I

Facultad de Ciencias Veterinarias

-UNCPBA-

“Evaluación del efecto de consumo de festuca tóxica sobre la calidad seminal en toros

Aberdeen Angus”

Nicanor Freije, Ernesto E. Freije, Jorge Cabodevila, Santiago Callejas

Marzo, 2019

Tandil

II

“Evaluación del efecto de consumo de festuca tóxica sobre la calidad seminal en toros Aberdeen Angus”

Tesina de la Orientación Sanidad Animal, presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Veterinario del alumno: Nicanor Freije. Tutor: Méd. Vet; Freije, Ernesto Director: Méd. Vet; Dr. Cabodevila, Jorge

Codirector: Méd. Vet; M Sc., Dr. Callejas, Santiago

Evaluador: Méd. Vet; Esp. Gabriela Cadenazzi

III

DEDICATORIA

A mis padres y mis hermanos, a María, quienes incondicionalmente

estuvieron a mi lado, sobre todo en los momentos difíciles. A mi madre

especialmente.

A mis abuelos Amaro y Marta, por ser unos segundos padres, por ser

cómplices más de una vez.

A mis abuelos Roberto y Dorita, por su cariño, su presencia y sus

llamadas de siempre.

A mi tío y padrino, Juan Pablo, por su simpleza para ver las cosas y

ser un oído cuando lo necesite.

A la Facultad de Ciencias Veterinarias de Tandil, la cual me brindó la

oportunidad de crecer, formarme y conocer personas increíbles.

A Tandil, y los amigos que me llevé, anécdotas, charlas, consejos;

gracias a todos ellos. Los tengo siempre presentes.

A los amigos de Ayacucho, por ser auténticos, por ser particularmente

únicos. Porque cada instante vivido con ellos es una locura diferente.

Al “gordo”, por enseñarme que no recordamos los días, sino los

pequeños momentos junto a las buenas personas.

IV

AGRADECIMIENTOS

A mi padre, porque además de haber sido mi tutor de residencia,

siempre lo fue en la vida.

A Alberto Areco, por brindar los animales para poder realizar el trabajo,

por su generosidad y paciencia.

A Santiago Pérez Wallace, por sus correcciones, por tenerme en

cuenta siempre, por su amistad.

A Nicolás Fiel, por las charlas, su amistad y su ayuda, sobre todo en

la residencia.

A Cesar Fiel, “el gallego”, porque además de un gran docente y amigo,

fue un consejero.

A Martin Narbaitz, por la gigante mano que me dio con el trabajo, y

sobre todo por ser un libro abierto y dejarme participar y aprender.

A Joaquín Armendano, por facilitarme material y por su ayuda

desinteresada.

A Jorge Cabodevila, director de la tesina, por tener siempre la mejor

disposición.

V

RESUMEN

En Argentina, numerosos estudios han demostrado el efecto de la festucosis en

vacas, pero son pocos los datos que se tienen sobre su impacto en el toro. La

presentación más común de la intoxicación se da durante los meses cálidos

coincidiendo con la época de entore, debido a ello se decidió realizar este trabajo

cuyo objetivo fue evaluar el efecto del consumo de festuca tóxica sobre la calidad

espermática (CE) en toros Aberdeen Angus de 2 años. Adicionalmente, se

estudió el efecto de la festucosis sobre perímetro escrotal (PE), temperatura

rectal (TR) y ganancia de peso vivo (GPV). Al día 0, se efectuó una extracción

de semen y se evaluó motilidad en masa, porcentaje de espermatozoides vivos;

morfología espermática y concentración. A partir de ese momento, a los toros se

los asignó a los grupos Ergo (n=8), el cual pastoreó durante 90 días un potrero

con festuca tóxica (grado de infestación 82%) y Control (n=2), el cual consumió

por igual período una pastura implantada, compuesta por cebadilla, pasto ovillo

y trébol blanco, compartiendo la misma fuente de agua. Las evaluaciones de

semen se repitieron cada 40 días aproximadamente, efectuándolas siempre

entre las 9 y 11 h. Luego de la tercera evaluación, a los toros del grupo Ergo se

los llevó al potrero del grupo Control. Pasados 72 días, se procedió a realizar

una última extracción de semen para comprobar, en caso de haber sido afectada

la calidad seminal, si los parámetros volvían a la normalidad. En conclusión, la

festucosis no afecta el PE ni la TR. En cambio, afecta la GDPV y la CE,

específicamente el porcentaje de anormalidades primarias, notándose su

impacto durante los meses más calurosos: diciembre, enero y febrero. Esta

afección es temporaria dado que, una vez retirados los toros de la pastura tóxica,

la CE vuelve a sus parámetros normales. Teniendo en cuenta que la época de

entore coincide con los meses donde la toxicidad de la festuca aumenta, las

evidencias preliminares de este experimento deberían corroborarse en futuros

trabajos que incluyan un número mayor de animales y la realización de estudios

hormonales que posibiliten evidenciar con certeza el efecto del hongo sobre el

animal.

Palabras claves: festucosis, calidad seminal, toros Aberdeen Angus.

VI

INDICE

1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1

2. ANTECEDENTES ........................................................................................................ 3

2.1. Termorregulación testicular................................................................................ 3

2.2. Espermatogénesis bovina .................................................................................. 5

2.3. Efectos del aumento de la temperatura testicular en la calidad del semen...... 9

3. OBJETIVOS ............................................................................................................... 12

3.1. Objetivo general ............................................................................................... 12

3.2. Objetivo secundario.......................................................................................... 12

4. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 13

4.1. Lugar y período de estudio: ............................................................................. 13

4.2. Animales: .......................................................................................................... 13

4.3. Porcentaje de infestación de la pastura........................................................... 13

4.4. Procedimiento .................................................................................................. 13

4.5. Clasificación de anormalidades ....................................................................... 14

4.6. Análisis estadístico ........................................................................................... 15

5. RESULTADOS ........................................................................................................... 16

5.1. Perímetro escrotal ............................................................................................ 16

5.2. Temperatura rectal ........................................................................................... 16

5.3. Aumento diario de peso vivo ............................................................................ 17

5.4. Calidad seminal ................................................................................................ 18

5.4.1. Motilidad en masa microscópica ......................................................... 18

5.4.2. Porcentaje de espermatozoides vivos................................................. 19

5.4.3. Morfología espermática ....................................................................... 19

5.4.3.1. Porcentaje de anormalidades primarias ............................... 19

5.4.3.2. Porcentaje de anormalidades secundarias .......................... 20

5.4.4. Concentración espermática ................................................................. 20

6. DISCUSIÓN ................................................................................................................ 26

7. CONCLUSIÓN ........................................................................................................... 27

8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 28

1

1. INTRODUCCIÓN

La cría bovina en Argentina se desarrolla mayoritariamente en campos

naturales y pasturas implantadas, siendo la festuca (Festuca arundinacea Schreb.) la

principal gramínea perenne cultivada, la cual se puede observar en pureza o

consociada con otras especies. Estimativamente, ocupa un área mayor al 30% del

total de las áreas cultivadas en Argentina, y más de un 70% en Uruguay (De Battista

et al., 1995; Milne, 2009). La difusión de este cultivo se inició en la década del ’50,

representando un recurso forrajero muy valioso para la zona ganadera en la cuenca

del Río Salado (Borrajo, 2015), estimándose la superficie implantada entre 3,5 y 4

millones de hectáreas (Bence, 2016).

La festuca puede ser infectada por el hongo endófito Epichloë coenophiala con

el cual mantiene una asociación simbiótica mutualista, siendo responsable de la

toxicidad para el ganado en pastoreo, lo que comúnmente conocemos como

“festucosis” lo cual ha significado un cambio drástico en la producción agrícola-

ganadera mundial.

La importancia agroeconómica de la infección de la festuca está relacionada

con la distribución y el uso de los pastos de alto valor forrajero que se cultivan en

Argentina. Entre los años 1986 y 1988, para la zona del norte de Buenos Aires, más

del 60 % de los lotes de semillas estaban fuera de condición para ser comercializados

y la principal limitante era la infección con el endófito (Delgado et al., 2013). Similar

difusión se ha observado en USA con un área de 15 millones de hectáreas, donde por

los problemas asociados a la presencia de festuca tóxica (FT) se han estimado

pérdidas anuales de 600 a 800 millones de dólares. En Argentina, las pérdidas están

estimadas en el equivalente a 410.000 terneros de destete de 170 kg de peso

(Campero, 1996).

Los ergoalcaloides, principalmente la ergovalina, se asocian con la festucosis,

siendo los responsables de la toxicidad en el ganado. En el bovino se han descriptos

diferentes cuadros clínicos:

- Pie de festuca: se produce durante el otoño-invierno, una vez pasadas las

dos semanas de pastoreo. Los alcaloides actúan sobre el sistema circulatorio

2

produciendo vasoconstricción periférica, dando como sintomatología

renguera y crecimiento anormal de las pezuñas (zapato chino); en casos

graves puede llegar a producirse el desprendimiento de las pezuñas.

También es común que presenten gangrena con pérdida de la cola y bordes

de las orejas. Esto se acentúa por las bajas temperaturas.

- Síndrome distérmico: este síndrome se produce en primavera y verano,

cuando la temperatura supera los 25°C y los animales se encuentran

pastoreando festuca parasitada. Los animales presentan el pelo largo, opaco

y se meten en el agua tratando de disipar el calor. Además de esta conducta

que puede ser adoptada por animales sanos, veremos otros signos que

denotan la enfermedad tales como el babeo, aumento de la frecuencia

respiratoria y fiebre. La temperatura corporal puede ascender hasta los 42°C

cuando lo normal es 38°C. Otros síntomas son la disminución de la

producción de leche que traerá aparejado menor peso de los terneros al

destete (mermas del 30 a 40 %), asoleamiento, renguera, bajo incremento de

peso y disminución de la eficiencia reproductiva, con porcentajes de preñez

con mermas de un 20 a 30%. Estos síntomas se acentúan durante los

encierres, pudiendo ocasionar la muerte de animales.

Numerosos estudios han demostrado el efecto de la festucosis en la vaca

(Porter y Thompson, 1992; Burke et al., 2001; Burns, 2012), pero son pocos

los datos que se tienen en Argentina, sobre su impacto en el toro. Teniendo

en cuenta que en nuestro país la presentación más común de la intoxicación

se da durante los meses más cálidos (diciembre, enero, febrero) coincidiendo

con la época de entore o servicio, se decidió realizar este trabajo, cuyo

objetivo fue evaluar el efecto del consumo de festuca tóxica sobre la calidad

espermática de toros Aberdeen Angus.

3

2. ANTECEDENTES

El estrés ambiental puede provocar baja calidad seminal, a

consecuencia de ello, las tasas de fertilización disminuyen y se afecta la fertilidad. Al

estar los testículos suspendidos en el escroto, la espermatogénesis es afectada al

exponerse a altas temperaturas externas, disminuyendo la calidad espermática, lo

cual también está directamente relacionado con la calidad del eyaculado (Nezhad et

al., 2013; Wechalekar et al., 2010; Rodríguez, 2007; Coubrough, 1985; Chemineau,

1993). Esta baja calidad seminal es debida principalmente a las afectaciones que

sufren las células de Sertoli por el estrés calórico; éste a su vez induce apoptosis,

estrés oxidativo en dichas células, el cual puede inducir a la infertilidad, por el daño

que ocasiona en los lípidos y proteínas de la membrana del espermatozoide, y por el

daño que provoca en el ADN del espermatozoide, lo cual se traduce a un pobre

desarrollo embrionario y abortos (Nezhad et al., 2013; Aitken y De Luliis, 2010;

Tremellen, 2008; Jung y Schuppe, 2007).

A los efectos de una mejor comprensión de los mecanismos de acción de la

festucosis en el macho, el planteo de la situación se hará según lo propuesto por

Bozlur Rahman et al., (2017) quienes consideran conveniente analizar en primera

instancia la termorregulación testicular, luego la espermatogénesis del bovino y, por

último, el efecto del aumento de la temperatura testicular sobre la calidad del semen.

2.1. Termorregulación testicular

Generalmente en los mamíferos, para una normal espermatogénesis, los

testículos requieren una temperatura de 4-5ºC más baja que la temperatura central

del cuerpo (33,4ºC). Esto se logra mediante la localización de los testículos en el

escroto, fuera de la cavidad abdominal.

En los toros, la piel del escroto es delgada, desprovista de grasa subcutánea y

bastante lampiña. La extensa vasculatura y la disposición linfática de los testículos

con los vasos sanguíneos superficiales del escroto, facilitan la eliminación de calor de

los testículos. El músculo liso de las arteriolas cutáneas del escroto, está inervado por

neuronas simpáticas. La estimulación de estas neuronas por bajas temperaturas

4

causa vasoconstricción; y, por otro lado, el calor causa una vasodilatación de las

arteriolas, disminuyendo o aumentando el suministro de sangre al escroto. Justo por

debajo de la piel del escroto, hay dos músculos importantes: la túnica dartos y el

músculo cremaster, que desempeñan un papel fundamental en la termorregulación.

La túnica dartos es una lámina delgada de músculo liso, que se encuentra bajo

el control tónico de los nervios del sistema simpático lumbar, que posiciona

rápidamente el escroto hacia el abdomen o lejos de éste, en respuesta a ambientes

fríos y cálidos, respectivamente. Debido a la característica tónica de este músculo, la

naturaleza contráctil puede mantenerse durante un período prolongado,

especialmente en ambientes fríos. La función del músculo cremaster es también llevar

los testículos cerca del abdomen tras la contracción. Sin embargo, debido a la

naturaleza estriada de este músculo, no puede sostener la contracción durante un

período prolongado.

Además de estas contracciones musculares, un rol importante en el

enfriamiento de los testículos posee el sistema vascular. La arteria testicular trae

sangre caliente del núcleo del cuerpo a los testículos. Esta arteria está íntimamente

enmarañada por una compleja red venosa, llamada plexo pampiniforme, y toda la

estructura (la red venosa y la arteria) se denomina cono vásculo-testicular. Debido a

esta vasculatura característica, los testículos poseen un sistema de circulación

sanguínea en contracorriente. Como resultado, la sangre arterial que ingresa a los

testículos se enfría en cierta medida por la sangre venosa que sale de estos.

Por otra parte, las glándulas sudoríparas también tienen un papel importante

controlando la temperatura testicular, dado que en los toros la densidad de éstas es

más alta en la piel del escroto que en las otras regiones del cuerpo. Además de la

protección de los testículos, la piel escrotal tiene un papel vital en la termorregulación

testicular. Por lo tanto, los toros que tienen un escroto normal con una circunferencia

escrotal adecuada pueden sobrellevar el estrés por calor hasta cierto punto.

5

2.2. Espermatogénesis bovina

La espermatogénesis es el proceso de desarrollo de espermatozoides a partir

de células germinales primordiales (CGP). Es un proceso continuo de diferenciación

y desarrollo y, de hecho, las CGP derivan de un pequeño subconjunto de células

embrionarias. En los mamíferos, después de alcanzar la pubertad, la

espermatogénesis se inicia principalmente a través de la influencia de la proteína

morfométrica ósea 8B. En toros, la espermatogénesis se logra a través de tres fases

distintas que consisten en espermatocitogénesis, meiosis y espermiogénesis que

duran aproximadamente 21, 23 y 17 días, respectivamente. Durante la

espermatocitogénesis, las CGP se dividen por mitosis para formar espermatogonias

de tipo A1. Ellas son las células madre. Una parte importante de esta fase es la

renovación de células madre. Algunas espermatogonias de tipo A1 vuelven a células

madre y continúan el proceso, a partir del cual pueden formarse nuevas

espermatogonias. Las otras espermatogonias de tipo A1 se dividen progresivamente

por mitosis para formar espermatogonias tipo A2, tipo A3 y tipo A4. Las

espermatogonias tipo A4 nuevamente se dividen para formar espermatogonias

intermedias (tipo Int) para luego formar espermatogonias de tipo B. Todas estas

divisiones tienen lugar en la parte basal de los túbulos seminíferos. Las

espermatogonias tipo B nuevamente se dividen por mitosis al menos una o dos veces

para formar espermatocitos primarios.

La meiosis se completa con dos pasos: meiosis I y meiosis II. Durante la meiosis

I, los espermatocitos primarios duplican su ADN y experimentan cambios nucleares

progresivos de la profase meiótica, conocida como preleptotene, leptotene, zigotene,

paquitene y diplotene, antes de dividirse para formar espermatocitos secundarios. Los

espermatocitos secundarios se someten a una segunda división meiótica para formar

células haploides, que se conocen como espermátides redondas. Las etapas

meióticas de la división celular tienen lugar en el compartimento adluminal de los

túbulos seminíferos. El proceso adicional durante el cual la espermátide se desarrolla

gradualmente en el espermatozoide se llama espermiogénesis.

Durante la espermiogénesis, los cambios que se producen son, la

condensación de la cromatina nuclear, la formación del flagelo o la cola del esperma

6

y el desarrollo del capuchón acrosomal. Esta fase también tiene lugar en el

compartimiento adluminal de los túbulos seminíferos. Las espermátides alargadas

resultantes, se mueven más cerca de la luz de los túbulos seminíferos.

Por último, las espermátides alargadas se liberan en la luz de los túbulos

seminíferos, mientras se someten a un proceso de transformación adicional conocido

como espermiación, antes de pasar al epidídimo para su maduración y

almacenamiento final. Los espermatocitos y/o las espermátidas experimentan una

remodelación extensa durante las fases meióticas y espermiogénicas del desarrollo:

inicialmente las histonas nucleoproteínicas se reemplazan por proteínas de transición

y finalmente, por protaminas. Las protaminas están involucradas en el

empaquetamiento de la cromatina espermática de tal manera que el genoma paterno

permanece funcionalmente inerte y protegido, y se logra una reducción notable en el

volumen nuclear.

Aunque los espermatozoides adquieren madurez durante el tránsito epididimal,

no alcanzan la capacidad de fertilización completa. Para alcanzar la capacidad

máxima de fertilización, los espermatozoides deben viajar y residir en el tracto

reproductivo femenino durante un período mínimo. Durante su estancia en el tracto

reproductivo femenino, los espermatozoides experimentan algunos cambios

bioquímicos que se conocen como capacitación. Esto incluye la eliminación de una

gran parte de las proteínas de recubrimiento extracelular que previenen la adhesión

durante el tránsito de los espermatozoides en el útero.

El proceso de fertilización implica una serie de interacciones específicas entre

los espermatozoides y los ovocitos. En primer lugar, en el oviducto, el patrón de

movilidad de los espermatozoides se vuelve hiperactivo, lo que se considera que

facilita la interacción espermatozoide-ovocito. En segundo lugar, algunas proteínas

específicas de la membrana plasmática que recubren el acrosoma están expuestas y

se unen a la zona pelúcida del ovocito. La unión de la zona probablemente inicia una

reacción acrosómica. La reacción acrosómica permite la liberación de una variedad

de enzimas, principalmente acrosina y hialuronidasa, que hidrolizan las proteínas de

la zona. Posteriormente, la fuerza mecánica generada por la acción flagelar de la cola,

empuja al espermatozoide hacia el espacio perivitelino del ovocito. Luego, el

7

espermatozoide entra en contacto directo con la membrana plasmática del ovocito. En

el momento del contacto directo, las proteínas de la superficie de los espermatozoides,

particularmente Izumo, localizadas en el segmento ecuatorial de la cabeza del

espermatozoide, están involucradas en la adhesión y fusión con la membrana

plasmática del ovocito. La fusión de espermatozoides y oocitos conduce a la

despolarización del oolema, que desencadena la liberación de gránulos corticales

localizados debajo de la superficie del ovocito y da como resultado el bloqueo de la

polispermia. Poco después de la fusión de la membrana, el núcleo del esperma

comienza a descondensarse, lo cual es necesario para preparar los cromosomas

paternos para que se emparejen con los cromosomas maternos. La descondensación

del núcleo del esperma comienza a través de la reducción de los enlaces disulfuro

entre las protaminas por un agente reductor primario, el glutatión. Después de la

descondensación del material nuclear, los pronúcleos paterno y materno se alinean

para formar un zigoto. Sin embargo, todos los eventos que incluyen la unión a la zona

y la penetración son altamente dependientes de la membrana plasmática intacta, el

acrosoma, las mitocondrias y el material nuclear de alta calidad de un espermatozoide.

Son varias las causas que podrían producir una espermatogénesis anormal

(IRAC, 1998). La mayoría de ellas pueden ser relacionadas con las elevadas

temperaturas o con el estrés. El aumento de 0,5 a 1ºC de temperatura en los testículos

de un toro, por algunos días, es suficiente para causar un desorden notorio en la

espermatogénesis. Aparentemente el mecanismo de daño por temperatura ocurre a

través de la hipoxia testicular. Debido a la peculiar anatomía del abastecimiento de

sangre a los testículos, el tejido testicular opera normalmente en un punto muy

cercano a la hipoxia. Al elevar la temperatura testicular aumenta la actividad

metabólica, para activar los mecanismos de pérdida de calor, hay vasodilatación y no

hay un aumento correspondiente en el abastecimiento de oxígeno, por lo tanto, el

tejido se encuentra en hipoxia.

Las funciones normales del epidídimo y del epitelio seminífero dependen de

niveles muy altos de testosterona. Hay evidencias de que las altas temperaturas

provocan una disminución de la liberación de LH, lo que resulta en niveles más bajos

de testosterona disponible para las células germinales en crecimiento, lo cual es

8

agravado por la hipoxia. Por ejemplo, las células de Sertoli, concentran testosterona

por medio de la producción de la proteína fijadora de andrógenos. Un mal

funcionamiento de las células de Sertoli o de las células de Leydig también puede

determinar una insuficiencia de testosterona.

El estrés en general, afecta la función testicular a través del mecanismo

endócrino descripto, induciendo la producción excesiva de cortisol, que a su vez

reduce la secreción de LH por la pituitaria y esto produce una disminución en la

producción de testosterona por las células de Leydig; además del efecto directo de la

adrenalina sobre el flujo sanguíneo.

Algunas células como las de Sertoli y las espermatogonias son más sensibles

y se degeneran, dejando espacios vacíos en el estrato germinal que luego se traduce

en una producción reducida de espermatozoides. Las espermátides también son

sensibles y forman espermatozoides anormales por efecto del estrés. Por ejemplo, el

resultado de una alteración en la espermatogénesis puede producir una mala

condensación de la cromatina nuclear, formación de vacuolas, cabezas de formas

anormales, mala disposición de las mitocondrias en la parte central, o falta de

adherencia entre las fibras de la cola del espermatozoide.

El resultado de severas alteraciones en la espermatogénesis es la

degeneración y descamación de estratos celulares al lumen del túbulo, quedando en

el epitelio germinal solo las células de Sertoli y las espermatogonias. Los túbulos

vacíos pierden turgencia y por esta razón los testículos que han sufrido una

degeneración se vuelven más blandos y más chicos. Después que desaparece el

daño, las espermatogonias repueblan los túbulos, los testículos vuelven a su tamaño

y consistencia normales y se produce semen de calidad y concentración normales.

Generalmente, cuando hay una alteración en la espermatogénesis, no todos

los túbulos son afectados en el mismo grado. Dentro de una sección histológica,

algunos túbulos podrían ser completamente normales y otros presentar daños

celulares. Por lo tanto, las muestras de semen tienen proporciones variadas de células

normales y anormales.

9

2.3. Efectos del aumento de la temperatura testicular en la calidad del semen

En general, los testículos operan al borde de la hipoxia. El aumento de la

temperatura aumenta el metabolismo testicular, con una mayor necesidad de oxígeno

para mantener el metabolismo aeróbico. Sin embargo, el flujo sanguíneo testicular

aumenta muy poco en respuesta al aumento de la temperatura testicular y, en

consecuencia, los testículos se vuelven más hipóxicos. Como resultado, algunos

estudios anteriores muestran claramente los cambios en la calidad del esperma.

Casady et al. (1953) expusieron dos toros Bos taurus (Guernsey) a 37ºC con

81% de humedad relativa durante 12 h por día, durante 17 días consecutivos. Se

descubrió que los eyaculados contienen 30-40% de espermatozoides

morfológicamente anormales (en su mayoría colas en espiral y cabezas desprendidas)

con una disminución profunda en el recuento total de espermatozoides, la

concentración y la motilidad.

En otro estudio, toros Bos taurus (Frisones) y Bos indicus (Afrikáner) se

expusieron a una temperatura ambiente de 40ºC con una humedad relativa del 35-45%

durante tan solo 12 h. A pesar que la exposición al estrés por calor en los toros fue

corta, se observó una disminución significativa en la motilidad y en el porcentaje de

espermatozoides vivos de ambas razas junto con un aumento significativo en el

porcentaje de espermatozoides morfológicamente anormales. Además, los toros Bos

taurus se encontraron más susceptibles al estrés por calor en comparación con los

toros Bos indicus.

Del mismo modo, Johnston et al. (1963) informaron que los toros mestizos (Bos

indicus x Bos taurus) expuestos a la alta temperatura ambiente eran comparativamente

menos susceptibles al estrés por calor en términos de calidad del semen y se

recuperaban más rápidamente que los toros Holstein.

Desde entonces, varios estudios han investigado las influencias estacionales en

la calidad del semen en diferentes razas de toros. Mathevon et al. (1998) realizaron un

estudio detallado para evaluar la influencia estacional en la calidad del semen en 198

toros Holstein durante las temporadas de verano e invierno y observaron que la

temporada de verano afectó significativamente todos los parámetros de calidad del

10

semen. Además, se investigó la influencia estacional sobre la calidad del semen en 6

toros Bos taurus (3 Limousine y 3 Simmental) y 5 toros Bos indicus (Nelore) donde los

toros Bos taurus se encontraron más susceptibles al calor en términos de producir un

gran número de cabezas anormales seguidas por gotas citoplásmicas durante todo el

período de estudio.

En otro estudio, Balic et al. (2012) investigaron la influencia estacional en 19

toros Bos taurus (Simmental): observaron que el estrés térmico del verano disminuyó

la calidad del semen y pudieron relacionar este hallazgo con la presencia de una alta

peroxidación lipídica (determinada por sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico).

Además, los autores observaron que el semen obtenido de toros jóvenes durante la

temporada de verano se asoció con un daño proteico oxidativo más intensivo. A nivel

celular, el estrés por calor ejerce sus efectos adversos al desplegar y agregar

directamente las proteínas. El estrés térmico induce la activación de factores de

transcripción de choque térmico (HSF), principalmente HSF1, que permite la

producción de proteínas de choque térmico (HSP) para reducir los efectos perjudiciales

de la carga de calor. Si el estrés por calor continúa, la producción de HSP se altera y

se producen cambios alterando el estado fisiológico junto con una mayor producción

de especies reactivas de oxígeno (ROS). Las especies de oxígeno reactivo son

pequeñas moléculas basadas en oxígeno que son altamente reactivas debido a los

electrones desapareados. Los ROS más destacados son el anión superóxido (O2-), el

peróxido de hidrógeno (H2O2) y el ion hidroxilo (OH-). Fisiológicamente, se requiere una

cierta cantidad de ROS para la regulación de varias vías de transducción de señales

transmembrana en células somáticas y para la capacitación y la reacción acrosómica

en los espermatozoides. Por el contrario, las altas concentraciones de ROS reducen la

motilidad y la viabilidad de los espermatozoides, que culminan en una pobre unión a la

zona pelúcida. Por lo tanto, es evidente que el aumento de la temperatura tiene un

efecto adverso sobre la calidad del semen, que podría estar relacionado con el

aumento de la producción de ROS. El fracaso en lograr este delicado equilibrio de ROS

en el plasma seminal puede dar como resultado una fertilidad comprometida.

Estudios realizados por Rutledge (2001), sugirieron que el efecto del estrés

sobre la calidad de los espermatozoides, puede mejorarse con la puesta en marcha de

11

la tecnología de la congelación seminal; sin embargo, el útero de las hembras, pueden

representar estrés térmico para los espermatozoides.

Wang et al. (2009) postula que los alcaloides ergóticos ejercen sus efectos

tóxicos a través de receptores de membrana, sugiriendo que lo harían por la vía de los

receptores alfa adrenérgicos, causando disminución en el porcentaje de

espermatozoides mótiles. Por otra parte, Schuenemann et al. (2005) realizaron un

trabajo para comprobar el efecto de la ergotamina (ET) sobre los parámetros

seminales, perfil endocrinológico, y la capacidad de desarrollo de ovocitos fecundados

in vitro con semen de toros alimentados con ET.

En su trabajo experimental utilizó dieciséis toros de un año para investigar la

administración de tartrato de ET y sus efectos en los parámetros del semen.

Los toros fueron asignados a una dieta de maíz agrietado, ensilaje de maíz y

harina de soja para el grupo control y una dieta suplementada diariamente con 40

mg/kg de tartrato de ET para el grupo restante.

Se midió diariamente circunferencia escrotal, recolectándose los datos de

temperatura rectal cada 14 días. Las muestras de semen se obtuvieron cada 60 días

y se evaluó la motilidad y la morfología. Las temperaturas escrotales se obtuvieron por

termografía inmediatamente antes de la electroeyaculación.

El semen de un subconjunto de toros de cada tratamiento también se evaluó

para la fertilización in vitro.

La administración de ET aumentó la temperatura rectal y resultó en

temperaturas escrotales más bajas en comparación con los toros control. Sin embargo,

la prolactina, la circunferencia escrotal, la testosterona, la motilidad y la morfología del

semen no difirieron entre los grupos durante todo el período experimental (224 días).

Las tasas de división de embriones derivados de la fertilización in vitro con semen de

toros, alimentados con ET, se redujeron en comparación con el grupo control; sin

embargo, los embriones desarrollados hasta blastocisto no difirieron entre los

tratamientos. En conclusión, la exposición prolongada de toros a ET pareció reducir el

potencial de fertilización de los espermatozoides.

12

Se observó un aumento general de la temperatura rectal en toros ET (39,4 ±

0,06 º C) en comparación con toros del grupo control (39,0 ± 0,04 º C), lo que indica

que los toros se vieron afectados por la administración de ET para simular toxicosis por

festuca. Por otra parte, las temperaturas rectales se elevaron en el momento de la

recolección de semen en los toros con ET en comparación con el grupo control. Los

toros que recibieron ET (70,8 ± 7,8 ng/ml) tuvieron concentraciones plasmáticas

similares de prolactina en comparación con los toros control (65,9 ± 7,8 ng /ml).

En cuanto a la respuesta testicular, ni el crecimiento diario promedio en la

circunferencia escrotal (0,034 ± 0,002 cm/día) ni las concentraciones de testosterona

(8,38 ± 1,1 ng/ml) se vieron afectados por la administración de ET.

Además, la ET no comprometió la motilidad de los espermatozoides. La

evaluación morfológica del semen indicó que la exposición prolongada a ET no alteró

el porcentaje de espermatozoides normales o el porcentaje de anomalías primarias y

secundarias. La motilidad de los espermatozoides medida en el momento de la

recolección del semen no difirió entre los toros que recibieron ET y los del grupo control.

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo general: Evaluar el efecto del consumo de festuca tóxica sobre la calidad

espermática (CE) en toros Aberdeen Angus de dos años de edad.

3.2. Objetivo secundario: Evaluar el efecto del consumo de festuca toxica sobre

circunferencia escrotal, temperatura y peso en toros Aberdeen Angus de dos años de

edad.

13

4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1. Lugar y período de estudio: El ensayo se realizó en un establecimiento, ubicado

en cercanías de Coronel Vidal, partido de Mar Chiquita, provincia de Buenos Aires, en

el período comprendido entre diciembre de 2016 y mayo de 2017.

4.2. Animales: Para realizar el trabajo se utilizaron 10 toros de dos años, raza

Aberdeen Angus, que se encontraban pastoreando una pastura compuesta por

cebadilla, pasto ovillo y trébol blanco.

4.3. Porcentaje de infestación de la pastura

Se determinó la presencia del hongo endófito E. coenophiala asexual siguiendo

la metodología descripta por Bacon y White (1994), a partir de muestras de macollos

de festuca de diferentes sitios al azar del potrero. De cada sitio se retiraron 3 macollos

(uno adelante, otro a la izquierda y otro a la derecha de la persona que realizaba el

muestreo), conformando esto una muestra. Una vez en el laboratorio, se obtuvo tejido

a partir de vainas basales externas (entre la base del tallo y el primer nódulo) de los

macollos con una hoja de bisturí. Brevemente se cortó el tallo longitudinalmente y se

extrajo material del sector medular, mediante un suave raspaje. El material fue

colocado en un portaobjeto, extendido y teñido con la solución de azul de anilina (100

ml de ácido láctico, 1 g de azul de metileno o anilina, 100 ml de glicerina y 500 ml de

agua destilada) y luego observadas mediante microscopio óptico (Casaro, 1986). De

esta manera se determinó el porcentaje de infestación de las pasturas.

4.4. Procedimiento

Al día 0, en el horario comprendido entre las 9 y 11 h, a los reproductores se

les efectuó determinación de peso, temperatura corporal y circunferencia escrotal.

Simultáneamente, se efectuó extracción de semen mediante electroeyaculación

(Electrojack 5) procediendo a evaluar motilidad masal e individual, porcentaje de

espermatozoides vivos, morfología y concentración espermática. A tal fin, se utilizó un

microscopio óptico con contraste de fase (Nikon Eclipse E200).

La motilidad en masa se evaluó a 4X a partir de una gota de semen puro,

colocada sobre un portaobjetos, utilizando una escala creciente de 0 a 5. La motilidad

14

individual se evaluó a 10x a partir de una dilución 1/20 de semen en solución

fisiológica. La concentración se determinó mediante espectrofotometría

(Spermacue, Minitub). Por último, se efectuó un frotis que fue coloreado con

eosina nigrosina para establecer la relación espermatozoides vivos/muertos y evaluar

la morfología espermática a 100X, utilizando aceite de inmersión. Las anormalidades

morfológicas se clasificaron en primarias o secundarias según Barth (2007).

A partir de ese momento se conformaron 2 grupos: Ergo (n=8) y Control (n=2).

A los animales del primer grupo, se los alojó durante un período de 90 días en un

potrero donde pastoreaban festuca tóxica con un grado de infestación del 82%, según

evaluación del INTA Balcarce, mediante la técnica descripta por Bacon y White

(1994). Los animales del otro grupo permanecieron por igual período en un potrero

contiguo, compartiendo la misma fuente de agua y consumiendo una pastura

implantada, compuesta por cebadilla, pasto ovillo y trébol blanco.

Las determinaciones y extracciones de semen efectuadas al día 0, se repitieron

cada 40 días aproximadamente. Inmediatamente de efectuada la 3ra extracción, los

toros del grupo Ergo fueron trasladados al potrero donde se encontraban los

animales del grupo Control. Transcurridos 72 días se procedió a realizar una última

extracción con el objetivo de evaluar, en caso de verse afectada la calidad seminal, si

los parámetros volvían a los valores iniciales.

4.5. Clasificación de anormalidades

Se efectuó según Barth (2000), quién caracteriza a los espermatozoides

morfológicamente anormales según la porción de la célula afectada y/o el origen del

daño. Las anormalidades según este criterio se clasifican en primarias y secundarias.

Se consideran anormalidades primarias, aquellas que ocurren o tienen su origen

durante la espermiogénesis dentro del testículo, mientras que las anormalidades

secundarias, se originan dentro del epidídimo o en el laboratorio.

15

Anormalidad Clasificación

Acrosoma Nudoso Primaria Cabeza Angosta Primaria Cabezas Piriformes Primaria Microcefalia Primaria Vacuolas Nucleares Primaria Formas Teratoides Primaria Gota Citoplasmática Proximal Primaria Defecto de Dag Primaria Cabezas Sueltas Secundaria Espermatozoides Decapitados Secundaria Gota Citoplasmática Distal Secundaria Pieza Medio Distal Doblada Secundaria Cola Enrollada Secundaria Cola Corta Secundaria Colas Abaxiales Secundaria Colas Accesorias Secundaria Colas Múltiples Secundaria Espermatozoides de cola corta Secundaria

4.6. Análisis estadístico

Las diferentes variables fueron analizadas empleando modelos lineales mixtos

(Proc. GLIMMIX, SAS Institute Inc., Cary, NC, EEUU). Se incluyó al grupo, el día y su

interacción como efectos fijos y al animal como efecto aleatorio. Se asumió una

estructura de correlación autorregresiva continua de primer orden entre las

observaciones realizadas en un mismo animal. Las comparaciones múltiples post

hoc fueron ajustadas, cuando fue necesario, empleando el método HSD de Tukey-

Kramer. Los valores se expresan como media de mínimos cuadrados ± error estándar

(media ± EE).

Las estructuras de correlación fueron seleccionadas de acuerdo con el criterio

de selección de Akaike. La homocedasticidad y simetría de los residuales fueron

corroborados mediante métodos gráficos, modelándose la heterogeneidad de

varianza cuando fue necesario.

16

5. RESULTADOS

5.1. Perímetro escrotal

Como se puede apreciar en la Figura 5.1, no se observó interacción ni

diferencias significativas entre los grupos. Sólo se vio una diferencia significativa entre

los días de medición (efecto día), aunque son pequeñas, manteniéndose dentro de

los parámetros normales.

Figura 5.1: Evolución del perímetro escrotal (cm) en los grupos Ergo y Control.

5.2. Temperatura rectal

Como se puede apreciar en la Figura 5.2, en la temperatura (TR) no se observó

una interacción significativa, pero sí un efecto del día, con la TR más elevada los días

77 y 130, aunque manteniéndose dentro de los rangos normales y sin diferencias entre

grupos.

17

Figura 5.2: Resultados de los controles de temperatura rectal (ºC) en los grupos Ergo y

Control.

5.3. Aumento diario de peso vivo

Como se puede apreciar en la Figura 5.3, la ganancia global de todo el

experimento fue significativamente menor en el grupo consumiendo festuca tóxica. Si

bien no se observó una interacción significativa (P<0,05), se registró una diferencia

numérica muy acentuada entre grupos en la ganancia de peso del primer período

(Diciembre-Febrero).

Figura 5.3: Resultados de la evolución de peso vivo (Kg/día) en los grupos Ergo y

Control.

18

En la Tabla 1, se presenta una síntesis de los valores registrados en lo que

respecta a perímetro escrotal, temperatura y peso corporal a lo largo del experimento.

Tabla 1. Resultados promedio de perímetro escrotal, temperatura corporal y peso corporal del

Grupo Ergo vs Grupo Control.

Grupo

27-12-16 02-02-17 14-03-17 06-05-17

P.E. T.C. P.C P.E. T.C. P.C P.E. T.C. P.C P.E. T.C. P.C

Ergo

37,0 38,6 451,8 37,4 39,1 452 37,9 39,5 466,4 38,8 39,6 480,8

Rango 32,0

41,0

37,6

40,1

408

496

33,5

41

38,7

39,5

410

500

35,5

41,5

39,2

39,5

424

492

36,0

43,0

39,2

39,9

437

504

Control

35,0 38,6 398 35,7 38,5 404,5 36,7 39,6 421,5 38,0 39,7 439,5

Rango 34,0

36,0

38,0

39,2

396

400

35,0

36,5

38,3

38,7

401

408

34

36

39,4

39,9

418

425

34

36

39,6

39,9

436

443

Referencias: P.E.: Perímetro escrotal; T.C.: Temperatura corporal y P.C.: Peso corporal

5.4. Calidad seminal

5.4.1. Motilidad en masa microscópica

Como se puede apreciar en la Figura 5.4.1, no se observaron interacción ni

diferencias significativas entre grupos y días.

Figura 5.4.1: Resultados de la evaluación de la motilidad en masa microscópica (Score 0-

5) en los grupos Ergo y Control.

19

5.4.2. Porcentaje de espermatozoides vivos

Como se puede apreciar en la Figura 5.4.2, no se observó interacción ni

diferencias significativas entre grupos y días.

Figura 5.4.2: Resultados de la evaluación de espermatozoides vivos (%) en los grupos

Ergo y Control.

5.4.3. Morfología espermática

5.4.3.1. Porcentaje de anormalidades primarias

Se observó interacción grupo x día. Al día 77 se registró un porcentaje

significativamente mayor de anormalidades primarias en el grupo Ergo. Estas

diferencias no fueron observadas en los restantes días de medición (Figura 5.4.3.1).

Figura 5.4.3.1: Presencia de anormalidades primarias (%) en los grupos Ergo y Control a

lo largo del experimento.

20

5.4.3.2. Porcentaje de anormalidades secundarias

Como se puede apreciar en la Figura 5.4.3.2, no se observó interacción ni

diferencias significativas entre grupos. Si se registró una diferencia significativa entre

los días de medición.

Figura 5.4.3.2: Presencia de anormalidades secundarias (%) en los grupos Ergo y Control

a lo largo del experimento.

5.4.4. Concentración espermática

Como se puede apreciar en la Figura 5.4.4, no se observó interacción ni diferencias

significativas entre grupos y días.

Figura 5.4.4.: Resultados de la evaluación de la concentración espermática (EZ/mL)

en los grupos Ergo y Control a lo largo del experimento.

21

En la Tabla 2 se detalla el tipo de anormalidad promedio de cada muestreo, y

el promedio total de anormalidades, reflejando las diferencias significativas.

Tabla 2: Promedio ( ) de anormalidades espermáticas del Grupo Ergo vs Grupo

Control a lo largo de todo el ensayo.

Anomalía

Fecha de Evaluación

Diciembre Febrero Marzo Mayo

Ergo Control Ergo Control Ergo Control Ergo Control

Acrosoma nudoso 0,49 0 0 0 0,76 0 0,19 0

Cabeza angosta 0,18 0,4 1,14 0 6,64 0 1,43 0

Cabeza piriforme 1,24 0,4 0,71 1,09 3,76 0,4 1,06 1,15

Microcefalia 0,1 1,18 0 0 0,35 0 0 0,38

Vacuolas

nucleares

0,58 1,17 0,6 4,68 0,78 2,18 0 0,38

Formas teratoides 0,37 0,4 0,24 0 0,54 1,05 0,1 1,53

Gota

citoplasmática

proximal

1,43 4,28 2,57 1,86 2,09 0,69 1,06 1,91

Defecto Dag 0 0 0,45 0 0 0 0 0

Cabezas sueltas 2,29 1,57 1,7 0,38 2,96 0,35 1,43 0

Espermatozoide

decapitado

0,84 1,17 0 0,36 1,07 0,35 0,57 0,38

Gota

citoplasmática

distal

0 0 1,39 0 0 0 0 0

Pieza medio distal

doblada

10,01 5,88 16,93 8,89 11,99 10,72 6,16 3,44

Cola enrollada 0,19 0 0,22 0,38 0,15 0,35 0,28 0,38

Cola corta 0 0 0 0 0,05 0 0 0

Colas abaxiales 0,1 0 0 0 0 0 0 0,38

Colas accesorias 0 0 0,09 0 0,13 0,35 0,09 0

Colas múltiples 0 0 0,28 0 0,15 0 0,1 0

Espermatozoides

de cola corta

0 0 0 0,05 0 0 0 0

Promedio total 17,82 16,43 26,33 17,62 31,41 16,43 12,45 9,93

Promedio

anormalidades

primarias

4,39 7,81 5,72 7,63 14,92a 4,32b 3,83 5,35

Promedio

anormalidades

secundarias

13,43cd 8,62cd 20,61c 10c 16,49c 12,12c 8,62d 4,58d

a y b difieren significativamente (Efecto Grupo x Día; P=0,01); c y d difieren significativamente (Efecto Día; P< 0,01)

22

Como muestra la Tabla 2, el promedio de anormalidades primarias refleja

diferencias significativas entre los grupos Ergo y Control.

En la Tabla 3, se presenta una síntesis de los valores registrados en lo que

respecta a motilidad en masa, porcentaje de espermatozoides vivos, morfología y

concentración espermática.

26

Tabla 3. Resultados de motilidad masal, porcentajes de espermatozoides vivos y de anormalidades totales del Grupo Ergo vs

Grupo Control a lo largo del ensayo.

Grupo

Diciembre Febrero Marzo Mayo

M.M. %V %AT C M.M. %V %AT C M.M. %V %AT C M.M. %V %AT C

Ergo

4,3 85,6 17,9 1,4x106 4,3 85,0 26,3 1,3x106 4,5 83,7 31,4 1,5x106 4,1 85,0 12,5 1,6x106

Rango 3,0

5,0

70

90

13,7

31,1

0,8x106

1,8x106

3,0

5,0

60

95

10,6

57,2

0,6x106

1,9x106

3,0

5,0

60

90

20,5

46,3

1,1x106

1,9x106

3,0

5,0

70

95

3,8

23,0

1,3x106

2,0x106

Control

3,5 72,5 16,4 1,0x106 3,5 72,5 17,6 1,4x106 4,0 82,5 16,4 1,3x106 3,5 77,5 9,9 1,3x106

Rango 3,0

4,0

65

80

16,4

19,6

0,9x106

1,1x106

3,0

4,0

65

80

15,7

19,5

0,7x106

1,6x106

4,0

4,0

80

85

12,8

20,0

1,3x106

1,4x106

3,0

4,0

75

80

8,3

11,4

1,4x106

1,2x106

Referencias: M.M.: Motilidad masal; %V: Porcentaje de espermatozoides vivos; %AT: Porcentaje de anomalías totales; C: Concentración espermática

expresada por mm3.

26

6. DISCUSIÓN

En la totalidad de los toros involucrados en el experimento, el perímetro

escrotal, indicador del tamaño testicular, superó el valor mínimo que deben tener los

toros de razas de razas productoras de carne a los 2 años de vida que es de 30 cm

(IRAC, 1998), no observándose interacción ni diferencias significativas entre grupos a

lo largo del ensayo coincidiendo con lo observado por Schuenemann et al. (2005).

Al igual que Jones et al. (2004), se evaluó también cambios en la temperatura

rectal y escrotal, coincidiendo en que las temperaturas rectales no fueron elevadas en

el grupo de tratamiento con dieta endofítica. Este resultado podría deberse a la

temperatura del día en que se efectuaron las evaluaciones de este parámetro, entre

las 7:00 hs a.m. y las 9:00 hs a.m., o debido a la aplicación de agua a los toros para

reducir el estrés por calor según lo exige el protocolo de cuidado de los animales.

En cuanto a la ganancia de peso vivo, esta fue significativamente menor en el

Grupo Ergo (efecto grupo) a lo largo de todo el ensayo, observándose una diferencia

numéricamente más acentuada en el primer periodo.

Respondiendo al objetivo principal del trabajo, el cual fue evaluar cambios en

los parámetros de calidad seminal, se observó que, tanto en la motilidad en masa

microscópica, porcentaje de espermatozoides vivos y concentración espermática no

se vieron diferencias significativas, difiriendo de lo expuesto por Casady et al. (1953)

y coincidiendo con lo expuesto por Schuenemann et al. (2005).

En coincidencia con lo descripto por Mathevon et al. (1998) y Casady et al. (1953)

se observa un porcentaje significativamente mayor de anormalidades primarias en el

grupo Ergo (efecto grupo al día 77), y una diferencia significativa entre los días de

medición (efecto día) en el porcentaje de anormalidades secundarias.

27

7. CONCLUSIÓN

De este experimento surge que la festucosis afecta la ganancia de peso

vivo, no así el perímetro escrotal y temperatura rectal (bajo las condiciones en

las que se realizó el experimento). En cambio, afecta la calidad espermática,

específicamente el porcentaje de anormalidades primarias, notándose su

impacto durante los meses más calurosos: diciembre, enero y febrero. Si bien

esta afección es temporaria, ya que, una vez retirados los toros de la pastura

tóxica e iniciado un nuevo proceso de espermatogénesis, la calidad seminal

vuelve a sus parámetros normales, debe tenerse en cuenta que la época de

entore coincide con los meses donde la toxicidad de la festuca aumenta. Es por

esto que las evidencias preliminares de este experimento deberían corroborarse

en futuros trabajos que incluyan un número mayor de animales y la realización

de estudios hormonales (análisis de prolactina), que posibiliten evidenciar con

certeza el efecto del hongo sobre el animal, permitiendo así evaluar de manera

más clara una de las variables que puede afectar considerablemente el resultado

de preñez de un rodeo.

28

8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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