Evaluación de patrones de inflamación durante la exposición a extractos

etanólicos de plantas en peces cebra (Danio rerio)

Luisa Matiz Ceron - 201326928

Resumen

Los compuestos naturales (NP) surgen como potenciales sustancias para la extracción de

moléculas químicas de importancia farmacéutica. Haciendo necesaria la evaluación in vivo

e in vitro de los patrones de estas sustancias. Se ha sugerido a Pentacalia ledifolia y Conyza

trihecatatis como posibles fuentes para extraer compuestos anti inflamatorios, debido al

conocimiento etnobotánico de algunas poblaciones sobres estas especies. Con este

propósito, se sugirió el uso de peces cebra como modelo de estudio. En este estudio se

evaluaron los patrones de inflamación, a través de la migración de neutrófilos en peces

cebra, durante la exposición a extractos etanolicos de las plantas Pentacalia ledifolia y

Conyza trihecatatis. Se determinó el pico máximo de migración de neutrófilos en peces

cebra, 7 – 8 hours post injury (hpi), de igual forma se visualizó un posible un patrón de anti

inflamación para P. ledifolia y C. trihecatactis, reflejado en una menor migración de

neutrófilos, sin embargo, no se pudo estimar en qué medida este efecto era de los

compuestos del extracto etanólico debido al efecto anti inflamatorio que también

presentaba el solvente (DMSO). Se estableció que incluso a concentraciones muy bajas de

dimetilsulfoxido (DMSO) hay un efecto anti inflamatorio, que tiende a ser obviado en la

literatura. Este efecto está enmascarando el resultado de los extractos etanolicos de ambas

plantas, sin embargo, se sugiere un proceso aditivo o sinérgico para el complejo DMSO-

extracto etanólico. Así mismo, se evaluó otro solvente (etanol) para comprobar las

propiedades anti inflamatorias anteriormente vistas al usar DMSO, mostrando un patrón

de anti inflamación, sin embargo menos específico para ambas plantas.

Introducción

En la actualidad los productos naturales (NP) representan una significativa fuente de

compuestos químicos aun no explorados por la ciencia (Crawford et al., 2011). Estos

compuestos, adaptados a las necesidades de cada organismo, tras procesos evolutivos, y

presentes en extractos constituidos por varias moléculas químicas, representan una

oportunidad en el desarrollo de medicamentos y el entendimiento de procesos biológicos.

Diversas son las plantas que se han empezado a utilizar en ensayos de NP, siendo las de

América y África las escogidas por su diversidad y propiedades desconocidas. En nuestro

caso se plantea el uso de dos plantas del páramo colombiano, de las especies Pentacalia

ledifolia y Conyza trihecatatis. En el caso de plantas del género Conyza, estas son

normalmente usadas como cicatrizantes e insecticidas. Específicamente, Conyza

trihecatactis es empleada como reductor de fiebre, estimulante de la menstruación y para

tratamiento de reumatismo, como diurético, anti hipertensivas y beneficiosa en el

tratamiento de afecciones al miocardio. (Loutfy, 2009; Hernández-Arias, 2014). Otras

especies de este género, como Conyza bonariensis, se utilizan para curar contusiones por

su efecto anti inflamatorio (Guzmán-Tirado, 1997). Por otro lado, de acuerdo con la

información etnobotánica, campesinos cundiboyacenses usan las plantas del género

Pentacalia como desinfectantes y cicatrizantes en heridas de difícil curación. Además, es

usada contra la sífilis, en erupciones cutáneas, dolores de garganta y úlceras (Garibello,

2010).

Dentro de las investigaciones realizadas para la evaluación de NP con propiedades anti

inflamatorias, las familias de compuestos alcaloides, fenoles y terpenoides, representan

una oportunidad para la generación de nuevas alternativas contra la inflamación

incontrolada (Bellik, Hammoudi, Abdellah, Iguer-Ouada, & Boukraâ, 2012). De igual

manera, se ha demostrado la efectividad de las isoflavonas generando anti inflamación (Yu,

Bi, Yu, & Chen, 2016), así como los esteroides de origen vegetal (Barnes, 2006).

Específicamente para los extractos de plantas que se plantea evaluar, Pentacalia ledifolia y

Conyza trihecatatis, se conoce la presencia de diversos compuestos aislados e identificados.

Para el caso de P. ledifolia los compuestos identificados son en su mayoría isoflavonas

(Ramírez, 2011), mientras que para C. trihecatatis la mayoría de sus metabolitos

pertenecen al grupo de los labdanos (Hernández-Arias, 2014). Investigaciones recientes en

estas dos familias de compuestos los han caracterizado por tener propiedades anti

inflamatorias (De Rosa & Tommonaro, 2012; Harris et al., 2013; Kim, Li, Wu, Lee, & Ryu,

2013; Tran, Wong, & Chai, 2017). Sin embargo, para ninguna de las dos especies se conoce

su composición química en totalidad, por lo que los extractos botánicos de estas plantas

involucran una oportunidad para describir nuevos productos naturales.

La inflamación es una respuesta esencial del cuerpo hacia los agentes exógenos, su

propósito es eliminar los patógenos para prevenir infección, limpiar las células necróticas y

el tejido dañado (Martin & Feng, 2009). En la inflamación, el reclutamiento de glóbulos

blancos o leucocitos es esencial para prevenir la entrada de microorganismos y comenzar

el cierre de la lesión (Martin & Feng, 2009). Por esta razón, el entendimiento de la biología

de los leucocitos, y esencialmente de los neutrófilos, principales células inmunes

involucradas en la respuesta inflamatoria, se hace necesario. Los neutrófilos corresponden

a la porción más grande de leucocitos en el cuerpo y son los primeros en migrar, guiados

por varias señales químicas, ayudando a limitar la invasión del patógeno.

Aunque la inflamación corresponde a un proceso de gran poder para la remoción de

patógenos y prevención de la infección, en casos donde ocurre de forma excesiva o nunca

ocurre, el tejido termina con un gran daño. Las consecuencias clínicas de un proceso de

inflamación no resuelto siguen siendo problemáticas para la medicina moderna, por causar

afecciones como la enfermedad de obstrucción pulmonar, artritis inflamatoria y

glomerulonefritis (Henry et al., 2013). Por esta razón, entender cómo funciona este proceso

inmunológico y como contrarrestarlo es una oportunidad para los productos naturales.

Para realizar estudios acerca de la respuesta inflamatoria usando neutrófilos, es usual la

extracción de estos de la sangre periférica, sin embargo, su corta vida hace que el trabajo

sea difícil y complejo. De esta forma se sugiere el uso de modelos biológicos que permitan

la visualización de neutrófilos bajo manipulaciones químicas. El pez cebra, Danio rerio,

modelo biológico de uso en el campo de la biología del desarrollo, presenta ventajas debido

a su alta variabilidad genética, similitud farmacológica con los humanos, pequeño tamaño,

transparencia, rápido desarrollo y alto número de embriones, que corresponden a los

principales estadios usados para experimentación (Crawford, Esguerra, & De Witte, 2008).

En el caso del sistema inmune, el pez cebra comparte muchas características con los

sistemas presentes en mamíferos, incluyendo las células involucradas en la respuesta del

sistema innato (Petrie, Strand, Tsung-Yang, Rabinowitz, & Moon, 2014), así como señales

celulares muy conservadas entre vertebrados e invertebrados tales como Wnt/β-catenina

y NOTCH (Correa et al., 2004; Fazio & Ricciardiello, 2016; Ma & Hottiger, 2016), que están

relacionadas con reclutamiento de células pro-inflamatorias, factores de transcripción

durante este proceso y la comunicación de las células que participan en él. Específicamente

en el proceso inflamatorio, se ha afirmado que vertebrados e invertebrados comparten la

morfología, bio-química y características funcionales de los neutrófilos (Henry et al., 2013).

Aunque la escala de tiempo y donde se generan los grupos celulares ocurre de manera

diferente en ambos grupos, la funcionalidad y objetivo parecen ser los mismos.

Concretamente en peces cebra, la aparición de los neutrófilos ocurre a las 32-48 hpf (Henry

et al., 2013). En el estudio de procesos de desplazamiento de grupos celulares,

específicamente de neutrófilos, son usadas pruebas citoquímicas e inmunomarcación como

el tinte Sudan Black de características lipofílicas (Mathias et al., 2010), la marcación de MPO

(Myeloperoxidase), así como anticuerpos LP (L-Plastin). De igual forma, debido al pequeño

tamaño de los embriones y larvas, se ha fomentado el desarrollo de líneas transgénicas para

realizar rastreos celulares con promotores específicos de neutrófilos como lyz y mpx,

marcados con proteínas fluorescentes (Gray et al., 2011; Henry et al., 2013; Petrie et al.,

2014). Por todo lo anterior, en este estudio se realizó un análisis de los patrones de

inflamación de las plantas Pentacalia ledifolia y Conyza trihecatatis, con el propósito de

establecer su potencial anti inflamatorio, mediante el conteo de neutrófilos en el pez cebra

como modelo animal.

Metodología

1.Modelo biológico

1.1 Condiciones de mantenimiento de los peces en el bioterio.

El mantenimiento y desarrollo de los animales se realizó de acuerdo con la regulación

del laboratorio de Biología del desarrollo (BIOLDES) de la Universidad de los Andes.

Con los estándares de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. A partir de la

guía se establecieron los siguientes parámetros fisicoquímicos para este laboratorio:

conductividad 600-800 μS/cm, pH 7.0 a 7.6, temperatura 27° C, con un mínimo de

25°C y un máximo de 29 °C, ciclo de luz/oscuridad 14/10 y suplemento de oxigeno

entre 6,5 y 8 mg/L en un sistema de recirculación de agua de Aquaneering Inc. De

igual forma, los animales son alimentados dos veces por día usando micro-crustáceos

(Artemia), copépodos y un suplemento de alimento granulado. En los tanques se

mantiene un máximo de 8 peces por litro de agua, donde se encuentran debidamente

etiquetados con sus cepas de procedencia, fecha de nacimiento y género.

1.2 Obtención de los embriones de pez cebra

Con el propósito de generar las larvas necesarias para la experimentación se usaron

ejemplares adultos sexualmente activos de las cepas silvestres AB, TAB5, TL y WIK.

Los cruces se realizaron usando un macho y dos hembras por caja de las cepas

anteriormente mencionadas. Estos fueron colocados entre lunes y viernes luego de

las 3:30 pm en “cajas de cruce”, que son dejadas toda la noche y posteriormente,

recolectadas luego de las 9:30 am del siguiente día, con el propósito de dejar un lapso

entre el apareamiento, resultado del cambio oscuridad/luz. Con respecto al

apareamiento, este sucede de manera externa debido a la liberación de los ovocitos

por parte de la hembra y la deposición del esperma sobre ellos, por parte del macho.

Los huevos resultantes son colectados en cajas de Petri con agua de huevo (20 μL azul

de metileno, 1,5 mL stock de sales: 40 g sal marina Crystal Sea® Marinemix/1L agua

destilada, 1 litro de agua corriente) y se transfieren a una incubadora a una

temperatura de 28.5°C donde se desarrollarán hasta el estadio necesario (4-5 dpf) no

superior a los 5 dpf.

2. Experimentación

2.1 Despigmentación de embriones

Para la evaluación de la migración de leucocitos se requiere una baja cantidad de

melanocitos sobre el cuerpo de pez. Para lograr esto se usó feniltiourea (PTU, por sus

siglas en inglés) a 200 μM. El PTU es aplicado desde las 6 hpf, a una concentración de

200 μM y debe ser cambiado cada dos dias. A las 24 hpf se sugiere realizar un

procesimiento de decorionacion de los embriones de manera manual, debido a que

el PTU genera endurecimiento en el corion, lo que impide la salida de manera natural

(a las 48 hpf) por parte del embrión. El PTU inhibe la síntesis de la enzima tirosinasas

de manera reversible, lo cual impedirá la síntesis de melanina sobre el epitelio dermal

y ocular del pez. Se siguieron presentando los iridiforos y xantoforos en todo el cuerpo

del animal.

2.2 Anestesia y cortes de aleta caudal

Como modelo para fomentar y evaluar de los patrones de inflamación se usó una

lesión en la aleta caudal de las larvas. Para realizar los cortes de la aleta caudal se

aplicó una solución de tricaina 0.00168ppm en 24 mL de agua destilada, seguido de

un baño frio en hielo, durante no más de 5 min, para inmovilizar, pero no matar al

pez. El ritmo cardiaco debe ser de 0 bmp para proceder. Se realizó el corte utilizando

una aguja de punta gruesa, usando un estereoscopio. El corte se debe realizó en la

aleta caudal, comprometiendo una parte del musculo de esta misma (Imagen 1).

Posteriormente, se transfirieron las larvas con el corte a cajas de Petri con agua de

huevo y se ingresaron a la incubadora a 28.5 °C. Se debe registro su actividad durante

la siguiente hora para descartar posibles cortes mortales en los individuos

experimentales.

Imagen 1. Lugar de corte. Se debe comprometer el musculo para generar una mayor

movilización de neutrófilos. El corte de debe realizar sin afectar la vena y aorta caudal del

pez. Fondo de la imagen editado usando Adobe Illustrator CS6.

2.3 Evaluación de pico máximo de migración de neutrófilos

2.3.1 Evaluación de migración de neutrófilos

Para realizar la evaluación de la migración de neutrófilos se realizó un ensayo de

inflamación general basado en un corte de aleta caudal, tal como se describió

anteriormente. Se analizó el patrón de migración de los neutrófilos, usando una

tinción histológica con Sudan Black B mediante una pre fijación con

Paraformaldehido (PFA) al 4%. Se realizó la observación de las poblaciones de

neutrófilos desde las 0 hpi (hours post injury) hasta las 11 hpi. Todos los peces

tuvieron las mismas condiciones y fueron tomados progresivamente para observar

la migración de los neutrófilos.

2.3.2 Citoquímica

Este procedimiento histológico fue tomado de Hanly, 2001. Se realizaron los

ajustes necesarios para realizar los objetivos propuestos.

Se tomaron 0,1 g de Sudan Black B (Sigma Aldrich-S2380) y se disolvieron en 33,3

mL de etanol absoluto, mediante un agitador magnético en un baño de agua a 30°.

Se preparo adicionalmente una solución de fenol tamponado, que consiste en 8 g

de fenol y una solubilización en etanol absoluto. Esta solución fue añadida a un

recipiente que contiene 0.15 g de fosfato de ácido de sodio disueltos en 50 mL de

agua destilada, agitando hasta homogenizar. La solución de trabajo debe estar

constituida por 30 mL de solución inicial de Sudan Black B y 20 mL del tampón de

fenol. Para la preservación del colorante se almaceno en un frasco ámbar

protegido de la luz.

Para la tinción, se debe fijo con PFA 4% por una noche a 4°C. Luego, se lavó con

PBS 1X, cuatro veces durante 1 minuto. Posteriormente, se incubó con Sudan Black

B por 45 minutos a temperatura ambiente. Finalizada esta incubación las muestras

fueron lavadas exhaustivamente con etanol al 70% hasta la ausencia de colorante

en el sobrenadante. Para generar una mejor visualización de los neutrófilos se

aplicó una solución de glicerol 80% (1:1:8, agua, PBS 1x y glicerina), en la cual se

sumergieron las larvas y se esperó a su precipitación (1 hora aproximadamente).

Para la rehidratación se usa PBST (PBS 1X con Tween 20 al 1%), realizando tres

lavados de 10 minuto. La visualización de los neutrófilos se realizó con un

microscopio estereoscopio Leica (MDG33) en un aumento de 60X en campo claro.

2.4 Curva de toxicidad para Diclofenaco

Se evaluaron diferentes concentraciones de Diclofenaco sódico 75mg/3mL en

solución inyectable (Voltaren). Lo anterior, se realizó con el propósito de establecer

una concentración no letal y con propiedades anti inflamatorias.

Se realizó un ensayo con base en la concentración de 1.01 μM, la cual estaba

establecida como poco letal para larvas de peces cebra (Chen et al., 2014). Las

concentraciones evaluadas fueron 1, 0.40, 0.20, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.008

y 0.006 mM. El ensayo fue realizado a través de cuatro replicas con las diferentes

concentraciones al azar, mediante placas de cultivo celular de 24 pozos y durante

11 horas. Las larvas incluidas en la prueba eran revisadas cada hora. Se estableció

la concentración letal 50 (CL50).

2.5 Determinación de patrones de anti inflamación de los extractos vegetales

2.5.1 Evaluación de la actividad anti inflamatoria de los extractos vegetales

Luego de realizar el corte a los 5 dpf, se aplicaron los tratamientos. De cada uno de

los extractos vegetales Pentacalia ledifolia y Conyza trihecatatis, se prepararon

soluciones a partir de un stock de 200mg/L con 0.02 g del extracto etanólico diluido

en 1 mL de solución DMSO 1% y llevado hasta 100 mL usando agua de huevo. Se

evaluó las concentraciones de 30-35 mg/L, y 4-2 mg/L para P. ledifolia y C.

trihecatatis respectivamente, debido a la baja mortalidad que hay en estas

concentraciones (Garzon & Forero, 2016). Además, se evalúo el patrón de

migración de neutrófilos en DMSO 1%, agua de huevo y Diclofenaco 0,008 mM,

sometidos a corte y sin él.

En dos placas de cultivo celular de 12 pozos se tomaron 2 pozos por cada

tratamiento con un mínimo de 3 peces en cada pozo. La prueba se inició desde la

realización del corte en la aleta caudal, y durante un periodo de 8 horas. Se

visualizo la migración de neutrófilos usando los protocolos de citoquímica

mencionados anteriormente.

2.5.2 Determinación de patrones de migración de neutrófilos para porcentaje de

DMSO en cada extracto vegetal

Se determino si la baja concentración de DMSO (dimetilsulfóxido) usada (< 1%)

para disolver el extracto etanólico de las plantas posee un efecto anti inflamatorio

significativo. Para esto, se realizó una evaluación de la migración de neutrófilos

durante las 8 hpi (al realizarse una herida en la aleta caudal). De esta forma los

correspondientes porcentajes fueron (Conyza 4 mg/L = 0,02%; Conyza 2 mg/L =

0,01%; Pentacalia 35 mg/L = 0,175%; Pentacalia 30 mg/L = 0,150%; DMSO = 1 %).

Se visualizó la migración de neutrófilos usando los protocolos de citoquímica

mencionados anteriormente.

2.5.3 Determinación de patrones de migración de neutrófilos para porcentaje de

etanol en cada extracto vegetal

Se determino si usando un solvente diferente al DMSO se mantenía el patrón de

anti inflamación. Se usaron las concentraciones de Conyza 0.9, 2, 5 mg/L y

Pentacalia 20, 30, 40 mg/L. Así mismo, se determinó si la baja concentración de

etanol usada (< 1%) para disolver el extracto etanólico de las plantas posee un

efecto anti inflamatorio significativo. Para esto, se realizó una evaluación de la

migración de neutrófilos durante 8 hpi (al realizarse una herida en la aleta caudal).

De esta forma los correspondientes porcentajes fueron (Conyza 0,9 mg/L =

0,0045%; Conyza 2 mg/L = 0,01%; Conyza 5 mg/L = 0,025%; Pentacalia 20 mg/L =

0,1%; Pentacalia 30 mg/L = 0,2%; Pentacalia 40 mg/L = 0,150%; etanol = 1 %). Se

visualizó la migración de neutrófilos usando los protocolos de citoquímica

mencionados anteriormente.

3. Análisis de imagen y datos:

El análisis del conjunto de neutrófilos en migración en cada corte se realizó con Fiji

(Schindelin et al., 2012) de manera manual mediante el complemento Colony counter y con

Icy (De Chaumont et al., 2012), de manera automática usando spot counter (Parámetros =

Scale 4, sensitividad 40.0 y 13 pixeles) con el propósito de comparar métodos. Se contó la

cantidad de neutrófilos presentes en el corte, específicamente los presentes en un campo

de 2 cm desde el punto más extremo del corte caudal para ambos programas. Para los

procedimientos estadísticos se usó el programa R (Gentleman et al., 2009 R versión 3.4.4)

con una significancia de 0.05. Usando un ANCOVA para evaluar el efecto del programa

usado y la cantidad de neutrófilos que migró cada hora. Posteriormente, se usó un test de

Tukey para determinar que categorías eran las más significativas. Para la evaluación de los

patrones anti inflamatorios de los extractos de las plantas se realizó un ANOVA y un test de

Tukey para determinar que categorías eran las más significativas. Lo mismo se realizó para

ambos solventes.

4. Resultados

4.1 Evaluación de pico máximo de migración de neutrófilos

Imagen 2. Migración de neutrófilos registrada entre 3 a 11 hpi comparando dos métodos de

conteo.

Imagen 3. Patrón de migración de neutrófilos entre 0-11 hpi. Fondo de la imagen editada usando

Adobe Illustrator CS6.

Se realizo un ANOVA de dos lados para evaluar la cantidad de neutrófilos que son contados

en cada hora con respecto a cada programa usado (Icy e ImageJ) y posteriormente un

TukeyHSD test. Primero, se encontró una diferencia significa entre el número de neutrófilos

que se cuentan usando ImageJ o Icy, con un valor P de 0.011. Sin embargo, al realizar la

estimación de los patrones de confianza (95%), se encontró que en general ambos

programas se comportan de la misma manera, prediciendo un patrón similar. Se encontró

una única relación significativa siendo el valor p entre el inicio de la migración de los

neutrófilos 3 hpi-8 hpi para ImageJ y 7 hpi para Fiji (Imagen 2). De igual forma, en la imagen

3, se puede apreciar un aumento en el número de neutrófilos, que progresivamente

comienza a disminuir luego del pico máximo. Se decide realizar la siguiente fase de

experimentación durante las 8 hpi usando solamente los datos de Icy.

4.2 Curva de toxicidad Diclofenaco sódico

De acuerdo con registro realizado, se estableció que a 1.01 μM era una concentración

segura, sin embargo, no presentaba patrones de anti inflamación. Por esta razón se decido

hacer una curva de toxicidad entre 1 y 0.006 Mm.

Se estableció que la CL50 corresponde a 0.039 mM. Siendo necesario usar una

concentración menor a esta como control positivo. Se eligió usar 0.008 mM, ya que es

inferior al LC50, a partir de esta concentración se registró una mortalidad nula y es la

primera en registrar un patrón de anti inflamación.

Se realizo un ANOVA de para evaluar la cantidad de neutrófilos que son contados en cada

tratamiento usado Icy y posteriormente un TukeyHSD test. No se encontraron relaciones

significativas (Imagen 4 y 5). Sin embargo, se observa un patrón de migración menor para

los tratamientos de extractos etanolicos de ambas plantas, siendo mayor para P. ledifolia

(Imagen 5). También se encontró un proceso anti inflamatorio para el DMSO al 1%, siendo

el que se usa para el stock inicial (200mg/L).

4.3 Determinación de patrones de anti inflamación de los extractos vegetales

Imagen 4. Migración de neutrófilos en extractos etanolicos de Pentacalia ledifolia (a) y Conyza

trihecatactis (b).

Imagen 5. Patrón de migración de neutrófilos 8 hpi Conyza trihecatatis y Pentacalia ledifolia.

Fondo de la imagen editada usando Adobe Illustrator CS6.

4.4 Determinación de patrones de migración de neutrófilos para porcentaje de DMSO en

cada extracto vegetal

Imagen 6. Migración de neutrófilos para concentraciones de solvente (DMSO) en extractos de

Pentacalia ledifolia (a) y Conyza trihecatactis (b). Negro indica los controles sin corte, gris los

conjuntos de extracto de la plantas-DMSO y blanco los porcentajes de etanol contenidos en los

conjuntos extracto-etanol.

Se realizo un ANOVA de dos lados para evaluar la cantidad de neutrófilos que son contados

en cada porcentaje de DMSO (presente en cada concentración de extracto etanólico).

Posteriormente, se realizó un TukeyHSD test. No se encontró una diferencia significa entre

el número de neutrófilos del agua contra los extractos de las plantas-DMSO y DMSO por sí

solo. Se encontró que en general hay una menor migración de neutrófilos cuando participa

el conjunto extracto-DMSO para ambas plantas.

4.5 Determinación de patrones de migración de neutrófilos para porcentaje de etanol en

cada extracto vegetal

Imagen 6. Migración de neutrófilos para concentraciones de solvente (etanol) en extractos de

Pentacalia ledifolia (a) y Conyza trihecatactis (b). negro indica los controles, gris porcentajes de

etanol en los extractos de la plantas-etanol y blanco los conjuntos de planta-etanol.

Se realizo un ANOVA de dos lados para evaluar la cantidad de neutrófilos que son contados

en cada porcentaje de DMSO (presente en cada concentración de extracto etanólico).

Posteriormente, se realizó un TukeyHSD test. No se encontró una diferencia significa entre

el número de neutrófilos del agua contra los extractos de las plantas-etanol y etanol por sí

solo. Se encontró que en general hay una menor migración de neutrófilos cuando el etanol

actúa por sí solo, por lo que no es un buen solvente para nuestros propósitos.

5. Discusión

La inflamación corresponde a proceso complejo en el cual varias poblaciones celulares y

sus factores de comunicación están interviniendo. En esta evaluación experimental se

describe de manera sencilla los patrones de migración de una de estas poblaciones

celulares, los neutrófilos, primeras células en migrar durante la activación de los epitelios.

Con respecto a los patrones de migración de neutrófilos se estableció que su pico máximo

ocurre a las 7-8 hpi (Imagen 2). Este pico máximo ocurre debido a la migración masiva de

neutrófilos para prevenir y limitar la entrada de patógenos, donde posteriormente ocurre

un proceso de apoptosis (ilustrado en el declive en nuestro caso). La vida media de los

neutrófilos en humanos se ha determinado entre 7 a 10 horas (Cartwright, Athens &

Wintrobe, 1964; Price, Chatta & Dale, 1996). Esto indica que en el pez cebra se están

llevando a cabo procesos similares a los que ocurren en la inflamación para la migración de

neutrófilos, indicando este modelo animal como un candidato específico para estudiar

estos patrones. Aunque, otras características acerca de la naturaleza de los neutrófilos no

fueron evaluadas en este ensayo, se sugiere la similitud en los tiempos de migración al

tejido alterado como un factor positivo más para la comparación entre humano-pez cebra.

En este ensayo se evaluaron dos programas para el conteo de neutrófilos (Icy y Fiji). Se

encontró una sobreposición de los intervalos de confianza para ambos programas (Imagen

2), indicando que ambos muestran el mismo patrón. La razón principal para el uso de ambos

programas era disminuir el sesgo al momento de contar las células y estimar la mejor forma

de realizar el conteo. Se determino que ambos generan patrones similares de migración,

teniendo picos diferentes de máxima migración, 7 hpi para Icy y 8 hpi para ImageJ. Ambos

tienen el mismo patrón ascendente-pico máximo-descendiente. Los datos tomados con

ImageJ presentan mayor variabilidad, mientras que los de Icy tiene una sobreestimación sin

embargo su variabilidad en menor. La constante sobre estimación de la cantidad de

neutrófilos con Icy, puede deberse al conteo erróneo de pigmentos. Ya que, el programa no

puede diferenciar los pigmentos de los neutrófilos si se encuentran en la zona de conteo.

Para disminuir este sesgo se sugiere el uso de líneas de peces sin pigmento, ya que el uso

de PTU, aunque es una buena variante cuando no se poseen estas líneas, no limpia

completamente las larvas. De igual forma el uso de líneas transgénicas, ya que permitirían

usar este procedimiento sin sobrestimar los neutrófilos presentes. Sin embargo, ya que el

patrón de sobreestimación es constante en todos los tratamientos y presenta menor

variabilidad que ImageJ, se decido evaluar solo los datos obtenidos con Icy.

Debido a la naturaleza lipofílica del Sudan Black B, en este ensayo se estarían tiñendo las

poblaciones de eosinófilos, monocitos y neutrófilos del pez por igual. Sin embargo, ya que

las poblaciones que presentan migración en procesos de inflamación corresponden de

forma mayoritaria a monocitos y neutrófilos, los eosinófilos quedan descartados.

Finalmente, con esta técnica no es posible diferenciar las poblaciones de monocitos de las

de neutrófilos, sin embargo, por ser esta ultima la primera en migrar y la más prominente

entre los leucocitos (Lieschke et al., 2001), se puede afirmar que hay un proceso de

migración casi exclusivo por parte de los neutrófilos. No obstante, se reitera el uso de

animales transgénicos para marcadores únicos de neutrófilos con el fin de validar los datos.

Por otro lado, aunque se ha reportado una baja letalidad y desarrollo normal en diclofenaco

sódico correspondiente a 1.01 μM (Chen et al., 2014), en este ensayo se encontró que esa

concentración no produce un efecto anti inflamatorio significativo por lo que se evaluaron

diferentes concentraciones a partir de 1.01 mM. Se encontró que la concentración de 0.039

mM corresponde a la CL50. Además, se estableció que a una concentración de 0.008 mM la

mortalidad de las larvas es cero y es la primera en la que se produce efecto anti inflamatorio.

Sin embargo, ya que estas concentraciones fueron establecidas a partir de una formula

inyectable de venta libre y no de un reactivo de laboratorio tal como en Chen y

colaboradores en el 2014, los resultados no pueden ser comparables. No obstante, de

acuerdo con los datos de diclofenaco a 0.008 mM (Valor P < 0.05) se sugiere que este tiene

un efecto anti inflamatorio evidente y puede ser usado como control positivo (Imagen 5).

Para ambos extractos de plantas, Pentacalia ledifolia y Conyza trihecatatis, parece haber un

efecto anti inflamatorio evidenciado en la migración de neutrófilos. Siendo las más altas las

de P. ledifolia, seguidas por C. trihecatatis (Imagen 5). Aunque, no se conoce con certeza

los componentes metabólicos de estos extractos etanolicos, se puede atribuir sus

propiedades antiinflamatorias a moléculas de labdanos, en el caso de C. trihecatatis e

isoflavonas (Ramírez, 2011) para P. ledifolia. Ambos compuestos por presentar propiedades

anti inflamatorias (Bellik, Hammoudi, Abdellah, Iguer-Ouada, & Boukraâ, 2012). Sin

embargo, no se descarta la posibilidad que estos no correspondan a los responsables de la

anti-inflamación, o que sea un conjunto de compuestos químicos los que estén produciendo

el efecto, ya que, los compuestos aislados y conocidos para estas dos plantas aun

corresponden a un espectro muy reducido. Sin embargo, aunque las plantas parecen tener

un potencial anti inflamatorio, el solvente usado en este ensayo, DMSO, también está

presentando un efecto similar, aunque en general menor por si solo al ser evaluados los

porcentajes correspondiente de cada dilución de los extractos (Imagen 6), presentando la

posibilidad de un efecto sinérgico o adicional con el extracto etanolico. Sin embargo, no

podemos esclarecer en qué medida el solvente es el causante de la anti inflamación

observada.

Se ha reportado el DMSO como sustancia anti inflamatoria (Swanson, 1985; Elisia et al.,

2016) y ampliamente usada en veterinaria (Brayton, 1986; Smith et al., 1998; Arden et al.,

1990) para el tratamiento de caballos. Se encontró que todos los porcentajes de DMSO

producen una menor migración de neutrófilos. Sin embargo, se observó una menor

migración de neutrófilos al estar presentes los extractos etanolicos y el DMSO, que cuando

solo se evaluaba el porcentaje de DMSO correspondiente. Indicando un efecto aditivo o

sinérgico en el conjunto de extractos etanolicos y el DMSO. Sin embargo, no se puede

establecer en qué medida el efecto anti inflamatorio es producido por una u otra parte del

conjunto.

Al evaluar los extractos de las plantas usando etanol la migración de neutrófilos en general

es mayor que en el DMSO (Imagen 6). Además, el etanol al 1% tiene un efecto

antiinflamatorio mayor que el DMSO al mismo porcentaje. Así mismo, en los ensayos de

etanol-planta en general no es posible ver el efecto que tiene los compuestos de las plantas

por si solos, por lo cual aunque el DMSO parece ser una mejor alternativa, se sugiere este

ensayo como una revisión inicial, para focalizar posteriores observaciones con instrumentos

más precisos y análisis químicos sobre la composición de los compuestos, que confirmen

las propiedades anti inflamatorias vistas en primera medida usando esta técnica en el pez

cebra.

6. Conclusión

Gracias a este ensayo se concluye que el pez cebra es una herramienta útil para la

evaluación de patrones de migración de neutrófilos. De igual forma, que el programa Icy

representa una herramienta útil para el conteo de esta población celular. Además, los

extractos de P. ledifolia y C. trihecatatis parecen generar un patrón anti inflamatorio,

reduciendo la migración de neutrófilos, aunque, parte de este proceso puede estar mediado

por el solvente, como ocurre para los dos que fueron evaluados en este ensayo. Sugerimos

este estudio como un acercamiento inicial a la determinación del potencial anti inflamatorio

de una sustancia, recomendando el uso de compuestos que no requieran la disolución en

solventes. Todo con el propósito de la posterior determinación de la composición de la

sustancia mediante un análisis químico. Así mismo, se sugiere el uso de animales

transgénicos para comparar los resultados obtenidos con secuencias visuales completas en

el mismo individuo. Por otro lado, aunque no era nuestro propósito inicial se establecieron

las propiedades anti inflamatorias del etanol y el DMSO en varias concentraciones inferiores

al 1%. Esto es muy importante, ya que indica la necesidad de evaluar todos los porcentajes

usados de estos solventes, aunque sean muy pequeños. Lo anterior, se resalta ya que en

algunos artículos se tiende a obviar estos por su pequeño valor.

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