DETECCIÓN TEMPRANA DE ORGANISMOS CAUSANTES DE LAS ENFERMEDADES DEL TRONCO DE … · 2014-08-20 ·...

1Enfermedades del tronco de la vid

DETECCIÓN TEMPRANA DE ORGANISMOSCAUSANTES DE LAS ENFERMEDADES

DEL TRONCO DE LA VID

Proyecto FPTA-237 Detección temprana de organismoscausantes de las enfermedades del tronco de la vid

Directora del Proyecto: Sandra Lupo

Equipo de Trabajo: Ing. Agr., Dr. Eduardo Abreo1

Ing. Agr., Sebastian Martínez2

Lic. Fernando Navarrete1

Dra. Lina Bettucci1

Dra. Sandra Lupo1*

1Laboratorio de Micología, Facultad de Ciencias, UDELAR.*Correo electronico: [email protected] Treinta y Tres.

2 Enfermedades del tronco de la vid

Título: DETECCIÓN TEMPRANA DE ORGANISMOS CAUSANTES DE LAS ENFERMEDADESDEL TRONCO DE LA VID

Directora de Proyecto: Sandra Lupo

Equipo de Trabajo: Ing. Agr., Dr. Eduardo Abreo1

Ing. Agr. Sebastian Martínez2

Lic. Fernando Navarrete1

Dra. Lina Bettucci1

Dra. Sandra Lupo1*

Serie: FPTA N° 44

© 2013, INIA

Editado por la Unidad de Comunicación y Transferencia del Tecnología del INIA

Andes 1365, Piso 12. Montevideo - Uruguayhttp://www.inia.org.uy

Quedan reservados todos los derechos de la presente edición. Esta publicación no se podráreproducir total o parcialmente sin expreso consentimiento del INIA.


Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria

Integración de la Junta Directiva

Ing. Agr., MSc., PhD. Álvaro Roel - Presidente

D.M.T.V., PhD. José Luis Repetto - Vicepresidente

Ing. Agr. Joaquín Mangado

Ing. Agr. Pablo Gorriti

D.M.V. Álvaro Bentancur

D.M.V., MSc. Pablo Zerbino


FONDO DE PROMOCIÓN DE TECNOLOGÍA AGROPECUARIA

El Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria (FPTA) fue instituido por elartículo 18º de la ley 16.065 (ley de creación del INIA), con el destino de financiarproyectos especiales de investigación tecnológica relativos al sector agropecuario delUruguay, no previstos en los planes del Instituto.

El FPTA se integra con la afectación preceptiva del 10% de los recursos del INIAprovenientes del financiamiento básico (adicional del 4o/oo del Impuesto a la Enaje-nación de Bienes Agropecuarios y contrapartida del Estado), con aportes voluntariosque efectúen los productores u otras instituciones, y con los fondos provenientes definanciamiento externo con tal fin.

EL FPTA es un instrumento para financiar la ejecución de proyectos de investiga-ción en forma conjunta entre INIA y otras organizaciones nacionales o internacionales,y una herramienta para coordinar las políticas tecnológicas nacionales para el agro.

Los proyectos a ser financiados por el FPTA pueden surgir de propuestaspresentadas por:

a) los productores agropecuarios, beneficiarios finales de la investigación, o por susinstituciones.

b) por instituciones nacionales o internacionales ejecutoras de la investigación, deacuerdo a temas definidos por sí o en acuerdo con INIA.

c) por consultoras privadas, organizaciones no gubernamentales o cualquier otroorganismo con capacidad para ejecutar la investigación propuesta.

En todos los casos, la Junta Directiva del INIA decide la aplicación de recursos delFPTA para financiar proyectos, de acuerdo a su potencial contribución al desarrollo delsector agropecuario nacional y del acervo científico y tecnológico relativo a lainvestigación agropecuaria.

El INIA a través de su Junta Directiva y de sus técnicos especializados en lasdiferentes áreas de investigación, asesora y facilita la presentación de proyectos a lospotenciales interesados. Las políticas y procedimientos para la presentación deproyectos son fijados periódicamente y hechos públicos a través de una amplia gamade medios de comunicación.

El FPTA es un instrumento para profundizar las vinculaciones tecnológicas coninstituciones públicas y privadas, a los efectos de llevar a cabo proyectos conjuntos.De esta manera, se busca potenciar el uso de capacidades técnicas y de infraestruc-tura instalada, lo que resulta en un mejor aprovechamiento de los recursos nacionalespara resolver problemas tecnológicos del sector agropecuario.

El Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria contribuye de esta manera ala consolidación de un sistema integrado de investigación agropecuaria para elUruguay.

A través del Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria (FPTA), INIA hafinanciado numerosos proyectos de investigación agropecuaria a distintas institucio-nes nacionales e internacionales. Muchos de estos proyectos han producido resulta-dos que se integran a las recomendaciones tecnológicas que realiza la institución porsus medios habituales.

En esta serie de publicaciones, se han seleccionado los proyectos cuyos resulta-dos se considera contribuyen al desarrollo del sector agropecuario nacional. Surelevancia, el potencial impacto de sus conclusiones y recomendaciones, y su aporteal conocimiento científico y tecnológico nacional e internacional, hacen necesaria laamplia difusión de estos resultados, objetivo al cual se pretende contribuir con estapublicación.


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CONTENIDO

INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 9

Enfermedad de Petri ............................................................................................ 9Esca ...................................................................................................................... 9Brazo muerto: botryosphaeria y eutypa die-back .......................................... 10Pie negro ............................................................................................................ 11Objetivos del proyecto ...................................................................................... 11

MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 11

Cuantificación de síntomas externos .............................................................. 11Obtención de muestras de plantas con síntomas externos ......................... 12Obtención de muestras de plantas sin síntomas externos .......................... 12Obtención de aislamientos fúngicos ............................................................... 12Identificación de las especies .......................................................................... 12Análisis de los datos ........................................................................................ 13Evaluación de métodos de extracción de ADN de madera, de cebadoresespecíficos ya existentes y diseño de nuevos cebadores ........................... 14

RESULTADOS ....................................................................................................... 15

Descripción de los síntomas en campo.......................................................... 15Incidencia de la enfermedad............................................................................. 16Aislamiento e Identificación de los hongos endófitos y asociadosa síntomas .......................................................................................................... 17Relación entre los síntomas, cultivares, regiones vitícolas y losgéneros de hongos ............................................................................................ 23

Caracterización de los síntomas según géneros ........................................... 23Caracterización de cultivares según géneros que contienen especiespatógenas ........................................................................................................... 24Caracterización de regiones según géneros de hongos que contienenespecies patógenas .......................................................................................... 24Hongos asociados a material de vivero ........................................................... 25Hongos aislados de plantines .......................................................................... 25Especificidad de cebadores ............................................................................. 27

DISCUSIÓN ............................................................................................................ 27

CONCLUSIONES GENERALES .......................................................................... 29

AGRADECIMIENTOS ............................................................................................ 29

BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................... 29


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DETECCIÓNTEMPRANA DEORGANISMOS

CAUSANTES DE LASENFERMEDADES DEL

TRONCO DE LA VID

Proyecto FPTA 237Período de Ejecución: Nov. 2006-Dic. 2008

Eduardo Abreo1

Sebastián Martínez2

Fernando Navarrete1

Lina Bettucci1

Sandra Lupo1

INTRODUCCIÓNLa reproducción de la vid por medio de

órganos vegetativos leñosos conlleva latransmisión de hongos endófitos, pató-genos débiles y patógenos en estadolatente que no son diagnosticados, nison objeto de los sistemas de certifica-ción actualmente en práctica. Sin embar-go, plantas de vid en bloques producto-res desarrollan enfermedades del troncocuyo origen de dispersión puede ser elmaterial reproductivo contaminado. En-tre ellas, se cuentan la enfermedad dePetri, esca, pie negro y brazo muerto(Mugnai et al., 1999).

Estas enfermedades atacan el viñedoen distintos momentos. Las enfermeda-des de Petri y pie negro se manifiestanen los primeros años causando la pérdi-da de vigor y la muerte de la plantamientras que el brazo muerto y la escaaparecen en el viñedo adulto, causandopodredumbres de los brazos y troncosde la planta de vid.

Enfermedad de Petri

Esta enfermedad afecta principalmen-te plantas de entre 1 y 5 años de edad.Los síntomas externos incluyen creci-miento atrofiado, marchitamiento y posi-ble muerte. No se producen síntomas enlas hojas, mientras que en la madera, seobservan puntos o estrías ennegrecidasy la producción de una goma negra quese observa en el corte transversal deltronco luego de algunos minutos. Las

plantas muestran una clásica coloraciónde los vasos del xilema que es el resulta-do de tilosis, gomas y compuestos fenó-licos formados dentro de los vasos por elhospedero como reacción al hongo cre-ciendo dentro y alrededor del xilema. Laseveridad es mayor en plantines injertadosque en estacas auto-enraizadas. Phaeomo-niella chlamydospora y Phaeoacremoniumaleophilum son los hongos más comun-mente aislados y se cree que son losprincipales agentes causales (Crous yGams, 2000; Mugnai et al., 1999). Otrasespecies de Phaeoacremonium y otrospatógenos como Cadophora luteo-oliva-cea han sido también implicadas en laenfermedad de Petri (Halleen et al., 2007,Navarrete et al., 2011). Recientemente,se ha propuesto el uso del término Phaeo-tracheomicosis para designar las distin-tas sintomatologías causadas por estegrupo de hongos (Surico, 2009).

En Uruguay, estudios preliminaressobre los organismos asociados a laenfermedad de Petri permitieron identifi-car a Pa. chlamydospora como uno delos organismos asociados al declina-miento de plantas de Vitis vinifera cv.Tannat, Cabernet Sauvignon, Merlot,Sirah, Chardonnay y Sauvignon Blanc, yde los portainjertos SO4, 3309C y 101-14de menos de 7 años de edad (Marroni yAbreo 2005).

Esca

Los organismos causales son los mis-mos que en la enfermedad de Petri, pero

1Facultad de Ciencias.2INIA Treinta y Tres .


en plantas adultas se los encuentra aso-ciados a Basidiomycetes generalmenteHymenochaetales, tales como Fomitipo-ria punctata e Inocutis jamaicensis, queproducen la pudrición blanca de texturaesponjosa típica de la esca (Fischer,2006).

Una sintomatología semejante, deno-minada hoja de malvón, fue descrita porGatica et al. (2000, 2001) en Argentina yestá asociada a Inocutis jamaicensis(Lupo et al., 2006). La esca producesíntomas foliares como vegetación redu-cida y hojas atigradas que toman unacoloración rojiza o amarilla dependiendode que los cultivares sean tintos o blan-cos respectivamente. La fisiología de loscarbohidratos se ve afectada, con reduc-ción en la acumulación de reservas, elvigor y el rendimiento, afectando final-mente la longevidad de la planta (Petit etal., 2006).

Brazo muerto: botryosphaeria yeutypa die-back

La eutipiosis o eutypa die-back escausada por el hongo Eutypa lata. Estaenfermedad puede causar la muerte departe o de la totalidad de una planta devid, produciendo reducciones significati-vas en el rendimiento del viñedo (Munkvoldet al., 1994). Este hongo también seencuentra en las plantas que sufren esca,donde actúa como pionero (Larignon yDubois, 1997) cuando penetra a través delas heridas producidas por la poda paracolonizar el tejido vascular de los cordo-nes y del tronco. Sin embargo, el miceliono se encuentra en las varas del año o elfollaje de las plantas infectadas. El pató-geno induce en la madera una necrosisen forma de ¨V¨, libera enzimas implica-das en la degradación de varios compo-nentes de la pared celular y tambiénmetabolitos que son transportados hacialas hojas. Es una enfermedad crónicaque se desarrolla muy lentamente y pre-senta síntomas altamente variables, loque hace que el diagnóstico en camposea muy difícil (Moller y Kasimatis, 1978).Los primeros síntomas externos de laenfermedad aparecen tres a diez añosdespués de la infección. Los síntomasfoliares consisten principalmente de lainhibición del crecimiento de los entrenu-dos y del desarrollo de las hojas en las

que se observan cambios en la forma,clorosis y necrosis marginal. La muertedel cordón, o de la planta entera, puedeproducirse varios años después de laaparición de los síntomas (Rudelle et al.,2005).

Después de la pérdida del ritidoma enla zona donde se produjo el cancro, elhongo produce estromas de color negroconteniendo numerosos peritecios conascosporas infecciosas (Carter, 1988).En medio de cultivo, Eutypa lata produceestructuras de reproducción asexual demanera lenta y errática y casi nunca laforma de reproducción sexual.

Eutypella vitis ha sido aislada de plan-tas con eutipiosis y su patogenicidad hasido demostrada en varas de vid (Jordany Schilder 2005) mientras que otros au-tores la consideraron poco virulenta(Úrbez-Torrez et al., 2009).

Por otra parte, las especies deBotryosphaeriaceae han sido aisladascon gran frecuencia de tejidos vegeta-les de plantas que exhiben síntomassimilares. Esta forma del brazo muertoha sido consecuentemente definida comocancro de botryosphaeria (bot. canker) otambién brazo negro muerto (black deadarm) y más recientemente botryosphae-ria die-back (Úrbez -Torres, 2011). Esconocido que especies de este grupopueden ser patógenas, saprofitas o en-dófitas de angiospermas y gimnosper-mas (Denman et al.,, 2000), siendo con-trovertida su participación como patóge-nos en el brazo muerto de la vid (Gubler2005). Los anamorphos de las especiesde Botryosphaeriaceae son actualmenteatribuidos a los géneros Fusicoccum,Neofusicoccum, Diplodia, Lasiodiplodiay Dothiorella (Crous y Palm 1999, Den-man et al., 2000, Phillips et al., 2005).Recientemente, se ha demostrado lapatogenicidad de aislamientos de todasestas especies en plantas de vid dedistintas variedades y en diferentes re-giones, aunque la virulencia varió entreespecies (Úrbez-Torres y Gubler, 2009).Estos estudios mostraron que las espe-cies de Botryosphaeriaceae son patóge-nos de la vid más importantes de lo queoriginalmente se pensaba, y que en con-sideración a las variaciones en la virulen-cia, es de fundamental importancia poderdistinguir las especies de manera de cono-cer el riesgo de ocurrencia de cancros.


Pie negro

El pie negro de la vid es una enferme-dad presente en viñedos en todas lasregiones productoras de uva del mundo.Esta enfermedad afecta plantas jóvenesy adultas. (Halleen et al., 2006a). Lossíntomas principales de la enfermedadson vasos oscurecidos e inclusiones degoma en los vasos del xilema de losportainjertos afectados. Las plantas en-fermas muestran poco vigor, troncos pe-queños, entrenudos cortos, reducción enel follaje total y tamaño de las hojas, conhojas que presentan clorosis internervaly necrosis (Scheck et al., 1998). Al co-mienzo de la primavera las plantas adul-tas, no desarrollan brotes o estos alcan-zan poco desarrollo y finalmente muerenen mitad del verano (Halleen et al., 2006a).Varias especies de Cylindrocarpon yCampylocarpon, presentes frecuente-mente en el suelo, han sido asociadas alpié negro de la vid (Halleen et al., 2004,2006b).

La manera en que los hongos causan-tes de las enfermedades del tronco de lavid contaminan el material de propaga-ción no es claro. Se especula que po-drían infectar las varas de los portainjer-tos sistémicamente a partir de plantasmadre de portainjerto infectadas o infec-tar las heridas producidas durante elproceso de vivero. El aislamiento repeti-do de Pa. chlamydospora y varias espe-cies de Phaeoacremonium de plantasjóvenes injertadas, portainjertos y tron-cos de plantas asintomáticos sugiereque estos hongos pueden existir tambiéncomo endófitos (Fourie y Halleen, 2002).Estos autores sugirieron que se debendesarrollar y validar métodos de detec-ción más sensibles con el propósito deevaluar la eficacia de las medidas deerradicación de los mismos del materialde propagación y establecer su estatusfitosanitario.

En la actualidad, el diagnóstico deestas enfermedades en Uruguay se basaen la observación de los síntomas pre-sentes en el campo varios años despuésdel inicio de la infección original y cuandootras plantas -aún asintomáticas- pue-den estar ya infectadas. La forma encu-bierta en que se encuentran estas enfer-medades impide no solamente su detec-ción sino incluso la realización de trata-

mientos preventivos. La falta de una he-rramienta de diagnóstico precoz lleva asía la aceptación de costos por pérdida deplantas, e impone restricciones a la vidaútil de los viñedos, limitando el desarrollode métodos de control.

Los métodos microbiológicos de iden-tificación consumen mucho tiempo ypueden producir falsos negativos cuandolos niveles de infección son bajos. El usode cebadores específicos fue eficientepara identificar Pa. chlamydospora a partirde micelio, en plantines, madera infecta-da y suelo (Tegli et al., 2000, Ridgway etal., 2002, Whiteman et al., 2002). Deforma similar, Aroca et al. (2008) diseña-ron cebadores específicos para aisla-mientos de Phaeoacremonium spp. enEspaña con la finalidad de detectar enforma temprana la presencia de estasespecies.

Objetivos del proyecto

Objetivo generalDisponer de métodos de diagnóstico

rápido de los principales hongos causan-tes de las enfermedades del tronco de lavid en Uruguay

Objetivos específicos1) Determinar la incidencia de las

enfermedades del tronco de la vid en elUruguay.

2) Conocer la diversidad de especiesasociadas a las enfermedades del troncode la vid en Uruguay.

3) Evaluar cebadores ya existentes y/o diseñar nuevos cebadores específicospara los hongos que son objeto de esteestudio.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cuantificación de síntomasexternos

Se realizó un relevamiento de plantasde vid con los síntomas externos antesdescriptos en todas las regiones vitíco-las del país. Se relevaron los síntomas deesca, brazo muerto y enfermedad dePetri. Los síntomas de pie negro, que


externamente pueden ser confundidoscon la enfermedad de Petri o Esca, nofueron considerados. Se contaron entre300 y 600 plantas ubicadas en filas en losdistintos viñedos y las filas fueron elegi-das al azar.

Obtención de muestras deplantas con síntomas externos

Se realizó el muestreo de plantas devid con síntomas externos de las enfer-medades del tronco de la vid en viñedoslocalizados en los departamentos deArtigas, Salto, Paysandú, Rivera, Tacua-rembó, Durazno, Colonia, San José, Ca-nelones, Montevideo y Maldonado (Figu-ra 1). El muestreo fue más intenso enaquellos departamentos donde existemayor superficie de viñedo, en particularen Canelones. En el caso de la enferme-dad de Petri, cada muestra consistió enuna sección del tronco que se extiende10 cm por arriba y por debajo de la unióndel injerto; en las plantas con esca ybrazo muerto, la muestra consistió enuna sección del tronco que contuviese lapodredumbre. En el caso del pie negro elmuestreo se circunscribió a los departa-mentos de Canelones, Montevideo, Co-lonia y Maldonado, y cada muestra con-sistió de secciones de raíces obtenidasdel suelo próximo al cuello de la planta.

Obtención de muestras deplantas sin síntomas externos

En vivero, se muestrearon varas delaño de Tannat, Moscatel de Hamburgo,Sauvignon Blanc, SO4 y Paulsen en con-diciones de ser injertadas, así como plan-tines enraizados de Tannat, Petit Verdot,Merlot, Cabernet Franc injertados en SO4y 3309C que no presentaban síntomas.

Obtención de aislamientosfúngicos

Las muestras fueron descortezadas ylavadas bajo agua corriente. Posterior-mente fueron desinfectadas superficial-mente mediante inmersión durante unminuto en alcohol 80%, 4 minutos enhipoclorito de sodio 4%, y finalmenteenjuagadas en agua estéril y secadassobre papel estéril. La muestra desinfec-tada fue abierta longitudinalmente conuna tijera previamente esterilizada porcalor, y se tomaron segmentos de xilemaennegrecido de 3 x 1 mm. Diez segmen-tos de cada muestra fueron sembradosen placas de Petri conteniendo medio decultivo PDA (Potato Dextrose Agar) aci-dificado con ácido láctico (pH 4,5). Lasplacas fueron cultivadas a 25 °C durantecuatro semanas para permitir la emer-gencia de los hongos buscados. Lossegmentos que no mostraron crecimien-to inicial fueron transferidos a otras pla-cas con el mismo medio de cultivo paraque no fuesen contaminados por hongosde rápido crecimiento.

En el material de vivero, se tomaronsegmentos de 4 cm de largo del xilema adistintas alturas desde las raíces hastael brote, que fueron desinfectados super-ficialmente (Figura 2). A partir de cadasegmento se obtuvieron 10 fragmentosde 2 x 2 mm (80 por plantín) de un total de37 plantines.

Identificación de las especies

La caracterización morfológica de lasespecies se realizó a partir de cultivos enmedio PDA. En el caso de algunos géne-ros, se llevó a cabo el cultivo en otrosmedios y en condiciones diferencialespara permitir el desarrollo de caracteresfenotípicos que pudiesen ser usados para

Figura 1. Localización de los sitios de muestreo.


la identificación de las especies. Losaislamientos de Phaeoacremonium fue-ron cultivados en placas conteniendoextracto de agar-malta al 2 % (MEA) a 25y 37 ºC. Los aislamientos de Botryos-phaeriaceae fueron cultivados en agaragua (2%) con acículas de pinos con elfin de facilitar la producción de conidios yestructuras reproductivas (Samson et al.,1995). Se observó y registró la produc-ción de pigmentos en PDA.

Extracción de ADN de cultivos purosLos aislamientos fueron cultivados

hasta que las colonias alcanzaron almenos 20 mm de diámetro. El micelio fuecolectado con bisturí estéril, y el ADN fueextraído y purificado de acuerdo al proto-colo de Lee y Taylor (1990).

Amplificación de ADN con cebadoresgenerales de hongos

El ADN de los aislamientos puros fueamplificado mediante PCR con cebado-res generales ITS4 e ITS5 que amplificanla totalidad de la región ITS (InternalTranscribed Spacer) del ADN ribosomal.En aislamientos del género Phaeoacre-monium se amplificó parte del gen quecodifica para la β-tubulina con los ceba-dores T1 y βt2b. En aislamientos delgénero Greeneria se amplificó una partede la región LSU del ADN ribosomal conlos cebadores LR0R y LR7 (Cuadro 1).

La reacción de amplificación se reali-zó en 25 µl de volumen final, en lascondiciones indicadas por los autores.Los productos de amplificación fueron

visualizados en gel de agarosa al 1 %teñido con bromuro de etidio, bajo luzultravioleta y secuenciados por Macro-gen (Seul, Corea del Sur). Se secuencia-ron las dos hebras de ADN y ambassecuencias fueron alineadas y corregi-das manualmente utilizando el programaMEGA 5 (Tamura et al., 2011). Se selec-cionaron secuencias del GenBank me-diante el algoritmo Blast (www.ncbi.nlm.gov) y se utilizaron para el análisisfilogenético de las cepas propias.

Análisis filogenéticoEl análisis filogenético por el método

de máxima parsimonia fue realizadomediante el programa PAUP4 -Phyloge-net ic Anal is is Using Parsimony(Swofford 2003). Se incluyeron secuen-cias corregidas de los aislamientos pro-pios, secuencias de las cepas tipo yotras cepas relacionadas obtenidas delGenBank cuyos códigos de identifica-ción se encuentran indicados en los ár-boles filogenéticos producidos.

Análisis de los datos

La frecuencia de aparición de las es-pecies aisladas de la madera mostrandodistintos síntomas y provenientes de dis-tintas regiones del país fue evaluadamediante un análisis de corresponden-cia.

Se contabilizó un aislamiento de cadaespecie patógena o potencialmente pa-tógena identificada por planta sintomáti-ca. Las especies se agruparon por géne-

Figura 2. Plantín descortezado yfraccionado para la ob-tención de segmentos.

Cuadro 1. Secuencia de los cebadores y tamaño esperado de los productos de amplificación

Cebadores Secuencia pb ReferenciaITS 4/ ITS 5 5’-tcctccgcttattgatatgc-3’/5’-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3’ 600 White et al., 1990

T1 / βt2b 5’-aacatgcgtgagattgtaagt-3’/5’-accctcagtgtagtgacccttggc-3’ 600 O’ Donnell y Cigelnik1997, Glass yDonalson,1995

LR0R / LR7 5’-acccgctgaacttaagc-3’/5’-tactaccaccaagatct-3’ 1300 Vilgalys y Hester 1990


ros. Se generaron matrices de la abun-dancia de los géneros en relación con lossíntomas, cultivares y regiones, del tipositio-especie. A partir de éstas, se formu-laron matrices con la densidad relativa decada género en relación al total de aisla-mientos (dr= núm. de aislamientos de ungénero/núm. total de aislamientos) apartir de las cuales se realizaron losanálisis de correspondencia. Para el orde-namiento de síntomas, cultivares y regio-nes se usó el análisis de correspondenciadel programa PAST (Hammer et al., 2001).

En la matriz géneros-cultivares, loscultivares de portainjertos de los que sedesconoce su identidad fueron agrupa-dos y considerados genéricamente en lacategoría ¨Portainjertos¨; los cultivaresde V. vinifera sub-representados en eltotal con respecto a Cabernet Sauvignon,que fue el más ampliamente muestreadoy analizado, fueron agrupados en lacategoría ¨Otros cultivares¨.

El análisis de la relación entre sínto-mas y regiones (Departamentos) se rea-lizó en base a una matriz de géneros-regiones que excluyó las regiones y gé-neros submuestreados.

El análisis de la relación entre sínto-mas externos y cultivares de V. viniferase realizó en base al registro de sínto-mas en los distintos cultivares. Debido aque el número de plantas relevado varióentre cultivares, se crearon tablas enbase 100 a partir de la cual se generó lamatriz de frecuencia relativa de síntomasexternos que se analizó mediante análi-sis de correspondencia.

Evaluación de métodos deextracción de ADN de madera,de cebadores específicos ya

existentes y diseño de nuevoscebadores

Extracción y amplificación directa apartir de material vegetal

La extracción de ADN a partir dematerial vegetal se realizó utilizando elkit Axyprep Multisource Genomic DNAde acuerdo a las instrucciones del fabri-cante (Axygen, CA, USA).

Evaluación de especificidad decebadores en ADN de cultivos puros

Se evaluó la especificidad de cebado-res disponibles para Pa. chlamydosporaPhaeoacremonium spp. e I. jamaicensisen ADN de estas especies purificado apartir de aislamientos locales, y en ADNde un conjunto de hongos que fueronencontrados en estrecha asociación enlos tejidos sintomáticos. En el caso delos cebadores Pal1N/Pal2 se llevó a caboun PCR en gradiente de temperaturadebido a que no se registró amplificacióna la temperatura de hibridación indica-das. El tamaño esperado de los produc-tos de amplificación se presenta en elcuadro 2. La especificidad de los cebado-res se evaluó en todos los aislamientosde Phaeoacremonium (37), en 13 dePhaeomoniella y en otras especies dehongos presentes en vid, N. parvum,Cadophora melinii, Greeneria uvicola,Inocutis jamaicensis, Alternaria alterna-ta, Campylocarpon pseudofasciculare,Phomopsis viticola, Phomopsis sp1. yPhomopsis sp2.

Evaluación de especificidad decebadores en ADN total de maderaenferma

Los cebadores seleccionados Pmo1f/Pmo2r para Pa. chamydospora y Pac1f/Pac2r y F2bt/R1bt para Phaeoacremo-nium spp. fueron usados para amplificarADN obtenido de la madera de plantascon síntomas de la enfermedad de Petri.Se removió la corteza de las muestras desarmientos de un año tomadas de plan-tas con síntomas externos correspon-dientes a la enfermedad. Posteriormen-te, se realizó una desinfección superfi-cial como se describió anteriormente yluego con un bisturí estéril se generaronpequeños fragmentos de xilema a partirde los cuales se obtuvo ADN usando elkit Axyprep Multisource Genomic DNAde acuerdo a las instrucciones del fabri-cante (Axygen, CA, USA). Los produc-tos de amplificación fueron visualizadosen gel de agarosa para confirmar la pre-sencia de bandas de los tamaños espe-rados. Se secuenciaron las bandas deltamaño esperado con el fin de confirmarmediante el análisis de secuencia que elproducto de PCR correspondiese a laespecie objetivo.


Cebadores Región Secuencia pb Referencia del ADN

Pal1N/Pal2 ITS 5’-aggtcgggggccaac-3’/5’-aggtgtaaactactgcgc-3’ 400 Tegli et al., 2000

Pac1f/Pac2r ITS 5’-accctttgtgaacatacctg-3’/5’-tactgcgctcggagtcctg-3’ 420 Overton et al., 2004

F2bt/R1bt β-tubulina 5´-vagcttcgacrwcctcgacg-3´/5´-gctacttacrcaytgrccggtctg-32 115 Aroca et al., 2008

Pch1/Pch2 ITS 5’-ctccaaccctttgtttatc-3’/5’-tgaaagttgatatggaccc-3’ 360 Tegli et al., 2000

Pmo1f/Pmo2r ITS 5’-gttacatgtgacgtctgaacg-3’/5’-cagtgtatgcttgattgctcg-3’ 320 Overton et al., 2004

INO1/ INO7 ITS 5’-gttcacttggtcggaggaaa -3’/5’-caaaccgacctagtcctca-3’ 111 Perez et al., 2003

Diseño de cebadoresSe diseñó un par de cebadores espe-

cíficos para Cadophora luteo-olivacea apartir de la secuencia de la región ITS.Para ello se utilizó el programa Primer3.Se le asignaron los siguientes paráme-tros: tamaño de los cebadores entre 20 y22 nucleótidos, TM 60 °C, porcentaje deGC entre 50 y 60 . El programa identificó4 pares de cebadores con esas caracte-rísticas y con cuyas secuencias se rea-lizó una búsqueda mediante el algoritmoBlast (www.ncbi.nlm.gov) en la base dedatos GenBank.Sólamente un par fueseleccionado para su posterior evalua-ción en madera.

RESULTADOS

Descripción de los síntomas encampo

En el caso de la enfermedad de Petri,las plantas sintomáticas fueron identifi-cadas en cuadros de vid recientementeimplantados, integrados por plantas jó-venes menores de 3 años mayoritaria-

mente sanas con abundante desarrollovegetativo (Figura 3 a). Entre éstas, seconstató la presencia de plantas conescaso desarrollo foliar (Figura 3 b), conpuntos oscuros en el corte transversaldel tronco, característicos de la enferme-dad de Petri (Figura 3 c).

Las plantas de vid con esca crónicase identificaron en cuadros en produc-ción. Estas plantas adultas presentabanescaso desarrollo foliar (Figura 4 a) y enel corte transversal del tronco se observóuna podredumbre con coloraciones blan-ca, amarilla y parda, de textura blanda ylímites irregulares (Figura 4 b). Las plan-tas con esca aguda (apoplejía) se identi-ficaron por el colapso del follaje y laexistencia de rebrotes tardíos en laspartes sanas del tronco (Figura 4 c). Enalgunos casos, se observó la presencia,sobre el tronco afectado, de basidiocarposproducidos por Basidiomycetes (4 d).

Las plantas con brazo muerto fueronidentificadas por la presencia de pulga-res con yemas que no brotaron (Figura 5a) que presentaron tejidos internos ne-crosados (Figura 5 b). En el corte trans-versal de los brazos y del tronco princi-

Cuadro 2. Cebadores específicos, secuencia y tamaño de los productos de amplificación esperados

Figura 3. Síntomas de enfermedad de Petri. a: planta joven sana, b: planta joven enferma,c: puntos castaños y negros que pueden exudar una sustancia gomosa negra.


Figura 4. Síntomas externos y signo de la esca. a: esca crónica, b: podredumbre blanca,c: apoplejía, d: basidiocarpo de Inocutis jamaicensis (signo) en tronco viejo devid.

Figura 5. Síntomas de brazo muerto. a: pulgar con yemas que no brotan, b: pulgar contejidos internos necrosado c: necrosis en ¨V¨ descendente

Figura 6. Síntomas de pie negro. a: retraso y fallas de brotación, b: raíces oscurecidas.

a b c

a b

pal, se observó la podredumbre sectorialde color oscuro y consistencia firme enforma de V (Figura 5 c).

Las plantas con pie negro fueron iden-tificadas por el retraso observado en labrotación de las yemas al inicio de laprimavera (Figura 6 a) y por la presenciade raíces necrosadas (Figura 6 b).

Incidencia de la enfermedad

La incidencia de Esca, Petri y brazomuerto mostró gran variación entre loscuadros relevados. Otros factores como

las características de la región y sistemade poda (poda a pulgar/poda a vara) po-drían ser los responsables de esa varia-ción (Cuadro 3).

Los cultivares que presentaron losporcentajes más altos del síntoma brazomuerto fueron Cabernet Sauvignon, Mar-selan, Cabernet Franc y Sauvignon Blanc(Cuadro 3). Estos cultivares están rela-cionados genéticamente dado que Ca-bernet Sauvignon y Marselan descien-den de Sauvignon Blanc y Cabernet Franc.

Los síntomas de Esca se encontraronen todos los cultivares analizados (Cua-


dro 3) y agrupó síntomas variables quevan desde el crecimiento reducido, muer-te de brazos y hojas coloreadas hasta lamuerte de la planta.

Caracterización de cultivares segúnsíntomas externos

El análisis de correspondencia mues-tra que el primer eje es responsable del91% de la variabilidad total, agrupandopor un lado a los cultivares CabernetFranc, Sauvignon Blanc, Cabernet Sau-vignon y Marselán, genéticamente em-parentados, y por otro a los cultivaresMerlot y Tannat (Figura 7). El segundoeje, que resume un 7,8% de la variación,establece un gradiente que separa alCabernet Franc y al Sauvignon Blanc, delCabernet Sauvignon y del Marselan.

Aislamiento e Identificación delos hongos endófitos yasociados a síntomas

Identificación morfológica yfilogenética de las especiesfitopatógenas

Se aislaron e identificaron las siguien-tes especies patógenas asociadas a lasenfermedades del tronco de la vid:Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacre-monium aleophilum, Phaeoacremoniumaustraliense, Cadophora luteo-olivacea, C.melinii, Campylocarpon pseudofascicula-re, Cylindrocarpon liriodendri, C. macrodi-dymum, C. olidum var. crassum, C. pauci-septatum, Eutypella vitis, Neofusicoccumparvum, N. luteum, Fusicoccum aesculi(B. dothidea), Diplodia seriata, Greeneriauvicola, Inocutis jamaicensis, Phomopsisviticola.

Phaeomoniella chlamydosporaSe obtuvieron 51 aislamientos de Pa.

chlamydospora provenientes de todaslas regiones muestreadas. Las coloniasemergieron tardíamente, diez a quincedías después de la siembra, e inicial-mente eran blancas volviéndose verdeoliva en los días posteriores (Figura 8 a,b). A nivel microscópico, se observaronlas células apicales hialinas sobre célu-las basales de pared engrosada, e hifascon abultamientos similares a clamidos-poras (8 c, d). Los aislamientos fueronmuy semejantes morfológicamente y tu-vieron una alta homología (99 a 100 %) enlas secuencias de la región ITS del ADNribosomal.

Phaeoacremonium spp.Se obtuvieron 33 aislamientos de

Phaeoacremonium spp.Mediante el crecimiento a 25 y a 37 °C

se establecieron distintos grupos morfo-

Cuadro 3. Porcentaje de plantas con síntomas según enfermedad y cultivar

Cabernet Cabernet Marselan Merlot Sauvignon Tannat Franc Sauvignon Blanc

Petri 1,9 1,5 0,3 2,7 0,6 4,1 Brazo muerto 4,2 7,8 15,6 0,0 9,1 0,7 Esca 0,2 0,6 0,0 0,0 0,7 0,2 Total de plantas 100 100 100 100 100 100

Figura 7. Ordenamiento de cultivares de acuerdo a la frecuenciarelativa de síntomas externos: 1 Enfermedad de Petri, 2Brazo muerto, 3 Esca.


fisiológicos que podrían indicar la exis-tencia de cepas con distintos requeri-mientos ambientales. A 25 ºC se observóque el crecimiento y la morfología de lascolonias fue similar en todos los aislamien-tos de P. aleophilum (Figura 9). A 37 ºC lascepas capaces de crecer se agruparon deacuerdo a la morfología de la colonia en (I)colonias blancas reverso amarillo a oscu-ro (V92, V327, V322, V110,V 312, V87);(II) colonias castañas con borde de creci-

miento claro, reverso castaño en el cen-tro (V154, V221); (III) colonias castañascon pigmentos difusibles castaño oscu-ro, reverso castaño oscuro (V67, V161,V197, V257, V90, V206, V207, V215)(Figura 10); otras cepas no crecieron a37 ºC. La morfología tipo (I) fue obtenidade muestras provenientes de los departa-mentos de Colonia y Rivera solamente.Las diferencias observadas en su creci-miento a 37 °C son indicativas de diferen-cias fisiológicas entre ellos.

Independientemente de las diferen-cias morfológicas observadas a 37 ºC,todos los aislamientos excepto el V95presentaron entre sí una alta identidad desecuencia de la región ITS y porcentajesde identidad de entre 100% y 99% conlas secuencias de P. angust ius(AB278178) y P. aleophilum (DQ 404355)del GenBank. Una selección de 28 aisla-mientos de Phaeoacremonium represen-tativos de todos los morfotipos, fue usa-da en un análisis filogenético basado enla secuencia parcial del gen que codificapara la β-tubulina junto a 29 secuenciasobtenidas del GenBank. Después del

Figura 8. Micromorfología y aspecto de la colonia de Phaeomoniella chlamydospora. a y b : colonia color verdeoliva de 2 y 4 semanas de crecimiento respectivamente, c: abultamiento de las hifas, d: fiálides concélulas apicales hialinas y conidios

Figura 9. Micromorfología y aspecto de la colonia de P.aleophilum en PDA a 25 °C. a: conidiogénesis yconidios, b: colonia castaña de 20 días decrecimiento.

Figura 10. Morfotipos de P. aleophilum creciendo a 37° C en medio de cultivo MEA. a: morfología del tipo I,b: morfología del tipo II, c: morfología del tipo III.


alineamiento, 274 sitios fueron parsimo-niosamente informativos, 88 fueron varia-bles y parsimoniosamente no informati-vos, y 237 fueron constantes. El árbolconsenso (50% majority rule) es presen-tado en la Figura 11 (TL = 1045; CI =0.5933; RI = 0.8365; RC = 0.4963; HI =0.4541). Veintisiete aislamientos se agru-paron con P. aleophilum (100% boots-trap) y un aislamiento se agrupó conaislamientos de P. australiense (100%bootstrap) obtenidos del GenBank, inclu-yendo las secuencias de las cepas tipode ambas especies (indicadas con *). P.aleophilum fue aislado en todas las regio-nes de Uruguay. P. australiense se aislósólamente una vez en el departamentode Colonia.

Botryosphaeriaceae spp.Se obtuvieron 90 aislamientos de

Botryosphaeriaceae. Morfológicamentese describieron e identificaron cuatroespecies de anamorfos Neofusicoccumparvum, N. luteum, Fusicoccum aesculi(B. dothidea) y Diplodia seriata. La iden-tificación morfológica (Figura 12), fue co-rroborada mediante el análisis de la se-cuencia ITS del ADN ribosomal de unaselección representativa de las distintasespecies (Figura 13). Algunos de losaislamientos fueron nombrados inicial-mente como N. parvum/ribis porque suscaracterísticas morfológicas tales comotamaño de los conidios se solapan, y elanálisis de la secuencia ITS no discrimi-na dentro de este complejo.

Figura 11. Árbol filogenético a partir de secuenciasparciales del gen de la β- tubulina deaislamientos propios de Phaeoacremoniumspp. (rojo, V) y secuencias del GenBank,

Figura 12. Conidios de las distintas especiesde Botryosphaeriaceae encontradasen vid.a: N. parvum/ribisb: B. dothideac: Diplodia seriatad: N. luteum


Figura 13. Árbol filogenético a partir de secuencias de regiónITS de aislamientos propios de Botryosphaeriaceae(V rojo) y secuencias del GenBank incluyendo ex-tipo (*).

se construyó con 57 aislamientos y tresespecies de Fusarium usadas como taxaexternos. De los 537 sitios incluyendogaps, 217 fueron parsimoniosamente in-formativos, 76 fueron variables y parsi-moniosamente no informativos y 244 fue-ron constantes. El análisis produjo 260árboles igualmente parsimoniosos conTL=794, CI=0,616, RI=0,867, HI=0,384.Se muestra el árbol consenso (50% ma-jority rule). Las especies encontradas enportainjertos en Uruguay se agrupan enseis grupos con secuencias del Gen-Bank incluyendo secuencias tipo de cadagrupo, a excepción de GU198181 y GU198182 que se agrupan con C. destruc-tans var. crassum EF607079 que no esla secuencia tipo.

Las especies identificadas fueron Ca.pseudofasciculare, C. liriodendri, C.macrodidymum, C. olidum var. crassum yC. pauciseptatum. Los aislamientos ten-tativamente identificados como Cylindro-carcapon destrutans podrían en realidadser otra especie cercana pero diferentede C. destructans var. crassum.

Phomopsis viticolaEn plantas sintomáticas se aisló P.

viticola, que produjo micelio blanco conpicnidios negros (Figura 16 a) y en loscuales sólo se observó la producción deα conidios (Figura 16 b) típicos de laespecie. A partir de material vegetal asin-tomático, principalmente en viveros, seaislaron otras especies de Phomopsis.

Greeneria uvicolaSe aisló G. uvicola asociada al sínto-

ma de brazo muerto. Las colonias inicial-mente grises formaban abundantes pic-nidios (Figura 17 a). Los conidios fueronde color castaño claro y exhibían cicatri-ces en ambos extremos (Figura 17 b). Elanálisis filogenético de las secuenciasde la región LSU de los aislamientosobtenidos en Uruguay corroboró la iden-tificación morfológica.

Cadophora luteo-olivacea y C.melinii

Los aislamientos correspondientes algénero Cadophora presentaron coloniasblancas y gris verdosas (Figura 18 a),con conidióforos ramificados con fiálides

Cylindrocarpon spp. yCampylocarpon pseudofasciculare

Los aislamientos pertenecientes a losgéneros Campylocarpon y Cylindrocar-pon presentaron características micro ymacromorfológicas muy variables en cul-tivo (Figura 14) por lo cual se construyóun árbol filogenético con la secuencia dela región ITS (Figura 15). El alineamiento


Figura 14. Aspecto de la colonia y micromorfologíade las especies de Cylindrocarpon yCampylocarpon. a: colonia, b: macroco-nidios, c: clamidosporas.

Figura 15. Árbol fi logenético a partir desecuencias de la región ITS deaislamientos de Cylindrocarpon yCampylocarpon propios ( rojo) ysecuencias del GenBank incluyendosecuencias ex-tipo (*).

y collarete visible (Figura 18 b). El análi-sis filogenético de la region ITS del ADNribosomal permitió la identificación delas especies C. luteo-olivacea y C. meli-nii.

Eutypella vitisSe encontraron sólo dos aislamientos

de esta especie asociados al síntoma debrazo muerto en el cv. Cabernet Sauvig-non. Las colonias eran inicialmente blan-cas y se oscurecieron progresivamenteformando primero manchones negros ais-lados que luego se unían cubriendo todala superficie (Figura 19 a). Se observó laproducción de α y β conidios (Figura 19b). Las secuencias obtenidas de la re-gión ITS de estos dos aislamientos fue-ron utilizadas en una búsqueda por ho-mología en la base de datos de nucleóti-dos del GenBank mediante el algoritmoBlast que permitió confirmar la identifica-ción de los aislamientos.

I. jamaicensisFue aislado de troncos con podredum-

bre blanca que caracteriza a la escacompleta y también de podredumbressectoriales en forma de V. Las coloniasde color marrón (Figura 20 a) luego devarias semanas produjeron carpóforos(Figura 20 b). Las secuencias de laregión ITS permitieron confirmar la iden-tidad de la especie.


Figura 16. a: colonia y b: conidiogénesis de P. viticola.

a b

Figura 17. a: Colonia, b: conidiogénesis de G. uvicola.

Figura 18. a: colonia; b: conidiogénesis de C. luteo-olivacea.

Figura 19. a: Colonia, b: conidiogénesis con formación de β-conidios.E. vitis.

a b

a b

a b


Figura 20. a: Colonia de I. jamaicensis de 20 días, b: colonia con formación decarpóforo.

a b

Relación entre los síntomas,cultivares, regiones vitícolas y

los géneros de hongos

Caracterización de los síntomassegún géneros

El análisis de correspondencia mues-tra que los dos ejes principales explicanrespectivamente un 73 % y un 16 % de lasdiferencias observadas entre síntomas. Elprimer eje separa claramente el síntomadel pie negro, caracterizado por la presen-

cia de Cylindrocarpon sensu lato, delbrazo muerto, esca y Petri. El segundo ejeestablece un gradiente entre estos tressíntomas, ubicando a la esca en una posi-ción intermedia entre el brazo muerto y laenfermedad de Petri (Figura 21). Dentro deese gradiente, Eutypella, Botryosphaeria eInocutis caracterizan al brazo muerto, mien-tras que P. chlamydospora, Phaeoacre-monium y C. luteo-olivacea caracterizan ala enfermedad de Petri. Greeneria, Pho-mopsis, Phoma, Acremonium caracteri-zan a la esca, que se ubica en una posiciónintermedia del gradiente.

Figura 21. Ordenamiento de síntomas de acuerdo a la frecuencia relativa de géneros.

1 Acremonium, 2 Alternaria, 3 Aureobasidium, 5 Botryosphaeria, 6Cadophora, 7 Cladosporium , 8 Crinipel l is, 9 Cylindrocarpon , 10Eupenicillium, 11 Eutypella, 12 Fusarium, 14 Gliocladium, 15 Greeneria,16 Inocutis, 17 Microphaeropsis , 18 Penicil l ium,19 Periconia , 20Pestalotiopsis, 21 Phaeoacremonium, 22 Phaeomoniella, 23 Phoma, 24Phomopsis, 25 Trichoderma, 26 Verticillium.


Caracterización de cultivares segúngéneros que contienen especiespatógenas

El cultivar Cabernet Sauvignon fueobjeto de un muestreo más intenso debi-do a que se encuentra plantado en todaslas regiones vitícolas del país y a la altafrecuencia de síntomas observados. Elprimer eje explica un 62% de la variacióny separa a los portainjertos de «otroscultivares» y del Cabernet Sauvignon (Fi-gura 22). El segundo eje explica un 37 %de la variación, casi la totalidad de lavariación restante, y separa al CabernetSauvignon de «otros cultivares».

Caracterización de regiones segúngéneros de hongos que contienenespecies patógenas

El análisis de correspondencia indicaque los dos primeros ejes explican el64% de la variación. El primer eje (36%)establece un gradiente que separa aMaldonado, Colonia y Montevideo de losdepartamentos del centro y norte delpaís (Figura 23). El segundo eje (28%),establece un segundo gradiente que se-para a Artigas, Paysandú y Durazno,ocupando Paysandú una posición inter-media.

Figura 23. Ordenamiento de los sitios demuestreo excluyendo departa-mentos y géneros submues-treados, de acuerdo a frecuen-cia relativa de géneros que con-tienen especies patógenas.

3 Botryosphaeria, 4 Cadophora, 6 Eutypella,7 Fusarium, 8 Greeneria, 9 Inocutis,10 Phaeoacremonium, 11 Phaeomoniella,13 Phomopsis

Figura 22. Ordenamiento de cultivares deacuerdo a la frecuencia relativade géneros que contienenespecies patógenas.

1 Botryosphaeria, 2 Cadophora,3 Cylindrocarpon, 4 Eupenicillium,5 Eutypella, 6 Fusarium, 7 Greeneria,8 Inocutis, 9 Phaeoacremonium,10 Phaeomoniella, 11 Phomopsis.


Hongos asociados a materialde vivero

Endófitos en varasLas especies más frecuentes aisla-

das como endófitos en varas asintomáti-cas fueron Phomopsis spp. (Figura 24)incluyendo Phomopsis viticola, varias es-pecies de Botryosphaeriaceae y Greene-ria uvicola (Cuadro 4). Las especies deBotryosphaeriaceae fueron F. aesculi (B.dothidea), N. parvum, D. seriata, N.luteum.

Cuadro 4. Número de aislamientos de las distintas especies de hongos endófitos en varas

S. Blanc Moscatel Tannat SO4 Paulsen

Acremonium sp. 3 0 0 0 0Alternaria alternata 16 1 3 4 11Botryosphaeriaceae 17 22 4 2 2Colletotrichum acutatum 1 0 0 5 12Epicoccum purpurascens 4 0 0 3 0Glomerella cingulata 0 0 1 0 0Micelio estéril 1 4 0 0 0Nigrospora sacchari 0 0 0 1 1Pestalotiopsis guepini 0 0 5 4 0Phomopsis viticola 0 11 15 5 28Phomopsis sp. 1 1 3 5 5 13Phomopsis sp. 2 6 4 0 2 6Greeneria uvicola 0 2 0 2 11Podospora sp. 0 0 0 0 1Sordaria fimicola 0 0 0 0 2

Figura 24. Phomopsis sp. a: colonias en PDA b: α conidios c: β conidios

Hongos aislados de plantines

Phaeomoniel la chlamydospora yPhaeoacremonium aleophilum, fueronaisladas en el 2,7 y 16,2 % de los plan-tines estudiados respectivamente. Pa.chlamydospora fue aislada en la partebasal del portainjerto (SO4) que presen-taba estrías negras mientras P. aleoph-ilum fue aislado de la zona de unión delinjerto tanto en el pie como en la variedad(Cuadro 5).


Cadophora luteo-olivacea fue aisladaen el 38 % de los plantines (Cuadro 5).Esta especie ha sido reportada comopatógena con una importancia secunda-r ia, respecto a Phaeomoniel la yPhaeoacremonium, pero capaz de pro-ducir necrosis de los vasos en plantines.

Varias especies de Botryosphaeria-ceae. fueron aisladas en el 51% de losplantines. Estas fueron, B. dothidea, N.parvum, N. luteum y D. seriata (Cuadro5). La mayoría de estas especies fueronlas mismas que se encontraron en cam-po en plantas con síntoma excepto N.

luteum que fue aislada solo de plantines.Otro patógeno de importancia aislado deplantines fue Cylindrocarpon spp. (8%).Este hongo causa pie negro y es elresponsable de la muerte de plantines alpoco tiempo de transplantados. Las es-pecies de Alternaria sp., Acremoniumsp., Epicoccum sp., Gliocladium roseum,Neosartorya sp. y Pseudogymnoascussp. no son consideradas patógenas. Al-gunas especies de Fusarium son impor-tantes patógenos en otras especies ve-getales, sin embargo, se desconoce suimportancia en vides en Uruguay.

Cuadro 5. Frecuencia de aislamientos de las distintas especies en plantinesasintomáticos

ESPECIES Nº plantas % de plantas

Acremonium ochraceum 1 2,7Acremonium spp. 16 43,2Alternaria spp. 23 62,2Basidiomycete con fíbulas sp.1 1 2,7Basidiomycete con fíbulas sp.2 1 2,7Botryosphaeria dothidea 6 16,2Botryosphaeria lutea 4 10,8Botryosphaeria parva/ribis 2 5,4Botrytis cinérea 1 2,7Cadophora luteo-olivacea 13 38Colletotrichum acutatum 7 18,9Colletotrichum gloeosporioides 5 13,5Cylindrocarpon liriodendri 1 2,7Cylindrocarpon macrodidymum 2 5,4Diplodia seriata 7 18,9Epicoccum purpurascens 1 2,7Fusarium spp. 6 16,2Gliocladium roseum 7 18,9Pseudoconyothyrium brasiliense 5 13,5Neosartorya sp. 3 8,1Phaeoacremonium aleophilum 6 16,2Phaeomoniella chlamydospora 1 2,7Phomoposis viticola 1 2,7Phomopsis spp. 2 5,4Pseudogymnoascus roseus 2 5,4


Especificidad de cebadores

Especificidad de cebadores en ADNde cultivos puros

Los cebadores Pac1f/Pac2r y F2bt/R1bt para P. aleophilum, Pmo1f/Pmo2rpara Pa. chlamydospora e INO1/ INO7para Inocutis jamaicensis resultaron es-pecíficos y produjeron los productos deamplificación esperados cuando fueronusados para amplificar de ADN de culti-vos puros (Cuadro 6).

PalN1/Pal2 resultó inespecífico en lascondiciones especificadas de PCR y sóloprodujo productos de amplificación a tem-peraturas de hibridación inferiores a lasindicadas por sus autores. Pch1/Pch2 re-sultó inespecífico para Pa. chlamydosporaen las condiciones especificadas de PCR.

Especificidad de cebadores en ADNtotal de madera

Pac1f/Pac2r produjo amplicones detamaños muy próximos a los esperados,pero las secuencias en algunos casos nopertenecieron al género Phaeoacremo-nium (90% de homología con secuenciade Chaetosphaeria tulasneorum

AF178547 y 89% de homología con Pho-mopsis viticola GQ250215), y por lo tantono fue seleccionado. Por su parte, Pmo1f/Pmo2r y F2bt/R1bt resultaron específi-cos, produciendo productos de amplifi-cación del tamaño esperado y cuyassecuencias pertenecieron a las especiesPa. chlamydospora y P. aleophilum, porlo que fueron seleccionados para el diag-nóstico temprano de estas especies ensarmientos provenientes de plantas devid asintomáticas.

DISCUSIÓNSe aisló e identificó la mayoría de las

especies citadas en asociación con lasenfermedades del tronco de la vid:Pa. chlamydospora, P. aleophilum, P.austaliense, F. aesculi, N. parvum / N.ribis, N. luteum, D. seriata, I. jamaicen-sis, C. luteo-olivacea, Cylindrocarponspp., Campylocarpon pseudofascicularey P. viticola.

Pa. chlamydospora, P. aleophilumson los principales responsables de laenfermedad de Petri y esca de la vid(Mugnai et al., 1999, Morton, 1999). Re-sulta notorio que excepto un aislamiento

Cuadro 6. Amplificación con cebadores específicos de Phaeoacremonium spp., Pa. chlamydospora,Inocutis jamaicensis y control (ITS4/ITS5) en ADN de cultivos puros

Especie Pac1f/Pac2r F2Bt/R1Bt Pmo1f/Pmo2r INO ITS

P. aleophilum (34 aislamientos) + + - - +P. australiense + - - - +Pa. chlamydospora (11 aislamientos) - - + - +Inocutis jamaicensis - - - + +Botryosphaeria parva - - - - +Phomopsis vitícola - - - - +Phomopsis sp. 1 - - - - +Phomopsis sp. 2 - - - - +Hymenochaetaceae - - - - +Greeneria uvicola - - - - +Altenaria alternata - - - - +Campylocarpon pseudofasciculare - - - - +Cadophora melinii - - - - +Eutypella vitis - - - - +Otras especies en ADN de madera + - - - +

(+) amplificación y (-) no amplificación.


de P. australiense, todos los otros aisla-mientos pertenecieron a la especie P.aleophilum, confirmándose la casi exclu-sividad de Pa. chlamydospora y P.aleophilum en relación a estas enferme-dades. Las diferencias morfológicas en-tre aislamientos de P. aleophilum pue-den deberse a la mayor variación genéti-ca que existe en esta especie (Mostert,2006), por lo que sería interesante anali-zar si estas diferencias se correspondencon diferencias en la patogenicidad delos distintos morfotipos. Estas especiesse asociaron principalmente a los sínto-mas de esca y Petri, en coincidencia conla opinión generalmente aceptada quelos señala como agentes causales prin-cipales de estas dolencias (Surico, 2009).Sin embargo, estas especies fueron en-contradas también asociadas al síntomade brazo muerto, por lo cual se ha suge-rido la existencia de un gradiente deespecies asociadas a un continuo desíntomas (Abreo et al., 2012)

La relevancia de Pa. chlamydospora yP. aleophilum como agentes causales delas enfermedades del tronco de la vidcondujo a la evaluación de cebadoresespecíficos que permitiesen su identifi-cación en material vegetal asintomático.El proceso de prueba de cebadores es-pecíficos es fundamental para asegurarla confiabilidad del diagnóstico tempranocuando se los aplica directamente sobreADN extraído de la madera que contieneuna mezcla de ADN. Los cebadoresPac1f/Pac2r amplificaron el ADN puro delas especies objetivo, pero también pro-dujeron un producto de amplificación deltamaño esperado que sin embargo perte-neció a especies no relacionadas que seencontraban presentes en la maderacuando se los probó directamente sobresarmientos. Su uso puede llevar a undiagnóstico equivocado y por lo tantofueron descartados. Las pruebas a quefueron sometidos los cebadores Pmo1F/Pmo2r y F2bt/R1bt permitieron asegurarla validez de los mismos.

La presencia de estas dos especiesfúngicas en sarmientos asintomáticosobtenidos en viveros comerciales pudoser detectada mediante el uso de los ce-badores seleccionados (Abreo et al., 2011).

En referencia al pie negro, es remar-cable el registro de varias especies del

grupo Cylindrocarpon sensu lato, en par-ticular de especies altamente patógenascomo C. liriodendri y C. macrodidymum(Alaniz et al., 2009) que aún no habíansido citadas en Uruguay asociadas al pienegro de la vid. Asimismo, se destaca elregistro de Ca. pseudofasciculare, quehasta el momento había sido citado sola-mente en Sudáfrica (Chaverri et al., 2011).Tal diversidad de especies, cuyos aisla-mientos provinieron de un tamaño demuestra relativamente pequeño, pareceindicar una condición favorable a su de-sarrollo en los viñedos implantados en ellitoral sur del Uruguay, zona a la que secircunscribió el muestreo de pie negro(Abreo et al., 2010). El pie negro estuvorelacionado a este género, junto a otrosgéneros que son habitantes frecuentesdel suelo, como Fusarium.

Asociadas al síntoma comúnmentedenominado brazo muerto se identifica-ron las especies F. aescul i , N.parvum/ribis, Neofusicoccum luteum/aus-trale, y Diplodia seriata. Los aislamien-tos representativos del complejo N.parvum/ribis y N. luteum/australe fueronposteriormente caracterizados medianteamplificación del gen que codifica para lasubunidad II de la ARN polimerasa yfactor de elongación. Dentro del comple-jo N. parvum/ribis se identificaron N.parvum y N. kwambonambiense. Dentrodel complejo N. luteum/australe la mayo-ría de los aislamientos pertenecieron aN. luteum mientras que N. australe fuesólo identificado en material vegetal asin-tomático proveniente de vivero (Abreo etal., 2013). Lasiodiplodia theobromae, laespecie que ha sido considerada másvirulenta en California (Úrbez-Torres yGubler 2009b), fue identificada sólo enuna muestra proveniente de Rivera (Abreoet al., 3013). Por otra parte no se pudoverificar la presencia de la especie Eu-typa lata, aunque sí se obtuvieron dosaislamientos de Eutypella vitis, especiemenos virulenta.

En el análisis de las regiones, losdepartamentos más cálidos del centro ynorte se asociaron a una mayor presen-cia de I. jamaicensis, Botryosphaeria-ceae y G. uvicola, y se separaron de losdepartamentos del sur que estuvieronprincipalmente asociados a E. vitis yFusarium spp. Coincidentemente, en cli-


ma cálidos las especies de Botryosphae-riaceae han sido consideradas dominan-tes frente a Eutypa lata y Eutypella vitisen su asociación con el brazo muerto dela vid, mientras que éstas fueron relativa-mente más frecuentes en climas fríos(Úrbez-Torres y Gubler, 2006; Catal etal., 2007).

Por su parte, Pa. chlamydospora y P.aleophilum estuvieron presentes en igualmedida en todas las regiones relevadas.

CONCLUSIONESGENERALES

Las enfermedades del tronco de la vid-enfermedad de Petri, esca y brazo muer-to- fueron diagnosticadas en viñedos entodo el territorio nacional, y su incidenciavarió según el cultivar.

Cada una de las enfermedades de laparte aérea estuvo asociada principal-mente a una o varias de las especies dehongos patógenos; sin embargo, en ge-neral estas asociaciones no fueron ex-clusivas y en realidad se verificó la exis-tencia de un gradiente de especies entrela enfermedad de Petri, esca y brazomuerto.

El pie negro de la vid estuvo asociadoa hongos del suelo como Cylindrocarponsensu lato, y se diferenció claramente delas enfermedades de las partes aéreas.Las especies identificadas en este estu-dio constituyeron los primeros reportesde estos patógenos de la vid en Uruguay,e incluyeron a C. liriodendri y C. macro-didymum - considerados como los princi-pales agentes causales de esta enferme-dad- y Ca. pseudofasciculare, una espe-cie patógena anteriormente detectadasólo en Sudáfrica.

El síntoma de brazo muerto observa-do en Uruguay se debe principalmente aespecies de Botryosphaeriaceae y no aEutypa lata. Eutypa lata no fue aislada eneste relevamiento. E. vitis fue aisladasólo de plantas del cultivar CabernetSauvignon.

Se detectó la presencia de Pa. chla-mydospora, P. aleophilum, P. viticola, yespecies de Botryosphaeriaceae comoendófitos en plantines sanos constituyenuna fuente inicial de dispersión de estospatógenos.

De las especies fúngicas menos co-nocidas, Greeneria uvicola estuvo aso-ciada a plantas con brazo muerto y esca,mientras que Cadophora luteo-olivaceaestuvo asociada a plantines con sínto-mas de la enfermedad de Petri.

Se determinó que los cebadoresPmo1f/Pmo2r y F2Bt/R1Bt son apropia-dos para ser usados en la deteccióntemprana de Pa. chlamydospora y P.aleophilum en material vegetal asintomá-tico.

AGRADECIMIENTOSLos autores agradecen a INIA por el

financiamiento de este proyecto y a FU-CREA por el acceso a los predios vitíco-las para la obtención de muestras.

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