a

migraciones tempranas por el cambio climaacutetico que trae consigo presiones de seleccioacuten por ende

nuevas amenazas para los frailejones (Nakashima et al 2007)

Como hemos visto hasta este punto las especies de hongos endoacutefitos se muestran en

muchos casos como benefactores y protectores de las diferentes plantas en las que habitan

incluyendo diferentes especies de frailejones

Los hongos endoacutefitos protegen tanto de factores bioacuteticos como virus hongos

fitopatoacutegenos bacterias insectos y factores abioacuteticos como las intemperancias del clima no

obstante en su relacioacuten endoacutefita geacuteneros como Hypoxylon que pertenece igual que Daldinia a la

familia Xylariaceae pueden tener roles amenazadores en conjunto con el cambio climaacutetico

seguacuten Gonzales y colaboradores (2019) inocularon cepas pertenecientes al geacutenero Hypoxylon en

hojas de Theobroma cacao y encontraron que en 48 horas se comenzoacute a notar las marcas de

clorosis y deshidratacioacuten foliar esto demuestra que cepas de este geacutenero pueden tener efectos

fitopatoacutegenos ocasionando muerte descendente pudricioacuten del tronco negro y resinosis de ramas

de mezquite (De la Torre-Almaraacutez et al 2003 De la Torre-Almaraacutez et al 2009)

La presencia de este geacutenero dentro del frailejoacuten en un marco del cambio climaacutetico lo

convierte en una amenaza latente ya que las condiciones seraacuten cada vez maacutes agrestes en los

paacuteramos de los Andes Tropicales Puede favorecer el desarrollo de este geacutenero que tiene las

enzimas necesarias para producir la pudricioacuten del tronco negro entre otras enfermedades

relevantes

51

Tambieacuten las especies del geacutenero Hypoxylon se han reportado como endoacutefitos en tejidos de

plantas lentildeosas o herbaacuteceas (Petrini y Petrini 1985 3) asiacute como saprofitos o fitopatoacutegenos

deacutebiles en madera de aacuterboles de zonas templadas o tropicales (Miller 1961) como lo menciona

Miller (1961)

Los geacuteneros Biscogniauxia Nemania tambieacuten estaacuten dentro de la familia Xylariaceae y

Divisioacuten Ascomycota un aspecto interesante de las especies de Biscogniauxia es que son

paraacutesitos exclusivos de las angiospermas dicotiledoacuteneas en donde concluyeron que todas las

especies pertenecientes a este geacutenero son patoacutegenos umllevesuml que se aprovechan de situaciones de

sequiacutea y estreacutes hiacutedrico para aumentar su patogenicidad (Ju et al 1998)

La especie de frailejoacuten E hartwegiana es una Dicotiledoacutenea eso explica porque

podemos encontrar esta especie de hongo endoacutefito en el frailejoacuten del presente estudio siendo de

vital importancia denotar que las especies de Biscogniauxia se aprovechan especialmente de las

situacioacuten de sequiacutea y estreacutes hiacutedrico difiacutecilmente las especies de este geacutenero podriacutean afectar a los

frailejones debido a que se caracterizan por ser reguladores de los ciclos hiacutedricos el agua es el

recurso que maacutes tiende a existir en un paacuteramo por la estructura de sus suelos compuesta por

andosoles porosos y necromasa acumulada teniendo asiacute un alto iacutendice de retencioacuten hiacutedrica

(Hernandez y Muntildeoz 2015) de modo que el cambio climaacutetico no favorece al geacutenero

Biscogniauxia en su estado patogeacutenico dentro del ecosistema de paacuteramo

En cuanto al geacutenero Nemania Da Silva y colaboradores (2018) llevaron a cabo una

investigacioacuten en la cual identificaron cepas pertenecientes a los geacuteneros Colletotrichum

Phyllosticta Xylaria Nemania y Alternaria en la especie ornamental Pachystachys lutea en

donde las mismas cepas fueron ensayadas para inhibir el crecimiento de hongos fitopatoacutegenos

como Colletotrichum sp en donde encontraron que Nemania era capaz de inhibir por medio de la

secrecioacuten de distintas enzimas el crecimiento de dichas especies gracias a su actividad

enzimaacutetica el geacutenero Nemania puede compensar los desequilibrios causados por el cambio

climaacutetico en teacuterminos de hongos fitopatoacutegenos

Hay que tener en cuenta que los elementos que dan forma a las interacciones planta-

endoacutefito incluyen el modo de transmisioacuten el patroacuten de infeccioacuten la edad de la planta las

condiciones ambientales potenciadas por el cambio climaacutetico y los antecedentes geneacuteticos (Aly et

al 2011 6) Los frailejones de la especie E hartwegiana que se muestrearon para el estudio se

52

tomoacute las hojas sanas lo que indica que poseiacutean estas cepas de endoacutefitos en equilibrio siendo este

uno de los pocos reportes de este geacutenero en especies de alta montantildea en los Andes Tropicales

El geacutenero Humiacutecola se encuentra soportado por un MPML de 10076 siendo una

hipoacutetesis evolutiva considerable es el uacutenico de la figura 14 que no estaacute dentro de la familia

Xylariaceae ya que pertenece a la familia Chaetomiaceae aunque se halla en la divisioacuten

Ascomycota se podriacutea considerar a la especie Humiacutecola fuscoatra como una de las especies de

endoacutefitos maacutes umlinofensivasuml debido a trabajos de investigacioacuten reportados como el de Menzies y

colaboradores (1998) y el de Naik y colaboradores (2009)

Humiacutecola fuscoatra no se considera un peligro latente para la especie E hartwegiana ya

que existe en equilibrio con su entorno Estaacute comprobado por medio de caracterizaciones

quiacutemicas que Humiacutecola fuscoatra es un importante productor de moleacuteculas de estimacioacuten

medica como el resorciacuteclico y lactonas aacutecidas (Mejia et al 2014) Por lo tanto es una especie

prometedora con un reservorio de metabolitos secundarios de importancia medicinal e industrial

que de seguir los efectos nocivos del cambio climaacutetico en los Andes Tropicales maacutes

especiacuteficamente en los paacuteramos esta especie podriacutea desaparecer

Figura 15 Cladogramas de las relaciones filogeneacuteticas del genero Diaporthe Crassiparies Massarina

Cryptocoryneum Cyphellophora y los grupos externos

Uno de los grupos mejores soportados en este cladograma es el grupo de Diaporthe en el

cual se encontraron cuatro especies siendo uno con maacutes abundancia de especies del estudio y que

posee un MPML de 10085 10089 y 10095 acorde a sus 3 nodos (veacutease figura 15) teniendo asiacute

una hipoacutetesis evolutiva confiable de estas relaciones las especies de Diaporthe pertenecen a la

familia Diaporthaceae de la divisioacuten Ascomycota y son especies de endoacutefitos que se distinguen

por inhibir el crecimiento de hongos patoacutegenos en el hospedero que se encuentren El estudio de

53

Da Silva y colaboradores (2018) mostroacute que cepas de Diaporthe sp Inhibieron el crecimiento de

Fusarium oxysporum y Colletotrichum sp hongos fitopatoacutegenos que aumentaran su presencia

aprovechando las alteraciones producidas por el cambio climaacutetico en los paacuteramos

Las especies de este geacutenero estaacuten en continuo cambio entre endoacutefitos y patoacutegenos

funcionando en la mayoriacutea de los casos en una relacioacuten mutualista en donde le brindan a la planta

mayor tolerancia a las sequias proteccioacuten de patoacutegenos y pestes caracteriacutestica uacutetil frente a los

retos ecoloacutegicos que plantea el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales (Hubbard et al 2014)

se conocen cerca de 800 especies de este geacutenero asociadas a una amplia gama de plantas

vasculares a nivel mundial (Rossman et al 2015)

Esto explica porque las especies de Diaporthe fueron una de las maacutes numerosas

encontradas en la especie de alta montantildea E hartwegiana teniendo en cuenta que esta especie

pasa raacutepidamente de un estado endoacutefito a un estado patogeacutenico y dada su faacutecil y alta distribucioacuten

representa un peligro en conjunto con el cambio climaacutetico para las especies de alta montantildea como

los frailejones y supone una amenaza para el balance hiacutedrico y ecosistemico en el futuro

El geacutenero Crassiparies de la familia Neohendersoniaceae y el geacutenero Massarina de la

familia Massarinaceae pertenecen al orden Pleosporales aunque se discute debido a las

similaridades morfoloacutegicas y genoacutemicas con Massarina si Crassiparies deberiacutea estar en la

familia Massarinaceae (Hyde et al 2013 4) Se tiene poca informacioacuten sobre la especie

Crassiparies quadrisporus por ende este puede ser uno de los primeros reportes de esta especie

en una especie de alta montantildea como lo es el frailejoacuten especiacuteficamente en la especie E

hartwegiana en un marco de cambio climaacutetico el geacutenero Crassiparies necesita mayores estudios

a nivel ecoloacutegico y microbioloacutegico para entender su papel dentro de esta crisis climaacutetica

Mientras tanto el geacutenero Massarina ha logrado ser aislado de agua dulce con el fin de

obtener fuentes de productos naturales bioloacutegicamente activos por medio de las investigaciones

quiacutemicas de Shearer (1999 2001) en una especie de Massarina obtuvieron como resultado el

aislamiento de tres nuevos sequiterpenoides y dos lactonas derivadas de policeacutetidos con nuevos

sistemas de anillos lo que indica que esta especie tambieacuten puede tener un rol importante

mediante la produccioacuten de enzimas y metabolitos secundarios en el marco de las invasiones

bioloacutegicas impulsadas por el cambio climaacutetico

54

El geacutenero Cryptocoryneum de la familia Cryptocoryneaceae existe poca informacioacuten de

sus mecanismos de accioacuten como endoacutefito o patoacutegeno maacutes aun en especies de los Andes

Tropicales este podriacutea ser uno de los primeros reportes sobre esta especie de hongo en una

especie de frailejoacuten especiacuteficamente E hartwegiana en el 2015 se reportoacute en Brasil el

descubrimiento de una nueva especie del genero Cryptocoryneum trataacutendose de Cryptocoryneum

parvulum hallada en las hojas de la especie Araucaria angustifolia (Gimnosperma) (Silva et al

2015 1) la informacioacuten sobre el geacutenero Cryptocoryneum en relacioacuten al cambio climaacutetico y sus

efectos dentro de especies de alta montantildea como el frailejoacuten auacuten son poco conocidas

Uno de los geacuteneros maacutes cercanos a los grupos externos del cladograma es Cyphellophora

perteneciente a la familia Cyphellophoraceae el cual posee un MPML de 10091 logrando una

hipoacutetesis evolutiva confiable Diversas especies de Cyphellophora han logrado ser aisladas de

infecciones superficiales de la piel o las untildeas en humanos y de materiales vegetales (Decock et

al 2003 Cheewangkoon et al 2009) Esto indica su amplia distribucioacuten y su capacidad para ser

patogeacutenica tanto en plantas como en animales maacutes aun en condiciones desfavorables para la

planta como son las condiciones de cambio climaacutetico

De la especie Cyphellophora reptans se tiene reporte que su morfologiacutea es muy similar a

la de una levadura por lo que es faacutecilmente confundida con una (Reacuteblovaacute et al 2013) Es posible

que este sea el uacutenico reporte de Cyphellophora reptans en las hojas de un frailejoacuten o especie de

alta montantildea que habite en los troacutepicos como E hartwegiana debido a ello sus mecanismos de

accioacuten en especies de paramo dentro de un marco de cambio climaacutetico es poco conocido Se

necesitan mayores estudios enfocados en esta especie para entender su ecologiacutea y dinamismo

ecoloacutegico respecto a los cambios en las variables ambientales

Se eligieron las especies Coprinellus domesticus y Coprinellus xanthothrix como grupos

externos con el fin de enraizar el aacuterbol debido a que pertenecen a la Divisioacuten Basidiomycota la

cual difiere en grado de la divisioacuten Ascomycota aunque conserva semejanzas conocidos como

caracteres ancestrales o plesiomorficos que avanzan a medida la filogenia se construye con los

datos de las diferentes secuencias de especies evidenciando novedades evolutivas conocidas

como apomorfias que cuando se dan en un grupo en particular pasan a ser sinapomorfias es decir

novedades evolutivas dentro de un grupo particular (Lehtonen 2020) Se optoacute por enraizar con

55

estas dos especies con el objetivo de dar robustez al aacuterbol filogeneacutetico (Barriel y 1998) lo cual se

consiguioacute como se nota en los estadiacutesticos del aacuterbol filogeneacutetico

56

57

Conclusiones

Se rechaza la hipoacutetesis nula (H0) y se concluye que la identificacioacuten y caracterizacioacuten

molecular de los hongos endoacutefitos encontrados en la especie de frailejoacuten Espeletia hartwegiana

ubicada en el paacuteramo romerales Quindiacuteo Colombia es diferente en 80 de sus geacuteneros y

especies de otras identificaciones de hongos endoacutefitos realizadas en especies de frailejoacuten

Por lo tanto los nuevos geacuteneros y especies de hongos endoacutefitos encontrados en el frailejoacuten

plantean nuevos desafiacuteos respecto al cambio climaacutetico ya que tienen un rol vital en la

supervivencia de estas especies de alta montantildea como los frailejones debido a su relacioacuten

mutualista o patoacutegena maacutes aun en los paacuteramos que son altamente sensibles a los efectos del

cambio climaacutetico incluso tan sensibles como las zonas polares (Bradley et al 2006)

La mayoriacutea de especies encontradas en el presente estudio tienen potencial para ayudar a

combatir el estreacutes abioacutetico producido por el cambio climaacutetico en los Andes Tropicales

Especiacuteficamente pueden ayudar a combatir el estreacutes bioacutetico producido por virus hongos

bacterias e insectos en un marco de cambio climaacutetico aumentos de temperatura cambios en la

concentracioacuten de CO2 cambios en la precipitacioacuten migraciones tempranas cambios en la

nubosidad disponibilidad hiacutedrica alteraciones en la estructura y composicioacuten de las especies

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58

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Anexos

Anexo 1 Tesista Cristhian Aristizabal junto al Frailejoacuten Espeletia hartwegiana Paacuteramo

Romerales Quindiacuteo Colombia

Anexo 2 Tesista Cristhian Aristizabal Colectando Hojas del Frailejoacuten Espeletia

hartwegiana Paacuteramo Romerales Quindiacuteo Colombia

74

Anexo 3 Coordenadas geograacuteficas tomadas de cada punto de colecta de las hojas del frailejoacuten

Espeletia hartwegiana ubicadas en el paacuteramo de romerales Quindiacuteo Colombia

Coordenadas Geograacuteficas

(Latitud)

De la Colecta del

Material Bioloacutegico total de 15

muestras (Longitud)

LAT N 4deg 37 5871717 LONG W 75deg 25

3292611

LAT N 4deg 37 5885220 LONG W 75deg 25

3271217

LAT N 4deg 37 5884485 LONG W 75deg 25

3312103

LAT N 4deg 36 5995487 LONG W 75deg 27

3045854

LAT N 4deg 37 6195784 LONG W 75deg 30

3292611

LAT N 4deg 40 159171 LONG W 75deg 26

380142

LAT N 4deg 40 363762 LONG W 75deg 26

209072

LAT N 4deg 40 399832 LONG W 75deg 27

173554

LAT N 4deg 40 383965 LONG W 75deg 27

464325

LAT N 4deg 39 486438 LONG W 75deg 27

173559

LAT N 4deg 40 56894 LONG W 75deg 26

568287

LAT N 4deg 40 159174 LONG W 75deg 27

190654

LAT N 4deg 40 125083 LONG W 75deg 26

345912

LAT N 4deg 40 116691 LONG W 75deg 27

208264

LAT N 4deg 40 314698 LONG W 75deg 27

140791

75

Anexo 4 Hoja del Frailejoacuten Espeletia hartwegiana

Anexo 5 Hifas observadas a traveacutes de un estereoscopio con el propoacutesito de seleccionar la

maacutes indicada y luego sembrar un cultivo puro a partir de ese micelio

76

Anexo 6 Backups o copias de cultivos axeacutenicos de los hongos endoacutefitos encontrados las

copias se conservaron con glicerol a -80degC en un ultra congelador de Thermo Scientifictrade

Anexo 7 Caja de laboratorio con las muestras de ADN extraiacutedas listas para ser empacadas

y enviadas

77

Anexo 8 Campana de flujo laminar umlBIOBASEuml en donde se trabajoacute con los cultivos

microbioloacutegicos de forma segura y esteacuteril propiedad de la Universidad del Quindiacuteo

Anexo 9 Muestras de ADN extraiacutedos de los Hongos endoacutefitos encontrados en las hojas de

frailejoacuten enviadas a la Universidad Ruhr de Bochum (Alemania)

78

Anexo 10 Estadiacutesticos resultantes del programa PAUP producto del aacuterbol de parsimonia

Anexo 11 Alineamiento de las secuencias ITS en el programa MEGA-X en donde se

observa en amarillo la secuencia umlTCATTAuml la cual es una secuencia altamente conservada

que se usa para marcar el inicio de la misma en hongos endoacutefitos

79

Anexo 12 Estadiacutesticos generados por el programa JmoldelTest usados para generar el

aacuterbol de relaciones filogeneacuteticas a partir de la regioacuten ITS de los hongos endoacutefitos aislados

total de modelos evaluados 88

ID Nombre Particioacuten lnL P AIC detaAIC Peso Cumpeso Udelta

1 JC 0 100820157 138 204400314 1341348 0 1 -

2 JC+I 0 98912511 139 200605022 9618188 0 1 -

3 JC+G 0 95470113 139 193720225 2733392 0 1 -

4 JC+I+G 0 95467507 140 193735014 274818 0 1 -

5 F81 0 100658095 141 204136189 13149356 0 1 -

6 F81+I 0 98761481 142 200362962 9376128 0 1 -

7 F81+G 0 95314814 142 193469628 2482794 0 1 -

8 F81+I+G 0 95324364 143 193508729 2521895 0 1 -

9 K80 10010 99734495 139 20224899 11262157 0 1 -

10 K80+I 10010 97835191 140 198470382 7483549 0 1 -

11 K80+G 10010 94227821 140 191255643 268809 0 1 -

12 K80+I+G 10010 94209963 141 191239926 253092 0 1 -

13 HKY 10010 99648091 142 202136181 11149348 0 1 -

14 HKY+I 10010 97761512 143 198383024 7396191 0 1 -

15 HKY+G 10010 94170799 143 191201599 214765 0 1 -

16 HKY+I+G 10010 94118678 144 191117357 130523 600E-04 0999 -

17 TrNef 10020 99564653 140 201929306 10942472 0 1 -

18 TrNef+I 10020 97712623 141 198245245 7258412 0 1 -

19 TrNef+G 10020 94150977 141 191121955 135121 400E-04 09994 -

20 TrNef+I+G 10020 94132131 142 191104263 117429 00011 09959 -

21 TrN 10020 99563809 143 201987618 11000784 0 1 -

22 TrN+I 10020 97702964 144 198285929 7299095 0 1 -

23 TrN+G 10020 94094235 144 191068469 81635 00065 09719 -

24 TrN+I+G 10020 94101378 145 191102757 115923 00012 09948 -

25 TPM1 12210 99713879 140 202227759 11240925 0 1 -

26 TPM1+I 12210 97826641 141 198473282 7486449 0 1 -

27 TPM1+G 12210 94249837 141 191319674 33284 0 1 -

28 TPM1+I+G 12210 942022 142 1912444 257566 0 1 -

29 TPM1uf 12210 99663473 143 202186945 11200112 0 1 -

30 TPM1uf+I 12210 97879458 144 198638917 7652083 0 1 -

31 TPM1uf+G 12210 94137349 144 191154699 167865 100E-04 09999 -

32 TPM1uf+I+G 12210 94141897 145 191183794 196961 0 1 -

80

33 TPM2 10212 99722544 140 202245087 11258254 0 1 -

34 TPM2+I 10212 97828213 141 198476426 7489592 0 1 -

35 TPM2+G 10212 94185859 141 191191718 204885 0 1 -

36 TPM2+I+G 10212 94153667 142 191147335 160501 100E-04 09998 -

37 TPM2uf 10212 99648091 143 202156182 11169348 0 1 -

38 TPM2uf+I 10212 97757018 144 198394035 7407202 0 1 -

39 TPM2uf+G 10212 941052 144 1910904 103566 00022 09904 -

40 TPM2uf+I+G 10212 9408801 145 19107602 89187 00044 0982 -

41 TPM3 12012 99768005 140 20233601 11349176 0 1 -

42 TPM3+I 12012 97958099 141 198736198 7749364 0 1 -

43 TPM3+G 12012 94227963 141 191275926 289093 0 1 -

44 TPM3+I+G 12012 94323885 142 191487769 500936 0 1 -

45 TPM3uf 12012 99625421 143 202110843 11124009 0 1 -

46 TPM3uf+I 12012 97770469 144 198420939 7434105 0 1 -

47 TPM3uf+G 12012 94165576 144 191211152 224319 0 1 -

48 TPM3uf+I+G 12012 94150861 145 191201721 214888 0 1 -

49 TIM1ef 12230 99592239 141 202004478 11017644 0 1 -

50 TIM1ef+I 12230 97822787 142 198485574 749874 0 1 -

51 TIM1ef+G 12230 94121043 142 191082087 95253 00033 09853 -

52 TIM1ef+I+G 12230 94122386 143 191104772 117939 00011 09969 -

53 TIM1 12230 99518653 144 201917306 10930473 0 1 -

54 TIM1+I 12230 9781156 145 19852312 7536286 0 1 -

55 TIM1+G 12230 94105198 145 191110396 123562 800E-04 09977 -

56 TIM1+I+G 12230 94087158 146 191094317 107483 00018 09922 -

57 TIM2ef 10232 99550617 141 201921233 109344 0 1 -

58 TIM2ef+I 10232 97704602 142 198249204 726237 0 1 -

59 TIM2ef+G 10232 94093484 142 191026968 40135 00516 0852 -

60 TIM2ef+I+G 10232 94073864 143 191007729 20895 0135 07169 -

61 TIM2 10232 99530022 144 201940044 1095321 0 1 -

62 TIM2+I 10232 97820158 145 198540315 7553482 0 1 -

63 TIM2+G 10232 94058678 145 191017356 30523 00834 08004 -

64 TIM2+I+G 10232 94060837 146 191041674 54841 00247 09248 -

65 TIM3ef 12032 99546286 141 201912572 10925739 0 1 -

66 TIM3ef+I 12032 97713931 142 198267862 7281028 0 1 -

67 TIM3ef+G 12032 94129376 142 191098753 111919 00014 09936 -

68 TIM3ef+I+G 12032 94112005 143 191084009 97176 0003 09883 -

69 TIM3 12032 99514376 144 201908751 10921918 0 1 -

70 TIM3+I 12032 97700023 145 198300047 7313213 0 1 -

71 TIM3+G 12032 94115323 145 191130646 143812 300E-04 09997 -

72 TIM3+I+G 12032 94096941 146 191113882 127048 700E-04 09984 -

73 TVMef 12314 9970418 142 20224836 11261526 0 1 -

74 TVMef+I 12314 97940598 143 198741196 7754363 0 1 -

81

Anexo 13 Estadiacutesticos generados a partir de correr los 88 modelos para los datos en el

programa jModelTest corriendo el criterio de informacioacuten AKAIKE (AIC)

75 TVMef+G 12314 94159829 143 191179657 192824 0 09999 -

76 TVMef+I+G 12314 94160993 144 191201987 215153 0 1 -

77 TVM 12314 99615991 145 202131982 11145148 0 1 -

78 TVM+I 12314 97746676 146 198413353 7426519 0 1 -

79 TVM+G 12314 94075503 146 191071005 84171 00057 09776 -

80 TVM+I+G 12314 94052588 147 191045176 58342 00208 09456 -

81 SYM 12345 99543166 143 201946331 10959498 0 1 -

82 SYM+I 12345 97757103 144 198394207 7407373 0 1 -

83 SYM+G 12345 94083056 144 191046112 59278 00198 09654 -

84 SYM+I+G 12345 94050035 145 19100007 13236 0198 05819 -

85 GTR 12345 99529525 146 20197905 10992217 0 1 -

86 GTR+I 12345 97686178 147 198312356 7325522 0 1 -

87 GTR+G 12345 94044194 147 191028387 41553 00481 09001 -

88 GTR+I+G 12345 94013417 148 190986834 0 03839 03839 -